TWI439545B - 辨別癌症細胞表現之ｃｅａ與ｃｄ－４３上含醣表位的抗體與其應用方法 - Google Patents

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Description

辨別癌症細胞表現之CEA與CD-43上含醣表位的抗體與其應用方法
本發明係關於辨別非造血細胞腫瘤或癌症細胞上表現之CD43與癌胚抗原(CEA)上的含醣表位之抗體(諸如，嵌合與人類化抗體)。這些抗體具有在缺少細胞毒素接合與免疫效應子功能的情況下於這些非造血細胞腫瘤或癌症細胞中引發細胞死亡(例如，細胞凋亡)的特性。這些抗體係可用作診斷與治療劑。
CD43(亦稱為涎福林(sialophorin)或白涎林(leukosialin))是一種高水平表現於大部分人類白血球(包括所有的T細胞)與血小板上且分子量範圍為115,000至135,000的重度唾液酸化分子。CD43表現在具有Wiskott-Aldrich症候群(一種染色體連鎖隱性免疫不全異常)之雄性T細胞上有所缺陷(Remold-O’Donnell等人(1987)Blood 70(1):104-9；Remold-O’Donnel等人(1984)J. Exp. Med . 159:1705-23)。
功能性研究驗證抗-CD43單株抗體刺激周圍血液T淋巴球的增殖(Mentzer等人(1987)J.Exp. Med . 1;165(5):1383-92；Park等人(1991)Nature ,350:706-9)與單核白血球的活化(Nong等人(1989)J. Exp. Med . 1:170(1):259-67)。單株抗-CD43抗體L11阻止T細胞結合淋巴結與培耶氏班(Peyer's patch)HEV。抗體L11抑制T細胞由血液滲入有組織的二級淋巴組織(McEvoy等人(1997)J. Exp. Med. 185:1493-8)。辨別CD43分子之單株抗體引發高密度表現CD34之體系標記陰性的骨髓造血先驅細胞(HPC)的細胞凋亡(Bazil等人(1996)Blood ,87(4):1272-81)與人類T-淋巴母細胞的細胞凋亡(Brown等人(1996)J. Biol. Chem. 271:27686-95)。近期研究進一步指出CD43作為人類T細胞上之E-選擇素的配體(Matsumoto等人(2005)J. Immunol. 175:8042-50；Fuhlbrigge等人(2006)Blood ,107:1421-6)。
有趣的是科學家亦已經發現某些非造血細胞腫瘤細胞(特別係大腸直腸腺癌)確實在細胞表面上表現CD43分子。Santamaria等人(1996)癌症Research ,56:3526-9；Baeckstrom等人(1995)J. Biol. Chem. 270:13688-92；Baeckstrom等人(1997)J. Biol. Chem. 272:11503-9；Sikut等人(1997)Biochem. Biophy. Res. Commun. 238:612-6。已經顯示結腸癌細胞株(COLO 205)中表現之CD43上的聚醣(glycan)不同於白血球CD43的那些聚醣(Baeckstrom等人(1997)J. Biol. Chem. 272:11503-9)。雖然已經暗示CD43過度表現造成腫瘤抑制蛋白p53的活化(Kadaja等人(2004)Oncogene 23:2523-30)與抑制NF-κB目標基因子群部分係透過抑制p65轉錄活性而達成(Laos等人(2006)Int. J. Oncol. 28:695-704)，但是仍缺少顯示CD43在結腸腫瘤生成中因果角色的直接證據。使用傳統抗-CD43抗體作為非造血細胞腫瘤細胞的治療之所以不成功係因為其強烈結合腫瘤與免疫T細胞兩者。仍需要產生專一性結合非-造血細胞腫瘤或癌症細胞上表現之CD43但不結合白血球或造血細胞源的其他細胞上表現之CD43的抗體。這些抗體可用作治療表現CD43之非造血細胞癌症的治療劑。
CEA通常表現於不同的腺體上皮組織(諸如，腸胃、呼吸與泌尿道)，其中其似乎位於細胞的頂面(Hammarstrom,S.(1999)Semin. 癌症Biol. 9,67-81)。在衍生自這些組織的腫瘤中，CEA表現由頂膜區域逐漸增加延伸至整個細胞表面且分泌蛋白進入血液中(Hammarstrom,S.(1999)Semin. Cancer Biol. 9,67-81)。CEA的過度表現發現於許多類型的癌症中，包括大腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳癌與甲狀腺癌。因此，已經將CEA用作腫瘤標記而測量癌症患者血液中數量提高之CEA的免疫試驗已經長期臨床應用於癌症的預後與管理(Gold P,等人(1965)J. Expl. Med. 122:467-81；Chevinsky,A. H.(1991)Semin. Surg. Oncol. 7,162-166；Shively,J. E. et al.,(1985)Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2,355-399)。
更重要的是CEA已經成為針對性治療可能有用的腫瘤相關抗原(Kuroki M,等人(2002)Anticancer Res 22:4255-64)。已經研發兩種主要利用CEA作為癌症免疫療法之目標的策略。一種方法係藉由抗-CEA抗體將自殺基因(一氧化氮合成酶(iNOS)基因)(Kuroki M.等人(2000)Anticancer Res. 20(6A):4067-71)或同位素(Wilkinson R W.等人(2001)PNAS USA 98,10256-60；Goldenberg，D. M.(1991)Am. J. Gastroenterol .,86:1392-1403；Olafsen T.等人Protein Engineering,Design ＆ Selection,17,21-27,2004)專一性指向表現CEA之腫瘤細胞。此方法已經延伸至應用接合治療劑(例如，藥物)、毒素、放射性核苷酸、免疫調節子或細胞素之抗體或抗體片段。另一方法係利用免疫細胞溶解活性，特別係透過抗體-依賴型細胞毒性(ADCC)或補體-依賴型細胞毒性(CDC)來排除表現CEA之腫瘤細胞(Imakiire T等人(2004)Int. J. Cancer :108,564-570)。這些方法通常引起細胞素釋出而造成全身性副作用。
已經在美國專利公開號2008/0171043與PCT WO 07/146172中描述了辨別非造血性癌症細胞上表現之CD-43與CEA上存在之含醣表位的抗體。這些抗體可在細胞毒素接合與免疫效應子功能不存在的情況下引發這些非造血性癌症細胞中的細胞凋亡。
本文所揭露之所有參考文獻、刊物與專利申請案在此以其全文併入。
本發明提供抗體(諸如，嵌合與人類化抗體)，其專一性結合非造血性癌症細胞表現之CD43與/或CEA上之表位但並不專一性結合白血球或Jurkat細胞表現之CD43，且在結合至非造血性癌症細胞之細胞表面上表現之表位後可在細胞毒素接合與免疫效應子功能不存在的情況下引發非造血性癌症細胞的細胞凋亡，其中表位包括醣類，而抗體對表位的結合係受到包括下列結構的醣類所抑制：Lea 結構、Lea -乳糖結構、LNDFH II結構或LNT結構。某些實施例中，抗體結合之表位係對岩藻醣敏感。
某些實施例中，抗體係衍生自鼠科抗體m5F1之嵌合或人類化抗體，其具有至少一胺基酸插入、刪除或取代於重鏈恆定區之樞紐區域中。
某些實施例中，本發明提供包括重鏈與輕鏈之單離抗體，其中(a)重鏈包括重鏈變異區與人類IgG1的重鏈恆定區，該重鏈變異區包括三個來自序列編號：1之胺基酸序列的互補決定區，其中重鏈恆定區的樞紐區域包括至少一胺基酸插入、刪除或取代；而(b)輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括三個來自序列編號：2之胺基酸序列的互補決定區，該輕鏈恆定區來自人類κ輕鏈或來自包括至少一胺基酸插入、刪除或取代之人類κ輕鏈。某些實施例中，重鏈恆定區包括序列編號：27或序列編號：29之胺基酸序列。
某些實施例中，在人類IgG1之樞紐區域中胺基酸K218的N-端插入一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個胺基酸，其中殘基的編號係EU編號系統。參見Burton,Mol. Immunol . 22:161-206,1985。某些實施例中，胺基酸殘基KSD插入胺基酸K218的N-端。
某些實施例中，抗體包括：(a)重鏈變異區，其包括三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區；及重鏈恆定區，其包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列；與(b)輕鏈變異區，其包括三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區；及輕鏈恆定區，其包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，抗體係人類化抗體。某些實施例中，抗體係嵌合抗體。某些實施例中，重鏈變異區包括選自序列編號：1、3與87-91所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，輕鏈變異區包括選自序列編號：2、4與92-96所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，抗體之重鏈變異區包括序列編號：1或序列編號：3之殘基20-137的胺基酸序列或來自序列編號：1或序列編號：3之變異區胺基酸序列。某些實施例中，抗體之輕鏈變異區包括序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列、來自序列編號：2之變異區胺基酸序列、序列編號：4之殘基21-132的胺基酸序列、或來自序列編號：4之變異區胺基酸序列。
某些實施例中，本發明之抗體包括重鏈與輕鏈，其中重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括序列編號：1之殘基20-137的胺基酸序列或來自序列編號：1之變異區胺基酸序列，該重鏈恆定區包括序列編號：27之胺基酸序列；而輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列或來自序列編號：2之變異區胺基酸序列，該輕鏈恆定區包括序列編號：10之胺基酸序列。
某些實施例中，本發明之抗體包括重鏈與輕鏈，其中重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括序列編號：1之殘基20-137的胺基酸序列或來自序列編號：1之變異區胺基酸序列，該重鏈恆定區包括序列編號：29之胺基酸序列；而輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列或來自序列編號：2之變異區胺基酸序列，該輕鏈恆定區包括序列編號：34之胺基酸序列。
某些實施例中，本發明之抗體包括重鏈與輕鏈，其中重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括序列編號：1之殘基20-137的胺基酸序列或來自序列編號：1之變異區胺基酸序列，該重鏈恆定區包括序列編號：29之胺基酸序列；而輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列或來自序列編號：2之變異區胺基酸序列，該輕鏈恆定區包括序列編號：35之胺基酸序列。
本發明亦提供本文所述之抗體的抗原結合片段。
本發明亦提供藥學組合物，其包括一或更多本文所述之抗體或其之抗原結合片段與藥學可接受載體。
本發明提供聚核苷酸與載體，其包括編碼本文所述之抗體重鏈與/或本文所述之抗體輕鏈或上述之片段的核酸序列。某些實施例中，聚核苷酸與載體包括編碼重鏈之核酸序列，重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區，該重鏈恆定區包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，聚核苷酸與載體包括編碼輕鏈之核酸序列，輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區，該輕鏈恆定區包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。
本發明亦提供宿主細胞，其包括本文所述之聚核苷酸與載體。
本發明更提供產生本文所述之任何抗體或抗原結合片段的方法。方法可包括在適當宿主細胞中表現一或更多編碼抗體或其之抗原結合片段的聚核苷酸(可分別表現成單一重鏈或輕鏈，或者重鏈與輕鏈兩者由一載體表現)。某些實施例中，重新取得與/或單離表現之抗體或其之抗原結合片段。本發明亦提供方法所產生之抗體或抗原結合片段。
本發明提供在具有癌症之個體中治療非造血性癌症的方法，其包括對個體施加有效劑量之組合物(包括一或更多本文所述之抗體)，其中一或更多抗體在個體中結合癌症細胞。某些實施例中，非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。某些實施例中，抗體係接合至細胞毒素。
本發明提供在個體中延遲非造血性癌症發展(諸如，延遲與/或抑制癌症進展)的方法，其包括對個體施加有效劑量之組合物(包括一或更多本文所述之抗體)，其中一或更多抗體結合個體中的癌症細胞。某些實施例中，非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。某些實施例中，抗體係接合至細胞毒素。
本發明亦提供在個體中治療非造血性癌症的方法，其包括對個體施加一數量的一或更多本文所述之抗體與一數量的另一抗-癌症劑，其中一或更多抗體結合個體中的癌症細胞，藉此一或更多抗體與抗-癌症劑一起提供個體中有效的癌症治療。某些實施例中，非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。某些實施例中，抗-癌症劑係化學治療劑。
本發明更提供包括藥學組合物之套組，該藥學組合物包括一或更多本文所述之抗體。某些實施例中，套組更包括對個體施加有效劑量之藥學組合物以治療非造血性癌症之用法說明。某些實施例中，套組包括一同施加藥學組合物與另一抗-癌症劑之用法說明。某些實施例中，抗體包括：(a)重鏈變異區，其包括三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區；及重鏈恆定區，其包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列；與(b)輕鏈變異區，其包括三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區；及輕鏈恆定區，其包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。
本發明亦提供套組，其包括第一藥學組合物(包括本文所述之抗體或抗原結合片段)、第二藥學組合物(包括另一抗-癌症劑)以及對個體共同施加第一藥學組合物與第二藥學組合物以治療非造血性癌症的用法說明。
需了解可結合本文所述之不同實施例的一個、某些或所有特性以形成本發明的其他實施例。熟悉技術人士將可理解本發明這些與其他態樣。
定義
