JPH067189A - ヒトＭ−ＣＳＦ β型ダイマ−に特異性を有するモノクロ− ナル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマ、お よびこの抗体の利用 - Google Patents
ヒトＭ−ＣＳＦ β型ダイマ−に特異性を有するモノクロ− ナル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマ、お よびこの抗体の利用Info
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- JPH067189A JPH067189A JP3333607A JP33360791A JPH067189A JP H067189 A JPH067189 A JP H067189A JP 3333607 A JP3333607 A JP 3333607A JP 33360791 A JP33360791 A JP 33360791A JP H067189 A JPH067189 A JP H067189A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 β型ダイマ−に特異的に反応し、ヒトM-CSF
β型モノマ−、ヒトM-CSF α型ダイマ−、およびヒトM-
CSF α型モノマ−のいずれにも反応しない特異性を有す
る新規なモノクロ−ナル抗体、このモノクロ−ナル抗体
を産生するハイブリドーマ、このモノクロ−ナル抗体を
有効成分とするβ型ダイマ−の定量用試薬、この試薬を
使用したβ型ダイマーの定量方法、およびこのモノクロ
−ナル抗体を利用したβ型ダイマ−の精製方法。 【効果】 β型ダイマ−にのみ特異的に反応する新規な
モノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生するハイブリド
ーマ、およびこの抗体を有効成分とするβ型ダイマ−定
量用試薬が得られ、この試薬を用いてβ型ダイマ−を簡
易、かつ高感度で定量することが可能であり、この抗体
を用いることによりヒト体液中に存在するβ型ダイマ−
を簡便、かつ高純度に精製することができる。
β型モノマ−、ヒトM-CSF α型ダイマ−、およびヒトM-
CSF α型モノマ−のいずれにも反応しない特異性を有す
る新規なモノクロ−ナル抗体、このモノクロ−ナル抗体
を産生するハイブリドーマ、このモノクロ−ナル抗体を
有効成分とするβ型ダイマ−の定量用試薬、この試薬を
使用したβ型ダイマーの定量方法、およびこのモノクロ
−ナル抗体を利用したβ型ダイマ−の精製方法。 【効果】 β型ダイマ−にのみ特異的に反応する新規な
モノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生するハイブリド
ーマ、およびこの抗体を有効成分とするβ型ダイマ−定
量用試薬が得られ、この試薬を用いてβ型ダイマ−を簡
易、かつ高感度で定量することが可能であり、この抗体
を用いることによりヒト体液中に存在するβ型ダイマ−
を簡便、かつ高純度に精製することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ヒトM-CSF β型ダイ
マ−（以下β型ダイマ−と略記することがある）に特異
的に反応する新規な抗β型ダイマ−のモノクロ−ナル抗
体、この抗体を産生するハイブリドーマ、この抗体を用
いたβ型ダイマ−の定量法、およびこの抗体を用いたβ
型ダイマ−の精製法に関するものである。
マ−（以下β型ダイマ−と略記することがある）に特異
的に反応する新規な抗β型ダイマ−のモノクロ−ナル抗
体、この抗体を産生するハイブリドーマ、この抗体を用
いたβ型ダイマ−の定量法、およびこの抗体を用いたβ
型ダイマ−の精製法に関するものである。
【０００２】なお、この明細書において百分率は、特に
断りのない限り重量による値を示す。
断りのない限り重量による値を示す。
【０００３】
【従来の技術とその課題】コロニ−刺激因子（以下ＣＳ
Ｆと略記することがある）は、哺乳動物の造血組織、例
えば骨髄等に存在する造血幹細胞の分化・増殖を刺激す
る造血因子として知られている。特にM-CSF は主として
単球・マクロファ−ジ系細胞に作用することが知られて
おり、そのｃＤＮＡも既に単離され［サイエンス(Scien
ce) 、第２３０巻、第２９１ページ、１９８５年］、蛋
白質の構造も明らかにされている。ヒトM-CSF にはβ型
およびα型のダイマーがあり、α型のダイマーはCSF-1
とも呼ばれている。
Ｆと略記することがある）は、哺乳動物の造血組織、例
えば骨髄等に存在する造血幹細胞の分化・増殖を刺激す
る造血因子として知られている。特にM-CSF は主として
単球・マクロファ−ジ系細胞に作用することが知られて
おり、そのｃＤＮＡも既に単離され［サイエンス(Scien
ce) 、第２３０巻、第２９１ページ、１９８５年］、蛋
白質の構造も明らかにされている。ヒトM-CSF にはβ型
およびα型のダイマーがあり、α型のダイマーはCSF-1
とも呼ばれている。
【０００４】例えば特開昭６４−２２８９９号公報と同
一の方法で精製したβ型ダイマーは、電気泳動で測定し
た分子量が75,000〜90,000のホモ２量体からなる糖蛋白
質であり、還元条件下での電気泳動により、そのサブユ
ニットの分子量は35,000〜45,000であることが知られて
いるが、このモノマ−は軟寒天コロニ−形成法において
生物活性の無いことが知られている。
一の方法で精製したβ型ダイマーは、電気泳動で測定し
た分子量が75,000〜90,000のホモ２量体からなる糖蛋白
質であり、還元条件下での電気泳動により、そのサブユ
ニットの分子量は35,000〜45,000であることが知られて
いるが、このモノマ−は軟寒天コロニ−形成法において
生物活性の無いことが知られている。
【０００５】α型のダイマーは、β型ダイマ−と同様の
活性を有し［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Journal of Biological Chemistry)、第２５
７巻、第１３６７９ページ、１９８２年］、β型ダイマ
−と同一のｃＤＮＡに由来すると推定されているが、分
子形成の過程が異なっているものと考えられている［モ
レキュラー・イムノロジー（Molecular Immunology) 、
第２５巻、第７６１ページ、１９８８年］。しかしなが
ら、これらM-CSF の分子型の相違の体内における生理学
的意義については未だ不明である。
活性を有し［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Journal of Biological Chemistry)、第２５
７巻、第１３６７９ページ、１９８２年］、β型ダイマ
−と同一のｃＤＮＡに由来すると推定されているが、分
子形成の過程が異なっているものと考えられている［モ
レキュラー・イムノロジー（Molecular Immunology) 、
第２５巻、第７６１ページ、１９８８年］。しかしなが
ら、これらM-CSF の分子型の相違の体内における生理学
的意義については未だ不明である。
【０００６】M-CSF の定量方法としては、生物学的方
法、免疫学的方法等が知られている。生物学的方法とし
ては、メトカルフ（Metcalf ）の方法［ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・メディスン（Journal of Biologi
cal Medicine) 、第４４巻、第２８７ページ、１９６６
年］が一般的であるが、この方法は操作が煩雑であり、
かつ不正確であった。また血中等の精製されていない検
体中のM-CSF を定量する場合、検体中にコロニ−形成阻
害因子が存在すること、および生物学的方法の定量感度
が低いことなどから、この方法による正確な定量は困難
であった［ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマト
ロジー（British Journal of Haematology) 、第２０
巻、第３２９ページ、１９７１年）。その他には、ＣＳ
Ｆによる細胞増殖を細胞の還元能を利用して定量する方
法（特開昭６２−２８２９５６号公報等）も知られてい
る。
法、免疫学的方法等が知られている。生物学的方法とし
ては、メトカルフ（Metcalf ）の方法［ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・メディスン（Journal of Biologi
cal Medicine) 、第４４巻、第２８７ページ、１９６６
年］が一般的であるが、この方法は操作が煩雑であり、
かつ不正確であった。また血中等の精製されていない検
体中のM-CSF を定量する場合、検体中にコロニ−形成阻
害因子が存在すること、および生物学的方法の定量感度
が低いことなどから、この方法による正確な定量は困難
であった［ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマト
ロジー（British Journal of Haematology) 、第２０
巻、第３２９ページ、１９７１年）。その他には、ＣＳ
Ｆによる細胞増殖を細胞の還元能を利用して定量する方
法（特開昭６２−２８２９５６号公報等）も知られてい
る。
【０００７】M-CSF の免疫学的定量方法としては、ＲＩ
Ａ（放射性同位元素分析法）が知られている［プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc
eedings of the Natlional Academy of Science of the
United States of America)、第７６巻、第５４１１ペ
ージ、１９７９年、ブラッド・セルズ(Blood cells) 、
第５巻、第４２１ページ、１９７９年、およびブラッド
(Blood) 、第５８巻、第６３０ページ、１９８１年］
が、この方法は感度が1.4 〜4U/ml とあまり高くないこ
と、高価なこと、取扱いが一定の基準により認可された
施設を必要とすること等の問題がある。また、ＲＩＡに
比較してより安価で簡便に定量できるＥＩＡ（酵素標識
法）も知られている（特開平２- ５５９５５号公報）
が、いずれにしても、これらの免疫学的方法ではα型と
β型の区別のみならず、ダイマ−とモノマ−の区別も不
可能であった。
Ａ（放射性同位元素分析法）が知られている［プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc
eedings of the Natlional Academy of Science of the
United States of America)、第７６巻、第５４１１ペ
ージ、１９７９年、ブラッド・セルズ(Blood cells) 、
第５巻、第４２１ページ、１９７９年、およびブラッド
(Blood) 、第５８巻、第６３０ページ、１９８１年］
が、この方法は感度が1.4 〜4U/ml とあまり高くないこ
と、高価なこと、取扱いが一定の基準により認可された
施設を必要とすること等の問題がある。また、ＲＩＡに
比較してより安価で簡便に定量できるＥＩＡ（酵素標識
法）も知られている（特開平２- ５５９５５号公報）
が、いずれにしても、これらの免疫学的方法ではα型と
β型の区別のみならず、ダイマ−とモノマ−の区別も不
可能であった。
【０００８】そのためβ型ダイマ−のみを特異的に認識
する手段として、最も入手しやすいのがモノクロ−ナル
抗体であるが、モノクロ−ナル抗体の作出は、近年公知
の技術であり、特に新規な方法ではない。特にM-CSF に
関連したモノクロ−ナル抗体として、ヒトM-CSF α型ダ
イマ−を免疫することによって得られたM-CSF ダイマ−
を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体が開示されてい
る（WO90/09400号公報) 。しかしながら、このモノクロ
−ナル抗体は、M-CSF のダイマ−とモノマ−を区別し得
るが、α型とβ型の区別は不可能である。このことはWO
90/09400号公報第２０ページ６〜７行のクレ−ム２の次
のような記載、即ち、「本モノクロ−ナル抗体は、ｃＤ
ＮＡのα、β及びγクロ−ンによりコ−ドされるＭ−Ｃ
ＳＦに結合する。」から明らかである。
する手段として、最も入手しやすいのがモノクロ−ナル
抗体であるが、モノクロ−ナル抗体の作出は、近年公知
の技術であり、特に新規な方法ではない。特にM-CSF に
関連したモノクロ−ナル抗体として、ヒトM-CSF α型ダ
イマ−を免疫することによって得られたM-CSF ダイマ−
を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体が開示されてい
る（WO90/09400号公報) 。しかしながら、このモノクロ
−ナル抗体は、M-CSF のダイマ−とモノマ−を区別し得
るが、α型とβ型の区別は不可能である。このことはWO
90/09400号公報第２０ページ６〜７行のクレ−ム２の次
のような記載、即ち、「本モノクロ−ナル抗体は、ｃＤ
ＮＡのα、β及びγクロ−ンによりコ−ドされるＭ−Ｃ
ＳＦに結合する。」から明らかである。
【０００９】また、ヒト尿中には、β型ダイマーのみが
