WO2005035582A1 - Ｃｃｒ４に特異的に結合する抗体組成物 - Google Patents

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antibody
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acid sequence
chain
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Shigeru Iida
Mitsuo Satoh
Miho Inoue
Masako Wakitani
Kazuhisa Uchida
Rinpei Niwa
Kenya Shitara
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • Antibody composition that specifically binds to CCR4.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a recombinant antibody molecule that specifically binds to human CC chemokine receptor 4 (hereinafter referred to as CCR) and has an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region.
  • CCR human CC chemokine receptor 4
  • An antibody composition wherein the N-glycoside-linked complex-type sugar chain is a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetyltyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain; a transformant producing the antibody product;
  • the present invention relates to a method for producing an antibody composition and a medicine containing the antibody composition.
  • Allergic diseases such as bronchial asthma are formed by various factors such as eosinophils, mast cells, IgE, cytokines and chemokines [Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152, 2059 (1995), Immunol. Today, 15, 19 (1994)].
  • Th cells CD4 positive helper T cells
  • activated Th cells are increased in airway cells of bronchial asthma patients and peripheral blood [ Am. Rev. 'Respir. Dis., 145, S22 (1992)].
  • IL-4 and IL-5 are elevated [Clin. Immunol. Immunopathol., 75, 75 (1995)]. These cytokins are produced by Th2 cells among helper cells. Therefore, ⁇ 1 ⁇ 2 cells are linked to allergic diseases. '
  • Therapeutic methods for immune diseases mediated by Th cells include 1) antagonists of cytokines and chemokines 2) inhibitors of cytokines and chemokine production 3) regulators of inflammatory cell functions 4) chemical mediators, etc. However, they are only radically inhibiting a part of the complex cytokine-chemokine-inflammatory cell network and are not radical.
  • Anti-CD4 antibodies can be used to control cells, but CD4 is widely expressed in immunocompetent cells and thus has the disadvantage of lacking specificity and being accompanied by strong immunosuppressive action [Int. Arch. Immunol., 118, 133 (1999)]. Steroids are the main treatment for Th2 cell-mediated immune diseases, but steroids have strong side effects.
  • CCR Human CC chemokine receptor 4
  • K5-5 from human immature basophil cell line KU-812.
  • WO96 / 23068 J. Biol. Chem., 270, 19495 (1995)
  • CCR4 is an effector / memory T cell [Int. Immunol., 11, 81 (1999)], and is reported to be expressed in memory cells involved in systemic immunity [Nature, 400, 776 (1999)].
  • memory T cells which are activated when inflammation is induced, migrate to local inflammation via CCM via ligands MDC and TARC and activate other inflammatory cells. There is a strong indication that it may be encouraged.
  • adult T-cell leukemia leukemia including mycosis fungoides, lymphoma In ', it has been reported that CCR4 is expressed on the tumor cell surface [Blood, 96, 685 (200
  • therapeutic agents for removing CCR4-expressing cells from patients are effective not only for Th2 cell-mediated immune diseases but also for CCR-mediated inflammatory diseases and leukemias. It is expected.
  • therapeutic agents targeting such specific molecules the following antibodies against CCR4 are known.
  • Antibodies against CCR include 1G1 and 2B10 antibodies (WO00 / 42074), which have receptor neutralizing activity, and antibodies (WO02 / 15666), which have angiogonist activity.These antibodies are hybridomas. Is an antibody produced by In addition, a human IgGl anti-CCR4 human CDR-grafted antibody that specifically reacts with the extracellular region of human CCR4, has no reactivity with platelets, and has cytotoxic activity against human CCR4-expressing cells is known. (W003 8635).
  • Humanized antibodies can be prepared as various forms of molecules because they are prepared using genetic recombination technology. For example, a humanized antibody having a high effector function can be produced [Caneer Res., 56, 1118 (1996)].
  • Human IgG'l subclass antibodies express ADCC activity and CDC activity through the interaction between their Fc region and the antibody receptor (hereinafter referred to as FcaR) or various complement components.
  • FcaR antibody receptor
  • various complement components In the binding between the antibody and FcaR, it is suggested that the sugar chain binding to the hinge domain of the antibody and the second domain of the C region (hereinafter referred to as C ⁇ 2 ′ domain) is important. [Chemical Immunology, 65, 88, (1997)].
  • Antibodies vary in the addition of galactose to the non-reducing end of the complex N-glycoside-linked sugar chain bound to the Fc region of the IgG molecule, and the addition of fucose to the N-acetylglucosamine at the reducing end. [Biochemistry, 36, 130 (1997)], and it has been reported that the addition of fucose to N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain significantly reduces the ADCC activity of the antibody. [WO00 / 61739, J. Biol. Chem., 278, 3466 (2003)].
  • antibody compositions used as pharmaceuticals are produced using genetic recombination techniques and are produced using animal cells, such as CH0 cells derived from Chinese nomster ovary tissue, as host cells.
  • animal cells such as CH0 cells derived from Chinese nomster ovary tissue
  • the sugar chain structure of the antibody composition varies depending on the host cell.
  • the composition comprising an antibody molecule having an Fc region can be added to the composition. It is possible to increase the ratio of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the complex N-glycoside-linked sugar chain that binds to the Fc region contained therein (C / 31140).
  • An object of the present invention is to provide a composition comprising a recombinant antibody molecule that specifically binds to human CC chemokine receptor 4 (hereinafter, referred to as CCR4) and has a complex N-glycoside-linked sugar chain in the Fc region.
  • CCR4 human CC chemokine receptor 4
  • An antibody composition wherein the N-glycoside-linked complex-type sugar chain is a sugar chain in which fucose is not linked to N-acetylglycamine at the reducing end of the sugar chain; a transformant producing the antibody composition;
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an antibody composition and a medicament containing the antibody composition.
  • the anti-CCR4 antibody composition of the present invention does not contain an antibody molecule having a sugar chain to which fucose is bound, the effector function is enhanced. Therefore, it is useful for the treatment of reducing the number of CCR4-expressing ⁇ 1 ⁇ 2 cells from a patient's body.
  • treatment with chemotherapy and radioisotope-labeled compounds is not required, which is expected to reduce side effects on patients. Is done.
  • reducing the dosage of therapeutic agents to patients is expected to reduce the burden on patients.
  • the present invention relates to the following (1) to (55).
  • An antibody composition comprising a recombinant antibody molecule which specifically binds to human CC chemokine receptor 4 (CCR4) and has a ⁇ -glycoside-linked complex type glycan in an Fc region, comprising an N-glycoside-linked
  • An antibody composition wherein the complex type sugar chain is a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • the N-glycoside-linked complex-type sugar chain is a sugar chain in which the 1-position of fucose is not bonded to the 6-position of N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • Antibody composition is a sugar chain in which the 1-position of fucose is not bonded to the 6-position of N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • the binding to the peptide in which at least one of the 16, 19, 20 and 20th tyrosine residues is sulfated is determined.
  • the antibody composition according to (7) which has lower binding ability to a peptide containing amino acids 13 to 25 of the amino acid sequence represented by No. 36.
  • CDRs Complementarity determining regions
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, and the light chain (L chain) V region of the antibody molecule is represented by SEQ ID NO: 23.
  • CDR Complementarity-determining region of heavy chain (H chain) variable region (V region) and light chain (L chain) V region of monoclonal antibody that specifically binds to human CC chemokine receptor (CCR4)
  • CCR4 human CC chemokine receptor
  • FR framework region of the H chain V region and L chain V region of the human antibody, and the H chain constant region (C region) and the L chain C region of the human antibody.
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, or the 40th Ala, 42nd Gly, 43 amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24.
  • Lss including an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Gly at position 44, Lys at position 76, and Ala at position 97 has been replaced with another amino acid residue;
  • the antibody composition according to any one of (26).
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, Thi "at position 28 and Ala at position 97.
  • the light chain (L chain) variable region (V region) of the antibody molecule has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or the second Ile, third Val, 50 amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 (24)
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, Ala at position 40, Gly at position 42, Glyte at position 43 Lyss contains an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Gly at position 44, Lys at position 76, and Ala at position 97 has been substituted with another amino acid residue, and the light chain of the antibody molecule (L chain)
  • the V region consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, from the 2nd Ile, 3rd Val, 50th Gln, and 88th Val
  • the antibody composition according to any one of (24) to (27) and (29), wherein at least one selected amino acid residue contains an amino acid sequence substituted with another amino acid residue.
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule is selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, or the 28th Thr and 97th Ala of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • the light chain (L chain) V region of the antibody molecule has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, wherein at least one amino acid residue is substituted with another amino acid residue.
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule is represented by SEQ ID NO: 24, 25, 27, 2
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule has an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: M, 25, 27, 28, 29, 30, 31 and 32; and
  • the light chain (L chain) V region of the antibody molecule comprises an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33, 34, and 35 (24;) to (26), (32), and (33)
  • the antibody composition according to any one of the above.
  • the heavy chain (H chain) variable region (V region) of the antibody molecule contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or, and the light chain (L chain) V region of the antibody molecule is SEQ ID NO: 35
  • the host cell must have an intracellular sugar nucleotide, GDP-an enzyme involved in the synthesis of fucose, or an N-glycoside-linked complex-type bran chain reducing end, N-acetylglucosamine at position 6 with fucose at position 1.
  • the transformant according to (36) which is a cell whose genome has been modified so as to inactivate an enzyme involved in sugar chain decoration to be bound.
  • the host cell binds the 1st position of fucose to the 6th position of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or N-acetylglucosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end. (36) The transformant according to (36), wherein all of the alleles on the genome of the enzyme involved in sugar chain modification are non-quantified cells. '
  • GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase is a protein encoded by D.NA selected from the group consisting of the following (a) and (b): The transformant according to 39).
  • a medicament comprising the antibody composition according to any one of (1) to (35) and (50) as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for a human CC chemokine receptor (CCR4) -related disease comprising as an active ingredient the antibody composition according to any one of (1) to (35) and (50).
  • CCR4 human CC chemokine receptor
  • a treatment for a human CC chemokine receptor 4 (CCR4) -related disease which comprises administering the antibody composition according to any one of (1) to (35) and (50) to a patient.
  • An antibody composition comprising a recombinant antibody molecule of the present invention which specifically binds to human CCM and has an N-glycoside-linked complex type sugar chain in an Fc region, wherein the N-glycoside-linked complex type sugar chain is Sugar chain reduction
  • the N-glycosidic complex type sugar chain is composed of the N-acetylglucosamine of the sugar chain reducing terminal.
  • Antibody molecules have Fc regions, to which N-glycoside-linked sugar chains are attached. Therefore, two sugar chains are bound per antibody molecule.
  • the N-glycoside-linked sugar chain has one or more side chains of galactose-N-acetylglucosamine (hereinafter, referred to as Gal-GlcNAc) on the non-reducing end side of the core structure in parallel, and further comprises Gal- Complex sugar chains having sialic acid, bisecting N-acetylglycosamine, etc. on the non-reducing terminal side of GlcNAc can be mentioned.
  • Gal-GlcNAc galactose-N-acetylglucosamine
  • the complex N-glucoside-linked sugar chain is represented by the following chemical formula 1.
  • the sugar chain to which fucose is not bound may be any one in which fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end in the chemical formula shown above, and
  • the structure of the sugar chain may be any.
  • the antibody composition of the present invention may be composed of an antibody molecule having a single sugar chain structure as long as it has the above sugar chain structure, or may have a plurality of different sugar chain structures. It may be composed of an antibody molecule having the same.
  • the expression that fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain means that fucose is not substantially bound.
  • the antibody composition having substantially no fucose binding specifically refers to an antibody composition in which fucose is not substantially detectable in the sugar chain analysis described in 4 below. Substantially undetectable means that it is below the detection limit of the measurement.
  • the antibody composition of the present invention in which fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain has high ADCC activity.
  • Percentage of antibody molecules having a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain contained in an antibody composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region
  • an antibody composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region
  • known methods such as hydrazine degradation and enzymatic digestion from antibody molecules [Biochemical Experimental Method, Protein Glycoprotein Research Method (Society Press Center), Takako Reiko (ed., 1989)]
  • release sugar chains and release release
  • the labeled sugar chain can be determined by labeling the sugar chain with a fluorescent label or an isotope, and separating the labeled sugar chain by one-way chromatography.
  • the released sugar chains can be determined by analyzing by HPAED-PAD method [Journal of Liquid Chromatography (j, Liq. Chromatogr.), 6, 15
  • the antibody composition of the present invention is an antibody composition comprising a recombinant antibody molecule that specifically reacts with the extracellular region of human CCR4, wherein the ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain has a reducing terminal of the sugar chain.
  • the antibody composition is a sugar chain in which fucose is not bound to ⁇ -acetylglucosamine, and among them, an antibody substance that does not show reactivity with human platelets is preferable.
  • the extracellular region of human CC is represented by an amino acid sequence containing amino acids 1 to 39, 98 to 112, 176 to 206 or 271 to 284 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, and preferably represented by SEQ ID NO: 36. 2 to 29 of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 37), more preferably 12 to 29 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 (SEQ ID NO: 38), still more preferably one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 36 Polypeptides or peptides represented by the 2nd to 25th positions are exemplified.
  • the antibody composition of the present invention preferably comprises a region containing amino acids 1 to 39, 98 to 112, 176 to 206 or 271 to 284 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, more preferably SEQ ID NO: 2 to 29 (SEQ ID NO: 37) of the amino acid sequence represented by 36, more preferably 12 to 29 (SEQ ID NO: 38) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, particularly preferably SEQ ID NO: 36
  • An antibody composition which specifically reacts with the polypeptide or ⁇ peptide represented by the 12th to 25th amino acids in the amino acid sequence, wherein the ⁇ -glycosidic complex glycan is a ⁇ -glycan at the reducing end of the glycan.
  • An antibody composition that is a sugar chain in which fucose is not bound to acetylglycosamine is exemplified.
  • the term "reactive with human platelets” means that the antibody does not substantially react with human platelets.
  • measurement using a device such as a flow cytometer that can detect the binding between the antibody and cells is used. No response.
  • the antibody composition of the present invention at least one of tyrosine residues at positions 16, 19, .20 and 22 of the peptide containing the amino acids 13 to 25 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 is sulfated.
  • An antibody composition having a lower binding property to the obtained peptide than the binding property to a synthetic peptide containing the 13th to 25th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 can be mentioned.
  • the antibody composition of the present invention includes a recombinant antibody having no activity of inhibiting the binding of the CCR4 ligand TARC (thymus and activation-regulatated ceraokine) or MDC (macrophage-derived cemokine) to CCR4.
  • Compositions. Having no activity of inhibiting the binding of CCR4 ligand TARC or MDC to CCR4 means that the antibody composition cannot substantially inhibit the binding between the ligand and the receptor. This means that even when the composition is in a high concentration, it does not affect the binding between the ligand and the receptor.
  • “high concentration” means that the concentration of the antibody is 50 ⁇ g / mL or more.
  • the antibody composition of the present invention includes a gene recombination that specifically binds to cells expressing human CCR4 (hereinafter referred to as human CCR4 expressing cells) and has an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region.
  • human CCR4 expressing cells include helper T2 cells (hereinafter referred to as Th2 cells).
  • Th2 cells are cells that produce interleukin_4 (hereinafter, referred to as IL-4), interleukin-5 (hereinafter, referred to as IL-5) and interleukin-13 (hereinafter, referred to as IL-13) It is.
  • IL-4 interleukin-4
  • IL-5 interleukin-5
  • IL-13 interleukin-13
  • cytotoxic activity include complement-dependent cytotoxic activity (hereinafter referred to as CDC activity) and antibody-dependent cytotoxic activity (hereinafter referred to as ADCC activity).
  • An antibody composition having cytotoxic activity against human CCR4-expressing cells wherein the N-glycoside-linked complex type sugar chain is a sugar chain in which fucose is not linked to N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • Certain antibody compositions can remove Th2 cells by damaging Th2 cells, which are human CCR4-expressing cells, by the cytotoxic activity of the antibody composition. Therefore, the antibody composition can suppress production of interleukins such as IIHk IL-5 and IL-13 from h2 cells.
  • the antibodies of the present invention include human chimeric antibody compositions, human CDR-grafted antibody compositions and human antibody compositions, and antibody fragment compositions thereof.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody consisting of VH and VL of a non-human animal antibody and CH and CL of a human antibody.
  • any animal can be used as long as hybridomas can be produced, such as mice, rats, hamsters, and rabbits.
  • the human chimeric antibody composition of the present invention obtains cDNAs encoding VH and VL of non-human animal antibodies specifically reacting with human CCR4, and has genes encoding human antibody CH and CL.
  • the expression vector can be produced by constructing a human-type chimeric antibody expression vector by inserting it into an animal cell expression vector and introducing it into animal cells.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any one belonging to human immunoglobulin (hereinafter, referred to as hlg), but is preferably of the hlgG class, and more preferably belongs to the hlgG class, higG hIgG2 s hIgG3, Any of the subclasses such as gG4 can be used.
  • hlg human immunoglobulin
  • CL the CL of the human chimeric antibody
  • any CL belonging to hlg may be used, and class CL or I class CL can be used.
  • the human quinula antibody composition that specifically binds to human CCR4 of the present invention includes VH CDR1, CDR2, CDR3 and / or VH consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 14, 15 and 16, respectively. 17, 18, the VL comprising the amino acid sequence represented by 19 CDRl, CD 2 S antihuman CCR4 Kinura antibodies comprising CDR3 S, amino acid sequence and / or VL SEQ ID NO: VH of the antibody are shown in SEQ ID NO: 21 23
  • An anti-human CCR4 quinula antibody containing an amino acid sequence represented by, the VH of the antibody is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 and the CH of the human antibody is composed of the amino acid sequence of the hlgGl subclass, and the VL of the antibody is SEQ ID NO: 23.
  • an anti-human CCR4 chimeric antibody composition comprising an amino acid sequence of the class consisting of an amino acid sequence represented by
  • the human CDR-grafted antibody means an antibody obtained by grafting the VH and VL CDRs of a non-human animal antibody into the appropriate positions of the human antibody VH and VL.
  • the human CDR-grafted antibody composition of the present invention is characterized in that the CDRs of V CDR and VL of an antibody of a non-human animal specifically reacting with CCR4 are converted into VH and VL frameworks of any human antibody (hereinafter referred to as FR).
  • An animal having a DNA encoding the heavy chain constant region (hereinafter, referred to as CH) and the light chain constant region (hereinafter, referred to as CL) of a human antibody Expression vector for cells To construct a human-type CDR-grafted antibody expression vector, and to express and produce the expression vector by introducing it into animal cells.
  • amino acid sequence of FRs of VH and VL of a human antibody any amino acid sequence derived from a human antibody can be used.
  • amino acid sequences of human antibody VH and VL FR amino acids registered in databases such as the Protein Data Bank, or the common amino acid sequences of human antibody VH and VL FR subgroups (Sequences of Proteins of Immunological In terest, US Dept. Health and Human Services, 1991).
  • the CH of the antibody of the present invention may be any CH as long as it belongs to Mg, but is preferably of the MgG class, and any subclass such as hIgGl, hIgG2, hIgG3 gG4 belonging to the hlgG class can be used.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody may be any of those belonging to hlg, and may be of class or ⁇ class.
  • the human CDR-grafted antibody composition of the present invention includes CDR1, CDR2, CDR3 of antibody VH consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOS: 14, 15, and 16, and / or SEQ ID NOs: 17, 18, and 19, respectively.
  • Examples include a human CDR-grafted antibody comprising VL CDR1, CM2, and CDR3 comprising the indicated amino acid sequence, or an antibody fragment composition thereof.
  • the VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, Ala at position 40, Gly at position 42, and Gly at position 43;
  • at least one amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or at least one of the 28th Thr and 97th Ala of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is substituted.
  • the G1 n and the .88 a A human CDR-grafted antibody comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from l is substituted is preferred, and the VH of the antibody is Ala at position 40, Gly at position 42 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:
  • An antibody comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Lys at position 43, Gly at position 44, Lys at position 6, and Ala at position 97 is substituted with another amino acid residue; and
  • at least one amino acid residue selected from the second Ile, the third Val, the 50th Gln, and the 88th Val has another amino acid residue.
  • a human CDR-grafted antibody composition comprising an amino acid sequence substituted with a residue, at least one amino acid wherein the VH of the antibody is selected from Thr at position 28 and Ala at position 97 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 Residue is another amino acid
  • a human CDR-grafted antibody composition comprising an amino acid sequence in which one amino acid residue is substituted with another amino acid residue is more preferred. .
  • a human CDR-grafted antibody composition comprising an amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, and 32, VL is a human CDR-grafted antibody composition comprising one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 26, 33, 34, and 35; VH of the antibody is SEQ ID NOs: 24, 25, 27, 28, Indicated by 29, 30, 31 and 32;
  • a human CDR-grafted antibody composition comprising an amino acid sequence selected from amino acid sequences and an VL of the antibody comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 26, 33, 34, and 35, and the like.
  • one or more amino acids have been deleted, added, substituted, and / or inserted, and specifically bind to the extracellular region of human CCR4, and are not reactive with human platelets. Fragments are also included in the antibody compositions of the present invention.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the antibody thread of the present invention means that one or more amino acid residues in one or more amino acid sequences in the same sequence Means that a plurality of amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added, and the deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added is naturally occurring. Regardless of type or unnatural type.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-asparaginic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L- Examples include methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tributophane, L-tyrosine, L-valine, and L-cysteine.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, norin, nornoline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butylylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid ''
  • Group D lysine, arginine, orditin, 2,4-diaminobonic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the recombinant antibody fragment composition of the present invention is an antibody fragment of the recombinant antibody composition that specifically binds to human CC, wherein the N-glycoside-linked complex type sugar chain is located at the reducing end of the sugar chain.
  • N-acetyl glu An antibody fragment composition comprising part or all of an antibody Fc region that is a sugar chain in which fucose is not bound to cosamine.
  • the antibody fragment compositions of the present invention include antibody fragment compositions such as Fab, Fab ⁇ F (ab ') 2 , scFv, diabody, dsFv, and peptides including CDRs, and N-glycoside-linked complex-type sugar chains.
  • An antibody fragment composition containing a part or all of an antibody Fc region, which is a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the sugar chain may be mentioned.
  • the fusion protein composition may be fused with a part or the whole of the Fc region, or may be a fusion protein composition with a protein containing a part or the whole of the Fc region.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with proteolytic enzyme papain (which is cleaved at the amino acid residue at position 224 of the H chain). About half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are disulfide. It is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, which is bound by bonding.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating the antibody composition of the present invention that specifically binds to human CCR4 with proteolytic enzyme papain.
  • DNA encoding the Fab of the antibody is introduced into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is expressed by introducing the vector into a prokaryotic organism. Can be manufactured.
  • F (a) ') 2 is a fragment obtained by treating IgG with the protease pepsin (which is cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain). It is a slightly larger antibody fragment with a molecular weight of about 100,000 and an antigen-binding activity.
  • F (ab ') 2 of the present invention can be obtained by treating the antibody composition of the present invention that specifically binds to human CCR4 with proteolytic enzyme pepsin.
  • the following Fab ′ can be prepared by a thioether bond or a disulfide bond.
  • Fab is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, in which the disulfide bond in the hinge region of F (ab') 2 is cleaved.
  • the 'Fab of the present invention' can be obtained by treating the F (ab ') 2 composition of the present invention which specifically binds to human CCR4 with a reducing agent dithiothreitol.
  • a DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody may be inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector may be expressed and produced by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. it can.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P).
  • P an appropriate peptide linker
  • the scFv of the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL of an antibody composition specifically binding to human CCR4 of the present invention, constructing a DNA encoding the scFv, and using the DNA as a prokaryotic expression vector.
  • the expression vector can be inserted into a eukaryotic expression vector, and then introduced into a prokaryote or eukaryote to express and produce it.
  • the diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and has a bivalent antigen-binding activity.
  • the divalent antigen-binding activities can be the same, or one can have a different antigen-binding activity.
  • the diabody of the present invention obtains a cDNA encoding the VH composition and VL of an antibody that specifically binds to the human CCR4 of the present invention, and replaces the scFv-encoding DNA with a P amino acid sequence having a length of 8 residues.
  • the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into the prokaryote or eukaryote to express the DNA. can do.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL has been substituted with a cysteine residue, which is linked via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • the dsFv of the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL of the antibody composition specifically binding to human CCR4 of the present invention, constructing a DNA encoding dsFv, and using the DNA as a prokaryotic expression vector. Alternatively, it can be produced by inserting into an eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. -
  • the peptide containing the CDR comprises at least one region of CDR of VH or VL.
  • Peptides containing more than one C can be linked directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing the CDR of the present invention is constructed by constructing ⁇ A encoding the VH and VL CDRs of the antibody composition specifically binding to human CCR4 of the present invention, and converting the DNA into a prokaryotic expression vector.
  • it can be produced by inserting the gene into a prokaryotic or eukaryotic organism by inserting the gene into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • Peptides containing CD can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained by introducing a DNA encoding an antibody molecule that specifically binds to human CCR4 into a host cell, wherein the transformant produces the antibody composition of the present invention. Any transformant is included as long as it is a transformant.
