CN113372438A - 改造抗体及其制造方法、以及提高抗体的热稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及改造抗体及其制造方法、以及提高抗体的热稳定性的方法。本发明的课题在于，提供提高抗体的热稳定性的技术和热稳定性提高的抗体。通过使抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基来解决上述课题。
Description
技术领域
本发明涉及热稳定性提高的改造抗体及其制造方法。此外，本发明还涉及提高抗体的热稳定性的方法。
发明背景
以往，已知通过对抗体的氨基酸序列进行改造来提高该抗体的热稳定性的技术。例如，专利文献1中记载了通过将抗体的轻链氨基酸序列中基于Kabat法的第80位和第171位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基来获得热稳定性提高的抗体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2019/0040119号说明书发明概述
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供对重链的氨基酸序列进行改造而提高热稳定性的新抗体及其制造方法、以及提高抗体的热稳定性的新方法。
用于解决课题的方法
本发明提供一种改造抗体，其包含选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基的重链。
本发明提供一种提高抗体的热稳定性的方法，其特征在于，使抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基。
本发明提供一种改造抗体的制造方法，包括：使抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基的工序，以及对该工序中得到的改造抗体进行回收的工序。
发明效果
根据本发明，提供一种与改造前的原来的抗体相比热稳定性提高的抗体。
附图说明
图1为显示用ELISA法对人源化抗HER2抗体(Fab)的野生型和其重链突变型(10-110)对于抗原的亲和性进行分析的结果的曲线图。
图2为显示用ELISA法对小鼠抗胰岛素抗体(Fab)的野生型和其重链突变型(9-109)对于抗原的亲和性进行分析的结果的曲线图。
图3为显示用ELISA法对兔抗CD80抗体(Fab)的野生型和其重链突变型(9-109)对于抗原的亲和性进行分析的结果的曲线图。
具体实施方式
本实施方式的改造抗体的特征在于，包含选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基的重链。这里，将具有使重链中的上述氨基酸残基变为半胱氨酸残基前的氨基酸序列的抗体称为“未改造的抗体”。
本说明书中，也将使未改造的抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基变为半胱氨酸残基称为“对重链进行改造”或“重链的改造”。认为通过这样的重链改造，在存在于从基于Kabat法的第8～11位选择的至少1个位置的半胱氨酸残基与存在于从基于IMGT法的109和第110位选择的至少1个位置的半胱氨酸残基之间形成二硫键。该二硫键形成的结果被认为是，本实施方式的改造抗体与未改造的抗体相比热稳定性提高。以这种方式，本实施方式的改造抗体是热稳定性提高的重链经人工改造的抗体。
抗体的重链中，基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基存在于可变区，基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基存在于恒定区。本说明书中，关于重链的“基于Kabat法”是指，重链可变区的氨基酸残基的编号按照Kabat等的编号方案(参照Kabat E.A.等，具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版，美国国家卫生研究院公共卫生服务局(Public Health Service,National Institutesof Health)，Bethesda,MD(1991),NIH出版号91-3242)。此外，关于重链的“基于IMGT法”是指重链的恒定区的氨基酸残基的编号按照Lefranc等的IMGT唯一编号(参照Lefranc MP.等,发育和比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)29(2005)185-203)。
本实施方式中，未改造的抗体只要具有选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基中的任一方或两方不是半胱氨酸残基的重链即可，没有特别限定。未改造的抗体的重链中变为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以为半胱氨酸残基以外的任意氨基酸残基。
未改造的抗体的重链中，选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基或选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基的情况下，该半胱氨酸残基可以维持原样。基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基和基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基全部为半胱氨酸的抗体不是本实施方式的改造对象。
作为使未改造的抗体的重链中的上述氨基酸残基为半胱氨酸残基的方法，可列举氨基酸残基的替换或插入。本说明书中通过“替换”进行的重链改造是指，将未改造的抗体的重链中从基于Kabat法的第8～11位选择的至少1个位置和/或存在于从基于IMGT法的109和第110位选择的至少1个位置的半胱氨酸残基以外的氨基酸残基替换为半胱氨酸残基。
本说明书中通过“插入”进行的重链改造是指，以存在于未改造的抗体的重链中从基于Kabat法的第8～11位选择的至少1个位置和/或从基于IMGT法的109和第110位选择的至少1个位置的方式新添加半胱氨酸残基。例如，通过插入使未改造的抗体的重链中基于Kabat法的第9位和基于IMGT法的第109位氨基酸残基为半胱氨酸残基的情况下，可以分别在基于Kabat法的第9位和第10位之间以及基于IMGT法的第109位和第110位之间添加半胱氨酸残基。
优选的实施方式中，改造抗体是通过替换对未改造的抗体的重链进行改造而得到的抗体。即，改造抗体优选包含选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基通过替换变为半胱氨酸残基的重链。此外，改造抗体优选包含选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基通过替换变为半胱氨酸残基的重链。
本实施方式中，未改造的抗体可以为识别任意抗原的抗体。此外，未改造的抗体可以为具有天然氨基酸序列的抗体(野生型抗体)，也可以为人工制造的抗体。人工制造的抗体是指基于本实施方式中重链的改造以外的方法人工改变了氨基酸序列的抗体。作为这样的抗体，可列举例如改变了CDR的氨基酸序列的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等。
优选实施方式中，未改造的抗体是其基因的碱基序列是公知的或可确认其碱基序列的抗体。具体地，是公知数据库中公开了抗体基因的碱基序列的抗体、或可得到产生该抗体的杂交瘤的抗体。作为这样的数据库，可列举例如GeneBank、abYsis、IMGT等。在有产生未改造的抗体的杂交瘤的情况下，抗体基因的碱基序列可以通过下述方法获得：通过公知方法从该杂交瘤获得抗体基因，对其碱基序列进行测序。
