JP3729841B2 - 抗hla−dr抗体の利用 - Google Patents
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Description
本発明は、このような抗体を作製し、抗腫瘍剤又は免疫抑制剤として使用することを目的とする。
本発明は、その第1の態様において、及び及びマウス-マウスハイブリドーマにより産生されるHLA-DRと結合するモノクローナル抗体、例えばHD4、HD6、HD8又はHD10により産生される好ましくはヒト抗体であるモノクローナル抗体又はその機能的断片を提供する。HD4、HD6、HD8又はHD10により産生されるモノクローナル抗体のタイプはイムノグロブリンG(IgG)型である。ここで、ハイブリドーマHD8は、受託番号がFERM BP-7773として、ハイブリドーマHD10は受託番号がFERM BP-7774として、2001年10月11日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託されている。ハイブリドーマHD4は受託番号がFERM BP-7771として、2001年10月11日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託されている。ハイブリドーマHD6は、受託番号が FERM BP-7772として、2001年10月11日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託されている。
(a)6週齢のSCIDマウスに抗アシアロGM1抗血清を10μl/マウス個体で静脈内投与し、抗アシアロGM1抗血清投与翌日にバーキットリンパ腫細胞Raji(ATCC CCL-86)を5×106/マウス個体で静脈内投与し、Raji投与5日後に投与量50μg/kg体重から5μg/kg体重で投与した場合のマウスの生存率が、ヒト抗HSA抗体を同量投与した場合の生存率よりも高いという性質;及び
(b)10% FCSを含むRPMI1640培地を用いて8μg/mLに調製した抗体50μLと10% FCSを含むRPMI1640培地を用いて2×105個/mLに調製した第1のヒトドナー由来成熟樹状細胞浮遊液50μLとを96穴プレートのウェル中で混合し、4℃で30分間放置し、次いで10% FCSを含むRPMI1640培地を用いて1×106個/mLに調製した前記第1のヒトドナーと組織適合抗原が異なる第2のヒトドナー由来の純度99%以上のT細胞浮遊液100μLを混合し、37℃、5%CO2存在下で5日間培養し、さらに3Hチミジンを1.0μCi/ウェルで添加して、さらに37℃、5%CO2存在下で16〜20時間培養した後、細胞へ取り込まれた3Hチミジンを回収し該3Hチミジンをシンチレーターで測定し、3Hチミジンの細胞への取り込みを指標として免疫抑制活性を測定した場合の免疫抑制活性が同濃度のマウス抗HLA-DRモノクローナル抗体L243(ATCC HB-55)を用いた場合の免疫抑制活性と比べて弱いという性質;
を有する、HLA-DRと結合する抗体及びその機能的断片である。
さらに、HLA-DRが関与する免疫活性を抑制することによる免疫抑制薬、特にリウマチ治療薬として有用である分子が提供された。
該抗体としてはイムノグロブリンG(IgG)、同A(IgA)、同E(IgE)及び同M(IgM)のいずれの型も好適に用いられうるが、通常はIgGがより好適である。
本発明の抗体は、クラスIIの主要組織特異性複合体(MHC)のひとつであるHLA-DRに対する抗体、すなわちHLA-DRを認識し結合する抗体、HLA-DRに反応性を有する抗体である。
本発明の抗体は、いずれのイムノグロブリンクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。
抗原としては、HLA-DRα鎖及びβ鎖をコードするDNAを動物細胞用発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを動物細胞に導入し、取得した形質転換株そのものを使用できる。因みに、HLA-DR α鎖及びβ鎖の一次構造は公知である[Steven GE, et al., (2000) The HLA FactsBook, Academic Press発行参照]ので、当業者に周知の方法により、HLA-DRのアミノ酸配列からペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
(1)で得られた抗原と、フロインドの完全若しくは不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、ヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウスが最も好適に用いられるが、そのようなマウスは富塚らの文献[Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722]に記載されている。
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることが出来るが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば8-アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)ミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton, D.E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978)]、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1) [Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)]、Sp2/O-Ag14(SP-2)[Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)]、P3X63Ag8.653(653)[Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550(1979)]、P3X63Ag8(X63)[Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)]などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば8-アザグアニン培地[グルタミン、2-メルカプトエタノール、ゲンタマイシン及びウシ胎児血清(以下「FCS」という)を加えたRPMI-1640培地に8-アザグアニンを加えた培地] 