  • a specific example is a transformant obtained by introducing a DNA encoding an antibody molecule that specifically binds to human CCR4 into a host cell such as (a) or (b) below. Can be -
  • the genome so that the activity of the enzyme involved in glycosylation modification is inactivated ⁇ A modified cell.
  • the genome has been modified to inactivate the enzyme, which means that a mutation is introduced into the expression control region of the gene encoding the enzyme so that the expression of the enzyme is deleted, or the enzyme is deleted.
  • This refers to introducing a mutation into the amino acid sequence of the gene encoding the enzyme so as to activate the enzyme.
  • Introducing a mutation refers to modifying the base sequence such as deleting, substituting, inserting and / or adding a base sequence on the genome.
  • (c) a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity; and the like.
  • one or more amino acids are composed of an amino acid sequence in which deletion, substitution, insertion, and / or addition are performed, and GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose A protein having -3,5-epimmelase 'activity;
  • ⁇ 1,6-fucosyltransferase is an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is bonded to position 6 of N-acetylglycosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • the 1,6-fucosyltransferase includes a protein encoded by the following DNA (a), (b), (c) or (d):
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 one or more amino acids consist of a deletion, substitution, insertion, Z or addition amino acid sequence, and ⁇ 1,6-fucosyltransferase.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 and having 1,6-fucosyltransferase activity.
  • Intracellular sugar nucleotide The DNA encoding the amino acid sequence of the enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose is a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; represented by SEQ ID NO: 1 or 3 Examples include a DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence under stringent conditions and encodes a protein having an enzymatic activity involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose. - ⁇ '
  • the DNA encoding the amino acid sequence of 1,6-fucosyltransferase is DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6. And DNA encoding a protein that hybridizes under stringent conditions and has 1,6-fucosyltransferase activity.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, DNA such as ⁇ A consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 6, or a fragment thereof.
  • DNA refers to DNA obtained by using the colony 'hybridization method, plaque' hybridization method or the southern hybridization method, and more specifically, DNA derived from koDney or plaque. After hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7-1.0 M sodium chloride using a filter on which DNA was immobilized, 0.1- to 2-fold concentration of SSC solution
  • the composition of a 1 ⁇ concentration SSC solution is composed of 150 sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
  • the DNA which can be identified by washing the filter at 65 ° C. can be mentioned. Neubridization is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (hereinafter abbreviated as "Molecular” 1 ⁇ ⁇ Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (hereafter abbreviated as current protocol 'in' molecular biology), DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. It can be performed according to the method that has been performed.
  • DNA that can hybridize under stringent conditions Specifically, DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 6, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably DNAs having a homology of 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and is used for the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose.
  • a protein having an associated enzymatic activity, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 8 in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and 1,6-fucosyl A protein having transferase activity is described in Molecular Cloning, 2nd Edition, Current-Protocols, Molecular, BioBio, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more.
  • the number of amino acids is not particularly limited, but the number of amino acids may be deleted or substituted by a well-known technique such as the site-directed mutagenesis method described above. Alternatively, the number is such that it can be added, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • the present invention also comprises an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 7 or 8, and comprises: ⁇ GDP-mannose 4,6-dehydrase activity;
  • proteins having 4-keto-6-dexoxy-D-mannose-3,5-epimerase activity or ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity specifically, proteins having SEQ ID NOs: 2, 4, and 7, respectively, are used.
  • an amino acid sequence represented by 8 and analysis software such as' BLAST [J. Mol, Biol., 215, 403 (1990)] or FASTA CMethods in Enzymology, 183, 63 (1990)].
  • proteins having a homology of at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more. be able to.
  • the host cell used in the present invention that is, an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or N-glycol-linked complex type sugar chain reducing terminal N-acetylglucosamine at the 6th position of fucose
  • Any method can be used as a method for obtaining a host cell in which an enzyme involved in sugar chain modification to be bound is inactivated, as long as it can inactivate the target enzyme.
  • a method of inactivating the above-mentioned enzyme is a method of inactivating the above-mentioned enzyme.
  • any lectin that can recognize the sugar chain structure may be used.
  • I A misaligned lectin can also be used.
  • lentil lectin LCA from Lens Culinaris: Lentil Agglutinin
  • enduma lectin PSA Pea Lectin from Pi sum sativum
  • Zebra bean lectin VFA Agglutinin from Vicia faba
  • Evening lectin ML Lectin derived from Aleuria aurantia
  • Lectin-resistant cells are cells whose growth is not inhibited even when an effective concentration of lectin is given.
  • the effective concentration is a concentration at which cells before the genomic gene is modified (hereinafter also referred to as a parent strain) cannot grow normally, and preferably a concentration at which the cells before the genomic gene is modified cannot grow.
  • the concentration is the same, more preferably 2 to 5 times, further preferably 10 times, most preferably 20 times or more.
  • the effective concentration of lectin that does not inhibit growth may be appropriately determined depending on the cell line, and the effective concentration of normal lectin is 10 g / mL to 1 Omg / mL, preferably 0.5 mg / mL to 2.Omg / mL. mL.
  • the host cells for producing the antibody composition of the present invention include any cells as long as they can express the antibody composition of the present invention.
  • Examples include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and the like. These cells include those described in 1 below. Particularly, among animal cells, CH0 cells derived from Chinese hamster ovary tissue, rat myeloma cell line YB2 / 3HL.. P2.Gll .16Ag.20 cells, mouse Myeloma cell line NS0 cell, mass myeloma cell line SP2 / 0-Agl4 cell, SHK hamster kidney-derived BHK cell, antibody-producing hybridoma cell, human leukemia cell line Namalba cell, embryonic stem cell, fertilized egg cell, etc. preferable.
  • transformant of the present invention examples include a CH0 cell line derived from Chinese hamster ovary tissue into which the anti-CCR4 antibody gene of the present invention has been incorporated, and a transformant Ms705 / CCM derived from CH0 / DG4 cells.
  • Cells that produce the antibody composition of the present invention are prepared by preparing a host cell to be used for producing the antibody composition of the present invention by the method described below. It can be prepared by introducing a gene encoding an anti-human CCR4 antibody by the method described in 2 below. ⁇
  • the host cell used for the production of the cell of the present invention may be an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or fucose at position 6 of N-acetylglucosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end. It can be prepared by targeting the gene of an enzyme involved in glycosylation at the 1-position and using a gene disruption method.
  • enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include GDP-mannose 4,6-dehydrase (hereinafter referred to as GMD), GDP-4-keto-6- Deoxy-D-mannose-3,5-epimelase (hereinafter referred to as Fx).
  • GMD GDP-mannose 4,6-dehydrase
  • Fx GDP-4-keto-6- Deoxy-D-mannose-3,5-epimelase
  • N-glycoside-linked complex type sugar chain Specific examples of enzymes involved in sugar chain modification at
  • the genes referred to here include DNA or RNA.
  • the method of gene disruption includes any method that can disrupt the gene of the target enzyme.
  • Examples include the antisense method, ribozyme method, homologous recombination method, RNA-DNA oligonucleotide method (hereinafter referred to as RD0 method), RNA interference method (hereinafter referred to as RNAi method), retro Examples include a method using a virus, a method using a transposon, and the like. Hereinafter, these will be described specifically.
  • the host cell used for preparing the cell of the present invention is an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose. Alternatively, it targets the enzyme gene involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetylglycosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain, and Cell Engineering, 1, 239 (1993) ), Bio / Technology, 1L 1097-(1999), Hum. Mol.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside bond complex Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain Prepare cDNA or genomic DNA encoding
  • position 1 of fucose is located at position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the enzyme or N-glycoside-linked complex type sugar chain involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose.
  • a recombinant DNA fragment is prepared by inserting the prepared DNA fragment or its full length downstream of the promoter 'of an appropriate expression vector. I do.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain
  • a host cell used for preparing the antibody composition of the present invention can be obtained.
  • a host cell used for producing the antibody composition of the present invention can also be obtained. .
  • the host cells used to prepare the antibody composition of the present invention include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and other enzymes involved in the synthesis of the target intracellular sugar nucleotide, GDP-fucose.
  • 1-fucose at position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain Any of those having a gene for an enzyme involved in sugar chain modification at which a position is bonded can be used. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • An expression vector that is capable of autonomous replication in the above host cells or that can be integrated into the chromosome, and that contains a designed antisense gene or a promoter at a position capable of transcribing a ribozyme is used. Used. Specifically, the expression vector described in 2 below can be mentioned.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • '' Enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Involves in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of sugar chain
  • Methods for selecting a transformant using the activity of the enzyme as an index include, for example, the following methods.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose, or N-glycoside-linked complex type Involves in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of sugar chain
  • Methods for selecting cells in which the enzyme has been inactivated are described in the literature [Shinsei Kagaku Kenkyusho 3 I, Glycoprotein (Tokyo Kagaku Dojin), The Japanese Biochemical Society (1988)], and the literature [Cell Engineering, Separate Volume, Experimental Protocol.
  • a method for selecting a 'transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index' includes, for example, the method described in 1 (5) below.
  • Methods for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include, for example, the methods described in 4 or 5 below.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or ⁇ ⁇ -glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of ⁇ ⁇ -acetylglycosamine at the reducing end of sugar chain
  • a method for preparing a cDNA encoding the following are the methods described below.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex Involves in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetylglycosamine at the reducing end of sugar chain Based on the amino acid sequence of the enzyme Using the cDNA library type I as the type I, the fucose position is the 6th position of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain by PCR. Obtain a gene fragment encoding an enzyme involved in sugar chain modification to bind.
  • a cDNA library is screened and the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal at the 6-position of N-acetylglycosamine DNA encoding an enzyme involved in sugar chain modification at which position 1 of fucose binds can be obtained.
  • the mRNA of human or non-human animal tissues or cells may be commercially available (eg, Clontech) or may be prepared from human or non-human animal tissues or cells as follows.
  • guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method Method for preparing total RNA from human or non-human animal tissues or cells.
  • AGPC Guanidine acid thiocyanate 'Phenol' Cloth form
  • mRNA can be prepared by using a commercially available kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen II) or Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • a cDNA library is prepared from the prepared human or non-human animal tissue or cell mRNA.
  • Methods for preparing a cDNA library include methods described in Molecular Cloning 2nd Edition, Current 'Protocols. in' Molecular 'Biology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), or commercially available kits. For example, a method using a Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies), a method using a ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE) and the like can be mentioned.
  • any phage vector, plasmid vector, or the like can be used as long as it can replicate autonomously in E. coli K12 strain.
  • ZAP Express [STRATAGENE, Strategies, 5, 58 (1992)], pBlescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989) ], ⁇ ZAP II (STRATAGENE), human gtlO, Agtll [DNA cloning, A Practical Approach], ⁇ , 49 (1985)], ATriplEx (Clontech), AExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 [Molecula mono-cellular 'biology (Mol. Cell; Biol,)' 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] Can be given.
  • Escherichia coli As a host microorganism for producing a cDNA library, any microorganism can be used, but Escherichia coli is preferably used. Specifically, Escherichiacoli XLl-Blue MRF '[STRATAGENE, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichiacoli C600 [Genetics,! £, 440 (1954)], Escherichia coli Y1088 [ Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichiacoli ⁇ 522 [Journal of the 'Molecular' Bio mouth (J. Mol.
  • the cDNA library may be used as it is for subsequent analyses, but the Oligocap method developed by Sugano et al. [Gene, JJ8, 171 (1994); Gene, ⁇ , 149 (1997); Protein nucleic acid enzyme, 1, 603 (1996); Experimental medicine, 11, 2491 (1993); cDNA cloning (Yodosha) (1 ") 6 ); may be prepared using the method for preparing a gene library (Yodosha) (1994)] and used for the following analysis.
  • Intracellular sugar nucleotide Intracellular sugar nucleotide.Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside complex type Involved in the sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of sugar chain Based on the amino acid sequence of the enzyme, a digitizing primer specific to the base sequence at the 5 ′ end and 3 ′ end of the base sequence predicted to encode the amino acid sequence was prepared and prepared.
  • the obtained gene fragment is an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglucosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end
  • DNA encoding an enzyme involved in the enzyme can be determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceedings of the National Science Academy of Sciences]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA), J74, 5463 (1977)] or ABI PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • a cDNA or cDNA library synthesized from mRNAs contained in tissues or cells of human or non-human animals is used to obtain colony-high, bleeding and plaque-hybridization (molecular cloning). 2nd edition).
  • Etc. the position of fucose at the 6th position of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or N-acetylglycosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal It is possible to obtain DNA of an enzyme involved in sugar chain modification, which binds to the enzyme.
  • the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain PCR was performed using the primers used to obtain the gene fragments encoding the enzymes to be synthesized, and using the cDNA or cDNA library synthesized from the mRNA contained in the tissues or cells of human or non-human animals as type III.
  • Amplification by using the enzyme to participate in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or a sugar in which position 1 of fucose binds to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain CDNA of an enzyme involved in chain modification can also be obtained.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding the enzyme involved in the modification can be determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceedings of Ob. The National. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • the nucleotide sequence of the DNA can be determined. :
  • the obtained DNA is included in the genes in the database.
  • Enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose or in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type glycan Can be confirmed.
  • the nucleotide sequence of a gene encoding an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose obtained by the above method includes, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the nucleotide sequence of a gene encoding an enzyme involved in sugar chain modification in which fucose is linked to position 1 of fucose at position 6 of N-glycoside-linked complex type sugar chain reduced end N-acetylglycosamine obtained by the above method For example, the base sequence described in SEQ ID NO: 5 or 6 can be mentioned.
  • DNA synthesizer such as del 392 (manufactured by Perkin Elmer) using the phosphoramidite method to obtain intracellular sugar nucleotides GDP-fucose. It is also possible to obtain cDNAs of enzymes involved in the synthesis of N-glycosides or enzymes involved in glycosylation in which fucose is linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chains. it can. '
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain
  • Examples of the method for preparing the genome marauder A include the method described below. For genomic DNA preparation method
  • genomic DNA examples include known methods described in Molecular Cloning, Second Edition, Current Protocols in 'Molecular' Biology, and the like.
  • genomic DNA library screening system Genetic Systems
  • Universal GenomeWalker TM Kits CL0NTECH
  • an enzyme or N-glycoside bond involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose It is also possible to obtain genomic DNA of an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is bonded to position 6 of N-acetylglycosamine at the reducing end of the complex type sugar chain.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding the enzyme to be converted can be determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceedings of Ob. Acad, Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)], or ABI PRISM377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). The nucleotide sequence can be determined.
  • the obtained DNA is included in the genes in the database.
  • a homology search program such as BLAST to search base sequence databases such as Genbank, EMBL, and DDBJ.
  • An enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or a sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end Can be confirmed.
  • DNA synthesizer such as a DNA synthesizer model 392 (manufactured by Perkin Elmer) using the phosphoramidite method to obtain the intracellular sugar nucleotide GDP- ⁇ -
  • a DNA synthesizer model 392 manufactured by Perkin Elmer
  • phosphoramidite method to obtain the intracellular sugar nucleotide GDP- ⁇ -
  • genomic DNA of an enzyme involved in the synthesis of glycan or an enzyme involved in sugar chain modification in which fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain You can also.
  • nucleotide sequence of the genomic DNA of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose obtained by the above method examples include the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 9, 10, 11 and 12.
  • the nucleotide sequence of the genome ⁇ A of the enzyme involved in sugar chain modification in which the 6-position of fucose is attached to the 6-position of N-acetylglycosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain obtained by the above method is
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 13 can be mentioned.
  • the first position of fucose is located at the sixth position of N-acylglucosamine at the reducing end of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the N-glycoside-linked complex type sugar chain without using an expression vector.
  • a host used to prepare the antibody composition of the present invention by directly introducing an antisense oligonucleotide or ribozyme designed based on the nucleotide sequence of an enzyme involved in ⁇ -linked sugar chain modification into a host cell You can also get cells.
  • the antisense oligonucleotide or ribozyme can be prepared by a known method or a DNA synthesizer. Specifically, the sugar that binds the 1-position of fucose to the 6-position of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the ⁇ -acetylglycosamine at the reducing end of the ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain.
  • Oligonucleotide sequence having a sequence corresponding to consecutive 5 to 150 bases, preferably 5 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases in the base sequence of cDNA and genomic DNA encoding the enzyme involved in chain modification Based on the information, it can be prepared by synthesizing an oligonucleotide (antisense oligonucleotide) corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide or a ribozyme containing the sequence of the oligonucleotide.
  • oligonucleotide antisense oligonucleotide
  • oligonucleotide derivatives examples include oligo RNA and derivatives of the oligonucleotide (hereinafter, referred to as oligonucleotide derivatives).
  • Oligonucleotide derivatives include oligonucleotide derivatives in which the phosphodiester bond in the oligonucleotide has been converted to a phosphorothioate bond, and phosphoric diester bonds in the oligonucleotide have become N3'-P5'phosphamidate bonds.
  • Oligonucleotide derivative Oligonucleotide derivative in which ribose and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bond, Peracyl in oligonucleotide is replaced with C-5 propynylperacyl Oligonucleotide derivatives, derivatives in which peracyl in oligonucleotides are substituted with C-5 thiazole peracyl, oligonucleotide derivatives in which cytosines in oligonucleotides are substituted with C-5 propynylcytosine, o In the oligonucleotides Oligonucleotides in which tocin has been replaced with phenoxazine-modified cytosine Derivatives, oligonucleotide derivatives in which the report in the oligonucleotide is substituted with 2'-0-propylribose, and oligonucleotide derivatives in
  • the host cell used to prepare the antibody composition of the present invention may be an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucos or the N-glycidylamine at the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the complex N-glycoside-linked sugar chain.
  • the target gene on the chromosome can be prepared by modifying the chromosome using the homologous recombination method, targeting the gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is cc-linked.
  • Intracellular sugar nucleotides enzymes involved in the synthesis of ⁇ -fucose or N-glycoside-linked complex-type enzymes involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose binds to position 6 of N-acetylglycosamine at the reducing end of sugar chains Prepare genomic DNA for
  • the target gene to be modified for example, an intracellular sugar nucleotide GDP-an enzyme involved in the synthesis of fucose or a fucose at position 6 of N-acetylglycosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end.
  • a target vector for homologous recombination of a structural gene or a promoter gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 is ⁇ -linked is prepared.
  • the cells of the present invention are prepared.
  • One host cell can be prepared.
  • host cells examples include yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, such as enzymes involved in the synthesis of target intracellular sugar nucleotides, GDP-fucose, or ⁇ ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain reducing ends.
  • Any cetylglucosamine can be used as long as it has a gene for an enzyme contributing to sugar chain modification in which position 1 of fucose is bonded to position 6 of cetyl.
  • Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or ⁇ ⁇ -glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of ⁇ ⁇ -acetylglycosamine at the reducing end of sugar chain
  • Examples of the method for preparing genomic DNA include the method for preparing genomic DNA described in (1) (a) above.
  • the nucleotide sequence of the genomic DNA of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose obtained by the above method includes, for example, the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 9, 10, 11 and 12.
  • SEQ ID NOS: 9, 10, 11 and 12 As the base sequence of the genome MA of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 6-position of fucose is attached to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain obtained by the above method, The base sequence described in SEQ ID NO: 13 is exemplified.
  • the target vector can be used in either the substitution type or the insertion type.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3 below can be used.
  • Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, Gene Targeting, A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press (1993), Biomanual Series 8 Gene Targeting, Mutant Mouse Using ES Cells Methods such as positive selection, motor selection, negative selection, and poly A selection described in Production (Yodosha) (1995) can be used. Methods for selecting the desired homologous recombinants from the selected cell strains include the Southern hybridization method for genomic DNA (Molecular 'Cloning 2nd edition) and the PCR method [PCR-Protocol. Ruz CR Protocols), Academic Press (1990)].
  • the host cell used for preparing the antibody composition of the present invention may be an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or an N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end ⁇ -acetylacetylglucosamine at position 6. It targets the gene of an enzyme involved in glycosylation at the 1-position of fucose and uses the RD0 method. For example, it can be prepared as follows.
  • a fucose is added at position 6 of N-acetylacetylglucosamine at the reducing end of the enzyme or N-glycoside-linked complex type sugar chain involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose.
  • the synthesized RD0 is introduced into host cells, and the target enzyme, ie, the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or N-acetylglycoscosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex-type sugar chain reducing terminal, is placed at position 6.
  • the host cell of the present invention can be prepared by selecting a transformant in which an enzyme involved in glycosylation at the 1-position of fucose is mutated.
  • Host cells include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and other target intracellular sugar nucleotides. Enzymes that contribute to the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked N-glycosylation at the reducing end of complex-type sugar chains. A The gene for the enzyme involved in sugar chain modification in which the 6th position of fucose is ⁇ -linked to the 6th position of cetylglucosamine Any of them can be used. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • RD0 For the introduction of RD0 into various host cells, the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain
  • Examples of the method for preparing the cDNA described in (1) above include the method for preparing the cDNA described in (1) (a) above.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain
  • Examples of the method for preparing the genomic DNA include the method for preparing the genomic DNA described in (1) (b) above.
  • the DNA base sequence is digested with an appropriate restriction enzyme or the like, and then subcloned into a plasmid such as BluescriptSK (-) (manufactured by Stratagene) and subjected to a commonly used base sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. Procedings of the National Academy of the Sciences (Proc. Natl. Acad, Sci., USA), U, 5463 (1977)], etc., and a base sequence automatic analyzer, for example, It can be confirmed by performing analysis using a base sequence analyzer such as ABI PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • a base sequence analyzer such as ABI PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • RD0 can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • RD0 is introduced into the host cell, and the target enzyme, an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or fucose at position 6 of N-acetylethylglucosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal
  • the target enzyme an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, or fucose at position 6 of N-acetylethylglucosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal
  • 6-position of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain as described in the above 1 (1) (a).
  • a method of selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index described in 4 or 5 below.
  • the host cell used to prepare the antibody composition of the present invention may be an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or N-acetylcycloglucosamine at the 6-position of the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal.
  • the RNAi method can be used to target the gene of an enzyme involved in sugar chain modification at which position 1 of fucose binds, for example, as follows.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain CDNA is prepared from the above cDNA using the method described in (a) of (1) above.
  • 1-position of fucose is ⁇ -linked to 6-position of N-acetylglucosamine, the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type sugar chain Design an RNAi gene of an appropriate length including a part encoding the enzyme involved in sugar chain modification or a part of the untranslated region.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the prepared cDNA fragment or its full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Involves in sugar chain modification in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetyltyldarcosamine at the reducing end of sugar chain
  • a host cell used for producing the cell of the present invention can be obtained.
  • host cells examples include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and other enzymes that participate in the synthesis of the target intracellular sugar nucleotide, GDP-fucose, or the N-glycan at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end.
  • Any cetylglucosamine can be used as long as it has a gene for an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of cetylglucosamine.
  • Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • RNAi gene As the expression vector, those which can replicate autonomously in the above host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed are used. Specific examples include the expression vectors described in 2 below.
  • a method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Intracellular sugar nucleotide GDP-Activity of enzymes involved in the synthesis of fucose or N-glycoside bond Involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of complex sugar chains
  • the method described in (a) of (1) can be mentioned.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index for example, the method described in (5) of this section 1 can be mentioned.
  • Methods for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include, for example, the methods described in 4 or 5 below.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain
  • Examples of the method for preparing the cDNA of the above include the method for preparing the cDNA described in (a) of (1) of this section 1, and the like.
  • the first position of fucose is located at the sixth position of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or N-acetylglycosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end.
  • the RNAi gene can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • RNAi gene construct is described in [Nature, Sato, «06 (1998); Proceedings of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95. , 15502 (1998); Nature, 395, 854 (1998); Proceedings' Ob 'The National Academy' Ob Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049 ( 1999); Cell, 95, 1017 (1998); Proceedings of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451 (1999); Proceedings of Ob-The National 'Academy' of Ob 'Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998); Nature Cell Biol., 70 ( 2000)].
  • the host cell used to prepare the antibody composition of the present invention is synthesized using the transposon system described in Nature Genet., 25, 35 (2000), etc., and synthesizes intracellular sugar nucleotide GDP-fucose.
  • N-glycoside-linked complex N-acetylglucosamine at the 6-position of fucose at position 6 of the reducing end, or the activity of an enzyme involved in sugar chain modification, or produced antibody molecule or cell membrane
  • a host cell used for preparing the cell of the present invention can be prepared. .
  • the transposon system is a system in which a foreign gene is randomly inserted into a chromosome to induce mutation, and is usually used as a vector for inducing mutation in a foreign gene contained in a transposon.
  • a transposase expression vector for random insertion into the chromosome is simultaneously introduced into the cell.
  • transposase Any transposase can be used as long as it is suitable for the sequence of the transposon to be used.
  • any gene can be used so long as it can induce mutation in the DNA of the host cell.
  • Examples of the host cell include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and other enzymes that are involved in the synthesis of the target intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end N- ⁇ .
  • Any cetylglucosamine can be used as long as it has a gene for an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is bonded to position 6 of cetyl glucosamine.
  • Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Involved in glycosylation in which position 1 of fucose is linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the end of sugar chain reduction
  • the method described in (a) of (1) of this section 1 can be mentioned.
  • Methods for selecting mutants using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index include, for example, the methods described in 4 or 5 below.