存在することが知られているが［ブラット(Blood) 、第
７７巻、第２１６０ページ、１９９１年］、ヒト尿中に
超微量含まれているβ型ダイマーを精製して医薬品とし
て使用する場合、家兎または馬から得たポリクロ−ナル
を用いた簡便な精製法が従来存在するのみであった。
存在することが知られているが［ブラット(Blood) 、第
７７巻、第２１６０ページ、１９９１年］、ヒト尿中に
超微量含まれているβ型ダイマーを精製して医薬品とし
て使用する場合、家兎または馬から得たポリクロ−ナル
を用いた簡便な精製法が従来存在するのみであった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】このように、β型ダイ
マ−に特異的に反応するモノクロ−ナル抗体、およびこ
の抗体を産生するハイブリドーマは従来知られておら
ず、従ってβ型ダイマ−だけを特異的に測定する方法は
皆無であり、β型ダイマ−の精製にも問題があった。
マ−に特異的に反応するモノクロ−ナル抗体、およびこ
の抗体を産生するハイブリドーマは従来知られておら
ず、従ってβ型ダイマ−だけを特異的に測定する方法は
皆無であり、β型ダイマ−の精製にも問題があった。
【００１１】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであり、β型ダイマ−とは反応するが、ヒ
トM-CSF α型モノマーおよびダイマーとは反応せず、ま
たヒトM-CSF β型モノマ−とも反応しないモノクロ−ナ
ル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマを提供す
ること、この抗体を使用して簡易、高感度でβ型ダイマ
−を定量する方法と、この定量法に使用する試薬を提供
すること、およびこの抗体を使用することによるβ型ダ
イマ−の簡便、かつ特異的な精製方法を提供すること、
を目的としている。
なされたものであり、β型ダイマ−とは反応するが、ヒ
トM-CSF α型モノマーおよびダイマーとは反応せず、ま
たヒトM-CSF β型モノマ−とも反応しないモノクロ−ナ
ル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマを提供す
ること、この抗体を使用して簡易、高感度でβ型ダイマ
−を定量する方法と、この定量法に使用する試薬を提供
すること、およびこの抗体を使用することによるβ型ダ
イマ−の簡便、かつ特異的な精製方法を提供すること、
を目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ヒトM-CSF β型ダイマ−に特異
的に反応し、ヒトM-CSF β型モノマ−、ヒトM-CSF α型
ダイマ−、およびヒトM-CSF α型モノマ−のいずれにも
反応しないことを特徴とするヒトM-CSF β型ダイマ−に
特異性を有するモノクロ−ナル抗体と、このモノクロ−
ナル抗体を産生するハイブリド−マを提供する。
を解決するものとして、ヒトM-CSF β型ダイマ−に特異
的に反応し、ヒトM-CSF β型モノマ−、ヒトM-CSF α型
ダイマ−、およびヒトM-CSF α型モノマ−のいずれにも
反応しないことを特徴とするヒトM-CSF β型ダイマ−に
特異性を有するモノクロ−ナル抗体と、このモノクロ−
ナル抗体を産生するハイブリド−マを提供する。
【００１３】またこの発明は、ヒトM-CSF β型ダイマ−
含有液のヒトM-CSF β型ダイマ−を免疫化学的に定量す
る方法において、上記モノクロ−ナル抗体を抗体として
使用することを特徴とするヒトM-CSF β型ダイマ−の免
疫化学的定量方法と、この免疫化学的定量に使用する試
薬において、上記モノクロ−ナル抗体を有効成分とする
ヒトM-CSF β型ダイマ−の免疫化学的定量用試薬を提供
する。
含有液のヒトM-CSF β型ダイマ−を免疫化学的に定量す
る方法において、上記モノクロ−ナル抗体を抗体として
使用することを特徴とするヒトM-CSF β型ダイマ−の免
疫化学的定量方法と、この免疫化学的定量に使用する試
薬において、上記モノクロ−ナル抗体を有効成分とする
ヒトM-CSF β型ダイマ−の免疫化学的定量用試薬を提供
する。
【００１４】さらに、この発明は、ヒトM-CSF β型ダイ
マ−含有液からヒトM-CSF β型ダイマ−を精製する方法
において、上記モノクロ−ナル抗体をヒトM-CSF β型ダ
イマ−の吸着体として使用することを特徴とするヒトM-
CSF β型ダイマ−の精製方法をも提供する。以下、この
発明の構成について、詳しく説明する。 （１）ハイブリドーマの作出 この発明のハイブリド−マの作出は、免疫、細胞融合、
融合細胞選択、アッセイおよびクロ−ニングの各工程よ
りなる公知の方法［ネイチャー(Nature)、第２５６巻、
第４９５ページ、１９７５年］により次のようにして行
うことができる。 1)免疫 精製β型ダイマ−を抗原として用い、これを完全フロイ
ンドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和し、
１週間〜数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜４
回注射し、動物を感作する。なお、精製β型ダイマ−
は、例えば特開昭64-22899号公報記載の方法により健康
な人の尿から分離、精製することができる。 2)細胞融合 前記の操作により免疫された動物から常法により摘出し
た脾臓細胞またはリンパ球Ｂ細胞と、骨髄腫細胞とを融
合し、細胞融合を得る。使用する骨髄腫細胞は、公知の
HGPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase)欠損マウスまたはラット骨髄腫細胞であり、ケーラ
ーおよびミルスタインの方法［ネイチャー(Nature)、第
２５６巻、第４９５ページ、１９７５年］により容易に
入手し得る。融合方法としてはHJV 法（センダイウイル
スを用いる方法）、ポリエチレングリコ−ル法（PEG
法）、電気融合法等の公知の方法が例示できる。 3)融合細胞の選択 次いで融合細胞のみが生育できる適当な選択培地中で２
〜４日毎に新鮮な選択培地と交換しながら細胞を10〜20
日間培養し、所望の融合細胞のみを選別する。HGPRT 欠
損骨髄腫細胞を融合親細胞として用いた場合、選択培地
としてはHAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine）
培地、HAz(Hypoxanthine, Azaserine)培地等を例示する
ことができる。 4)アッセイ アッセイ工程は、融合細胞の中から、目的とする特異抗
体産生細胞を選別する工程である。通常、選別は、培養
上清に含まれる抗体活性を固相または液相放射性同位元
素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫化学測定法（Ｅ
ＩＡ）、凝集法、蛍光抗体法等の公知の方法で規定する
ことにより行う。 5)クロ−ニング クロ−ニング工程は、目的の特異抗体産生細胞を一つの
クロ−ンから由来した均一な細胞集団とする工程であ
る。公知の限外希釈法等によって、モノクロ−ナルな細
胞に由来し、安定してβ型ダイマ−と反応する抗体を産
生する細胞株、いわゆるハイブリド−マを得る。
マ−含有液からヒトM-CSF β型ダイマ−を精製する方法
において、上記モノクロ−ナル抗体をヒトM-CSF β型ダ
イマ−の吸着体として使用することを特徴とするヒトM-
CSF β型ダイマ−の精製方法をも提供する。以下、この
発明の構成について、詳しく説明する。 （１）ハイブリドーマの作出 この発明のハイブリド−マの作出は、免疫、細胞融合、
融合細胞選択、アッセイおよびクロ−ニングの各工程よ
りなる公知の方法［ネイチャー(Nature)、第２５６巻、
第４９５ページ、１９７５年］により次のようにして行
うことができる。 1)免疫 精製β型ダイマ−を抗原として用い、これを完全フロイ
ンドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和し、
１週間〜数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜４
回注射し、動物を感作する。なお、精製β型ダイマ−
は、例えば特開昭64-22899号公報記載の方法により健康
な人の尿から分離、精製することができる。 2)細胞融合 前記の操作により免疫された動物から常法により摘出し
た脾臓細胞またはリンパ球Ｂ細胞と、骨髄腫細胞とを融
合し、細胞融合を得る。使用する骨髄腫細胞は、公知の
HGPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase)欠損マウスまたはラット骨髄腫細胞であり、ケーラ
ーおよびミルスタインの方法［ネイチャー(Nature)、第
２５６巻、第４９５ページ、１９７５年］により容易に
入手し得る。融合方法としてはHJV 法（センダイウイル
スを用いる方法）、ポリエチレングリコ−ル法（PEG
法）、電気融合法等の公知の方法が例示できる。 3)融合細胞の選択 次いで融合細胞のみが生育できる適当な選択培地中で２
〜４日毎に新鮮な選択培地と交換しながら細胞を10〜20
日間培養し、所望の融合細胞のみを選別する。HGPRT 欠
損骨髄腫細胞を融合親細胞として用いた場合、選択培地
としてはHAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine）
培地、HAz(Hypoxanthine, Azaserine)培地等を例示する
ことができる。 4)アッセイ アッセイ工程は、融合細胞の中から、目的とする特異抗
体産生細胞を選別する工程である。通常、選別は、培養
上清に含まれる抗体活性を固相または液相放射性同位元
素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫化学測定法（Ｅ
ＩＡ）、凝集法、蛍光抗体法等の公知の方法で規定する
ことにより行う。 5)クロ−ニング クロ−ニング工程は、目的の特異抗体産生細胞を一つの
クロ−ンから由来した均一な細胞集団とする工程であ
る。公知の限外希釈法等によって、モノクロ−ナルな細
胞に由来し、安定してβ型ダイマ−と反応する抗体を産
生する細胞株、いわゆるハイブリド−マを得る。
【００１５】以上の方法により得られたハイブリドーマ
は、β型ダイマ−に特異的に反応するモノクロ−ナル抗
体を産生するという機能的特徴を有している。その代表
的な例として、ラットのリンパ球Ｂ細胞とラットのミエ
ローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを、ハイブ
リドーマMO9106と命名し、通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託し、微工研条寄第3662号(FERM BP
-3662)なる受託番号が付された。
は、β型ダイマ−に特異的に反応するモノクロ−ナル抗
体を産生するという機能的特徴を有している。その代表
的な例として、ラットのリンパ球Ｂ細胞とラットのミエ
ローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマを、ハイブ
リドーマMO9106と命名し、通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託し、微工研条寄第3662号(FERM BP
-3662)なる受託番号が付された。
【００１６】このハイブリドーマMO9106は、次の性質を
有している。 ａ）由 来：ラット脾細胞（Lou ラット；実験動物
中央研究所より入手）とラットミエロ−マ細胞（Y3Ag1.
2.3 ）［ネイチャ−(Nature)、第２７７巻、第１３１ペ
−ジ、１９７９年］) との融合細胞であるハイブリド−
マ ｂ）形 態：非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する ｃ）継代培養 ：可能 ｄ）機能的特徴：β型ダイマ−に特異的に反応するモノ
クロ−ナル抗体の産生 ｅ）細胞増殖性：附着および浮遊の両者において良好 ｆ）保存条件 ：１０％ＤＭＳＯ，９０％ＦＣＳ中にて
−８０℃以下で保存するｇ）血清要求性：通常、１０％
ＦＣＳ添加培地にて培養する （２）モノクロ−ナル抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリド−マを組織培養用フ
ラスコに接種し、公知の無血清培地、血清を含む公知の
動物細胞用培地等で培養し、得られた培養上清から、あ
るいはプリスタン（2,6,10,14-Tetramethyl pentadecan
e)を前投与したマウス等の動物にこのハイブリド−マを
接種し、生体内培養して得た生体浸出液から、公知の方
法により精製される。即ち、得られた培養上清または生
体浸出液を通常の蛋白精製に用いられる生化学的方法、
例えば硫酸アンモニウムによる塩沈法、カラムクロマト
グラフィ−等により精製することができる。得られたモ
ノクロ−ナル抗体はβ型ダイマ−と特異的に結合し、単
一クロ−ンに由来する均一な抗体であり、ラットまたは
マウス由来であることを特徴としている。
有している。 ａ）由 来：ラット脾細胞（Lou ラット；実験動物
中央研究所より入手）とラットミエロ−マ細胞（Y3Ag1.