、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium;以下「IMDM」という)、又はダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium;以下「DMEM」という)で継代培養するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地(例えば、10% FCSを含むDMEM培地)で継代培養し、融合当日に2×107以上の細胞数を確保しておく。
抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
上記ミエローマ細胞が、8-アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、及びミエローマ細胞どうしの融合細胞は、HAT含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、HAT含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
(2)の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの1ウェルに1個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって1個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって1個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便であり、よく用いられる。
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をHT培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステムを用いた培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲルろ過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の予防又は治療剤を有効成分として含有する抗HLA-DRモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス(例えばBALB/c)若しくはnu/nuマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明の予防又は治療剤を有効成分として含有する抗HLA-DRモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット(例えば、MAbTrap GIIキット;アマシャムファルマシアバイオテク社製)等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、ヒトHLA-DRに対して高い抗原特異性を有する。
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー(Ouchterlony)法、ELISA法、又はRIA法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ELISA法又はRIA法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び280nmにおける吸光度[1.4(OD280)=イムノグロブリン1mg/mL]より算出する方法により行うことができる。
本発明の抗体は下記のa)及びb)の機能的特性を有するもので、それぞれの特性は例えば各項目に記載の方法により確認することができる:
a) SCIDマウス等の免疫不全マウスにHLA-DRを発現しているヒト癌細胞を移植し、本発明の抗体を投与したときのマウス生存率を調べた結果、マウスの生存日数が延長する。
b) 同種異系リンパ球混合による免疫反応への抑制活性がL243と比べて弱い。また、a)及びb)の特性は詳細には、
(a)6週齢のSCIDマウスに抗アシアロGM1抗血清を10μl/マウス個体で静脈内投与し、抗アシアロGM1抗血清投与翌日にバーキットリンパ腫細胞Raji(ATCC CCL-86)を5×106/マウス個体で静脈内投与し、Raji投与5日後に投与量5〜50μg/kg体重、好ましくは5μg/kg体重で1回投与した場合のマウスの生存率が、ヒト抗HSA抗体を同量投与した場合の90日後の生存率よりも高いという性質;及び
(b)10% FCSを含むRPMI1640培地を用いて8〜200μg/mL、好ましくは8μg/mLに調製した抗体50μLと10% FCSを含むRPMI1640培地を用いて2×105個/mLに調製した第1のヒトドナー由来成熟樹状細胞浮遊液50μLとを96穴プレートのウェル中で混合し4℃で30分間放置し、次いで10% FCSを含むRPMI1640培地を用いて1×106個/mLに調製した前記第1のヒトドナーと組織適合抗原が異なる第2のヒトドナー由来の純度99%以上のT細胞浮遊液100μLを混合し、37℃、5%CO2存在下で5日間培養し、さらに3Hチミジンを1.0μCi/ウェルで添加して、さらに37℃、5%CO2存在下で16〜20時間培養した後、細胞へ取り込まれた3Hチミジンを回収し該3Hチミジンをシンチレーターで測定し、3Hチミジンの細胞への取り込みを指標として免疫抑制活性を測定した場合の免疫抑制活性が同濃度のマウス抗HLA-DRモノクローナル抗体L243(ATCC HB-55)を用いた場合の免疫抑制活性と比べて弱いという性質である。
前記 a)の性質は前記抗体が強い抗腫瘍活性を有することを意味する。
