JP2021134154A - 改変抗体及びその製造方法、並びに抗体の熱安定性を向上させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
2) Kabat法に基づく9番目のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく110番目のアミノ酸残基;及び
3) Kabat法に基づく10番目のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく110番目のアミノ酸残基。
・重鎖CDR1:DTYIH (配列番号2)
・重鎖CDR2:RIYPTNGYTRYADSVKG (配列番号3)
・重鎖CDR3:WGGDGFYAMDY (配列番号4)
・可変領域:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (配列番号5)
・軽鎖CDR1:RASQDVNTAVA (配列番号17)
・軽鎖CDR2:SASFLYS (配列番号18)
・軽鎖CDR3:QQHYTTPPT (配列番号19)
・可変領域:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTV (配列番号20)
マウス抗体、ヒト化抗体及びウサギ抗体のそれぞれの三次元構造データから、重鎖において可変領域と定常領域とが近接する部位にあるアミノ酸残基を各領域から見出し、それらのアミノ酸残基間の距離をソフトウェアにより算出した。
マウス抗インスリン抗体及びウサギ抗CD80抗体のそれぞれの重鎖のアミノ酸配列をDiscovery Studio 2017 R2に入力し、自動ホモロジーモデリング機能により重鎖の三次元構造データを得た。そして、各抗体の重鎖の立体構造を視覚化した。また、ヒト化抗HER2抗体(トラスツズマブ)の三次元構造データをProtein Data Bank(PDB)よりダウンロードし、該データをDiscovery Studio 2017 R2に入力して重鎖の立体構造を視覚化した。その結果、いずれの抗体の重鎖においても、可変領域の8〜11番目のアミノ酸残基を含む部分と、定常領域の108〜111番目のアミノ酸残基を含む部分とが近接していることが分かった。
可変領域の8〜11番目の各アミノ酸残基のα炭素と、定常領域の108〜111番目の各アミノ酸残基とのα炭素との間の距離(Å)を、三次元構造データに基づいてDiscovery Studio 2017 R2により算出した。結果を表10〜12に示す。
ヒト化抗体、マウス抗体及びウサギ抗体のそれぞれについて、可変領域と定常領域との間でジスルフィド結合が形成されるように、上記の参考例で特定したアミノ酸残基をシステイン残基に置換して改変抗体を作製した。
(1.1) ヒト化抗体の遺伝子の取得
ジェンスクリプトジャパン株式会社にヒト化抗HER2モノクローナル抗体(トラスツズマブ)の遺伝子の合成を委託して、ヒト化抗HER2抗体の遺伝子を含むプラスミドDNAを取得した。
以下のようにして、マウス抗インスリン抗体の遺伝子を取得した。
[試薬]
ISOGEN(株式会社ニッポンジーン)
SMARTer(登録商標)RACE 5'/3'キット(clontech社)
10x A-attachment mix(東洋紡株式会社)
pcDNA(商標)3.4 TOPO(登録商標)TAクローニングキット(Thermo Fisher社)
Competent high DH5α(東洋紡株式会社)
QIAprep Spin Miniprepキット(QIAGEN社)
KOD plus neo(東洋紡株式会社)
Ligation high ver.2(東洋紡株式会社)
ヒトインスリンを抗原に用いて、Kohler及びMilstein, Nature, vol.256, p.495-497, 1975に記載される方法により、マウス抗ヒトインスリン抗体を産生するハイブリドーマを作製した。このハイブリドーマの培養物(10 mL)を1000 rpmで5分間遠心処理した後、上清を除去した。得られた細胞をISOGEN(1mL)で溶解し、室温で5分静置した。ここに、クロロホルム(200μL)を添加し、15秒間撹拌した後、室温で3分間静置した。そして、これを12000×Gで10分間、4℃にて遠心処理して、RNAを含む水相(500μL)を回収した。回収した水相にイソプロパノール(500μL)を添加して混合した。得られた混合物を室温で5分間静置した後、12000×Gで10分間、4℃にて遠心処理した。上清を除去して、得られた沈殿物(トータルRNA)に70%エタノール(1mL)を添加し、7500×Gで10分間、4℃にて遠心処理した。上清を除去し、RNAを風乾させ、RNaseフリーの水(20μL)に溶解した。
上記(i)で得られた各トータルRNAを用いて、以下の組成のRNAサンプルを調製した。
[RNAサンプル]
トータルRNA (500 ng/μL) 1μL
RTプライマー 1μL
脱イオン水 1.75μL
合計 3.75μL
[逆転写反応液]
5x First-Strandバッファー 2μL
20 mM DTT 1μL
10 mM dNTP mix 1μL
RNAaseインヒビター 0.25μL
SMARTScribe RT(100 U/μL) 1μL
cDNA合成用サンプル 4.75μL
合計 10μL
[5'RACE反応液]
10x PCRバッファー 5μL
dNTP mix 5μL
25 mM Mg2SO4 3.5μL