「抗體」係能夠透過位於免疫球蛋白分子之變異區中的至少一抗原辨別位置專一性結合目標(諸如，醣類、聚核苷酸、脂質、聚胜肽等)之免疫球蛋白分子。本文所用之詞彙不僅包括完整的多株或單株抗體，還有其之片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv)、單鏈(ScFv)、其之突變、包括抗體部分之融合蛋白、與包括抗原辨別位置之免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。抗體包括任何類型的抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其之亞型)，而抗體不必需為任何特定類型。取決於免疫球蛋白之重鏈恆定區域的抗體胺基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同類型。免疫球蛋白有五種主要類型：IgA、IgD、IgE、IgG與IgM，且許多這些類型可進一步區分成子型(同型)，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1與IgA2。對應不同類型之免疫球蛋白的重鏈恆定區域分別稱為α、δ、ε、γ與μ。習知不同類型之免疫球蛋白的子單位結構與三維結構。
本發明之抗體進一步預期包括雙專一性、多專一性、單鏈、與嵌合及人類化分子，其對抗體的至少一CDR區所給予之聚胜肽具有親合力。本發明之抗體亦包括單域抗體，其係抗體重鏈之變異區域或抗體輕鏈之變異區域任一者。Holt等人(2003),Trends Biotechnol. 21:484-490。技術中亦習知製造包括抗體重鏈之變異區域或抗體輕鏈之變異區域任一者之區域抗體的方法，該區域抗體包含抗體六個自然存在的互補決定區的其中三個。參閱例如Muyldermans,Rev. Mol. Biotechnol. 74:277-302,2001。
本文所用之「單株抗體」代表實質同質抗體的抗體，即除了少量存在的可能自然存在突變，構成總體之個別抗體係相同的。單株抗體通常係高度專一的、針對單一抗原位置。再者，相對於通常包括針對不同決定位(表位)之不同抗體的多株抗體製備，各個單株抗體係針對抗原上的單一決定位。修飾詞「單株」表明抗體係由實質同質的抗體群體得到的特性，而不應解釋成需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明而即將應用之單株抗體可藉由Kohler與Milstein,(1975),Nature ,256:495最早描述的融合瘤方法加以製造，或可藉由例如美國專利號4,816,567所述之重組DNA方法加以製造。亦可自應用例如McCafferty等人(1990),Nature ,348:552-554所述之技術產生之嗜菌體資料庫單離單株抗體。
本文所用之「嵌合抗體」代表變異區或變異區部分來自第一物種而恆定區來自第二物種之抗體。完整嵌合抗體包括兩份嵌合輕鏈與兩份嵌合重鏈。技術中習知嵌合抗體的製造(Cabilly等人(1984),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277；Harlow與Lane(1988),Antibodies:a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory)。一般而言，這些嵌合抗體中，輕鏈與重鏈兩者之變異區模擬衍生自一哺乳類物種之抗體變異區，而恆定部分係同源於衍生自另一物種之抗體序列。某些實施例中，可在變異區與/或恆定區中進行胺基酸修飾。
「單離」抗體係一種已經自其天然環境之成分中辨別與分離與/或取得之抗體。
本文所用之「實質純淨」代表材料係至少50%純淨(即，不具污染物)、更佳係至少90%純淨、更佳係至少95%純淨、更佳係至少98%純淨、更佳係至少99%純淨。
本文所用之「人類化」抗體代表非-人類(例如，鼠科)抗體的形式，其係包含極少衍生自非-人類免疫球蛋白之序列的專一性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈、或其之片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或抗體的其他抗原-結合亞序列)。大部分，人類化抗體係接受者之互補決定區(CDR)的殘基由非-人類物種(捐獻抗體)之CDR的殘基所取代之人類免疫球蛋白(接受抗體)，非-人類物種(捐獻抗體)諸如，具有所欲專一性、親合性與能力的小鼠、大鼠或兔子。某些實例中，人類免疫球蛋白之Fv架構區域(FR)殘基係由對應的非-人類殘基所取代。再者，人類化抗體可包括接受抗體或輸入之CDR或架構序列中沒有發現的殘基，但是將其包含在內以進一步提升與最佳化抗體表現。一般而言，人類化抗體包括實質上所有的至少一個(通常為兩個)變異區域，其中所有或實質上所有的CDR區對應於非-人類免疫球蛋白的那些CDR區，而所有或實質上所有的FR區係人類免疫球蛋白共有序列的那些FR區。人類化抗體最理想亦包括通常係人類免疫球蛋白的至少一部分免疫球蛋白恆定區或區域(Fc)。抗體可具由如WO 99/58572中所述修飾之Fc區。其他形式的人類化抗體可具有一或更多參照原始抗體而改變之CDR(一、二、三、四、五、六)，其亦稱為一或更多CDR「衍生自」一或更多來自原始抗體的CDR。
本文所用之「人類抗體」意指胺基酸序列對應於人類產生之抗體與/或已經利用技術中習知或本文所述之製造人類抗體技術任一者製造之胺基酸序列的抗體。此種人類抗體的定義包括包含至少一人類重鏈聚胜肽或至少一人類輕鏈聚胜肽的抗體。上述實例之一係包括鼠科輕鏈與人類重鏈聚胜肽的抗體。可利用技術中習知的不同技術產生人類抗體。一實施例中，人類抗體係選自噬菌體資料庫，其中該噬菌體資料庫表現人類抗體(Vaughan等人1996,Nature Biotechnology ,14:309-314；Sheets等人(1998),PNAS ,(USA)95:6157-6162；Hoogenboom與Winter,1991,J. Mol. Biol .,227:381；Marks等人(1991),J. Mol. Biol .,222:581)。亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座導入轉殖基因動物(例如，小鼠)來製造人類抗體，而轉殖基因動物中的內源性免疫球蛋白基因已經被部分或完全去活化。此方法描述於美國專利號5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425與5,661,016。或者，可藉由永生化產生針對目標抗原之抗體的人類B淋巴球來製備人類抗體，上述B淋巴球可自個體中或已經在試管內免疫而取得。參閱諸如Cole等人Monoclonal and Cancer Therapy,Alan R. Liss,p. 77(1985)；Boerner等人(1991),J. Immunol .,147(1):86-95；與美國專利號5,750,373。
抗體的「變異區」代表單一或組合的抗體輕鏈變異區或抗體重鏈變異區。重鏈與輕鏈之變異區個別由三個亦稱為高度變異區之互補決定區(CDR)所連接之四個架構區域(FR)所構成。各個鏈中的CDR係由FR相當接近地固持在一起，並與其他鏈的CDR促成抗體之抗原-結合位置的形成。至少有兩種確定CDR的技術:(1)一種方法係根據物種之間的序列變化性(即，Kabat等人Sequence of Proteins of Immunological Interest,(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；與(2)一種方法係根據抗原-抗體複合物的結晶學研究(Al-lazikani等人(1997)J. Molec. Biol . 273:927-948))。本文所用之CDR可代表任一方法或兩者方法之組合所界定之CDR。
抗體的「恆定區」代表單一或組合的抗體輕鏈恆定區或抗體重鏈恆定區。抗體恆定區通常提供結構穩定性與其他的功能，諸如抗體鏈結合、分泌、經胎盤移動性(transplacental mobility)及補體結合，但並不涉及抗原結合。恆定區基因中的胺基酸序列與相應之外顯子序列取決於其衍生之物種；然而，胺基酸序列中導致同種異形(allotype)之變化相對受限於物種種特定恆定區中。各個鏈之變異區藉由連結聚胜肽序列結合至恆定區。連結序列係由輕鏈基因中「J」序列與重鏈基因中「D」序列與「J」序列之組合所編碼。
本文所用之「抗體-依賴型細胞介導之細胞毒性」與「ADCC」代表細胞介導之反應，其中表現Fc受體(FcR)之非專一性細胞毒性細胞(諸如，自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球與巨噬細胞)辨別目標細胞上的結合抗體並接著造成目標細胞的裂解。可利用試管內ADCC試驗(諸如，美國專利號5,500,362或5,821,337中所述)來評估關注之分子的ADCC活性。上述試驗的有用效應子細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)與NK細胞。替代或額外地，可活體內試驗(例如，Clynes等人1998,PNAS (USA),95:652-656所揭露之動物模式)關注之分子的ADCC活性。
「補體依賴型細胞毒性」與「CDC」代表目標在補體存在下的裂解。補體活化路徑係由補體系統之第一補體(Clq)結合至與同源抗原複合之分子(例如，抗體)所引發。為了確定補體活化，可實施例如Gazzano-Santoro等人J. Immunol. Methods ,202:163(1996)中所述之CDC試驗。
本文交替應用詞彙「聚胜肽」、「寡胜肽」、「胜肽」與「蛋白」代表任何長度的胺基酸聚合物。聚合物可為線性或支狀，其可包括修飾之胺基酸，且其可由非-胺基酸中斷。詞彙亦包含已經由自然或插入修飾之胺基酸聚合物；例如，雙硫鍵形成、醣化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾(例如，與標記成分接合)。定義中亦包括例如，包含一或更多胺基酸類似物(包括例如，非自然胺基酸等)的聚胜肽、以及其他技術中習知的修飾。由於本發明之聚胜肽係基於抗體，所以可理解聚胜肽可為單鏈或連結鏈。
本文交替應用「聚核苷酸」或「核酸」來代表任何長度且包括DNA與RNA的核苷酸聚合物。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾之核苷酸或鹼基與/或其類似物、或任何可由DNA或RNA聚合酶併入聚合物之基質。聚核苷酸可包括修飾之核苷酸(諸如，甲基化核苷酸與其類似物)。如果存在的話，可在聚合物組合前或後給予核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可由非-核苷酸成分所中斷。在聚合化後可進一步修飾聚核苷酸，例如以標記成分接合。其他修飾類型包括諸如，「加帽(cap)」；以類似物取代一或更多自然存在核苷酸；核苷酸內修飾，諸如具有無電荷連結(諸如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoamidate)、胺甲酸酯(cabamate)等)的那些核苷酸與具有帶電連結(諸如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些核苷酸、包含懸垂部分(例如，蛋白(諸如，核酸酶、毒素、抗體、信號胜肽、聚-L-離胺酸等))的那些核苷酸、具有嵌入劑(諸如，啶、補骨脂素(psoralen)等)的那些核苷酸、包含螯化物(諸如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的那些核苷酸、包含烴化劑的那些核苷酸、具有修飾之連結(諸如，α異構核酸等)的那些核苷酸、以及聚核苷酸的未修飾形式。再者，通常存在於糖中的任何羥基可藉由例如膦酸基(phosphonate)、磷酸基加以取代、可藉由標準保護基加以保護、或經活化以製備與額外核苷酸的額外連結、或可接合至固體支撐件。可磷酸化或以胺類或1-20碳原子之有機加帽基團取代5’與3’末端OH。其他羥基亦可衍生至標準保護基。聚核苷酸亦可包含技術中習知的核醣或去氧核醣類相似形式，包括諸如2’--O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-疊氮-核醣、碳環糖類似物、α-異構醣、差向異構(epimeric)醣，諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、哌喃糖、呋喃糖、景天酮庚糖(sedoheptulose)、非環類似物與非鹼性(abasic)核苷類似物(例如，甲基核糖苷)。可由替代連接基團取代一或更多磷酸二酯連接。這些替代連接基團包括(但不限於)實施例中磷酸根由P(O)S(「硫代磷酸根(thioate)」)、P(S)S(「二硫代磷酸根(dithioate)」)、“(O)NR2 (「胺基磷酸根(amidate)」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2 (「formacetal」)，其中各個R或R’分別為H或經取代或未經取代之選擇性包含醚(-O-)連接之烷基(1-20C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。並非需要聚核苷酸中所有連接係相同的。上述可用於本文所提到的所有聚核苷酸，包括RNA與DNA。
本文所用之「載體」意指能夠傳送且較佳能夠在宿主細胞中表現一或更多關注之基因或序列的構築體。載體實例包括(但不限於)病毒載體、裸露的DNA或RNA表現載體、質體、黏質體(cosmid)或噬菌體載體、與陽離子聚集劑結合之DNA或RNA表現載體、裝入脂質體中之DNA或RNA表現載體、與某些真核細胞(例如，生產細胞)。
本文所用之「表現控制序列」意指引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子(諸如，持續性或誘導性啟動子)或增強子。表現控制序列係操作性連接至即將轉錄之核酸序列。
本文所用之藥物、化合物或藥學組合物的「有效劑量」或「有效數量」係足以造成有利或所欲結果之數量。關於預防性應用，有利或所欲結果包括諸如排除或降低風險、減輕嚴重度或延遲疾病開始等結果，包括疾病的生化、組織與/或行為症狀、其之併發症與疾病發展過程中呈現的中間病理現象。關於治療應用，有利或所欲結果包括諸如減少一或更多起因於疾病的症狀、提高那些罹患疾病者的生活品質、減少治療疾病所需之其他藥物的劑量、提高另一藥物治療(例如，經由標定)的效應、延遲疾病的進展與/或延長存活等臨床結果。癌症或腫瘤的實例中，藥物的有效數量可具有減少癌症細胞的數目；降低腫瘤尺寸；抑制(即，減緩到某種程度且較佳係停止)癌症細胞滲入周圍器官；抑制(即，減緩到某種程度且較佳係停止)腫瘤轉移；抑制腫瘤成長到某種程度；與/或減輕與異常相關之一或更多症狀至某種程度等效果。可以一或更多施加來施加有效劑量。關於本發明之意圖，藥物、化合物或藥學組合物的有效劑量係足以直接或間接完成預防或治療處理的數量。如臨床領域所理解般，可搭配或不搭配另一藥物、化合物或藥學組合物來達成藥物、化合物或藥學組合物的有效劑量。因此，若搭配一或更多其他試劑可達成所欲結果可將一或更多治療劑的施加視為「有效劑量」且單一試劑可視為有效劑量。
本文所用之「搭配」代表除了另一治療形式外施加一治療形式。因此，「搭配」代表對個體施加其他治療形式之前、之間或之後施加一種治療形式。
本文所用之「治療」係一種得到有利或所欲結果(包括且較佳有臨床結果)的方法。關於本發明之意圖，有利或所欲結果包括(但不限於)一或更多下列：減少癌細胞的增殖(或摧毀)、減少起因於疾病之症狀、提高那些罹患疾病者的生活品質、減少治療疾病所需之其他藥物的劑量、延遲疾病的進展與/或延長個體的存活。