本発明のヒト抗HLA-DR抗体の精製された製剤を含有する製剤もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥(フリーズドライ)し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。かかる予防又は治療剤は、種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
a) SCIDマウス等の免疫不全マウスにHLA-DRを発現しているヒト癌細胞を移植し、本発明の抗体を投与したときのマウス生存率を調べた結果、マウスの生存日数が延長する。
b) 同種異系リンパ球混合による免疫反応への抑制活性がL243と比べて弱い。
本発明の分子は、水又はそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液又は懸濁液のアンプルとして使用に供される。また、無菌粉末製剤(本発明の分子を凍結乾燥するのが好ましい)をアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよい。
ヒトHLA-DRが細胞膜上に過剰発現している細胞を得るため、ヒトHLA-DRα鎖及びβ鎖全長アミノ酸の発現プラスミドベクターを作製した。HLA-DRα鎖及びβ鎖をコードするDNAは、PCR法により作製した。
鋳型PCRを行うにあたり、鋳型として用いたのは、ヒトHLA-DRα鎖及びβ鎖をコードするcDNAを保持するプラスミドベクターpEF-neo-HLA-DRα及びpEF-neo-HLA-DRβである。pEF-neo-HLA-DRα及びpEF-neo-HLA-DRβは以下の方法で作製された。完全長ヒトHLA-DRα鎖DNA及びHLA-DRβ鎖DNAを、その5’末端にEcoRI配列を、その3’末端にNotI配列と終止コドンを付加する為のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い修飾した。ヒト末梢血単核球由来cDNAを鋳型として、HLA-DRαについてはプライマーとして:5'-CCGGAATTCCCACCATGGCCATAAGTGGAGTCCCTGTG -3'(配列番号1)及び5'- AAAGCGGCCGCTCATTACAGAGGCCCCCTGCGTTCTGC -3'(配列番号2)を、HLA-DRβについてはプライマーとして:5'-CCGGAATTCCTGGTCCTGTCCTGTTCTCCAGCA-3'(配列番号3)及び5'- AAAGCGGCCGCTCATCAGCTCAGGAATCCTGTTGGCTG -3'(配列番号4)を合成し、LA-TaqDNAポリメラーゼ(ギブコ・ビーアールエル社製)を使用して、(94℃、15秒;55℃、30秒;72℃、60秒間)×30サイクルのPCR反応を行った。合成された配列を、EcoRI-NotI断片として単離し、同一酵素で解裂されていたpEF-neoベクター(改変pEF-BOS[Mizushima S. & Nagata S., Nucleic Acids Res (1990), 18, 5332参照]にneomycin耐性遺伝子を組み込んだベクター)に連結した。得られたプラスミドをpEF-neo-HLA-DRα及びpEF-neo-HLA-DRβと命名した。pEF-neo-HLA-DRαに組み込まれたHLA-DRαは、765bpのcDNAがコードされ、pEF-neo-HLA-DRβに組み込まれたHLA-DRβは、801bpのcDNAがコードされている。以下、実施例中のすべてのPCRの反応温度調節は、ジーンアンプPCRシステム9700;(株)パーキンエルマー・ジャパン社製を使用した。
a)で作製したpEF-neo-HLA-DRα及びpEF-neo-HLA-DRβを、LipofectAMINE Plus(ギブコ・ビーアールエル社製)を用いて、L929細胞(American Type Culture Collection (ATCC) No.CCL-1)に導入した。遺伝子導入はマニュアルの方法にて行った。細胞培養用フラスコ(培養面積75cm2)中で37℃、5.0%炭酸ガス下で24時間培養した後、G418(ギブコ・ビーアールエル社製)を1mg/mLになるように加え、1週間培養した。次いで、R-phycoerythrin標識したマウス抗ヒトHLA-DR抗体(BDファーミンジェン社製)を用いたフローサイトメーター(FCM:ベクトンディキンソン社製)解析を行い、遺伝子導入された細胞でG418耐性の形質を獲得したもののうち、細胞膜表面上にHLA-DRを発現している細胞を選択的にソーティングした。
免疫に用いたマウスは、内因性Ig重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトIg重鎖遺伝子座を含む14番染色体断片
(SC20)及びヒトIgκ鎖トランスジーン(KCo5)を同時に保持する。このマウスはヒトIg重鎖遺伝子座を持つ系統Aのマウスと、ヒトIgκ鎖トランスジーンを持つ系統Bのマウスとの交配により作製された。系統Aは、内因性Ig重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な14番染色体断片 (SC20)を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告[Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97:722]に記載されている。また、系統Bは内因性Ig重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトIgκ鎖トランスジーン(KCo5)を保持するマウス系統(トランスジェニックマウス)であり、例えばFishwildらの報告[Nat Biotechnol, (1996),l14:845]に記載されている。
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門(安東民衛ら著作、講談社発行 1991)等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのヒトHLA-DRは、実施例1で調製したHLA-DR発現L929細胞を用いた。被免疫動物は、実施例2で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