cDNAサンプル 2.5μL
10x Universal Primer Mix 5μL
3'-プライマー 1μL
KOD plus neo (1 U/μL) 1μL
精製水 27μL
合計 50μL
[反応条件]
94℃で2分、
98℃で10秒、50℃で30秒、及び68℃でt秒を30サイクル、及び
68℃で3分。
5’RACE産物 9μL
10x A-attachment mix 1μL
合計 10μL
[TAクローニング反応液]
アデニン付加産物 4μL
salt solution 1μL
pCDNA3.4 1μL
合計 6μL
上記(ii)で得られたTAクローニングサンプル(3μL)をDH5α(30μL)に添加して、氷上で30分静置した後、混合物を42℃にて45秒間加熱してヒートショックを行った。再度、氷上で2分静置した後、全量をアンピシリン含有LBプレートに塗布した。該プレートを37℃にて16時間インキュベートした。プレート上のシングルコロニーをアンピシリン含有LB液体培地中に取り、37℃にて16時間振とう培養(250 rpm)した。培養物を5000×Gで5分間遠心処理して、大腸菌の形質転換体を回収した。回収した大腸菌からQIAprep Spin Miniprepキットを用いてプラスミドを抽出した。具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。得られたプラスミドの塩基配列を、pCDNA3.4ベクタープライマーを用いて確認した。以上より、マウス抗インスリン抗体の遺伝子を含むプラスミドDNAを取得した。
CD80で免疫したウサギの末梢血からリンパ球を取得し、該リンパ球からmRNAを抽出してcDNAを合成した。得られたcDNAを、抗体遺伝子をクローニングするための公知のプライマーを用いて増幅し、Fabファージライブラリを作製した。得られたライブラリを用いて、公知のFabファージディスプレイ法及びバイオパニング(Lang IM, Barbas CF 3rd, Schleef RR., Recombinant rabbit Fab with binding activity to type-1 plasminogen activator inhibitor derived from a phage-display library against human alpha-granules, (1996) Gene 172(2):295-8及びPhilippa M. O'Brien, Robert Aitken, Antibody Phage Display, (2002) Methods in Molecular Biology Volume No. 178参照)により、ウサギ抗CD80抗体のFabクローンを得た。取得したウサギ抗CD80抗体のFabクローンの遺伝子を、ウサギ抗体のFc領域をコードする遺伝子を含むプラスミドDNAに組み込んで、ウサギ抗CD80抗体の遺伝子を含むプラスミドDNAを取得した。
(2.1) プライマーの設計及びPCR
各抗体の遺伝子の塩基配列に基づいて、重鎖における可変領域の9番目又は10番目のアミノ酸残基と、定常領域の109番目又は110番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換するためのプライマーを設計した。また、各抗体に特許文献1に記載の軽鎖への変異をさらに導入するため、各抗体の軽鎖における可変領域の80番目のアミノ酸残基及び定常領域の171番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置換するためのプライマーを設計した。
[PCR反応液]
10x PCRバッファー 5μL
25 mM Mg2SO4 3μL
2mM dNTP mix 5μL
フォワードプライマー 1μL
リバースプライマー 1μL
プラスミドDNA (40 ng/μL) 0.5μL
KOD plus neo (1U/μL) 1μL
精製水 33.5μL
合計 50μL
[反応条件]
98℃で2分、
98℃で10秒、54℃で30秒、及び68℃で4分を30サイクル、及び
68℃で3分。
[ライゲーション反応液]
DpnI処理済みPCR産物 2μL
Ligation high ver.2 5μL
T4ポリヌクレオチドキナーゼ 1μL
精製水 7μL
合計 15μL
ライゲーション反応後の溶液(3μL)をDH5α(30μL)に添加して、上記(1.2)(iii)と同様にして、大腸菌の形質転換体を得た。得られた大腸菌からQIAprep Spin Miniprepキットを用いてプラスミドDNAを抽出した。得られた各プラスミドDNAの塩基配列を、pCDNA3.4ベクタープライマーを用いて確認した。以下、これらのプラスミドDNAを、哺乳動物細胞発現用プラスミドとして用いた。
[試薬]
Expi293(商標)細胞(Invitrogen社)
Expi293(商標) Expression培地(Invitrogen社)
ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Invitrogen社)
Expi293細胞は、5%CO2雰囲気下、37℃にて振とう培養(150 rpm)して増殖させた。サンプル数に応じた数の30 mLの細胞培養物(3.0 x 106 cells/mL)を準備した。各抗体の野生型及び変異型をコードするプラスミドDNAを用いて、以下の組成のDNA溶液を調製し、5分間静置した。
[DNA溶液]
