JP2022060048A - 抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基を特異的に認識できる技術を提供する。【解決手段】αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基と結合する抗体又はその抗体断片であり、前記抗体は、所定のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、所定のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域とを有する；ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を過剰発現させて得られるリコンビナントαジストログリカンを抗原として、前記抗体又はその抗体断片を発現する動物細胞を得ることを特徴とする方法；前記抗体又はその抗体断片をコードする核酸及びベクター；前記ベクターを含む、形質転換体；前記抗体又はその抗体断片を含むがん診断薬。【選択図】なし

Description

本発明は、抗体及びその使用に関する。

ジストログリカンは、筋ジストロフィーの発症と関係する膜タンパク質として研究されている。ジストログリカンは、細胞外領域のαサブユニット（αジストログリカン）と膜貫通領域のβサブユニット（βジストログリカン）を有する。
野生型のαジストログリカンは、ラミニン結合性の糖鎖修飾を受けていることが知られている。この糖鎖修飾の一例として、αジストログリカンのＴｈｒ^３１７／Ｔｈｒ^３１９の部分のリン酸化三糖構造がある（非特許文献１）。
このリン酸化三糖構造は、リン酸化マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンから形成される。そして、ラミニン結合性の糖鎖においては、このリン酸化三糖構造の先端に二分子のリン酸化リビトール（ＲｂｏＰ）から形成されるタンデムのリビトールリン酸構造が形成されている。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１６， １５（１１） ３４２４－３４３４．

本発明者は、αジストログリカンがグリセロールリン酸修飾基を有することを真核生物で初めて見出している（非特許文献１）。しかし、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾の分子生物学的意義、生理学的作用の解明にはさらなる研究が必要である。
そこで、本発明は、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基を特異的に認識できる技術を提供する。

本発明者は、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基と特異的に結合する抗体によれば、グリセロールリン酸修飾基が発現した細胞を選択的に検出、分別できると考えた。分別したその細胞の遺伝的性質の解析等は、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基の分子生物学的意義、生理学的作用の解明に有効である。
加えて、本発明者は、グリセロールリン酸修飾基ががん細胞において高発現していることを知見し、当該抗体のがん診断薬としての有用性を見出した。

本発明は下記の［１］～［９］の態様を有する。
［１］ αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基と結合する抗体又はその抗体断片であり、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１；配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２；及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３；を有する、重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１；配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２；及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３；を有する、軽鎖可変領域と、を有する抗体、又はその抗体断片。
［２］ 前記重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含む、［１］の抗体又はその抗体断片。
［３］ 前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含む、［１］又は［２］の抗体又はその抗体断片。
［４］ ［１］～［３］のいずれかの抗体又はその抗体断片の生産方法であり、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を細胞中で過剰発現させ、次いで、前記細胞で発現したグリセロールリン酸修飾基を有するリコンビナントαジストログリカンを抗原として用いて、前記抗体又はその抗体断片を発現する動物細胞を得ることを特徴とする、方法。
［５］ 前記リコンビナントαジストログリカンの発現に際して、さらに、ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の機能を抑制又は阻害することを特徴とする、［４］の方法。
［６］ ［１］～［３］のいずれかの抗体又はその抗体断片をコードする、核酸。
［７］ ［６］の核酸を含む、ベクター。
［８］ ［７］のベクターを含む、形質転換体。
［９］ ［１］～［３］のいずれかの抗体又はその抗体断片を含む、がん診断薬。

本発明によれば、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基を特異的に認識できる技術が提供される。

αジストログリカンに結合したグリセロールリン酸修飾基の一例を説明するための図である。 αジストログリカンに結合したグリセロールリン酸修飾基の一例を説明するための図である。 実験例１における抗ラミニン結合性糖鎖抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 実験例２におけるαジストログリカンの一次構造を示す図である。 実験例３で樹立した抗体のグリセロールリン酸修飾基に対する結合能をウエスタンブロッティングにより分析した結果を示す図である。 実験例３で樹立した抗体のグリセロールリン酸修飾基に対する結合能をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す。 実験例３で樹立した抗体を用いた免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡像である。 実験例３で樹立した抗体を用いて大腸癌組織を免疫染色した結果を示す図である。

本明細書における下記の用語の意味は以下の通りである。
「ＣＤＰ－Ｇｒｏ」は、「ＣＤＰ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ」の略である。「ＣＤＰ－Ｇｒｏ」のＩＵＰＡＣ名は、［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－ａｍｉｎｏ－２－ｏｘｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－１－ｙｌ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｘｏｌａｎ－２－ｙｌ］ｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ］ ［（２Ｒ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅである。
「ＣＤＰ－Ｒｂｏ」は、「ＣＤＰ－ｒｉｂｉｔｏｌ」の略である。「ＣＤＰ－Ｒｂｏ」のＩＵＰＡＣ名は、［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－ａｍｉｎｏ－２－ｏｘｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－１－ｙｌ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｘｏｌａｎ－２－ｙｌ］ｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ］ ［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－２，３，４，５－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔｙｌ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅである。
「グリセロールリン酸修飾基」は、αジストログリカンに結合したリン酸化三糖構造に結合した修飾基であって、一分子のリン酸と一分子のグリセロールから化学的に形成された原子団を意味する。
アミノ酸配列における「数個」とは、５個、４個、３個又は２個を意味する。
アミノ酸が「付加」されるとは、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端にアミノ酸が付加されること又はペプチドの任意の位置にアミノ酸が挿入されることを意味する。
数値範囲を示す「～」は、その前後に記載された数値を下限値及び上限値として含むことを意味する。