未改造的抗体和本实施方式的改造抗体可以为来源于任何动物的抗体。作为这样的动物，优选为哺乳动物，可列举例如人、小鼠、兔、大鼠、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马等。其中优选人、小鼠和兔。
未改造的抗体和本实施方式的改造抗体的类别可以为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE中的任一种，优选为IgG。IgG的亚类没有特别限定，可以为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任一种。本实施方式中，未改造的抗体和改造抗体重链的亚类没有特别限定。来源于人的情况下，重链的亚类可以为γ1、γ2、γ3和γ4中的任一种；来源于小鼠的情况下，重链的亚类可以为γ1、γ2a、γ2b和γ3中的任一种。
未改造的抗体只要重链中具有基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基和基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基，也可以是抗体片段的形态。本实施方式的改造抗体只要包含通过重链的改造导入的半胱氨酸残基，也可以是抗体片段的形态。作为这样的抗体片段，可列举例如Fab、Fab'、F(ab')2和还原型IgG(reduced IgG)等。其中，特别优选Fab。
本实施方式中，改造抗体的重链可以具有未改造的抗体重链的全长序列，也可以具有未改造的抗体重链的部分序列。例如，未改造的抗体为完整抗体(例如IgG)、改造抗体为抗体片段(例如Fab)的情况下，处于抗体片段的形态的改造抗体的重链具有未改造的抗体重链的部分序列。
如上所述，本实施方式的改造抗体与未改造的抗体相比热稳定性提高。抗体的热稳定性一般可以通过测定伴随热压力变性的抗体的量或比率的方法来评价。这样的测定方法本身在本技术领域是公知的，例如可列举利用差示扫描量热仪(DSC)、CD谱、荧光光谱、傅立叶变换红外分光光度计(FTIR)等进行的测定。本实施方式中，改造抗体的热稳定性优选用由通过DSC测定获得的信息来评价。作为这样的信息，例如可以为Tm(热容量为最大值时的温度)，也可以为分析峰值本身。
本实施方式中，通过DSC测得的改造抗体的Tm值比未改造的抗体的Tm值高。例如，通过DSC测得的改造抗体的Tm值比未改造的抗体的Tm值至少高约1℃，优选至少高约2℃，更优选至少高约3℃。
本实施方式中改造的氨基酸残基不是CDR的氨基酸残基，因此被认为不会使抗体对于抗原的亲和性下降至在实用上产生问题的程度。抗体对于抗原的亲和性可以通过ELISA法等免疫学测定方法进行评价，也可以通过抗原抗体反应中的动力学参数(结合速度常数、解离速度常数和解离常数)进行评价。动力学参数可以通过表面等离子共振(SPR)技术获得。
优选实施方式中，改造抗体包含选自由基于Kabat法的第9和第10位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基变为半胱氨酸残基的重链。这样的改造抗体中，特别优选包含以下的1)～3)中任一个所示的氨基酸残基变为半胱氨酸残基的重链的改造抗体。
1)基于Kabat法的第9位氨基酸残基和基于IMGT法的第109位氨基酸残基，
2)基于Kabat法的第9位氨基酸残基和基于IMGT法的第110位氨基酸残基，
以及
3)基于Kabat法的第10位氨基酸残基和基于IMGT法的第110位氨基酸残基。
本实施方式中，也可以以不仅是重链、在轻链中也在可变区与恒定区之间形成二硫键的方式进行改造。即，本实施方式的改造抗体可以包含基于Kabat法的第80和171位氨基酸残基为半胱氨酸残基的轻链。这样的轻链改造本身是公知的，专利文献1中有记载(美国专利申请公开第2019/0040119号说明书通过参照并入本说明书)。这里，关于轻链的“基于Kabat法”是指轻链的可变区的氨基酸残基的编号按照上述Kabat等的编号方案，轻链的恒定区的氨基酸残基的编号按照Kabat等的EU Index。EU Index记载在Kabat等的上述文献中。轻链的亚类没有特别限定，优选为κ链。
本说明书中，也将使未改造的抗体的轻链中基于Kabat法的第80位和第171位氨基酸残基变为半胱氨酸残基的操作称为“对轻链进行改造”或“轻链的改造”。本实施方式中，未改造的抗体轻链的改造可以与重链的改造同样地通过氨基酸残基的替换或插入来进行。这样的经改造的轻链中，认为在存在于基于Kabat法的第80和171位位置的半胱氨酸残基之间形成有二硫键。具有经改造的轻链和重链的本实施方式的改造抗体中，通过轻链和重链分别形成二硫键，热稳定性可以进一步提高。
作为本实施方式的改造抗体的具体例子，分别对人源化抗HER2抗体和兔抗CD80抗体的改造抗体进行说明。以下也将本实施方式的改造抗体表述为“重链突变型(X-Y)”。X为8、9、10或11，Y为109或110。“重链突变型(X-Y)”表示未改造的抗体的重链中基于Kabat法的第X位氨基酸残基和基于IMGT法的第Y位氨基酸残基变为半胱氨酸残基的改造抗体。
此外，以下也将具有基于Kabat法的第80和171位氨基酸残基为半胱氨酸残基的轻链、且具有未经改造的重链的抗体表述为“轻链突变型(80-171)”。进一步，以下也将具有轻链突变型(80-171)的轻链和重链突变型(X-Y)的重链的本实施方式的改造抗体表述为“轻链-重链突变型(80-171/X-Y)”。X为8、9、10或11，Y为109或110。“轻链-重链突变型(80-171/X-Y)”表示未改造的抗体的重链中第X位氨基酸残基和第Y位氨基酸残基变为半胱氨酸残基、且未改造的抗体的轻链中第80位和第171位氨基酸残基变为半胱氨酸残基的改造抗体。
表1中显示了人源化抗HER2抗体的野生型(曲妥珠单抗)的Fab片段中重链的氨基酸序列。表1中，下划线部表示可变区，用灰色标出的部分表示CDR，用□圈出的残基表示基于Kabat法的可变区第8～11位氨基酸残基以及基于IMGT法的恒定区第109位和第110位氨基酸残基。需说明的是，表1所示氨基酸序列中，恒定区中的用□圈出的残基相当于第208和209位，但在IMGT法中，将它们作为第109位和第110位氨基酸残基进行编号。
[表1]
人源化抗HER2抗体野生型的Fab片段的重链
人源化抗HER2抗体重链的各CDR和可变区的氨基酸序列如下。
·重链CDR1：DTYIH(序列编号2)
·重链CDR2：RIYPTNGYTRYADSVKG(序列编号3)
·重链CDR3：WGGDGFYAMDY(序列编号4)
·可变区：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(序列编号5)
表2和3中显示了人抗HER2抗体的各突变型的Fab片段中重链的氨基酸序列。表2和3中，下划线部表示可变区，用灰色标出的部分表示CDR，用□圈出的残基表示基于Kabat法的可变区的第X位氨基酸残基和基于IMGT法的恒定区的第Y位氨基酸残基。
[表2]
人源化抗HER2抗体的重链突变型(8-109)的Fab片段的重链
人源化抗HER2抗体的重链突变型(8-110)的Fab片段的重链
人源化抗HER2抗体的重链突变型(9-109)的Fab片段的重链
人源化抗HER2抗体的重链突变型(9-110)的Fab片段的重链
[表3]
人源化抗HER2抗体的重链突变型(10-109)的Fab片段的重链
人源化抗HER2抗体的重链突变型(10-110)的Fab片段的重链
人源化抗HER2抗体的重链突变型(11-109)的Fab片段的重链
人源化抗HER2抗体的重链突变型(11-110)的Fab片段的重链
表4中显示了人源化抗HER2抗体野生型的重链的全长序列。表4中，用灰色标出的部分表示CDR。
[表4]
人源化抗HER2抗体野生型的重链
表5中显示了人源化抗HER2抗体野生型的轻链(κ)的全长序列和其突变型的氨基酸序列。表5中，下划线部表示可变区，用灰色标出的部分表示CDR，用□圈出的残基表示基于Kabat法的第80位和第171位氨基酸残基。