軽鎖プラスミド溶液 15μgに相当する量(μL)
重鎖プラスミド溶液 15μgに相当する量(μL)
Opti-MEM(商標) 適量(mL)
合計 1.5 mL
ExpiFectamine試薬 80μL
プラスミド溶液 1420μL
合計 1.5 mL
各細胞培養物を3000 rpmで5分間遠心処理して、培養上清を回収した。培養上清には、トランスフェクションされたExpi293(商標)細胞から分泌された各抗体が含まれる。得られた培養上清を再度、15000×Gで10分間遠心処理して、上清を回収した。得られた上清をHiTrap Protein A HPカラム(GEヘルスケア社)を用いて精製した。得られた溶液を、Superdex 200 Increase 10/300 GLカラム(GEヘルスケア社)を用いてさらに精製して、抗体溶液を取得した。精製についての具体的な操作は、各カラムの添付文書に従って行った。
ヒト化抗HER2抗体の野生型(トラスツズマブ)と、その改変抗体として重鎖変異型(9-109)、重鎖変異型(10-110)及び軽鎖・重鎖変異型(80-171/10-110)を得た。ヒト化抗HER2抗体の野生型は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する。ヒト化抗HER2抗体の重鎖変異型(9-109)及び重鎖変異型(10-110)は、それぞれ配列番号8及び11で表されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する。ヒト化抗HER2抗体の軽鎖・重鎖変異型(80-171/10-110)は、配列番号11で表されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号16で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。
実施例1で作製した各抗体の野生型及びそれらの改変抗体の熱安定性を検討した。
実施例1で得た各抗体から常法によりFabフラグメントを得た。各抗体のFabフラグメントを含む溶液の溶媒をゲルろ過により、示差走査熱量計(DSC)での測定に用いるバッファー(リン酸緩生理食塩水:PBS)に置換した。ゲルろ過の条件は下記のとおりである。
バッファー:PBS (pH 7.4)
使用したカラム:Superdex 200 Increase 10/300 (GEヘルスケア社)
カラム体積(CV):24 mL
サンプル体積:500μL
流速:1.0 mL/min
溶出量:1.5 CV
フラクション体積:500μL
サンプル量:400μL
測定範囲:30℃〜100℃
昇温速度:1℃/分
DSC測定により取得した各抗体のTm値を、以下の表13〜15に示す。表中、「ΔTm(℃)」は、各変異型のTm値と野生型のTm値との差である。
ヒト化抗HER2抗体の野生型及びその改変抗体の凝集性を検討した。改変抗体として、実施例1で作製した軽鎖・重鎖変異型(80-171/10-110)と、実施例1の軽鎖改変用プライマーセットを用いて作製した軽鎖変異型(80-171)とを用いた。
各抗体を含む溶液の溶媒をゲルろ過によりPBS(pH 7.4)に置換した。各抗体を含むフラクションをPBSで希釈して、サンプル(終濃度12.5〜100μM)を調製した。ゼータサイザーナノZSP(Malvern社)を用いて、動的光散乱(DLS)法により、25℃で各抗体の拡散係数を測定した。DLSの測定結果から、x軸に抗体濃度を、y軸に拡散係数(μm2/s)をプロットした。プロットしたデータの回帰直線を最小二乗法により算出して、回帰直線の傾き及び切片を取得した。最小二乗法では、Σ{yk - (axk+b)}2の値が最小となるa及びbを求めた。
各抗体を含む溶液の溶媒をゲルろ過によりPBS(pH 7.4)に置換した。各抗体を含むフラクションをPBSで希釈して、サンプル(終濃度5μM)を調製した。MicroCal PEAQ-DSC (Malvern Instruments Ltd社)を用いて、各抗体のTm値を測定した。ゲルろ過及びDSC測定の条件は、実施例1で述べた条件と同じであった。
各抗体の回帰直線の式を、以下の表16に示す。表中、「ΔTm(℃)」は、各変異型のTm値と野生型のTm値との差である。また、「凝集性」は、野生型の抗体に対する各変異型の凝集性の変化を、回帰直線の傾きの値に基づいて評価した結果を示す。
実施例1で作製した各抗体の野生型及びそれらの変異型の抗原に対する親和性を、ELISA法により検討した。
(1.1) 抗原及び検出用抗体
ヒト抗HER2抗体の抗原として、HER2タンパク質(R&D Systems社、カタログ番号:1129-ER)を用いた。マウス抗インスリン抗体の抗原として、ヒューマリンR注100単位(イーライリリー社)を用いた。ウサギ抗CD80抗体の抗原として、CD80タンパク質(R&D Systems社、カタログ番号:140-B1)を用いた。検出用抗体として、ヒト化抗HER2抗体(Fab)の野生型及びその重鎖変異型(10-110)と、マウス抗インスリン抗体(Fab)の野生型及びその重鎖変異型(9-109)と、ウサギ抗CD80抗体(Fab)の野生型及びその重鎖変異型(9-109)を用いた。これらの検出用抗体(Fab)には、ヒスチジンタグが付加されていた。各検出用抗体を1% BSA含有PBSで段階的に希釈して、濃度の異なる複数のFab溶液を得た。