本文所用之「延遲疾病的發展」意指推遲、妨礙、減緩、阻礙、穩定與/或延緩疾病(例如，癌症)的發展。此延遲可為任何不同長度的時間，取決於病史與/或治療之個體。熟悉技術人士可理解充分或明顯的延遲實際上可包括阻止，其中個體不發展該疾病。例如，可延遲末期癌症，例如轉移的發展。
「個體」或「受試者」係哺乳動物，較佳係人類。哺乳動物亦包括(但不限於)農場動物、運動動物、寵物(諸如，貓、狗、馬)、靈長類、小鼠與大鼠。
本文所用之詞彙「專一性辨別」或「專一性結合」代表可測量與可再現的交互作用(諸如，目標與抗體間之吸引或結合)，其在包括生物分子之異質性分子群體存在下確定目標的存在。例如，專一性或優先地結合表位之抗體係以較高親合力、結合力(avidity)、更容易地與/或以較大持續時間(高於其結合目標的其他表位或非目標表位)結合此表位的抗體。藉由閱讀此定義可理解例如專一性或優先結合第一表位之抗體(或部分或表位)可或不可專一性或優先地結合第二表位。因此，「專一性結合」或「優先結合」並不必然需要(雖然其可包括)排除性結合。專一性結合目標之抗體的結合常數係至少約103 M-1 或104 M-1 、有時約105 M-1 或106 M-1 、其他實例約106 M-1 或107 M-1 、約108 M-1 至109 M-1 、或約1010 M-1 至1011 M-1 或更高。許多免疫試驗形式可用來選擇專一性與特定蛋白有免疫反應之抗體。例如，固相ELISA免疫試驗係例行用來選擇與蛋白專一性免疫反應之單株抗體。參閱例如，Harlow與Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Co1d Spring Harbor Publications,New York，可用於確定專一性免疫反應之免疫試驗形式與條件的描述。
本文所用之詞彙「癌症」、「腫瘤」、「癌性」與「惡性」代表或描述哺乳動物中的生理症狀，其一般係以未受調控之細胞生長為特徵。癌症的實例包括(但不限於)癌(carcinoma)，其包括腺癌、淋巴瘤、胚細胞瘤(blastoma)、黑色素瘤(melanoma)與肉瘤。上述癌症的更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非-小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、胃腸癌、霍奇金氏(Hodgkin's)與非-霍奇金氏淋巴瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、神經膠質瘤(glioma)、卵巢癌、肝臟癌症(諸如，肝癌(hepatic carcinoma)與肝癌(hepatoma))、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾腺癌、腎臟癌症(諸如，腎細胞癌與威爾姆氏(Wilms')腫瘤)、基底細胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食道癌與不同類型的頭頸部癌。
除非文中另有明示，否則本文與附屬之申請專利範圍中所用之單數形式「一」與「該」包括複數對照物。例如，提到一「抗體」係提到一或更多抗體(例如，莫耳量)且包括其技術中習知的等效物等。
可以理解本文所述之本發明的態樣與變化包括態樣與變化「構成」與/或「實質構成」的那些。
專一性結合非造血性癌症細胞上表現之CD43與CEA上之醣類表位的抗體與聚胜肽
本發明提供專一性結合非造血性癌症細胞表現之CD43與/或CEA上之表位、但不專一性結合白血球(例如，周圍T細胞)或Jurkat細胞表現之CD43上之表位的單離抗體與衍生自抗體之聚胜肽。
某些實施例中，本發明提供之抗體包括：重鏈變異區，其包括一或更多序列編號：1的CDR區；與人類IgG1的重鏈恆定區。某些實施例中，抗體包括輕鏈變異區，其包括一或更多序列編號：2的CDR區；與κ輕鏈恆定區。
某些實施例中，一或更多抗體之重鏈恆定區與/或輕鏈恆定區中的胺基酸殘基係經修飾(包括胺基酸插入、刪除與取代)。例如，可修飾實施例中顯示之胺基酸殘基。
某些實施例中，本發明提供之抗體包括：(a)重鏈變異區，其包括一或更多來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區；與重鏈恆定區，其包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列；及(b)輕鏈變異區，其包括一或更多來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區；與輕鏈恆定區，其包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，一或更多來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區係三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區。某些實施例中，一或更多來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區係三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區。某些實施例中，重鏈中的CDR1、CDR2與CDR3分別包括胺基酸序列SYVMH(序列編號：168)、YINPYNGGTQYNEKFKG(序列編號：169)與RTFPYYFDY(序列編號：170)。某些實施例中，輕鏈中的CDR1、CDR2與CDR3分別包括胺基酸序列 RSSQSILHSNGNTYLE(序列編號：171)、KVSNRFS(序列編號：172)與FQGSHAPLT(序列編號：173)。某些實施例中，重鏈變異區包括來自序列編號：1或3的變異區胺基酸序列。某些實施例中，輕鏈變異區包括來自序列編號：2或4的變異區胺基酸序列。
某些實施例中，一或更多衍生自序列編號：1與/或序列編號：2之胺基酸序列的CDR係至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同於至少一、至少二、至少三、至少四、至少五、或至少六個序列編號：1與/或序列編號：2的CDR。
本發明之抗體與聚胜肽進一步具有一或更多下列特徵：(a)若以α-1→(2,3,4)-岩藻醣苷酶處理包含表位之分子則會降低抗體或聚胜肽對表位的結合；(b)包含Lea 結構、Lea -乳糖結構、LNDFH II結構與/或LNT結構之醣類可抑制抗體或聚胜肽對表位的結合；(c)在細胞毒素接合與免疫效應子功能不存在下，當結合癌症細胞之細胞表面上表現之表位後可引發非造血性癌症細胞的死亡(例如，透過細胞凋亡)；(d)在結合癌症細胞之細胞表面上表現之表位後可抑制非造血性癌症細胞的細胞生長或增殖；與(e)治療或預防個體中在細胞表面上表現表位之非造血性癌症，諸如大腸直腸癌與胃癌。
本文所用之詞彙「抑制」包括部分與完全抑制。例如，抗體或聚胜肽對CD43與CEA上之表位的結合係由包含Lea 結構、Lea -乳糖結構、LNDFH II結構或LNT結構之醣類抑制至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可藉由直接競爭或其他機制來抑制抗體對表位的結合。
表現表位之非-造血性癌症細胞的實例包括(但不限於)大腸直腸癌症細胞(諸如，COLO 205與DLD-1)、胃癌症細胞(例如，NCI-N87)與胰臟癌症細胞(例如，SU.86.86，ATCC No. CRL-1837)。
本發明之抗體與聚胜肽可辨別非造血性癌症細胞上呈現之CD43的細胞外區域，但不會結合白血球CD43(例如，周圍T細胞)的細胞外區域或Jurkat細胞(淋巴母細胞白血病細胞)上表現之CD43的細胞外區域。某些實施例中，本發明之新抗體或聚胜肽不會專一性結合造血源細胞表現之CD43。
本發明包括本文所述對抗體或聚胜肽之修飾，其包括不會明顯影響其之特性的功能上等效抗體以及活性與/或親合力提高或減少的變體。例如，抗體之胺基酸序列可經突變以取得對癌症細胞表現之CD43或CEA具有所欲結合親合力的抗體。聚胜肽的修飾係技術中的例行實踐而不必在本文中詳細描述。修飾之聚胜肽的實例包括具有保守性取代胺基酸殘基之聚胜肽、一或更多不明顯傷害地改變化學類似物之功能活性或應用的胺基酸刪除或附加。
胺基酸序列插入包括長度範圍由一個殘基至包含一百或更多殘基之聚胜肽的胺基-與/或羧基-末端融合以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有N-端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至表位標記之抗體。其他抗體分子的插入變體包括在抗體之N-或C-端融合可提高抗體血清半生期之酵素或聚胜肽。
取代變體移除抗體分子中之至少一胺基酸殘基並在其位置插入不同殘基。取代突變最有興趣的位置包括高度變異區，但亦可考慮FR改變。保守性取代顯示於標題「保守性取代」下之表中。若上述取代造成生物活性的改變，那麼可導入更多下表中稱為「示範性取代」或參照胺基酸類型進一步描述於下的實質改變並篩選產物。
可藉由選擇取代來達成抗體之生物特性的實質修飾，該取代明顯改變其維持下列特性之作用：(a)取代區域中之聚胜肽骨幹的結構，例如片狀或螺旋狀構形，(b)分子在目標位置處的電荷或疏水性，或(c)側鏈的主體。根據共同側鏈特性可將自然存在殘基分為幾組：
(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)極性不帶電荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性(負電)：Asp、Glu;
(4)鹼性(正電)：Lys、Arg;
(5)影響鏈方向的殘基：G1y、Pro;及
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。
可藉由改變這些類型之一的成員為另一類型來產生非-保守性取代。
亦通常以絲胺酸取代不牽涉於維持適當構形的任何半胱胺酸殘基以改善分子的氧化穩定性並預防異常的交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵結加至抗體以改善其之穩定性，特別係當抗體係抗體片段(例如，Fv片段)時。
胺基酸修飾的範圍由改變或修飾一或更多胺基酸至完全重新設計區域(例如，變異區)。變異區中的變化可改變結合親合力與/或專一性。某些實施例中，在CDR區域中不產生超過1-5個保守性胺基酸取代。其他實施例中，在CDR區域中不產生超過1-3個保守性胺基酸取代。又其他實施例中，CDR區域係CDRH3與/或CDR L3。
修飾亦包括醣化與非醣化聚胜肽、以及具有其他轉譯後修飾的聚胜肽，諸如不同糖類的醣化、乙醯化與磷酸化。抗體在其恆定區之保守性位置被醣化(Jefferis與Lund,(1997),Chem. Immunol. 65:111-128；Wright與Morrison,(1997),TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白之側鏈的寡醣影響蛋白的功能(Boyd等人(1996),Mol. Immunol. 32:1311-1318；Wittwe與Howard,(1990),Biochem. 29:4175-4180)，而醣蛋白部分之間的分子內交互作用可影響醣蛋白的構形與呈現之三維表面(Hefferis與Lund，同上之文獻；Wyss與Wagner,(1996),Current Opin. Biotech. 7:409-416)。寡醣亦可根據特定辨別結構將已知醣蛋白指向某些分子。亦已經發表抗體的醣化會影響抗體-依賴型細胞毒性(ADCC)。明確地說，已經發表具有四環素-調控表現之β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺醯基轉移酶III(β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase,GnTIII)(二分GlcNAc之醣基轉移酶催化形成)的CHO細胞具有改善的ADCC活性(Umana等人(1999),Mature Biotech. 17:176-180)。
抗體的醣化通常係N-連結或O-連結任一者。N-連結代表醣類部分附著至天冬醯胺酸殘基的側鏈。三胜肽序列：天冬醯胺酸-X-絲胺酸、天冬醯胺酸-X-蘇胺酸與天冬醯胺酸-X-半胱胺酸，其中X係任何胺基酸除了脯胺酸；係將醣類部分酵素附著至天冬醯胺酸側鏈的辨別序列。因此，這些三胜肽序列的任一者存在於聚胜肽中可產生可能的醣化位置。O-連結醣化代表將醣類N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖之一附著至羥基胺基酸，大部分通常係絲胺酸或蘇胺酸(但亦可應用5-羥基脯胺酸或5-羥離胺酸)。
可藉由改變胺基酸序列而方便地達成將醣化位置附著至抗體，以至其包含一或更多上述之三胜肽序列(用於N-連結醣化位置)。亦可藉由附加一或更多絲胺酸或蘇胺酸殘基至原始抗體序列或以一或更多絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來達成改變(用於O-連結醣化位置)。
亦可改變抗體醣化型態而不改變根本的核苷酸序列。醣化大部分取決於用於表現抗體之宿主細胞。由於用來表現重組醣蛋白(例如，抗體)作為可能治療方法的細胞類型很少係自然細胞，因此可預期抗體之醣化型態的改變(參閱例如，Hse等人(1997),J. Biol. Chem. 272:9062-9070)。
本發明之抗體包括抗體片段(諸如，Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、Fc等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)、其之突變、包含抗體部分的融合蛋白、以及免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構，其包括專一性所需之抗原辨別位置。抗體可為鼠科、大鼠、駱駝、人類或任何其他來源(包括人類化抗體)。
聚胜肽(包括抗體)對CD43或CEA的結合親合力可能低於約500nM、約400nM、約300nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM任一者。如同技術中所習知，結合親合力可表現成KD 或解離常數，而結合親合力提高對應於KD 的降低。確定抗體對CD43或CEA之結合親合力的一種方法係藉由測量抗體單官能基Fab片段的結合親合力。為了得到單官能基Fab片段，可用木瓜酶切割抗體(例如，IgG)或重組式表現。可藉由表面電漿子共振(BlAcore3000TM 表面電漿子共振(SPR)系統，BIAcore,INC,Piscaway NJ)與ELISA確定抗體之Fab片段的親合力。取得動力結合率(kon )與分離率(koff )(通常在25℃下測量)；並以koff /kon 計算平衡解離常數(KD )值。
某些實施例中，本發明之抗體與聚胜肽減少具有表位之癌症細胞的數目與/或抑制具有表位之腫瘤或癌症細胞的細胞生長或增殖。相較於未以抗體或聚胜肽處理之細胞，細胞數目的減少或者細胞生長或增殖的抑制較佳係至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約65%、約75%或更高。癌症細胞包括(但不限於)大腸直腸癌、胰臟癌、肺癌與胃癌。