＜抗体又はその抗体断片＞
本発明の一実施形態は、抗体又はその抗体断片を提供する。当該抗体又はその抗体断片は、αジストログリカンに結合したグリセロールリン酸修飾基と特異的に結合する。つまり、抗体は、αジストログリカンに結合したグリセロールリン酸修飾基に対する抗体であり、抗グリセロールリン酸修飾抗体であるとも言える。

グリセロールリン酸修飾基と抗体（又はその抗体断片）との解離定数（Ｋｄ）は、例えば１．０×１０^－６Ｍ未満でもよく、１．０×１０^－７Ｍ未満でもよく、１．０×１０^－８Ｍ未満でもよく、１．０×１０^－９Ｍ未満でもよい。解離定数（Ｋｄ）は、例えば、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用したＳＰＲ法による測定、競合ＥＬＩＳＡ法による測定等により測定できる。ＳＰＲ法に際しては、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）等の市販の装置、センサー、試薬類を使用できる。

図１、２は、αジストログリカンに結合したグリセロールリン酸修飾基の一例を説明するための図である。グリセロールリン酸修飾基１は、リン酸化三糖構造２の先端に結合している。リン酸化三糖構造２は、Ｎ－アセチルガラクトサミン３とＮ－アセチルグルコサミン４とリン酸化マンノース５とを有する。

グリセロールリン酸修飾基１は、リン酸化三糖構造２の先端のＮ－アセチルガラクトサミン３の３位の酸素原子と結合している。そして、Ｎ－アセチルガラクトサミン３の１位の酸素原子は、Ｎ－アセチルグルコサミン４の３位の酸素原子と結合している。
Ｎ－アセチルグルコサミン４の１位の酸素原子は、リン酸化マンノース５の４位の酸素原子と結合している。そして、リン酸化マンノース５の１位の酸素原子は、αジストログリカン６と結合している。

グリセロールリン酸修飾基１を有するαジストログリカン６においては、リン酸化三糖構造２の先端のＮ－アセチルガラクトサミン３に一分子のリン酸化グリセロール（ＧｒｏＰ）が結合している。このように、グリセロールリン酸修飾基１を有するαジストログリカン６は、リン酸化三糖構造２を介して結合したグリセロールリン酸修飾基１を細胞外の表面に提示していると考えられる。
グリセロールリン酸修飾基１は、細胞内のＣＤＰ－Ｇｒｏ７をドナー基質とする酵素反応によって、リン酸化三糖構造２の先端に形成されると考えられている。この酵素反応には、ＦＫＴＮ（Ｆｕｋｕｔｉｎ）、ＦＫＲＰ（Ｆｕｋｕｔｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の関与が指摘されている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１８ Ａｕｇ ３； ２９３（３１）：１２１８６－１２１９８．）。

一実施形態において抗体は、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とを有する。
重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１；配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２；及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３；を含む。以下、「重鎖相補性決定領域」を「ＨＣＤＲ」と記載する。
軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１；配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２；及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３；を含む。以下、「軽鎖相補性決定領域」を「ＬＣＤＲ」と記載する。

ただし、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、抗体がグリセロールリン酸修飾基との結合能を維持できる範囲であれば、配列番号１～３のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列；配列番号１～３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列；とそれぞれ代替可能である。
また、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、抗体がグリセロールリン酸修飾基との結合能を維持できる範囲であれば、配列番号４～６のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列；配列番号４～６のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列；と代替可能である。

一実施形態において、抗体の重鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。配列番号７のアミノ酸配列は、抗体がグリセロールリン酸修飾基との結合能を維持できる範囲であれば、配列番号７のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列；配列番号７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列；と代替可能である。
配列番号７のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７のアミノ酸配列と９０～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号７のアミノ酸配列と９５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号７のアミノ酸配列と９６～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号７のアミノ酸配列と９７～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号７のアミノ酸配列と９８～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列が挙げられる。

一実施形態において、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。配列番号８のアミノ酸配列は、抗体がグリセロールリン酸修飾基との結合能を維持できる範囲であれば、配列番号８のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列；と代替可能である。
配列番号８のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列としては、例えば、配列番号８のアミノ酸配列と９０～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸配列と９５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸配列と９６～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸配列と９７～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸配列と９８～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列が挙げられる。

一実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。配列番号９のアミノ酸配列は、マウスＩｇＭ由来のアミノ酸配列を有する。配列番号９のアミノ酸配列のうち、マウスＩｇＭに由来する部分の配列のＵｎｉｐｒｏｔの登録番号は、Ｐ０１８７２である。
配列番号９のアミノ酸配列は、抗体がグリセロールリン酸修飾基との結合能を維持できる範囲であれば、配列番号９のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列；配列番号９のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列；と代替可能である。
配列番号９のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列としては、例えば、配列番号９のアミノ酸配列と８５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号９のアミノ酸配列と９０～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号９のアミノ酸配列と９５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号９のアミノ酸配列と９６～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号９のアミノ酸配列と９７～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号９のアミノ酸配列と９８～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列が挙げられる。