各抗原をPBS(pH 7.4)で希釈して、各抗原の溶液を調製した。各抗原の溶液をMaxiSorp(商標)平底プレート(Thermo Fisher社)のウェルに添加し、4℃にて一晩静置した。抗原溶液を除去し、ブロッキング溶液(1% BSA含有PBS)を各ウェルに添加してブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、各Fab溶液を各ウェルに100μLずつ添加して、抗原抗体反応を室温で1時間行った。Fab溶液を除去し、各ウェルに洗浄液(1% BSA含有PBS)を添加してウェルを洗浄した。洗浄後、HRP標識抗His Tag抗体(Bethyl Laboratories, Inc.、カタログ番号:A190-114P)の溶液を添加して、抗原抗体反応を室温で行った。抗体溶液を除去し、各ウェルに洗浄液(1% BSA含有PBS)を添加してウェルを洗浄した。洗浄後、ABST基質(Thermo Fisher社)の溶液を各ウェルに添加し、450 nmでの吸光度を測定した。結果を図1〜3に示す。
図1〜3に示されるように、ヒト化抗体、マウス抗体及びウサギ抗体のいずれの改変抗体においても、抗原に対する親和性は、各抗体の野生型とほぼ同じであった。
Claims (14)
- Kabat法に基づく8〜11番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく109及び110番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基とがシステイン残基とされた重鎖を含む、改変抗体。
- 前記8〜11番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基が、置換によりシステイン残基とされた重鎖を含む請求項1に記載の改変抗体。
- 前記109及び110番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基が、置換によりシステイン残基とされた重鎖を含む請求項1又は2に記載の改変抗体。
- Kabat法に基づく9及び10番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基がシステイン残基とされた重鎖を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の改変抗体。
- 以下の1)〜3)のいずれか1つに示されるアミノ酸残基がシステイン残基とされた重鎖を含む請求項1〜4のいずれか1項に記載の改変抗体。
1) Kabat法に基づく9番目のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく109番目のアミノ酸残基;
2) Kabat法に基づく9番目のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく110番目のアミノ酸残基;及び
3) Kabat法に基づく10番目のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく110番目のアミノ酸残基 - 未改変の抗体に比べて熱安定性が向上した抗体である請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変抗体。
- 哺乳動物に由来する抗体である請求項1〜6のいずれか1項に記載の改変抗体。
- 前記哺乳動物が、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ又はウマである請求項7に記載の改変抗体。
- Fab、Fab'、F(ab')2、還元型IgG、IgG、IgA、IgM、IgD又はIgEである請求項1〜8のいずれか1項に記載の改変抗体。
- Kabat法に基づく8〜11番目から選択される少なくとも1つの位置に存在するシステイン残基と、IMGT法に基づく109及び110番目から選択される少なくとも1つの位置に存在するシステイン残基との間にジスルフィド結合が形成されている請求項1〜9のいずれか1項に記載の改変抗体。
- Kabat法に基づく80及び171番目のアミノ酸残基がシステイン残基とされた軽鎖をさらに含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の改変抗体。
- Kabat法に基づく80及び171番目の位置に存在するシステイン残基の間にジスルフィド結合が形成されている請求項11に記載の改変抗体。
- 抗体の熱安定性を向上させる方法であって、
抗体の重鎖において、Kabat法に基づく8〜11番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく109及び110番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基とをシステイン残基とすることを特徴とする、方法。 - 抗体の重鎖において、Kabat法に基づく8〜11番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基と、IMGT法に基づく109及び110番目のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸残基とをシステイン残基とする工程と、
前記工程で得られた改変抗体を回収する工程と
を含む、改変抗体の製造方法。
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