CN114437221B

CN114437221B - 一种癌症检测抗体及其用途

Info

Publication number: CN114437221B
Application number: CN202011226776.7A
Authority: CN
Inventors: 黄思佳; 李江美
Original assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: CN114437221A

Abstract

本申请提供一种癌症检测抗体或其抗原结合片段。还提供编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子，以及用于表达该抗体或其抗原结合片段的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供包含该抗体或其抗原结合片段的检测试剂盒，以及本申请抗体或其抗原结合片段、或检测试剂盒在癌症细胞/组织的体外检测中的用途。

Description

一种癌症检测抗体及其用途

技术领域

本申请涉及一种与人Claudin 18.2特异结合的抗体，其可以用于Claudin 18.2阳性细胞或组织的体外检测。

背景技术

Claudin是一类建立细胞旁屏障并控制细胞间分子流动的细胞表面蛋白家族((Singh et al.，(2010)J Oncol 2010：541957)，是紧密结合的必需成分，在保持上皮细胞极性、控制细胞旁扩散、以及调控细胞生长分化方面起到重要作用。现今在哺乳动物中已发现24个claudin成员，不同的成员在不同组织中表达，且其改变的功能与癌症形成相关联(Swisshelm et al.，(2005)Adv Drug Deliv Rev 57(6)：919-928)。

Claudin 18，又称CLD18，是四次跨膜蛋白，具有四个跨膜疏水区和两个胞外区。其以两种不同剪接变体存在，分别为Claudin 18.1和Claudin 18.2，两者仅在N端的第一跨膜区和第一胞外区处存在差异，而C端的蛋白质一级序列完全相同(见图1)。

Claudin 18.1选择性地在正常肺中表达，而Claudin 18.2在正常组织中的表达仅限于胃，具体为胃上皮的分化短寿细胞(Sahin et al.，(2008)Clin Cancer Res 14(23)：7624-7634)。此外，Claudin 18.2在大比例的原发胃癌及其转移癌中大量存在，并在其恶变中发挥重要作用。例如，在胰腺、食道、卵巢和肺肿瘤中发现有Claudin 18.2的频繁异位激活，还在胃癌、支气管癌、乳腺癌以及耳鼻喉癌中观察到Claudin 18.2表达(Niimi et al.，(2001)Mol Cell Biol 21(21)：7380-7390；Tanaka et al.(2011)J Histochem Cytochem59(10)：942-952；Micke et al.，(2014)Int J Cancer 135(9)：2206-2214；Shimobaba etal.(2016)Biochim Biophys Acta 1863(6 Pt A)：1170-1178；Singh et al.，(2017)JHematol Oncol 10(1)：105；Tokumitsu et al.，(2017)Cytopathology 28(2)：116-121)。临床上已开发出与Claudin 18.2特异结合的抗体来用于癌症的治疗。例如，Claudiximab(IMAB362)，一种由Ganymed开发的Claudin 18.2嵌合IgG1抗体，在治疗胃食道癌晚期的I期和II期临床试验中表现出鼓舞人心的效力(Sahin et al.，(2018)Eur J Cancer100：17-26)。

在治疗前，需要进行Claudin 18.2阳性患者的临床确诊。尽管好的Claudin 18.2治疗抗体不断被开发出来，Claudin 18.2体外检测抗体的开发却屡屡受挫。当Claudin18.1和Claudin 18.2在细胞上处于跨膜状态时，N端第一跨膜区和第一胞外区存在的少量氨基酸差异可能引起第一胞外区空间构象的不同，加上第一胞外区还可能与第二胞外区相互作用形成更复杂的结构，靶向胞外区的治疗抗体可以借助于此而在一定程度上区分Claudin 18.1和Claudin 18.2。而在进行体外检测时，疑似病理组织通常先进行石蜡切片或冷冻切片，后进行Claudin 18.2的免疫组化染色。切片过程、石蜡处理(包括石蜡包埋和脱石蜡)、切片脱水等步骤会不同程度地破坏Claudin 18.2的3D结构、甚至序列的完整性，使得切片上Claudin 18.1和Claudin 18.2的差异进一步缩小至数个氨基酸，从而让Claudin 18.1和Claudin 18.2的体外区分变得异常困难。

Claudin 18.2阳性的体外诊断是Claudin 18.2相关癌症确诊以及后续治疗的必经步骤，是Claudin 18.2治疗中必须要突破的关口。Ganymed筛选了出两种靶向Claudin18C端的抗体(WO2013/167259)，43-14A和35-22A，发现其能够较好地体外区分Claudin18.1和Claudin 18.2。