[表5]
人源化抗HER2抗体野生型的轻链
人源化抗HER2抗体的轻链突变型(80-171)的轻链
人源化抗HER2抗体轻链的各CDR和可变区的氨基酸序列如下。
·轻链CDR1：RASQDVNTAVA(序列编号17)
·轻链CDR2：SASFLYS(序列编号18)
·轻链CDR3：QQHYTTPPT(序列编号19)
·可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTV(序列编号20)
表6中显示了兔抗CD80抗体野生型的Fab片段中重链的氨基酸序列。表6中，下划线部表示可变区，用灰色标出的部分表示CDR，用□圈出的残基表示基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基和基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基。需说明的是，表6所示氨基酸序列中，可变区中的用□圈出的残基相当于第7～10位，但在兔抗体的情况下，通过Kabat法进行编号，是从第2位开始的，因而用□圈出的残基成为基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基。此外，表6所示氨基酸序列中，恒定区中的用□圈出的残基相当于第205和206位，但在IMGT法中，将它们作为第109位和第110位氨基酸残基进行编号。
[表6]
兔抗CD80抗体野生型的Fab片段的重链
表7和8中显示了兔抗CD80抗体的各突变型的Fab片段中重链的氨基酸序列。表7和8中，下划线部表示可变区，用灰色标出的部分表示CDR，用□圈出的残基表示基于Kabat法的第X位氨基酸残基和基于IMGT法的第Y位氨基酸残基。X为8、9、10或11，Y为109或110。
[表7]
兔抗CD80抗体的重链突变型(8-109)的Fab片段的重链
兔抗CD80抗体的重链突变型(8-110)的Fab片段的重链
兔抗CD80抗体的重链突变型(9-109)的Fab片段的重链
兔抗CD80抗体的重链突变型(9-110)的Fab片段的重链
[表8]
兔抗CD80抗体的重链突变型(10-109)的Fab片段的重链
兔抗CD80抗体的重链突变型(10-110)的Fab片段的重链
兔抗CD80抗体的重链突变型(11-109)的Fab片段的重链
兔抗CD80抗体的重链突变型(11-110)的Fab片段的重链
表9中显示了兔抗CD80抗体野生型的轻链(κ)的全长序列和其突变型的氨基酸序列。表9中，下划线部表示可变区，用灰色标出的部分表示CDR，用□圈出的残基表示基于Kabat法的第80位和第171位氨基酸残基。需说明的是，表9所示氨基酸序列中，恒定区中的用□圈出的残基相当于第172位，由于CDR长度的关系，在Kabat法中，该残基成为第171位氨基酸残基。
[表9]
兔抗CD80抗体野生型的轻链
兔抗CD80抗体的轻链突变型(80-171)的轻链
本实施方式的改造抗体的使用方法与未改造的抗体相比没有特殊变化的地方。改造抗体与未改造的抗体同样可以用于各种试验和研究、或者抗体医药等。此外，本实施方式的改造抗体可以用本技术领域公知的标记物等进行修饰。
本实施方式的提高抗体的热稳定性的方法(以下也称为“提高热稳定性的方法”)中，使抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基。通过该重链的改造，抗体的热稳定性与未改造的抗体相比提高。即，重链通过本实施方式的提高热稳定性的方法被改造的抗体与上述本实施方式的改造抗体是同样的。
本实施方式的提高热稳定性的方法作为对象的抗体与上述未改造的抗体是同样的。作为使未改造的抗体的重链中上述氨基酸残基为半胱氨酸残基的方法，可列举氨基酸残基的替换或插入。氨基酸残基的替换和插入可以通过DNA重组技术和其他分子生物学技术等公知方法来进行。例如，有产生未改造的抗体的杂交瘤的情况下，如后述实施例1所示，使用从该杂交瘤提取的RNA，通过逆转录反应和RACE(Rapid Amplification of cDNAends，cDNA末端快速扩增)法，分别合成编码轻链的聚核苷酸和编码重链的聚核苷酸。通过利用PCR法、使用用于对重链进行改造的引物对编码重链的聚核苷酸进行扩增，获得编码经改造的重链的聚核苷酸。例如将未改造的抗体的重链中基于Kabat法的第9位和基于IMGT法的第109位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基的情况下，通过利用PCR法、使用用于将这些氨基酸残基替换为半胱氨酸残基的引物对编码重链的聚核苷酸进行扩增，获得编码在基于Kabat法的第9位和基于IMGT法的第109位位置具有半胱氨酸残基的重链的聚核苷酸。通过将得到的聚核苷酸与编码未改造的抗体轻链的聚核苷酸一起插入本技术领域公知的表达用载体，获得包含编码本实施方式的改造抗体的聚核苷酸的表达载体。
编码轻链的聚核苷酸和编码重链的聚核苷酸可以插入1个表达载体，也可以分别插入2个表达载体。表达载体的种类没有特别限定，可以为哺乳动物细胞用表达载体，也可以为大肠杆菌用表达载体。通过用得到的表达载体对适当的宿主细胞(例如哺乳动物细胞或大肠杆菌)进行转化或转染，能够获得改造抗体。
没有产生未改造的抗体的杂交瘤的情况下，例如可以通过Kohler和Milstein自然(Nature)第256卷第495-497页、1975中记载的方法等公知方法制作产生抗体的杂交瘤。或者，也可以使用从用规定的抗原免疫的小鼠、兔等动物的外周血或脾脏获得的RNA。使用从外周血或脾脏获得的RNA的情况下，如后述实施例1所示，可以从该RNA合成cDNA，由得到的cDNA制作Fab噬菌体文库。可以使用该文库，通过噬菌体展示法等，获得编码作为未改造的抗体的Fab的聚核苷酸。通过利用上述那样的PCR法对得到的聚核苷酸进行扩增，能够获得编码作为本实施方式的改造抗体的Fab的聚核苷酸。通过将得到的聚核苷酸插入本技术领域公知的表达用载体，获得包含编码本实施方式的改造抗体的Fab片段的聚核苷酸的表达载体。通过用得到的表达载体对适当的宿主细胞进行转化或转染，能够获得改造抗体的Fab片段。
以往已知通过在抗体的氨基酸序列中导入突变来改变该抗体对于抗原的亲和性的技术。但存在下述情况：由于突变的导入，即使对于抗原的亲和性如愿被改造，抗体的热稳定性也会同时下降。抗体的热稳定性与抗体的保存稳定性、抗凝集性相关，因而被用作抗体医药开发中的一个指标。如上所述，本实施方式的改造抗体和与未改造的抗体同样的抗原结合，对于该抗原的亲和性也与未改造的抗体为同等程度。因此，如果将本实施方式的提高热稳定性的方法应用于例如由于突变的导入、虽然对于抗原的亲和性提高、但热稳定性下降的突变抗体，则能够在维持该抗体对于抗原的亲和性的状态下提高热稳定性。
根据本实施方式的改造抗体的制造方法(以下也称为“制造方法”)，能够获得上述本实施方式的改造抗体。本实施方式的制造方法中，首先，使抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基。在本实施方式的制造方法中对重链进行改造的抗体与上述未改造的抗体是同样的。使未改造的抗体的重链中上述氨基酸残基为半胱氨酸残基的方法的详细情况与关于本实施方式的提高热稳定性的方法的描述是同样的。
接下来，对通过上述重链的改造得到的抗体进行回收。例如，将表达改造抗体的宿主细胞在含有适当增溶剂的溶液中溶解，使改造抗体在该溶液中游离。上述宿主细胞将改造抗体分泌至培养基中的情况下，对培养上清进行回收。游离的改造抗体可以通过亲和色谱等公知方法来回收。例如，制造的改造抗体为IgG的情况下，可以通过使用Protein A或G的亲和色谱来回收。也可以根据需要通过凝胶过滤等公知方法对回收的改造抗体进行纯化。