2.3 ）［ネイチャ−(Nature)、第２７７巻、第１３１ペ
−ジ、１９７９年］) との融合細胞であるハイブリド−
マ ｂ）形 態：非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する ｃ）継代培養 ：可能 ｄ）機能的特徴：β型ダイマ−に特異的に反応するモノ
クロ−ナル抗体の産生 ｅ）細胞増殖性：附着および浮遊の両者において良好 ｆ）保存条件 ：１０％ＤＭＳＯ，９０％ＦＣＳ中にて
−８０℃以下で保存するｇ）血清要求性：通常、１０％
ＦＣＳ添加培地にて培養する （２）モノクロ−ナル抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリド−マを組織培養用フ
ラスコに接種し、公知の無血清培地、血清を含む公知の
動物細胞用培地等で培養し、得られた培養上清から、あ
るいはプリスタン（2,6,10,14-Tetramethyl pentadecan
e)を前投与したマウス等の動物にこのハイブリド−マを
接種し、生体内培養して得た生体浸出液から、公知の方
法により精製される。即ち、得られた培養上清または生
体浸出液を通常の蛋白精製に用いられる生化学的方法、
例えば硫酸アンモニウムによる塩沈法、カラムクロマト
グラフィ−等により精製することができる。得られたモ
ノクロ−ナル抗体はβ型ダイマ−と特異的に結合し、単
一クロ−ンに由来する均一な抗体であり、ラットまたは
マウス由来であることを特徴としている。
【００１７】以上のようにして得られたこの発明のモノ
クロ−ナル抗体は、次に示す理化学的性質を有してい
る。 ラット由来のγグロブリンのIgG に属する。 IgG のIgG １サブクラスに属する。 Ｌ鎖として、κ鎖を有する。 （３）β型ダイマー測定用試薬 この発明のβ型ダイマー測定用試薬としては、ＥＩＡ試
薬が望ましく、各試薬を一組のセット（いわゆるキッ
ト）とするのが使用上便利であるため、以下キット化さ
れた試薬を例示して説明する。
クロ−ナル抗体は、次に示す理化学的性質を有してい
る。 ラット由来のγグロブリンのIgG に属する。 IgG のIgG １サブクラスに属する。 Ｌ鎖として、κ鎖を有する。 （３）β型ダイマー測定用試薬 この発明のβ型ダイマー測定用試薬としては、ＥＩＡ試
薬が望ましく、各試薬を一組のセット（いわゆるキッ
ト）とするのが使用上便利であるため、以下キット化さ
れた試薬を例示して説明する。
【００１８】この発明のβ型ダイマー測定用試薬は、例
えば固定化抗M-CSF 抗体（１次抗体）、抗M-CSF 抗体
（２次抗体）、酵素標識抗体（３次抗体）、活性測定用
基質、反応停止剤、検量線作成用標準品、および緩衝液
の７種の試薬から構成することができる。この発明のβ
型ダイマー測定用試薬の一例を示せば次のとおりであ
る。 固定化抗β型ダイマー抗体 固定化抗M-CSF 抗体は、１次抗体として用いられる抗M-
CSF 抗体を不溶性担体に固定化したものである。不溶性
担体としては、ビ−ズ、マイクロプレ−ト、繊維等が例
示できるが、マイクロプレ−トが望ましく、特にポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の透明な合成
樹脂製の酵素免疫測定法用マイクロタイトレ−ションプ
レ−トが好適である。
えば固定化抗M-CSF 抗体（１次抗体）、抗M-CSF 抗体
（２次抗体）、酵素標識抗体（３次抗体）、活性測定用
基質、反応停止剤、検量線作成用標準品、および緩衝液
の７種の試薬から構成することができる。この発明のβ
型ダイマー測定用試薬の一例を示せば次のとおりであ
る。 固定化抗β型ダイマー抗体 固定化抗M-CSF 抗体は、１次抗体として用いられる抗M-
CSF 抗体を不溶性担体に固定化したものである。不溶性
担体としては、ビ−ズ、マイクロプレ−ト、繊維等が例
示できるが、マイクロプレ−トが望ましく、特にポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の透明な合成
樹脂製の酵素免疫測定法用マイクロタイトレ−ションプ
レ−トが好適である。
【００１９】抗M-CSF 抗体（１次抗体）としては、この
発明のモノクロ−ナル抗体または公知の方法で得られた
ポリクロ−ナル抗体が使用できるが、ウサギ由来抗β型
ダイマー抗体が望ましい。公知の方法で得られるポリク
ロ−ナル抗体は、具体的には精製M-CSF を適当な動物
（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット
等）に免疫して得た抗血清から、通常の蛋白の精製法に
より精製することができる。 固定化は次のようにして
行われる。波長280nm で測定した吸光度により表わされ
る蛋白濃度が0.001 〜0.005 の範囲に抗体を溶解し、こ
の溶液の適量、例えば50〜100 μｌを容器に入れ、例え
ば０〜37℃で１〜24時間静置し、希釈液を除去する。適
量の洗浄液、例えば200 〜300 μｌを用い、望ましくは
１〜３回洗浄する。洗浄液としては、蒸留水、生理食塩
液、およびこれらに0.01〜1.0%のアルブミン、Tween-20
を添加溶解した液が使用できる。 抗M-CSF 抗体（２次抗体） ２次抗体として用いられる抗抗M-CSF 抗体は、１次抗体
がこの発明のモノクロ−ナル抗体であれば、公知の方法
により得られるポリクロ−ナル抗体であり、一次抗体が
公知の方法により得られるポリクロ−ナル抗体であれ
ば、そのモノクロ−ナル抗体を用いることができるが、
この発明のモノクロ−ナル抗体を用いるのが望ましい。 酵素標識抗体 酵素標識抗体は３次抗体として用いられる抗体に酵素を
標識したものである。標識用酵素はＥＩＡ試薬で通常用
いられる酵素、例えばパ−オキシダ−ゼ、アルカリフォ
スファタ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等が使用でき
るが、パ−オキシダ−ゼを用いるのが望ましい。３次抗
体は、２次抗体である抗M-CSF 抗体に対する抗体として
の役割を有している。具体的には２次抗体と同種動物に
由来するイムノグロブリンに対する抗体であり、例え
ば、２次抗体がこの発明のモノクロ−ナル抗体である場
合、３次抗体はラット由来イムノグロブリンに対する抗
体（抗ラット由来イムノグロブリン抗体）である。この
３次抗体は、公知の方法により次のようにして調製する
ことができる。即ち、２次抗体と同種動物由来のイムノ
グロブリンを適当な動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤ
ギ、ウサギ、モルモット等。ただし、２次抗体が由来す
る種とは異なることが望ましい）に免疫し、得られた抗
血清から精製するが、ヤギ由来のウサギイムノグロブリ
ンに対する抗体を用いるのが望ましい。標識方法は公知
の方法であり、例えば、Ｎ−サクシンイミジル３−（２
´−ピリジルジチオ）プロピオネ−トを用いる方法、グ
ルタルアルデヒドを用いる方法、Ｎ，Ｎ´−ο−フェニ
レンジマレイミドを用いる方法等を例示することができ
る。 活性測定用基質 酵素活性測定用基質は、使用する標識用酵素の種類によ
って異なるが、当該酵素に適当した基質の粉末、錠剤ま
たは溶液であり、例えばパ−オキシダ−ゼにはＡＢＴＳ
と過酸化水素、ο−フェニレンジアミンと過酸化水素の
組合せ等、またアルカリフォスファタ−ゼにはフェニル
リン酸と４−アミノアンチピリンの組合せ等を例示する
ことができる。 反応停止剤 反応停止剤も使用する標識用酵素の種類により異なる
が、使用する酵素に適当した公知の反応停止剤を用いる
ことができる。 検量線作成用標準品 この発明の試薬に用いられる標準品は後述する検量線を
作成するために用いられるものであり、溶液または凍結
乾燥品からなっている。標準品は緩衝液に溶解して使用
し、測定する物質の濃度に合わせて４〜６段階の濃度に
小分けして検量線の作成に使用することができる。 緩衝液 この発明の試薬キットに使用する緩衝液は、抗原抗体反
応用、および標識用酵素の酵素活性測定用、の２種類で
ある。抗原抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９、塩
濃度が0.01〜0.2M程度のものが好ましく、例えば0.1Mリ
ン酸塩緩衝化生理食塩液、ｐＨ7.0 を例示することがで
きる。酵素活性測定用緩衝液は、標識用酵素の種類によ
り異なるが、通常前記の抗原抗体反応用緩衝液を共用で
きる。標識用酵素の活性測定条件が、前記の抗原抗体反
応緩衝液の塩濃度、ｐＨと異なる場合に限り、酵素活性
測定用緩衝液を作成する。 ブロッキング剤 この発明の試薬キットには、他にブロッキング剤として
前記の抗原抗体反応用緩衝液に0.2 〜0.5 ％ＢＳＡ等
の蛋白質を溶解したものを用いる。ここにいう蛋白質
は、ＢＳＡ、ゼラチン等であり、特にＢＳＡに限定され
るものではない。
発明のモノクロ−ナル抗体または公知の方法で得られた
ポリクロ−ナル抗体が使用できるが、ウサギ由来抗β型
ダイマー抗体が望ましい。公知の方法で得られるポリク
ロ−ナル抗体は、具体的には精製M-CSF を適当な動物
（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット
等）に免疫して得た抗血清から、通常の蛋白の精製法に
より精製することができる。 固定化は次のようにして
行われる。波長280nm で測定した吸光度により表わされ
る蛋白濃度が0.001 〜0.005 の範囲に抗体を溶解し、こ
の溶液の適量、例えば50〜100 μｌを容器に入れ、例え
ば０〜37℃で１〜24時間静置し、希釈液を除去する。適
量の洗浄液、例えば200 〜300 μｌを用い、望ましくは
１〜３回洗浄する。洗浄液としては、蒸留水、生理食塩
液、およびこれらに0.01〜1.0%のアルブミン、Tween-20
を添加溶解した液が使用できる。 抗M-CSF 抗体（２次抗体） ２次抗体として用いられる抗抗M-CSF 抗体は、１次抗体
がこの発明のモノクロ−ナル抗体であれば、公知の方法
により得られるポリクロ−ナル抗体であり、一次抗体が
公知の方法により得られるポリクロ−ナル抗体であれ
ば、そのモノクロ−ナル抗体を用いることができるが、
この発明のモノクロ−ナル抗体を用いるのが望ましい。 酵素標識抗体 酵素標識抗体は３次抗体として用いられる抗体に酵素を
標識したものである。標識用酵素はＥＩＡ試薬で通常用
いられる酵素、例えばパ−オキシダ−ゼ、アルカリフォ
スファタ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等が使用でき
るが、パ−オキシダ−ゼを用いるのが望ましい。３次抗
体は、２次抗体である抗M-CSF 抗体に対する抗体として
の役割を有している。具体的には２次抗体と同種動物に
由来するイムノグロブリンに対する抗体であり、例え
ば、２次抗体がこの発明のモノクロ−ナル抗体である場
合、３次抗体はラット由来イムノグロブリンに対する抗
体（抗ラット由来イムノグロブリン抗体）である。この
３次抗体は、公知の方法により次のようにして調製する
ことができる。即ち、２次抗体と同種動物由来のイムノ
グロブリンを適当な動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤ
ギ、ウサギ、モルモット等。ただし、２次抗体が由来す
る種とは異なることが望ましい）に免疫し、得られた抗
血清から精製するが、ヤギ由来のウサギイムノグロブリ
ンに対する抗体を用いるのが望ましい。標識方法は公知
の方法であり、例えば、Ｎ−サクシンイミジル３−（２
´−ピリジルジチオ）プロピオネ−トを用いる方法、グ
ルタルアルデヒドを用いる方法、Ｎ，Ｎ´−ο−フェニ
レンジマレイミドを用いる方法等を例示することができ
る。 活性測定用基質 酵素活性測定用基質は、使用する標識用酵素の種類によ
って異なるが、当該酵素に適当した基質の粉末、錠剤ま
たは溶液であり、例えばパ−オキシダ−ゼにはＡＢＴＳ
と過酸化水素、ο−フェニレンジアミンと過酸化水素の
組合せ等、またアルカリフォスファタ−ゼにはフェニル
リン酸と４−アミノアンチピリンの組合せ等を例示する
ことができる。 反応停止剤 反応停止剤も使用する標識用酵素の種類により異なる
が、使用する酵素に適当した公知の反応停止剤を用いる
ことができる。 検量線作成用標準品 この発明の試薬に用いられる標準品は後述する検量線を
作成するために用いられるものであり、溶液または凍結
乾燥品からなっている。標準品は緩衝液に溶解して使用
し、測定する物質の濃度に合わせて４〜６段階の濃度に
小分けして検量線の作成に使用することができる。 緩衝液 この発明の試薬キットに使用する緩衝液は、抗原抗体反
応用、および標識用酵素の酵素活性測定用、の２種類で
ある。抗原抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９、塩
濃度が0.01〜0.2M程度のものが好ましく、例えば0.1Mリ
ン酸塩緩衝化生理食塩液、ｐＨ7.0 を例示することがで
きる。酵素活性測定用緩衝液は、標識用酵素の種類によ
り異なるが、通常前記の抗原抗体反応用緩衝液を共用で
きる。標識用酵素の活性測定条件が、前記の抗原抗体反
応緩衝液の塩濃度、ｐＨと異なる場合に限り、酵素活性
測定用緩衝液を作成する。 ブロッキング剤 この発明の試薬キットには、他にブロッキング剤として
前記の抗原抗体反応用緩衝液に0.2 〜0.5 ％ＢＳＡ等
の蛋白質を溶解したものを用いる。ここにいう蛋白質
は、ＢＳＡ、ゼラチン等であり、特にＢＳＡに限定され
るものではない。
【００２０】この発明のβ型ダイマー測定用試薬の他の
例を示せば次のとおりである。 ａ）固定化抗β型ダイマー抗体（１次抗体） 前記に準じて調製する。 ｂ）ビオチン化抗β型ダイマー抗体（２次抗体） ２次抗体として用いる抗体は、１次抗体がこの発明のモ
ノクローナル抗体である場合は公知の方法で得られるポ
リクロ−ナル抗体であり、一次抗体が公知の方法で得ら
れるポリクロ−ナル抗体である場合はそのモノクローナ
ル抗体である。いずれの場合においても公知の方法でビ
オチンを結合させる。具体的には、ＮＨＳ−ＬＣビオチ
ン等をＤＭＳＯ等を用いて反応させ、抗体に結合させ
る。 ｃ）酵素標識抗体 ビオチンと反応させるアビジンには、公知の方法で酵素
を標識する。標識する酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等を
例示することができ、特にパーオキシダーゼが望まし
い。 ｄ）活性測定用基質 前記に準じて調製する。 ｅ）反応停止液 前記に準じて調製する。 ｆ）検量線作成用標準品 前記に準じて調製する。 ｇ）緩衝液 この発明の試薬キットに使用する緩衝液は、抗原抗体反
応用、ビオチン・アビジン反応用、および標識酵素の酵
素活性測定用の３種類である。抗原抗体反応用、および
標識酵素の酵素活性測定用の緩衝液は、前記に準じて
調製する。ビオチン・アビジン反応用の緩衝液は、アビ
ジンが非特異的にビオチンと結合するため0.01〜0.1 ％
の蛋白質を含むｐＨ６〜９、0.01〜0.2Mの塩濃度が望ま
しく、例えば0.02％ＢＳＡを含む0.1Mリン酸塩緩衝化生
理食塩液（ｐＨ7.0 ）を例示することができる。緩衝液
の蛋白質は、ＢＳＡ、ゼラチン等であり、特にＢＳＡに
限定されるものではない。 ｈ）ブロッキング剤 前記に準じて作成する。
例を示せば次のとおりである。 ａ）固定化抗β型ダイマー抗体（１次抗体） 前記に準じて調製する。 ｂ）ビオチン化抗β型ダイマー抗体（２次抗体） ２次抗体として用いる抗体は、１次抗体がこの発明のモ
ノクローナル抗体である場合は公知の方法で得られるポ
リクロ−ナル抗体であり、一次抗体が公知の方法で得ら
れるポリクロ−ナル抗体である場合はそのモノクローナ
ル抗体である。いずれの場合においても公知の方法でビ
オチンを結合させる。具体的には、ＮＨＳ−ＬＣビオチ
ン等をＤＭＳＯ等を用いて反応させ、抗体に結合させ
る。 ｃ）酵素標識抗体 ビオチンと反応させるアビジンには、公知の方法で酵素
を標識する。標識する酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等を
例示することができ、特にパーオキシダーゼが望まし
い。 ｄ）活性測定用基質 前記に準じて調製する。 ｅ）反応停止液 前記に準じて調製する。 ｆ）検量線作成用標準品 前記に準じて調製する。 ｇ）緩衝液 この発明の試薬キットに使用する緩衝液は、抗原抗体反
応用、ビオチン・アビジン反応用、および標識酵素の酵
素活性測定用の３種類である。抗原抗体反応用、および
標識酵素の酵素活性測定用の緩衝液は、前記に準じて
調製する。ビオチン・アビジン反応用の緩衝液は、アビ
ジンが非特異的にビオチンと結合するため0.01〜0.1 ％
の蛋白質を含むｐＨ６〜９、0.01〜0.2Mの塩濃度が望ま
しく、例えば0.02％ＢＳＡを含む0.1Mリン酸塩緩衝化生
理食塩液（ｐＨ7.0 ）を例示することができる。緩衝液
の蛋白質は、ＢＳＡ、ゼラチン等であり、特にＢＳＡに
限定されるものではない。 ｈ）ブロッキング剤 前記に準じて作成する。
【００２１】以上のようにしてこの発明のβ型ダイマー
測定用試薬は調製され、次に記載するようにして、試料
に含まれるβ型ダイマーの定量に使用される。 （４）β型ダイマーの定量方法 β型ダイマーの定量法には、幾通りかの方法が考えられ
るが、前記（３）の〜の試薬を用いて実施する例を
示せば次のとおりである。各試薬の調製および検量線の
作製は前記（３）に記載したとおりである。試料に含ま
れるβ型ダイマーの濃度は、得られた検量線に、検量線
作成用標準品と同様の操作を行った濃度未知のサンプル
から得られる吸光値を代入することにより、次のように
して定量することができる。
測定用試薬は調製され、次に記載するようにして、試料
に含まれるβ型ダイマーの定量に使用される。 （４）β型ダイマーの定量方法 β型ダイマーの定量法には、幾通りかの方法が考えられ
るが、前記（３）の〜の試薬を用いて実施する例を
示せば次のとおりである。各試薬の調製および検量線の
作製は前記（３）に記載したとおりである。試料に含ま