バーキットリンパ腫細胞Daudi(ATCC No. CCL-213)を各ウェルに1×105個加えた後、ハイブリドーマ上清を加え、4℃で20分間インキュベートした。次いで、1%FCS入りのPBSで2回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン軽鎖κ(Igκ)抗体(50μg/ウェル:DAKO社製)を加え、4℃で20分間インキュベートした。1%FCS入りPBSで2回洗浄し、TMB発色基質(DAKO社製)を各ウェルに100μLずつ加え、室温下で20分間インキュベートした。各ウェルに0.5M硫酸(100μL/ウェル)を加え、反応を止めた。波長450nm(参照波長570nm)での吸光度をマイクロプレートリーダー(1420 ARVO マルチラベルカウンター:WALLAC社製)で測定して陽性反応を示した抗体産生クローンを選択した。
Daudiを各ウェルに1×105個加えた後、ハイブリドーマ上清を加え、4℃で20分間インキュベートした。次いで、1%FCS入りのPBSで2回洗浄し、各ウェルにそれぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヒツジ抗ヒトIgG1抗体、ヒツジ抗ヒトIgG2抗体、ヒツジ抗ヒトIgG3抗体又はヒツジ抗ヒトIgG4抗体(各2000倍希釈、50μL/ウェル、The Binding Site社製)を加え、室温下で1時間インキュベートした。1%FCS入りPBSで3回洗浄後、基質緩衝液(TMB、100μL/ウェル、DAKO社製)を各ウェルに加え、室温下で20分間インキュベートした。次いで、0.5M硫酸(100μL/ウェル)を加え、反応を止めた。波長450nm(参照波長570nm)での吸光度をマイクロプレートリーダー(1420 ARVO マルチラベルカウンター:WALLAC社製)で測定し、各クローンのサブクラスを決定した。どのサブクラスにも陽性反応のなかったクローンについては、IgGではないため選択から除外した。
結果のうち最終的に選択したクローンのみの結果を表1に示す。
最初に正常ヒト末梢血由来単核球をFicoll(Ficoll-PaquePLUS: Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて定法に従って調製した。抗凝固剤としてクエン酸ナトリウム液を含んだ採血バッグ(テルモ社製)に採取した正常ヒト血液を遠心分離(600G、室温、5分)し、細胞分画と血漿を分離した。細胞分画をPBSで希釈してFicollに重層し、比重遠心(400G、室温、30分間)により単核細胞を分離した。中間層を単核球として抽出してPBSで2回洗浄したのち、さらにPBSで希釈して100Gで10分間遠心分離し、上清中に残留した血小板を除去した。以上の方法で正常ヒト末梢血由来単核球(PBMC)を取得した。
主要組織適合抗原(MHC)の異なる同種異系の移植においては、T細胞が非自己(組織不適合)のMHC分子複合体(アロ抗原)を認識することで活性化し拒絶反応を引き起こす。ヒトのMHCはHLA(human leukocyte antigen)と呼ばれ、HLA-A, B, Cの属するクラスI抗原と、HLA-DP, DQ, DRの属するクラスII抗原があり、さらにそれぞれの分子が多型性を有するため、ヒトのHLAの組み合せは数千通り可能となり、他人の間では組織不適合になる可能性がきわめて高くなっている。同種異系リンパ球混合培養は、組織適合抗原の異なる(以下便宜上ドナーA、ドナーBという)リンパ球を混合培養することで、アロ抗原に反応するT細胞の増殖をin vitroにおいて調べる試験である。
実施例4乃至5から得られたハイブリドーマの培養上清からのヒト抗HLA-DRモノクローナル抗体の精製は以下の方法で行った。ヒト抗HLA-DRモノクローナル抗体を含む培養上清をrmp Protein A(アマシャムファルマシアバイオテク社製)及び0.8×40cm カラム(バイオラッド社製)を用い、吸着緩衝液としてPBS、溶出緩衝液として0.02M グリシン緩衝液(pH 3)を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は1M Tris (pH 9.0)を添加してpH7.2付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜(10000カット、Spectrum Laboratories社製)を用いてPBSに置換し、孔径0.22μm のメンブランフィルターMILLEX-GV (ミリポア社製)でろ過滅菌し、精製ヒト抗HLA-DRモノクローナル抗体を得た。精製抗体の濃度は280nmの吸光度を測定し、1mg/mL を1.4 ODとして算出した。
同種異系リンパ球混合培養は、組織適合抗原の異なる(以下便宜上ドナーA、ドナーBという)リンパ球を混合培養することで、アロ抗原に反応するT細胞の増殖をin vitroにおいて調べる試験であるが、さらに、ドナーAの末梢血からin vitroで誘導した単球由来の成熟樹状細胞(DC)とドナーBの末梢血から分離したT細胞のみを混合培養することで、貪食細胞などによる抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を除外した条件下で同様のアロ抗原に対するT細胞の反応性を調べることができる。そこで、抗HLA-DRモノクローナル抗体の存在下で同種異系のDCとT細胞を用いた混合培養を行い、T細胞のアロ抗原反応性に対する抗HLA-DRモノクローナル抗体の作用を調べた。具体的には、丸底96ウェルプレート(Falcon社製)にドナーAの成熟DCを2×105個/mLになるように10% FCSを含むRPMI 1640培地(RPMI-10% FCS)に浮遊させた。抗HLA-DRモノクローナル抗体、陰性コントロールとしてヒトポリクローナルIgG(hIgG)及び陽性コントロールとしてマウス抗HLA-DRモノクローナル抗体L243(ATCC HB-55)は、200、40、8μg/mLになるようにRPMI-10% FCSで希釈した。また、ドナーBの末梢血より分離した純度99%以上のT細胞を1×106個/mLとなるようにRPMI-10% FCSに浮遊させた。最初に、ドナーA由来の成熟DCと抗HLA-DRモノクローナル抗体を各50μLずつ96穴プレート上で混合し、4℃で30分放置した。次に、ドナーB由来のT細胞100μLを混合し、37℃、5日間、5% CO2存在下で培養した後、3Hチミジン(Amersham Pharmacia Biotech社製)を1.0μCi/ウェルとなるように添加して、さらに37℃、16〜20時間、5% CO2存在下で培養した。Micro96 Harvester(SKATRON社製)を用いて細胞に取り込まれた3Hチミジンをグラスフィルターマット(Printed Filtermat:Wallac社製)に回収し、乾燥後シンチレーター(Betap; Scint:Wallac社製)によく浸し、パッケージング後、β線量を液体シンチレーションカウンター(1205BETAPLATE:Wallac社製)で活性測定した。