某些實施例中，本發明之抗體與聚胜肽在結合非造血性癌症細胞的細胞表面上表現之表位後，能夠單獨地引發細胞死亡，例如透過細胞凋亡。本文所用之詞彙「引發細胞死亡」意指本發明之抗體或聚胜肽可直接與細胞表面上表現之分子交互作用，且結合/交互作用單獨係足以引發細胞中的細胞死亡而不需其他因子的幫助，諸如細胞毒素接合或其他免疫效應子功能，即補體-依賴型細胞毒性(CDC)、抗體-依賴型細胞毒性(ADCC)或胞噬作用。
本文所用之詞彙「細胞凋亡(apoptosis)」代表細胞內細胞破壞的基因-引導過程。細胞凋亡不同於細胞壞死(necrosis)；其包括細胞骨架瓦解、細胞質收縮與凝聚、磷脂絲胺酸表現在細胞膜的外表面上與皰，造成細胞膜連結囊或凋亡小體的形成。該過程亦稱為「計畫性細胞死亡」。細胞凋亡過程中發現特有現象，諸如細胞表面彎曲、細胞核染色絲的凝聚、染色體DNA的片段化與粒線體功能的喪失。許多習知技術可用來偵測細胞凋亡，諸如以Annexin V、碘化丙錠、DNA片段試驗與YO-PRO-1(Invitrogen)來染細胞。
偵測細胞死亡(例如，細胞凋亡)的方法包括(但不限於)偵測型態、DNA片段、酵素活性與聚胜肽降解等。參閱Siman等人的美國專利號6,048,703；Martin與Green(1995),Cell ,82:349-52；Thomberry與Lazebnik(1998),Science ,281:1312-6；Zou等人的美國專利號6,291,643；Scovassi與Poirier(1999),Mol. Cell Biochem .,199:125-37；Wyllie等人(1980),Int. Rev. Cytol .,68:251-306；Belhocine等人(2004),Technol. Cancer Res. Treat .,3(1):23-32，以參考資料併入本文中。
某些實施例中，本發明之抗體與聚胜肽辨別非造血性癌症細胞上表現之構形表位，且此表位的結構具有與三胜肽N'-Trp-Pro-Ile-C'形成之結構相等之物理與化學特徵。本文所用之「表位的結構具有與胜肽形成之結構相等之物理與化學特徵」意指兩個結構具有與抗體結合相關之物理與化學特性，以致專一性結合一結構之抗體可結合兩者結構。某些實施例中，結合聚胜肽之抗體與聚胜肽在聚胜肽之N-端包括胺基酸序列N'-Trp-Pro-I1e-C'。
某些實施例中，本發明之抗體與聚胜肽與抗體m5F1或h5F1競爭結合癌症細胞之細胞表面上表現的表位。某些實施例中，本發明之抗體或聚胜肽結合CD43或CEA上之表位(抗體m5F1或h5F1至少一者結合)。
競爭試驗可用來確定是否兩個抗體藉由辨別相同或空間上重疊的表位結合相同表位或是一抗體競爭式抑制另一抗體對抗原的結合。技術中習知這些試驗。一般而言，將抗原或抗原表現細胞固定在多孔盤中並測量未標記抗體阻礙標記抗體之結合的能力。上述競爭式試驗常用的標記係放射性標記或酵素標記。
某些實施例中，CDR係Kabat CDR。其他實施例中，CDR係Chothia CDR。其他實施例中，CDR係Kabat與Chothia CDR的組合(亦稱為「組合式CDR」或「延伸式(extended)CDR」)。換句話說，對於任何包含超過一個CDR的已知實施例而言，CDR可為Kabat、Chothia與/或組合式任一者。
技術中習知並在本文揭露產生抗體與衍生自抗體之聚胜肽的方法。產生之抗體經測試具有對非造血性癌症或腫瘤細胞表現之CD-43或CEA上之表位的專一性結合，但不具有對CD43表現之白血球、Jurkat細胞與/或造血性源的其他CD43表現細胞的專一性結合。癌症細胞或包含表位之細胞外區域(包括其之片段)可用來試驗。
Jurkat細胞株係淋巴母細胞白血病細胞，且係由Schneider等人自14歲男孩之周圍血液中建立。Schneider等人Int. J. Cancer 19:621-626,1977。可商業上取得不同的Jurkat細胞株，例如取自American Type Culture Collection(諸如，ATCC TIB-152、ATCC TIB-153、ATCC CRL-2678)。
可藉由免疫沉澱或藉由試管內結合試驗(諸如，放射免疫試驗(RIA)或酵素連結免疫吸附試驗(ELISA))來確定產生之抗體的結合專一性。技術中習知上述之技術與試驗。例如，可藉由Munson與Pollard(1980),Anal. Biochem .,107:220的Scatchard分析確定單株抗體的結合親合力。
可利用技術中習知與本文所述之方法對辨別之抗體進一步測試其引發細胞死亡(例如，細胞凋亡)與/或抑制細胞生長或增殖的能力。
亦可藉由重組DNA方法產生本發明之抗體，諸如美國專利號4,816,567與6,331,415所述之那些方法，其以參考資料併入。例如，可利用傳統步驟(例如，利用能夠專一性結合編碼鼠科抗體之重鏈與輕鏈之基因的寡核苷酸探針)輕易地單離與定序編碼本發明之單株抗體的DNA。本發明之融合瘤細胞作為上述DNA的較佳來源。一但單離後，可將DNA置入表現載體中，接著將表現載體轉染入不另外產生免疫球蛋白蛋白之宿主細胞(諸如，猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓癌細胞)，以在重組宿主細胞中合成單株抗體。DNA亦可經修飾，例如藉由以人類重鏈與輕鏈恆定區域的編碼序列取代替換同源鼠科序列(美國專利號4,816,567)或藉由共價連接所有或部分的非-免疫球蛋白聚胜肽序列至免疫球蛋白編碼序列。上述非-免疫球蛋白聚胜肽可取代本發明之抗體的恆定區域或可取代本發明抗體的一抗原-結合位置之變異區域以產生嵌合二價抗體。
某些實施例中，本發明之抗體係由兩個表現載體所表現。編碼抗體(例如，人類化抗體)之重鏈的第一表現載體包括編碼抗體重鏈之變異區的第一部分與編碼抗體重鏈之恆定區的第二部分。某些實施例中，第一部分編碼之重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括一或更多來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區，該重鏈恆定區包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，一或更多來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區係三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區。編碼抗體之輕鏈的第二表現載體包括編碼抗體輕鏈之變異區的第一部分與編碼抗體輕鏈之恆定區的第二部分。某些實施例中，第一部分編碼之輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括一或更多來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區，該輕鏈恆定區包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，一或更多來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區係三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區。
或者，本發明之抗體(例如，人類化抗體)係由單一表現載體所表現。單一表現載體編碼本發明之抗體的重鏈與輕鏈兩者。某些實施例中，表現載體包括聚核苷酸序列，其編碼重鏈與輕鏈，重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括一或更多來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區，該重鏈恆定區包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列。而輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括一或更多來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區，該輕鏈恆定區包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，一或更多來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區係三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區。某些實施例中，一或更多來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區係三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區。
通常表現載體具有衍生自與宿主細胞相容之物種的轉錄與轉譯調控序列。此外，載體通常帶有能夠在轉形細胞中提供表形篩選的特定基因。
習知許多不同的真核細胞重組宿主-載體表現系統並可用於本發明中。例如在真核微生物中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或普通的麵包酵母係最常應用的，即便可取得許多其他品系(例如嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris))。可自ATCC取得衍生自多細胞生物的細胞株(諸如，Sp2/0或中國倉鼠卵巢(CHO))，並亦可用作宿主。適合真核轉形之一般載體質體係諸如pSV2neo與pSV2gpt(ATCC)、pSVL與pSVK3(Pharmacia)、及pBPV-1/pML2d(International Biotechnology,Inc.)。
本發明中有用之真核宿主細胞較佳係融合瘤、骨髓癌、質漿細胞瘤或淋巴瘤細胞。然而，可適當地應用其他真核宿主細胞，前提是哺乳宿主細胞能夠辨別蛋白表現的轉錄與轉譯DNA序列；藉由切割引導序列來處理引導胜肽並分泌蛋白；並提供蛋白的轉譯後修飾，例如醣化。
因此，本發明提供藉由重組表現或體(包括本文所揭露之DNA構築體)轉形且能夠表現本發明之抗體或聚胜肽的真核宿主細胞。某些實施例中，本發明轉形之宿主細胞因此包括至少一DNA構築體，其包括本文所述之輕鏈與重鏈DNA序列以及轉錄與轉譯調控序列，轉錄與轉譯調控序列相對輕鏈與重鏈-編碼DNA序列配置以引導抗體或聚胜肽的表現。
可藉由技術中習知的標準轉染步驟以許多方式轉形本發明所用之宿主細胞。標準轉染步驟中可用的係電穿孔技術、原生質融合與磷酸鈣沉澱技術。上述技術通常描述於F. Toneguzzo等人(1986),Mol. Cell. Biol. ,6:703-706；G. Chu等人Nucleic Acid Res. (1987),15:1311-1325；D. Rice等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979),79:7862-7865；與V. Oi等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983),80:825-829。
兩個表現載體的實例中，可一個接一個分別或共同地(共同轉移或共同轉染)將兩個表現載體送入宿主細胞中。
本發明亦提供產生抗體或聚胜肽之方法，其包括培養包含編碼抗體或聚胜肽之表現載體的宿主細胞，並藉由熟悉技術人士所習知的方式自培養物中取得抗體或聚胜肽。某些實施例中藉由傳統免疫球蛋白純化步驟單離或純化抗體，諸如A蛋白-瓊脂糖凝膠(Protein A-Sepharose)、烴基磷灰石層析(hydroxylapatite chromatography)、膠體電泳、透析或親合力層析。
再者，可在基因轉殖動物中產生所欲之抗體。可根據標準方法取得適當的基因轉殖動物，方法包括將適當表現載體微注入卵中、將卵轉移至假孕雌性中、並選擇表現所欲抗體之後代。
本發明亦提供專一性辨別癌症細胞表現之CD43與CEA上之表位的嵌合抗體。例如，嵌合抗體的變異區與恆定區係來自不同物種。某些實施例中，重鏈與輕鏈兩者之變異區係來自本文所述之鼠科抗體。某些實施例中，變異區包括來自序列編號：1與序列編號：2之變異區、或者序列編號：1之殘基20-137與序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列。某些實施例中，重鏈與輕鏈兩者之恆定區係來自人類抗體。
可藉由技術中建立相當完善的技術來製備本發明之嵌合抗體。參閱諸如，美國專利號6,808,901、美國專利號6,652,852、美國專利號6,329,508、美國專利號6,120,767與美國專利號5,677,427，各個以參考資料併入。一般而言，可藉由取得編碼抗體之重鏈與輕鏈變異區的cDNA、將cDNA插入表現載體中來製備嵌合抗體，而表現載體一但被導入真核宿主細胞後可表現本發明之嵌合抗體。表現載體較佳係帶有功能上完整的恒定重鏈或輕鏈序列，以致可輕易地將任何變異重鏈或輕鏈序列插入表現載體中。
本發明提供專一性辨別非造血性癌症細胞表現之CD43與CEA上之表位的人類化抗體。人類化抗體係其中CDR殘基由非-人類物種(諸如，小鼠、大鼠或兔子)之CDR殘基取代且具有所欲專一性、親合力與能力的人類抗體。某些實例中，人類抗體之Fv架構殘基係由對應的非-人類殘基所取代。
人類化單株抗體通有有四個步驟。其為：(1)確定初始抗體輕鏈與重鏈變異區域之核苷酸及預測之胺基酸序列(2)設計人類化抗體，即決定人類化處理過程中應用之抗體架構區域(3)實際的人類化方法/技術與(4)人類化抗體的轉染與表現。參閱諸如，美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089、6,180,370與6,548,640。例如，恆定區可經設計以更類似人類恆定區以避免若抗體用於人類臨床試驗與治療時的免疫反應。參閱諸如，美國專利號5,997,867與5,866,692。
保留對抗原的高親合力與其他有利生物特性來人類化抗體係重要的。為達成此目標，可藉由親本序列與利用親本與人類化序列之三維模型的不同概念性人類化產物的分析處理來製備人類化抗體。熟悉技術人士可一般地取得並知曉三維免疫球蛋白模型。可取得描述與展示選擇之候選免疫球蛋白序列的可能三維構形結構之電腦程式。檢驗這些展示可允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能角色，即分析殘基影響候選免疫球蛋白結合其之抗原的能力。此方法中，可自共有與輸入序列選擇與組合FR殘基以致達成所欲之抗體特性，例如對目標抗原的親合力增加。一般而言，CDR殘基係直接且大部分實質牽涉於影響抗原結合。人類化抗體亦可包含樞紐區域中的修飾以改善抗體的一或更多特性。