  • the host cell used to prepare the antibody composition of the present invention may be an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or N-glycidylamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal at position 6.
  • it can be prepared by targeting a gene of an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is ⁇ -linked, and introducing a dominant negative form of the enzyme.
  • Specific examples of enzymes involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fuco's include GMD and Fx.
  • Examples of enzymes involved in sugar chain modification in which the first position of fucose is attached to the sixth position of N-acetylglycosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex-type sugar chain include ⁇ , 6-fucosyl. Examples thereof include transerase and hi-L-fucosidase. ;
  • These enzymes are enzymes that catalyze a specific reaction having substrate specificity, and by destroying the active center of such a catalytic enzyme having substrate specificity, these enzymes are A dominant negative body can be produced.
  • GMD is used as an example. The production of the dominant negative body is specifically described below.
  • a dominant negative body can be prepared by substituting these four amino acids that are responsible for the enzyme activity of GMD. Based on the results of the preparation of a dominant negative form of GMD derived from Escherichia coli, homology comparison and three-dimensional structure prediction based on amino acid sequence information are performed, for example, GMD (SEQ ID NO: 2) derived from CH0 cells. Then, a dominant negative body can be prepared by substituting threonine at position 155, glutamic acid at position 157, tyrosine at position 179, and lysine at position 183 with another amino acid.
  • Genes with such amino acid substitutions can be produced using the site-directed mutagenesis method described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current Protocols' In Molecular' Biology, etc. .
  • the host cell used to prepare the antibody composition of the present invention is a molecular cloning using a gene encoding a dominant negative form of the target enzyme prepared as described above (hereinafter abbreviated as a dominant negative form gene).
  • a dominant negative form gene a gene encoding a dominant negative form of the target enzyme prepared as described above.
  • Intracellular sugar nucleotide Enzyme involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycoside-linked complex type Involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is attached to position 6 of N-acetylglycosamine, which has not been reduced to a sugar chain Prepare a dominant negative body gene for the enzyme.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared as necessary.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length DNA downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • 'A transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector. .
  • Intracellular sugar nucleotide Intracellular sugar nucleotide.
  • Enzyme activity involved in the synthesis of GDP-fucose or N-glycosidic bond A glycosylation in which fucose is bonded to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of complex-type sugar chains.
  • a transformant using the activity of the enzyme to be decorated or the sugar chain structure of the produced antibody molecule or the glycoprotein on the cell membrane as an index, a host cell to be used for preparing the cell of the present invention is prepared. be able to.
  • host cells include enzymes involved in the synthesis of the target intracellular sugar nucleotide, GDP-fucose, and N-glycans at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end, such as enzymes, animal cells, insect cells, and plant cells. Any cetylglucosamine that has a gene for an enzyme involved in sugar chain modification in which position 1 of fucose is bonded to position 6 can be used. Specific examples include the host cells described in 2 below.
  • An expression vector that can replicate autonomously in the above host cells or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where DNA encoding the dominant negative body of interest can be transcribed is used.
  • Specific examples include the expression vectors described in 2 below.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 2 below can be used.
  • Complex sugar chain modification in which fucose position 1 is bonded to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of complex type sugar chain Examples of a method for selecting a transformant using the activity of the enzyme to be given as an index include the method described in (a) in 1 (1) below.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index includes, for example, the method described in 1 (5) below.
  • Methods for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include, for example, the methods described in 4 or 5 below.
  • the host cell used to produce the antibody of the present invention is an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or fucose at position 6 of N-acetyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal.
  • the gene can be prepared by introducing a mutation into the gene of an enzyme involved in sugar chain modification that binds to position 1 and selecting a desired cell line in which the enzyme has been mutated.
  • Specific examples of enzymes involved in the combined ⁇ 3 ⁇ 4 of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include GMD and Fx.
  • Examples of enzymes involved in sugar chain modification in which fucose is attached to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain include al, 6-fucosyltransylase. Ferase, ⁇ -L-fucosidase and the like.
  • the methods for introducing a mutation into an enzyme include: 1) Involvement in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose from a mutant obtained by treating the parent strain by mutagenesis treatment or a spontaneously occurring mutant.
  • Select the desired cell line based on the activity of the enzyme or the activity of the enzyme involved in sugar chain modification in which fucose is linked to position 6 of fucose at position 6 of the reducing end of ⁇ ⁇ -glycoside-linked complex type glycan.
  • any treatment can be used as long as it induces a point mutation, deletion or frameshift mutation in the cell line of the parent strain.
  • Spontaneously occurring mutants include those that occur spontaneously by continuing subculture under normal cell culture conditions without special mutagenesis treatment. it can.
  • Examples of the method for measuring the activity of the enzyme to be performed include the method described in (a) of (1) of this section 1.
  • Examples of the method for identifying the sugar chain structure of the produced antibody molecule include the methods described in 4 and 5 below.
  • As a method for identifying the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane for example, the method described in item 3 (1) of this section can be mentioned.
  • the host cell used to produce the antibody of the present invention is an enzyme involved in the synthesis of an intracellular sugar nucleotide, GDP-fucose, which is located at the 6-position of N-acetyl-glucosamine at the N-glycoside-linked complex ⁇ chain reducing end.
  • Antisense RNA / DNA technology [Bioscience and Industry,, 322 (1992) ⁇ Chemistry , 681 (1991), Biotechnology, 358 (1992), Trends in Biotechnology, Ifi, 87 (1992) ⁇ Trends in Biotechnology, 152 (1992), Cell Engineering, 1, 1463 (1997)], triple'helix technology [Trends in Biotechnology, 132 (1992)], etc., to suppress transcription or translation of target genes can do.
  • enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include GMD and Fx.
  • enzymes involved in glycosylation in which fucose is attached to position 6 of N-acetylthiolcommine at the reducing end of N-glycoside-linked complex-type sugar chains are, specifically, 1,6-fucosyltransferase.
  • ze-L-fucosidase ze-L-fucosidase.
  • the method described in (5) of this section 1 can be mentioned.
  • the method for identifying the sugar chain structure of the produced antibody molecule include the methods described in 4 and 5 below.
  • the host cell used for preparing the antibody composition of the present invention is a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are linked. It can be prepared by using a technique for selecting a strain that is resistant.
  • Methods for selecting a lectin-resistant strain that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain is linked to the 1-position of fucose include, for example, Somatik -A method using a lectin described in Cell 'and' Molecular 'Genetics (Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51 (1986).
  • any lectin can be used as long as it recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -acetylglycosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked.
  • Specific examples include lentil lectin LCA (Lenti 1 Agglutinin from LensCulinaris) Endo bean lectin PSA (Pea Lectin from Pi sum sativum), Broad bean lectin VFA (Agglutinin from 3fe from Vicia faba), and Hylochawan Evening lectin ML (Lectin derived from Aleuriaaurantia) and the like can be mentioned. .
  • the cells are cultured for 1 day to 2 weeks, preferably 1 day to 1 week in a medium containing the above lectin at a concentration of lg / mL to 1 mg / mL, and the surviving cells are subcultured or colonized.
  • a medium containing the above lectin at a concentration of lg / mL to 1 mg / mL By picking up, transferring to another culture vessel, and continuing culturing in a lectin-containing medium, the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain of the present invention and the 1-position of fucose are combined.
  • a strain that is resistant to a lectin that recognizes the resulting sugar chain structure can be selected.
  • the antibody composition of the present invention can be prepared by using the method described in Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols in Molecular No., Antilogies, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory , 1988 (hereinafter abbreviated as Antibodies), Monoclonal Antibodies principles and practice, Third Edition, Acad, Press, 1993 (hereinafter abbreviated as Monoclonal Antibodies), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (hereinafter abbreviated as “antibody engineering”), etc., for example, by expressing in host cells as follows: it can.
  • a full-length cDNA of an anti-human CCR4 antibody molecule is prepared, and a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the antibody molecule is prepared.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or the full length thereof downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing an antibody molecule By introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing an antibody molecule can be obtained.
  • any of yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like can be used as long as it can express the gene of interest.
  • N-glycoside-linked sugar chain that binds to the Fc region of the antibody fragment
  • Cells can also be used as host cells.
  • the expression vector a vector which is capable of autonomous replication in the above-described host cell or capable of integration into a chromosome and containing a promoter at a position capable of transcribing DNA encoding the antibody molecule of interest is used.
  • a cDNA or a probe or primer specific to a target body molecule can be obtained from human or non-human animal tissues or cells. It can be prepared using '
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), and YCp50 (ATCC37419).
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GA p promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, al 10 promoter, human one Toshodzuku protein promoter, MF monument 1 promoter, CUP 1 promoter and the like can and Ageruko. .
  • Examples of the host cell include microorganisms belonging to the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Krybetia spp., Trichosporon, Schuniomyces, etc. be able to.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electoporation method [Methods. Enzymol.], 194, 182 (1990)]
  • the Sueloplast method [Proceedings of the National Academy of Sciences, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A.], 84. 1929 (1978) )]
  • Lithium acetate method Journal of Bacteriology (J. Bacteriology), 153, 163 (1983), D. Seedings of the 'National Academy of Sciences' (Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 75, 1929 (1978)]. .
  • examples of the expression vector include pc'DNAIs pcDM8 (commercially available from Funakoshi), PAGE107 [JP-A-3-22979; Cytoteclmology, 3, 133, (1990)]. ], PAS3-3 [Tokudokihira 2-227075], pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [Journal of Obb] Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210 and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include Namalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese hamster cells, HBT5637 (Japanese Patent Publication No. 63-299), radiomyeloma cells, and mice. Examples include myeloma cells, Syrian hamster kidney-derived cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells, and the like.
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • an electroporation method [Cytotechnology,, 133 (1990)] ]
  • the calcium phosphate method [Tokudakihira 2-227075]
  • the ribofection method [Procedures 'ob' the 'National' Academy 'ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84 7413 (1987)]
  • the injection method [manipulating the mouse embryo a laboratory 'manual]
  • a method using a particle gun (gene gun) [Patent No. 2606856, Patent No.
  • insect cells When insect cells are used as a host, for example, current protocols “in” molecular biology, Baculovims Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992), bio / technology (Bio / Technology) Technology), 6, 47 (1988) and the like.
  • the recombinant virus can be further infected to the insect cells to express the protein.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all from Invitorogeii) and the like.
  • the baculovirus for example, Autograp a californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects night moth family insects, can be used.
  • Insect cells include Sf9 and Sf21, which are ovarian cells of Spodopterafrugiperda [Current Proto-Cornoles-in 'Morequiula-Pyrology-Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], and Trichoplusiani ovarian cell High 5 (Invitrogen) can be used.
  • Methods for co-transferring the above-described expression-introducing vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method [procedures' Bu. The National 'Academy' Ob 'Sayen (Proc. Nat 1. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include a Ti plasmid, a tobacco mosaic virus vector, and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) and the gene actin 1 promoter—Yuichi.
  • Examples of the host cell include plant cells of tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat, wheat, and the like.
  • any method for introducing DNA into a plant cell can be used.
  • agrobacterium Agrobacterium
  • WO94 / 00977 the electoral-portion method
  • a method using a particle gun (gene gun) Japanese Patent No. 2517813
  • Japanese Patent No. 2517813 Japanese Patent No. 2517813
  • antibody gene expression methods include secretory production and fusion protein expression between the Fc region and other proteins, etc., according to the method described in Molecular 'Cloning, 2nd edition. But can. -
  • the antibody composition can be produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating the antibody molecule in the culture, and collecting from the culture.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • the transformant contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism, so that the cultivation of the transformant is efficient.
  • a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the medium can be used as a medium.
  • the carbon source may be any as long as the organism can assimilate; glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other inorganic or organic acid ammonium salts, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, and yeast extract. Corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and digested products thereof can be used.
  • the inorganic salts potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, man sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia and the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl-/?-D-thiogalactoviranoside or the like is transformed with a recombinant vector using the trp promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American 'Medical Association (The Journal of the American' Medical Association)] , 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 1, 501 (1952)], Daruko's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 Medium [Proceeding of the Societe for the Biological Medicine], 73, 1 (1950)], Whitten's Medium [Developmental Engineering Experiment Manual-Transgenics] 'How to make mice (Kodansha), edited by Motoya Katsuki (1987)] or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium can be used.
  • Culturing is usually carried out pH6, 0 ⁇ 8.0, 30 ⁇ 40 ° C, 5% C0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TNM-FH medium As a medium for culturing transformants obtained using insect cells as a host, commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), SHOO II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, ExCel05 (all JRH Biosciences), Grace's Insect Medium [Nature, ⁇ 1, 788 (1962)] and the like can be used.
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6.0 to 7.0, 25 to 30 ° C, etc. for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured with the cell or by dividing the cell into a plant cell or organ.
  • a medium for culturing the transformant a commonly used Murashige 'and Skoog (MS) medium, a white (White) medium, or a medium obtained by adding a plant hormone such as auxin or cytokinin to such a medium is used. be able to.
  • Cultivation is usually performed at pH 5.0 to 9.0 and 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from an animal cell or a plant cell having an expression vector incorporating DM encoding an antibody molecule is cultured according to a usual culture method, and the antibody composition is produced and accumulated.
  • the antibody composition can be produced by collecting the antibody composition from the culture.
  • a method for expressing the antibody gene secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular 'Cloning 2nd edition, in addition to direct expression.
  • the method of producing the antibody composition includes a method of producing it in a host cell, a method of secreting it out of the host cell, and a method of producing it on the host cell outer membrane.
  • the host cell to be used and the antibody molecule to be produced The method can be selected by changing the structure of
  • a DNA encoding an antibody molecule and a DNA encoding a signal peptide suitable for expression of the antibody molecule are inserted into an expression vector using a gene recombination technique, and the expression vector is used as a host cell.
  • the desired antibody molecule can be actively secreted out of the host cell.
  • the production amount can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • transgenic animal or plant Furthermore, by redifferentiating the cells of the transgenic animal or plant, an individual animal (transgenic non-human animal) or plant (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created. Can be used to produce an antibody composition. '
  • the transformant is an animal or plant individual
  • the animal is bred or cultivated according to a usual method to produce and accumulate the antibody composition, and the antibody composition is collected from the animal or plant individual.
  • the antibody composition can be produced. ,, '
  • an antibody composition In the case of an animal individual, for example, a transgenic non-human animal into which maraudal A encoding an antibody molecule has been introduced is bred, and the antibody composition is produced and accumulated in the animal, and the antibody composition is extracted from the animal. By collecting the antibody, an antibody composition can be produced. Examples of the place of production and accumulation in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs, and the like.
  • the promoter used at this time any promoter that can be expressed in animals can be used.
  • a casein promoter and a casein promoter, which are breast cell-specific promoters can be used. 1; 5 lactoglobulin promoter, whey acidic protein promoter, etc. are preferably used.
  • a transgenic plant into which DNA encoding an antibody molecule has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, 0 (1994); tissue culture, 21 (1995)]. ); Cultivation according to Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], producing and accumulating an antibody composition in the plant, and collecting the antibody composition from the plant.
  • a method for producing an antibody composition can be mentioned.
  • An antibody composition produced by a transformant into which a gene encoding an antibody molecule has been introduced is, for example, when the antibody composition is expressed in a lysed state in cells, after the culture is completed, the cells are centrifuged. After harvesting and suspending in an aqueous buffer, the cells are disrupted using an ultrasonic disrupter, French press, Mantongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method can be used, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Tylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAI0N HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), etc.
  • the cells When the antibody composition is expressed as an insoluble form in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to collect the insoluble form of the antibody composition as a precipitated fraction. .
  • the recovered insoluble form of the antibody composition is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution to return the antibody composition to a normal three-dimensional structure, a purified sample of the antibody product can be obtained by the same isolation and purification method as described above. '
  • the antibody composition or a derivative thereof can be collected in the culture supernatant. That is, the culture composition is treated by the same method as centrifugation as described above to obtain a culture supernatant, and the antibody composition is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Can be obtained.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which genes encoding human antibody CH and CL have been incorporated.
  • the expression vector for animal cells contains genes encoding human antibody CH and CL. Each can be constructed by cloning.
  • the C region of the human antibody can be CH and CL of any human antibody.
  • the C region of the IgGl subclass of the H chain of the human antibody hereinafter referred to as M ⁇ 1
  • the human antibody And the C region of the L chain hereinafter referred to as hC c).
  • chromosomal DNA consisting of exons and introns
  • cDNA prepared by reverse transcription from mRNA can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • PAGE107 Cytotecnology, 3, 133 (1990)
  • pAGE103 Journal of J. Biochem., 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Procedures of the National Academy of Sciences (Proc, Natl. Acad. Sci. USA), 78, 1527 (1981)]
  • promoters and enhancers used in expression vectors for animal cells include the early promoter of SV40 and Enhancer [Journal of Biochem., 101 1307 (1987)], Moroni mouse leukemia. LTR of virus [Biochemical and Biophysical 'Research' Communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 (1987)], immunoglobulin ⁇ chain promoter [Cell, 11, 479 ( 1985)] and Enhanser [Cell,, 717 (1983)] '.
  • Humanized antibody expression vectors are of the type in which the antibody H-chain and L-chain are present on separate vectors or of the type present on the same vector (hereinafter referred to as tandem type). Either of them can be used, but the ease of construction of a humanized antibody expression vector, the ease of introduction into animal cells, and the balance of antibody H chain and L chain expression in animal cells are balanced. From the viewpoint of the present invention, a vector for expression of a humanized antibody of the evening type is more preferable [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)].
  • tandem humanized antibody expression vectors include pKANTEX93 [Molecularity (Mol. I Thigh dish ol.), 37, 1035 (2000)], ⁇ 18 [Hybridoma, 17, 559 (1998) ].
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used for expression of a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody in animal cells. '
  • CDNAs encoding non-human animal antibodies can be obtained as follows.
  • CDNA is synthesized using mRNA extracted from hybridoma cells producing an antibody that specifically binds to human CCR4 as type III.
  • the synthesized cDNA is inserted into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or a recombinant plasmid having a cDNA encoding the H chain V region and a cDNA encoding the L chain V region were obtained. Isolate the recombinant phage or recombinant plasmid containing the phage.
  • the entire nucleotide sequence of VH and VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • Hybridoma cells producing antibodies of non-human animals that can specifically bind to human CCR4 were immunized with non-human animals using human CCR4 represented by SEQ ID NO: 36 by a well-known method
  • Antibodies A hybridoma was prepared from the antibody-producing cells and the myeloma cells of the immunized animal, and then a single cell was prepared in accordance with Laboratory Bottle Laboratory (Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998).
  • the cellized hybridomas can be selected, cultured, purified from the culture supernatant, and obtained.
  • any animal can be used as long as hybridoma cells can be produced, such as mice, rats, hamsters, and egrets.
  • guanidine thiocyanate-trifluor tf cesium acetate method As a method for preparing total RNA from NP cells, guanidine thiocyanate-trifluor tf cesium acetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)] Methods for preparing mRNA from RNA include oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning: A Laboratory Manual], Cold Spring Harbor Lab. Press New York , 1989]. Examples of kits for preparing mRNA from hybridoma cells include Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) and Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized from type II mRNA extracted from predoma cells as long as it can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ II (Stratagene GtlO, human gtll [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech), AExCelU pT7T3 18U (Pharmacia) And PCD2 [Molecular 'Cell. Biol.', 3, 280 (1983)] and p (JC18 [Gene, 33, 103 (1985)]]]
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ II Stratagene G
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XLl-BlueMRF ' [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 1, 778 (1983)] ], ⁇ 522 [Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol '.), 166, 1 (1983)], K802 [Journal of Molecular Biology Mol. Biol.], 16, 118 (1966)] and JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • Methods for selecting cDNA clones encoding the VH and VL of non-human animal antibodies from the cDNA library include colony hybridization using a probe labeled with an isotope or fluorescence, or a blunt hybridization method.
  • the method can be selected according to the "K-hybridization method [Molecular Cloning: A Laboratory Ma 'Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press Ne York, 1989].
  • Prepare primers and use cDNA or cDNA library as type I PCR [Molecular Cloning: A Laboratory Manual], Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; cDNA encoding VH and VL can also be prepared according to Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34]. ,
  • the cDNA selected by the above method is digested with an appropriate restriction enzyme and the like, cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Sanger Reactions such as the dideoxy method [Procedings of the National Academy 'Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. 'U.S.A.], 74, 5463 (1977))]
  • the base sequence of the cDNA can be determined by performing analysis using an automatic base sequence analyzer, for example, a base sequence analyzer such as ABI PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by Applied Biosystems).
  • the amino acid sequence of the antibody variable region or the nucleotide sequence of the DNA encoding the variable region is already known.
  • the antibody can be produced using the following method.
  • the frequency of codon usage [Sequences of Proteins of Immunological Interest] (Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services , 1991] designing a DNA sequence encoding the variable region, synthesizing several synthetic DNAs having a length of about 100 bases based on the designed DNA sequences, and performing PCR by using them. By doing so, DNA can be obtained.
  • DNA can be obtained by synthesizing several synthetic DNAs having a length of about 100 bases based on the information and performing PCR using them. . —
  • amino acid sequence of VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence refer to the amino acid sequence of VH and VL of the known antibody [Sequences of Proteins of Proteins]. of I t logical interest), US Dept. Health and Human Services, 1991], to estimate the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence, and to know the subgroup to which the antibody belongs. it can. Further, the amino acid sequence of each CDR of VH and VL can be found in the same manner.
  • a cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody is located upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody in the vector for expressing a humanized antibody described in (1) of Section 2 of this section.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed.
  • a cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody can be obtained by combining the nucleotide sequences at the 3 'end of the non-human animal antibodies VH and VL with the 5' end of the CH and CL of the human antibody Ligated to a synthetic DNA comprising a sequence and a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at both ends, and ligated to the vector for expression of a humanized antibody described in (1) of item 2 of this section.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting a gene encoding the CH and CL of the human antibody upstream of the gene so that they are expressed in an appropriate form.
  • CDNAs encoding the human CDR-grafted antibody VH and VL can be constructed as follows. First, the amino acid sequences of the VH and VL ⁇ FR of the human antibody to which the CDRs of the VH and VL of the antibody of the desired non-human animal are transplanted are selected. As the amino acid sequence of FR of human antibody VH and VL, any amino acid sequence can be used as long as it is derived from human antibody. For example, FR amino acid sequences of VH and VL of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, and common amino acid sequences of subgroups of FR of VH and VL of human antibodies [Sequences 'ob' Health and Human Services, 1991], among others.
  • a human-type CDR-grafted antibody having sufficient activity is produced.
  • the amino acid sequences of the VH and VL CDRs of the antibody of the target non-human animal are transplanted into the amino acid sequences of the FRs of the selected human antibodies VH 'and VL, and the VH and VL sequences of the human CDR-grafted antibodies are grafted.
  • Design the amino acid sequence The frequency of codons found in the nucleotide sequence of the designed amino acid sequence in the antibody gene [Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991], and design a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH ⁇ S and VL of the human CDR-grafted antibody.
  • the amplification product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 2, and the desired human CDR-grafted antibody is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL.
  • the human CDR-grafted antibody has a higher antigen-binding activity than the original non-human animal antibody by grafting only the VH and VL CDRs of the non-human animal antibody to the human antibody VH and VL FR. It has been known to decrease [Bi / Techn0L0GY], £, 266 (1991). This is due to the fact that not only the CDRs but also some amino acid residues are directly or indirectly involved in antigen binding activity in the original non-human antibody VH and VL. Residues are different from those of human antibody VH and VL FR
  • human-type CDR-grafted antibodies must be able to interact with the amino acid residues involved in direct antigen binding and the CDR amino acid residues in the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies. Identify amino acid residues that act or maintain the antibody's three-dimensional structure and indirectly participate in antigen binding, and derive them from the original non-human animal antibody [BIO / TECHNOLOGY], 9, 266 (1991)].
  • the modification of the amino acid residue of FR of VH and VL of a human antibody can be achieved by performing the PCR method described in item 2 (5) of this section using the synthetic DNA for modification.
  • the nucleotide sequence of the amplified product after PCR is determined by the method described in (2) of this section 2 to confirm that the desired modification has been made.
  • CDNA encoding VH and VL can be inserted to construct a human CDR-grafted antibody expression vector.
  • synthetic DNAs used for constructing the human CDR-grafted antibody VH and VL in (5) and (6) of item 2 above appropriate restriction at the 5 'end of the synthetic DNA located at both ends is appropriate.
  • the expression vector can be inserted to construct a human CDR-grafted antibody expression vector.
  • a humanized quinula antibody and a humanized CDR-grafted antibody (hereinafter collectively referred to as a humanized antibody) ) Can be obtained in a stable manner.
  • Examples of a method for introducing a humanized antibody expression vector into animal cells include an electrolysis method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891; Cytoteclmology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any animal cell capable of producing a humanized antibody can be used.
  • mouse myeloma cells such as NS0 cells, SP2 / 0 cells, Chinese hamster ovary cells CHO / dhfr-cells, CH0 / DG44 cells, rat myeloma cells YB2 / 0 cells, IR983F cells, and Syrian hammus yuichi Examples include BHK cells derived from the kidney, Namalva cells which are human myeloma cells, and preferably, CH0 / DG44 cells which are Chinese hamster ovary cells, and radiomyeloma YB2 / 0 cells.