对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。

发明内容

本申请的发明人意外发现了一种能特异结合人Claudin 18.2，特别是组织切片中的人Claudin 18.2，而不与人Claudin 18.1结合的抗体。相比于Ganymed的43-14A，本申请抗体对人Claudin 18.2，特别是组织切片中的人Claudin 18.2的结合特异性更高。

因而，在第一个方面，本申请提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，与人Claudin 18.2特异结合，包含(i)重链可变区，其含有VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区，其中该VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区分别包含与SEQ ID NOs：1、2和3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或(ii)轻链可变区，其含有VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区，其中该VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区分别包含与SEQ ID NOs：5、6和7具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与SEQ ID NO：4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本申请的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区分别包含与SEQ ID NOs：4和8具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

本申请的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。重链恒定区可以为小鼠IgG1、IgG2(如IgG2a)、或IgG4重链恒定区，或其片段，或者可以为人IgG1、IgG2(如IgG2a)、或IgG4重链恒定区，或其片段。轻链恒定区可以为小鼠κ或λ轻链恒定区，或其片段，或者可以为人κ或λ轻链恒定区，或其片段。在一个实施方式中，本申请的单克隆抗体包含小鼠IgG1重链恒定区和小鼠κ轻链恒定区。在一个实施方式中，小鼠IgG1重链恒定区和小鼠κ轻链恒定区分别包含SEQ ID NOs：9和10的氨基酸序列。重链可变区的C端与重链恒定区的N端连接，轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端连接。

本申请的抗体可以包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本申请的抗体可以是例如IgG1、IgG2或IgG4的全长抗体。在一些实施方式中，本申请的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或F(ab′)2片段。

本申请的抗体或其抗原结合部分可以是兔源、或嵌合的。

在第二个方面，本申请提供含有上述抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本申请抗体或其抗原结合部分的结合特异性。例如，本申请的双特异性分子能够同时结合Claudin 18.2以及Claudin 18.2阳性癌症细胞表达的其他分子，例如CD47、PD-L1等。

在第三个方面，本申请提供编码本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本申请还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备Claudin 18.2抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达该抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离该抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子。

在第四个方面，本申请提供一种组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及合适的载体。

在第五个方面，本申请提供一种体外检测试剂盒，包含本申请的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或包含它们的组合物。

本申请的体外检测试剂盒还可以包含用于检测本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与Claudin 18.2结合水平的可检测物质。可检测物质可以是指示酶(例如辣根过氧化酶(HRP))、放射性标记物、荧光团等。在一个实施方式中，可检测物质是辣根过氧化酶。

本申请的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子可以与可检测物质偶联。在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子可以例如通过化学作用与可检测物质直接偶联。本申请的体外检测试剂盒还可以包含与本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子的某部分，例如重链恒定区或轻链恒定区，例如Fc区，结合的二抗，该二抗与可检测物质偶联。

本申请的体外检测试剂盒还可以包含固体支持物，用于固定检测样本。固体支持物可以是载玻片。

本申请的体外检测试剂盒还可以包含测量可检测物质水平的试剂。在一个实施方式中，可检测物质为辣根过氧化酶，测量可检测物质水平的试剂是DAB(3，3N-二氨基联苯胺)。

在一个实施方式中，本申请的体外检测试剂盒包含(i)本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子；(ii)可检测物质；和(iii)固体支持物，其中(i)与(ii)偶联。在一个实施方式中，本申请的体外检测试剂盒包含(i)本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子；(ii)可检测物质；(iii)固体支持物；和(iv)测量可检测物质水平的试剂，其中(i)与(ii)偶联。

本申请还涉及本申请抗体或其抗原结合部分、双特异分子、或体外检测试剂盒在用于检测样本中是否存在Claudin 18.2阳性细胞中的用途。

因而，在第六个方面，本申请提供一种使用本申请的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或体外检测试剂盒来检测样本中是否存在Claudin 18.2阳性细胞的方法，包括：

(i)取得样本，可选地将其固定于固体支持物；

(ii)使样本与偶联可检测物质的本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子接触一段时间；以及

(iii)确定本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况。

样本可以是组织切片，例如胰腺、食道、卵巢、肺、胰腺、胃、支气管、乳腺和耳鼻喉的组织切片。组织切片可以是石蜡切片或冷冻切片，厚度可以在4-7μm的范围内。样本还可以是细胞石蜡切片，厚度可以在4-7μm的范围内。样本可以取自人。