另一替代方式中，可藉由噬菌體呈現技術篩選並重組地產生抗體。參閱諸如，美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743與6,265,150；與Winter等人Annu. Rev. Immunol .12：433-455(1994)。或者，噬菌體呈現技術(McCafferty等人Nature 348：552-553(1990))可用來自未免疫供應者之免疫球蛋白變異(V)區域基因庫(repertoire)於試管內產生人類抗體與抗體片段。根據此技術，將抗體V區域基因同一讀框(in-frame)地選殖入絲狀噬菌體之主要或次要塗層蛋白基因任一者(諸如，M13或fd)，並在噬菌體微粒表面上呈現功能性抗體片段。由於絲狀微粒包含噬菌體基因體的單股DNA複本，根據抗體之功能特性的篩選亦造成篩選編碼呈現這些特性之抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細胞的某些特性。可以不同形式執行噬菌體呈現；參閱例如Johnson,Kevin S.與Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3,564-571(1993)。許多V-基因片段的來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人Nature 352:624-628(1991)從衍生自免疫小鼠脾臟的V基因小型隨機組合庫單離大量不同的抗-口咢唑啉酮(oxazolone)抗體。依照Mark等人J. Mol. Biol . 222:581-597(1991)或Griffith等人EMBO J . 12:725-734(1993)所述之技術可建構來自未免疫人類捐贈者之V基因庫並實質上單離針對不同抗原(包括自體-抗原)之抗體。自然免疫反應中，抗體基因以高速率累積突變(體細胞超突變)。某些導入之改變可給予較高的親合力，且在隨後的抗原挑戰過程中可優先地複製與分化呈現高親合力表面免疫球蛋白之B細胞。可應用習知的「鏈改組(chain shuffling)」技術來模擬此自然過程。Marks等人Bio/Technol . 10:779-783(1992))。此方法中，由噬菌體呈現取得之「初級」人類抗體的親合力可加以改善，藉由連續以未免疫捐贈者之V區域基因的自然存在變體(庫)的庫取代重鏈與輕鏈V區基因。此技術可產生親合力在pM-nM範圍中的抗體與抗體片段。 Waterhouse等人Nucl. Acids Res. 21:2265-2266(1993)已經描述產生非常大的噬菌體抗體庫(亦稱為「所有庫之母」)之策略。基因改組亦可用來自囓齒類抗體取得人類抗體，其中人類抗體與起始囓齒類抗體具有相似的親合力與專一性。根據此方法(亦稱為「表位壓印」)，以人類V區域基因庫取代噬菌體呈現技術取得之囓齒類抗體的重鏈或輕鏈V區域基因以產生囓齒類=人類嵌合體。抗原上的選擇造成單離能夠恢復功能性抗原-結合位置的人類變異區，即表位控制(壓印)夥伴的選擇。在重複處理以取代剩餘的囓齒類V區域時，可得到人類抗體(參閱PCT公開案WO 93/06213，1993年4月1日出版)。不像藉由CDR嫁接囓齒類抗體的傳統人類化，此技術提供完全的人類抗體，其不具有囓齒類源的架構或CDR殘基。顯而易見雖然上述係關於人類化抗體，但所討論之一般原則適用於客制化抗體應用，例如狗、貓、靈長類、馬與牛。
某些實施例中，抗體係完全人類抗體。專一性結合抗原之非-人類抗體可用來產生結合抗原之完全人類抗體。例如，熟悉技術人士可應用鏈交換技術，其中非-人類抗體的重鏈與表現不同人類輕鏈之表現庫共同表現。接著針對抗原結合篩選得到之雜合抗體(包含一人類輕鏈與一非-人類重鏈)。接著將參與抗原結合之輕鏈與人類抗體重鏈庫共同表現。再一次針對抗原結合篩選得到之人類抗體。例如此一方法的技術係描述於美國專利號5,565,332。此外，抗原可用來接種基因轉殖人類免疫球蛋白基因之動物。參閱例如美國專利號5,661,016。
抗體可為雙專一性抗體(一種對至少兩個不同抗原具有結合專一性的單株抗體)，其可藉由本文所揭露之抗體加以製備。技術中習知產生雙專一性抗體的方法(參閱例如Suresh等人(1986),Methods in Enzymology 121:210)。傳統上，雙專一性抗體的重組產生係根據兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共同表現，而該兩個重鏈具有不同的專一性(Millstein與Cuello,(1983),Nature 305,537-539)。
根據一種產生雙專一性抗體的方法，將具有所欲結合專一性(抗體-抗原結合位置)之抗體變異區域融至免疫球蛋白恆定區域序列。融合較佳係與免疫球蛋白重鏈恆定區域(包括至少部分的樞紐、CH2與CH3區)。較佳係讓包含輕鏈結合所需位置之第一重鏈恆定區(CH1)位於至少一融合中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合與(若想要的話)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入不同的表現載體，並共同轉染入適當的宿主生物。在用於構築之三聚胜肽鏈的不均等比例可提供最佳產率實施例中，此方法提供調整三聚胜肽片段之相互比例良好的彈性。然而，當至少兩個相同比例之聚胜肽鏈的表現造成高產率或當比例不具特定意義時，有可能將二或所有三個聚胜肽鏈的編碼序列插入一表現載體。
一方法中，雙專一性抗體係由一臂中具有第一結合專一性之雜合免疫球蛋白重鏈、與另一臂中之雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合專一性)所構成。這個免疫球蛋白輕鏈僅在雙專一性分子一半之不對稱結構促進所欲之雙專一性化合物與不欲之免疫球蛋白鏈組合的分離。此方法係描述於PCT公開案WO 94/04690，1994年3月3日出版。
包含兩個共價連接之抗體的雜接合(Heteroconjugate)抗體亦位於本發明之範圍中。上述抗體已經用於將免疫系統細胞指向不欲之細胞(美國專利號4,676,980)、並用於治療HIV感染(PCT公開案WO 91/00360與WO 92/200373；及EP 03089)。可利用任何方便的交聯方法產生雜接合抗體。技術中習知適當的交聯劑與技術且描述於美國專利號4,676,980。
亦可產生單鏈Fv片段，例如描述於Iliades等人1997,FEBS Letters ,409:437-441。利用不同連接子耦合上述單鏈片段係描述於Kortt等人1997,Protein Engineering ,10:423-433。技術中習知許多重組產生與運用抗體的技術。
可以思及本發明不僅包括上述之單株抗體，且亦包括任何含有抗體活性結合區的其之片段，諸如Fab、F(ab’)2 、scFv、Fv片段等。可利用技藝中建立相當完善的技術自本文所述之單株抗體產生上述片段(Rousseaux 等人(1986),inMethods Enzymol .,121:663-69 Academic Press)。
技術中習知製備抗體片段的方法。例如，以胃蛋白酶酵素切割抗體好產生抗體片段以提供稱為F(ab')2 的100Kd片段。可利用硫醇還原劑與選擇性的硫醇基(來自雙硫鍵結的切割)阻隔基進一步切割此片段以產生50Kd Fab’單價片段。或者，利用木瓜酶的酵素切割直接產生兩個單價Fab片段與Fc片段。這些方法描述於諸如美國專利號4,036,945與4,331,647以及其含之參考文獻，專利以參考資料併入本文中。亦參閱Nisonoff等人(1960),Arch Biochem. Biophys. 89:230；Porter(1959),Biochem. J. 73:119；Edelman等人inMETHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1，頁422(Academic Press 1967)。
或者，可藉由將編碼抗體之Fab的DNA插入原核生物表現載體或真核生物表現載體，並將載體導入原核生物或真核生物以表現Fab來產生Fab。
除了宿主細胞的選擇以外，重組產生抗體過程中影響醣化的因子包括生長模式、培養基配方、培養密度、氧化作用、pH、純化方案等。已經提出許多改變特定宿主生物中達成之醣化型態的方法，其包括導入或過度表現牽涉於寡醣產生的某些酵素(美國專利號5,047,335、5,510,261與5,278,299)。可自醣蛋白酵素地移除醣化或某些類型的醣化，例如應用內糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、內糖苷酶F1、內糖苷酶F2、內糖苷酶F3。此外，重組宿主細胞可經遺傳設計成在處理某些類型的多醣中有缺陷。技術中習知這些與相似的技術。
某些實施例中，可利用技術中習知的耦合技術來修飾本發明之抗體，耦合技術包括(但不限於)酵素手段、氧化取代與螯合。例如，可應用修飾來附加免疫試驗的標記。利用技術中建立之步驟來產生修飾之聚胜肽並可利用技術中習知的標準試驗來篩選，某些係描述於下與實施例中。
可將本發明之抗體或聚胜肽接合(例如，連接)至試劑(例如，治療劑)與標記。治療劑的實例係放射性部分、細胞毒素或化學治療分子。
可將本發明之抗體(或聚胜肽)連接至標記，諸如螢光分子、放射性分子、酵素或任何技術中習知的其他標記。本文所用之詞彙「標記」代表可被偵測的任何分子。某些實施例中，可藉由併入放射性標記胺基酸來標記抗體。某些實施例中，可將能被標記之卵白素(例如，鏈黴卵白素包含可被光學或比色法偵測之螢光標記或酵素活性)偵測之生物素部分附著至抗體。某些實施例中，可將標記併入或附著至另一試劑，而該試劑再結合關注之抗體。例如，可將標記併入或附著至一抗體，而該抗體再專一性結合關注之抗體。某些實施例中，標記或標誌亦可為治療性。技術中習知並可應用許多標記聚胜肽與醣蛋白的方法。某些一般的標記類型包括(但不限於)酵素性、螢光、化學發光與放射性標記。聚胜肽之標記的實例包括(但不限於)下列：放射性同位素或放射性核素(諸如，3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)、螢光標記(諸如，螢光異硫氰酸鹽(FITC)、若丹明(rhodamine)、鑭磷光體(lanthanide phosphors)、藻紅素(PE))、酵素標記(諸如，辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、冷光酶(luciferase)、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸鹽去氫酶、醇類脫氫酶、蘋果酸去氫酶、青黴素酶(penicillinase)、冷光酶)、化學發光、生物素基(biotinyl group)、二級受體辨別之預定聚胜肽表位(諸如，白胺酸拉鍊對序列、二級抗體的結合位置、金屬結合區域、表位標記)。某些實施例中，藉由不同長度的間隔臂附著標記以減少可能的空間阻礙。
本發明亦提供藥學組合物，其包括本文所述之抗體或聚胜肽、與藥學可接受載體或賦形劑。藥學可接受賦形劑係技術中習知的，且其係促進藥學有效物質施加之相對惰性物質。例如，賦形劑可給予形狀或黏稠或作為稀釋劑。適當的賦形劑包括(但不限於)穩定劑、潤濕與乳化劑、不同滲透壓的鹽類、封裝劑、緩衝劑與皮膚穿透促進劑。賦形劑以及腸胃外與非腸胃外藥物輸送係提出於Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing(2000)。
某些實施例中，本發明提供用於任何本文所述之方法的組合物(本文所述)，不論係用作藥劑與/或用作製造藥劑。
聚核苷酸、載體與宿主細胞
本發明亦提供聚核苷酸，其包括編碼任何本文所述之單株抗體與聚胜肽的核苷酸序列。某些實施例中，聚胜肽包括輕鏈與/或重鏈變異區的序列。
某些實施例中，聚核苷酸包括編碼重鏈之核酸序列與/或編碼輕鏈之核酸序列，重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括一或更多來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區，該重鏈恆定區包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列，而輕鏈包括輕鏈變異區與輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括一或更多來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區，該輕鏈恆定區包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。某些實施例中，聚核苷酸包括編碼重鏈之核酸序列與/或編碼輕鏈之核酸序列，重鏈包括重鏈變異區與重鏈恆定區，該重鏈變異區包括三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR區，該重鏈恆定區包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列，而輕鏈包括輕鏈變異區與恆定區，該輕鏈變異區包括三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR區，該恆定區包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列。
熟悉技術人士可以理解因為基因密碼的退化，有許多核苷酸序列編碼本文所述之一聚胜肽。這些聚核苷酸的其中某些與任何天生基因之核苷酸序列具有極小的同源性。因此，本發明特別地考量密碼子應用中之差異所造成的聚核苷酸變化。再者，包括本文提供之聚核苷酸序列的基因之對偶基因係位於本發明之範圍中。對偶基因係因為一或更多突變(諸如，核苷酸的刪除、附加與/或取代)而改變之內源性基因。得到之mRNA與蛋白可以(但不是必需)具有改變之結構或功能。可利用標準技術(諸如，雜合、擴增與/或資料庫序列比對)辨別對偶基因。
可利用化學合成、重組方法或PCR取得本發明之聚核苷酸。技術中習知化學聚核苷酸合成的方法而不需在本文詳細描述。熟悉技術人士可利用本文提供之序列與商業DNA合成機來產生所欲之DNA序列。
關於利用重組方法製備聚核苷酸，可將包括所欲序列之聚核苷酸插入適當載體、並接著將載體導入適當宿主細胞以便複製與擴增，如本文進一步所述。可藉由任何技術中習知的手段將聚核苷酸插入宿主細胞。藉由直接攝入、內噬作用、轉染、F-交配或電穿孔將外源性聚核苷酸導入來轉形細胞。一但導入後，可在細胞中維持外源性聚核苷酸為非-併入載體(例如，質體)或併入宿主細胞基因體中。可藉由技術中習知方法自宿主細胞單離如此擴增之聚核苷酸。參閱例如，Sambrook等人(1989)。
或者，PCR可再產生DNA序列。PCR技術係技術中習知的且描述於美國專利號4,683,195、4,800,159、4,754,065與4,683,202以及PCR:The Polymeraase Chain Reaction,Mullis等人eds.,Birkauswer Press,Boston(1994)。
本發明亦提供載體(諸如，選殖載體、表現載體)，其包括編碼本文所述之任何聚胜肽(包括抗體)的核酸序列。適當選殖載體可根據標準技術構築或選自大量技術中可取得之選殖載體。雖然選擇之選殖載體可根據預期應用之宿主細胞而有所改變，但有用的選殖載體通常具有自我複製的能力、擁有特定限制內切酶的單一目標與/或攜帶可用於選擇含有載體之殖株的標記基因。適當實例包括質體與細菌病毒，諸如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)與其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4，噬菌體DNA、與穿梭載體，諸如pSA3與pAT28。這些與許多其他選殖載體可取自商業賣主，諸如BioRad、Strategene與Invitrogen。
表現載體通常係可複製的聚核苷酸構築體，其包含根據本發明之聚核苷酸。表現載體可在宿主細胞中複製成附加體或染色體DNA的併入部分任一者。適當的表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體以及PCT公開案WO 87/04462中揭露之表現載體。載體成分通常包括(但不限於)一或更多下列：信號序列；複製起始點；一或更多標記基因；適當的轉錄控制元件(諸如，啟動子、增強子與終結子)。關於表現(即，轉譯)而言，通常亦需要一或更多轉譯控制元件，諸如核糖體結合位置、轉譯起始位置與終止密碼子。