  • a transformant that stably produces a humanized antibody can be obtained by the method described in Japanese Patent Publication No. 2-257891 (hereinafter referred to as G418 sulfate). And the like.
  • RPMI1640 as animal cell culture medium Medium (Nissui Pharmaceutical), GIT medium (Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (JRH), IMDM medium (GIBC0 BRL), Hybridoma-SFM medium (GIBC0 BRL), or these
  • FCS fetal calf serum
  • a humanized antibody By culturing the obtained transformant in a medium, a humanized antibody can be produced and accumulated in the culture supernatant.
  • the amount of humanized antibody produced in the culture supernatant and the antigen-binding activity were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter referred to as ELISA; Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998, monoclonal antibodies: Principles and Practice (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] and the like.
  • the transformant can increase the amount of humanized antibody produced using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • Humanized antibodies can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column [Antibodies: A Laboratory Manual], Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8 , 1988, Monoclonal Antipodes: Principle 'Frillez and F .. Lactose (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice j, Academic Press Limited, 1996) Also, other purification methods usually used for protein purification can be used, for example, gel filtration, ion exchange chromatography, and the like. Purification can be performed by a combination of purification and ultrafiltration, etc.
  • the molecular weight of the purified humanized antibody H chain, L chain or the entire antibody molecule can be determined by SDS-modified polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter, SDS- Notation: PAGE; Nature (227), 227, .680 (1970)] or Western blotting method [Antibodies: A Laboratory Manual] Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limit ed, 1996 ".
  • the method for producing the antibody composition using animal cells as a host has been described above.
  • yeast, insect cells, plant cells, or animal or plant cells can be produced by the same method as that for animal cells.
  • a composition can be manufactured. '
  • a cell for expressing the antibody molecule is prepared using the method described in 1 above, and then the cell is cultured.
  • the antibody composition of the present invention can be produced by purifying the composition.
  • the binding activity to an antigen and the binding activity to an antigen-positive cultured cell line are determined by ELISA and fluorescent antibody methods [Cancer Immunology 'Immunoser. I, thigh unother.), 36, 373 (1993)]. Cytotoxic activity against antigen-positive cultured cell lines can be evaluated by measuring CDC activity, ADCC activity, etc. Kiru [Cancer 'Imnologi-I', Immunotherapy. (Cancer Immunol. I Awakening Mother.), 36. 373 (1993)].
  • the safety and therapeutic effect of the antibody composition in humans can be evaluated using an appropriate model of an animal species relatively close to humans such as cynomolgus monkeys. '
  • the sugar chain structure of the antibody molecule expressed in various cells can be determined according to the analysis of the sugar chain structure of a normal glycoprotein.
  • the sugar chains bound to IgG molecules are composed of neutral sugars such as galactose, mannose and fucose, amino sugars such as N-acetylglycosamine, and acidic sugars such as sialic acid.
  • a method such as sugar chain structure analysis using a two-dimensional sugar chain mapping method or the like.
  • composition analysis of the sugar chain of the antibody composition neutral sugar or amino sugar is released by performing acid hydrolysis of the sugar chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • the composition ratio can also be analyzed by fluorescence labeling with Maikoko and 2-aminoviridine. Specifically, a sample obtained by acid hydrolysis according to a known method [Agriculative and Biological Chemistry (Agric. Biol. Chem.), 55 (1), 283-284 (1991)] is used. Fluorescence lapelation is achieved by 2-aminopyridylation, and the composition ratio can be calculated by HPLC analysis.
  • Structural analysis of the sugar chain of the antibody composition is performed using the dimensional sugar chain mapping method [Analytical Biochemistry-(Anal .. Biochem.), 171, 73 (1988), Biochemistry Experimental Method 23-glycoprotein sugar chain research method (Academic Society Publishing Center) Reiko Takahashi's Ed. (1989)].
  • the X-axis indicates the sugar chain retention time or elution position by reverse-phase chromatography
  • the X-axis indicates the sugar chain retention time or elution position by normal-phase chromatography. This is a method for estimating the sugar chain structure by plotting and comparing the results with those of known sugar chains.
  • an antibody is degraded by hydrazine to release a sugar chain from the antibody, and fluorescent labeling of the sugar chain with 2-aminopyridine (hereinafter abbreviated as ⁇ ) [Journal of “Ob” Biochemistry (J. Biochem. .), 95, 197 (1984)], the sugar chain is separated from excess PA-forming reagent, etc. by gel filtration, and reversed phase chromatography is performed. Next, normal phase chromatography is performed on each peak of the collected sugar chains. Based on these results, the results were plotted on a two-dimensional bran chain map and compared with the sugar chain standard (TaKa3 ⁇ 4a) and the literature [Analytical 'Biochemistry., 171, 73 (1988)]. The sugar chain structure can be estimated from the comparison of the spots.
  • mass spectrometry such as MALDI-T0F-MS of each sugar chain can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain mapping method.
  • the antibody composition is composed of antibody molecules having different sugar chain structures binding to the Fc region of the antibody.
  • the antibody composition of the present invention is characterized in that, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains binding to the Fc region, the proportion of sugar chains in which no N-acetylglucosamine at the reducing terminal of sugar chains is bonded to N-acetylglucosamine Is 100 ° /. And high ADCC activity.
  • Such an antibody composition can be identified by using the method for analyzing the sugar chain structure of the antibody component described in 4. above. In addition, it can be identified by using an immunological quantification method using lectin.
  • Lectins used to identify the sugar chain structure of antibody molecules include, for example, WGA (wheat-germ agglutinin from T. vulgaris), ConA (concanavalin A from C. ensiformis), and RIC (toxin from R. communis). ), L-PHA (leukoagglutinin from P. vulgaris), LCA (lentil agglutinin from L. culinaris), PSA (Pea lectin from P.
  • AAL Aleuria aurantia Lectin
  • ACL Amaranthus caudatus Lectin
  • BPL Bauhinia purpurea Lectin
  • DSL Natural stramonium Lectin
  • DBA Dolichos bif lorus Agglutinin
  • EBt Elderberry Balk Lectin
  • ECL Erythrina cristagalli Lectin
  • 'EEL Euonymus europaeus' Lectin
  • G ⁇ Nalanine GSL Griffonia simplicifolia Lectin
  • HPA Helix pomatia Agglutinin
  • HHL Hippeastrum Hybrid Lectin
  • Jacalin LTL (Lotus tetragonolobus Lectin)
  • LEL Licopersicon esculentum Lectin
  • MAL MAL
  • a lectin that specifically recognizes the sugar chain structure in which fucose is bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the N-glucoside-linked complex type sugar chain.
  • a lectin that specifically recognizes the sugar chain structure in which fucose is bound to N-acetylglycosamine at the reducing end of the N-glucoside-linked complex type sugar chain.
  • Specific examples thereof include Lentil Lectin LCA (Lentil Agglutinin from Lens Culinaris) Endomelectin PSA (Pea Lectin from Pis value sativum), Broad bean lectin VFA (AggluUn in from Vicia 'f aba), Hylochawan evening lectin ML (Lectin from Aleuria aurantia) Things can be done. '
  • the antibody composition of the present invention specifically binds to human CCR4 and has high antibody-dependent cytotoxicity. Therefore, it is useful in the prevention and treatment of various CCR4-expressing cell-related diseases such as cancer diseases and inflammatory diseases.
  • cancer diseases for which treatment with the antibody composition of the present invention is effective include hematologic cancer, particularly leukemia or lymphoma.
  • hematologic cancer particularly leukemia or lymphoma.
  • Specific examples include adult T-cell leukemia; ATL, mycosis fungoides, Sezari's syndrome, undifferentiated large cell lymphoma, nonspecific T-cell lymphoma, and the like. .
  • Inflammatory diseases for which treatment with the antibody composition of the present invention is effective include acute, chronic airway hyperresponsiveness or bronchial asthma, atopic dermatitis including atopic dermatitis, chronic sinusitis, Churg-Strauss syndrome Th2 cell-mediated immune disorders, such as erythema, pemphigus, eosinophilic myocarditis, allergic gastroenteritis, allergic granulomatous vasculitis, allergic rhinitis or hay fever.
  • Cancer a malignant tumor, has cancer cells proliferate, for example, in B cell lymphoma, specific B cells abnormally proliferate.
  • Ordinary anticancer agents are characterized by inhibiting the growth of cancer cells.
  • antibodies with high antibody-dependent cytotoxicity can treat cancer by damaging the cancer cells that express the antigen by a cell-killing effect, and are thus more useful as therapeutic agents than conventional anticancer drugs. It is.
  • the antitumor effects of antibody drugs alone are insufficient for cancer treatment drugs, and 'combined therapy with chemotherapy has been performed [Science, 1197 (1998)].
  • a stronger antitumor effect of the antibody composition of the present invention alone is recognized, dependence on chemotherapy is reduced, and side effects are reduced.
  • inflammatory diseases such as chronic airway irritable asthma, bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis or hay fever, IL-4, IL-5 and IL- produced from Th2 cells
  • Inflammatory cells such as eosinophils and mast cells are proliferated or differentiated by cytokines and chemokines such as 13 and the tissue-injury allergic reaction is produced through the production molecules produced by these inflammatory cells.
  • cytokines and chemokines such as 13
  • chemokines such as 13
  • Inhibitors of inflammatory cells, inflammatory cells and inflammatory biofunctional molecules have been developed, but these therapeutic agents only partially inhibit the function between cytokines, chemokines and inflammatory cells, Is not a typical remedy.
  • the antibody composition of the present invention specifically binds to the extracellular region of CCR4 and shows strong cytotoxic activity against CCR4-expressing cells, Th2 is a cell expressing CCR4 in the upstream part of an allergic reaction. It can selectively eliminate cells and suppress the production of IL-4, It-5 and IL-13 from ⁇ 1 ⁇ 2 cells. Therefore, it is useful as a therapeutic agent for the above-mentioned inflammatory diseases.
  • the antibody composition of the present invention does not contain an antibody molecule having a sugar chain to which fucose is bound, cytotoxic activity is enhanced. Therefore, it is possible to treat patients with the above-mentioned cancer and inflammation-injected diseases that cannot be cured by an antibody composition containing an antibody molecule having a sugar chain to which fucose is bound.
  • diseases such as cancer, bronchial asthma, and chronic sinusitis are difficult to reach the infiltration site of CCR4-expressing cells. Therefore, it is preferable that even a small amount of the drug has a therapeutic effect.
  • the antibody composition of the present invention has high ADCC activity even in a small amount, it is useful for treating these diseases.
  • the drug containing the antibody of the present invention can be administered alone as a therapeutic agent, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers to obtain a pharmaceutical preparation. It is desirable to provide as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the art.
  • intravenous administration can be preferably used.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, propellants, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • -Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, P -It can be manufactured using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol, hydroxy It can be produced using a binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • the injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a powdered injection can be prepared by freeze-drying the antibody in a conventional manner and adding sodium chloride thereto.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • Sprays are prepared using the antibody composition itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory tract mucosa of the recipient, and disperses the antibody composition as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the antibody composition and the carrier used. In these parenteral preparations, the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dosage or number of administrations varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but the amount of the active ingredient is usually 10 g / kg to 20 mg / kg per adult per day.
  • Methods of examining the antitumor effect of the antibody composition on various tumor cells include CDC activity measuring methods and ADCC activity measuring methods in in vitro experiments, and in vivo experiments in mice and the like. Examples include the use of tumor systems in experimental animals and antitumor experiments.
  • FIG. 1 shows the construction of plasmid pKOFUT8Neo.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of genomic Southern analysis of a genomic lockout 'clone obtained by breaking one copy of the FUT8 allele of CH0 / DG44 cells.
  • the lanes show, from the left, the molecular weight markers, genomic Southern clones 50-10-104 and the genomic Southern of the parent strain CH0 / DG44 cells.
  • FIG. 3 shows the results of genomic Southern analysis of the double knockout clone WK704 in which both FUT8 alleles of CH0 / DG44 cells were disrupted. Arrows indicate the replacement positions of positive fragments detected when homologous recombination has occurred.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of genomic Southern analysis of a clone in which a drug resistance gene has been removed from a double knockout clone in which both FUT8 alleles of CH0 / DG44 cells have been disrupted. Lanes are from left to right, molecular weight marker, drug knockout clone 4-5-C3, double knockout clone WK704, double knockout clone 50-10-104 and parental CH0 / DG44 cells, respectively. Genome Southern. .
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the expression vector of the prepared anti-CCR4 human CDR-grafted antibody.
  • FIG. 6 is a graph showing the reactivity of the purified MS705 / CCR4 antibody and DG44 / CCR4 antibody to the CCR4 partial peptide in the ELISA method, which was measured by changing the antibody concentration.
  • the horizontal axis shows the antibody concentration, and the vertical axis shows the absorbance at each antibody concentration. Mouth indicates DG44 / CCR4 antibody, and ⁇ indicates Ms705 / CCR4 antibody. -FIG.
  • FIG. 7 shows the results of measuring the ADCC activity of purified MS705 / CCR4 antibody and DG44 / CCR4 antibody on human CCR4 high-expressing cells (CCM / EL-4) with varying antibody concentration.
  • the horizontal axis shows the antibody concentration, and the vertical axis shows the cytotoxic activity at each antibody concentration.
  • * Indicates the DG44 / CCR4 antibody, and ⁇ indicates the Ms705 / CCR4 antibody.
  • FIG. 8 shows the CCM of an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody composition prepared by adding 0-300 ng / mL DG44 / CCR4 antibody or Ms705 / CCR4 antibody to 3.7 ng / mL ⁇ Ms705 / CC! Antibody.
  • FIG. 3 is a view showing in vitro ADCC activity on / EL4 cells. The vertical axis of the graph shows the cytotoxic activity, and the horizontal axis shows the concentration of the added antibody.
  • ⁇ is an antibody composition prepared by adding Ms705 / CCR4 antibody to 3.7 ng / mL Ms705 / CCR4 The activity of each is shown. * In the figure indicates the percentage of antibodies with sugar chains with sugar chains to which fucose does not bind among the antibody compositions prepared by adding the DG44 / CC antibody to the 3.7 ng / mL Ms705 / CCR4 antibody. Shows 20% or more of the antibody composition. '
  • FIG. 9 shows the in vitro ADCC activity on CCM / EL4 cells of the antibody composition consisting of the Ms705 / CCR4 antibody alone and the antibody composition obtained by mixing the Ms705 / CCR4 antibody with a 9-fold amount of the DG44 / CC antibody.
  • FIG. The vertical axis of the graph shows the cytotoxic activity.
  • the numbers shown on the horizontal axis of the graph indicate the concentration of the Ms705 / CCR4 antibody (ng / mL :), the concentration of the added DG44 / CCR4 antibody (ng / mL :), and the total antibody concentration (ng / mL) from the top. It shows.
  • the mouth indicates the activity of the antibody composition consisting of the MS705 / CCR4 antibody alone
  • the open square indicates the activity of the antibody composition obtained by mixing the Ms705 / CCR4 antibody with a 9-fold amount of the DG44 / CCR4 antibody.
  • a CH0 / DG44 cell line deleted of the genomic region containing the translation initiation codon of both FUT8 alleles was constructed by the following procedure.
  • the DNA fragment was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • 0.1 kg of the I fragment (about 1.6 Kb) derived from pKOSelectNeo and a fragment (about 10.1 Kb) derived from pKOFUT8Puro obtained above were added to sterile water to make 5 L, and Ligation High ( The ligation reaction was performed by adding 5 / L and reacting at 16 ° C for 30 minutes.
  • Escherichia coli DH5 strain was transformed using the reaction solution, plasmid DNA was prepared from each of the obtained ampicillin-resistant clones, and attached using Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems).
  • pKOFUT8Neo shown in FIG. 1 was obtained.
  • pK0FUT8Neo was used as a targeting vector to generate a minoprotein cell line for the FUT8 gene of CH0 cells.
  • CH0 / DG44 cells derived from Chinese hamster ovary deficient in the dihydrofolate reductase gene (dhfr) [Somatic Cell and Moleculer Genetics, 12, 555, 1986] contain the Chinese hamster FUT8 genomic region constructed in section 1 of Example 1.
  • the targeting vector pKOFUT8Neo was introduced as follows.
  • pKOFUT8Neo was linearized by digestion with restriction enzyme I (manufactured by New England Biolabs), and the linearized 4 pK0FUT8Neo was transferred to 1.6 ⁇ 10 6 CH0 / DG44 cells by electoral port poration method [Cytotechnology ( Cytotechnology), 3, 133 (1990)], IMDM-dFBS (10) -HT (1) [dialysis FBS (Invitrogen) 10%, HT supplement (Invitrogen) 1x concentration And then inoculated into a 10 cm dish for adherent cell culture (Falcon).
  • Diagnosis of homologous recombination of the G418-resistant clone obtained in this section (1) was performed by PCR using genomic DNA as follows.
  • a freezing medium [20% DMSOs 40% fetal serum, 40% IMDM] was added to each well and suspended.
  • Half of the cell suspension in each gel was seeded on a flat-bottom 96-well plate for adherent cells (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) to prepare a replica plate, and the other half was frozen and stored as a master plate.
  • Neomycin-resistant clones on the replica plate IMDM containing G418 at a concentration of 600 zg / mL -.
  • IMDM containing G418 at a concentration of 600 zg / mL -.
  • cells were harvested, From the recovered cells, genomic DNA of each clone was prepared according to a known method [Analytical Biochemistry, 201, 331 (1992)], and 30 L of TE-RNase buffer (pH 8. 0)
  • the primer used for genomic PCR was designed as follows. First, from the sequence of the FUT8 genomic region (SEQ ID NO: 13) obtained by the method described in Example 12 of WO03 / 31140, primers represented by SEQ ID NO: 39 or SEQ ID NO: 40 were used as forward primers. In addition, a primer (SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42) that specifically binds to the loxP sequence of the evening vector was used as a reverse primer and used in the following polymerase chain reaction (PCR).
  • reaction solution was subjected to 0.8% (w / v) agarose gel electrophoresis, and a strain in which a homologous and approximately 1.7 Kb specific amplification product generated by recombination was recognized was determined as a positive clone.
  • Diagnosis of homologous recombination of the positive clones obtained in this section (2) was carried out as follows by Southern blotting using genomic DNA.
  • genomic DNA of each clone was prepared according to a known method [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)], and 150 ⁇ L each of TE-RNase buffer ( ⁇ 80 ⁇ ) overnight.
  • a probe used for a Southern plot was prepared as follows. From the sequence of the FUT8 genomic region (SEQ ID NO: 13) obtained by the method described in Example 12 of W003 / 31140, primers represented by SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 were prepared, and were subjected to the following PCR. Using.
  • the reaction solution was subjected to 1.75% (Wv) agarose gel electrophoresis, and a probe DNA fragment of about 230 bp was recovered using a GENECLEAN Spin Kit (manufactured by BIO 101).
  • the resulting probe DNA solution sac Chi 5 ⁇ L, [ «- 32 P] dCTP l, 75MBq and Megaprime DNA Labeling system, and radiolabeled using dCTP (Amersh am Pharmacia Biotech Inc.).
  • the hybridization was performed as follows. First, the nylon membrane onto which the genomic DNA digest was transferred was sealed in a roller pot, and 15 mL of hybridization solution (5xSSPE, 50xDen haldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 / g / mL salmon sperm) DNA] was added thereto, and prehybridization was performed at 65 ° C for 3 hours. Then, the 32 P-labeled probe DNA was heat-denatured and charged into a bottle, followed by hybridization at 65 ° C.
  • hybridization solution 5xSSPE, 50xDen haldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, 100 / g / mL salmon sperm
  • the nylon membrane was immersed in 50 mL of a primary washing solution [2xSSC_0.1% (w / v) SDS], and washed by heating at 65 ° C for 15 minutes. After repeating the above washing operation twice, the nylon membrane was immersed in 50 mL of a secondary washing solution [0.2 ⁇ SSC-0.1% (w / v) SDS], and washed by heating at 65 ° C. for 15 minutes. After washing, the nylon film was exposed to X-ray film at -80 ° C and developed.
  • Fig. 2 shows the results of analysis of the parent strain CH0 / DG44 cells and the positive clone A-geno A of the 50-10-104 strain obtained in this section (2) by this method.
  • CH0 / DG44 cells only an approximately 25.5 Kb fragment from the wild-type FUT8 allele was detected.
  • the positive clone 50-10-104 strain in addition to a fragment of about 25.5 Kb derived from the wild-type FUT8 allele, a fragment of about 20.0 Kb specific to the homologously recombined allele was detected. Since the ratio of the two fragments was 1: 1, it was confirmed that strain 50-10-104 was a hemi-knockout clone in which one copy of the FUT8 allele was disrupted.
  • pK0FUT8Puro is digested with the restriction enzyme MI (New England Biolabs) to linearize it, and 4 ⁇ g of the linearized pKOFUT8Puro is converted to a 1.6 ⁇ 10 6 FUT8 gene into a mino-out clone by electroporation [Site Technology (Cytotechnology), 3, 133 (1990)], suspended in IMDM-dFBS (10) -HT (1), and seeded on a 10 cm dish for adherent cell culture (Falcon).
  • MI New England Biolabs
  • Diagnosis of homologous recombination of the drug-resistant clone obtained in this section (1) was performed as follows using a Southern blot using genomic DNA.
  • each clone in the above plate was subjected to trypsin treatment, and the cells were seeded on a flat-bottomed 24-well plate for adherent cells (manufactured by GRAINA).
  • Puromycin (SIGMA Co.) 15 ⁇ G / mL of concentration including IMDM-dFBS (10) - HT (1) was cultured 37 ° C, 1 week at 5% C0 2 incubator within one with
  • trypsin treatment was performed, and the cells were seeded on a flat-bottomed 6-well plate for adherent cells (manufactured by GRAINA).
  • the plate was cultured at 37 ° C.
  • the cloned genomic DNA was prepared and dissolved in 150 LL of TE-RNase buffer (pH 8.0).
  • the genomic DNA 12 / g prepared above was digested with the restriction enzyme HI (manufactured by New England Biolabs), and the DNA fragment was recovered using the ethanol precipitation method. Then, a 20 // L TE buffer ( pH 8.0) and subjected to 0.6% (w / v) agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, the genome is transferred to a nylon membrane in accordance with a known method [Proceedings of the National Institute of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979)]. The DNA was transcribed. After the transfer, the nylon film was subjected to a heat treatment at 80 ° C. for 2 hours and fixed.
  • HI restriction enzyme
  • a probe to be used for a Southern plate was prepared as follows. First, primers (SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46) that specifically bind to a sequence 5 ′ to the FUT8 genomic region contained in the targeting vector were prepared and used in the following PCR.
  • the reaction solution was subjected to 1.75% (w / v) agarose gel electrophoresis, and a probe DNA fragment of about 230 bp was purified using GENECLEAN Spin Kit (manufactured by BIO 101) '. 5 ⁇ L of the obtained probe DNA solution was radiolabeled using [Hi- 32 P] dCTP 1.75 MBq and Megaprime DNA Labeling system, dCTP (Amersh am Pharmacia Biotech).
  • the hybridization proceeds as follows. First, the nylon membrane onto which the above genomic DNA digest was transferred was sealed in a bottle with a mouthpiece, and 15 mL of a high hybridization solution (5xSSPE, 50x Den haldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, ⁇ zg / mL salmon sperm DNA] and prehybridization at 65 ° C for 3 hours, heat-denature the 32 P-labeled probe DNA, and add to a bottle at 65 ° C Hybridization was carried out overnight. After hybridization, the nylon membrane was immersed in 50 mL of a primary washing solution [2xSSC—0.1% (w / v) SDS], and washed by heating at 65 ° C for 15 minutes.
  • a high hybridization solution 5xSSPE, 50x Den haldt's solution, 0.5% (w / v) SDS, ⁇ zg / mL salmon sperm DNA
  • prehybridization at 65 °
  • the membrane was immersed in 50 mL of secondary washing solution [0.2xSSC-0.1% (w / v) SDS] and heated at 65 ° C for 15 minutes for washing. . After washing, the film was exposed to X-ray film at -80 ° C and developed.
  • Fig. 3 shows the results of analysis of the genomic DNA of the WK704 strain, one of the puromycin-resistant clones, obtained from the 50-10-104 strain by the method described in this section (1) by this method. .
  • a fragment of about 25.5 Kb derived from the wild-type FUT8 allele disappeared, and only a fragment of about 20.0 Kb specific to the homologously recombined allele (indicated by an arrow in the figure) was detected. From these results, it was confirmed that the WK704 strain was a clone in which both FUT8 alleles were disrupted.
  • Cre recombinase expression vector pBS185 (manufactured by Life Technologies) was introduced as follows. ⁇ '
  • PBS185 was introduced into a 1.6 ⁇ 10 6 FUT8 gene double knockout clone by the electoral-portion method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], and then IMDM-dFBS (10) -HT (1 ) Suspended in 10 mL, and diluted 20,000-fold using the same medium. After seeding the dilutions into adherent cells culture Yoyo 10cm dish (manufactured by Falcon) seven, were cultured between 37 ° C, 10 days in a 5% C0 2 incubator, to form colonies.