実施例1で作成したHLA-DR発現L929細胞に対する、実施例3で取得した精製各モノクローナル抗体の反応性の検討を、FCM解析で行った。2×107/mLの濃度で、L929細胞及びHLA-DR発現L929細胞を、0.1%アジ化ナトリウム及び1%牛胎児血清含有したPBS(Staining Medium、以下SM)に浮遊させ、96穴丸底プレートに100ml/ウェルで分注した。遠心分離(600G、4℃、2分)した後、上清を除去し、実施例3で培養したハイブリドーマの培養上清(50μl)を加えて撹拌した後、氷温下30分間静置してから、遠心分離(600G、4℃、2分)して上清を除去した。ペレットを100μl/ウェルのSMで2回洗浄した後、0.0125mg/mLのRPE蛍光標識ウサギ抗ヒトIgκ F(ab')2抗体(DAKO社製)30μLを加え、氷温下30分間インキュベートした。SMで2回洗浄した後、SMに懸濁し、FCMで各細胞の蛍光強度を測定した。
実施例8から得られた精製ヒト抗HLA-DRモノクローナル抗体の効果を、以下に記載する方法に従ってマウス担癌モデルを用いて検討した。
(1)HD4、HD8抗体遺伝子のcDNAクローニングと発現ベクター作製
ハイブリドーマHD4、HD8を10ng/mL IL-6(R&D Systems社製)、10% Fetal Bovine Serum(SIGMA社製)含有eRDF培地(極東製薬社製)で培養し、遠心分離により細胞を集めた後TRIZOL(ギブコビーアールエル社製)を添加し、取扱説明書にしたがってTotal RNAを抽出した。抗体cDNAの可変領域のクローニングは、SMART RACE cDNA amplification Kit(クローンテック社製)を用い、添付の説明書にしたがって行った。
5μgのtotal RNAを鋳型として、1st strand cDNAを作製した。
Total RNA 5μg/3μL
5’CDS 1μL
SMART oligo 1μL
5×Buffer 2μL
DTT 1μL
DNTP mix 1μL
Superscript II 1μL
を加え42℃で1.5時間インキュベートした。
さらに、100μLのTricine Bufferを加えた後、72℃で7分間インキュベートし、1st strand cDNAを取得した。
cDNAの増幅には、Takara社のZ-Taqを用いた。
cDNA 2μL
10xZ-Taq Buffer 5μL
dNTP mix 4μL
Z-Taq 1μL
プライマー1
プライマー2
上記組成の反応液を再蒸留水にて最終容量50μLとし、PCRに供した。
GTCGACCCAGCCCTGGGATTTTCAGGTGTTTTCAGGTGTTTTCATTTGGTGATCAGGACTGAACAGAGAGAACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAACTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTGGTGGTGATAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATCATGGTTCGGGGAGTTATTATCCCTACTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSGISGGGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHGSGSYYPYWFDYWGQGTLVTVSSA
AGATCTGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAACTTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCCGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG
METPAQLLFLLLLWLPDTTGELVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRT
GTCGACTGGCTGACCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTTCAGCTGCAGCACTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGGGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAGTCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAAAATTTCTATGGTTCGGAGACTTGTCATAAGAAGTATTACTGCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
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MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