本发明的范围包括编码本实施方式的改造抗体或其片段的被分离且纯化的聚核苷酸。编码本实施方式的改造抗体的片段的被分离且纯化的聚核苷酸优选编码从基于Kabat法的第8～11位选择的至少1个位置包含半胱氨酸残基的重链的可变区和从基于IMGT法的第109位和第110位选择的至少1个位置包含半胱氨酸残基的重链的恒定区。本发明的范围也包括包含上述聚核苷酸的载体。载体是为了转化或转染而设计的聚核苷酸构建物。载体的种类没有特别限定，可以从表达载体、克隆载体、病毒载体等本技术领域公知的载体适当选择。此外，本发明的范围还包括包含该载体的宿主细胞。宿主细胞的种类没有特别限定，可以从真核细胞、原核细胞、哺乳动物细胞等适当选择。
上述提高热稳定性的方法可以应用于公知的作为医药组合物的有效成分的抗体。本发明的另一实施方式为以药理学上的有效量含有上述改造抗体的医药组合物。例如该医药组合物所含的抗体的重链具有CDR1：DTYIH(序列编号2)、CDR2：RIYPTNGYTRYADSVKG(序列编号3)和CDR3：WGGDGFYAMDY(序列编号4)。该抗体的重链可以包含序列编号6～13中任一个记载的氨基酸序列。该抗体的重链可以包含序列编号14的氨基酸序列。该抗体可以进一步包含轻链。例如该抗体的轻链具有CDR1：RASQDVNTAVA(序列编号17)、CDR2：SASFLYS(序列编号18)和CDR3：QQHYTTPPT(序列编号19)。该抗体的轻链可以包含序列编号15或16的氨基酸序列。
该医药组合物可以含有医学上允许的添加物。这样的添加物可以从本技术领域的公知添加物适当选择。可列举例如赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、胶囊基剂、增塑剂、着色剂、溶剂、稳定剂、保存剂、缓冲剂、止痛剂、基剂、乳化剂、悬浮化剂、矫味剂、甜味剂、吸附剂、助溶剂、pH调节剂、增稠剂、等渗剂、分散剂、防腐剂、润湿剂、香料、抗氧化剂等。
医药组合物的制剂形态没有特别限定，例如可以为固体制剂、半固体制剂、液体制剂、注射剂、栓剂等其他本领域技术人员公知的制剂形态的任一种。作为具体的剂型，可列举例如锭剂、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖锭剂、注射剂、液剂、酏剂、糖浆剂、柠檬水剂、栓剂、软膏剂、悬浮剂、乳剂、搽剂、乳液剂、经皮吸收型制剂、贴剂、糊剂、气雾剂等，但不限于此。
本发明的另一实施方式涉及使用上述医药组合物的治疗方法。本实施方式的治疗方法包括用医药组合物对患者进行给药的工序。
以下通过实施例详细地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。
[实施例]
参考例
分别由小鼠抗体、人源化抗体和兔抗体的三维结构数据，从各区域找出重链中处于可变区与恒定区接近部位的氨基酸残基，用软件算出这些氨基酸残基间的距离。
(1)可变区与恒定区之间接近的氨基酸残基
将小鼠抗胰岛素抗体和兔抗CD80抗体各自的重链氨基酸序列输入DiscoveryStudio 2017R2，通过自动同源性建模功能得到重链的三维结构数据。然后，使各抗体重链的立体结构图像化。此外，从Protein Data Bank(PDB)下载人源化抗HER2抗体(曲妥珠单抗)的三维结构数据，将该数据输入Discovery Studio 2017R2，使重链的立体结构图像化。结果可见，任一抗体的重链中，包含可变区第8～11位氨基酸残基的部分与包含恒定区第108～111位氨基酸残基的部分都是接近的。
(2)接近的氨基酸残基间的距离
基于三维结构数据，用Discovery Studio 2017R2算出可变区第8～11位各氨基酸残基的α碳与恒定区第108～111位各氨基酸残基的α碳之间的距离
将结果示于表10～12。
[表10]
小鼠抗胰岛素抗体
[表11]
人源化抗HER2抗体
[表12]
兔抗CD80抗体
如表10～12中粗框所示，可见，任一抗体的重链中，基于Kabat法的第8～11位各氨基酸残基与基于IMGT法的第109位和第110位各氨基酸残基更为接近。
实施例1：改造抗体的制作
对于人源化抗体、小鼠抗体和兔抗体，分别以在可变区与恒定区之间形成二硫键的方式将上述参考例中确定的氨基酸残基替换为半胱氨酸残基，制作改造抗体。
(1)各抗体基因的获得
(1.1)人源化抗体基因的获得
委托金斯瑞日本株式会社合成人源化抗HER2单克隆抗体(曲妥珠单抗)的基因，获得包含人源化抗HER2抗体基因的质粒DNA。
(1.2)小鼠抗体基因的获得
如下操作，获得小鼠抗胰岛素抗体的基因。
[试剂]
ISOGEN(株式会社日本基因)
SMARTer(注册商标)RACE 5'/3'试剂盒(clontech公司)
10x A-attachment mix(东洋纺株式会社)
pcDNA(商标)3.4TOPO(注册商标)TA克隆试剂盒(Thermo Fisher公司)
Competent high DH5α(东洋纺株式会社)
QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN公司)
KOD plus neo(东洋纺株式会社)
Ligation high ver.2(东洋纺株式会社)
(i)从产生抗体的杂交瘤提取总RNA
抗原使用人胰岛素，通过Kohler和Milstein自然(Nature)第256卷,第495-497页,1975中记载的方法，制作产生小鼠抗人胰岛素抗体的杂交瘤。在1000rpm下对该杂交瘤的培养物(10mL)进行5分钟离心处理后，将上清除去。将得到的细胞用ISOGEN(1mL)溶解，室温静置5分钟。在其中添加氯仿(200μL)，搅拌15秒后，室温静置3分钟。然后，在4℃、12000×G下对其进行10分钟离心处理，回收含有RNA的水相(500μL)。在回收的水相中添加异丙醇(500μL)并混合。将得到的混合物室温静置5分钟后，在4℃、12000×G下进行10分钟离心处理。将上清除去，在得到的沉淀物(总RNA)中添加70％乙醇(1mL)，4℃、7500×G下进行10分钟离心处理。将上清除去，使RNA风干，溶解在无RNase水(20μL)中。
(ii)cDNA的合成
使用上述(i)中得到的各总RNA，制备以下组成的RNA样品。
[RNA样品]
将制备的RNA样品在72℃加热3分钟后，42℃温育2分钟。然后，在RNA样品中添加12μM SMARTerIIA寡核苷酸(1μL)，制备cDNA合成用样品。使用该cDNA合成用样品，制备以下组成的逆转录反应液。
[逆转录反应液]
使制备的逆转录反应液在42℃反应90分钟。然后，将反应液在70℃加热10分钟，添加TRICINE-EDTA(50μL)。使用得到的溶液作为cDNA样品，制备以下组成的5'RACE反应液。
[5'RACE反应液]
在下述反应条件下，将制备的5'RACE反应液用于RACE反应。下述“t”在轻链中为90秒，在重链中为150秒。
[反应条件]
94℃2分钟，
98℃10秒、50℃30秒、68℃t秒，30个循环，并且
68℃3分钟。
使用上述反应中得到的5’RACE产物，制备以下组成的溶液。使该溶液在60℃反应30分钟，在5’RACE产物的末端添加腺嘌呤。
使用得到的添加有腺嘌呤的产物和pcDNA(商标)3.4TOPO(注册商标)TA克隆试剂盒，制备以下组成的TA克隆反应液。将该反应液室温温育10分钟，将添加有腺嘌呤的产物克隆至pCDNA3.4。
[TA克隆反应液]
(iii)转化、质粒提取和序列的确认
将上述(ii)中得到的TA克隆样品(3μL)添加在DH5α(30μL)中，冰上静置30分钟后，将混合物在42℃加热45秒进行热激。再次在冰上静置2分钟后，全量涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上。将该平板在37℃温育16小时。将平板上的单菌落接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养16小时(250rpm)。在5000×G下对培养物进行5分钟离心处理，回收大肠杆菌的转化子。用QIAprep Spin Miniprep试剂盒从回收的大肠杆菌提取质粒。具体操作按照该试剂盒所附手册来进行。使用pCDNA3.4载体引物对得到的质粒的碱基序列进行确认。通过以上操作，获得包含小鼠抗胰岛素抗体基因的质粒DNA。