可藉由許多適當手段將包含關注之聚核苷酸的載體導入宿主細胞中，包括電穿孔、應用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖(DEAE-dextran)或其他物質的轉染；微注射轟擊；脂轉染法(lipofection)；與感染(例如，當載體係例如牛痘病毒之感染性媒介)。導入載體或聚核苷酸的選擇通常取決於宿主細胞的特徵。
本發明亦提供宿主細胞，其包括任何本文所述之聚核苷酸或載體。任何能夠過度表現異源性DNA之宿主細胞可用於單離編碼關注之抗體、聚胜肽或蛋白之基因的用途。哺乳類宿主細胞的非限制實例包括(但不限於)COS、HeLa與CHO細胞。亦參閱PCT公開案WO 87/04462。適當的非-哺乳類宿主細胞包括原核生物(諸如，E.coli 或B.subtillis )與酵母菌(諸如，S，cerevisae 、S，pombe ；或K.lactis )。
診斷應用
本發明提供利用本發明之抗體、聚胜肽與聚核苷酸來偵測、診斷與監控與表位表現相關之疾病、異常或症狀的方法，表位表現相對正常樣本係增加或減少任一者，與/或不適當的表現，例如通常缺少表位表現之組織與/或細胞中存在表現。
某些實施例中，方法包括在取自受試者之樣本中偵測表位表現，而受試者疑有癌症，諸如大腸直腸癌、胰臟癌、胃癌與肺癌。偵測方法較佳包括以本發明之抗體、聚胜肽或聚核苷酸接觸樣本並確定結合水平是否不同於對照組或對比樣本的結合水平。方法亦有用於確定本文所述之抗體或聚胜肽是否適合治療患者。
本文所用之詞彙「樣本」或「生物樣本」代表整個生物或其之組織、細胞或組成部分的一部分(例如，體液包括(但不限於)血液、黏液、淋巴液、關節液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿液、陰道液與精液)。「樣本」或「生物樣本」進一步代表由整個生物或其之組織、細胞或組成部分的一部分製備的均質物、裂解物或萃取物，其包括(但不限於)諸如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚的外部分、呼吸道、腸道與泌尿生殖道、眼淚、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘤、器官。大部分，樣本已經自動物上移除，但詞彙「樣本」或「生物樣本」亦可代表活體內分析的細胞或組織，即不需自動物上移除。一般而言，「樣本」或「生物樣本」包含來自動物的細胞，但該詞彙亦代表可用來測量癌症相關之聚核苷酸或聚胜肽水平的非-細胞性生物材料，諸如血液、唾液或尿液的非-細胞部分。「樣本」或「生物樣本」進一步代表媒介，例如已經增殖生物於其中的營養湯或膠，其包含細胞成分，諸如蛋白或核酸分子。
一實施例中，以抗體接觸細胞或細胞/組織裂解物並確定抗體與細胞間之結合。當試驗細胞顯示相對於相同組織類型之對照細胞的結合活性時，這代表試驗細胞係癌性。某些實施例中，試驗細胞係來自人類組織。
可應用許多技術中習知用於偵測特定抗體-抗原結合的方法。可根據本發明執行之示範性免疫試驗包括螢光偏極化免疫試驗(FPIA)、螢光免疫試驗(FIA)、酵素免疫試驗(EIA)、散射測濁抑制免疫試驗(nephelometric inhibition immunoassay,NIA)、酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)與放射性免疫試驗(RIA)。可將指示部分或標記基團附著至受試抗體並經選擇以符合可用之試驗設備與相容免疫試驗步驟通常所規定之不同方法應用的需求。適當的標記包括(不限於)放射性核素(諸如，125 I、131 I、35 S、3 H或32 P)、酵素(諸如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、冷光酶或β。半乳糖苷酶)、螢光部分或蛋白(諸如，螢光素(fluorescein)、若丹明、藻紅素、GFP或BFP)或冷光部分(諸如，Quantum Dot Corporation,Palo Alto,CA提供的QdotTM 奈米微粒)。熟悉技術人士習知執行上述不同免疫試驗即將應用的一般技術。
針對診斷之目的，可用可偵測部分標記包括抗體之聚胜肽，可偵測部分包括(但不限於)放射性同位素、螢光標記以及許多技術中習知的酵素-基質標記。技術中習知將標記接合至抗體的方法。
某些實施例中，不需要標記包括本發明之抗體的聚胜肽，可利用結合本發明之抗體的標記抗體來偵測其之存在。
本發明之抗體可應用於任何習知試驗方法，諸如競爭性結合試驗、直接與間接的三明治試驗與免疫沉澱試驗。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press,Inc. 1987)。
抗體與聚胜肽亦可用於活體內診斷試驗，例如活體內成像。通常以放射性核素(諸如，111 In、99 Tc、14 C、131 I、125 I或3 H)標記抗體或聚胜肽，以致可利用免疫閃爍造影術(immunoscintiography)來定位關注之細胞或組織。
抗體亦可當作病理學(利用技藝中習知技術)的染劑。
治療應用
本發明之抗體能夠引發非造血性癌症細胞死亡。因此，本發明提供本發明之抗體與聚胜肽在治療與/或延遲癌症發展中的治療應用，癌症諸如大腸直腸癌、肺癌、胰臟癌、胃癌、乳癌、肝細胞癌與甲狀腺癌。可治療任何癌症，諸如結腸癌、大腸直腸癌、肺癌、乳癌、腦瘤、惡性黑色素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發性骨髓癌、胃癌、胰臟癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌、皮膚癌、尿道癌、前列腺癌、絨毛膜癌(choriocarcinoma)、咽瘤、喉癌、泡膜細胞增生症(thecomatosis)、雄性胚細胞瘤(androblastoma)、子宮內膜增生(endometrium hyperplasy)、子宮內膜異位症(endometriosis)、胚胎瘤(embryoma)、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、血管瘤、海綿狀血管瘤(cavernous hemangioma)、血管母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、星狀細胞瘤(astrocytoma)、神經纖維瘤(neurofibroma)、寡樹突膠質瘤(oligodendroglioma)、髓質母細胞瘤(medulloblastoma)、神經節神經母細胞瘤(ganglioneuroblastoma)、神經膠質瘤、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、錯構胚細胞瘤(hamartoblastoma)、骨性肉瘤(osteogenic sarcoma)、子宮肌肉瘤(leiomyosarcoma)、甲狀腺肉瘤與威爾姆氏腫瘤，以及表現本文所述之抗體辨別之表位的癌症細胞。方法可進一步包括在即將治療之個體中偵測本文所述之抗體或聚胜肽與腫瘤或癌症細胞之間結合的步驟。
通常，將包含抗體或聚胜肽之有效劑量組合物施加至需要治療之受試者，藉此抑制癌症細胞的生長與/或引發癌症細胞的死亡。較佳地以藥學可接受載體來配置該組合物。
一實施例中，組合物經配置以藉由腹膜內、靜脈內、皮下與肌肉內注射以及其他施加形式(諸如，口服、黏膜、吸入、舌下等)加以施加。
另一實施例中，本發明亦思及包含接合其他分子(諸如，可偵測標記或治療或細胞毒性劑)之本發明抗體或聚胜肽之組合物的施加。試劑可包括(但不限於)放射性同位素、毒素、類毒素、發炎劑、酵素、反義(antisense)分子、胜肽、細胞素或化學治療劑。熟悉技術人士通常習知接合抗體與上述分子之方法。參閱諸如，PCT公開案WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624；美國專利號5,314,995與EP 396,387；其之全文倚參考資料併入本文中。
一實施例中，組合物包括接合細胞毒性劑之抗體或聚胜肽。細胞毒性劑可包括任何對細胞有害的試劑。可接合至抗體或片段的較佳細胞毒性劑類型包括(但不限於)太平洋紫杉醇(paclitaxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙啶(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、文克斯汀(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道諾魯比辛(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、葡萄糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、特他卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)與嘌呤黴素(puromycin)以及上述之類似物或同系物。
治療所需劑量取決於選擇之施加路徑、配方的性質、受試者疾病的種類、受試者大小、體重、表面積、年紀與性別；施加之其他藥劑與主治醫師的判斷。適當劑量的範圍係0.01-1000.0mg/kg。
通常可應用任何下列劑量：施加至少約50mg/kg(體重)；至少約10mg/kg(體重)；至少約3mg/kg(體重)；至少約1mg/kg(體重)；至少約750μg/kg(體重)；至少約500μg/kg(體重)；至少約250μg/kg(體重)；至少約100μg/kg(體重)；至少約50μg/kg(體重)；至少約10 μg/kg(體重)；至少約1μg/kg(體重)或更少的劑量。關於數天或更長(取決於症狀)的重複施加而言，治療持續到出現所欲之疾病症狀的疾病症狀的抑制。示範性給藥方案包括施加約6mg/kg抗體的每週劑量。然而，取決於醫師想達成之藥物衰退型態，其他給藥方案係有用的。經驗考量(例如，半生期)通常有助於劑量的確定。可藉由傳統技術與試驗輕易地監測此治療的進展。
某些受試者中需要高於一劑量。可在治療過程中確定並調節施加頻率。例如，可根據即將治療之癌症類型與階段、施加之試劑係用於預防或治療目的、先前治療、患者的臨床病史與對試劑的反應以及主治醫師的判斷來確定或調節施加頻率。臨床醫師通常施加一治療抗體(例如，嵌合5F1抗體)直到達到適當劑量以達成所欲結果。某些實例中，抗體的持續連續釋出配方係適當的。技術中習知達成持續釋出的不同配方與裝置。
一實施例中，可在已經給予一或更多施加之受試者上經驗地確定抗體或聚胜肽的劑量。給受試者增加劑量的抗體或聚胜肽。爲了確定抗體或聚胜肽的功效，可監測疾病症狀的標記(諸如CD43或CEA)。亦可藉由確定腫瘤負荷或體積、疾病進展時間(TDP)與/或確定反應速率(RR)來測量活體內效率。
根據本發明方法之抗體或聚胜肽施加可為持續性或週期性，這取決於諸如接受者的生理症狀、施加目的係治療或預防、以及熟練醫師習知的其他因子。抗體或聚胜肽的施加可實質持續預定的時間週期或可為連續間隔劑量。
其他配方包括技術中習知的適當輸送形式，包括(但不限於)例如脂質體之載體。參閱例如，Mahato等人(1997)Pharm. Res. 14:853-859。脂質體製備物包括(但不限於)細胞轉染劑(cytofectin)、多層囊泡(multilamellar vesicle)與單層囊泡(unilamellar vesicle)。
另一實施例中，組合物可包括一或更多抗-癌症劑、一或更多本文所述之抗體、或可具有結合不同抗原之抗體或聚胜肽。上述組合物可包含至少一、至少二、至少三、至少四、至少五個不同抗體。抗體與其他抗-癌症劑可位於相同配方(例如混合物，如同技術中通常之表示)、或位於不同配方(但同時或接續地施加)，而特別有用於治療較廣範圍的個體族群。
編碼本發明之任何抗體或聚胜肽的聚核苷酸亦可用來將本發明之任何抗體或聚胜肽輸送並表現於所欲之細胞中。顯而易見的是表現載體可用來直接表現抗體或聚胜肽。可藉由任何技術中習知手段來施加表現載體，諸如腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、脊髓膜內、心室內、口服、腸胃內(enterally)、非腸胃內、鼻內、真皮、舌下或藉由吸入。例如，表現載體的施加包括局部或全身性施加，包括注射、口服、微粒鎗或導管施加與局部施加。熟悉技術人士熟悉表現載體的施加以取得活體內外源性蛋白的表現。參閱諸如美國專利號6,436,908、6,413,942與6,376,471。
亦可應用包括編碼本發明任何抗體或聚胜肽之聚核苷酸的治療組合物之針對性輸送。受體-介導之DNA輸送技術係描述於諸如，Findeis等人Trends Biotechnol .(1993)11:202；Chiou等人Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff,ed.)(1994)；Wu等人J. Biol. Chem .(1988)263:621；Wu等人J. Biol. Chem.(1994)269:542；Zenke等人(1990),Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,87:3655；Wu等人(1991),J. Biol. Chem . 266:338。以約100ng至約200mg範圍之DNA施加包含聚核苷酸之治療組合物以用於基因治療方案中的局部施加。基因治療方案過程中亦可應用約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg與約20μg至約100μg的DNA濃度範圍。
可利用基因輸送載具輸送本發明之治療聚核苷酸與聚胜肽。基因輸送載具可係病毒或非-病毒來源(通常參閱Jolly(1994)，Cancer Gene Therapy 1:51;Kimura(1994),Human Gene Therapy 5:845;Connelly(1985),Human Gene Therapy 1:185;與Kaplitt(1994),Nature Genetics 6:148)。可利用內源性哺乳動物或異源姓啟動子來引發上述編碼序列的表現。編碼序列的表現可為持續型或調節型任一者。
技術中習知用來輸送所欲之聚核苷酸並在所欲之細胞中表現的病毒式載體。示範性病毒式載體包括(但不限於)重組反轉錄病毒，諸如PCT公開案WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO 93/25234、WO 93/11230、WO 93/10218、WO 91/02805、美國專利號5,219,740、4,777,127、GB專利號2,200,651與EP專利號0345242;α病毒-式載體，諸如辛德畢斯(Sindbis)病毒載體、聖利基(Semliki)森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、羅斯河(Ross River)病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)與委內瑞拉(Venezuelan)馬腦炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR 1249、ATCC VR-532));與腺相關病毒(AAV)載體，諸如PCT公開案WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984與WO 95/00655。亦可應用Curiel(1992),Hum .Gene Ther . 3:147所述施加連接之DNA以殺死腺病毒。