HD4及びHD8については、各抗体の可変領域を以下の各種ベクターに組み込んだ。IgG1タイプにはN5KG1-Val Larkベクター、IgG4タイプにはN5KG4 Lark(いずれもIDEC Pharmaceuticals製で、US patent 6001358に記載されているN5KG1の改変ベクターである。N5KG1-Val LarkについてはN5KG1と同様にIgG1を保持したままの改変、N5KG4 LarkについてはIgG4タイプに組替えたものである。)、IgG2タイプにはN5KG1-Val Larkの重鎖定常配列部分をIgG2タイプに組替えたベクター(N5KG2)を用い、実施例12の方法と同様にベクターにHD4及びHD8の可変領域を組み込んだ。新たに、IgG1タイプ或いはIgG2タイプのベクターに組み込まれている重鎖定常部分のEUナンバリングシステムにおける331番目のプロリン(P)をコードする配列CCCをセリン(S)をコードするTCCに変異させた(Mi-Hua Tao, et al. 1993. J.Exp.Med)ベクターを作成(以下、順にN5KG1Ser、N5KG2Serと書く)し、実施例12の方法と同様にベクターにHD4及びHD8の可変領域を組み込んだ。以下に説明する図3及び表3中、例えばサブクラスをIgG1のHD4抗体はHD4IgG1又はHD4G1と記し、さらに重鎖定常部分のEUナンバリングシステムにおける331番目のプロリン(P)をコードする配列CCCをセリン(S)をコードするTCCに変異させた遺伝子の発現抗体はHD4IgG1Ser又はHD4G1Serと記する。
実施例12及び13で構築した組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、例えばCHO細胞の dhfr欠損株(ATCC CRL-9096)、CHO-Ras(Katakura Y., et al., Cytotechnology, 31: 103-109, 1999)、HEK293T(ATCC CRL-11268)などが用いられる。
抗体を介した細胞傷害性活性は、NK細胞或いは好中球などのキラー活性を有する細胞と抗体の存在下でターゲット細胞への傷害活性(抗体依存性細胞性細胞傷害活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)、以下、ADCC)、及び補体と抗体の存在下でターゲット細胞への傷害活性(補体依存性細胞傷害活性(Complement-Dependent Cytotoxicity)以下、CDC)の測定を実施した。抗体は、実施例8で作成したハイブリドーマ由来HD4及びHD8、実施例14で作成した各CHO細胞由来の組換え抗体を使用した。この際、コントロールとしてhIgGを用いた。
実施例11と同様のモデルを使用し、HD8組換え型抗体のマウス担癌モデルを用いた薬理作用を検討した。
定法に従ってウェスタン解析を実施することで、各抗体のエピトープ解析を実施した。簡単には、セルロース或いはPVDF膜はブロックエース(雪印社製)などでブロッキング後、各抗体を1次抗体として1μg/mLの濃度で、二次抗体としてHRP conjugated anti rabbit IgG(DAKO社製)を用いて0.5μg/mLの濃度で反応させ、HRP標識抗ヒト抗体(例:DAKO社製)と反応させ、化学発光試薬(例:ECLウェスタンブロッティング検出試薬:アマシャムバイオサイエンス社)を用いて、化学発光検出装置(例:LAS-1000:富士フィルム社製)で化学発光を検出した。
バックグラウンドの5%未満:-
バックグラウンドの5%以上10%未満 :+/-
バックグラウンドの10%以上20%未満 :+
バックグラウンドの20%以上30%未満 :++
バックグラウンドの30%以上50%未満 :+++
バックグラウンドの50%以上:++++
配列番号24〜145-人工配列の説明:ペプチド
Claims (84)
- ハイブリドーマHD8(受託番号 FERM BP-7773)が産生する、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD8(受託番号 FERM BP-7773)が産生する抗体の可変領域を有する、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- 抗体のサブクラスが、IgGである請求項2記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG1である請求項3記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項4記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列の改変が、EUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸のSerへの置換である請求項5記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG2である請求項3記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項7記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列の改変が、EUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸のSerへの置換である請求項8記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG3である請求項3記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項10記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG4である請求項3記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項12記載の抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD8(受託番号 FERM BP-7773)。