一実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号１０のアミノ酸配列からなる。配列番号１０のアミノ酸配列は、マウスＩｇκ由来のアミノ酸配列を有する。配列番号１０のアミノ酸配列のうち、マウスＩｇκに由来する部分の配列のＵｎｉｐｒｏｔの登録番号は、Ｐ０１８３７である。
配列番号１０のアミノ酸配列は、抗体がグリセロールリン酸修飾基との結合能を維持できる範囲であれば、配列番号１０のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列；と代替可能である。
配列番号１０のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列と８５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９０～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９６～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９７～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９８～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列が挙げられる。

アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、基準アミノ酸配列に対する対象アミノ酸配列の配列同一性として、次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。次いで、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸のアミノ酸残基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸残基数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸残基数×１００ ・・・（１）

特に、天然の抗体は、重鎖と軽鎖とを有する糖タンパク質である。そして、重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合により相互に結合されている。
各重鎖は、重鎖可変領域と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１；ＣＨ２；及びＣＨ３；を含む。
各軽鎖は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわち、ＣＬを含む。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性の領域とフレームワーク領域（ＦＲ）とにさらに細分可能である。各重鎖可変領域及び各軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。この３つのＣＤＲ及び４つのＦＲは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される。

本実施形態の抗体は、一本のペプチド鎖からなる一本鎖抗体でもよい。例えば、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、アルパカ等のラクダ科動物は、重鎖からなる一本鎖抗体を有する。
この場合、一本鎖抗体の可変領域の配列は、本実施形態に開示の重鎖のアミノ酸配列から決定できると考えられる。一本鎖抗体は、天然由来でもよく、ナノボディのように遺伝子工学的な手法により生産された一本鎖ペプチドでもよい。

抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）をとり得る。すなわち、抗体は、ＩｇＧ抗体でもＩｇＭ抗体でもＩｇＡ抗体でもＩｇＤ抗体でもＩｇＥ抗体でもよい。
抗体は、任意のクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）でもよく、任意のサブクラスの抗体でもよい。

抗体のアイソタイプ、クラス、サブクラスについて、例えば、抗体の重鎖は、下記の配列番号１８～２６のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。ただし、抗体の重鎖は下記の配列番号の配列に限定されず、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号等で特定される公知の定常領域の配列を用いて適宜設計、変更、置換可能である。
配列番号１８：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８７８のマウスＩｇＡ由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号１９：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８８１のマウスＩｇＤ由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２０：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０６３３６のマウスＩｇＥ由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２１：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８６８のマウスＩｇＧ１由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２２：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８７６のヒトＩｇＡ由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２３：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８８０のヒトＩｇＤ由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２４：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８５４のヒトＩｇＥ由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２５：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８５７のヒトＩｇＧ１由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２６：配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８７１のヒトＩｇＭ由来のアミノ酸配列を有する重鎖全長のアミノ酸配列。

抗体のアイソタイプ、クラス、サブクラスについて、例えば、抗体の軽鎖は、下記の配列番号２７～２９のアミノ酸配列からなるものが挙げられる。ただし、抗体の軽鎖は下記の配列番号の配列に限定されず、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号等で特定される公知の定常領域の配列を用いて適宜設計、変更、置換可能である。
配列番号２７：配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８４３のマウスＩｇλ由来のアミノ酸配列を有する軽鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２８：配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０１８３４のヒトＩｇκ由来のアミノ酸配列を有する軽鎖全長のアミノ酸配列。
配列番号２９：配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｐ０ＣＧ０４のヒトＩｇλ由来のアミノ酸配列を有する軽鎖全長のアミノ酸配列。

抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。また、抗体は、天然の供給源に由来してもよく、人工の組換え供給源に由来してもよい。モノクローナル抗体は、例えば、グリセロールリン酸修飾基を有するリコンビナントαジストログリカンを抗原として用いて、通常のモノクローナル抗体の生産方法により取得することができる。モノクローナル抗体の生産方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態は、上述した抗体の抗体断片を提供する。
本実施形態の抗体断片は、αジストログリカンに結合したグリセロールリン酸修飾基と特異的に結合する。そのため、抗体断片は、グリセロールリン酸修飾基結合性フラグメントであるとも言える。
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、上述した抗体の一部からなるペプチド等が挙げられる。ペプチドは化学的に合成できるため、抗体全長やｓｃＦｖ等と比較してより容易に製造でき、取り扱いも容易である。また、品質管理が容易で安定性が高い。

本実施形態の抗体断片は、下記のいずれかのペプチドでもよい。
配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号１のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号２のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号３のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号４のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号５のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号５のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号６のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号６のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号７のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号８のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号８のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号９のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号９のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
配列番号１０のアミノ酸配列を含むペプチド；又は配列番号１０のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列若しくは配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、グリセロールリン酸修飾基に対する結合能を有するペプチド。
ここで、配列番号１～１０のアミノ酸配列の詳細は、上述した抗体における配列番号１～１０のアミノ酸配列と同内容である。

本実施形態の抗体断片は、基板上に結合するための官能基をさらに有してもよい。この場合の官能基としては、例えばシステイン残基のチオール基等が挙げられる。すなわち、本実施形態のペプチドは、配列番号１～１０のアミノ酸配列において、Ｎ末端側又はＣ末端側にシステイン残基がさらに付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。

（作用効果）
以上説明した本実施形態の抗体又はその抗体断片は、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基と特異的に結合するため、グリセロールリン酸修飾基の特異的な認識が可能となる。

＜抗体の生産方法＞
本発明の一実施形態は、上述した抗体又はその抗体断片の生産方法を提供する。当該生産方法では、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を細胞中で過剰発現させる。次いで、前記細胞で発現したグリセロールリン酸修飾基を有するリコンビナントαジストログリカンを抗原として用いて、前記抗体又はその抗体断片を発現する動物細胞を得ることを特徴とする。

ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を細胞中で過剰発現させる方法は、特に限定されないが、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素をコードする発現ベクターを細胞内に導入する方法が好ましい。ただし、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素は、リコンビナントαジストログリカンの発現に使用する細胞が元来保有するものでもよい。
ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素は、当該細胞内でＣＤＰ－Ｇｒｏの生化学的な合成反応を促進できるものであればよく、特に限定されない。ＣＤＰ－Ｇｒｏの生化学的な合成反応の一つとして、細胞内のＣＴＰとグリセロールリン酸からＣＤＰ－Ｇｒｏを合成する反応がある。

ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素の過剰発現により、当該細胞内のＣＤＰ－Ｇｒｏの存在量、すなわち、グリセロールリン酸修飾基の形成反応のドナー基質の存在量が多くなる。その結果、グリセロールリン酸修飾基を有するリコンビナントαジストログリカンが当該細胞の表面に発現しやすくなる。これは、図１、２に示すリン酸化三糖構造２の先端におけるグリセロールリン酸修飾基１の形成反応が、ＣＤＰ－Ｇｒｏの存在量の増加に伴い、競合反応より起きやすくなるためである。

ここでの競合反応とは、リン酸化三糖構造２の先端におけるタンデムのリビトールリン酸構造の形成反応である。通常の条件下、例えば、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を過剰発現させていない条件下では、タンデムのリビトールリン酸構造の先に、細胞間接着に寄与する糖鎖、すなわちラミニン結合性の糖鎖が相対的に形成されやすい。一方で、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を過剰発現させた条件下では、リン酸化三糖構造２の先端におけるグリセロールリン酸修飾基１の合成反応が起きやすく、グリセロールリン酸修飾基の存在率が高くなると考えられる。
グリセロールリン酸修飾基の先には糖鎖が伸長していない。そのため、グリセロールリン酸修飾基は、αジストログリカンの糖鎖伸長を終結させるように働くと考えられる。また、グリセロールリン酸修飾基が発現したαジストログリカンにおいては、ラミニンとの結合能が消失する。

ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素としては、例えば、グラム陽性菌由来のＴａｇＤが挙げられる。ただし、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素は、ＴａｇＤに限定されない。
ＴａｇＤのアミノ酸配列及び立体構造は、例えば、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３，２７８，５１８６３－５１８７１等の文献、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ＩＤ：１Ｎ１Ｄ等のデータベースに記載されている。本願において、ＴａｇＤのアミノ酸配列及び立体構造については、これら文献、データベースの内容を援用できる。

一実施形態において、リコンビナントαジストログリカンは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。そして、リコンビナントαジストログリカンは、配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチドがフォールディングしたものである。

本実施形態においては、リコンビナントαジストログリカンの配列番号１１のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：と代替可能である。
配列番号１１のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列と８０～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と８５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９０～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９５～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９６～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９７～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９８～９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列が挙げられる。

ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を過剰発現させる細胞には、あらかじめリコンビナントαジストログリカンの発現用ベクターを導入し、リコンビナントαジストログリカンの発現誘導をかけておくことが好ましい。リコンビナントαジストログリカンの発現用ベクターは、例えば、配列番号１２の塩基配列からなる。ただし、リコンビナントαジストログリカンの発現ベクターは、グリセロールリン酸修飾を有するリコンビナントαジストログリカンを発現し得るものであればよく、特に限定されない。

リコンビナントαジストログリカンの発現に際しては、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素の過剰発現に加えて、さらに、ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の機能を抑制又は阻害することが好ましい。グリセロールリン酸修飾基の存在率がさらに高くなると期待されるからである。
ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素は、リコンビナントαジストログリカンの発現に使用する細胞が元来保有するものである。ただし、ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素は、当該細胞内でＣＤＰ－Ｒｂｏの生化学的な合成反応を促進し得るものであれば、特に限定されない。ＣＤＰ－Ｒｂｏの生化学的な合成反応の一つとして、細胞内のＣＴＰとリビトールリン酸からＣＤＰ－Ｒｂｏを合成する反応がある。

ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の機能の抑制又は阻害により、当該細胞内のＣＤＰ－Ｒｂｏの存在量が少なくなる。その結果、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素の過剰発現との重畳的効果が得られ、グリセロールリン酸修飾基を有するリコンビナントαジストログリカンが当該細胞の表面に発現しやすくなり、グリセロールリン酸修飾基の存在率が高くなる。これは、グリセロールリン酸修飾基１の合成反応の競合反応（すなわち、タンデムのリビトールリン酸構造の形成反応）が相対的に起きにくくなることで、グリセロールリン酸修飾基１の合成反応がさらに起きやすくなるためである。

ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素としては、例えば、ＩＳＰＤ（Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。ＩＳＰＤは、ＣＲＰＰＡ遺伝子にコードされている。ただし、ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素はこの例示に限定されない。
ＩＳＰＤのアミノ酸配列及び立体構造は、例えば、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１５）２２：１６４３等の文献、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＩＤ：２ＸＷＬ）等のデータベースに記載されている。また、ＣＲＰＰＡ遺伝子の塩基配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（Ｅｎｔｒｙ Ａ４Ｄ１２６）等のデータベースに記載されている。本願において、ＩＳＰＤのアミノ酸配列及び立体構造については、これら文献、データベースの内容を援用できる。

ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の機能を抑制又は阻害させる方法は、特に限定されない。例えば、ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の発現量（転写量、翻訳量）を低減させる方法でもよく、ゲノムＤＮＡ中のＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素をコードする遺伝子に変異を導入して合成機能が低下したＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の変異体を発現させてもよい。
ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の発現量の低減に際しては、種々の遺伝子工学的手法を用いることができ、その具体的手法は特に限定されない。

リコンビナントαジストログリカンは、ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素が過剰発現した細胞から定法にしたがって、回収すればよい。リコンビナントαジストログリカンの回収に際しては、種々の分析的手法、タンパク質精製方法を用いることができ、その具体的手法は特に限定されない。

次いで、一実施形態の方法においては、回収したリコンビナントαジストログリカンを抗原として用いて、本実施形態の抗体又はその抗体断片を発現する動物細胞を得る。
例えば、リコンビナントαジストログリカンを用いて免疫した動物からハイブリドーマを調製してもよい。ハイブリドーマの中から、スクリーニングによってグリセロールリン酸修飾基と良好に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、当該ハイブリドーマをクローニングし、抗グリセロールリン酸修飾抗体のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを本実施形態の抗体等を発現する動物細胞としてもよい。

ハイブリドーマの調製に際しては、例えば、リコンビナントαジストログリカンを、動物に対して、希釈剤、アジュバントとともに抗体産生が可能な部位に投与し、動物を免疫することができる。希釈剤としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等が挙げられる。
抗原等の投与量、投与間隔は特に限定されない。定法にしたがって投与量、投与間隔を設定できる。
動物としては、例えば、マウス、モルモット、ラット、ヤギ、サル、アカゲザル、イヌ、ウサギ、ウシ、ニワトリ、ネコ、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ラクダ等が挙げられる。なかでも、マウス、ラットが好ましい。

ハイブリドーマの調製方法、培養方法は、特に限定されない。また、グリセロールリン酸修飾基と良好に反応する抗体のスクリーニング、クローニングの具体的手法も特に限定されない。これらの具体的な方法は、種々の実験的プロトコールにしたがって行うことができる。

＜核酸＞
本発明の一実施形態は、上述した抗体又はその抗体断片をコードする核酸を提供する。本実施形態の核酸を発現させることにより、抗体又はその抗体断片を製造できる。

本実施形態の核酸としては、例えば、上述した抗体の重鎖可変領域遺伝子、上述した抗体の軽鎖可変領域遺伝子、上述した抗体の重鎖可変領域遺伝子の一部をコードする遺伝子、上述した抗体の軽鎖可変領域遺伝子の一部をコードする遺伝子、上述した抗体の重鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする遺伝子等が挙げられる。

上述した抗体の重鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号１３に示す。また、上述した抗体の軽鎖可変領域遺伝子の塩基配列を配列番号１４に示す。本実施形態の核酸は、配列番号１３の塩基配列からなる核酸でもよく、抗体の重鎖可変領域をコードする核酸でもよい。また、本実施形態の核酸は、配列番号１４の塩基配列からなる核酸でもよく、抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸でもよい。

配列番号１３の塩基配列は、配列番号１３の塩基配列と相同な塩基配列と代替可能である。配列番号１３の塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、配列番号１３の塩基配列と６０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と７０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と８０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と８５～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と９０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と９５～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と９６～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と９７～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１３の塩基配列と９８～９９％の配列同一性を示す塩基配列が挙げられる。

配列番号１４の塩基配列は、配列番号１４の塩基配列と相同な塩基配列と代替可能である。配列番号１４の塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、配列番号１４の塩基配列と６０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と７０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と８０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と８５～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と９０～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と９５～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と９６～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と９７～９９％の配列同一性を示す塩基配列；配列番号１４の塩基配列と９８～９９％の配列同一性を示す塩基配列が挙げられる。

塩基配列の配列同一性は、例えば、基準塩基配列に対する対象塩基配列の配列同一性として、次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。次いで、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（２）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００ ・・・（２）

＜ベクター＞
本発明の一実施形態は、上述した核酸を含むベクターを提供する。本実施形態のベクターは、発現ベクターでもよい。本実施形態のベクターを適切な宿主に導入することにより、抗体又はその抗体断片を製造できる。

発現ベクターとしては、投与対象の細胞中で抗体又はその抗体断片を発現可能であれば特に限定されない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等が挙げられる。ただし、ベクターはこれらの例示に限定されない。

発現ベクターにおける、抗体又はその抗体断片の発現用プロモーターは特に限定されない。例えば、ｌａｃプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、ポリヘリドンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。ただし、発現用プロモーターはこれらの例示に限定されない。

発現ベクターは、発現用プロモーター以外に他の構成要素をさらに有してもよい。発現ベクターにおける他の構成要素としては、例えば、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等が挙げられる。ただし、発現ベクターにおける他の構成要素はこれらの例示に限定されない。

＜形質転換体＞
本発明の一実施形態は、上述したベクターを含む形質転換体を提供する。本実施形態の形質転換体又はその培地等より、抗体又はその抗体断片を製造できる。

形質転換体としては、例えば、上述したベクターが導入された、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の培養細胞；上述したベクターが導入された、カイコ等の昆虫生体；上述したベクターが導入された、タバコ等の植物体；例えば、乳中、卵中に上述した抗体又はその抗体断片を発現するように遺伝子改変された、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリ等の動物等が挙げられる。ただし、形質転換体はこれらの例示に限定されない。