亦可應用非-病毒輸送載具與方法，包括(但不限於)與單獨殺死腺病毒有關或無關的多陽離子濃縮DNA(參閱例如，Curiel(1992),Hum. Gene Ther. 3:147)；配體-連接DNA(參閱例如，Wu(1989),J. Biol. Chem. 264:16985)；真核生物細胞輸送載具細胞(參閱諸如，美國專利號5,814,482、PCT公開案WO 95/07994、WO 96/17072、WO 95/30763與WO 97/42338)與核電荷中和作用或與細胞膜融合。
亦可應用裸露DNA。示範性裸露DNA導入方法係描述於PCT公開案WO 90/11092與美國專利號5,580,859。可作為基因輸送載具之脂質體描述於美國專利號5,422,120、PCT公開案WO 95/13796、WO 94/23697、WO 91/14445、與EP專利號0 524 968。額外方法描述於Philip(1994),Mol. Cell Biol. 14:2411與Woffendin(1994),PNAS 91:1581。
此外，本發明提供治療個體中癌症的方法，其包括a)對個體施加有效劑量包含本發明之抗體的組合物，與b)對個體施加第二癌症療法。某些實施例中，第二療法包括手術、輻射、荷爾蒙療法、基因療法、其他抗體療法與化學療法。可同時(例如，同步施加)與/或接續地(例如，依序施加)包含抗體之組合物與第二療法。例如，包含抗體之組合物與第二療法施加之時間間隔不超過約15分鐘，諸如不超過約10、5或1分鐘任一者。或者，包含抗體之組合物與第二療法施加之時間間隔超過約15分鐘，諸如超過20、30、40、50或60分鐘、1天、2天、3天、1週、2週或1月或更久任一者。
可接連或同時施加包括本發明之抗體的組合物與一或更多其他治療劑，諸如化學治療劑(諸如，5-FU、5-FU/MTX、5-FU/溜口佛林(5-FU/Leucovorin)、左美索(Levamisole)、愛萊諾迪肯(Irinotecan)、草酸鉑(草酸鉑)、卡培他濱(Capecitabin)或尿嘧啶/替尬氟(Uracil/Tegafur))、免疫佐劑、生長抑制劑、細胞毒性劑與細胞素等。抗體與治療劑的數量取決於應用藥物之類型、治療之病理症狀與施加排程與路徑，但通常小於若各個單獨應用的量。
施加包含本文所述之抗體的組合物之後，可藉由熟悉技術人士所習知的不同方法評估組合物在試管內與活體內的效力。習知多種用來試驗候選組合物之抗-癌症活性的動物模式。這些包括異位移植人類腫瘤之去胸腺裸鼠或scid/scid小鼠、或遺傳鼠科腫瘤模式(例如，p53剔除小鼠)。這些動物模式的活體內特性使其可特別預測人類患者中的反應。可利用標準技術將細胞導入同系(syngeneic)小鼠來產生上述模式動物，諸如皮下注射、尾巴靜脈注射、脾臟移植、腹膜內灌注與腎被囊下的灌注等。
套組
本發明亦提供本方法中所用之套組。本發明之套組包括一或更多容器，其包括本文所述之純化抗體或聚胜肽以及根據本文所述之任何本發明方法所用之用法說明。某些實施例中，這些用法說明包括根據本文所述之任何方法施加抗體以治療與/或延遲非造血性癌症(例如，大腸直腸癌)發展的描述。套組可進一步包括選擇適合治療之個體的描述，選擇係根據辨別個體是否具有疾病與疾病階段、或表位是否表現於個體中之癌症細胞上。
某些實施例中，偵測樣本中之癌症細胞的套組包括本文所述之抗體或聚胜肽以及偵測樣本中抗體或聚胜肽結合細胞之試劑。
關於使用抗體或聚胜肽以治療或延遲癌症發展之用法說明通常包括預期治療的劑量、給藥方案與施加路徑等資訊。容器可為單劑量、巨大包裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中提供的用法說明通常係書寫在標籤或包裝插入物(例如，套組內包含之紙片)的用法說明，但亦可接受機器辨認之用法說明(例如，磁性或光學儲存盤攜帶之用法說明)。
標籤或包裝嵌入物指出該組合物係用來治療本文所述之癌症。可提供用法說明來執行本文所述之任何方法。
本發明之套組係位於適當包裝內。適當包裝包括(但不限於)藥水瓶、瓶子、罐、撓性包裝(諸如，密封Mylar或塑膠袋)等。亦包括搭配特定裝置應用之包裝，特定裝置諸如吸入器、鼻部施加裝置(例如，噴霧器)或灌注裝置(例如，微型泵)。套組可具有無菌存取埠(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿之塞子的藥水瓶)。容器亦可具有無菌存取埠(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿之塞子的藥水瓶)。組合物中至少一活性試劑係本文所述之抗體。容器可進一步包括第二藥學活性試劑。
套組可選擇性提供額外成分，諸如緩衝液與說明資訊。通常套組包括容器以及在容器上或與其相連之標籤或包裝嵌入物。
實施例
提供下方實施例用於描述而非用來限制本發明。
實 施例1：5F1之輕鏈與重鏈變異區的選殖
如2006年7月7日申請之美國專利申請案11/811,303(美國專利公開案2008/0171043)所示，藉由PCR擴增5F1輕鏈與重鏈變異區之變異區cDNA，並將合成之cDNA次選殖入pCRII(Invitrogen)以便確定序列。自許多單獨殖株取得核苷酸序列並分析之。選擇來自單獨殖株的相同cDNA序列代表各個抗體的輕鏈或重鏈V區。下表2顯示編碼鼠科5F1(m5F1)與人類化5F1Vc(h5F1Vc)之輕鏈與重鏈V區的核苷酸序列與轉譯之胺基酸序列。
實施例2.嵌合5F1變體的修飾形式
小鼠5F1抗體的同型係鼠科IgG3。爲了排除人類抗-小鼠抗體(HAMA)反應問題並在人類中具有更有效的Fc-依賴型反應，藉由結合鼠科5F1抗體之變異(V)區與人類IgG1之恆定區來產生5F1嵌合形(c5F1)抗體(c5F1-v0；重鏈：序列編號1(VH)、編號9(CH)；輕鏈：序列編號2(VL)、編號10(CL)，參閱表2與第2圖)。亦比對人類IgG1與鼠科IgG3之重鏈恆定區(包括CH1、樞紐、CH2與CH3區域)的胺基酸序列。由序列比對可得知，CH1-樞紐區域顯示出鼠科IgG3與人類IgG1間最大的差異(第1圖)。本文用於序列比對之「*」意指行中殘基在列中的所有序列內係相同的，「：」意指發現保留性取代，而「.」意指發現半保留性取代。爲了讓c5F1與鼠科5F1具有等效的細胞凋亡-引發能力，產生許多c5F1重鏈之CH1與/或樞紐區域中的修飾(表3；表3中的殘基編號係根據Burton,Mol. Immunol. 22:161-206,1985所述之EU編號系統)並產生許多C5F1輕鏈中的修飾(表4)。某些實例中，將修飾之重鏈與c-端修飾輕鏈共同表現(表5)。亦參閱第2圖的重鏈與輕鏈胺基酸序列。
實施例3.在嵌合5F1抗體之重鏈與輕鏈恆定區中導入改變
爲了促進抗體產生與純化，利用包含人類IgG1重鏈與κ輕鏈之恆定區的pcDNA5-FRT-hIgG1(由AbGenomics生產)來表現嵌合5F1(c5F1)。分別藉由PCR利用m5F1HC-xbaI f/m5F1HC-xbaI r與m5F1LC-xbaI f/m5F1LC-xbaI r(表6，引子A3/A7與A8/A9)來分別擴增m5F1重鏈與輕鏈基因之變異區。藉由XbaI剪切PCR產物並接著插入pcDNA5-FRT-hIgG1。包含c5F1之重鏈基因與輕鏈基因兩者的完整組合c5F1表現載體c5F1/pcDNA5-FRT-hIgG1係用來表現未-修飾c5F1抗體。相同質體亦當作模板以便導入c5F1修飾。
依照製造商用法說明利用QuikChange Multi Site Directed Mutageneis Kit(Stratagene,Cat#200531-5)用PCR-式定點突變與將突變導入c5F1/pcDNA5-FRT-hIgG1基因之引子(表6)來產生具有刪除之構築體(v15)或S取代殘基220(Eu編號)之構築體(v16)。寡核苷酸M1(5’-CAGAGCCCAAATCTGACAAAACTCACAC-3’(序列編號：47))係用來刪除殘基220的Cys(v15)，而寡核苷酸M2(5’-CAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACAC-3’(序列編號：48))係用來在殘基220處產生Ser取代(v16)。爲了排除定點突變過程中PCR導入隨機突變的可能性，以AgeI(CH1區中)與XmaI(CH3區中)切割包含修飾之DNA片段，並重新殖入原本c5F1/pcDNA5-FRT-hIgG1以取代原本未修飾區。
或者，部分重疊PCR亦用來產生所有剩餘的修飾(表3-6)。簡短的說，兩個PCR反應用來產生兩個包含所欲突變的DNA產物片段，且其共有至少20個核苷酸的部分重疊序列。接著混合兩個PCR產物、變性並讓其重新黏合。接著利用另一具有兩個較外側引子之PCR反應(與先前兩個PCR相比)來擴增組裝的全長DNA片段。例如關於v1，引子對A4/M23與M24/A3(表6)係藉由PCR用來產生第一次兩個片段。接著混合兩個PCR片段、重新黏合並利用較外側引子(A3與A4)來產生全長PCR產物。最後，將包含修飾之DNA片段重新殖入原本c5F1/pcDNA5-FRT-hIgG1中。透過XbaI(重鏈V區的開端中)與AgeI(CH1區中)位置將包含CH1修飾之片段重新殖入。透過AgeI(CH1區中)與XmaI(CH3區中)位置將包含樞紐修飾之片段重新殖入。爲了產生輕鏈的c-端修飾，透過AvrII(輕鏈V區的末端中)與BamHI(輕鏈編碼序列下游中)位置選殖PCR產物來取代原本未修飾之序列。
接著藉由Lipofetamine 2000(Invitrogen，目錄編號11668-019)將帶有或不帶有修飾之質體轉染入Flp-In-CHO細胞(Invitrogen，目錄編號R758-07)。收集含有未修飾或修飾之c5F1抗體的培養基，並藉由A蛋白純化抗體。在COLO205細胞中試驗純化抗體的結合與細胞凋亡-引發活性。
結合試驗
將0.125-4ug/ml濃度範圍的純化m5F1、c5F1-v0、c5F1-v15與c5F1-v16抗體加入1.5x105 COLO 205細胞並在4℃下培養30分鐘，以包含2% FBS與0.05% NaN3 之PBS清洗兩次，接著在4℃下以1μg/ml的對應二級抗體(R-PE-接合之山羊F(ab')2抗-小鼠IgG(H+L)，Southern Biotech，目錄編號1032-09；或R-PE-接合之山羊抗-人類IgG，Southern Biotech，目錄編號2040-09)培養30分鐘。染色結束時，以包含2% FBS與0.05% NaN3 之PBS清洗樣本兩次並藉由流式細胞儀分析。利用Cell Quest軟體在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上執行所有的流式細胞分析。
細胞凋亡試驗
將1.5x105 的COLO 205細胞植入96-孔盤的孔中。在培養基中新鮮配置2-32ug/ml濃度範圍之純化m5F1、c5F1-v0、c5F1-v15、c5F1-v16與對照抗體的等量樣本並加入各個孔中。以m9E10與h16C11A處理之樣本係作為同型對照。在FACS分析細胞凋亡之前將處理之細胞保持在37℃培養器下6小時。針對細胞的細胞凋亡試驗，依照製造商用法說明利用Annexin-V-FITC Apotosis Detection Kit(Strong Biotech，目錄編號AVK250)來測量Annexin V染色。簡短的說，收集處理之細胞並重新懸浮於室溫下Annexin V結合緩衝液(含有Annexin V-FITC)中。在黑暗中培養15分鐘後，以200μl的Annexin V結合緩衝液清洗細胞兩次。在FACS分析之前，加入0.25μg/ml的碘化丙錠(PI)。利用Cell Quest軟體在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上執行所有的流式細胞分析。Annexin VI陽性與/或PI陽性細胞視為細胞凋亡細胞。
表6：用於在c5F1基因中導入突變的引子
結果
來自流式細胞分析之不同5F1抗體的結合與細胞凋亡-引發作用係顯示於第3圖與下表7中。c5F1-v0、c5F1-v15與c5F1-v16正好如同其小鼠對應物m5F1一樣結合COLO 205細胞並在COLO 205細胞中引發細胞凋亡。與c5F1相比，c5F1-v15與c5F1-v16較少結合COLO205細胞。關於細胞凋亡誘導，c5F1-v0處理之細胞中發現的作用不如m5F1有效。然而在應用樞紐修飾形式(c5F1-v15與c5F1-v16)時，可恢復細胞凋亡-引發活性。c5F1-v15與c5F1-v16兩者在COLO205細胞中引發細胞凋亡幾乎與m5F1一樣有效，除了c5F1-v15與c5F1-v16對COLO 205細胞的結合活性似乎低於c5F1-v0。32ug/ml下的同型對照抗體9E10(小鼠Ig對照)與h16C11A(人類Ig對照)並沒有在COLO 205細胞中引發細胞凋亡。
實施例4.5F1抗體的人類化
亦開發5F1的人類化形式(第4圖)且併入具有恆定區修飾之表現質體中(參閱實施例2與3)。
互補決定區(CDR)嫁接係用來產生人類化5F1(h5F1M)的變異區，其中藉由重組DNA技術將小鼠5F1變異區之CDR併入人類IgG1變異區(接受抗體)的架構區中。爲了確定最適合鼠科5F1的接受抗體，與AbGenomics產生之免疫球蛋白資料庫一起分析鼠科5F1變異區之序列。鼠科抗體M195(Man Sung Co等人J. Immunol. 148(4):1149-1154(1992年2月15日))顯示最適合鼠科5F1。因此選擇人類抗體Eu(Man Sung Co等人J. Immunol. 148(4):1149-1154(1992年2月15日))作為接受抗體。設計並合成核苷酸序列以產生具有三個鼠科5F1之CDR區併入抗體Eu變異區之架構區中的人類化5F1形式。
爲了建造h5F1M之各個V基因，合成四對55-70鹼基長度的寡核苷酸(連續共有至少18個核苷酸的部分重疊區)(表8。重鏈：H1-H8，輕鏈：L1-L8)。在四個步驟中執行整個V基因的組裝與擴增：1)黏合四對互補寡核苷酸(重鏈：H1/H2、H3/H4、H5/H6與H7/H8；輕鏈：L1/L2、L3/L4、L5/L6與L7/L8)並在不同反應中以Klenow片段填滿3’缺口區以產生四個雙股DNA(dsDNA)片段；2)將得到之四個dsDNA片段成對混合、變性、重新黏合、並在兩個不同反應中填補3’缺口好產生兩個dsDNA片段；3)將得到之兩個dsDNA片段混合、變性、重新黏合、並填補3’缺口好產生全長dsDNA；及4)接著利用具有兩個較外側引子(重鏈：A10與A11，輕鏈：A12與A13(表8)，其包含XbaI位置)之PCR反應來擴增組合之VL與VH片段。
接著分別透過重鏈與輕鏈的NheI位置與AvrII位置將含XbaI的VH與VL片段插入pcDNA5-FRT-hIgG1載體。包含h5F1M之重鏈與輕鏈基因兩者的完全組合h5F1M表現質體h5F1M/pcDNA5-FRT-hIgG1係用來表現未-修飾之h5F1M抗體。相同質體亦當作模板以便導入h5F1M修飾(第4圖)。
h5F1-M的修飾
利用表8與9中所列之引子以部分重疊的PCR與PCR-式定點突變來修飾h5F1-M之變異區(第4圖)。如實施例2-3所示，將未修飾或修飾之h5F1變異區併入人類IgG恆定區(未修飾或修飾)。接著將表現質體轉染入CHO細胞。收集懸浮液並藉由A蛋白純化抗體。在COLO205細胞中試驗純化抗體的結合與細胞凋亡-引發功能。
實施例5.嵌合5F1變體的特性描述
抗體對Colo205細胞的結合