(1.3)兔抗体基因的获得
从用CD80免疫的兔的外周血获得淋巴细胞，从该淋巴细胞提取mRNA，合成cDNA。使用用于克隆抗体基因的公知引物，对得到的cDNA进行扩增，制作Fab噬菌体文库。使用得到的文库，通过公知的Fab噬菌体展示法和生物淘选(参照Lang IM,Barbas CF 3rd,SchleefRR.,来自针对人类alpha颗粒的噬菌体展示文库的具有与1型纤溶酶原激活剂抑制剂结合活性的重组兔Fab(Recombinant rabbit Fab with binding activity to type-1plasminogen activator inhibitor derived from a phage-display library againsthuman alpha-granules),(1996)基因(Gene)172(2):295-8和Philippa M.O'Brien,RobertAitken,抗体的噬菌体展示(Antibody Phage Display),(2002)分子生物学方法(Methodsin Molecular Biology)第178卷)，得到兔抗CD80抗体的Fab克隆。将获得的兔抗CD80抗体的Fab克隆的基因插入包含编码兔抗体的Fc区域的基因的质粒DNA，获得包含兔抗CD80抗体基因的质粒DNA。
(2)各抗体的突变型基因的获得
(2.1)引物设计和PCR
基于各抗体基因的碱基序列，设计用于将重链中可变区第9位或第10位氨基酸残基、以及恒定区第109位或第110位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基的引物。此外，为了进一步在各抗体中导入专利文献1记载的轻链的突变，设计用于将各抗体的轻链中可变区第80位氨基酸残基和恒定区第171位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基的引物。
使用包含各抗体基因的质粒DNA作为模板，制备以下组成的PCR反应液。
[PCR反应液]
在下述反应条件下，将制备的PCR反应液用于PCR反应。
[反应条件]
98℃2分钟，
98℃10秒、54℃30秒、68℃4分钟，30个循环，并且
68℃3分钟。
在得到的PCR产物(50μL)中添加2μL DpnI(10U/μL)，使PCR产物片段化。使用经DpnI处理的PCR产物，制备以下组成的连接反应液。将该反应液在16℃温育1小时，进行连接反应。
[连接反应液]
(2.2)转化、提取质粒DNA和序列的确认
将连接反应后的溶液(3μL)添加在DH5α(30μL)中，与上述(1.2)(iii)同样操作，得到大肠杆菌的转化子。用QIAprep Spin Miniprep试剂盒从得到的大肠杆菌提取质粒DNA。使用pCDNA3.4载体引物，对得到的各质粒DNA的碱基序列进行确认。以下使用这些质粒DNA作为哺乳动物细胞表达用质粒。
(3)哺乳动物细胞中的表达
[试剂]
Expi293(商标)细胞(Invitrogen公司)
Expi293(商标)Expression培养基(Invitrogen公司)
ExpiFectamine(商标)293转染试剂盒(Invitrogen公司)
(3.1)转染
Expi293细胞在5％CO2气氛下、37℃振荡培养(150rpm)进行繁殖。准备与样品数相应数量的30mL细胞培养物(3.0×106cells/mL)。使用编码各抗体的野生型和突变型的质粒DNA，制备以下组成的DNA溶液，静置5分钟。
[DNA溶液]
制备以下组成的转染试剂，静置5分钟。
将制备的DNA溶液与转染试剂混合，静置20分钟。将得到的混合液(3mL)添加在细胞培养物(30mL)中，5％CO2气氛下、37℃振荡培养(150rpm)20小时。20小时后，在各培养物中分别添加150μL和1.5mL的ExpiFectamine(商标)转染增强剂1和2，5％CO2气氛下、37℃振荡培养(150rpm)6天。
(3.2)抗体的回收和纯化
在3000rpm下对各细胞培养物进行5分钟离心处理，回收培养上清。培养上清中含有从被转染的Expi293(商标)细胞分泌的各抗体。再次在15000×G下对得到的培养上清进行10分钟离心处理，回收上清。用HiTrap Protein A HP Column(GE医疗公司)对得到的上清进行纯化。进一步用Superdex 200Increase 10/300GL Column(GE医疗公司)对得到的溶液进行纯化，获得抗体溶液。关于纯化的具体操作按照各Column所附文件来进行。
(4)结果
得到人源化抗HER2抗体的野生型(曲妥珠单抗)、以及作为其改造抗体的重链突变型(9-109)、重链突变型(10-110)和轻链-重链突变型(80-171/10-110)。人源化抗HER2抗体的野生型具有包含序列编号1所示氨基酸序列的重链。人源化抗HER2抗体的重链突变型(9-109)和重链突变型(10-110)分别具有包含序列编号8和11所示氨基酸序列的重链。人源化抗HER2抗体的轻链-重链突变型(80-171/10-110)具有包含序列编号11所示氨基酸序列的重链和包含序列编号16所示氨基酸序列的轻链。
得到兔抗CD80抗体的野生型、以及作为其改造抗体的重链突变型(9-109)、重链突变型(9-110)、重链突变型(10-110)、轻链-重链突变型(80-171/9-109)和轻链-重链突变型(80-171/9-110)。兔抗CD80抗体的野生型具有包含序列编号21所示氨基酸序列的重链。兔抗CD80抗体的重链突变型(9-109)、重链突变型(9-110)和重链突变型(10-110)分别具有包含序列编号24、25和27所示氨基酸序列的重链。兔抗CD80抗体的轻链-重链突变型(80-171/9-109)具有包含序列编号24所示氨基酸序列的重链和包含序列编号31所示氨基酸序列的轻链。兔抗CD80抗体的轻链-重链突变型(80-171/9-110)具有包含序列编号25所示氨基酸序列的重链和包含序列编号31所示氨基酸序列的轻链。
得到小鼠抗胰岛素抗体的野生型、以及作为其改造抗体的重链突变型(9-109)、重链突变型(10-110)、轻链-重链突变型(80-171/9-109)和轻链-重链突变型(80-171/10-110)。小鼠抗胰岛素抗体的重链突变型(9-109)是野生型抗体的重链中基于Kabat法的可变区第9位氨基酸残基和基于IMGT法的恒定区第109位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基的抗体。小鼠抗胰岛素抗体的重链突变型(10-110)是野生型抗体的重链中基于Kabat法的可变区第10位氨基酸残基和基于IMGT法的恒定区第110位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基的抗体。小鼠抗胰岛素抗体的轻链-重链突变型(80-171/10-110)是野生型抗体的重链中基于Kabat法的可变区第9位氨基酸残基和基于IMGT法的恒定区第109位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基、且野生型抗体的轻链中基于Kabat法的可变区第80位氨基酸残基和恒定区第171位氨基酸残基替换为半胱氨酸残基的抗体。
实施例2：改造抗体的热稳定性
对实施例1中制作的各抗体的野生型和它们的改造抗体的热稳定性进行检测。
(1)热稳定性的测定
通过常规方法，由实施例1中得到的各抗体得到Fab片段。通过凝胶过滤将含有各抗体的Fab片段的溶液的溶剂替换为差示扫描量热仪(DSC)的测定中使用的缓冲液(磷酸缓冲生理盐水：PBS)。凝胶过滤的条件如下所述。
[凝胶过滤的条件]
缓冲液：PBS(pH 7.4)
使用的色谱柱：Superdex 200Increase 10/300(GE医疗公司)
色谱柱体积(CV)：24mL
样品体积：500μL
流速：1.0mL/min