  • an arbitrary clone is collected on a flat bottom plate for adherent cells (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) according to a known method [Gene Targeting, Oxford University Press, (1993)].
  • adherent cells manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.
  • the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° for 1 week. After the culture, each clone on the plate was trypsinized, and a double volume of a freezing medium [20% DMS0, 40% fetal bovine serum, 0% top DM] was added to each well and suspended.
  • Half of the cell suspension in each well was seeded on a flat bottom 96-well plate for adherent cells (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) to make a replica plate, while the other half was frozen and stored as a master plate.
  • the positive clones selected in this section (2) were diagnosed by the following procedure to remove drug-resistant genes by genomic Southern blot. ,
  • a probe used for a Southern plot was prepared as shown below.
  • the following PC was performed using primers (SEQ ID NO: 4.5 and SEQ ID NO: 46) that specifically bind to the sequence 5 'further than the FUT8 genomic region contained in the Yuichii targeting vector.
  • the reaction solution was subjected to 1.7'5% (w / v) agarose gel electrophoresis, and a probe DNA fragment of about 230 bp was purified using a GENECLEAN Spin Kit (manufactured by BIO 101). 5 ⁇ L of the obtained probe DNA solution was subjected to radiation labeling using [Hi- 32 P] dCTP 1.75 MBq and Megaprime DNA Labeling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the hybridization was performed as follows. First, the nylon membrane onto which the above genomic DNA digest was transferred was sealed in a roller bottle, and the hybridization solution [5 X SSPE, 50 x Denaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS , LOO ⁇ g / mL salmon sperm DNA], prehybridize at 65 ° C for 3 hours, heat denature the 32 P-labeled probe DNA, put into a bottle, and incubate at 65 ° C Redidation was conducted.
  • the hybridization solution [5 X SSPE, 50 x Denaldt's solution, 0.5% (w / v) SDS , LOO ⁇ g / mL salmon sperm DNA]
  • the nylon membrane was immersed in 50 mL of a primary washing solution [2 ⁇ SSC—0.1% (W / V) SDS], and washed by heating at 65 ° C. for 15 minutes. Repeat the above washing operation once. Repeat, then immerse the nylon membrane in 50 mL of secondary washing solution [0.2 X SSC—0.1% (W / V) SDS] and heat at 65 ° C for 15 minutes And washed. After washing, the film was exposed to X-ray film at -80 ° C and developed. '
  • FIG. 4 shows the parent strain CH0 / DG44, cells, the 50-10-104 strain described in section 2 of this example, the WK704 strain described in section 3 of this example, and the WK704 strain from this section ( The results of analyzing the genomic DNA of strain 4-5-C3, which is one of the drug-sensitive clones obtained by the method described in 2), by this method are shown.
  • CH0 / DG44 cells only a DNA fragment of about 8.0 Kb derived from the wild-type FUT8 allele was detected.
  • DNA fragments of about 9.5K derived from alleles in which homologous recombination occurred were observed.
  • the neomycin resistance gene (approximately 1.6 Kb) and the puromycin resistance gene (approximately 1.5 Kb) are further removed from the homologous recombination allele. Only a DNA fragment of about 8.0 Kb was detected. From this result, it was confirmed that the drug resistance gene was removed from the 4-5-C3 strain by Cre recombinase. FUT8 gene double knockout clones from which the drug resistance gene had been removed (hereinafter referred to as FUT8 gene double knockout cells) were obtained in multiple strains other than the 4-5-C3 strain.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the expression vector of the prepared anti-CCR4 human CDR-grafted antibody composition.
  • transformant capable of growing on an IMDM-dFBS (10) medium containing G418 at a concentration of 500 g / mL and producing an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody was obtained.
  • the transformant obtained from the parental CH0 / DG44 cell was named DG44 / CCR4 strain, and the transformant obtained from the FUT8 gene double noquart cell was named Ms705 / CCR4 strain.
  • the 1% BSA-PBS was discarded, and the culture supernatant of the transformed strain or various diluted solutions of the antibody purified from the culture supernatant were added with a gel, followed by reaction at room temperature for 1 hour. After the reaction, each pellet was washed with PBS containing Tween 20 at a concentration of 0.05% (hereinafter referred to as Tween-PBS) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then diluted with 1% BSA-PBS in 2000-fold.
  • Tween-PBS PBS containing Tween 20 at a concentration of 0.05%
  • a serum-labeled goat anti-human IgG (H & L) antibody solution (manufactured by American Qualex) was added as a secondary antibody solution at 50 L / ml, and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, after washing with Tween-PBS, 0.55 g of ABTS substrate solution [2,2'-amino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ammonium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added.
  • Each of the transformants was suspended in IMDM-dFBS (10) containing H18 at a concentration of 500 ⁇ g / mL, and 30 mL was inoculated into a 182 cm 2 flask (manufactured by Grina Co., Ltd.) and placed in a 5% CO 2 incubator. When the cell density reached confluence, the culture supernatant was removed, the cells were washed with 25 mL of PBS, and 30 mL of EXCELL301 medium (manufactured by JRH Biosciences) was injected.
  • the acquired Ms705 / CCR4 strain was transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary on September 9, 2003 (1-1, Tsukuba East, Ibaraki, Japan, 1 Chuo No. 6) by FERM BP. Deposited as -8467.
  • the binding activity of the DG44 / CCR4 antibody and the MS705 / CCR4 antibody purified in section 3 of the example to the human CCR4 antigen was measured as follows.
  • Compound 1 (SEQ ID NO: 38) was selected as a human CCR4 extracellular domain peptide to which an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody can react.
  • a conjugate with BSA Bovine Serum Albumin (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) was prepared by the following method and used as an antigen for use in activity measurement by ELISA.
  • FIG. 6 shows the binding activity of the DG44 / CCR4 antibody and the Ms705 / CCR4 antibody to the CCR4 extracellular region partial peptide. Both antibodies had the same binding activity to the CCM extracellular domain partial peptide.
  • the in-cytotoxic activity of the DG44 / CCR4 antibody and the Ms705 / CCR4 antibody obtained in section 3 of Example 2 was measured as follows.
  • heparin sodium manufactured by Shimizu Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the mononuclear cell layer was separated according to the attached instruction manual. After washing by centrifugation three times with RPMI1640-FCS (5) medium, the cells were suspended in the same medium at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / mL to obtain an effector-one cell solution.
  • the plate was centrifuged, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant was measured using CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) according to the attached instructions.
  • the absorbance data for spontaneous release of target cells was obtained by using only the medium instead of the Efecta-cell solution and the antibody solution, and the absorbance data of spontaneously released target cells was obtained by using the medium instead of the target cell solution and the antibody solution.
  • was obtained by performing the same operation as above using only Absorbance data of total release of target cells was obtained by adding 15 ⁇ L of 9% Triton X-100 solution 45 minutes before the end of the reaction, using the medium instead of the antibody solution and effector cell solution. The operation was performed, and the LDH activity of the supernatant was measured. ADCC activity was determined by the following equation.
  • FIG. 7 shows the cytotoxic activity of DG44 / CCR4 antibody and Ms705 / CCR4 antibody on CCR4 / EL4 cells.
  • the MS705 / CCR4 antibody showed higher ADCC activity than the DG44 / CCR4 antibody at any antibody concentration.
  • the DG44 / CCR4 antibody and MS705 / CCR4 antibody purified in section 3 of Example were analyzed for the composition of neutral sugar and amino sugar as follows.
  • the composition ratio of each component was calculated from the peak area of the neutral sugar 'amino sugar component in the mouth file, when the N-acetylglucosamine ratio was set to 4.
  • Table 2 shows the percentage of sugar chains in which fucose is not bonded to N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain, as calculated from the monosaccharide composition ratio of each antibody. Indicated. For the DG44 / CCR4 antibody, the ratio of sugar chains to which fucose was not bound was 8%. On the other hand, since the peak of fucose was below the detection limit for the MS705 / CCR4 antibody, the proportion of sugar chains to which fucose was not bound was estimated to be (about 100%).
  • Antibody name Percentage of sugar chains to which fucose is not bound (%)
  • an antibody composition having a sugar chain to which fucose is not bound, and an antibody molecule having a sugar chain to which fucose is not bound Biological activity was compared with that of an antibody compound in which an antibody molecule having a sugar chain to which fucose binds was mixed.
  • an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody having a sugar chain to which fucose is mixed is mixed with an MS705 / CC antibody, which is an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody composition having a sugar chain to which fucose is not bound.
  • the change in the cytotoxic activity of the antibody composition was examined as follows.
  • the target cell solution prepared in the above (1) 50 L (1 ⁇ 10 4 cells / well) of the target cell solution prepared in the above (1) was dispensed into each well of a 96-well U-shaped bottom plate (manufactured by Falcon). Next, the effector cell solution prepared in (2) was added in an amount of 50 ⁇ L (2 ⁇ 10 5 cells / ⁇ l, the ratio of effector cells to target cells was 20: 1). Furthermore, the Ms705 / CCR4 'antibody and the DG44 / CCR4 antibody were used alone or in a mixture of the two to make a total volume of 150 L, and reacted at 37 ° C for 4 hours.
  • an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody composition was prepared in which the proportion of the antibody having a sugar chain to which Fucose 'was not bound was changed. ADCC activity was measured.
  • an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody composition was prepared by adding -300 ng / mL DG44 / CCR4 antibody to 3.7 ng / mL MS705 / CCR4 antibody. The ADCC activity of the prepared antibody composition is shown in FIG.
  • an antibody molecule having a sugar chain to which fucose is bound and an antibody molecule having a sugar chain to which fucose is not bound are mixed, an antibody molecule having a sugar chain to which fucose is not bound is also present.
  • the antibody composition having a ratio of 20% or more exhibited significantly higher ADCC activity than the antibody composition having the ratio of less than 20%.
  • Figure 9 graphically shows the ADCC activity of a 10 ng / mL MS705 / CCR4 antibody sample and an antibody sample obtained by adding 9 ng of 90 ng / mL DG44 / CCR4 antibody to 10 ng / mL Ms705 / CCM antibody. .
  • ADCC activity of MS705 / CCR4 antibody was significantly reduced by adding DG44 / CCR4 antibody.
  • the ADCC activity of the 10 ng / mL Ms 705 / CCR4 antibody sample was increased even if the antibody concentration of the fan body composition was increased 100 times or more while the abundance ratio of the MS705 / CCR4 antibody and the DG44 / CCR4 antibody was 1: 9.
  • the antibody molecule having the sugar chain to which fucose is bound inhibits the ADCC activity of the antibody molecule having the sugar chain to which fucose is not bound. It was revealed that ADCC activity could not be exhibited at the same level as the product. Therefore, the antibody composition of the present invention can treat patients who could not be cured by the conventional antibody composition. ' Industrial availability
  • a composition comprising a recombinant antibody molecule that specifically binds to human CCM according to the present invention and has an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region, wherein the N-glycoside-linked complex type sugar chain is the sugar chain.
  • An antibody composition comprising a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylglycosamine at the reducing end, a transformant producing the antibody composition, a method for producing the antibody composition, and the antibody composition S drug provided.
  • the antibody composition of the present invention has a high activity of damaging cells expressing CCR, it is clinically useful as a medicament for treating diseases associated with CCR such as cancer or inflammatory disease.
  • SEQ ID NO: 32-Description of artificial sequence Amino acid sequence of antibody heavy chain variable region

Abstract

ヒトCCケモカイン受容体（CCR4）に特異的に結合し、N-グリコシド結合複合型糖鎖をFc領域に有する抗体分子からなる組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物、該抗体組成物を生産する形質転換体、該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する医薬を提供する。

Description

明細書
CCR4に特異的に結合する抗体組成物 . 枝術分野
本発明は、 ヒト CCケモカイン受容体 4 (以下、 CCR と表記する）に特異的に結合し、 N-グリ コシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる組成物であって、 N- グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合 していない糖鎖である抗体組成物、 該抗体 物を生産する形質転換体、 該抗体組成物の製造 方法および該抗体組成物を含有する医薬に関する。
背景技術
気管支喘息を始めとするアレルギー疾患は、好酸球、肥満細胞あるいは IgE、サイトカイン、 ケモカインなどの様々な因子により病態が形成されている [Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 152, 2059(1995)、 Immunol. Today, 15, 19(1994)] 。
サイトカイン.を産生する細胞は、主に CD4陽性のヘルパー T細胞（以下、 Th細胞と表記する） であり、 気管支喘息患者の気道細胞、 末梢血中には活性化 Th細胞が増加している [Am. Rev. 'Respir. Dis. , 145, S22(1992)] 。
アトピー性皮膚炎患者、 喘息患者あるいはアレルギー性炎症動物モデルでは、 IL- 4、 IL- 5が 上昇している [Clin. Immunol. Immunopathol . , 75, 75(1995)] 。 これらのサイト力インは、 ヘルパー Τ細胞のうち Th2細胞から産生される。したがって、 Τ1ι2細胞はアレルギー疾患と，連 している。 '
Th 細胞が介在する免疫疾患に対する治療法としては、 1)サイトカイン ·ケモカインに対す る拮抗剤 2)サイトカイン 'ケモカイン産生抑制剤 3)炎症性細胞の機能制御剤 4)ケミカルメデ イエ一夕一拮抗剤など、 が開発されているが、 これらは複雑なサイトカイン ·ケモカイン ·炎 症性細胞間のネットワークの一部を阻害するだけであり、 根治的ではない。
以上のことから、 複雑なサイトカイン ·ケモカイン ·炎症性細胞間のネットワークのすべて を抑制するためには、 アレルギー反応の上流部、 すなわち ¾2細胞の制御が必要となる。
細胞を制御するものとしては抗 CD4抗体があげられるが、 CD4は免疫担当細胞に広く発現し ているため、特異性に欠け、強い免疫抑制作用を伴うという欠点を有する [Int. Arch. Aller. Immunol., 118, 133(1999)]。 また、 Th2細胞が介在する免疫疾患に対する主な治療法はステ ロイド投与であるが、 ステロイドは強い副作用を有する。
ヒト CCケモカイン受容体 4 (以下、 CCR と表記する） は、 ヒト未熟好塩基球細胞株 KU- 812 から K5- 5として遺伝子クローニングされた G蛋白共役型の 7回膜貫通型のケモカイン受容体で ある [WO96/23068、 J. Biol. Chem., 270, 19495 (1995)] 。 CCR4は Th2細胞での発現が確認 されており [J. Exp. Med., 187) 129 (1998)、 J. Immunol., 161, 5111 (1998)]、 また CCR4 はエフェクター/メモリー T細胞 [Int. Immunol . , 11, 81 (1999)]、 全身性免疫に関わるメモ リ一Τ細胞に発現していることが報告されている [Nature, 400, 776(1999)] 。 以上のことか ら、 炎症が誘発された場合に活性化を受けるメモリー T細胞は、 CCMを介してリガンドである MDCや TARCによつて炎症局所に遊走し、他の炎症性細胞の活性化を促す可能性が強く示唆され る。 また、 免疫疾患以外にも成人 T細胞白血病、 菌状息肉症をはじめとする白血病、 リンパ腫 において、'腫瘍細胞表面に CCR4が発現していることが報告されている [Blood, 96, 685 (200
0)]
以上のことから、 CCR4を発現する細胞を患者の体内から除去するための治療剤は、 Th2細胞 が介在する免疫疾患に限らず、 CCR が介在する炎症性疾患および白血病の治療剤として有効で あることが期待される。 この様な特異的な分子を標的とする治療剤として、 以下に示す CCR4 に対する抗体が知られている。
CCR に対する抗体は、受容体の中和活性を有する 1G1抗体および 2B10抗体 (WO00/42074)、 アン夕ゴニスト活性を有する抗体 (WO02/15666) などが報告されているが、 これらの抗体はハ イブリドーマにより生産された抗体である。 また、 ヒト CCR4の細胞外領域に特異的に反応し、 血小板には反応性を有さず、 ヒト CCR4発現細胞に対して細胞傷害活性を示すヒト IgGl型の抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体が知られている （W003 8635) 。
一般にヒト以外の動物の抗体をヒトに投与すると、 異物として認識され、 副作用を惹起する こと [J. Clin. Oncol., 881 (1984)、 Blood, 65, 1349(1985), -J. Natl. Cancer Inst. , 80, 932(1988)、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 82, 1242 (1985)] 、 抗体の体内からの消失を速 めることにより [Blood, 65, 1349(1985), J. Nucl, Med. , 26, 1011 (1985)、 J. Natl. Cancer. Inst. , 80, 937(1988)]、抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている [J. Immunol. , 135, 1530(1985)、 Cancer Res, , 46, 6489(1986)] 。
これらの問題点を解決するために遺伝子組換え技術を利用して、 ヒト以外の動物の抗体をヒ ト型相補性決定領域 （以下、 CDR と表記する） 移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みら れている [Nature, 321, 522(1986)] 。 ヒト化抗体は、 ヒト以外の動物の抗体に比べ、 免疫原 性が低下し [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 4220(1989)] 、 治療効果が延長することが 報告されている [Cancer Res. , 56, 1118(1996)、 Immunol. , 85, 668(1995)]。
ヒト化抗体は、 遺伝子組換え技術を利用して作製するため、 様々な形態の分子として作製す ることができる。例えば、 エフェクター機能の高いヒト化抗体を作製することができる [Cane er Res. , 56, 1118(1996)] 。
近年、 Rituxanによる非ホジキン白血病患者の治療、 Herceptinによる乳癌患者の治療におい て、抗体 g薬が患者のエフェクター細胞に強い ADCC活性を惹起した場合には、より高い治療効 果が得られている (Blood, 99, 754, 2002; J. Clin. Oncol. , 1, 3940, 2003; Clin. Cancer Res, , 10, 5650, 2004)。 '
ヒト IgG'lサ クラスの抗体は、 その Fc領域と抗体レセプ夕一 （以下、 Fcァ Rと表記する） あるいは各種補体成分との相互作用を介して、 ADCC活性および CDC活性を発現する。 抗体と F cァ Rとの結合においては、 抗体のヒンジ領域及び C領域の第 2番目のドメイン （以下、 Cァ' 2' ドメインと表記する）に結合している糖鎖の重要性が示唆されている [Chemical Immunology, 65, 88, (1997) ] 。
抗体 IgG分子の Fc領域に結合している N-グリコシド結合複合型糖鎖の非還元末端へのガラ クトースの付加、および還元末端の N-ァセチルグルコサミンへのフコースの付加に関しては多 様性があることが知られており [Biochemistry, 36, 130(1997)] 、 特に糖鎖の還元末端の N - ァセチルグルコサミンへのフコースの付加により、抗体の ADCC活性が大きく低下することが報 告されている [WO00/61739、 J. Biol. Chem. , 278, 3466 (2003)] 。 一般に、医薬品として利用される抗体組成物の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、 動物細胞、 例えばチャイニーズノヽムスター卵巣組織由来の CH0細胞などを宿主細胞として製造 されているが、 発現させた抗体組成物の糖鎖構造は宿主細胞によって異なる。
抗体生産細胞内のひ 1 , 6—フコシルトランスフェラーゼ （以下、 FUT8と表記する） 、 GDP-マ ンノース 4, 6-デヒドラ夕ーゼ （以下、 GMDと表記する）、 GDP-4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノー ス -3 , 5-ェピメラーゼ （以下、 Fxと表記する） の活性を低下または欠失することにより、 Fc領 域を有する抗体分子からなる «物中で、 該組成物中に含まれる Fc領域に結合する N-グリコ シド結合複合型糖鎖の還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 の割合を増加させることができる (顧/ 31140) 。
発明の鬨示 '
本発明の目的は、 ヒト CCケモカイン受容体 4 (以下、 CCR4と表記する） に特異的に結合し、 N -グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる組成物であつ て、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルグルコ ミンにフコースが 結合していない糖鎖である抗体組成物、 該抗体組成物を生産する形質転換体、 該抗体組成物の 製造方法および該抗体組成物を含有する医薬等を提供することにある。本発明の抗 CCR4抗体組 成物はフコ一スが結合した糖鎖を有する抗体分子を含まないためエフェク夕一機能が増強され る。そのため、 CCR4を発現した Τ1ι2細胞を患者の体内から減少させる治療に有用である。エフ ェク夕一機能が増強された抗体を治療に用レ、ることにより、 化学療法、'放射性同位体元素標識 体などと併用が不要となることから患者への副作用を軽減させることが期待される。 また、 患 者への治療薬の投与量を減少させることで患者への負担の軽減などが期待される。
本発明は、 以下の （1 ) 〜 （5 5 ) に関する。
( 1 ) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) に特異的に結合し、 Ν-グリコシド結合複合型糖 鎖を Fc領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体組成物であつて、 N-グリコシド結合複 合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖で ある抗体組成物。
( 2 ) N-グリコシド結合複合型糖鎖が、 該糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位 にフコースの 1位がひ結合していな 、糖鎖である、 （ 1 ) に記載の抗体組成物。
( 3 ) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) の細胞外領域に特異的に結合する、 （ 1 ) 記 載の抗体組成物。
( 4 ) 細胞外領域が、 配列番号 36 で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 .98〜112、 176〜206 および 271~284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である （3 ) に記載の抗体組成物。
( 5 ) 細胞外領域が、 配列番号 36 で示されるアミノ酸配列の 2〜29番目に存在するェピ トープである （3 ) または （4 ) 項に記載の抗体組成物。
( 6 ) 細胞外領域が、 配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜29番目に存在するェピ ト一プである （3 ) 〜 （5 ) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
( 7 ) 細胞外領域が、 配列番号 36で示されるアミソ酸配列の 13〜25番目に存在するェピ トープである （3 ) 〜 （6 ) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
( 8 ) 配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含むペプチドのうち、 16、 19、 20および 番目の少なくとも 1つのチロシン残基が硫酸化されたぺプチドへの結合性が配列 番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含むぺプチドへの結合性よりも低いことを特 徴とする （7) に記載の抗体組成物。
(9) ヒト血小板に反応性を示さない（ 1 ) ~ ( 8 )のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(10) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) の細胞外領域に特異的に結合し、 CCR4リガン ドである TARC (thymus and activation-regulated chemokine; たは MDC ^macrophage-deri ved chemokine) の CCR4への結合を阻害する活性を有さなぃ （1)〜（9) のいずれか 1項に 記載の抗体組成物。
. (1 1) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4)発現細胞に特異的に結合する （ 1)〜（ 10) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(12) ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4)発現細胞に対し細胞傷害活性を示す（ 1 )〜 (1 1) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(13) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4)発現細胞に対し、 非ヒト動物由来ハイプリド 一マが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞傷害活性を示す （1)〜（12) のいずれ か 1項に記載の抗体組成物。
(14) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4)発現細胞が、 ヘルパー T細胞である、 （1 1). 〜（13) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(15) 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害 （ADCC) 活性である （12) または （13) に記載の抗体組成物。 ' ，
(16) それそれ配列番号 14、 15、 16で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖 (H 鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 （CDR) 1、 CDR2、 CDR3を含む、 (1)〜（15) の いずれか 1項に記載の抗体組成物。
(17) それそれ配列番号 17、 18、 19で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子軽鎖 (L 鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 （CDR) 1、 CDR2、 CDR3を含む、 (1)〜（16) の いずれか 1項に記載の抗体組成物。
(18) それぞれ配列番号 14、 15、 16で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖 (H 鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 （CDR) 1、CDR2、CDR3、およびそれぞれ配列番号 17、 18、 19で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (CDR) 1、 CD R2S CDR3を含む、 （ 1 )〜（17) のいずれか 1項に記載 ©抗体組成物。
(19) 伝子組換え抗体がヒト型キヌラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である （ 1 ) ~ (18) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(20) ヒト型キメラ抗体がヒト CCケモカイン受容体（CCR4) に特異的に結合するモノク ローナル抗体の重鎖 （Η鎖） 可変領域 （V領域） ¾よび軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (C DR)を含む、 （19) に記載の抗体組成物。
(21) 抗体分子の重鎖 （Η鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 21で示されるアミノ酸 配列を含む、 （ 20 ) に記載の抗体組成物 0
(22) 抗体分子の軽鎖 （ L鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 23で示されるアミノ酸 配列を含む （20) に記載の抗体組成物。 (23) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 21で示されるアミノ酸 配列を含み、 かつ、 抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域が、 配列番号 23で示されるアミノ酸配列を 含む （20) 〜 （22) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(24) ヒト型 CDR移植抗体がヒト CCケモカイン受容体（CCR4) に特異的に結合するモノ クローナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (CDR)を含む、 （ 19 ) に記載の抗体組成物。
(25) ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4)に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 （CDR) とヒト抗体の H 鎖 V領域および L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR) を含む、 （24)に記載の抗体組成物。
(26) ヒト CCケモカイン受容体（CCR4)に特異的に結合するモノクロ一ナル抗体の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 （CDR) とヒト抗体の H 鎖 V領域および L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR)、 ならびにヒト抗体の H鎖定常領域 （C 領域） および L鎖 C領域を含む、 （24) または （25) に記載の抗体組成物。
(27) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 24で示されるアミノ酸 配列、 または配列番号 24で示されるアミノ酸配列の 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の. L ss 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミ ノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、 （24) 〜 （26) のいずれ か 1項に記載の抗体組成物。
(28) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 25で示されるアミノ酸 配列、または配列番号 25で示されるァミノ酸配列の 28番目の Thi "および 97番目の Alaのうち 少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、 (24) 〜 （26) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(29) 抗体分子の軽鎖 （L鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 26で示されるアミノ酸 配列、または配列番号 26で示されるアミノ酸配列の 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目 Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換さ れたァミノ酸配列を含む、 （24) 〜 （26) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(30) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 で示されるアミノ酸 配列、 または配列番号 24で示されるアミノ酸配列の 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Lyss 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミ ノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域が、配列番号 26で示されるアミノ酸配列、 または配列番号 26で示されるアミノ酸配列, - の 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1 つのアミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含む、 （24) 〜 （27) および （29) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(31) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 25で示されるアミノ酸 配列、または配列番号 25で示されるアミノ酸配列の 28番目の Thrおよび 97番目の Alaから選 ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域が、 配列番号 26で示されるアミノ酸配列、 または配列番 号 26で示されるアミノ酸配列の 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配 列を含む、 （24) 〜 （26)'、 （28)および（29) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(32) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 それそれ配列番号 24、 25、 27、 2
8、 29、 30、 31および 32で示されるアミノ酸 列から選ばれるアミノ酸配列を含む、 （24) 〜 （28)、 （29) 〜 （3 1) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(33) 抗体分子の軽鎖 （L鎖） 可変領域 （V領域） せ、 それそれ配列番号 26、 33、 34お よび 35で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む、 (24)〜（2 6)、 (2
9. ) 〜 （'3 1) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(34) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 M、 25、 27、 28、 29、 3 0、 31および 32で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、かつ、抗体分子の軽鎖 (L 鎖） V領域が、 配列番号 33、 34および 35で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列 を含む （ 24；) 〜 （ 2 6 )、 （ 32 ) および （ 33 ) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
(35) 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、配列番号 27または で示される アミノ酸配列を含み、 かつ、 抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域が配列番号 35で示されるアミノ酸 配列を含む、 （24) 〜 （2 6) のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
.(36) ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) に特異的に結合する抗体分子をコードする D NAを宿主細胞に導入して得られる、 （ 1 )〜（ 35 ) のいずれか 1項に記載の抗体組成物を生 産する形質転換体。
(37) 宿主細胞が,、 細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素、 また は N-グリコシド結合複合型糠鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が ひ結合する糖鎖 飾に関与する酵素を失活ずるようにゲノムが改変された細胞である、 （36) に記載の形質転換体。
(38) 宿主細胞が、 細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素、 また は N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が ひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノヅクァゥトされた細 胞である、 （ 36 ) に記載の形質転換体。'
(39) 細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素が、 GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラ夕ーゼ（GMD)および GDP-4-ケト -6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼ（F X) からなる群から選ばれる酵素である、 （37) または （38) に記載の形質転換体。
(40) GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼが、以下の（a)および (b)からなる群から選ば れる DNAがコードする蛋白質である、 （39) に記載の形質転換体。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA; .