组织切片可以附着于固体支持物，例如载玻片。

本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况可以通过测量结合Claudin 18.2的可检测物质的水平来确定。在一个实施方式中，本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况可以在去除未结合Claudin 18.2的可检测物质后，通过测量结合Claudin 18.2的可检测物质的水平来确定。在一个实施方式中，可检测物质为辣根过氧化酶，其水平可以通过DAB染色确定。

本申请还提供一种使用本申请抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或体外检测试剂盒来判断受试者是否患有Claudin 18.2相关癌症的方法，包括：

(i)取得样本，可选地将其固定于固体支持物；

(ii)使样本与偶联可检测物质的本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子接触一段时间；

(iii)确定本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况；

以及

(iv)将(iii)的结果与参照样本，例如健康志愿者的样本，的结果相比较。

受试者可以是人。

固体组织切片样本可以附着于固体支持物，例如载玻片。

本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况可以通过测量与Claudin 18.2结合的可检测物质的水平来确定。例如，本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况可以通过在去除未结合Claudin 18.2的可检测物质后，通过测量结合Claudin 18.2的可检测物质的水平来确定。在一个实施方式中，可检测物质为辣根过氧化酶，其水平可以通过DAB染色确定。

基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。

应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由。。。组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。

附图说明

以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。

图1示出人Claudin 18.1和人Claudin 18.2的氨基酸序列比对，其中黑框内为跨膜区氨基酸序列。

图2示出本申请抗体19C3和对照抗体43-13A在含有人Claudin18.1/18.2阳性细胞的石蜡切片上的染色结果，其中箭头指向较为明显的Claudin 18.1染色。

图3示出本申请抗体19C3和对照抗体43-13A在人Claudin18.2阳性胃癌组织的石蜡切片上的染色结果。

具体实施方式

为更好地理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“Claudin 18.2”是指2型Claudin 18。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人Claudin 18.2特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的Claudin 18.2蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人Claudin 18.2蛋白特异的抗体可以完全地对人Claudin 18.2蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的Claudin 18.2蛋白交叉反应。术语“人Claudin18.2”是指具有人氨基酸序列的Claudin 18.2蛋白，例如具有Genbank登录号为EAW79094.1(Venter，J.C.et al.，(2001)Science 291(5507)：1304-1351)或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的Claudin 18.2蛋白。

术语“Claudin 18.1”是指1型Claudin 18。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。术语“人Claudin 18.1”是指具有人氨基酸序列的Claudin 18.1蛋白，例如具有Genbank登录号为AAI46669.1(Strausberg R.L.et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)：16899-16903)或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的Claudin 18.1蛋白。

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即C_H1、C_H2和C_H3。各轻链由轻链可变区(简称V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C_L构成。V_H和V_L区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各V_H和V_L由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，Claudin 18.2蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂V_L和V_H构成的Fv片段；(v)由V_H构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中V_L和V_H区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与Claudin 18.2蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合Claudin 18.2蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人Claudin 18.2蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的Claudin 18.2蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

术语“兔源抗体”是指可变区骨架和CDR区得自兔种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自兔种系免疫球蛋白序列。本申请的兔源抗体可以包含不由兔种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“兔源抗体”不包括在兔骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。

术语“嵌合抗体”是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。

术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。

在本文中，“特异结合人Claudin 18.2”的抗体是指与人Claudin 18.2(还可能是其他非人物种的Claudin 18.2)结合但是基本不与非Claudin 18.2蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人Claudin 18.2蛋白，即K_D值为1.0x 10^-8M以下。

术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的K_D为1.0x 10^-6M以上，更优选1.0x 10^-5M以上，更优选1.0x 10^-4M以上、1.0x 10^-3M以上，更优选1.0x 10^-2M以上。

本申请中所用的术语“偶联”是两个分子经化学作用等结合在一起。例如，两个分子经共价键或非共价键如离子键而结合在一起。

术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。优选受试者为人。

本申请的多个方面在以下更加具体地加以描述。

Claudin 18.2抗体特异识别组织或细胞切片上的人Claudin 18.2

本申请的抗体或其抗原结合部分能够特异性地结合人Claudin 18.2，特别是组织切片或细胞切片上的人Claudin 18.2，而不与人Claudin 18.1结合。相比于Ganymed的43-14A，本申请抗体或其抗原结合部分对人Claudin 18.2，特别是组织切片或细胞切片中的人Claudin 18.2的结合特异性更高。