＜がん診断薬＞
本発明の一実施形態は、下記（ａ）の抗体又はその抗体断片を含むがん診断薬を提供する。
（ａ）αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基と結合する抗体であり、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１；配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２；及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３；を有する、重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１；配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２；及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３；を有する、軽鎖可変領域とを有する、抗体又はその抗体断片。

前記（ａ）の抗体又はその抗体断片においては、重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含んでもよい。また、前記（ａ）の抗体又はその抗体断片においては、重鎖が配列番号９のアミノ酸配列からなるものでもよく、軽鎖が配列番号１０のアミノ酸配列からなるものでもよい。

前記（ａ）の抗体又はその抗体断片において、配列番号１～１０のアミノ酸配列の詳細は、＜抗体又はその抗体断片＞の項において配列番号１～１０のアミノ酸配列について説明した内容と同内容である。

がん診断薬は、前記（ａ）の抗体、前記（ａ）の抗体断片以外の他の成分をさらに含んでもよい。
他の成分は、典型的には、薬学的に許容される担体、添加剤である。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、崩壊剤、流動性促進剤等が挙げられる。
他の成分は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ただし、他の成分は、これらの例示に制限されない。

がん診断薬の使用方法は特に限定されない。例えば、診断対象から採取した細胞を含む組織とがん診断薬との結合能を評価する方法が挙げられる。具体例には、診断対象から採取した試料とがん診断薬とを接触させ、がん診断薬中の抗体又はその抗体断片が試料中の細胞由来のグリセロールリン酸修飾基と結合したか否かを検出する方法が挙げられる。試料とがん診断薬とを接触させる際には、抗体又はその抗体断片を基板に結合して固定して、基板上で結合の有無を検出してもよい。

がん診断薬の使用対象、すなわち、診断対象は、がんに罹患し得る動物種であればよく、特に限定されない。例えば、ヒト、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳類が挙げられるが、これらの例示に制限されない。

診断目的としてのがん種は、特に限定されないが、グリセロールリン酸修飾基が高発現していることが好ましい。例えば、後述の実験例に示すように、大腸癌においてはグリセロールリン酸修飾基が高発現していることを本発明者は確認している。加えて、ステージＩ～ＩＶにかけて大腸癌の悪性度が高くなるにつれてグリセロールリン酸修飾基が高発現していることも確認されている。
ただし、αジストログリカンは、細胞外マトリックスとの結合能と関与していることから、大腸癌以外のがん種であってもグリセロールリン酸修飾基を有するαジストログリカンが高発現している可能性がある。したがって、診断目的としてのがん種は、大腸癌に限定されない。今後の実験等により大腸癌以外のがん種についても、本実施形態のがん診断薬の適用性が実証されるであろうと期待できる。

以上説明した本実施形態のがん診断薬によれば、診断対象の動物種ががんに罹患しているか否かについて、診断結果、予測結果を得られる。このように、本実施形態のがん診断薬は、あくまでも診断対象の動物種ががんに罹患しているか否かの診断結果、予測結果を得ることを目的としたものであり、がん細胞の死滅のような治療効果を得ることを目的としたものではない。

次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されない。

＜実験例１：ＨＣＴ１１６変異細胞＞
以下の実験例では、ＷＴのＨＣＴ１１６細胞に加えて、以下の３種類のＨＣＴ１１６変異細胞を使用した。

（ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮ）
ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮは、ＦＫＴＮが欠損したＨＣＴ１１６変異細胞である。ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮは、非特許文献１に記載の方法にしたがって調製した。

（ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ）
ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤは、ＩＳＰＤが欠損したＨＣＴ１１６変異細胞である。ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤは、非特許文献１に記載の方法にしたがって調製した。

（ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤ）
ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤは、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤにおいてＴａｇＤを過剰発現させたＨＣＴ１１６変異細胞である。ＴａｇＤは、グラム陽性菌由来のＣＤＰ－Ｇｒｏ合成酵素である。したがってＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤにおいては、ＣＤＰ－Ｇｒｏ合成酵素が過剰発現している。
ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤは、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤにＴａｇＤ発現用ベクターを導入し、ＴａｇＤの発現を誘導して得た。ＴａｇＤ発現用ベクターは、哺乳細胞発現用ベクターｐＣＡＧ－Ｎｅｏ（富士フイルム和光純薬株式会社）のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩの制限酵素切断部位に、ＴａｇＤをコードする人工核酸を組み込んで得た。ＴａｇＤをコードする人工核酸は、ＦＡＳＭＡＣ社に受託合成した。受託合成した人工核酸の塩基配列は配列番号１５に示す。
図３は、抗ラミニン結合性糖鎖抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。ＴａｇＤの過剰発現の有無（＋－）でラミニン結合性糖鎖の発現の有無が変化し、具体的には、ＴａｇＤの過剰発現（＋）によりラミニン結合性糖鎖のバンドが消失している。このことから、ＴａｇＤの過剰発現によりリビトールリン酸構造の形成の競合反応、すなわち、グリセロールリン酸修飾基の形成反応が起きやすくなり、グリセロールリン酸修飾基が高発現していることが期待された。

野生型（ＷＴ）のＨＣＴ１１６細胞と各変異細胞について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）による質量分析を行い、グリセロールリン酸修飾、リビトールリン酸構造の発現を確認した。各変異細胞のグリセロールリン酸修飾、リビトールリン酸構造のそれぞれの発現傾向を表１に示す。表１中、「△ＦＫＴＮ」は、ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮであり、「△ＩＳＰＤ」は、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤであり、「△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤ」は、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤである。

ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮでは、グリセロールリン酸修飾、リビトールリン酸構造のいずれも発現が認められにくい。
ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ及びＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤでは、グリセロールリン酸修飾が高発現する傾向がある。一方、リビトールリン酸構造の発現は認められにくい。そして、グリセロールリン酸修飾基は、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤの方が、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤより高発現する傾向がある。

＜実験例２：リコンビナントαジストログリカンの発現＞
１０ｃｍの細胞用シャーレを用い、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤを５％のＣＯ_２存在下、３７℃で培養した。次いで、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤにリコンビナントαジストログリカンをコードする配列番号１２の発現用プラスミドを２５μｇ導入した。発現用プラスミドの導入に際しては、ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｍａｘ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。発現用プラスミドの導入後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したＤＭＥＭ培地（ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養し、リコンビナントαジストログリカンを発現させた。リコンビナントαジストログリカンの発現時の培養条件は、５％のＣＯ_２存在下で３７℃、７２時間とした。
培地を回収し、プロテインＧアフィニティカラムを用いて培地からリコンビナントαジストログリカンを精製した。プロテインＧアフィニティカラム樹脂はＰＢＳバッファーで洗浄し、ｐＨ２．５のグリシンバッファーで溶出させた。溶出液はトリス塩酸バッファーでｐＨを中性に調製した。精製後、リコンビナントαジストログリカンをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画化した。

実験例２で使用したリコンビナントαジストログリカンのアミノ酸配列は、配列番号１１に示した。図４は、αジストログリカンの一次構造を示す図である。
図４の上段に示すように、通常、αＤＧ（ジストログリカン）は、内因性プロセシングでＮ末端ドメイン（Ｎ－ｔｅｒｍ）が失われ、Ｑ^３１３から始まるポリペプチドである。また、ムチン様ドメイン中に存在するＴｈｒ^３１７／Ｔｈｒ^３１９はラミニン結合性糖鎖形成に必要である。
実験例２で使用したリコンビナントαジストログリカンは、図４中、中段及び下段で、「αＤＧ３７３（Ｔ３２２Ｒ）－Ｆｃ」として示した。αＤＧ^３７３（Ｔ^３２２Ｒ）－Ｆｃは、通常のαＤＧのムチン様ドメイン及びＣ末端ドメインの代わりに、ＦｃドメインがＲ^３７３に融合されている。αＤＧ^３７３（Ｔ^３２２Ｒ）－Ｆｃをトリプシンで処理すると、２つのラミニン結合性糖鎖が結合するスレオニン部位を有する１０アミノ酸からなるペプチドが得られる。

＜実験例３：抗グリセロールリン酸修飾抗体のクローニング及びシーケンシング＞
ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤから単離したリコンビナントαジストログリカンをＰＢＳバッファーに懸濁し、Ｔｉｔｅｒ ＭＡＸ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ社）と１：１の比率で最終容量が２００μＬとなるように５分間混合し、抗原懸濁液を得た。得られた抗原懸濁液を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスを皮下免疫した。投与間隔は２週間とし、合計３回投与した。各投与量は、２０～４０μＬとし、尾基部の両側に投与した。
最終免疫の３日後に、２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの鼠径リンパ節からのリンパ球を、ＥＣＦＧ２１（ＮＥＰＡＧＥＮＥ）を用いてＳｐ２／０－Ａｇ１２骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを調製した。次いで、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を添加したＨＡＴ培地ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中でハイブリドーマを培養した。
ハイブリドーマ培養液の上清液を回収し、上清液と各ＨＣＴ１１６変異細胞との差動反応性をフローサイトメトリーにより分析した。ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮよりもＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤと反応性に優れる抗体を分泌するハイブリドーマを限界希釈によりクローニングした。

次いで、市販のキット（商品名「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ」、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出した。続いて、市販のキット（商品名「ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’Ｋｉｔ」、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ）法による完全長ｃＤＮＡを合成した。

次いで、マウス抗体重鎖定常領域、及びマウス抗体軽鎖定常領域に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーの塩基配列を配列番号１６、１７に示す。

次いで、得られたＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法によりシークエンスした。続いて、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を用いて、得られた塩基配列及び当該塩基配列から予測されるアミノ酸配列を解析し、抗グリセロールリン酸修飾抗体を樹立した。

表２に、抗グリセロールリン酸修飾抗体の塩基配列、アミノ酸配列と、配列表の配列番号との対応を示す。

＜実験例４：抗原－抗体結合能の評価＞
（抗グリセロールリン酸修飾抗体と抗原との相互作用）
抗グリセロールリン酸修飾抗体について、下記の２種類のαジストログリカンとの結合能をウエスタンブロッティングで分析した。
・（α１）ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤ細胞由来のリコンビナントαジストログリカン。
・（α２）ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮから回収、精製したリコンビナントαジストログリカン。

（α１）は、実験例３でＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫に用いたものであり、グリセロールリン酸修飾基を有する。一方、（α２）は、グリセロールリン酸修飾基が発現していないＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮに由来することから、グリセロールリン酸修飾基を有さないと考えられる。
図５に示すウエスタンブロッティングの結果のように、抗グリセロールリン酸修飾抗体は、（α１）に対して（α２）より優れた結合能を示した。この結果から、本抗体は、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基に対して特異的に結合することを確認できた。