れるβ型ダイマーの濃度は、得られた検量線に、検量線
作成用標準品と同様の操作を行った濃度未知のサンプル
から得られる吸光値を代入することにより、次のように
して定量することができる。
【００２２】濃度未知の試料（例えばヒトの尿等）を、
生理食塩水を用いて１〜８倍程度に段階的に希釈し、希
釈液の吸光度を測定し、検量線の範囲に入った吸光度か
らその吸光度に対応するβ型ダイマ−の濃度を求め、希
釈率を乗じて元の試料に含まれるβ型ダイマ−の濃度を
定量することができる。この発明の方法により定量し得
る試料は、もちろん尿に限定されるわけではなく、他に
は例えば腫瘍細胞の培養上清、ヒト血清等がある。これ
らも前記ヒト尿と同様に測定することが可能であるが、
試料中に含まれるβ型ダイマ−の濃度が高く検量線範囲
を超えるようであれば、さらに段階希釈を行い、定量す
ることが可能である。逆に試料に含まれるβ型ダイマ−
の濃度が低い場合は、試料を濃縮して測定することも可
能である。 （５）β型ダイマ−の精製方法 人尿中には、β型ダイマ−およびヒトM-CSF β型モノマ
−が存在しているが、生物活性を有するのはダイマ−の
みであり、このダイマーを精製する必要がある。この発
明の精製方法においては、この発明の抗体を適当な担
体、例えばホルミルセルロファイン（商標。チッソ社
製）、ブロモシアン活性化セファロ−ス４Ｂ（商標。フ
ァルマシア社製）等に結合させた抗体カラムを使用し、
その他は常法により人尿から極めて簡便にβ型ダイマ−
を精製することができる。
生理食塩水を用いて１〜８倍程度に段階的に希釈し、希
釈液の吸光度を測定し、検量線の範囲に入った吸光度か
らその吸光度に対応するβ型ダイマ−の濃度を求め、希
釈率を乗じて元の試料に含まれるβ型ダイマ−の濃度を
定量することができる。この発明の方法により定量し得
る試料は、もちろん尿に限定されるわけではなく、他に
は例えば腫瘍細胞の培養上清、ヒト血清等がある。これ
らも前記ヒト尿と同様に測定することが可能であるが、
試料中に含まれるβ型ダイマ−の濃度が高く検量線範囲
を超えるようであれば、さらに段階希釈を行い、定量す
ることが可能である。逆に試料に含まれるβ型ダイマ−
の濃度が低い場合は、試料を濃縮して測定することも可
能である。 （５）β型ダイマ−の精製方法 人尿中には、β型ダイマ−およびヒトM-CSF β型モノマ
−が存在しているが、生物活性を有するのはダイマ−の
みであり、このダイマーを精製する必要がある。この発
明の精製方法においては、この発明の抗体を適当な担
体、例えばホルミルセルロファイン（商標。チッソ社
製）、ブロモシアン活性化セファロ−ス４Ｂ（商標。フ
ァルマシア社製）等に結合させた抗体カラムを使用し、
その他は常法により人尿から極めて簡便にβ型ダイマ−
を精製することができる。
【００２３】ホルミルセルロファイン（商標。チッソ社
製）を担体に使用する場合についてこの発明の精製方法
を例示すれば、次のとおりである。この発明の抗体を0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0 ）に溶解し、抗体
溶液を調製する。これとは別にホルミルセルロファイン
を蒸留水および0.1Mリン酸ナトリウムで洗浄し、吸引濾
過して緩衝液を除去し、ホルミルセルロファイン１ｇ
（湿重量）を５０mlの三角フラスコに採取し、適当な濃
度の抗体溶液２mlを添加し、室温で２時間撹拌し、次い
で７mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを添加し、更に
室温で10時間撹拌して抗体を結合させる。のち、0.2Mト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）で洗浄し、５mgの水素化
シアノホウ素ナトリウムを含む２mlのトリス−塩酸緩衝
液を加え、室温で４時間撹拌して、反応基を失活させ
る。この担体を適当な大きさのカラムに充填し、予め溶
出液である0.02M グリシン−塩酸溶液（ｐＨ3.0 ）１０
mlおよび洗浄液である３M チオシアン酸カリウム１０ml
を通液し、余分な蛋白質を除去する。この抗体カラムに
健康な人から採取した尿100ml を通液し、生理食塩水１
０mlを通液して抗体に結合しない蛋白質を除去する。次
に、0.02M グリシン−塩酸溶液（ｐＨ3.0 ）１０mlを通
液し、抗体結合蛋白質を溶出させ、目的とするβ型ダイ
マ−を含有する画分を得る。のち３M オシアン酸カリウ
ム１０mlを通液し、非特異的に結合している余分な蛋白
質を除去し、次回の使用に備える。
製）を担体に使用する場合についてこの発明の精製方法
を例示すれば、次のとおりである。この発明の抗体を0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0 ）に溶解し、抗体
溶液を調製する。これとは別にホルミルセルロファイン
を蒸留水および0.1Mリン酸ナトリウムで洗浄し、吸引濾
過して緩衝液を除去し、ホルミルセルロファイン１ｇ
（湿重量）を５０mlの三角フラスコに採取し、適当な濃
度の抗体溶液２mlを添加し、室温で２時間撹拌し、次い
で７mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを添加し、更に
室温で10時間撹拌して抗体を結合させる。のち、0.2Mト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）で洗浄し、５mgの水素化
シアノホウ素ナトリウムを含む２mlのトリス−塩酸緩衝
液を加え、室温で４時間撹拌して、反応基を失活させ
る。この担体を適当な大きさのカラムに充填し、予め溶
出液である0.02M グリシン−塩酸溶液（ｐＨ3.0 ）１０
mlおよび洗浄液である３M チオシアン酸カリウム１０ml
を通液し、余分な蛋白質を除去する。この抗体カラムに
健康な人から採取した尿100ml を通液し、生理食塩水１
０mlを通液して抗体に結合しない蛋白質を除去する。次
に、0.02M グリシン−塩酸溶液（ｐＨ3.0 ）１０mlを通
液し、抗体結合蛋白質を溶出させ、目的とするβ型ダイ
マ−を含有する画分を得る。のち３M オシアン酸カリウ
ム１０mlを通液し、非特異的に結合している余分な蛋白
質を除去し、次回の使用に備える。
【００２４】以上の操作を行うことにより、人尿に含ま
れる蛋白質中のβ型ダイマ−を、少なくとも２５０倍に
精製することができる。この発明の精製方法は、遺伝子
組換えによって得られるβ型ダイマーにも利用できる。
次に試験例を示してこの発明の作用効果を実証する。 試験例１ この試験は、この発明のハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体がβ型ダイマ−のみと特異的に反応する
ことを調べるために行った。 (1) 試料の調製 a)β型ダイマ−の調製 特開昭６４−２２８９９号公報の実施例１記載の方法に
より人尿から調製したβ型ダイマ−を、安定剤として0.
25mg／mlのＨＳＡを含む生理食塩水に溶解し、凍結保存
して使用した。
れる蛋白質中のβ型ダイマ−を、少なくとも２５０倍に
精製することができる。この発明の精製方法は、遺伝子
組換えによって得られるβ型ダイマーにも利用できる。
次に試験例を示してこの発明の作用効果を実証する。 試験例１ この試験は、この発明のハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体がβ型ダイマ−のみと特異的に反応する
ことを調べるために行った。 (1) 試料の調製 a)β型ダイマ−の調製 特開昭６４−２２８９９号公報の実施例１記載の方法に
より人尿から調製したβ型ダイマ−を、安定剤として0.
25mg／mlのＨＳＡを含む生理食塩水に溶解し、凍結保存
して使用した。
【００２５】b)ヒトＭ−ＣＳＦβ型モノマ−の調製 上記β型ダイマ−調製過程において得られるヒトＭ−Ｃ
ＳＦβ型モノマ−を安定剤として0.25mg／mlのＨＳＡを
含む生理食塩水中に溶解し、凍結保存して使用した。 c)ヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−の調製 凍結乾燥品である市販品（ジェンザイム社製）から調製
した。
ＳＦβ型モノマ−を安定剤として0.25mg／mlのＨＳＡを
含む生理食塩水中に溶解し、凍結保存して使用した。 c)ヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−の調製 凍結乾燥品である市販品（ジェンザイム社製）から調製
した。
【００２６】d)モノクローナル抗体の調製 実施例２と同一の方法により調製した。 (2) 試験方法 前記(1) のa)〜c)で調製したβ型ダイマ−、ヒトＭ−Ｃ
ＳＦβ型モノマ−、およびヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−
を各々０，２，４，６，８，１０ng/ml の割合で生理食
塩水により希釈した以外は、実施例３と同一の方法によ
り試験を実施した。 (3) 試験結果 この試験の結果は図１に示したとおりである。図１はこ
の発明のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
と各種ヒトＭ−ＣＳＦとの反応性を示し、縦軸および横
軸は、それぞれ吸光度、および各種ヒトＭ−ＣＳＦの濃
度を示し、図中−○−、−●−、および−□−は、それ
ぞれβ型ダイマ−、ヒトＭ−ＣＳＦβ型モノマ−、およ
びヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−を示す。
ＳＦβ型モノマ−、およびヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−
を各々０，２，４，６，８，１０ng/ml の割合で生理食
塩水により希釈した以外は、実施例３と同一の方法によ
り試験を実施した。 (3) 試験結果 この試験の結果は図１に示したとおりである。図１はこ
の発明のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
と各種ヒトＭ−ＣＳＦとの反応性を示し、縦軸および横
軸は、それぞれ吸光度、および各種ヒトＭ−ＣＳＦの濃
度を示し、図中−○−、−●−、および−□−は、それ
ぞれβ型ダイマ−、ヒトＭ−ＣＳＦβ型モノマ−、およ
びヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−を示す。
【００２７】図１から明らかなように、この発明のハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、いずれの
濃度においてもβ型ダイマ−とのみ反応し、ヒトＭ−Ｃ
ＳＦβ型モノマ−、およびヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−
とはほとんど反応しないことが認められた。なお、原料
および試料の調製方法を変更して同様に試験してもほぼ
同様の結果が得られた。 試験例２ この試験は、この発明のハイブリドーマの抗体産生を調
べるために行った。 (1) 試料の調製 a)β型ダイマ− 試験例１と同一の方法により調製した。 b)モノクロ−ナル抗体 ハイブリド−マの培養上清をそのまま使用した。 (2) 試験方法 1)ハイブリド−マの継代培養 １０%FCSを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０ml
に、実施例１で得たハイブリドーマMO9106を１〜２×１
０5 ／mlの割合で懸濁し、ＣＯ2 インキュベ−タ−内で
静置培養した。ハ−ベスト時には全量を回収し、遠心分
離してハイブリド−マと培養上清とを分離し、上記に示
したハイブリド−マの必要量だけをそのまま次の培養に
移した。 2)培養上清の力価測定 β型ダイマ−を５０ng/ml の濃度に生理食塩水で希釈
し、 100μｌ／ウエルの割合でポリスチレン製の９６ウ
エル酵素免疫測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−
ト（ヌンク社製）に分注し、37℃で１時間静置し、希釈
液を除去し、0.5 ％のTween 20を含む生理食塩水を300
μｌ／ウエルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して
液を除去する操作を３回反復して洗浄した。なお、以下
の洗浄はすべてこの方法で行った。
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、いずれの
濃度においてもβ型ダイマ−とのみ反応し、ヒトＭ−Ｃ
ＳＦβ型モノマ−、およびヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−
とはほとんど反応しないことが認められた。なお、原料
および試料の調製方法を変更して同様に試験してもほぼ
同様の結果が得られた。 試験例２ この試験は、この発明のハイブリドーマの抗体産生を調
べるために行った。 (1) 試料の調製 a)β型ダイマ− 試験例１と同一の方法により調製した。 b)モノクロ−ナル抗体 ハイブリド−マの培養上清をそのまま使用した。 (2) 試験方法 1)ハイブリド−マの継代培養 １０%FCSを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０ml
に、実施例１で得たハイブリドーマMO9106を１〜２×１
０5 ／mlの割合で懸濁し、ＣＯ2 インキュベ−タ−内で
静置培養した。ハ−ベスト時には全量を回収し、遠心分
離してハイブリド−マと培養上清とを分離し、上記に示
したハイブリド−マの必要量だけをそのまま次の培養に
移した。 2)培養上清の力価測定 β型ダイマ−を５０ng/ml の濃度に生理食塩水で希釈
し、 100μｌ／ウエルの割合でポリスチレン製の９６ウ
エル酵素免疫測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−
ト（ヌンク社製）に分注し、37℃で１時間静置し、希釈
液を除去し、0.5 ％のTween 20を含む生理食塩水を300
μｌ／ウエルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して
液を除去する操作を３回反復して洗浄した。なお、以下
の洗浄はすべてこの方法で行った。
【００２８】実施例３の(2) に従い、0.3 ％ゼラチン
水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プレ−トに分注
し、37℃で１時間静置し、希釈液を除去し、前記と同様
に洗浄した。 ハイブリド−マの培養上清を生理食塩水で２〜２20倍
まで段階希釈し、各希釈液を 100μｌ／ウエルの割合で
ポリスチレン製の９６ウエル酵素免疫測定法用マイクロ
タイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社製）に分注し、37
℃で１時間静置し、希釈液を除去し、前記と同様に洗浄
した。
水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プレ−トに分注
し、37℃で１時間静置し、希釈液を除去し、前記と同様
に洗浄した。 ハイブリド−マの培養上清を生理食塩水で２〜２20倍
まで段階希釈し、各希釈液を 100μｌ／ウエルの割合で
ポリスチレン製の９６ウエル酵素免疫測定法用マイクロ
タイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社製）に分注し、37
℃で１時間静置し、希釈液を除去し、前記と同様に洗浄
した。
【００２９】実施例３の(5) に従いＨＲＰ標識抗ラッ
トIgG （ジャクソン・イムノリサ−チ社製）を生理食塩
水で5000倍に希釈し、 100μｌ／ウエルの割合でプレ−
トに分注し、37℃で１時間静置し、希釈液を除去し、洗
浄した。 実施例３の(6) に従い、酵素基質としてABTSと過酸化
水素（ケ−・ピ−・エル社製）を 100μｌ／ウエルの割
合でプレ−トに分注し、室温で３０分放置し、のちＥＩ
Ａリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）により吸光度を測定
し、ＥＩＡリ−ダ−で測定可能な最大の吸光度（2.0)と
ブランク値との差の1/2 の値を示す希釈段階をこの発明
のモノクロ−ナル抗体の抗体価と定義し、各継代培養に
ついて各希釈段階の中からこの定義に該当する吸光度を
示した希釈倍率を抗体価として表１に示した。 (3) 試験結果 この試験の結果は表１に示したとおりである。表１から
明らかなようにハイブリド−マMO9106は、９回の継代培
養を重ねてもモノクロ−ナル抗体の産生量にはほとんど
変化が無く、生存率（回収細胞数に対する生存細胞数の
百分率）も９０％を維持していた。なお、同様の試験を
反復して実施したが、ほぼ同一の結果が得られた。
トIgG （ジャクソン・イムノリサ−チ社製）を生理食塩
水で5000倍に希釈し、 100μｌ／ウエルの割合でプレ−
トに分注し、37℃で１時間静置し、希釈液を除去し、洗
浄した。 実施例３の(6) に従い、酵素基質としてABTSと過酸化
水素（ケ−・ピ−・エル社製）を 100μｌ／ウエルの割
合でプレ−トに分注し、室温で３０分放置し、のちＥＩ
Ａリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）により吸光度を測定
し、ＥＩＡリ−ダ−で測定可能な最大の吸光度（2.0)と
ブランク値との差の1/2 の値を示す希釈段階をこの発明
のモノクロ−ナル抗体の抗体価と定義し、各継代培養に
ついて各希釈段階の中からこの定義に該当する吸光度を
示した希釈倍率を抗体価として表１に示した。 (3) 試験結果 この試験の結果は表１に示したとおりである。表１から
明らかなようにハイブリド−マMO9106は、９回の継代培
養を重ねてもモノクロ−ナル抗体の産生量にはほとんど