本申请的抗体可以是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如兔源、或嵌合的抗体。

Claudin 18.2单克隆抗体

本申请的抗体或其抗原结合部分可以包含SEQ ID NOs：1-3和5-7的重链和轻链可变区CDR，或者SEQ ID NOs：4和8的重链和轻链可变区。本申请抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR和轻链可变区CDR通过Kabat编号系统确定，且CDR区氨基酸序列的SEQ ID NO列于表1中。领域内熟知，重链可变区和轻链可变区CDR可以通过例如Chothia、IMGT、AbM或Contact编号系统/方法确定。

本申请的抗体还可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。重链恒定区可以为小鼠IgG1、IgG2(如IgG2a)、或IgG4重链恒定区，或其片段，或者可以为人IgG1、IgG2(如IgG2a)、或IgG4重链恒定区，或其片段。轻链恒定区可以为小鼠κ或λ轻链恒定区，或其片段，或者可以为人κ或λ轻链恒定区，或其片段。在一个实施方式中，本申请的单克隆抗体包含小鼠IgG1重链恒定区和小鼠κ轻链恒定区。在一个实施方式中，小鼠IgG1重链恒定区和小鼠κ轻链恒定区分别包含SEQ ID Nos：9和10的氨基酸序列。

与人Claudin 18.2结合的其他Claudin 18.2抗体的V_H和/或V_L序列(或CDR序列)可以与本申请抗体的V_H和/或V_L序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当V_H和V_L(或其中的CDR)混合并配对时，特定V_H/V_L配对中的V_H序列可以由结构近似的V_H序列取代。相似地，优选特定V_H/V_L配对中的V_L序列由结构近似的V_L序列取代。

在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括Claudin 18.2抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人Claudin 18.2的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一Claudin 18.2抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。

此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer etal.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashiet al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis andStoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献军通过引用的方式全部并入本文。

在另一实施方式中，本申请的抗体包含Claudin 18.2抗体的重链可变区的CDR2以及至少Claudin 18.2抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一Claudin 18.2抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人Claudin 18.2。

保守修饰

在另一实施方式中，本申请的抗体包含与本申请Claudin 18.2抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelleyand O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。

本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。

基因修饰的抗体

本申请的抗体可以以具备本申请Claudin 18.2抗体的一个或多个V_H/V_L序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，V_H和/或V_L)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力。

在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定抗体的特性的重组抗体(Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的V_H和V_LCDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。

用于本申请抗体的优选骨架序列是结构上与本申请抗体所用的骨架序列相似的那些。V_H CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一类的可变区修饰是将V_H和/或V_L CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。

此外，在另一实施方式中，本申请提供分离的Claudin 18.2单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)V_H CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_HCDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_L CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_L CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_LCDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。

此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。

在一个实施方式中，C_H1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变C_H1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。

在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。

此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。

抗体的物理特性

本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。

例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)JImmunol172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选Claudin 18.2抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。

在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。

各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选Claudin 18.2抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。

单克隆抗体的制备

本申请的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。

制备本申请单克隆抗体的转染瘤的生成

本申请的抗体处可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。

术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。

抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而V_H与载体中的C_H可操作地连接，V_L与载体中的C_L可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。

优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。

双特异性分子

另一方面，本申请涉及包含本申请抗体或其抗原结合部分与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。

在实施方式中，除Claudin 18.2结合特异性外，双特异性分子还可以特异结合Claudin 18.2阳性癌症细胞表达的其他分子，如PD-L1、CD47等。

双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)₂构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，cited supra；Cao and Suresh，BioconjugateChemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)。

编码抗体的核酸分子

在另一方面，本申请提供编码本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。

本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。

优选的本申请核酸分子包括编码Claudin 18.2单克隆抗体的V_H和V_L序列或CDR的那些。一旦获得了编码V_H和V_L的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_H或V_L的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。

编码V_H区的分离DNA可以通过可操作地连接V_H编码DNA与编码重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H区的DNA可以可操作地与仅编码重链C_H1恒定区的另一DNA分子连接。

编码V_L区的分离DNA可以通过可操作地连接V_L编码DNA与编码轻链恒定区C_L的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。

为创建scFv基因，编码V_H和V_L的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)₃的另一片段连接，从而V_H和V_L序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中V_H和V_L区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。

组合物

在另一方面，本申请提供一种组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合片段、双特异性分子、核酸分子、表达载体或宿主细胞，与合适的载体配制在一起。

载体可以包含溶剂、细胞培养基等，为本领域技术人员所知。

Claudin 18.2的体外检测试剂盒

本申请提供一种体外检测试剂盒，包含本申请的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子。

本申请的体外检测试剂盒还可以包含用于检测本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与Claudin 18.2结合水平的可检测物质。可检测物质可以是可检测的基团，例如荧光标记、冷光标记、可免疫检测的标记、辐射标记、化学标记、核酸标记或多肽标记。在一些实施方式中，可检测物质可以是具有可检测活性，例如对于特定底物的酶活性，的基团。具有可检测活性的检测物质的例子包括例如辣根过氧化酶(HRP)和荧光素酶基团。在一个实施方式中，可检测物质是辣根过氧化酶。