(b) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(41) GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼが、 以下の （a) 〜（c) からなる群から選ば れる蛋白質である、 （39) に記載の形質転換体。
( a ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質； (b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入 および'/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕ーゼ 活性を有する蛋白質；
( c ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列と 80%'以上の相同性を有するァミノ酸配列からな り、 かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ夕一ゼ活性を有する蛋白質。
(42) GDP-4-ケト- 6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼが、以下の （a)および (b) からなる群から選ばれる D.NAがコードする蛋白質である、 （39) に記載の形質転換体。
. (a) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA;
(b) 配列番号 3で表される塩基配列からなる' DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、 かつ GDP- 4-ケト -6-デォキシ- D-マンノース- 3，5-ェピメラ一ゼ活性を有する蛋白質を. コードする DNA。
(43) GDP- 4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3, 5-ェピメラーゼが、 以下の （a)〜（c) からなる群から選ばれる蛋白質である、 （39) に記載の形質転換体。
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入. および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ GDP- 4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース -3,5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質；
( c ) 配列番.号 4で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸配列からな り、 かつ GDP- 4-ケト- 6-デォキシ -D-マンノース- 3,5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質。
(44) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位に'フコー スの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素が《 1 , 6—フコシルトランスフヱラーゼである (37) または （38) に記載の形質転換体。 .
(45) ひ 1,6—フコシルトランスフェラーゼが、 以下の （a)〜（ からなる群から選ばれ る DNAがコードする蛋白質である、 （44) に記載の形質転換体。
(a) 配列番号 5で表される塩基配列からなる DNA;
(b) 配列番号 6で.表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 5で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ αΐ, 6—フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA；
(d) 配列番号 6で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ《1,6—フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(46) ひ 1,6—フコシルトランスフェラ一ゼが、 以下の （a)〜（f)からなる群から選ばれ る蛋白質である、 （44) に記載の形質転換体。
( a ) 配列番号 7で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b ) 配列番号 8で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠'失、 置換、 挿入 およひ'/または付加されたァミノ酸配列からなり、かつ 1 , 6—フコシルトランスフェラーゼ活 性を有する蛋白質； (d) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ α 1 , 6—フコシルトランスフェラーゼ活 性を有する蛋白質； ·
( e ) 配列番号 7で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸配列からな り、 かつ《1,6—フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質；
(f) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな り、 かつひ 1,6—フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
.'(47) 形質転換体が FERM BP- 8467である （46) に記載の形質転換体。
(48) 宿主細胞が、 下記の（a)〜（i)からなる群から選ばれる細胞である （36) 〜 （4 7) のいずれか 1項に記載の形質転換体。 · .
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラヅトミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；
(c) マウスミエローマ細胞株 NS0細胞； ' . -
(d) マウス エローマ細胞株 SP2/0- Agl4細胞；
(e) シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を産生するハイプリドーマ細胞； '
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h)胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞。 '
(49) (36) 〜 （48) のいずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物 中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該抗体組成物を採取し、 精製する、 （1) 〜 （35) のいず れか 1項に記載の抗体組成物の製造方法。
(50) (49) に記載の製造方法により得られる、 （1) 〜 （35) のいずれか 1項に 記載の抗体組成物。
(5 1) (1) 〜 （35) および （50) いずれか 1項に記載の抗体組成物を有効成分と して含有する医薬。
(52) ( 1 ) 〜 （ 35 ) および （ 50 ) のいずれか 1項に記載の抗体組成物を有効成分 として含有するヒト CCケモカイン受容体 (CCR4) 関連疾患の治療薬。
(53) ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4) 関連疾患が、 癌または炎症性疾患である （ 5 2) に記載の治療薬。
(54) ( 1 ) 〜 （ 35 ) および （ 50 ) のいずれか 1項に記載の抗体組成物を患者に投 与することを特徴とする、 ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) 関連疾患の治療方法。
(55) ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4) 関連疾患の'治療薬を製造するための （ 1 ) 〜 ( 35 ) および （ 50 ) のいずれか 1項に記載の抗体組成物の使用。
以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2003年 10 月 8 日に出願された日本国特許出願 2003-35016 号の優先権を主張するものであり、 当該特許出願の明細書及び図面に記載される 内容を包含する。
本発明のヒト CCMに特異的に結合し、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する遺伝 子組換え抗体分子からなる抗体組成物であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元 末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物としては、 該 N-グりコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコー スの 1位がひ結合していない糖鎖である抗体組成物があげられる。
抗体分子には Fc領域があり、それらの領域には N-グリコシド結合糖鎖が結合する。従って、 抗体 1分子あたり 2本の糖鎖が結合している。
N-グリコシド結合糖鎖としては、コァ構造の非還元末端側にガラクトース- N-ァセチルグルコ サミン （以下、 Gal- GlcNAcと表記する） の側鎖を並行して 1ないしは複数本有し、 更に Gal - G lcNAcの非還元末端側にシアル酸、 バイセクティングの N-ァセチルグルコサミンなどを有する コンプレックス型 （複合型） 糖鎖をあげることができる。
本発明において、 N-グルコシド結合複合型糖鎖としては、 下記化学式 1で示される。
化学式 1
±Fucor 1
土 Gal 1 4GlcNAc β 1 2Man Of 1
6 6
土 GlcNAc 1 4Man^ 1 4GlcNAC iS 1 4G,cNAc
Figure imgf000010_0001
土 Gal 1 4GlcNAc β 1 2Man a 1
本発明において、 フコースが結合していない糖鎖としては、 上記で示された化学式中、 還元 末端側の N-ァセチルグルコサミンにはフコースが結合されていないものであればよく、非還元 末端の糖鎖の構造はいかなるものでもよい。
したがって、 本発明の抗体組成物としては、 上記の糖鎖構造を有していれば、 単一の糖鎖構 造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、 複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子か ら構成されていてもよい。
本発明において、糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していないとは、 実質的にフコースが結合していないことをいう。 実質的にフコースが結合していない抗体組成 物とは、 具体的には、 後述の 4に記載の糖鎖分析において、 フコ スが実質的に検出できない 程度の抗体組成物である場合をいう。 実質的に検出できない程度とは、 測定の検出限界以下で あることを意味する。糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない本 発明の抗体組成物は、 高い ADCC活性を有する。
N -グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物中に含まれる、 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子 の割合は、 抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [生物化学実験法 蛋白質糖鎖研究法 (学会出版センター)高撟禮子編（1989) ]を用い、 糖鎖を遊離させ、 遊離さ せた糖鎖を蛍光標識体又は同位元素標識し、 標識した糖鎖をタ口マトグラフィ一法にて分離す ることによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖を HPAED-PAD法 [ジャーナル-ォ ブ. リキッド .クロマトグラフィー （j , Liq. Chromatogr . ) , 6 , 1577 (1983 ) ]によって分析 することで決定することができる。
本発明の抗体組成物としては、ヒト CCR4の細胞外領域に特異的に反応する遺伝子組換え抗体 分子からなる抗体組成物であって、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の Ν-ァセ チルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物などがあげられるが、 そ の.なかでもヒト血小板に反応性を示さない抗体 物が好ましい。
ヒト CC の細胞外領域としては、 配列番号 36に示されるアミノ酸配列の 1〜39,、 98〜112、 176〜206または 271〜284番目を含むアミノ酸配列で表され、好ましくは配列番号 36に示され るアミノ酸配列の 2~29番目 （配列番号 37 )、より好ましくは配列番号 36に示されるアミノ酸 配列の 12〜29番目 （配列番号 38 )、さらに好ましくは配列番号 36に示されるアミノ酸配列の 1 2〜25番目で表されるボリペプチド又はペプチドがあげられる。 したがって、 本発明の抗体組 成物としては、 好ましくは、配列番号 36に示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176〜20 6または 271〜284番目を含む領域、 より好ましくは配列番号 36に示されるアミノ酸配列の 2 . 〜29番目 （配列番号 37)、 さらに好ましくは配列番号 36に示されるアミノ酸配列の 12〜29番 目 （配列番号 38 )、 特に好ましくは配列番号 36に示されるアミノ酸配列の 12〜25番目で表さ れるポリぺプチド又は^^プチドに、 特異的に反応する抗体組成物であつて、 Ν-グリコシド結合 複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 である抗体組成物などがあげられる。
ヒト血小板に反応性を示さないとは、 抗体がヒト血小板と実質的に反応しないことをいい、 具体的には、 フローサイトメ一夕一などの抗体と細胞の結合を検出できる装置による測定で反 応性を示さないことをいう。
また、 本発明の抗体組成物としては、 配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を 含むペプチドのうち、 16、 19、. 20および 22番目の少なくとも 1つのチロシン残基が硫酸化さ れたぺプチドへの結合性が、 配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含む合成べ プチドへの結合性よりも、 反応性が低い抗体組成物があげられる。
本発明の抗体組成物としては、 CCR4リガンドである TARC (thymus and activation- regulat ed c eraokine) または MDC (macrophage-derived c emokine)の CCR4への結合を阻害する活性 を有さない遺伝子組換え抗体組成物を包含する。 CCR4リガンドである TARCまたは MDCの CCR4 への結合を阻害する活性を有さないとは、 抗体組成物がリガンドと受容体との結合を実質的に 阻害できないことをいい、 具体的には、 抗体組成物が高濃度であってもリガンドと受容体との 結合に影響を与えないことをいう。ここ.で、高濃度とは抗体の濃度が 50〃g/mL以上であること をいう。
また、 本発明の抗体組成物としては、 ヒト CCR4を発現する細胞 （以下、 ヒト CCR4発現細胞 と称す）に特異的に結合し、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する遺伝子組換え抗体 分子からなる抗体組成物であって、 該 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N- ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物などがあげられるが、 そのなかでもヒト CCM発現細胞に対し細胞傷害活性を有する抗体組成物が好ましい。 ヒト CCR4発現細胞としては、 ヘルパー T2細胞 （以下、 Th2細胞と称す） などがあげられる。 Th2細胞は、 インターロイキン _ 4 (以下、 IL- 4と称す） 、 インターロイキン一 5 (以下、 IL -5と称す） およびインターロイキン一 1 3 (以下、 IL- 13と称す） を産生する細胞である。 細胞傷害活性としては、 補体依存性細胞傷害活性 (以下、 CDC活性と表記する）あるいは抗体 依存性細胞傷害活性 (以下、 ADCC活性と表記する）などがあげられる。
ヒト CCR4発現細胞に対し細胞傷害活性を有する抗体組成物であって、 該 N-グリコシド結合 複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 である抗体組成物は、該抗体組成物の有する細胞傷害活性によりヒト CCR4発現細胞である Th2 細胞を傷害することにより、 Τ1ι2細胞を除去することができる。 したがって、該抗体組成物は Τ h2細胞から IIHk IL- 5、 IL- 13などのインターロイキンの産生を抑制することができる。 本発明の抗体 «物は、 ヒト型キメラ抗体組成物、 ヒト型 CDR移植抗体組成物およびヒト抗 体組成物、 ならびにそれらの抗体断片組成物を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLとヒト抗体の CHおよび CLとか らなる抗体をいう。 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラヅ ト、 ハムスター、 ラビット等、 ハ イブリドーマを作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体組成物は、ヒト CCR4に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子を有す る動物細胞用発現ベクターにそれそれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、 動物 細胞へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
ヒト型キメラ抗体の CHとしては、 ヒトイムノグロブリン （以下、 hlgと表記する） に属すれ ぱいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、 さらに hlgGクラスに属する hi gG hIgG2s hIgG3、 gG4といったサブクラスのいずれも用い.ることができる。 また、 ヒト型 キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよく、 クラスあるいは; Iクラス のものを用いることができる。
本発明のヒト CCR4に特異的に結合するヒト型キヌラ抗体組成物としては、それぞれ配列番号 14、 15および 16で示されるアミノ酸配列からなる VHの CDR1、 CDR2、 CDR3および/またはそ れそれ配列番号 17、 18、 19で示されるアミノ酸配列からなる VLの CDR1、 CD 2S CDR3S を含む 抗ヒト CCR4キヌラ抗体、 抗体の VHが配列番号 21で示されるァミノ酸配列および/または VL が配列番号 23で示されるァミノ酸配列を含む抗ヒト CCR4キヌラ抗体、抗体の VHが配列番号 2 1で示されるァミノ酸配列およびヒト抗体の CHが hlgGlサブクラスのァミノ酸配列からなり、 抗体の VLが配列番号 23で示されるァミノ酸配列およびヒト抗体の CLが クラスのアミノ酸配 列からなる抗ヒト CCR4キメラ抗体組成物があげられる。
ヒト型 CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRをヒト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体を意味する。
本発明のヒト型 CDR移植抗体組成物は、 CCR4に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体の V Ηおよび VLの CDRを任意のヒト抗体の VHおよび VLのフレームワーク （以下、 FRと表記する） に移植した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒト抗体の重鎖定常領域 (以下、 CHと表記する） および軽鎖定常領域 （以下、 CLと表記する） をコードする DNAを有する動物細胞用発現べクタ —にそれそれ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 該発現ベクターを動物細胞 へ導入することにより発現させ、 製造するこ'とがでぎる。
ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれ ば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 Protein Data Bankなどのデータベース に登録されているヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列、 またはヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共通アミノ酸配列 (Sequences of Proteins of Immunological In terest , US Dept . Health and Human Services , 1991 ) などがあげられる。
本発明の抗体の CHとしては、 Mgに属すればいかなるものでもよいが、 MgGクラスのものが 好適であり、 さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2, hIgG3 gG4といったサブクラスの いずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移植抗体の CLとしては、 hlgに属すればいず れのものでもよく、 クラスあるいは λクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型 CDR移植抗体組成物としては、それぞれ配列番号 14、 15、 16で示されるアミ ノ酸配列からなる抗体 VHの CDR1、 CDR2、 CDR3および またはそれそれ配列番号 17、 18、 19 で示されるァミノ酸配列からなる VLの CDR1、 CM2、 CDR3を含むヒト型 CDR移植抗体 物ま たは該抗体断片組成物などがあげられる。
これらのヒト型 CDR移植抗体組成物のなかでも、 抗体の VHが配列番号 24で示されるァミノ 酸配列、 または配列番号 24で示されるアミノ酸配列の 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目 © L ss 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも' 1つのァ ミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植抗体組成物、 抗体の VHが、配列番号 25で示されるァミノ酸配列、または配列番号 25で示されるアミノ酸配 列の 28番目の Thrおよび 97番目の Alaのうち少なくとも 1つ ©アミノ酸残基が置換されたァ ミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植抗体組成物、 抗体の VLが、 配列番号 26で示されるアミノ酸 配列、 または配列番号 26で示されるアミノ酸配列の 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の G1 n、 および.88番目の alから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配 列を含むヒト型 CDR移植抗体 物が好ましく、 抗体の VHが配列番号 で示されるアミノ酸 配列の 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Lys、 44番目の Gly、 6番目の Lys、 および 9 7番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたァ ミノ酸配列を含み、かつ、抗体の VLが配列番号 26で示されるアミノ酸配列のうち、 2番目の I le、 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ 酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植抗体組成物、 抗体 の VHが配列番号 25で示されるァミノ酸配列の 28番目の Thrおよび 97番目の Alaから選ばれ る少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、 抗体の VLが配列番号 26で示されるアミノ酸配列の 2番目の Ile、3番目の Val、50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換さ れたアミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植抗体組成物がより好ましい。 .