変化が無く、生存率（回収細胞数に対する生存細胞数の
百分率）も９０％を維持していた。なお、同様の試験を
反復して実施したが、ほぼ同一の結果が得られた。
【００３０】
【表１】
【００３１】次に実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限
定されるものではない。
かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限
定されるものではない。
【００３２】
実施例１（ハイブリドーマの作出） (1) 動物の免疫 生理食塩水で希釈したβ型ダイマ−と不完全フロインド
・アジュバントとの1:1 のエマルジョンを調製し、５−
８週齢の雌のLou ラット（実験動物中央研究所から入
手）の背部皮下および腹腔に、ラット１匹あたりβ型ダ
イマ−として100〜200 堯（エマルジョン量として0.5
〜1.0ml)を投与した。追加免疫は不完全フロインド・ア
ジュバントを用いて２〜３週間毎に行い、β型ダイマ−
の投与量は１匹あたり50〜100 堯とした。追加免疫終了
１週間目に採血し、血清中の抗体価をＥＩＡ法により測
定し、抗体価の上昇がプラト−に達し、さらにＥＩＡ法
での抗体価がコントロールに比較して数万から数十万倍
と十分に高い抗体価が認められるまで追加免疫を継続し
た。 (2) 細胞融合 高抗体価が認められたラット４匹にβ型ダイマ−溶液を
１匹あたり100 堯の割合で腹腔内投与し、４日後に脾臓
を摘出した。ラット骨髄腫細胞（Y3Ag1.2.3)［ネイチャ
−（Nature) 、第２７７巻、第１３１ペ−ジ、１９７９
年］と前記ラット脾細胞とを細胞数比で１：５の割合で
ポリエチレングリコ−ル1500を用いて融合した。１０％
ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）を用いてポ
リエチレングリコ−ルを洗浄除去し、細胞をＨＡＴ培地
（シグマ社製）に懸濁し、９６穴プレ−ト（ヌンク社
製）に約１０5 cells/ウエルずつ分注し、３７℃、７％
ＣＯ 2 下で７日間培養した。その結果、１２ウエルの細
胞に抗体産生が認められた。 (3) スクリ−ニングおよびクロ−ニング 前記ハイブリド−マの増殖を終了した各ウエルの培地を
一部採取し、常法により抗体産生活性のスクリ−ニング
を行い、抗原に対して高い力価が認められるウエルにつ
いて限界希釈法により次のようにクロ−ニングを行っ
た。ラット腹腔滲出細胞をフィ−ダ−細胞として用い、
コロニ−形成ウエルの培養上清の抗体価をＥＩＡ法によ
り測定し、抗体産生が認められたウエルについて、前記
と同様の方法により再度クロ−ニングを行い、さらに前
記と同様の方法により培養し、産生された培養上清に含
まれる抗体の性質を同様の方法で試験した。
・アジュバントとの1:1 のエマルジョンを調製し、５−
８週齢の雌のLou ラット（実験動物中央研究所から入
手）の背部皮下および腹腔に、ラット１匹あたりβ型ダ
イマ−として100〜200 堯（エマルジョン量として0.5
〜1.0ml)を投与した。追加免疫は不完全フロインド・ア
ジュバントを用いて２〜３週間毎に行い、β型ダイマ−
の投与量は１匹あたり50〜100 堯とした。追加免疫終了
１週間目に採血し、血清中の抗体価をＥＩＡ法により測
定し、抗体価の上昇がプラト−に達し、さらにＥＩＡ法
での抗体価がコントロールに比較して数万から数十万倍
と十分に高い抗体価が認められるまで追加免疫を継続し
た。 (2) 細胞融合 高抗体価が認められたラット４匹にβ型ダイマ−溶液を
１匹あたり100 堯の割合で腹腔内投与し、４日後に脾臓
を摘出した。ラット骨髄腫細胞（Y3Ag1.2.3)［ネイチャ
−（Nature) 、第２７７巻、第１３１ペ−ジ、１９７９
年］と前記ラット脾細胞とを細胞数比で１：５の割合で
ポリエチレングリコ−ル1500を用いて融合した。１０％
ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）を用いてポ
リエチレングリコ−ルを洗浄除去し、細胞をＨＡＴ培地
（シグマ社製）に懸濁し、９６穴プレ−ト（ヌンク社
製）に約１０5 cells/ウエルずつ分注し、３７℃、７％
ＣＯ 2 下で７日間培養した。その結果、１２ウエルの細
胞に抗体産生が認められた。 (3) スクリ−ニングおよびクロ−ニング 前記ハイブリド−マの増殖を終了した各ウエルの培地を
一部採取し、常法により抗体産生活性のスクリ−ニング
を行い、抗原に対して高い力価が認められるウエルにつ
いて限界希釈法により次のようにクロ−ニングを行っ
た。ラット腹腔滲出細胞をフィ−ダ−細胞として用い、
コロニ−形成ウエルの培養上清の抗体価をＥＩＡ法によ
り測定し、抗体産生が認められたウエルについて、前記
と同様の方法により再度クロ−ニングを行い、さらに前
記と同様の方法により培養し、産生された培養上清に含
まれる抗体の性質を同様の方法で試験した。
【００３３】以上の操作によりβ型ダイマーに特異的に
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
（MO9106) を作出した。 実施例２（モノクローナル抗体の取得） 実施例１で得た抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル抗
体産生ハイブリド−マ（MO9106) １×１０5 を１０％Ｆ
ＣＳを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０mlで培養
し、のち培養上清を1/2 容量に濃縮し、プロテイン・ジ
ー・セファロース・エフエフ［protein G sepharose ff
（商標。ファルマシア社製）］17.8mlをカラム（直径１
cm、長さ１０cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、濃縮
した前記培養上清をカラムに通液し、再び生理食塩水で
洗浄し、余分な蛋白質を除去し、その後0.02M のグリシ
ン塩酸緩衝液（ｐＨ3.0 ）を用いて抗β型ダイマー特異
的モノクローナル抗体を溶出させた。溶出液に１M トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）を添加し、溶出液のｐＨを中
性付近に調整し、抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル
抗体約６０ngを含む溶液約５０mlを得た。 実施例３（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗ヒトM-CSF ポリクロ−ナ
ル抗体をＰＢＳに１堯／mlの濃度で溶解し、 100μｌ／
ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免疫測
定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社
製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、 0.5％のTween 20を含むＰＢＳを 300μｌ／ウエル
の割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去する
操作を３回反復して洗浄した。なお、以下の洗浄はすべ
てこの方法で行った。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ｎg/mlの範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体をＰＢ
Ｓに１堯／mlの濃度で溶解し、 100μｌ／ウエルの割合
でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を
除去し、洗浄した。 (5) ３次抗体 ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサ−
チ社製）をＰＢＳで5000倍に希釈し、 100μｌ／ウエル
の割合でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希
釈液を除去し、洗浄した。 (6) 活性測定用基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を 100
μｌ／ウエルの割合でプレ−トに分注し、室温で３０分
放置し、のちＥＩＡリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）に
より吸光度を測定した。検量線作成用標準品の吸光度を
縦軸に、検量線作成用標準品の濃度を横軸にとり、図２
に示す検量線を作成した。 (7) β型ダイマーの定量 図２の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
（MO9106) を作出した。 実施例２（モノクローナル抗体の取得） 実施例１で得た抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル抗
体産生ハイブリド−マ（MO9106) １×１０5 を１０％Ｆ
ＣＳを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０mlで培養
し、のち培養上清を1/2 容量に濃縮し、プロテイン・ジ
ー・セファロース・エフエフ［protein G sepharose ff
（商標。ファルマシア社製）］17.8mlをカラム（直径１
cm、長さ１０cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、濃縮
した前記培養上清をカラムに通液し、再び生理食塩水で
洗浄し、余分な蛋白質を除去し、その後0.02M のグリシ
ン塩酸緩衝液（ｐＨ3.0 ）を用いて抗β型ダイマー特異
的モノクローナル抗体を溶出させた。溶出液に１M トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）を添加し、溶出液のｐＨを中
性付近に調整し、抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル
抗体約６０ngを含む溶液約５０mlを得た。 実施例３（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗ヒトM-CSF ポリクロ−ナ
ル抗体をＰＢＳに１堯／mlの濃度で溶解し、 100μｌ／
ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免疫測
定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社
製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、 0.5％のTween 20を含むＰＢＳを 300μｌ／ウエル
の割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去する
操作を３回反復して洗浄した。なお、以下の洗浄はすべ
てこの方法で行った。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ｎg/mlの範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体をＰＢ
Ｓに１堯／mlの濃度で溶解し、 100μｌ／ウエルの割合
でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を
除去し、洗浄した。 (5) ３次抗体 ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサ−
チ社製）をＰＢＳで5000倍に希釈し、 100μｌ／ウエル
の割合でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希
釈液を除去し、洗浄した。 (6) 活性測定用基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を 100
μｌ／ウエルの割合でプレ−トに分注し、室温で３０分
放置し、のちＥＩＡリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）に
より吸光度を測定した。検量線作成用標準品の吸光度を
縦軸に、検量線作成用標準品の濃度を横軸にとり、図２
に示す検量線を作成した。 (7) β型ダイマーの定量 図２の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
【００３４】健康な人から集めた尿を１〜８倍に生理食
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。測定された吸光度のうち、検量線の範囲内
の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.603 、および
0.391 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃度を図２の
検量線から求め、6.6 ng／mlおよび3.0 ng／mlを得た。
後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値（6.0 ng／m
l）は、１倍で測定した値(6.6ng／ml) とほぼ同じであ
り、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度は、これらの
平均値から6.3 ng／mlと定量された。 実施例４（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗M-CSF ポリクロ−ナル抗
体を、生理食塩水に１堯／mlの割合で溶解し、 100μｌ
／ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免疫
測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社
製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、0.5 ％のTween 20を含むＰＢＳを３００μｌ／ウエ
ルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去す
る操作を３回反復して洗浄した。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ng/ml の範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体を常法
（口野嘉幸ら編、”遺伝子・蛋白質実験操作ブロッティ
ング法”、２４１頁、ソフトサイエンス社、昭和６３
年）によりビオチン化し、ＰＢＳに１堯／mlとなるよう
に溶解し、 100μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−
トに入れ、３７℃で１時間静置し、のち希釈液を除去
し、洗浄した。 (5) ＨＲＰ標識アビジン ３次抗体の代替として、ＨＲＰ標識アビジン（ベクタ−
社製）を用い、これを生理食塩水で5000倍に希釈し、 1
00μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−トに入れ、室
温で３０分静置後、希釈液を除去、洗浄した。 (6) 活性測定用酵素基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を使用
し、 100μｌ／ウエルの割合でプレ−トに入れ、室温で
３０分放置後、ＥＩＡリ−ダ−により吸光度を測定し
た。検量線作成用標準品の吸光度を縦軸に、検量線作成
用標準品の濃度を横軸にとり、図３に示す検量線を作成
した。 (7) β型ダイマーの定量 図３の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。測定された吸光度のうち、検量線の範囲内
の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.603 、および
0.391 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃度を図２の
検量線から求め、6.6 ng／mlおよび3.0 ng／mlを得た。
後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値（6.0 ng／m
l）は、１倍で測定した値(6.6ng／ml) とほぼ同じであ
り、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度は、これらの
平均値から6.3 ng／mlと定量された。 実施例４（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗M-CSF ポリクロ−ナル抗
体を、生理食塩水に１堯／mlの割合で溶解し、 100μｌ
／ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免疫
測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社
製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、0.5 ％のTween 20を含むＰＢＳを３００μｌ／ウエ
ルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去す
る操作を３回反復して洗浄した。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ng/ml の範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体を常法