本申请的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子可以与可检测物质偶联。在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子可以与可检测物质直接偶联。本申请的体外检测试剂盒还可以包含与本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子的某部分，例如重链恒定区或轻链恒定区，例如Fc区，结合的二抗，该二抗与可检测物质偶联。

本申请的体外检测试剂盒还可以包含固体支持物，用于固定检测样本。固体支持物可以是样本如组织切片可方便固定(例如，通过吸附)、且适用于分析Claudin 18.2阳性样本(例如，根据本申请的组织切片样本)的任何固体支持物。用在本申请体外检测试剂盒的合适固体支持物为本领域已知。在一些实施方式中，固体支持物可以包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃、玻璃、或石英。在一些实施方式中，固体支持物可以是载玻片。

本申请的体外检测试剂盒还可以包含测量可检测物质水平的体系。当可检测物质为辣根过氧化酶时，体外试剂盒可以包含辣根过氧化酶的底物DAB(3，3N-二氨基联苯胺)。当本申请的体外检测试剂盒采用化学发光检测时，可参照在例如Kricka et al.，Analytica chimica acta，(2003)，500(1)：279-286和Chen et al.，Chinese Journal ofAnalytical Chemistry(2012)40(1)：3-10中的描述进行化学发光的检测。当可检测物质是例如在合适激发时产生电磁辐射的化学物质时，例如是吖啶化合物(例如吖啶酯或吖啶磺酰胺酯)时，本申请的体外检测试剂盒还可以包含碱性双氧水来激活该化学物质。当可检测物质是例如催化冷光化合物发出电磁辐射的酶时，本申请的体外检测试剂盒可以包含过氧化氢来催化发光氨降解。

在一个实施方式中，本申请的体外检测试剂盒包含(i)本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子；(ii)可检测物质；和(iii)固体支持物，其中(i)与(ii)偶联。在一个实施方式中，(i)与(ii)通过化学作用直接偶联。在一个实施方式中，(i)与(ii)通过蛋白分子，如结合(i)的抗体，偶联。

在一个实施方式中，本申请的体外检测试剂盒包含(i)本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子；(ii)可检测物质；(iii)固体支持物；和(iv)测量可检测物质水平的试剂，其中(i)与(ii)偶联。在一个实施方式中，(i)与(ii)通过化学作用直接偶联。在一个实施方式中，(i)与(ii)通过蛋白分子，如结合(i)的抗体，偶联。

本申请的用途和方法

本申请的抗体或其抗原结合部分、双特异分子、或体外检测试剂盒可以用于Claudin 18.2阳性样本的体外检测，且具有比现有技术抗体如Ganymed的43-14A更好的Claudin 18.2体外结合特异性。

因而，使用本申请的抗体或其抗原结合部分、双特异分子、或体外检测试剂盒，可以更加便捷地研究Claudin 18.2在正常人体组织中、甚至在各组织的具体部位处的表达和分布，还能更加便捷地判断出某一癌症与Claudin 18.2表达的关系，从而更好地对病人进行对症下药。

在一个方面，本申请提供一种使用本申请的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或体外检测试剂盒来检测样本中是否存在Claudin 18.2阳性细胞的方法，包括(i)取得样本，可选地将其固定于固体支持物；(ii)使样本与偶联可检测物质的本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子接触一段时间；以及(iii)确定本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况。

组织切片可以附着于固体支持物，例如载玻片。

本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况可以通过测量与Claudin 18.2结合的可检测物质的水平来确定。在一个实施方式中，可检测物质为辣根过氧化酶，其水平可以通过DAB染色确定。

另一方面，本申请还提供一种使用本申请抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或体外检测试剂盒来诊断受试者是否患有Claudin 18.2相关癌症的方法，包括(i)取得样本，可选地将其固定于固体支持物；(ii)使样本与偶联可检测物质的本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子接触一段时间；(iii)确定本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子与样本的结合情况；以及(iv)将(iii)的结果与参照样本，如健康志愿者的样本，的结果相比较。