- ハイブリドーマHD4(受託番号 FERM BP-7771)が産生する、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD4(受託番号 FERM BP-7771)が産生する抗体の可変領域を有する、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- 抗体のサブクラスが、IgGである請求項16記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG1である請求項17記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項18記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG2である請求項17記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項20記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列の改変が、EUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸のSerへの置換である請求項21記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG3である請求項17記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項23記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG4である請求項17記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項25記載の抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD4(受託番号 FERM BP-7771)。
- ハイブリドーマHD10(受託番号 FERM BP-7774)が産生する、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD10(受託番号 FERM BP-7774)。
- ハイブリドーマHD6(受託番号 FERM BP-7772)が産生する、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD6(受託番号 FERM BP-7772)が産生する抗体の可変領域を有する、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- 抗体のサブクラスが、IgGである請求項31記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG1である請求項32記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項33記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG2である請求項32記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項35記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG3である請求項32記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項37記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG4である請求項32記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項39記載の抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD6(受託番号 FERM BP-7772)。
- 配列番号21及び23で示されるアミノ酸配列のうち可変領域のマチュア部分のアミノ酸配列を含む、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- 配列番号20及び22で示される塩基配列がコードするペプチドのうち可変領域のマチュア部分のアミノ酸配列を含む、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- 抗体のサブクラスが、IgGである請求項42記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG1である請求項44記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項45記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列の改変が、EUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸のSerへの置換である請求項46記載の抗体又はその機能的断片。
- サブクラスがIgG1でありEUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸がSerへ置換された抗体HD8である抗体HD8G1Ser又はその機能的断片。
- IgGがIgG2である請求項44記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項49記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列の改変が、EUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸のSerへの置換である請求項50記載の抗体又はその機能的断片。
- サブクラスがIgG2でありEUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸がSerへ置換された抗体HD8である抗体HD8G2Ser又はその機能的断片。
- IgGがIgG3である請求項44記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項53記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG4である請求項44記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項55記載の抗体又はその機能的断片。
- 配列番号17及び19で示されるアミノ酸配列のうち可変領域のマチュア部分のアミノ酸配列を含む、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- 配列番号16及び18で示される塩基配列がコードするペプチドのうち可変領域のマチュア部分のアミノ酸配列を含む、HLA-DRと結合する抗体又はその機能的断片。