（口野嘉幸ら編、”遺伝子・蛋白質実験操作ブロッティ
ング法”、２４１頁、ソフトサイエンス社、昭和６３
年）によりビオチン化し、ＰＢＳに１堯／mlとなるよう
に溶解し、 100μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−
トに入れ、３７℃で１時間静置し、のち希釈液を除去
し、洗浄した。 (5) ＨＲＰ標識アビジン ３次抗体の代替として、ＨＲＰ標識アビジン（ベクタ−
社製）を用い、これを生理食塩水で5000倍に希釈し、 1
00μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−トに入れ、室
温で３０分静置後、希釈液を除去、洗浄した。 (6) 活性測定用酵素基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を使用
し、 100μｌ／ウエルの割合でプレ−トに入れ、室温で
３０分放置後、ＥＩＡリ−ダ−により吸光度を測定し
た。検量線作成用標準品の吸光度を縦軸に、検量線作成
用標準品の濃度を横軸にとり、図３に示す検量線を作成
した。 (7) β型ダイマーの定量 図３の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
【００３５】健康な人から集めた尿を１〜８倍に生理食
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。測定された吸光度のうち、検量線の範囲内
の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.516 、および
0.343 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃度を図３の
検量線から求め、7.1ng ／mlおよび3.3ng ／mlを得た。
後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値（6.6ng ／m
l）は、１倍で測定した値(7.1ng／ml) とほぼ同じであ
り、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度は、これらの
平均値から6.8 ng／mlと定量された。 実施例５（モノクローナル抗体固定化担体の調製） ホルミルセルロファイン（商標。チッソ社製）を蒸留水
および0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液にて洗浄し、のち吸
引濾過して緩衝液を除き、精製したホルミルセルロファ
イン1.5 ｇ（湿重量）を５０mlの三角フラスコに採取
し、実施例２と同一の方法で得た抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体１０mgを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液に一晩透析した溶液を添加し、室温で２時間撹拌し、
次いで７mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更
に室温で１０時間撹拌し、この抗体をホルミルセルロフ
ァインに結合させ、のち0.2Mトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.0）で洗浄し、５mgの水素化シアノホウ素ナトリウム
を含む２mlのトリス−塩酸緩衝液を加え、室温で４時間
撹拌し、反応基を失活させ、抗β型ダイマ−特異的モノ
クロ−ナル抗体固定化担体約２mlを得た。 実施例６（β型ダイマーの精製） 実施例５と同一の方法で調製した抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体固定化担体２mlをカラム（直径１c
m、長さ５cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、予め集
めた健常人尿100 mlをカラムに通液し、カラム容量の５
倍量の生理食塩水で洗浄し、のち0.02M グリシン塩酸緩
衝液（ｐＨ3.0 ）で吸着画分を溶出させ、溶出された吸
着画分のｐＨをただちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.
0 ）で中性付近に調整し、精製されたβ型ダイマ−約0.
2 μg を含む溶液約２mlを得た。
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。測定された吸光度のうち、検量線の範囲内
の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.516 、および
0.343 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃度を図３の
検量線から求め、7.1ng ／mlおよび3.3ng ／mlを得た。
後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値（6.6ng ／m
l）は、１倍で測定した値(7.1ng／ml) とほぼ同じであ
り、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度は、これらの
平均値から6.8 ng／mlと定量された。 実施例５（モノクローナル抗体固定化担体の調製） ホルミルセルロファイン（商標。チッソ社製）を蒸留水
および0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液にて洗浄し、のち吸
引濾過して緩衝液を除き、精製したホルミルセルロファ
イン1.5 ｇ（湿重量）を５０mlの三角フラスコに採取
し、実施例２と同一の方法で得た抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体１０mgを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液に一晩透析した溶液を添加し、室温で２時間撹拌し、
次いで７mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更
に室温で１０時間撹拌し、この抗体をホルミルセルロフ
ァインに結合させ、のち0.2Mトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.0）で洗浄し、５mgの水素化シアノホウ素ナトリウム
を含む２mlのトリス−塩酸緩衝液を加え、室温で４時間
撹拌し、反応基を失活させ、抗β型ダイマ−特異的モノ
クロ−ナル抗体固定化担体約２mlを得た。 実施例６（β型ダイマーの精製） 実施例５と同一の方法で調製した抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体固定化担体２mlをカラム（直径１c
m、長さ５cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、予め集
めた健常人尿100 mlをカラムに通液し、カラム容量の５
倍量の生理食塩水で洗浄し、のち0.02M グリシン塩酸緩
衝液（ｐＨ3.0 ）で吸着画分を溶出させ、溶出された吸
着画分のｐＨをただちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.
0 ）で中性付近に調整し、精製されたβ型ダイマ−約0.
2 μg を含む溶液約２mlを得た。
【００３６】前記一度の操作で得られた精製β型ダイマ
−は、もとの尿に含まれる蛋白中の含量の約250 倍に濃
縮されていた。また、この溶出液を濃縮し、常法により
ウエスタン・ブロッティングにかけ、抗M-CSF ポリクロ
−ナル抗体（ヒトM-CSF α型およびβ型モノマ−と反
応）と反応させた結果、β型ダイマ−のみが検出され
た。
−は、もとの尿に含まれる蛋白中の含量の約250 倍に濃
縮されていた。また、この溶出液を濃縮し、常法により
ウエスタン・ブロッティングにかけ、抗M-CSF ポリクロ
−ナル抗体（ヒトM-CSF α型およびβ型モノマ−と反
応）と反応させた結果、β型ダイマ−のみが検出され
た。
【００３７】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって奏せられる効果は次のとおりである。 (1) β型ダイマ−にのみ特異的に反応する新規なモノク
ロ−ナル抗体が得られる。 (2) β型ダイマ−にのみ特異的に反応する新規なモノク
ロ−ナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。 (3) 上記抗体を有効成分とするβ型ダイマ−定量用試薬
を提供することができる。 (4) 上記試薬を用いたβ型ダイマ−の新規な免疫化学的
定量法を提供することができる。 (5) 上記抗体を用いることによりヒト体液等に存在する
β型ダイマ−を簡便、かつ高純度に精製することができ
る。
よって奏せられる効果は次のとおりである。 (1) β型ダイマ−にのみ特異的に反応する新規なモノク
ロ−ナル抗体が得られる。 (2) β型ダイマ−にのみ特異的に反応する新規なモノク
ロ−ナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。 (3) 上記抗体を有効成分とするβ型ダイマ−定量用試薬
を提供することができる。 (4) 上記試薬を用いたβ型ダイマ−の新規な免疫化学的
定量法を提供することができる。 (5) 上記抗体を用いることによりヒト体液等に存在する
β型ダイマ−を簡便、かつ高純度に精製することができ
る。
【図１】この発明のβ型ダイマ−特異的モノクロ−ナル
抗体を用いたＥＬＩＳＡ試験結果を示す。
抗体を用いたＥＬＩＳＡ試験結果を示す。
【図２】この発明のβ型ダイマ−定量用試薬により作成
した検量線を示す。
した検量線を示す。
【図３】この発明のβ型ダイマ−定量用試薬により作成
した他の検量線を示す。
した他の検量線を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】M-CSF の免疫学的定量方法としては、ＲＩ
Ａ（放射性同位元素分析法）が知られている［プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オ
ブ・アメリカ（Proceedingsof the Natlional Academy
of Science of the United States of America)、第７
６巻、第５４１１ページ、１９７９年、ブラッド・セル
ズ(Blood cells) 、第５巻、第４２１ページ、１９７９
年、およびブラッド(Blood) 、第５８巻、第６３０ペー
ジ、１９８１年］が、この方法は感度が1.4 〜4U/ml と
あまり高くないこと、高価なこと、取扱いが一定の基準
により認可された施設を必要とすること等の問題があ
る。また、ＲＩＡに比較してより安価で簡便に定量でき
るＥＩＡ（酵素標識法）も知られている（特開平２- ５
５９５５号公報）が、いずれにしても、これらの免疫学
的方法ではα型とβ型の区別のみならず、ダイマ−とモ
ノマ−の区別も不可能であった。
Ａ（放射性同位元素分析法）が知られている［プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オ
ブ・アメリカ（Proceedingsof the Natlional Academy
of Science of the United States of America)、第７
６巻、第５４１１ページ、１９７９年、ブラッド・セル
ズ(Blood cells) 、第５巻、第４２１ページ、１９７９
年、およびブラッド(Blood) 、第５８巻、第６３０ペー
ジ、１９８１年］が、この方法は感度が1.4 〜4U/ml と
あまり高くないこと、高価なこと、取扱いが一定の基準
により認可された施設を必要とすること等の問題があ
る。また、ＲＩＡに比較してより安価で簡便に定量でき
るＥＩＡ（酵素標識法）も知られている（特開平２- ５
５９５５号公報）が、いずれにしても、これらの免疫学
的方法ではα型とβ型の区別のみならず、ダイマ−とモ
ノマ−の区別も不可能であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】さらに、この発明は、ヒトM-CSF β型ダイ
マ−含有液からヒトM-CSF β型ダイマ−を精製する方法
において、上記モノクロ−ナル抗体をヒトM-CSF β型ダ
イマ−の吸着体として使用することを特徴とするヒトM-
CSF β型ダイマ−の精製方法をも提供する。以下、この
発明の構成について、詳しく説明する。 （１）ハイブリドーマの作出 この発明のハイブリド−マの作出は、免疫、細胞融合、
融合細胞選択、アッセイおよびクロ−ニングの各工程よ
りなる公知の方法［ネイチャー(Nature)、第２５６巻、
第４９５ページ、１９７５年］により次のようにして行
うことができる。 1)免疫 精製β型ダイマ−を抗原として用い、これを完全フロイ
ンドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和し、
１週間〜数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜４
回注射し、動物を感作する。なお、精製β型ダイマ−
は、例えば特開昭64-22899号公報記載の方法により健康
な人の尿から分離、精製することができる。 2)細胞融合 前記の操作により免疫された動物から常法により摘出し
た脾臓細胞またはリンパ球Ｂ細胞と、骨髄腫細胞とを融
合し、細胞融合を得る。使用する骨髄腫細胞は、公知の
HGPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase)欠損マウスまたはラット骨髄腫細胞であり、ケーラ
ーおよびミルスタインの方法［ネイチャー(Nature)、第
２５６巻、第４９５ページ、１９７５年］により容易に
入手し得る。融合方法としてはHJV 法（センダイウイル
スを用いる方法）、ポリエチレングリコ−ル法（PEG
法）、電気融合法等の公知の方法が例示できる。 3)融合細胞の選択 次いで融合細胞のみが生育できる適当な選択培地中で２
〜４日毎に新鮮な選択培地と交換しながら細胞を10〜20
日間培養し、所望の融合細胞のみを選別する。HGPRT 欠
損骨髄腫細胞を融合親細胞として用いた場合、選択培地
としてはHAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine）
培地、HAz(Hypoxanthine, Azaserine)培地等を例示する
ことができる。 4)アッセイ アッセイ工程は、融合細胞の中から、目的とする特異抗
体産生細胞を選別する工程である。通常、選別は、培養
上清に含まれる抗体活性を固相または液相放射性同位元
素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫化学測定法（Ｅ
ＩＡ）、凝集法、蛍光抗体法等の公知の方法で測定する
ことにより行う。 5)クロ−ニング クロ−ニング工程は、目的の特異抗体産生細胞を一つの
クロ−ンから由来した均一な細胞集団とする工程であ
る。公知の限外希釈法等によって、モノクロ−ナルな細
胞に由来し、安定してβ型ダイマ−と反応する抗体を産
生する細胞株、いわゆるハイブリド−マを得る。
マ−含有液からヒトM-CSF β型ダイマ−を精製する方法
において、上記モノクロ−ナル抗体をヒトM-CSF β型ダ
イマ−の吸着体として使用することを特徴とするヒトM-
CSF β型ダイマ−の精製方法をも提供する。以下、この
発明の構成について、詳しく説明する。 （１）ハイブリドーマの作出 この発明のハイブリド−マの作出は、免疫、細胞融合、
融合細胞選択、アッセイおよびクロ−ニングの各工程よ
りなる公知の方法［ネイチャー(Nature)、第２５６巻、
第４９５ページ、１９７５年］により次のようにして行
うことができる。 1)免疫 精製β型ダイマ−を抗原として用い、これを完全フロイ
ンドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和し、
１週間〜数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜４
回注射し、動物を感作する。なお、精製β型ダイマ−
は、例えば特開昭64-22899号公報記載の方法により健康
な人の尿から分離、精製することができる。 2)細胞融合 前記の操作により免疫された動物から常法により摘出し
た脾臓細胞またはリンパ球Ｂ細胞と、骨髄腫細胞とを融
合し、細胞融合を得る。使用する骨髄腫細胞は、公知の
HGPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase)欠損マウスまたはラット骨髄腫細胞であり、ケーラ
ーおよびミルスタインの方法［ネイチャー(Nature)、第
２５６巻、第４９５ページ、１９７５年］により容易に
入手し得る。融合方法としてはHJV 法（センダイウイル
スを用いる方法）、ポリエチレングリコ−ル法（PEG
法）、電気融合法等の公知の方法が例示できる。 3)融合細胞の選択 次いで融合細胞のみが生育できる適当な選択培地中で２
〜４日毎に新鮮な選択培地と交換しながら細胞を10〜20
日間培養し、所望の融合細胞のみを選別する。HGPRT 欠
損骨髄腫細胞を融合親細胞として用いた場合、選択培地
としてはHAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine）
培地、HAz(Hypoxanthine, Azaserine)培地等を例示する
ことができる。 4)アッセイ アッセイ工程は、融合細胞の中から、目的とする特異抗
体産生細胞を選別する工程である。通常、選別は、培養
上清に含まれる抗体活性を固相または液相放射性同位元