具体的には、 抗体の VHが配列番号 24、 25、 27、 28、 29、 30、 31および 32で示されるアミノ 酸配列から選ばれるァミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植抗体組成物、抗体の VLが、配列番号 2 6、 33、 34および 35で示されるアミノ酸配列から選ばれる 1つのアミノ酸配列を含むヒト型 C DR移植抗体組成物、 抗体の VHが配列番号 24、 25、 27、 28、 29、 30、 31および 32で示される アミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、 かつ抗体の VLが、 配列番号 26、 33、 34 ¾よ び 35から選ばれるァミノ酸配列を含むヒト型 CDR移植抗体組成物などがあげられる。
本発明のヒト型 CDR移植抗体組成物としては、抗体の VHが配列番号 27または 28で示される アミノ酸配列を含み、 かつ、抗体の VLが配列番号 35で示されるアミノ酸配列を含むヒト型 CD ϋ移植抗体組成物組成物が最も好ましい。
これらのアミノ酸配列にお て、 1以上のアミノ酸が欠失、 付加、 置換および/または挿入 され、 ヒト CCR4の細胞外領域に特異的に結合し、ヒト血小板に反応性を示さない抗体または抗 体断片も本発明の抗体組成物に包含される。
欠失、 置換、 挿入および/または付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限 定されないが、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ 'イン 'モレ キュラー.バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10 , 6487 ( 1982 )、 Proc . Natl . Acad . S ci . , USA, 79 , 6409 ( 1982 )、 Gene , 34 , 315 ( 1985 )、 Nucleic Acids Research , 13 , 4431 ( 19 85)、 Proc . Natl . Acad . Sci USA, 82 , 488 ( 1985 )等に記載の ^位特異的変異導入法等の周知の 技術により、 欠失、 置換もしくは付加できる程度の数であり、 例えば、 1〜数十個、 好ましく は 1〜2 0個、 より好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個である。
本発明の抗体糸 物のァミノ酸配列において 1以上のァミノ酸残基が欠失、 置換、 揷入また は付加されたとは、 同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のアミノ酸配列中において、 1また は複数のアミノ酸残基の欠失、 置換、 揷入または付加があることを意味し、 欠失、 置換、 挿入 または付加が同時に生じてもよく、 置換、 挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天 然型とを問わない。 天然型アミノ酸残基として 、 L-ァラニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラ ギン酸、 L -グルタミン、 L -グルタミン酸、 グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイ シン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L -トリブトファン、 L-チロシン、 L-バリン、 L-システィンなどがあげられる。
以下に、 相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。 以下の同一群に含まれるアミ ノ酸残基は相互に置換可能である。 '
A群：ロイシン、 イソロイシン、 ノルロイシン、 ノ リン、 ノルノ リン、 ァラニン、 2 -ァミノ ブタン酸、 メチォ ン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t -プチルァラニン、 シクロへキ シルァラニン
B群：ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 イソァスパラギン酸、 イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸 '
C群：ァスパラギン、 グルタミン ■ '
D群： リジン、 アルギニン、 オル二チン、 2，4-ジァミノブ夕ン酸、 2 , 3-ジァミノプロピオン 酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン
G群：フエ二ルァラニン、 チロシン
本発明の遺伝子組換え抗体断片組成物は、ヒト CC に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組 成物の抗体断片であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端の N-ァセチルグル コサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体 Fc領域の一部または全部を含んで ヽる 抗体断片組成物である。 '
本発明の抗体断片組成物としては、 Fab、 Fab \ F ( ab ' )2、 scFv、 diabody、 dsFvおよび CDR を含むぺプチドなどの抗体断片組成物であつて、 N-グリコシド結合複合型糖鎖 該糖鎖の還元 末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体 Fc領域の一部ま たは全部を含む抗体断片組成物があげられるが、該抗体断片組成物に抗体の Fc領域の一部また は全部を含まない場合は、該抗体断片と、 N-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端の N-ァセチ ルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体 Fc領域の一部または全部と融 合させるか、または該 Fc領域の一部または全部を含む、蛋白質との融合蛋白質組成物とすれば よい。
Fabは、 IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち （H鎖の 224番目のァ ミノ酸残基で切断される） 、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフイド結合で結合した 分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。 - 本発明の Fabは、本発明のヒト CCR4に特異的に結合する抗体組成物を蛋白質分解酵素パパ,ィ ンで処理して得ることができる。 または、 該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現べ クタ一あるいは真核生物用発現べクタ一に揷入し、 該ベクタ一を原核生物あるレヽは真核生物へ 導入することにより発現させ、 製造することができる。
F(a ) ' )2は、 IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち （H鎖の 234番目 のアミノ酸残基で切断される） 、 Fabがヒンジ領域のジスルフィド^を介して結合されたも のよりやや大きい、 分子量約 10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の F(ab ' )2は、本発明のヒト CCR4に特異的に結合する抗体組成物を蛋白質分解酵素ぺ プシンで処理して得ることができる。 または、下記の Fab 'をチォエーテル結合あるいはジスル フイド結合させ、 作製することができる。
Fab'は、 上記 F (ab ' )2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約 5万の抗原結合 活性を有する抗体断片である。 '
' 本発明の Fab 'は、本発明のヒト CCR4に特異的に結合する F (ab ' )2組成物を還元剤ジチオスレ ィトール処理して得ることができる。 または、該抗体の Fab '断片をコードする DNAを原核生物 用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該ベクターを原核生物あるいは真 核生物へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する） を用い て連結した、 VH- P- VLないしは VL- P- VHポリぺプチドで、 抗原結合活性を有する抗体断片であ る。
本発明の scFvは、 本発明のヒト CCR4に特異的に結合する抗体組成物の VHおよび VLをコー ドする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクターあ る 、は真核生物用発現べク夕一に挿入し、 該発現べク夕一を原核生物ある 、は真核生物へ導入 することにより発現させ、 製造することができる。
diabodyは、 scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。 二価の抗原結合活性は、 同一であることもできるし、.一方を異なる抗原結合活性とすることも できる。 本発明の diabodyは、本発明のヒト CCR4に特異的に結合する抗体の VH組成物および VLをコ —ドする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを Pのアミノ酸配列の長さが 8残基以下とな るように構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現べクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 製造することが できる。
dsFvは、 VHおよび VL中のそれそれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリぺプチ ドを該システィン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。 システィン残基 に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法（Protein Engineering, 7 , 697-704 , 1994) に従って、 抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明の dsFvは、 本発明のヒト CCR4に特異的に結合する抗体組成物の VHおよび VLをコー ドする cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクターあ ' るいは真核生物用発現ベクターに揷入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入 することにより発現させ、 製造することができる。 -
CDRを含むぺプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構成される。複 数の C を含むぺプチドは、 直接または適当なぺプチドリンカーを介して結合させることがで • ぎる。
本発明の CDRを含むぺプチドは、 本発明のヒト CCR4に特異的に結合する抗体組成物の VHお よび VLの CDRをコードする丽 Aを構築し、該 DNAを原'核生物用発現ベクターあるいは真核生物 用発^べク夕一に挿入し、 該発現べク夕一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより 発現させ、 製造することができる。 '
また、 CD を含むぺプチドは、 Fmoc法 （フルォレニルメチルォキシカルボニル法）、 tBoc法 (t-ブチルォキシカルボニル法） などの化学合成法によつて製造することもできる。
本発明の形質転換体としては、ヒト CCR4に特異的に結合する抗体分子をコードする DNAを宿 主細胞に導入して得られる形質転換体であって、 本発明の抗体組成物を生産する形質転換体で あればいかなる形質転換体でも包含される。具体的な例としては、 ヒト CCR4に特異的に結合す る抗体分子をコードす,る DNAを以下の（a)または (b )などの宿主細胞に導入して得ちれる形質転 換体があげられる。 -
( a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に閧与する酵素が失活するようにゲノムが改 変された細胞；
(b ) ' N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位 が《結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が^^失活するようにゲノムが改変された細胞。 . 上述において、 酵素が失活するようにゲノムが改変されたとは、 該酵素の発現を欠失させる ように該酵素をコードする遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、 または該酵素を失活さ せるように該酵素をコードする遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することをいう。 変異を導 入するとは、 ゲノム上の塩基配列を欠失、 置換、 挿入および/または付加させるといった塩基 配列の改変を行うことをいう。 このように改変されたゲノム遺伝子の発現または活性が完全に 抑制されることをゲノム遺伝子がノックアウトされるという。 細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素としては、 GDP-マンノース 4 , 6 - デヒドラターゼ （GMD)、 GDP- 4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼ （Fx) など があげられる。
GDP-マンノース 4, 6-デヒドラ夕ーゼどしては、
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b ) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラタ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA； などがあげられる。 '
GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラ夕ーゼとしては、
( a ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4, 6-デヒドラ夕ーゼ 活性を有する蛋白質； -
( c ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ酸配列からな り、 かつ GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質； . などがあげられる。
GDP- 4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼとしては、
( a ) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA；
(b ) 配列番号 3·で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ GDP- 4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質を コードする DNA ;'
などがあげられる。，
GDP- 4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼとしては、
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b ) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ GDP-4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース -3 , 5-ェピメラ一ゼ'活性を有する蛋白質；
(c ) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有する ミノ酸配列からな り、 かつ GDP- 4-ケト -6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質； などがあげられる。
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が 結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 《 1 , 6-フコシルトランスフェラーゼがあげられ る。
本発明において、 ひ 1 , 6-フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（a)、 （b)、 （c )または（d) の DNAがコードする蛋白質、
( a ) 配列番号 5で表される塩基配列からなる DNA
(b) 配列番号 6で表される塩基配列からなる DNA
( c) 配列番号 5で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつひ 1 , 6-フコシルトランスフェラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA (d) 配列番号 6で表される塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件でハイプリダイズ し、 かつ α ΐ , 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
または、
( e ) 配列番号 7で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質
(f ) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(g) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入およ び Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ《1 , 6-フコシルトランスフェラ一ゼ活性を 有する蛋白質
(h) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入 よ び/または付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ《 1 , 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を 有する蛋白質
( i ) 配列番号 7で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 かつひ 1 , 6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質 -
( j ) 配列番号 8で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 かつひ 1 , 6-フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質 ' 等があげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素のァミノ酸配列をコードする DNA としては、'配列番号 1または 3で表される塩基配列を有する DNA、 配列番号 1またば 3で表さ れる塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ細胞内糖ヌク レォチド GDP-フコースの合成に関与する酵素活性を有する蛋白質をコードする DNAなどがあげ られる。 - · '
ひ 1，6—フコシルドランスフヱラーゼのアミノ酸配列をコードする DNAとしては、配列番号 5 または 6で表される塩基配列を有する DNA、配列番号 5または 6で表される塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつひ 1 , 6—フコシルトランスフェラーゼ 活性を有する蛋白質をコードする DNAなどがあげられる。
本発明において、 ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNAとは、 例えば配列番 号 1、 3、 5または 6で表される塩基配列からなる丽 Aなどの DNAまたはその一部の断片をプロ ーブとして、 コロニー 'ハイブリダィゼ一シヨン法、 プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あ るいはサザンハイブリダィゼーション法等を用いることにより得られる DNAを意味し、 具体的 には、 コ Dニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0.7〜1 .0Mの 塩ィ匕ナトリウム存在下、 65°Cでハイブリダイゼーションを行った後、 0.1〜2倍濃度の SSC溶液
(1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150 塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあげることができる。 ノヽイブリダィゼーシヨンは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edition, Co Id Spring Harbor Laboratory Press , 1989(以下、モレキユラ1 ~~ ·クローニング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons , 1987- 1997 (以下、カレント · プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジーと略す） 、 DNA Clonin 1 : Core Techni ques , A Practical Approach, Second Edition, Oxford University ( 1995 )等に言 3載されてい る方法に準じて行うことができる。 ストリンジヱントな条件下でハイブリダイズ可能な DNAと して具体的には、 配列番号 1、 3、 5または 6で表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同 性を有する DNA、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、 特に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAをあげることができ る。
本発明において、 配列番号 2または 4で表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、 置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ細胞内糖ヌクレオチ ド GDP—フコースの合成に関与する酵素活性を有する蛋白質、 または配列番号 Ίまたは 8で表 されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および/または付加された アミノ酸配列からなり、 かつひ 1，6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質は、 モレ キユラ一 ·クローニング第 2版、 カレント -プロトコールズ ·ィン ·モレキュラー ·バイオ口 ジーヽ Nucleic Acids Research, 10 , 6487 ( 1982 )、 Proc . Natl . Acad. Sci . , USA, 79 , 6409 (1982 )、 Gene , 34. 315 (1985 )、 Nucleic Acids Research, 13 , 4431 (1985 )、 Proc . Natl . A cad. Sci USA, 82 , 488 ( 1985 )等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号 1、 3、 5または 6で表される塩基配列を有する DNAに部位特異的変異を導入することにより取得す ることができる。 欠失、 置換、 揷入および/または付加されるアミノ酸の数は 1以上でありそ. の数は特に限定されないが、 上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、 欠失、 置換 もしくは付加できる程度の数であり、例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜20個、 より好ましく は 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜5個である。
また、 本発明において配列番号 2、 4、 7または 8であらわされるアミノ酸配列と 80%以上の 相同性を有するアミノ酸配列からなり、 かゥ GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラ夕ーゼ活性、 GDP- 4 -ケト -6 -デォキシ -D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼ活性、 または《1 , 6-フコシルトランスフエ ラーゼ活性を有する蛋白質としては、 具体的には、 それそれ配列番号 2、 4、 7または 8で表さ れるアミノ酸配列と' BLAST 〔J . Mol , Biol . , 215 , 403 (1990 )〕 や FASTA CMethods in Enzymo logy, 183 , 63 ( 1990 )〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、 少なくとも 80%以上、好ま しくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97% 以上、 最も好ましくは 99 %以上の相同性を有する蛋白質などをあげることができる。
また、 本発明に用いられる宿主細胞、 すなわち細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成 に関与する酵素、または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6 位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活した宿主細胞を取得する方法 としては、 目的とする酵素を失活させることができる手法であれば、 いずれの手法でも用いる ことができる。 上述の酵素を失活させる手法としては、
( a ) 酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法； '
( b ) 酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
( c ) 酵素についての突然変異を導入する手法；
( d ) 酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
( e ) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位がひ 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあげられる。
N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結 合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、 該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、 い ずれのレクチンでも用いることができる。 その具体的な例としては、 レンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の： Lentil Agglutinin) ヽ エンドゥマメレクチン PSA (Pi sum sativum 由来の Pea Lectin)、 ゾラマメレクチン VFA (Vicia f aba由来の Agglutinin)、 ヒィロチャヮ ン夕ケレクチン ML (Aleuria aurantia由来の Lectin) 等を挙げることができる。
レクチンに耐性な細胞とは、 レクチンを有効濃度与えたときにも、 生育が阻害されない細胞 を言う。 有効濃度とは、 ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞 （以下、 親株とも称す） が正常 に生育できない濃度以上であり、 好ましくは、 ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞が成育で きない濃度と同濃度、 より好ましくは 2〜5倍、 さらに好ましくは 10倍、 最も好ましくは 20 倍以上である。
生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、 細胞株に応じて適宜定めればよく、 通常のレク チンの有効濃度は 10 g/mL〜 1 Omg/mL 好ましくは 0. 5mg/mL〜 2. Omg/mL.である。
本発明の抗体組成物を生産させる宿主細胞としては、 本発明の抗体組成物を発現できる上記 宿主細胞であればいかなる細胞も包含する。例えば、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞な どがあげられる。 これらの細胞としては、 後述 1に記載のものがあげられ、 特に、 動物細胞の 中でも、チャイニーズハムスター卵巣組織由来の CH0細胞、 ラヅトミエローマ細胞株 YB2/3HL . . P2. Gll .16Ag.20細胞、 マウスミエローマ細胞株 NS0細胞、 マ スミエローマ細胞株 SP2/0-Agl 4細胞、 シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞、 抗体を産生するハイプリドーマ細胞、 ヒ ト白血病細胞株ナマルバ細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞などが好ましい。
本発明の形質転換体としては、具体的には、本発明の抗 CCR4抗体の遺伝子を組み込んだチヤ ィニーズハムスター卵巣組織由来の CH0細胞株 CH0/DG4 細胞由来の形質転換株 Ms705/CCMが あげられる。なお、 CH0細胞株 CHO/DG4 細胞由来の形質転換株 Ms705/CC は、 平成 15年 9月 9日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つぐば巿 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に FE應 BP- 8467として寄託されている。
以下に、 本発明の抗体組成物を生産する細胞の作製方法、 本発明の抗体組成物の製造方法お よび本発明の抗体組成物の分析方法ならびに利用方法について説明する。
1 . 本発明の抗体組成物を生産する細胞の作製
本発明の抗体組成物を生産する細胞 （以下、 本発明の細胞と称す） は、 以下に述べる手法に より、 本発明の抗体組成物を生産するために用いる宿主細胞を作製し、 該宿主細胞に後述 2に 記載の方法により、抗ヒト CCR4抗体をコードする遺伝子を導入することにより、作製すること ができる。 ■
( 1 ) 酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法 '
本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成 に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6 位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、 遺伝子破壊の 方法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に 閧与する酵素としては、 具体的には、 GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラ夕一ゼ （以下、 GMDと表記 する） 、 GDP-4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラ一ゼ （以下、 Fx と表記する） な どがあげられる。 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフ コースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 具体的には 《1 , 6-フコシルト ランスフェラ一ゼ、 α - L-フコシダーゼなどがあげられる。
ここでいう遺伝子どは、 DNAまたは RNAを含む。
遺伝子破壊の方法としては、 標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であれば いかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、 リボザィム法、相同組換え法、 RNA-DNAオリゴヌクレオチド法（以下、 RD0法と表記する）、 RNAインターフヱアレンス法（以 下、 RNAi法と表記する）、 レトロウイルスを用いた方法、 トランスポゾンを用いた方法等があ げられる。 以下これらを具体的に説明する。
( a ) アンチセンス法又はリボザィム法による本発明の細胞を作製するための宿主細胞の作製 本発明の細胞の作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成 に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6 位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に閧与する酵素遺伝子を標的とし、 細胞工学， 1 , 239 ( 1993 )、 バイオ/テクノロジー (BIO/TECHNOLOGY) , 1L 1097 -( 1999 )、 ヒューマン ·モレキ ユラ一.ジエネテイクス（Hum. Mol . Genet . ) , 5 , 1083 (1995)、 細胞工学'， 13 , 255 ( 1994)、 プロシーディングス 'ォブ ·ザ ·ナショナル'ァカデミー'ォブ 'サイエンス（Pro Natl . Acad.. Sci . U. S .A. ) , 96 , 1886 ( 1999 )等に記載されたアンチセンス法またはリボザィム法を用いて、 例えば、 以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関 与する酵素をコードする cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。
調製した c丽 Aあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した丽 Aの配列に基づき、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素ま たは N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1 位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする DNA部分、 非翻訳領域の部分あるいはィ ントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザィムを設計する。
該アンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを細胞内で発現させるために、 調製した DNAの断 片、 または全長を適当な発現ベクターのプロモーター'の下流に挿入することにより、 ，組換えべ ク夕ーを作製する。
該組換えベクターを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体 を得る。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、 本発明の抗体組成物を作製 するために用いる宿主細胞を得ることができる。 また、 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または 産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、 本発明の抗体組成物 を作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
： 本発明の抗体組成物を作製するために用いられる宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫 細胞、植物細胞など、標的とする細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素ま たは N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1 位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いるこ とができる。 具体的には、 後述 2に記載の宿主細胞があげられる。
発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製が可能であるか、 ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計したアンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを転写できる位置に プロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的にほ、 後述 2に記載の発現ベクターが あげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換え ベクターの導入方法を用いることができる。 ' 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 以下の方法があ げられる。
形質転換体を邐択する方法 - ,
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素,または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素が失活した細胞を選択する方法としては、文献 [新生化学実験講座 3 質 I ,糖蛋 白質 (東京化学同人）日本生化学会編（1988 )]、文献 [細胞工学， 別冊， 実験プロトコ一ルシリー ズ，グ ィコバイオロジー実験プロトコール,糖蛋白質 ·糖脂質 ·プロテオグリカン (秀潤社製） 谷口直之 '鈴木明美'古川清 '管原一幸監修 (1996) ]、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント .プロトコールズ ·イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された生化学的な方 法あるいは遺伝子工学的な方法などを用いて、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関 与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位に フコースの' 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を測定する方法があげら'れる。 生 化学的な方法としては、 例えば、 酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげら れる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子の NA量を測定するノーザン解析や
- PCR法等があげられる。
' 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体'を選択する方法としては、 例えば、 後述 1の （ 5 ) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体 を選択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または Ν-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素をコードする cDNAを調製する方法としては、例えば、下記に記載の方法があげられ る。 '
cDNAの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞から全腿 A又は mRNAを調製する。
調製した全 RNA又は mRNAから cDNAライブラリ一を作製する。
.細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、 デジエネレイティブプライマーを作製し、 作製した cDNAライブラリ一を銪型として PCR法で細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する 酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコー スの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 cDNAライブラリーをスクリーニングし、細胞内 糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元 末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵 素をコードする DNAを取得することができる。
.ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞の mRNAは市販のもの（例えば Clontech社）を用いてもよ いし、 以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全 RNAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァ 二ジン-トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソヅズ 'イン 'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology), 154, 3 (1987)]、酸性チォシアン酸グァニジン'フエノール'クロ口ホルム（AGPC) 法 [アナリティカル 'バイオケミストリー（Analytical Biochemi-stry) , 162, 156 (1987); 実 験医^、 9, 1937 (1991 )] などがあげられる。
また、 全謂 Aから poly(A)+ RNAとして mRNAを調製する方法としては、 ォリゴ （dT) 固定化 セルロースカラム法 (モレキュラー ·クローニング第 2版) 等があげられる。
さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen¾)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社） などの市販のキヅトを用いることにより mRNAを調製することができる。 調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞 mRNAから cDNAライブラリ一を作製する。 cDNA ライブラリ一作製法としては、 モレキュラー ·クロ ニング第 2版、 カレント 'プロトコール ズ.イン 'モレキュラー 'バイオロジー、 A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)等に記載され た方法、 あるいは市販のキット、 例えば Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies社） 、 ZAP- cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE社) を用い る方法などがあげられる。
cDNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌 K 12株中で自立 複製できるものであれば、 ファージベクタ一、 プラスミドベクター等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社、 ストラテジーズ（Strategies) , 5, 58 (1992)]、 pBl escript II SK (+) [ヌクレイヅク .ァシヅド ·リサーチ（Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)]、 λ ZAP II (STRATAGENE社）、 人 gtlO、 Agtll [ディーェヌェ一'クローニング ·ァ ' プラクティカル 'アプローチ（DNA cloning, A Practical Approach),丄， 49 (1985)]、 ATriplEx (Clontech社) 、 AExCell (Pharmacia社) 、 pT7T318U (Pharmacia社) 、 pcD2 [モレキユラ 一-セルラー'バイオロジー (Mol. Cell; Biol, ) ' 280 (1983)]および pUC18 [ジーン（Gene), 33, 103 (1985)]等をあげることができる。
cDNAライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いる ことができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、 Escherichiacoli XLl-Blue MRF' [STRATAGENE社、 ストラテジーズ（Strategies) , 5, 81 (1992)]、 Escherichiacoli C600 [ジ エネテイクス（Genetics), !£, 440 (1954)]、 Escherichia coliY1088 [サイエンス（Science) , 222, 778 (1983)]、 Escherichia coliY1090 [サイエンス（Science) , 222, 778 (1983)]、 Escherichiacoli丽 522 [ジャーナル'ォブ 'モレキュラー 'バイオ口ジ一（J. Mol. Biol. )， 166, 1 (1983)] 、 Escherichiacoli K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジ一（J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] および Escherichiacoli JM105 [ジーン（Gene), 38, 275 (1985)] 等が用いられる。 ,
cDNAライブラリ一は、 そのまま以降の解析に用いてもよいが、 不完全長 cDNAの割合を下げ て、完全長 cDMを効率よく取得するために、菅野らが開発したォリゴキヤヅプ法 [ジーン（Gene), JJ8, 171 (1994); ジーン（Gene), 舰, 149 (1997); 蛋白質核酸酵素， 1, 603 (1996); 実験 医学， 11， 2491 (1993); cDNAクローニング (羊土社）（1"6)； 遺伝子ライプラリーの作製法（羊 土社） （1994)] を用いて調製して以下の解析に用いても,よい。
細胞内糖ヌクレオチド .GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド 合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関 与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、 該アミノ酸配列をコ一ドすることが予測される塩基配 列の 5'末端および 3'末端の塩基配列に特異的なデジエネレイティブプライマーを作製し、作製 した cDNAライブラリ一を錶型として PCR法 [ピーシーアール'プロ-トコールズ（PCR Protocols), Academic Press (1990)] を用いて DNAの増幅を行うことにより、 細胞内糖ヌクレオチド GDP - フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグ. ルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子 断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N - グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α 結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする DNAであることは、 通常用いられる塩基配列解 析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナシ ョナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ),J74, 5463 (1977)] あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一 （Applied Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置 を用いて分析することにより、 確認することができる。 , 該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mRNAから合 成した cDNAあるいは cDNAライブラリーからコロニーハイ,ブリダィゼーシヨンやプラークハイ プリダイゼーシヨン （モレキュラー .クローニング第 2版）.等を用いて、 細胞内糖ヌクレオチ ド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセ チルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の DNAを取得 することができる。
また、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複 合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾 に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたブライマ一を使用し、 ヒト又 は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mRNAから合成した cDNAあるいは cDNAライブラリーを 鎳型として、 PCR法を用いて増幅することにより、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成 に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6 位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の cDNAを取得することもできる。 ' 取得した細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖 修飾に関与する酵素をコードする DNAの塩基配列は、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例え ばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォブ .ザ .ナショナル .ァカ デミ一'ォブ ·サイエンス（Proc . Natl . Acad. Sci . U. S .A. ) , 74 , 5463 (1977 )] あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一 （Applied Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析 することにより、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。 ：
決定した cDNAの塩基配列をもとに、 BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、 Genbank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データペースを検索することにより、 取得した DNAがデータ ベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N- グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ 結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。 上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素をコ一ド する遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号 1または 3に記載の塩基配列があげられる。 上記の方法で得られる N-グリコシド結合複合型糖鎖還元未端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列と しては、 例えば、 配列番号 5または 6に記載の塩基配列があげられる。
決定された DNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合成機励 del 392 (Perkin Elmer社製） '等の DNA合成機で化学合成することにより、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチ ルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の 'cDNA を取得 することもできる。 '
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素のゲノム匪 Aを調製する方法としては、 例えば、 以下に記載の方法があげられる。 ゲノム DNAの調製方法 に
ゲノム DNAを調製する方法としては、 モレキュラー .クローニング第 2版やカレント .プロ トコールズ.イン 'モレキュラー 'バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。 ま た、 ゲノム DNA ライブラリースクリーニングシステム (Genome Systems社) や Universal GenomeWalker™Kits (CL0NTECH社） などを用いることにより'、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコ ースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルグルコ サミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム DNAを取得する こともできる。
取得した細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖 修飾に関与する酵素をコードする DNAの塩基配列は、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例え ばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス .ォブ .ザ、ナショナル ·ァカ デミ一'ォブ ·サイエンス（Pro Natl . Acad, Sci . U. S .A. ) , 74 , 5463 ( 1977 )] あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一 （Applied Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析 することにより、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。 決定したゲノム DNAの塩基配列をもとに、 BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、 Genbank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、 取得した DNAがデータ ベース中の遺伝子の中で細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N- グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α 結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。 決定された DNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合成機 model 392 (Perkin Elmer社製） 等の DNA合成機で化学合成することにより、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フ π—スの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチ ルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム DNAを 取得することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素のゲノム DNAの塩基配列としては、例えば配列番号 9、 10、 11および 12に記載の塩基配列があげられる。 上記の方法で得られる N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム丽 Aの塩基配列としては、 例えば配列番号' 13に記載の塩基配列があげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素ま たは N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセ ルグルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合する糖鎖修飾に閧与する酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌ クレオチドまたはリボザィムを、 直接宿主細胞に導入することで、 本発明の抗体組成物を作製 するために用いる宿主細胞を得ることもで る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムは、 公知の方法または DNA合成機により 調製することができる。具体的には、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に閧与する酵 素または Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位にフコース の 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする cDNAおよびゲノム DNAの塩基配列の うち、 連続した 5〜150塩基、 好ましくは 5〜60塩基、 より好ましくは 10〜40塩基に相当する 配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、 該ォリゴヌクレオチドと相補的な配列 に相当するオリゴヌクレオチド (アンチセンスオリゴヌクレオチド) または該オリゴヌクレオ チドの配列を含むリボザィムを合成して調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、 オリゴ RNAおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体 （以下、 ォ リゴヌクレオチド誘導体という) 等があげられる。
ォリゴヌクレオチド誘導体としては、 ォリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホス フォロチォエート結合に変換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌクレオチド中のリン 酸ジエステル結合が N3 ' - P5 'ホスフォアミデート結合に変換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結^ rがべプチド核酸結合に変換されたォ リゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C- 5プロピニルゥラシルで置換 されたォリゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌクレオチド中のゥラシルが C- 5チアゾールゥラシ ルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C- 5プロピニ ルシトシンで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 ォリゴヌクレオチド中のシトシンがフエ ノキサジン修飾シトシン（phenoxazine- modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド 誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリポースが 2 ' - 0-プロピルリボースで置換されたオリゴヌク レオチド誘導体、 あるいはオリゴヌクレォチド中のリボースが 2にメトキシェトキシリボ一ス で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる [細胞工学， 11, 1463 (1997)] 。 ( b ) 相同組換え法による本発明の抗体組成物を作製するための宿主細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコー スの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルグルコサ ミンの 6位にフコースの 1位が cc結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、 染色 体上の標的遺伝子を相同組換え法を用いて染色体を改変することによって作製することができ る。
染色体上の標的遺伝子の改変は、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harb r Laboratory Press ( 1994) (以下、 「マニピュレイティ ング ·ザ ·マウス ·ェンブリオ ·ァ ·ラボラトリ一 ·マニュアル」 と略す） 、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxf ordUniversity Press (1993 )、 バイオマニュアルシ リーズ 8 ジーンターゲヅティング， ES細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 （1995) (以下、 「ES細胞 ¾用いた変異マウスの作製」 と略す）等に記載の方法を用い、 例えば以下のように行 うことができる。
細胞内糖ヌクレオチド （ΦΡ-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が 結合する糖鎖修飾に関 与する酵素のゲノム DNAを調製する。
ゲノム DNAの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、細胞内糖ヌクレオチド GDP - フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグ ルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の構造遺伝子、 ある いはプロモーター遺伝子） を相同組換えするためのターゲヅトベクターを作製する。
作製した夕一ゲヅトベクタ一を宿主細胞に導入し、 染色体上の標的遺伝子と夕ーゲヅトべク 夕一の間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、 本発明の細胞の作製のために用 1ヽる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的'とする細胞内糖ヌクレオ チド GDP-フコースの合成に関与する酵素または Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν -ァ セチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に闋与する酵素の遺伝子を 有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に記載の宿主細胞 があげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または Ν-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素のゲノム DNAを調製する方法 'しては、上記 1の（ 1 )の（a )に記載のゲノム DNA の調製方法などがあげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素のゲノム DNAの塩基配列として、 例えば配列番号 9、 10、 11および 12に記載の塩基配列があげられる。 上記の方法で得られる N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム MAの塩基配列として、 例えば配列番号 13に記載の塩基配列があげられる。 ' ' 染色体上の標的遺伝子を相同組換えするための夕ーゲヅトベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993 )、 ノ イォマニュアルシリ —ズ 8 ジーン夕ーゲヅティング， ES細胞を用いた変'異マウスの作製 (羊土社）（1995)等に記載 の方法にしたがって作製することができる。 ターゲットベクタ一は、 置換型、 挿入型いずれで も用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲヅトぺクタ の導入には、 後述 3に記載の各種宿主細胞に適した組 換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press (1993 )、 バイオマニュアルシリーズ 8 ジーン夕ーゲ ヅティング， ES細胞を用いた変異マウスの作製 (羊土社）（1995 )等に記載のポジティブ選択、 プ 口モーター選択、 ネガティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 選別した細 胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNAに対するサザンハ イブリダィゼーシヨン法 （モレキュラー 'クローニング第 2版） や PCR法 [ピーシ一アール - プロトコ一ルズ CR Protocols) , Academic Press (1990 )] 等があげられる。
( c ) RD0方法による本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコー スの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端 φ Ν-ァセチルグルコサ ミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、 RD0 法を い、 例えば、 以下のように作製することができる。 ' 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または Ν-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素の cDNAあるいはゲノム DNAを上記 1の （1 ) の （a ) に記載の方法を用い、 調製す る。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。 '
決定した DNAの配列に基づき'、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素ま たは N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコ一スの 1 位が 結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分、 非翻訳領域の部分あるいはィント 口ン部分を含む適当な長さの RD0のコンストラクトを設計し合成する。
合成した RD0を宿主細胞に導入し、標的とした酵素、 すなわち細胞内糖ヌクレオチド GDP -フ コースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグル コサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素に変異が生じた形質転 換体を選択することにより、 本発明の宿主細胞を作製することができる。
. 宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする細胞内糖ヌクレオ チド GDP-フコースの合成に H与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァ セチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に閧与する酵素の遺伝子を 有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に記載の宿主細胞 があげられる。
各種宿主細胞への RD0の導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換えべク夕一の 導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素の cDNAを調製する方法とじては、 例えば、 上記 1の （1) の （a) に記載の cDNA の調製方法などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 上記 1の （1) の （b) に記載の ゲノム DNAの調製方法などがあげられる。
DNAの塩基配列は、 適当な制限酵素などで切断後、 BluescriptSK (-) (Stratagene社製）等 のプラスミドにサブクローニングし、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えば、 サンガー (Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー 'ォ ブ.サイエンス（Proc.. Natl. Acad, Sci . , U.S.A. ) , U, 5463 (1977)] 等の反応を行い、 塩基 配列自動分析装置、 例えば、 ABI PRISM377DNAシークェンサ一 （Applied Biosystems社製） 等 の塩基配列分析装置を用レヽて分析することにより、 確認することができる。
RD0は、，常法または DNA合成機を用 、ることにより調製することができる。
RD0を宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関 与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位に フコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝牛に変異が生じた細胞を選択する 方法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ 'イン 'モレ キュラー ·バイオロジー等に記載された染色体上の遣伝子の変異を直接検出する方法があげら れる。
また、 前記 1の （1) の （a) に記載の、 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースの合成に関与 する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフ コースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する 方法、 後述 1の （5) に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択 する方法、 あるいは、 後述 4または後述 5に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質 転換体を選択する方法も用いることができる。
RD0は、サイエンス (Science), 273, 1386 (1996); ネィチヤ一 ·メディシン（Nature Medicine), 4, 285 (1998); へパトロジー（Hepatology) , 1462 (1997); ジーン'セラピー（Gene Therapy) , 5, 1960 (1999); ジーン 'セラピー（Gene Therapy), 5, 1960 (1999); ジャーナル'ォブ 'モ レキユラ一'メディシン（J. Mol. Med.), 75, 829 (1997); プロシ一ディングス 'ォプ ·ザ · ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774 (1999); プロシーディングス.ォブ.ザ.ナショナル ·アカデミー.ォブ.サイエンス（Proc . Natl . Acad. Sci. USA), 96, 8768 (1999); ヌクレイック ·ァシッド · リサ一チ（Nuc. Acids. Res.), 27, 1323 (1999); インべスティゲーシヨン ·ォブ 'ダーマトロジー（Invest. Dematol.), Ill, 1172 (1998 ) ; ネイチヤー ·バイオテクノロジ一（Nature, Biotech. ) , 16 , 1343 ( 1998 ) ; ネイチヤー · バイオテクノロジー（Nature Biotech. ) , 18 , 43 (2000 ) ; ネイチヤー .バイオテクノロジー (Nature Biotech. ) ,. 18 , 555 (2000 )等の記載に従って設計することができる。
( d ) RNAi法による本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコー スの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサ ミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、 RNAi 法.を用い、 例えば、 以下のように作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素の cDNAを上記 1の （1 ) の （a) に記載の方法を用い、 cDNAを調製する。
調製した cDNAの塩基配列を決定する。
決定した cDNAの配列に基づき、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素 または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む 適当な長さの RNAi遺伝子を設計する。
該腿 Ai遺伝子を細胞内 '発現させるために、 調製した cDNAの断片、 または全長を適当な発 現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体 を得る。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形 質転換体を選択することで、 本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることができ る。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする細胞内糖ヌクレオ チド GDP-フコースの合成に閧与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァ セチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を ' 有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に記載の宿主細胞 があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組み込みが 可能で、設計した RNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられ る。 具体的には、 後述 2に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換えべク夕一 の導入方法を用いる'ことができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性または N-グリコシド結合 複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修 飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 本項 1の
( 1 ) の （a ) に記載の方法があげられる。 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 本項 1の （5) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体 を選択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素の cDNA を調製する方法としては、 例えば、 本項 1の （1) の （a) に記載された cDNAの調製方法などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素ま たは N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1 位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計した RNAi遺伝子を、直接宿 主細胞に導入することで、本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
RNAi遺伝子は、 常法または DNA合成機を用いることにより調製することができる。
RNAi遺伝子のコンストラクトは、 [ネイチヤー (Nature),里， «06 (1998); プロシーディン グス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502 (1998); ネイチヤー (Nature) , 395, 854 (1998); プロシーディングス 'ォブ'ザ- ナショナル ·アカデミー'ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049 (1999); セル（Cell), 95, 1017 (1998); プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー'ォ ブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451 (1999); プロシーディングス ·ォブ - ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998); ネイチヤー 'セル'バイオロジー (Nature Cell Biol.), 70 (2000)]等の記載に従って設計 することができる。
(e) トランスポゾン.を用いた方法による、 本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主 '細胞の作製
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、ネイチヤー ·ジエネテイク（Nature Genet.), 25, 35 (2000)等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 鎖還元末端の N-ァセチ ルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、 あるい は産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、 本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。 .