洗脱量：1.5CV
级分体积：500μL
将含有各抗体的Fab片段的级分用PBS稀释，制备样品(终浓度5μM)。使用MicroCalPEAQ-DSC(Malvern Instruments Ltd公司)，测定各抗体的Fab片段的Tm值。测定条件如下所述。
[DSC测定条件]
样品量：400μL
测定范围：30℃～100℃
升温速度：1℃/分钟
(2)结果
将通过DSC测定获得的各抗体的Tm值示于以下的表13～15。表中，“ΔTm(℃)”是各突变型的Tm值与野生型的Tm值之差。
[表13]
| 小鼠抗胰岛素抗体(Fab) | Tm(℃) | ΔTm(℃) |
| 野生型 | 77.1 | - |
| 重链突变型(9-109) | 79.3 | 2.2 |
| 重链突变型(10-110) | 79.2 | 2.1 |
| 轻链-重链突变型(80-171/9-109) | 83.3 | 6.2 |
| 轻链-重链突变型(80-171/10-110) | 83.0 | 5.9 |
[表14]
| 人源化抗HER2抗体(Fab) | Tm(℃) | ΔTm(℃) |
| 野生型 | 81.9 | - |
| 重链突变型(9-109) | 83.8 | 1.9 |
| 重链突变型(10-110) | 86.0 | 4.1 |
| 轻链-重链突变型(80-171/10-110) | 89.7 | 7.8 |
[表15]
| 兔抗CD80抗体(Fab) | Tm(℃) | ΔTm(℃) |
| 野生型 | 79.8 | - |
| 重链突变型(9-109) | 82.1 | 2.3 |
| 重链突变型(10-110) | 83.5 | 3.7 |
| 重链突变型(9-110) | 82.8 | 3.0 |
| 轻链-重链突变型(80-171/9-109) | 85.3 | 5.5 |
| 轻链-重链突变型(80-171/9-110) | 86.8 | 7.0 |
如表13～15所示，人源化抗体、小鼠抗体和兔抗体的任一改造抗体中，与各抗体的野生型相比，Tm值均高约2～4℃。因此表明，本实施方式的改造抗体与原来的抗体相比是热稳定性提高的抗体。此外，轻链-重链突变型的Tm值与野生型相比高5℃以上。由此表明，通过以不仅是重链、轻链中也形成二硫键的方式进行改造，热稳定性能够进一步提高。
实施例3：改造抗体的凝集性
对人源化抗HER2抗体的野生型和其改造抗体的凝集性进行检测。作为改造抗体，使用实施例1中制作的轻链-重链突变型(80-171/10-110)、以及使用实施例1的轻链改造用引物组制作的轻链突变型(80-171)。
(1)扩散系数的测定
通过凝胶过滤将含有各抗体的溶液的溶剂替换为PBS(pH 7.4)。将含有各抗体的级分用PBS稀释，制备样品(终浓度12.5～100μM)。使用Zetasizer Nano ZSP(Malvern公司)，通过动态光散射(DLS)法，在25℃测定各抗体的扩散系数。根据DLS的测定结果，x轴绘制的是抗体浓度，y轴绘制的是扩散系数(μm2/s)。通过最小二乘法算出绘制的数据的回归直线，获得回归直线的斜率和截距。求出最小二乘法中Σ{yk-(axk+b)}2的值最小的a和b。
(2)热稳定性的测定
通过凝胶过滤将含有各抗体的溶液的溶剂替换为PBS(pH 7.4)。将含有各抗体的级分用PBS稀释，制备样品(终浓度5μM)。使用MicroCal PEAQ-DSC(Malvern InstrumentsLtd公司)测定各抗体的Tm值。凝胶过滤和DSC测定的条件与实施例1中描述的条件是同样的。
(3)结果
将各抗体的回归直线计算式示于以下的表16。表中，“ΔTm(℃)”是各突变型的Tm值与野生型的Tm值之差。此外，“凝集性”表示基于回归直线斜率的值对各突变型的凝集性相对于野生型抗体的变化进行评价的结果。
[表16]
| 人源化抗HER2抗体 | ΔTm(℃) | 回归直线 | 凝集性 |
| 野生型 | 0 | y＝-1.7x+68.8 | - |
| 轻链突变型(80-171) | +3.4 | y＝-1.6x+69.8 | 无变化 |
| 轻链-重链突变型(80-171/10-110) | +7.8 | y＝-0.9x+68.3 | 改善 |
已知，在对抗体浓度和扩散系数进行绘图的曲线图中的回归直线中，斜率的值越接近0则意味着溶液中的抗体越分散。由表16可见，轻链突变型(80-171)的凝集性与野生型相比几乎没有变化，轻链-重链突变型(80-171/10-110)的凝集性与野生型相比有改善。该结果提示，通过对重链和轻链两方进行改造，能够改善凝集性。
实施例4：改造抗体对于抗原的亲和性
通过ELISA法对实施例1中制作的各抗体的野生型和它们的突变型对于抗原的亲和性进行检测。
(1)利用ELISA法的测定
(1.1)抗原和检测用抗体
作为人抗HER2抗体的抗原，使用HER2蛋白(R&D Systems公司，目录编号：1129-ER)。作为小鼠抗胰岛素抗体的抗原，使用Humulin R注100单位(Eli Lilly公司)。作为兔抗CD80抗体的抗原，使用CD80蛋白(R&D Systems公司，目录编号：140-B1)。作为检测用抗体，使用人源化抗HER2抗体(Fab)的野生型和其重链突变型(10-110)、小鼠抗胰岛素抗体(Fab)的野生型和其重链突变型(9-109)、以及兔抗CD80抗体(Fab)的野生型和其重链突变型(9-109)。这些检测用抗体(Fab)带有组氨酸标签。将各检测用抗体用含有1％BSA的PBS进行梯度稀释，得到浓度不同的多个Fab溶液。
(1.2)测定
将各抗原用PBS(pH 7.4)稀释，制备各抗原的溶液。将各抗原的溶液添加在MaxiSorp(商标)平底板(Thermo Fisher公司)的孔中，4℃静置过夜。将抗原溶液除去，在各孔中添加封闭溶液(含有1％BSA的PBS)进行封闭。将封闭溶液除去后，在各孔中添加各Fab溶液，每孔100μL，室温进行1小时抗原抗体反应。将Fab溶液除去，在各孔中添加洗涤液(含有1％BSA的PBS)对孔进行洗涤。洗涤后，添加HRP标记抗His Tag抗体(BethylLaboratories,Inc.，目录编号：A190-114P)的溶液，室温下进行抗原抗体反应。将抗体溶液除去，在各孔中添加洗涤液(含有1％BSA的PBS)对孔进行洗涤。洗涤后，在各孔中添加ABST底物(Thermo Fisher公司)的溶液，测定450nm处的吸光度。将结果示于图1～3。
(2)结果
如图1～3所示，人源化抗体、小鼠抗体和兔抗体的任一改造抗体中，对于抗原的亲和性均与各抗体的野生型大体相同。
序列表
<110> 希森美康株式会社
<120> 改造抗体及其制造方法、以及提高抗体的热稳定性的方法
<130> 19-034
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 2
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 3
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 4
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 6
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Cys Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Cys
195 200 205
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<210> 7
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Cys Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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<210> 8