受试者可以是人。

固体组织切片样本可以附着于固体支持物，例如载玻片。

本申请还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。

实施例

实施例1单抗隆抗体的生成和筛选

将C端带有hFc标签的人Clauidn 18.2N端1-110氨基酸残基(SEQ ID NO：11)与多种佐剂组合，免疫新西兰白兔，获得阳性克隆51个。

经表位检测后，选取6个克隆，测序得到轻重链DNA序列。将抗体的轻链和重链可变区基因分别克隆至载有小鼠轻链或重链恒定区DNA序列的pCDNA3.1(Invitrogen公司)载体EcoRI/BamHI酶切位点之间，使得重链可变区的C端接重链恒定区(对应氨基酸序列为SEQID NO：9)的N端，轻链可变区的C端接轻链恒定区(对应氨基酸序列为SEQ ID NO：10)的N端。用载体转染CHO-K1细胞，进行全长抗体分泌表达。收集细胞培养上清，进行纯化。经进一步亲和力验证，最终选取19C3为候选分子，其重链/轻链可变区和CDR的氨基酸序列如表1所示。

表1.重链/轻链可变区CDR和重链/轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs.

实施例2稳定表达人Claudin 18.1或Claudin 18.2的HEK293A细胞株的构建

合成编码人Claudin 18.1(SEQ ID NO：12)和人Claudin 18.2(SEQ ID NO：13)的DNA序列，通过EcoRI和BamHI双酶切将上述两个基因的编码序列分别克隆到pLV-sfGFP(2A)puro质粒的EcoRI和BamHI位点之间。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-Claudin 18.1或pLV-EGFP(2A)-Puro-Claudin 18.2与psPAX2以及pMD2.G共转染至HEK293T细胞(Cobioer，中国)，生成慢病毒。得到的慢病毒转染至HEK293A细胞(Cobioer，中国)，以生成过表达人Claudin 18.1或人Claudin 18.2的稳定细胞株HEK293/h18.1和HEK293/h18.2。将细胞株培养在添加有10％FBS(Cat#：FND500，Excell)和0.2μg/ml嘌呤霉素(Cat#：A11138-03，Gibco)的DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)中，培养时间为7天以上。

Claudin 18.1和Claudin 18.2的表达经荧光激活细胞分类术(FACS)检测。具体而言，100,000个转染细胞在96孔板的各孔中铺板，并在之后加入市售CLDN18抗体(兔抗Claudin-18，Cat#：388100，Life Technology)。4℃孵育1小时后，板用PBST洗涤3遍，再加入PE耦联的驴抗兔IgG二抗(1∶500，PE驴抗兔IgG抗体，Cat#：406421，Biolegend)。4℃孵育1小时后，板用PBS洗涤3遍，之后使用FACS仪器(BD)监测细胞荧光度。

实施例3细胞石蜡切片的免疫组织化学分析

检测19C3在细胞石蜡切片免疫组织化学测试中对人claudin18.1和人claudin18.2的区分度。专利CN 104321345 B中公开的43-14A用作对照，具体而言，按照实施例1的方法，使用SEQ ID NOs：14和15所示的重链和轻链可变区氨基酸序列进行全长抗体表达和纯化。具体地，将该抗体的轻链和重链可变区基因分别克隆至载有小鼠轻链或重链恒定区DNA序列(对应氨基酸分别为SEQ ID NO：9和10)的pCDNA3.1(Invitrogen公司)载体EcoRI/BamHI酶切位点之间，使得重链可变区的C端接重链恒定区的N端，轻链可变区的C端接轻链恒定区的N端。

使用实施例2中构建的HEK293/h18.1和HEK293/h18.2细胞，采集一定数量的细胞，制作细胞石蜡切片。简单而言，细胞悬液1000rmp离心5min，弃上清，加入1mL预冷至4℃的PBS重悬，移入EP管，3000rmp 5min离心，弃上清，加入1mL10％中性福尔马林中，室温静置2h，以镊子将细胞团从管底轻轻取出，置入细胞包埋盒。装有细胞团块的包埋盒，浸没在10倍以上体积10％中性福尔马林中，固定24h。

包埋盒在室温下依次用以下液体浸泡，逐级脱水透明：75％酒精(Alc)1h→85％Alc 1h→95％Alc 1h→100％Alc 30min×3→100％二甲苯20min×2，更换液体时务必将前一种液体充分控干。

包埋盒置入65℃恒温干燥箱，融化的石蜡浸泡1h×2。蜡块固定在石蜡切片机上，修块至组织最大面完全暴露。调整切片厚度为4μm，切出连续蜡带。将蜡带移入30％Alc，再捞入展片机水槽(水温调节为35℃)，待蜡带完全展平。用载玻片将蜡带捞起，依次插入玻片架。放入恒温干燥箱，65℃烤片4h，室温放凉。移入玻片盒，干燥处避光保存。