素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫化学測定法（Ｅ
ＩＡ）、凝集法、蛍光抗体法等の公知の方法で測定する
ことにより行う。 5)クロ−ニング クロ−ニング工程は、目的の特異抗体産生細胞を一つの
クロ−ンから由来した均一な細胞集団とする工程であ
る。公知の限外希釈法等によって、モノクロ−ナルな細
胞に由来し、安定してβ型ダイマ−と反応する抗体を産
生する細胞株、いわゆるハイブリド−マを得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】図１から明らかなように、この発明のハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、いずれの
濃度においてもβ型ダイマ−とのみ反応し、ヒトＭ−Ｃ
ＳＦβ型モノマ−、およびヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−
とはほとんど反応しないことが認められた。なお、原料
および試料の調製方法を変更して同様に試験してもほぼ
同様の結果が得られた。 試験例２ この試験は、この発明のハイブリドーマの抗体産生を調
べるために行った。 (1) 試料の調製 a)β型ダイマ− 試験例１と同一の方法により調製した。 b)モノクロ−ナル抗体 ハイブリド−マの培養上清をそのまま使用した。 (2) 試験方法 1)ハイブリド−マの継代培養 １０%FCSを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０ml
に、実施例１で得たハイブリドーマMO9106を１〜２×１
０5 ／mlの割合で懸濁し、ＣＯ2 インキュベ−タ−内で
静置培養した。培養時には全量を回収し、遠心分離して
ハイブリド−マと培養上清とを分離し、上記に示したハ
イブリド−マの必要量だけをそのまま次の培養に移し
た。 2)培養上清の力価測定 β型ダイマ−を５０ng/ml の濃度に生理食塩水で希釈
し、 100μｌ／ウエルの割合でポリスチレン製の９６ウ
エル酵素免疫測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−
ト（ヌンク社製）に分注し、37℃で１時間静置し、希釈
液を除去し、0.5 ％のTween 20を含む生理食塩水を300
μｌ／ウエルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して
液を除去する操作を３回反復して洗浄した。なお、以下
の洗浄はすべてこの方法で行った。
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、いずれの
濃度においてもβ型ダイマ−とのみ反応し、ヒトＭ−Ｃ
ＳＦβ型モノマ−、およびヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマ−
とはほとんど反応しないことが認められた。なお、原料
および試料の調製方法を変更して同様に試験してもほぼ
同様の結果が得られた。 試験例２ この試験は、この発明のハイブリドーマの抗体産生を調
べるために行った。 (1) 試料の調製 a)β型ダイマ− 試験例１と同一の方法により調製した。 b)モノクロ−ナル抗体 ハイブリド−マの培養上清をそのまま使用した。 (2) 試験方法 1)ハイブリド−マの継代培養 １０%FCSを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０ml
に、実施例１で得たハイブリドーマMO9106を１〜２×１
０5 ／mlの割合で懸濁し、ＣＯ2 インキュベ−タ−内で
静置培養した。培養時には全量を回収し、遠心分離して
ハイブリド−マと培養上清とを分離し、上記に示したハ
イブリド−マの必要量だけをそのまま次の培養に移し
た。 2)培養上清の力価測定 β型ダイマ−を５０ng/ml の濃度に生理食塩水で希釈
し、 100μｌ／ウエルの割合でポリスチレン製の９６ウ
エル酵素免疫測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−
ト（ヌンク社製）に分注し、37℃で１時間静置し、希釈
液を除去し、0.5 ％のTween 20を含む生理食塩水を300
μｌ／ウエルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して
液を除去する操作を３回反復して洗浄した。なお、以下
の洗浄はすべてこの方法で行った。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】
【実施例】 実施例１（ハイブリドーマの作出） (1) 動物の免疫 生理食塩水で希釈したβ型ダイマ−と不完全フロインド
・アジュバントとの1:1 のエマルジョンを調製し、５−
８週齢の雌のLou ラット（実験動物中央研究所から入
手）の背部皮下および腹腔に、ラット１匹あたりβ型ダ
イマ−として100〜200 μg(エマルジョン量として0.5
〜1.0ml)を投与した。追加免疫は不完全フロインド・ア
ジュバントを用いて２〜３週間毎に行い、β型ダイマ−
の投与量は１匹あたり50〜100 μg とした。追加免疫終
了１週間目に採血し、血清中の抗体価をＥＩＡ法により
測定し、抗体価の上昇がプラト−に達し、さらにＥＩＡ
法での抗体価がコントロールに比較して数万から数十万
倍と十分に高い抗体価が認められるまで追加免疫を継続
した。 (2) 細胞融合 高抗体価が認められたラット４匹にβ型ダイマ−溶液を
１匹あたり100 μg の割合で腹腔内投与し、４日後に脾
臓を摘出した。ラット骨髄腫細胞（Y3Ag1.2.3)［ネイチ
ャ−（Nature) 、第２７７巻、第１３１ペ−ジ、１９７
９年］と前記ラット脾細胞とを細胞数比で１：５の割合
でポリエチレングリコ−ル1500を用いて融合した。１０
％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）を用いて
ポリエチレングリコ−ルを洗浄除去し、細胞をＨＡＴ培
地（シグマ社製）に懸濁し、９６穴プレ−ト（ヌンク社
製）に約１０5 cells/ウエルずつ分注し、３７℃、７％
ＣＯ2 下で７日間培養した。その結果、１２ウエルの細
胞に抗体産生が認められた 。(3) スクリ−ニングおよびクロ−ニング 前記ハイブリド−マの増殖を終了した各ウエルの培地を
一部採取し、常法により抗体産生活性のスクリ−ニング
を行い、抗原に対して高い力価が認められるウエルにつ
いて限界希釈法により次のようにクロ−ニングを行っ
た。ラット腹腔滲出細胞をフィ−ダ−細胞として用い、
コロニ−形成ウエルの培養上清の抗体価をＥＩＡ法によ
り測定し、抗体産生が認められたウエルについて、前記
と同様の方法により再度クロ−ニングを行い、さらに前
記と同様の方法により培養し、産生された培養上清に含
まれる抗体の性質を同様の方法で試験した。
・アジュバントとの1:1 のエマルジョンを調製し、５−
８週齢の雌のLou ラット（実験動物中央研究所から入
手）の背部皮下および腹腔に、ラット１匹あたりβ型ダ
イマ−として100〜200 μg(エマルジョン量として0.5
〜1.0ml)を投与した。追加免疫は不完全フロインド・ア
ジュバントを用いて２〜３週間毎に行い、β型ダイマ−
の投与量は１匹あたり50〜100 μg とした。追加免疫終
了１週間目に採血し、血清中の抗体価をＥＩＡ法により
測定し、抗体価の上昇がプラト−に達し、さらにＥＩＡ
法での抗体価がコントロールに比較して数万から数十万
倍と十分に高い抗体価が認められるまで追加免疫を継続
した。 (2) 細胞融合 高抗体価が認められたラット４匹にβ型ダイマ−溶液を
１匹あたり100 μg の割合で腹腔内投与し、４日後に脾
臓を摘出した。ラット骨髄腫細胞（Y3Ag1.2.3)［ネイチ
ャ−（Nature) 、第２７７巻、第１３１ペ−ジ、１９７
９年］と前記ラット脾細胞とを細胞数比で１：５の割合
でポリエチレングリコ−ル1500を用いて融合した。１０
％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）を用いて
ポリエチレングリコ−ルを洗浄除去し、細胞をＨＡＴ培
地（シグマ社製）に懸濁し、９６穴プレ−ト（ヌンク社
製）に約１０5 cells/ウエルずつ分注し、３７℃、７％
ＣＯ2 下で７日間培養した。その結果、１２ウエルの細
胞に抗体産生が認められた 。(3) スクリ−ニングおよびクロ−ニング 前記ハイブリド−マの増殖を終了した各ウエルの培地を
一部採取し、常法により抗体産生活性のスクリ−ニング
を行い、抗原に対して高い力価が認められるウエルにつ
いて限界希釈法により次のようにクロ−ニングを行っ
た。ラット腹腔滲出細胞をフィ−ダ−細胞として用い、
コロニ−形成ウエルの培養上清の抗体価をＥＩＡ法によ
り測定し、抗体産生が認められたウエルについて、前記
と同様の方法により再度クロ−ニングを行い、さらに前
記と同様の方法により培養し、産生された培養上清に含
まれる抗体の性質を同様の方法で試験した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】以上の操作によりβ型ダイマーに特異的に
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
（MO9106) を作出した。 実施例２（モノクローナル抗体の取得） 実施例１で得た抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル抗
体産生ハイブリド−マ（MO9106) １×１０5 を１０％Ｆ
ＣＳを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０mlで培養
し、のち培養上清を1/2 容量に濃縮し、プロテイン・ジ
ー・セファロース・エフエフ［protein G sepharose ff
（商標。ファルマシア社製）］17.8mlをカラム（直径１
cm、長さ１０cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、濃縮
した前記培養上清をカラムに通液し、再び生理食塩水で
洗浄し、余分な蛋白質を除去し、その後0.02M のグリシ
ン塩酸緩衝液（ｐＨ3.0 ）を用いて抗β型ダイマー特異
的モノクローナル抗体を溶出させた。溶出液に１M トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）を添加し、溶出液のｐＨを中
性付近に調整し、抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル
抗体約６０ngを含む溶液約５０mlを得た。 実施例３（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗ヒトM-CSF ポリクロ−ナ
ル抗体をＰＢＳに１μg/mlの濃度で溶解し、 100μｌ／
ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免疫測
定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社
製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、 0.5％のTween 20を含むＰＢＳを 300μｌ／ウエル
の割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去する
操作を３回反復して洗浄した。なお、以下の洗浄はすべ
てこの方法で行った。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ｎg/mlの範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体をＰＢ
Ｓに１μg/mlの濃度で溶解し、 100μｌ／ウエルの割合
でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を
除去し、洗浄した。 (5) ３次抗体 ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサ−
チ社製）をＰＢＳで5000倍に希釈し、 100μｌ／ウエル
の割合でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希
釈液を除去し、洗浄した。 (6) 活性測定用基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を 100
μｌ／ウエルの割合でプレ−トに分注し、室温で３０分
放置し、のちＥＩＡリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）に
より414nm で吸光度を測定した。検量線作成用標準品の
吸光度を縦軸に、検量線作成用標準品の濃度を横軸にと
り、図２に示す検量線を作成した。 (7) β型ダイマーの定量 図２の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
（MO9106) を作出した。 実施例２（モノクローナル抗体の取得） 実施例１で得た抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル抗
体産生ハイブリド−マ（MO9106) １×１０5 を１０％Ｆ
ＣＳを含むRPMI1640培地（日水製薬社製）５０mlで培養
し、のち培養上清を1/2 容量に濃縮し、プロテイン・ジ
ー・セファロース・エフエフ［protein G sepharose ff
（商標。ファルマシア社製）］17.8mlをカラム（直径１
cm、長さ１０cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、濃縮
した前記培養上清をカラムに通液し、再び生理食塩水で
洗浄し、余分な蛋白質を除去し、その後0.02M のグリシ
ン塩酸緩衝液（ｐＨ3.0 ）を用いて抗β型ダイマー特異
的モノクローナル抗体を溶出させた。溶出液に１M トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）を添加し、溶出液のｐＨを中
性付近に調整し、抗β型ダイマ−特異的モノクロ−ナル
抗体約６０ngを含む溶液約５０mlを得た。 実施例３（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗ヒトM-CSF ポリクロ−ナ
ル抗体をＰＢＳに１μg/mlの濃度で溶解し、 100μｌ／
ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免疫測
定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク社
製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、 0.5％のTween 20を含むＰＢＳを 300μｌ／ウエル
の割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去する
操作を３回反復して洗浄した。なお、以下の洗浄はすべ
てこの方法で行った。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ｎg/mlの範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体をＰＢ
Ｓに１μg/mlの濃度で溶解し、 100μｌ／ウエルの割合
でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を
除去し、洗浄した。 (5) ３次抗体 ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサ−
チ社製）をＰＢＳで5000倍に希釈し、 100μｌ／ウエル
の割合でプレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希
釈液を除去し、洗浄した。 (6) 活性測定用基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を 100
μｌ／ウエルの割合でプレ−トに分注し、室温で３０分
放置し、のちＥＩＡリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）に
より414nm で吸光度を測定した。検量線作成用標準品の
吸光度を縦軸に、検量線作成用標準品の濃度を横軸にと
り、図２に示す検量線を作成した。 (7) β型ダイマーの定量 図２の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】健康な人から集めた尿を１〜８倍に生理食
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。414nm で測定された吸光度のうち、検量線
の範囲内の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.603
、および0.391 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃
度を図２の検量線から求め、6.6 ng／mlおよび3.0 ng／
mlを得た。後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値
（6.0 ng／ml）は、１倍で測定した値(6.6ng／ml) とほ
ぼ同じであり、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度
は、これらの平均値から6.3 ng／mlと定量された。 実施例４（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗M-CSF ポリクロ−ナル抗