（抗グリセロールリン酸修飾抗体を用いたフローサイトメトリー）
ＷＴのＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮ、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤの４種の各細胞を使用し、フローサイトメトリーを行った。
まず、培地を取り除きＰＢＳバッファーで洗浄した後、０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ／２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳバッファーを加え、３７℃で３分静置後、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）ｍｅｄｉｕｍを添加した。その後遠心して上清を取り除きＰＢＳバッファーで洗いＦＡＣＳチューブに移した。さらに遠心して上清を取り除き、一次抗体として実験例３で得たハイブリドーマの培養上清を加え、氷上で２０分静置した。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーで洗い、遠心して上清を取り除いた後、二次抗体として、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＭ（２．０μｇ／ｍｌ）を添加し、氷上で２０分静置した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗い、遠心してフィルター滅菌済ＰＢＳバッファーで懸濁し、フローサイトメトリーを行った。

図６は、フローサイトメトリーの結果を示す。抗グリセロールリン酸修飾抗体は、グリセロールリン酸修飾基の発現がないＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮ細胞、グリセロールリン酸修飾基の発現が乏しいＷＴのＨＣＴ１１６に対して１０～３０％程度の反応性を示した。一方で、本抗体は、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ細胞に対して５０％程度の反応性を示し、ＴａｇＤが過剰発現したＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤでは５０～８０％程度の反応性を示した。このように、グリセロールリン酸修飾基の発現量の増加に伴い、反応性が上昇することから、本抗体は、細胞表面に発現したグリセロールリン酸修飾基に特異的な結合能を具備していることを確認できた。

＜実験例５：免疫染色＞
ＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮ、ＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤを、５％ＣＯ_２中、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中、３７℃で培養した。次いで、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを加えて室温３０分静置し固定化させた。ＰＢＳで洗い、免疫組織染色用ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｎｅ ｈｉｓｔｏ、ナカライテスク）を加えて室温１０分（又は３％ＢＳＡを含むＰＢＳを加えて室温１時間半）ブロッキングを行った。抗グリセロールリン酸修飾抗体を一次抗体液として添加し、一晩４℃で静置して染色した。ＰＢＳで洗い、二次抗体液を加えて４℃で一時間静置し、さらにＰＢＳで洗浄した。細胞にはその後核染色溶液（ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ＤＯＪＩＮＤＯ）５μｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を添加し、次いで遮光して室温で５分間静置した。続いてＰＢＳで洗い、封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、カバーガラスをかける際にカバーガラスとプレートの間に充填させた。その後蛍光顕微鏡でプレートを観察した。

グリセロールリン酸修飾基の発現量が多いＨＣＴ１１６△ＩＳＰＤ＋ＴａｇＤにおいては、グリセロールリン酸修飾基が発現しないＨＣＴ１１６△ＦＫＴＮと比較して蛍光強度の高い染色像が認められた（図７）。図７の染色像のように、抗グリセロールリン酸修飾抗体を用いた免疫染色により、グリセロールリン酸修飾基の発現の発現量に依存した染色像を得ることができた。なお、図７では細胞核を青色で示し、抗グリセロールリン酸修飾抗体による染色を赤色で示した。

（抗グリセロールリン酸修飾抗体を用いた大腸癌組織免疫染色）
転移性の大腸癌細胞を用いた以外は、上記と同様にして、抗グリセロールリン酸修飾抗体を用いて大腸癌組織を染色する組織免疫染色を行った。結果を図８に示す。
図８の上段の右側の写真に示すように、抗グリセロールリン酸修飾抗体によれば大腸癌組織のグリセロールリン酸修飾基（ＧｒｏＰ）を免疫染色することができた。
図８の下段に示すように、大腸癌のステージがステージＩＶへと段階的に進行するにしたがって、グリセロールリン酸修飾基が高発現する傾向があることを確認した。特に、ステージＩＶの大腸癌組織においては、およそ７５％がグリセロールリン酸修飾基の発現陽性率を示した。
この結果から、抗グリセロールリン酸修飾抗体によれば、がん組織上のグリセロールリン酸修飾基を特異的に認識できることが示唆された。したがって、がん診断薬への適用の可能性が充分に期待できる。

本発明によれば、αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基を特異的に認識する技術を提供できる。

１ グリセロールリン酸修飾基
２ リン酸化三糖構造
３ Ｎ－アセチルガラクトサミン
４ Ｎ－アセチルグルコサミン
５ リン酸化マンノース
６ αジストログリカン
７ ＣＤＰ－Ｇｒｏ

Claims (9)

1. αジストログリカンのグリセロールリン酸修飾基と結合する抗体又はその抗体断片であり、
   配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１；配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２；及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３；を有する、重鎖可変領域と、
   配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１；配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２；及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３；を有する、軽鎖可変領域と、
   を有する抗体、又はその抗体断片。
2. 前記重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗体断片。
3. 前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗体断片。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗体断片の生産方法であり、
   ＣＤＰ－Ｇｒｏの合成酵素を細胞中で過剰発現させ、次いで、前記細胞で発現したグリセロールリン酸修飾基を有するリコンビナントαジストログリカンを抗原として用いて、前記抗体又はその抗体断片を発現する動物細胞を得ることを特徴とする、方法。
5. 前記リコンビナントαジストログリカンの発現に際して、さらに、ＣＤＰ－Ｒｂｏの合成酵素の機能を抑制又は阻害することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗体断片をコードする、核酸。
7. 請求項６に記載の核酸を含む、ベクター。
8. 請求項７に記載のベクターを含む、形質転換体。
9. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗体断片を含む、がん診断薬。

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