石蜡切片先进行HE(苏木精-伊红)染色。简单而言，石蜡切片放入恒温干燥箱，65℃烤片30min。随后，按以下步骤复水：100％二甲苯5min×2→100％Alc 5min×2→95％Alc5min×2→85％Alc 5min→75％Alc 5min→流水冲洗5min(更换液体时务必将前一种液体充分控干)。以滤纸刮去苏木素液表面的氧化膜，染液充分没过切片上的组织，浸染10min。镜下观察染色程度，染色不足时可适当延长染色时间。流水洗去多余的染液，用盐酸酒精(70％Alc含1％盐酸)分化10s，流水冲洗反蓝15min，0.5％伊红浸染10s，流水洗去多余染液。之后，按以下步骤脱水、透明：75％Alc 2min→85％Alc 2min→95％Alc 2min→100％Alc 2min×2→100％二甲苯5min×2(更换液体时务必将前一种液体充分控干)。中性树脂封片，无灰尘处晾片至树脂干透。

之后，将石蜡切片进行免疫组织化学(IHC)染色。简单而言，将切片按上述步骤进行常规复水，在3％H₂O₂中浸泡10min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗。使用pH8.0EDTA进行抗原修复后，滴加19C3和对照抗体的工作液(1∶1000稀释，抗体稀释液ZLI-9028)完全覆盖组织，37℃湿盒内孵育1h，PBS洗。抗小鼠IgG Fc(HRP)二抗(Cat#：ab97265，Abcam)经1∶1000稀释，滴加完全覆盖组织，37℃湿盒内孵育30min，PBS洗。滴加DAB工作液完全覆盖组织，光镜下观察至阳性部位呈深棕色，立即将切片浸泡至自来水中终止显色反应，并以自来水流水冲洗10min。之后参照上述HE染色步骤进行苏木素复染、脱水、透明、和封片。

结果如图2所示，19C3和43-14A均能与过表达人Claudin18.2的细胞HEK293/h18.2结合，而19C3几乎不与Claudin18.1结合，43-14A与人Claudin18.1的结合明显多于19C3。

实施例4胃癌PDX石蜡切片免疫组织化学分析

从人源肿瘤异种移植(PDX)模型取得Claudin18.2阳性胃癌组织，进行组织脱水和包埋，制备3μm厚度组织切片。如上所述，用二甲苯和梯度酒精脱蜡水化组织切片，蒸馏水洗5min。抗原采用高压修复法，将切片放入盛有枸橼酸水溶液(PH 6.0)的高压锅，100℃2.5min，自然冷却至室温。PBS洗三次，每次3分钟。滴加过氧化物酶阻断剂(TA-060-H2O2Q，Thermo)，室温孵育10min。PBS洗三次，每次3min。滴加1∶1000稀释比例的19C3或43-13A，4℃孵育过夜。PBS洗三次，每次3分钟。滴加山羊抗鼠IgG/HRP聚合物(PV-6002，GBI)，室温避光孵育30min。PBS洗三次，每次3分钟。滴加DAB溶液，室温避光显色5分钟。苏木素复染，自来水洗。盐酸酒精分化，返蓝，脱水透明后封片。显微镜下观察和拍照。Isotype抗体作为阴性对照。

结果如图3所示，对于Claudin18.2阳性胃癌切片，阳性信号定位于细胞膜，使用19C3作为一抗的免疫组织化学染色具有良好的组织特异性与灵敏度，与43-13A相比，非肿瘤区域特异染色较低，肿瘤细胞间质清晰。阴性对照使用同型抗体作为一抗，没有观察到染色。

实施例5肿瘤组织免疫组织化学分析

使用胃癌组织芯片(西安艾丽娜，ST2161a)和胰腺癌组织芯片(上海芯超生物，HPan-Ade120Sur-01)，以19C3作为一抗，进行免疫组织化学分析。胃癌组织芯片含216点，共216例，含多病理类型胃癌及正常胃组织组合微阵列，其中腺癌172例、粘液腺癌12例、未分化癌5例、印戒细胞癌6例、类癌3例、鳞状细胞癌1例、恶性间质瘤9例、正常胃组织8例。胰腺癌组织芯片含120点，其中生存期胰腺癌63例、57例癌旁。简单而言，免疫组织化学分析按照实施例4所述进行，除微波修复抗原100℃15min外。

免疫组化的结果显示，在胃癌芯片的208个胃癌组织中，有73个呈Claudin 18.2阳性(73/208)，在胰腺癌芯片的63个胰腺癌组织中，有30个呈Claudin 18.2阳性表达(30/63)。