將1ug/ml的純化m5F1、c5F1-v0、c5F1-v17、c5F1-v24與c5F1-v25抗體加入2x105 COLO 205細胞並在4℃下培養30分鐘，以包含1% FBS之PBS清洗兩次，接著在4℃下以1μg/ml的對應二級抗體(R-PE-接合之山羊F(ab')2抗-小鼠IgG(H+L)，Southern Biotech，目錄編號1032-09；或R-PE-接合之山羊抗-人類IgG，Southern Biotech，目錄編號2040-09)培養30分鐘。染色結束時，以包含1% FBS與0.05% NaN3 之PBS清洗樣本兩次並藉由流式細胞儀分析。利用Cell Quest軟體在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上執行所有的流式細胞分析。表10中的資料指出所有試驗之5F1抗體形式可結合Colo205細胞。
細胞凋亡試驗
將1.5x105 的COLO 205細胞植入96-孔盤的孔中。在培養基中新鮮配置8-32ug/ml濃度範圍之純化m5F1、c5F1、c5F1-v17、c5F1-v24、c5F1-v25與對照抗體的等量樣本並加入各個孔中。在FACS分析細胞凋亡之前將處理之細胞保持在37℃培養器下6小時。針對細胞的細胞凋亡試驗，依照製造商之用法說明利用Annexin-V-FITC Apotosis Detection Kit(Strong Biotech，目錄編號AVK250)來測量Annexin V染色。簡短的說，收集處理之細胞並重新懸浮於室溫下Annexin V結合緩衝液(含有Annexin V-FITC)中。在黑暗中培養15分鐘後，以200μl的Annexin V結合緩衝液清洗細胞兩次。在FACS分析之前，加入0.25μg/ml的碘化丙錠(PI)。利用Cell Quest軟體在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上執行所有的流式細胞分析。Annexin VI陽性與/或PI陽性細胞視為細胞凋亡細胞。表11中之資料顯示所有試驗之5F1抗體形式可在Colo205細胞中引發細胞凋亡。
(b)實驗2
異種移植研究
在第0天將5 x106 Colo205細胞皮下植入6-7週大SCID小鼠的後腹區。在腫瘤-細胞接踵後第0天開始腹膜內注射30mg/kg抗體的治療，並在第4、7、11、14與18天重複。在各個實驗組中應用六隻小鼠。根據兩週藉由卡尺測量腫瘤體積(mm3 )來評估腫瘤生長，而腫瘤大小係利用下式加以計算：π/6×較大直徑×(較小直徑)2 (Kievit E,Cancer Research,60:6649-55)。在第21天犧牲小鼠並單離腫瘤且測量重量。表12中顯示之結果指出所有試驗之抗體的抗-腫瘤效應與PBS處理之比較。
5F1抗體搭配草酸鉑引發Colo205細胞之細胞凋亡的協同效應
將1.4x105 的Colo205細胞植入96-孔盤的孔中。新鮮配置重新組成於5%葡萄糖溶液中之草酸鉑等量樣本並以1與10ug/ml的最終濃度加入各個孔中，可單獨加入或搭配10與30ug/ml最終濃度之純化c5F1-v17、c5F1-v24、c5F1-v25與對照抗體的等量樣本。在FACS分析細胞凋亡之前將處理之細胞保持在37℃培養器24小時。針對細胞的細胞凋亡試驗，依照製造商之用法說明利用Annexin-V-FITC Apotosis Detection Kit(Strong Biotech，目錄編號AVK250)來測量Annexin V染色。簡短的說，收集處理之細胞並重新懸浮於室溫下Annexin V結合緩衝液(含有Annexin V-FITC)中。在黑暗中培養15分鐘後，以200μl的Annexin V結合緩衝液清洗細胞兩次。在FACS分析之前，加入0.5μl的碘化丙錠(PI)。利用Cell Quest軟體在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上執行所有的流式細胞分析。Annexin VI陽性與/或PI陽性細胞視為細胞凋亡細胞。表13中之資料顯示所有試驗之5F1抗體搭配草酸鉑在Colo205癌症細胞中引發細胞凋亡的協同效應。
m5F1抗體對SU86.86胰臟癌症細胞的結合與細胞凋亡誘發
將1ug/ml的純化m5F1與對照抗體加入2x105 SU.86.86細胞並在4℃下培養1小時，以包含1% FBS之PBS清洗兩次，接著在4℃下以1μg/ml的對應二級抗體(R-PE-接合之山羊F(ab')2抗-小鼠IgG(H+L)，Southern Biotech，目錄編號1032-09)培養1小時。染色結束時，以包含1% FBS之PBS清洗樣本兩次並藉由流式細胞儀分析。利用Cell Quest軟體在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上執行所有的流式細胞分析。
將2x105 的SU86.86細胞植入12-孔盤的孔中。在培養基中新鮮配置2-32ug/ml濃度範圍之純化m5F1的等量樣本並加入各個孔中。包括32ug/ml的對照抗體用於背景信號測量。在FACS分析細胞凋亡之前將處理之細胞保持在37℃培養器下6小時。針對細胞的細胞凋亡試驗，依照製造商之用法說明利用Annexin-V-FITC Apotosis Detection Kit(Strong Biotech，目錄編號AVK250)來測量Annexin V染色。簡短的說，收集處理之細胞並重新懸浮於室溫下Annexin V結合緩衝液(含有Annexin V-FITC)中。在黑暗中培養15分鐘後，以200μl的Annexin V結合緩衝液清洗細胞兩次。在FACS分析之前，加入0.25μg/ml的碘化丙錠(PI)。利用Cell Quest軟體在BD-LSR流式細胞儀(Becton Dickinson)上執行所有的流式細胞分析。Annexin VI陽性與/或PI陽性細胞視為細胞凋亡細胞。
表14與15中之資料顯示m5F1可結合胰臟癌症細胞株SU.86/86，且m5F1的結合引發SU.86.86細胞中的細胞凋亡。
對抗體c5F1.v15、c5F1.v16與c5F1.v24執行結合實驗。這些抗體顯示對SU.86.86細胞的明顯結合。對抗體c5F1.v15執行細胞凋亡試驗。資料指出8ug/ml與32ug/ml的此抗體僅可在交聯劑小鼠抗-人類IgG(專一於Fcγ片段)存在下引發SU.86.86細胞的細胞凋亡(Jackson ImmunoResearch 209-005-098)。
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第1圖顯示鼠科IgG3重鏈恆定區(序列編號：138)與人類IgG1重鏈恆定區(序列編號：139)之間的胺基酸序列比較與排列。底線係樞紐區域。如圖所示，胺基酸相同性係214/333(64.3%)、相似性係261/333(78.4%)而空隙係6/333(1.8%)。
第2(A-E)圖顯示未修飾與修飾之重鏈人類IgG1恆定區之間的胺基酸序列比較與排列，而第2F圖顯示未修飾與修飾之輕鏈人類IgG1κ恆定區之間的胺基酸序列比較與排列。
第3圖顯示m5F1、c5F1v0、c5F1v15與c5F1v16抗體對Colo 205的結合，其來自0.125μg/ml-4μg/ml不同濃度範圍的流式細胞分析。對照抗體的背景信號(MFI)：抗-小鼠二級抗體：3；抗-人類二級抗體：3；小鼠IgG：4；人類IgG：5。所有抗體m5F1、c5F1v0、c5F1v15與c5F1v16皆顯示對Colo205細胞超出背景信號的明顯結合。
第4(A與B)圖顯示h5F1M、h5F1A Va、h5F1A Vs、h5F1M Va與h5F1M Vs之VH(a)與VL(b)之間的胺基酸序列比較與排列。
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Claims (39)

  1. 一種單離的抗體，該單離的抗體包括一重鏈與一輕鏈，其中(a)該重鏈包括一重鏈變異區與一重鏈恆定區，該重鏈變異區包括三個來自序列編號：1之胺基酸序列的互補決定區(CDR)而該重鏈恆定區包括序列編號：9之胺基酸序列，其中該重鏈恆定區之樞紐區域包括至少一胺基酸插入、刪除或取代；及(b)該輕鏈包括一輕鏈變異區與一輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括三個來自序列編號：2之胺基酸序列的互補決定區而該輕鏈恆定區包括序列編號：10之胺基酸序列，或者該輕鏈恆定區包括序列編號：10之胺基酸序列且進一步包括至少一胺基酸插入於該恆定區上；其中該抗體專一性結合一非造血性癌症細胞表現之CD43或一癌胚抗原(CEA)上之一表位。
  2. 如專利申請範圍第1項所述之抗體，其中該重鏈恆定區包括選自序列編號：11至30所構成之群組的胺基酸序列，而該輕鏈恆定區包括選自序列編號：10與31至37所構成之群組的胺基酸序列。
  3. 如專利申請範圍第1項所述之抗體，其中該抗體係一人類化抗體。
  4. 如專利申請範圍第1項所述之抗體，其中該抗體係一嵌合抗體。
  5. 如專利申請範圍第1項所述之抗體，其中該重鏈恆定區包括序列編號：27的胺基酸序列。
  6. 如專利申請範圍第5項所述之抗體，其中該輕鏈恆定區包括序列編號：10的胺基酸序列。
  7. 如專利申請範圍第6項所述之抗體，其中該重鏈變異區包括序列編號：1之殘基20-137的胺基酸序列而該重鏈恆定區包括序列編號：27的胺基酸序列，且該輕鏈變異區包括序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列而該輕鏈恆定區包括序列編號：10的胺基酸序列。
  8. 如專利申請範圍第1項所述之抗體，其中該重鏈恆定區包括序列編號：29的胺基酸序列。
  9. 如專利申請範圍第8項所述之抗體，其中該輕鏈恆定區包括序列編號：34的胺基酸序列。
  10. 如專利申請範圍第9項所述之抗體，其中該重鏈變異區包括序列編號：1之殘基20-137的胺基酸序列而該重 鏈恆定區包括序列編號：29的胺基酸序列，且該輕鏈變異區包括序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列而該輕鏈恆定區包括序列編號：34的胺基酸序列。
  11. 如專利申請範圍第8項所述之抗體，其中該輕鏈恆定區包括序列編號：35的胺基酸序列。
  12. 如專利申請範圍第11項所述之抗體，其中該重鏈變異區包括序列編號：1之殘基20-137的胺基酸序列而該重鏈恆定區包括序列編號：29的胺基酸序列，且該輕鏈變異區包括序列編號：2之殘基20-131的胺基酸序列而該輕鏈恆定區包括序列編號：35的胺基酸序列。
  13. 如專利申請範圍第1至12項任何一項所述之抗體，其中該非造血性癌症細胞選自大腸直腸癌細胞、胰臟癌細胞或胃癌細胞所構成之群組。
  14. 如專利申請範圍第1至12項任何一項所述之抗體，其中該抗體係接合至一細胞毒性劑。
  15. 如專利申請範圍第14項所述之抗體，其中該細胞毒性劑係一放射性同位素或一毒素。
  16. 一種聚核苷酸，該聚核苷酸包括一核酸序列，該核酸 序列編碼申請專利範圍第1-15項任何一項所述之抗體的該重鏈與/或該輕鏈。
  17. 一種載體，該載體包括一核酸序列，該核酸序列編碼申請專利範圍第1-15項任何一項所述之抗體的該重鏈與/或該輕鏈。
  18. 一種宿主細胞，該宿主細胞包括申請專利範圍第17項所述之載體。
  19. 一種產生一抗體的方法，該方法至少包括培養申請專利範圍第18項所述之宿主細胞，該宿主細胞產生該核酸所編碼之抗體，並自該細胞培養基重新取得該抗體。
  20. 一種產生一抗體的方法，該方法至少包括在一宿主細胞中表現：(a)一聚核苷酸，該聚核苷酸包括一編碼一重鏈的核酸序列，該重鏈包括一重鏈變異區與一重鏈恆定區，該重鏈變異區包括三個來自序列編號：1之胺基酸序列的CDR而該重鏈恆定區包括選自序列編號：11-30所構成之群組的胺基酸序列；及(b)一聚核苷酸，該聚核苷酸包括一編碼一輕鏈的核酸序列，該輕鏈包括一輕鏈變異區與一輕鏈恆定區，該輕鏈變異區包括三個來自序列編號：2之胺基酸序列的CDR 而該輕鏈恆定區包括選自序列編號：10與31-37所構成之群組的胺基酸序列，其中該些編碼重鏈與輕鏈之聚核苷酸係共同表現於該宿主細胞中；其中該抗體專一性結合一非造血性癌症細胞表現之CD43或一癌胚抗原(CEA)上之一表位。
  21. 如申請專利範圍第19或20項所述之方法，其中該抗體係自該細胞培養基單離。
  22. 一種由申請專利範圍第19至21項任何一項所述之方法產生的抗體。
  23. 如專利申請範圍第22項所述之抗體，其中該非造血性癌症細胞選自大腸直腸癌細胞、胰臟癌細胞或胃癌細胞所構成之群組。
  24. 一種藥學組合物，該藥學組合物包括申請專利範圍第1-15、22與23項任何一項所述之抗體以及一藥學可接受載體。
  25. 一種套組，該套組包括一藥學組合物，該藥學組合物包括申請專利範圍第1-15、22與23項任何一項所述之抗體以及一藥學可接受載體。
  26. 如專利申請範圍第25項所述之套組，其中該套組更包括用法說明，該用法說明係關於對一個體施加一有效劑量的藥學組合物以治療非造血性癌症。
  27. 如申請專利範圍第25項所述之套組，其中該套組進一步包括對一個體一起施加該藥學組合物與另一抗-癌症劑以治療非造血性癌症的用法說明。
  28. 如申請專利範圍第25項所述之套組，其中該非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。
  29. 一種套組，該套組包括一第一藥學組合物與一第二藥學組合物，該第一藥學組合物包括申請專利範圍第1-15、22與23項任何一項所述之抗體以及一藥學可接受載體，而該第二藥學組合物包括另一抗-癌症劑。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之套組，其中該套組進一步包括對一個體一起施加該第一藥學組合物與該第二藥學組合物以治療非造血性癌症的用法說明。
  31. 如申請專利範圍第29項所述之套組，其中該非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。
  32. 組合物用以製造一藥品的一種應用，該藥品用以在一 個體中治療非造血性癌症，其中該組合物包括申請專利範圍第1-15項任何一項所述之抗體。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之應用，其中該非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。
  34. 申請專利範圍第1-15、22與23項任何一項所述之抗體與另一抗-癌症劑用以製造一藥品的一種應用，該藥品用以在一個體中治療非造血性癌症，藉此該抗體與該抗-癌症劑一起提供該個體中癌症的有效治療。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之應用，其中該抗-癌症劑係一化學治療劑。
  36. 如申請專利範圍第34項所述之應用，其中該非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。
  37. 組合物用以製造一藥品的一種應用，該藥品用以在一個體中治療非造血性癌症，其中該組合物包括申請專利範圍第1-15項任何一項所述之抗體，其中對該個體一起施加該抗體與另一抗-癌症劑，藉此該抗體與該抗-癌症劑一起提供該個體中癌症的有效治療。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之應用，其中該抗-癌症 劑係一化學治療劑。
  39. 如申請專利範圍第37項所述之應用，其中該非造血性癌症係大腸直腸癌、胰臟癌或胃癌。
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