体を、生理食塩水に１μg ／mlの割合で溶解し、 100μ
ｌ／ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免
疫測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク
社製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、0.5 ％のTween 20を含むＰＢＳを３００μｌ／ウエ
ルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去す
る操作を３回反復して洗浄した。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ng/ml の範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体を常法
（口野嘉幸ら編、”遺伝子・蛋白質実験操作ブロッティ
ング法”、２４１頁、ソフトサイエンス社、昭和６３
年）によりビオチン化し、ＰＢＳに１μg ／mlの割合で
溶解し、 100μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−ト
に入れ、３７℃で１時間静置し、のち希釈液を除去し、
洗浄した。 (5) ＨＲＰ標識アビジン ３次抗体の代替として、ＨＲＰ標識アビジン（ベクタ−
社製）を用い、これを生理食塩水で5000倍に希釈し、 1
00μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−トに入れ、室
温で３０分静置後、希釈液を除去、洗浄した。 (6) 活性測定用酵素基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を使用
し、 100μｌ／ウエルの割合でプレ−トに入れ、室温で
３０分放置後、ＥＩＡリ−ダ−により414nm で吸光度を
測定した。検量線作成用標準品の吸光度を縦軸に、検量
線作成用標準品の濃度を横軸にとり、図３に示す検量線
を作成した。 (7) β型ダイマーの定量 図３の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。414nm で測定された吸光度のうち、検量線
の範囲内の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.603
、および0.391 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃
度を図２の検量線から求め、6.6 ng／mlおよび3.0 ng／
mlを得た。後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値
（6.0 ng／ml）は、１倍で測定した値(6.6ng／ml) とほ
ぼ同じであり、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度
は、これらの平均値から6.3 ng／mlと定量された。 実施例４（β型ダイマーの定量） (1) １次抗体 常法により家兎から得た精製抗M-CSF ポリクロ−ナル抗
体を、生理食塩水に１μg ／mlの割合で溶解し、 100μ
ｌ／ウエルの割合でポリエチレン製の９６ウエル酵素免
疫測定法用マイクロタイトレ−ションプレ−ト（ヌンク
社製）に分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、0.5 ％のTween 20を含むＰＢＳを３００μｌ／ウエ
ルの割合で各ウエルに注入し、数秒静置して液を除去す
る操作を３回反復して洗浄した。 (2) ブロッキング剤 0.3 ％ゼラチン水溶液を 250μｌ／ウエルの割合で各プ
レ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除去
し、前記と同様に洗浄した。 (3) 検量線作成用標準品 標準品（試験例１と同一のβ型ダイマ−）を0.63ng/ml
〜10ng/ml の範囲に調整し、 100μｌ／ウエルの割合で
プレ−トに分注し、３７℃で１時間静置し、希釈液を除
去し、洗浄した。 (4) ２次抗体 実施例２と同一の方法で得たモノクロ−ナル抗体を常法
（口野嘉幸ら編、”遺伝子・蛋白質実験操作ブロッティ
ング法”、２４１頁、ソフトサイエンス社、昭和６３
年）によりビオチン化し、ＰＢＳに１μg ／mlの割合で
溶解し、 100μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−ト
に入れ、３７℃で１時間静置し、のち希釈液を除去し、
洗浄した。 (5) ＨＲＰ標識アビジン ３次抗体の代替として、ＨＲＰ標識アビジン（ベクタ−
社製）を用い、これを生理食塩水で5000倍に希釈し、 1
00μｌ／ウエルの割合で抗体溶液をプレ−トに入れ、室
温で３０分静置後、希釈液を除去、洗浄した。 (6) 活性測定用酵素基質 ＡＢＴＳと過酸化水素（ケ−・ピ−・エル社製）を使用
し、 100μｌ／ウエルの割合でプレ−トに入れ、室温で
３０分放置後、ＥＩＡリ−ダ−により414nm で吸光度を
測定した。検量線作成用標準品の吸光度を縦軸に、検量
線作成用標準品の濃度を横軸にとり、図３に示す検量線
を作成した。 (7) β型ダイマーの定量 図３の検量線を用いて次のようにしてヒト尿に含まれる
β型ダイマーの濃度を定量した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】健康な人から集めた尿を１〜８倍に生理食
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。414nm で測定された吸光度のうち、検量線
の範囲内の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.516
、および0.343 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃
度を図３の検量線から求め、7.1ng ／mlおよび3.3ng ／
mlを得た。後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値
（6.6ng ／ml）は、１倍で測定した値(7.1ng／ml) とほ
ぼ同じであり、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度
は、これらの平均値から6.8 ng／mlと定量された。 実施例５（モノクローナル抗体固定化担体の調製） ホルミルセルロファイン（商標。チッソ社製）を蒸留水
および0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液にて洗浄し、のち吸
引濾過して緩衝液を除き、精製したホルミルセルロファ
イン1.5 ｇ（湿重量）を５０mlの三角フラスコに採取
し、実施例２と同一の方法で得た抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体１０mgを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液に一晩透析した溶液を添加し、室温で２時間撹拌し、
次いで７mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更
に室温で１０時間撹拌し、この抗体をホルミルセルロフ
ァインに結合させ、のち0.2Mトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.0）で洗浄し、５mgの水素化シアノホウ素ナトリウム
を含む２mlのトリス−塩酸緩衝液を加え、室温で４時間
撹拌し、反応基を失活させ、抗β型ダイマ−特異的モノ
クロ−ナル抗体固定化担体約２mlを得た。 実施例６（β型ダイマーの精製） 実施例５と同一の方法で調製した抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体固定化担体２mlをカラム（直径１c
m、長さ５cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、予め集
めた健常人尿100 mlをカラムに通液し、カラム容量の５
倍量の生理食塩水で洗浄し、のち0.02M グリシン塩酸緩
衝液（ｐＨ3.0 ）で吸着画分を溶出させ、溶出された吸
着画分のｐＨをただちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.
0 ）で中性付近に調整し、精製されたβ型ダイマ−約0.
2 μg を含む溶液約２mlを得た。
塩水で段階的に希釈し、検量線作成用標準品と同様の操
作を行った。414nm で測定された吸光度のうち、検量線
の範囲内の値である１倍希釈および２倍希釈の値0.516
、および0.343 の吸光度に対応するβ型ダイマーの濃
度を図３の検量線から求め、7.1ng ／mlおよび3.3ng ／
mlを得た。後者の２倍希釈の値に希釈倍率を乗じて値
（6.6ng ／ml）は、１倍で測定した値(7.1ng／ml) とほ
ぼ同じであり、この尿に含まれるβ型ダイマーの濃度
は、これらの平均値から6.8 ng／mlと定量された。 実施例５（モノクローナル抗体固定化担体の調製） ホルミルセルロファイン（商標。チッソ社製）を蒸留水
および0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液にて洗浄し、のち吸
引濾過して緩衝液を除き、精製したホルミルセルロファ
イン1.5 ｇ（湿重量）を５０mlの三角フラスコに採取
し、実施例２と同一の方法で得た抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体１０mgを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液に一晩透析した溶液を添加し、室温で２時間撹拌し、
次いで７mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを加え、更
に室温で１０時間撹拌し、この抗体をホルミルセルロフ
ァインに結合させ、のち0.2Mトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.0）で洗浄し、５mgの水素化シアノホウ素ナトリウム
を含む２mlのトリス−塩酸緩衝液を加え、室温で４時間
撹拌し、反応基を失活させ、抗β型ダイマ−特異的モノ
クロ−ナル抗体固定化担体約２mlを得た。 実施例６（β型ダイマーの精製） 実施例５と同一の方法で調製した抗β型ダイマ−特異的
モノクロ−ナル抗体固定化担体２mlをカラム（直径１c
m、長さ５cm）に充填し、生理食塩水で洗浄し、予め集
めた健常人尿100 mlをカラムに通液し、カラム容量の５
倍量の生理食塩水で洗浄し、のち0.02M グリシン塩酸緩
衝液（ｐＨ3.0 ）で吸着画分を溶出させ、溶出された吸
着画分のｐＨをただちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.
0 ）で中性付近に調整し、精製されたβ型ダイマ−約0.
2 μg を含む溶液約２mlを得た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 3/28 8517−4Ｈ 15/06 8619−4Ｈ 17/02 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｇ０１Ｎ 33/50 7055−2Ｊ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ Ｖ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 柳内 延也 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 武智 和男 大阪府枚方市招堤大谷２−25−１ 株式会 社ミドリ十字中央研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 ヒトM-CSF β型ダイマ−に特異的に反応
し、ヒトM-CSF β型モノマ−、ヒトM-CSF α型ダイマ
−、およびヒトM-CSF α型モノマ−のいずれにも反応し
ないことを特徴とするヒトM-CSF β型ダイマ−に特異性
を有するモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトM-CSF β型ダイマ−に特異的に反応
し、ヒトM-CSF β型モノマ−、ヒトM-CSF α型ダイマ
−、およびヒトM-CSF α型モノマ−のいずれにも反応し
ないモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マ。 - 【請求項３】 ハイブリド−マが、ヒトM-CSF β型ダイ
マ−で免疫された動物から摘出した脾臓細胞またはリン
パ球Ｂ細胞と、骨髄腫細胞とを融合して得られた細胞融
合であることを特徴とする請求項２のハイブリド−マ。 - 【請求項４】 ハイブリド−マが、ハイブリドーマMO91
06（微工研条寄第3662号）であることを特徴とする請求
項２または３のハイブリド−マ。 - 【請求項５】 ヒトM-CSF β型ダイマ−含有液のヒトM-
CSF β型ダイマ−を免疫化学的に定量する方法におい
て、ヒトM-CSF β型ダイマ−に特異的に反応し、ヒトM-
CSF β型モノマ−、ヒトM-CSF α型ダイマ−、およびヒ
トM-CSF α型モノマ−のいずれにも反応しないモノクロ
−ナル抗体を抗体として使用することを特徴とするヒト
M-CSF β型ダイマ−の免疫化学的定量方法。 - 【請求項６】 ヒトM-CSF β型ダイマ−の免疫化学的定
量に使用する試薬において、ヒトM-CSF β型ダイマ−に
特異的に反応し、ヒトM-CSF β型モノマ−、ヒトM-CSF
α型ダイマ−、およびヒトM-CSF α型モノマ−のいずれ
にも反応しないモノクロ−ナル抗体を有効成分とするヒ
トM-CSF β型ダイマ−の免疫化学的定量用試薬。 - 【請求項７】 ヒトM-CSF β型ダイマ−含有液からヒト
M-CSF β型ダイマ−を精製する方法において、ヒトM-CS
F β型ダイマ−に特異的に反応し、ヒトM-CSF β型モノ
マ−、ヒトM-CSF α型ダイマ−、およびヒトM-CSF α型
モノマ−のいずれにも反応しないモノクロ−ナル抗体を
ヒトM-CSF β型ダイマ−の吸着体として使用することを
特徴とするヒトM-CSF β型ダイマ−の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3333607A JPH067189A (ja) | 1991-12-17 | 1991-12-17 | ヒトＭ−ＣＳＦ β型ダイマ−に特異性を有するモノクロ− ナル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマ、お よびこの抗体の利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3333607A JPH067189A (ja) | 1991-12-17 | 1991-12-17 | ヒトＭ−ＣＳＦ β型ダイマ−に特異性を有するモノクロ− ナル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマ、お よびこの抗体の利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067189A true JPH067189A (ja) | 1994-01-18 |
Family
ID=18267941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3333607A Pending JPH067189A (ja) | 1991-12-17 | 1991-12-17 | ヒトＭ−ＣＳＦ β型ダイマ−に特異性を有するモノクロ− ナル抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマ、お よびこの抗体の利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH067189A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7728113B2 (en) | 2003-09-10 | 2010-06-01 | Amgen Fremont Inc. | Methods of treating arthritic conditions with antibodies to M-CSF |
-
1991
- 1991-12-17 JP JP3333607A patent/JPH067189A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7728113B2 (en) | 2003-09-10 | 2010-06-01 | Amgen Fremont Inc. | Methods of treating arthritic conditions with antibodies to M-CSF |
| US9718883B2 (en) | 2003-09-10 | 2017-08-01 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to M-CSF |
| US10280219B2 (en) | 2003-09-10 | 2019-05-07 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to M-CSF |
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