本申请中涉及的序列如下。

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尽管本申请已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本申请不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。

序列表

<110> 北京天广实生物技术股份有限公司

北京华放天实生物制药有限责任公司

<120> 一种癌症检测抗体及其用途

<130> 55556 00049

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的VH-CDR1

<400> 1

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的VH-CDR2

<400> 2

Ile Ile Ser Pro Val Val Thr His Thr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的VH-CDR3

<400> 3

Asp Leu Gly Pro Ser Tyr Ser Arg Gly Thr Ile Ile Pro Phe Asn Leu

1 5 10 15

<210> 4

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的的VH

<400> 4

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Ser Pro Val Val Thr His Thr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Ile Ile Thr Ser

65 70 75 80

Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu Gly

85 90 95

Pro Ser Tyr Ser Arg Gly Thr Ile Ile Pro Phe Asn Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val

165 170 175

Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr

180 185 190

Ser Ser

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的VL-CDR1

<400> 5

Thr Leu Ser Ser Ala His Ser Thr Tyr Tyr Ile Glu

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的VL-CDR2

<400> 6

Leu Lys Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Gly Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的VL-CDR3

<400> 7

Gly Val Thr Asp Lys Asn Val Phe Ala Phe Phe Tyr Val

1 5 10

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19C3抗体的的VL

<400> 8

Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Thr Leu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Ser Thr Tyr Tyr

20 25 30

Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met

35 40 45

Gln Leu Lys Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Gly Thr Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Ser

65 70 75 80

Ser Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Thr Asp

85 90 95

Lys Asn Val Phe Ala Phe Phe Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu

100 105 110

Thr Val Thr Gly Gln Pro

115

<210> 9

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IgG1重链恒定区

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠κ轻链恒定区

<400> 10

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 11

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile

1 5 10 15

Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr

20 25 30

Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly

35 40 45

Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg

50 55 60

Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg

65 70 75 80

Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val

85 90 95

Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu

100 105 110

<210> 12

<211> 261

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr

20 25 30

Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly

35 40 45

Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg

50 55 60

Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg

65 70 75 80

Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val

85 90 95

Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser

115 120 125

Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val

130 135 140

Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly

145 150 155 160

Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe

165 170 175

Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met

180 185 190

Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala

195 200 205

Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly

210 215 220

Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser

245 250 255

Lys His Asp Tyr Val

260

<210> 13

<211> 261

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile

1 5 10 15

Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr

20 25 30

Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly

35 40 45

Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg

50 55 60

Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg

65 70 75 80

Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val

85 90 95

Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser

115 120 125

Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val

130 135 140

Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly

145 150 155 160

Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe

165 170 175

Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met

180 185 190

Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala

195 200 205

Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly

210 215 220

Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser

245 250 255

Lys His Asp Tyr Val

260

<210> 14

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 43-14A的重链可变区

<400> 14

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Phe Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Val Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Thr Leu Thr Val Ser Ser

130

<210> 15

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 43-14A的轻链可变区

<400> 15

Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Ile Pro

20 25 30

Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Asn

35 40 45

Leu Leu His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Val Gln Val Leu Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

Claims

1.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区，该轻链可变区包含VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区，其中VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNOs：1、2、3、5、6和7所示。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NOs：4和8所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，包含与所述重链可变区相连的重链恒定区和/或与所述轻链可变区相连的轻链恒定区，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其为兔源或嵌合的。

7.一种组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

8.根据权利要求7所述的组合物，还包含用于检测所述抗体或其抗原结合部分与Claudin18.2蛋白的结合水平的可检测物质。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述可检测物质与所述抗体或其抗原结合部分偶联。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述可检测物质为辣根过氧化酶。

11.一种用于非疾病诊断目的的在样本中检测Claudin18.2阳性细胞的存在的方法，包括：

(i)取得样本，并将其固定于固体支持物；

(ii)使样本与权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分接触一段时间，其中所述抗体或其抗原结合部分偶联有用于检测其与Claudin1 8.2蛋白结合水平的可检测物质；以及

(iii)确定所述抗体或其抗原结合部分与样本的结合水平。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述样本为胰腺、食道、卵巢、肺、胰腺、胃、支气管、乳腺和耳鼻喉的组织切片。

13.根据权利要求11所述的方法，其中固体支持物为载玻片。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述可检测物质为辣根过氧化酶。

15.权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制备一种用于诊断Claudin18.2相关癌症的试剂盒中的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分偶联有用于检测其与Claudin18.2蛋白结合水平的可检测物质。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述可检测物质为辣根过氧化酶。