- 抗体のサブクラスが、IgGである請求項57記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG1である請求項59記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項60記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG2である請求項59記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項62記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列の改変が、EUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸のSerへの置換である請求項63記載の抗体又はその機能的断片。
- サブクラスがIgG2でありEUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸がSerへ置換された抗体HD4である抗体HD4G2Ser又はその機能的断片。
- IgGがIgG3である請求項59記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項66記載の抗体又はその機能的断片。
- IgGがIgG4である請求項59記載の抗体又はその機能的断片。
- 重鎖定常領域のアミノ酸配列を、改変した請求項68記載の抗体又はその機能的断片。
- ハイブリドーマHD8(受託番号 FERM BP-7773)、ハイブリドーマHD10(受託番号 FERM BP-7774)、ハイブリドーマHD4(受託番号 FERM BP-7771)及びHD6(受託番号 FERM BP-7772)からなる群から選択されるハイブリドーマの保有する核酸であって、前記ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を含む抗体をコードする核酸又は該抗体の機能的断片をコードする核酸。
- 可変領域が配列番号17および19で示されるアミノ酸配列のうち可変領域のマチュア部分のアミノ酸配列を含む、請求項70記載の抗体をコードする核酸又は該抗体の機能的断片をコードする核酸。
- 可変領域が配列番号21および23で示されるアミノ酸配列のうち可変領域のマチュア部分のアミノ酸配列を含む、請求項70記載の抗体をコードする核酸又は該抗体の機能的断片をコードする核酸。
- サブクラスがIgG1でありEUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸がSerへ置換された抗体HD8である抗体HD8G1Ser、サブクラスがIgG2でありEUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸がSerへ置換された抗体HD8である抗体HD8G2Ser及びサブクラスがIgG2でありEUナンバリングシステムにおける331番目のアミノ酸がSerへ置換された抗体HD4である抗体HD4G2Serからなる群から選択される抗体をコードする核酸又は該抗体の機能的断片をコードする核酸。
- 請求項70〜73のいずれか1項に記載の核酸によりコードされるタンパク質。
- 請求項70〜73のいずれか1項に記載の核酸を有する発現ベクター。
- 請求項75に記載の発現ベクターを有する宿主。
- 大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれる請求項76記載の宿主。
- ハイブリドーマHD8(受託番号 FERM BP-7773)、ハイブリドーマHD10(受託番号 FERM BP-7774)、ハイブリドーマHD4(受託番号 FERM BP-7771)及びHD6(受託番号 FERM BP-7772)からなる群から選択されるハイブリドーマから抗HLA-DRモノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して該モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清又は宿主の分泌物から抗HLA-DRモノクローナル抗体を採取することを含む、抗HLA-DRモノクローナル抗体の製造方法。
- 配列番号21で示されるアミノ酸配列の21番目のQから152番目のS、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列の23番目のAから129番目のKのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片。
- 配列番号20で示される塩基配列の101番目のCから496番目のA、及び配列番号22で示される塩基配列の100番目のGから420番目のAの塩基配列がコードするアミノ酸配列を含む、抗体又はその機能的断片。
- 配列番号17で示されるアミノ酸配列の20番目のEから142番目のS、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列の21番目のEから128番目のKのアミノ酸配列を含む、抗体又はその機能的断片。
- 配列番号16で示される塩基配列の136番目のGから504番目のA、及び配列番号18で示される塩基配列の95番目のGから418番目のAの塩基配列がコードするアミノ酸配列を含む、抗体又はその機能的断片。
- 配列番号17で示されるアミノ酸配列の20番目のEから142番目のS、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列の21番目のEから128番目のKのアミノ酸配列を含む、抗体又はその機能的断片をコードする核酸。
- 配列番号21で示されるアミノ酸配列の21番目のQから152番目のS、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列の23番目のAから129番目のKのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能的断片をコードする核酸。
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