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Cys Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Cys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Cys Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Cys Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 10
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Cys Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<210> 11
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Cys Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Cys Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 12
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<210> 13
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Cys Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<210> 14
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Cys
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 17
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 18
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 19
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 21
<211> 220
<212> PRT
<213> 家兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 21
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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Ile Ile Ser Ser Ser Thr Asn Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Val Lys Gly
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65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Arg
85 90 95
Ser Asp Asp Gly Tyr Gly Asp Tyr Gly Pro Phe Asn Leu Trp Gly Pro
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
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Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr
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Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn
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Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys
210 215 220
<210> 22
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 22
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Cys Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Ser Ser Ser Thr Asn Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Val Lys Gly
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115 120 125
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
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<210> 23
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 23
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Cys Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
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<210> 24
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 24
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Cys Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 25
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Cys Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
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<223> 经改造的抗体
<400> 26
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Cys Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
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<210> 27
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 27
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Cys Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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210 215 220
<210> 28
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 28
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Cys Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Asp Asp Gly Tyr Gly Asp Tyr Gly Pro Phe Asn Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val
165 170 175
Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr
180 185 190
Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Cys Ala Thr Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys
210 215 220
<210> 29
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 29
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Cys Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val
165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Cys Thr Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys
210 215 220
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 家兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 30
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Met Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Arg
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Ser Ala Gln Tyr Asn Ser His Ser Val
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Val Val Gln Gly Ser Ala Ser Pro Ile Val Gln Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经改造的抗体
<400> 31
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Met Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Asp Pro Val
100 105 110
Ala Pro Ser Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu Glu Leu Thr Thr
115 120 125
Gly Thr Ala Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
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145 150 155 160
Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Ser Pro Glu Asp Cys Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Ser Ala Gln Tyr Asn Ser His Ser Val
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Val Val Gln Gly Ser Ala Ser Pro Ile Val Gln Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210
Claims (14)
1.一种改造抗体，其包含选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基的重链。
2.根据权利要求1所述的改造抗体，其包含选自由所述第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基通过替换变为半胱氨酸残基的重链。
3.根据权利要求1或2所述的改造抗体，其包含所述选自由第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基通过替换变为半胱氨酸残基的重链。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的改造抗体，其包含选自由基于Kabat法的第9位和第10位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基变为半胱氨酸残基的重链。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的改造抗体，其包含以下的1)～3)中任一个所示的氨基酸残基变为半胱氨酸残基的重链：
1)基于Kabat法的第9位氨基酸残基和基于IMGT法的第109位氨基酸残基，
2)基于Kabat法的第9位氨基酸残基和基于IMGT法的第110位氨基酸残基，
以及
3)基于Kabat法的第10位氨基酸残基和基于IMGT法的第110位氨基酸残基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的改造抗体，其为与未改造的抗体相比热稳定性提高的抗体。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的改造抗体，其为哺乳动物来源的抗体。
8.根据权利要求7所述的改造抗体，所述哺乳动物为人、小鼠、兔、大鼠、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛或马。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的改造抗体，其为Fab、Fab'、F(ab')2、还原型IgG、IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的改造抗体，存在于从基于Kabat法的第8～11位选择的至少1个位置的半胱氨酸残基与存在于从基于IMGT法的第109位和第110位选择的至少1个位置的半胱氨酸残基之间形成有二硫键。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的改造抗体，其进一步包含基于Kabat法的第80位和第171位氨基酸残基为半胱氨酸残基的轻链。
12.根据权利要求11所述的改造抗体，其中，存在于基于Kabat法的第80位和第171位位置的半胱氨酸残基之间形成有二硫键。
13.一种提高抗体的热稳定性的方法，其特征在于，使抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基。
14.一种改造抗体的制造方法，包括：
使抗体的重链中选自由基于Kabat法的第8～11位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基、以及选自由基于IMGT法的第109位和第110位氨基酸残基组成的组的至少1个氨基酸残基为半胱氨酸残基工序，以及
对所述工序中得到的改造抗体进行回收的工序。
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