トランスポゾンのシステムとは、 外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然 変異を誘発させるシステムであり、 通常、 ドランスポゾンに揷まれた外来遺伝子に突然変異を 誘発させるベクタ一として用い、 この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトラン スポゼースの発現べクタ一を同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、 用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用 いることができる。 "
外来遺伝子としては、 宿主細胞の DNAに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用い ることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする細胞内糖ヌクレオ チド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァ セチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に閧与する酵素の遺伝子を 有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に記載の宿主細胞 があげられる。 各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組 み換えベクターの導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元未端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 '与する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、 例えば、 本項 1の （1 ) の （a ) に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、 例えば、 本項 1の （5 ) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を指標として突然変異体 を選択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。
( 2 ) 酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法 .
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコー スの合成に閧与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサ ミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、 該酵 素のドミナントネガディブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。 細胞 内糖ヌクレオチド GDP-フコー'スの合成に関与する酵素としては、 具体的には、 GMD、 Fxなどが あげられる。 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコー スの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 具体的には、 α ΐ , 6-フコシルトラン スフエラーゼ、 ひ- L-フコシダーゼなどがあげられる。 ；
これらの酵素は、 基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、 このような基 質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、 これらの酵素のドミナ ントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、 GMD を例として.、 そのド ミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述 Αる。
大腸菌由来の GMDの立体構造を解析した結果、 4つのアミノ酸（133番目のトレオニン、 135 番目のグルタミン酸、 157番目のチロシン、 161番目のリシン）が酵素活性に重要な機能を担つ ていることが明らかにされている （Structure , ^ 2 , 2000) 。 すなわち、 立体構造の情報にも とづきこれら 4つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、 レ、ずれ の変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。 一方、 GMD の補酵素 NADPや基質である GDP-マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど 変化が観察されていない。 従って、 GMD の酵素活性を担うこれら 4つのアミノ酸を置換するこ とによりドミナントネガティブ体を作製することができる。 大腸菌由来の GMDのドミナントネ ガティブ体の作製の結果に基づき、 ァミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測 を行うことにより、 例えば、 CH0細胞由^の GMD (配列番号 2 ) では、 155番目のトレオニン、 157番目のグルタミン酸、 179番目のチロシン、 183番目のリシンを他のアミノ酸に置換するこ とによりドミナントネガティブ体を作製することができる。 このようなアミノ酸置換を導 し た遺伝子の作製は、 モレキュラー'クローニング第 2版、 カレント ·プロトコールズ 'イン · モレキュラー 'バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。 本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 上述のように作製した標的酵素の ドミナントネガティブ体をコードする遺伝子 （以下、 ドミナントネガティブ体遺伝子と略記す る） を用い、 モレキュラー ·クローニング第 2版、 カレント ·プロトコールズ 'イン 'モレキ ユラ一'バイオロジー、 マニピユレ一ティング 'マウス 'ェンブリオ第 2版等に記載された遺 伝子導入の方法に従って、 例えば、 以下のように作製することができる。 .
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元未端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関 与する酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長 DNAをもとにして、 必要に応じて、 該蛋白質. ' をコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片、 または全長 DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することに より、 組換えべクタ一を作製する。 ' 該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、 形質転換 体を得る。 .
細胞内糖ヌクレオチ.ド GDP-フコースの合成に閧与する酵素の活性または N-グリコシド結合 複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修 飾に閧与する酵素の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標 に形質転換体を選択することで、 本発明の細胞を作製するために用いる宿主細胞を作製するこ とができる。
宿主細胞としては、 酵每、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする細胞内糖ヌクレオ チド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァ セチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を 有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述 2に記載の宿主細胞 があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み み が可能で、 目的とするドミナントネガティブ体をコードする DNAを転写できる位置にプロモー 夕一を含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述 2に記載の発現ベクターがあげられ る。 · 各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述 2に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクター の導入方法を用いることができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性または N-グリコシド結合 複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修 飾に閧与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述 1 ( 1 ) の （a ) に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述 1の （5 ) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体 を選択する方法としては、 例えば、 後述 4または後述 5に記載の方法があげられる。
( 3 ) 酵素に突然変異を導入する手法 本発明の抗体 物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコー スの合成に関与する酵素または N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサ ミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子に突然変異を導入 し、 該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合 β¾に関与する酵素としては、 具体的には、 GMD、 Fx などがあげられる。 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位に フコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 具体的には、 a l , 6-フコシル 卜ランスフェラーゼ、 α - L-フコシダ一ゼなどがあげられる。 ： 酵素に突然変異を導入する方法としては、 1 ) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異 体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に 関与する酵素の活性または Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミン の 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として所望の細胞 株を選択する方法、 2 ) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に 生じた突然変異体から、 生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、 3 ) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体か ら、 該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などが あげられる。
突然変異誘発処理としては、 親株の細胞の画 Αに点突然変異、 欠失あるいはフレームシフト 突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、 ェチルニトロソゥレア、 二ドロソグァ二ジン、 ベンゾピレン、 ァクリジン色素 による処理、 放射線の照射などがあげられる。 また、 種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変 異誘発物質として用いることができる。 突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、 例えば、組織培養の 術第三版（朝倉書店） 日本組織培養学会編（1996 )、 ネイチヤー'ジエネ テイクス（Nature Genet . ) , M, 314 , ( 2000 )等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、 特別な突然変異誘発処理を施さないで、 通常の細 胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることが できる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性または N-グリコシド結合 複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修 飾に関与する酵素の活性を測定する方法としては、 例えば、 本項 1の （1 ) の （a ) に記載の 方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、 例えば、 後述 4または 後述 5に記載の方法があげられる。 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、 例えば、 本項の 1の （5 ) に言 3載の方法があげられる。
( 4 ) 酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明の抗体 物を作製するために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコー スの合成に関与する酵素まこは N-グリコシド結合複合型耱鎖還元末端の N-ァセチルグルコサ ミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を標的とし、 アン チセンス RNA/DNA技術 [バイオサイエンスとインダストリ一， , 322 ( 1992 )Ν 化学， 681 ( 1991 )、 Biotechnology , 358 ( 1992 )、 Trends in Biotechnology, Ifi, 87 ( 1992 )ヽ Trends in Biotechnology, 152 (1992 )、細胞工学， ϋ, 1463 (1997)]、トリプル'ヘリヅクス技術 [Trends in Biotechnology, 132 (1992 )] 等を用い、 標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制する ことで作製することができる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素としては、 具体的には、 GMD、 Fx などがあげられる。 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコ ミンの 6位に フコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、 具体的には、 ひ 1 , 6-フコシル トランスフェラ一ゼ、 ひ- L-フコシダーゼなどがあげられる。 ' 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に閧与する酵素の活性または' N-グリコシド結合 複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修 . 飾に閧与する酵素の活性を測定する方法としては、 例えば、 本項 1の （1 ) の （a) に記載の 方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、 例えば、 本項 1の （5 ) に記載の 方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、 例えば、 後述 4または 後述 5に記載の方法があげられる。
( 5 ) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコース© 1位がひ 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
本発明の抗体組成物を作製するために用いる宿主細胞は、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N -ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに 耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
N -グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位がひ結 合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、 例えば、 ソマテ イク-セル 'アンド'モレキュラー 'ジエネティクス（Somatic Cell Mol . Genet . ) , 12 , 51 (1986 ) 等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、 Ν-グリコシド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位とフコ —スの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いるこ とができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチン LCA(LensCulinaris由来の Lenti 1 Agglutinin) ェンドウマメレクチン PSA (Pi sum sativum由来の Pea Lectin) 、 ソラマメレク チン VFA (Vicia faba由 3feの Agglutinin)、ヒィロチャワン夕ケレクチン ML (Aleuriaaurantia 由来の Lectin) 等を挙げることができる。 .
具体的には、 l g/mL〜lmg/mLの濃度の上述のレクチンを含む培地で 1 日〜 2週間、好ましく は 1 日〜 1週間培養し、 生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピヅクアップし別の 培養容器に移し、 さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、 本発明の N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコースの 1位がひ結合 した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
2 . 抗体組成物の製造方法 ' 本発明の抗体組成物は、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ · ィン ·モレキュラー ·ノ、、ィォロジ一、 Antibodies , A Laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (以下、 アンチボディズと略す) 、 Monoclonal Antibodies principles and practice , Third Edition, Acad, Press , 1993 (以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press , 1996 (以下、 アンチボディエンジニアリングと略す） 等に記載された方法を用い、 例えば、 以下の ように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗ヒト CCR4抗体分子の全長 cDNAを調製し、 該抗体分子をコードする部分を含む適当な長さ の DNA断片を調製する。 、
該 DNA断片、または全長を適当な発現べクタ一のプロモーターの下流に挿入することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えぺク夕一を、 該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、 抗体分子 を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とする遺伝子を発現でき るものであればいずれも用いることができる。
抗体分字の Fc領域に結合する N-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素、 すなわち細胞内 糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素または N -グ.リコシド結合複合型糖鎖還元 末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵 素が失活した細胞を選択するか、 または前述 1に示された種々の人為的手法により得られた細' 胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、'上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可 能で、 目的とする抗体分子をコードする DNAを転写できる位置にプロモーターを含有している ものが用いられる。
cDNAは、 前記 1 . の （1 ) の （a ) に記載の cDNAの調製方法に従い、 ヒト又は非ヒト動物 の組織又は細胞より、 目的とする^;体分子に特異的なプローブまたはプライマー等を用いて調 製することができる。 '
酵母を宿主細胞として用い.る場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEP13 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419) 等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、 '例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー夕一、 PH05プロモーター、 PGKプ 口モーター、 GApプロモーター、 ADHプロモーター、 gal 1プロモーター、 al 10プロモーター、 ヒ一トショヅク蛋白質プロモーター、 MFひ 1 プロモーター、 CUP 1 プロモーター等をあげるこ とができる。 .
宿主細胞としては、 サヅカロミセス属、 シゾサヅカロミセス属、 クリュイべ口ミセス属、 ト リコスポロン属、シュヮニォミセス属等に属する微生物、例えば、 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe 、 Kluyveromyces lactis ヽ Trichosporon pullulans 、 Schwanniomycesalluvius等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNAを導入する方法であればいずれも用いるこ とができ、例えば、 エレクト口ポレーシ ン法 [メソヅズ'イン 'ェンザィモロジ一 (Methods . Enzymol . ) , 194, 182 ( 1990 )] 、 スフエロプラスト法 [プロシーディングス 'ォブ ·ザ ·ナシ ョナル ·アカデミー ·オフ、、 ·サイエンス（Proc . Natl . Acad. Sci , U. S . A) , 84. 1929 ( 1978 )]、 酢酸リチウム法 [ジャーナル'ォブ'バクテリオロジー（J . Bacteriology) , 153 , 163 ( 1983 )、 プ Dシーディングス ·ォブ 'ザ ·ナショナル ·アカデミー.ォブ'サイエンス（Pro Natl . Acad. Sci . U. S . A) , 75 , 1929 ( 1978 )] に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、例えば、 pc'DNAIs pcDM8 (フナ コシ社より巿販）、 PAGE107 [特開平 3-22979；サイトテクノロジー（Cytoteclmology) , 3 , 133 , (1990 )] 、 pAS3-3 [特鬨平 2-227075] 、 pCDM8 [ネイチヤー (Nature ) , 329 , 840 , (1987 )] 、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社）、 pREP4 (Invitrogen社） 、 pAGE103 [ジャーナル'ォブ 'バイオ ケミストリー（J . Biochemistry) , 101 , 1307 (1987 )] 、 pAGE210等をあげることができる。 プロモータ一としては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺伝子のプロモーター、 SV40 の初期プロモーター、 レトロウイルスのプロモータ一、 メタ口チォネインプロモー夕一、 ヒー トショヅクプロモーター、 SRひプロモー夕一等をあげることができる。 また、 ヒト CMVの IE 遺伝子のェンハンサ一をプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特閧昭 63-299) 、 ラヅトミエロ —マ細胞、 マウスミエローマ細胞、 シリアンハムスター腎臓由来細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細 胞等をあげることができる。
組換えべク夕一の導入方法としては、 動物細胞に DNAを導入する方法であればいずれも用い ることができ、例えば、エレクトロポレーシヨン法 [サイトテクノロジー（Cytotechnology) , , 133 (1990 )] 、 リン酸カルシウム法 [特鬨平 2-227075] 、 リボフェクシヨン法 [プロシーディ ングス 'ォブ 'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc . Natl . Acad . Sci . U. S .A. ) , 84. 7413 ( 1987 )]、 ィンジェクシヨン法 [マニピュレイティング ·ザ ·マウス ·ェンブリオ · ァ.ラボラトリー'マニュアル]、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法 [特許第 2606856 号、特許第 2517813号]、 DEAE-デキストラン法 [バイオマニュアルシリーズ 4 伝子導入と 発現'解析法（羊土社）横田崇'新井賢一編 (1994)]、 ウィルスベクター法 [マニピユレ一ティ ング ·マウス ·ェンプリオ第 2版]等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント ·プロトコールズ 'イン 'モレキュ ラー ·ノ ィ才ロジー Baculovims Expression Vectors , A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York ( 1992 )、 バイオ/テクノロジー（Bio/Technology) , 6 , 47 (1988 )等に記載 された方法によって、 蛋白質を発現することができる。
即ち、 発現ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に 組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、 蛋白質を発現させる ことができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogeii社） 等'をあげることができる。 - バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグラフ ァ ·カリフオル二力 ·ヌクレア一 ·ポリヘドロシス ·ウイルス (Autograp a californica nuclear polyhedrosis virus )等を用いることができる。
昆虫細胞としては、 Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [カレント ·プロト コーノレズ ·イン 'モレキユラ—パイォロジ——Baculovirus Expression Vectors , A Laboratory Manual , W, H. Freeman and Company , New York ( 1992 ) ]、 Trichoplusianiの卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社） 等を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記発現導入べクタ一と上記バキュロウィ ルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 （特開平 2-227075)、 リポフエクシ ヨン法 [プロシーディングス 'ォブ ·ザ ·ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイェン （ Pro c . Nat 1 . Acad . Sci . U. S .A. ) , 84 , 7413 ( 1987 ) ] 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、' Ti プラスミド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス (CaMV) の 35Sプロモーター、 ィネアクチン 1プロモ —夕一等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブラナ、 アルファ ルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげることが-できる。
組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に DNAを導入する方法であればいずれも用い ることができ 例えば、 ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) '[特開昭 59-140885、 特開昭 60-70080、 WO94/00977] 、 エレクト口ポレーシヨン法 [特開昭 60-251887] 、 パーテイクルガ ン （遺伝子銃） を用いる方法 [日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813]等をあげることがで ぎる。 .
抗体遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー 'クローニング第 2版に記 載されている方法等に準じて、分泌生産、 Fc領域と他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うこ とが,できる。 -
. 糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した酵母、 動物細胞、 昆虫細胞ま^は植物細胞により発 現させた場合には、 導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ること ができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 抗体組成物を製造することができる。 形質転換体を培地に 培養する方法は、 宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培¾としては、 該生物が資化 し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれ ば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 - 炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクトース、 スク ロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノールなどのアルコール類等を用いることがで ぎる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素ィ匕合物、 な らびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープリカ一、 カゼイン加水分解物、 大 豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびその消化物等を用レヽることができる。 無機塩類としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸 マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マン癌、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用い ることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は 15〜 40°Cがよく、 培養時間は、 通常 16時間〜 7日間である。 培養中の pHは 3.0〜9.0に保持する。 pHの調製は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを 用いて行う。 '
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加し てもよい。 '
プロモー夕一として誘導性のプロモ一夕一を用いた組換えべクタ一で形質転換した微生物を 培養するときには、 必要に応じてインデュ一サーを培地に添加してもよい。 例えば、 lac プロ モー夕一を用いた組換えべク夕一で形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル -/? -D -チォガラクトビラノシド等を、 trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微 生物を培養するときにはィンドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使用されている RPMI1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォブ ·ザ ·ァメリカン ·メディカル ·ァソシェイシヨン（The Journal of the American' Medical Association) , 199 , 519 ( 1967 )] 、 Eagleの MEM培地 [サ ィエンス（Science ) , 1 , 501 ( 1952 )]、ダルぺヅコ改変 MEM培地 [ヴユウロロジー (Virology) , 8 , 396 (1959)] 、 199培地 [プロシーディング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォア ·ザ ·バイ ォロジカル ·メァイスン (Proceeding of the Societ for the Biological Medicine ) , 73 , 1 (1950 )] 、 Whitten培地 [発生工学実験マニュアル-トランスジェニヅク 'マウスの作り方 （講 談社）勝木元也編（1987) ]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることが できる。
培養は、 通常 pH6 , 0〜8.0、 30〜40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよ い。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使用されている TNM-FH培地（Pharmingen社）、 SHOO II SFM培地（Lif e Technologies社）、 ExCell400、 ExCel 05 (いずれも JRH Biosciences社) 、 Grace ' s Insect Medium [ネイチヤー (Nature) ,■■ 1 , 788 (1962 )] 等を用いることができる。
培養は、 通常 pH6.0〜7.0、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲン夕マイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞とレて、 または植物の細胞や器官に分ィ匕 させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地としては、 一般に使用されている ムラシゲ'アンド.スクーグ (MS )培地、ホワイト (White )培地、またはこれら培地にオーキシン、 サイトカイニン等、 植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 pH5.0〜9.0、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加し てもよい。 上記のとおり、 抗体分子をコードする DMを組み込んだ発現ベクターを保有する動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方法に従って培養し、 '抗体組成物を生成蓄 積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。 抗体遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー 'クローニング第 2版に記 載されている方法に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等を行うことができる。 ' 抗体組成物の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に分泌させる方 法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿主細胞や、 生産させる抗体 分子の構造を変えることにより、 該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法 [ジ ヤーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリー（J . Biol . C em. ) , 264 , 17619 ( 1989 )] 、 口 ゥらの方法 [プロシ一デイングス ·ォブ 'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc . Natl . Acad. Sci . U. S .A. ) , 86 , 8227 (1989 ) ; ジーン ·デベロップメント（Genes Develop . ) , 4 , 1288 (1990) ] または特閧平 05-336963、 WO94/23021等に記載の方 ¾を準用することにより、 該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 .
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 発現ベクターに、 抗体分子をコードする DNA、 お よび抗体分子の発現に適切なシグナルぺプチドをコ一ドする DNAを挿入し、 該発現ベクターを 宿主細胞へ導入の後に抗体分子を発現させることにより、 目的とする抗体分子を宿主細胞外に 積極的に分泌させることができる。
また、特閧平 2- 227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用 レヽた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、.遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺伝子が導入さ れた動物個体 （トランスジエニック非ヒト動物） または植物個体 （トランスジヱニヅク植物） を造成し、 これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。 '
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育または栽培し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することによ り、 該抗体組成物を製造することができる。 ， ， '
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば公知の方法 [ァメリカン -ジ ヤーナレ ·ォブ -クリ二カノレ ·ニュ一卜リショ (American Journal of Clinical Nutrition) , 63 , 639S (1996 ) ; ァメリカン ·ジャーナル ·ォブ · クリニカル ·二ユートリシヨン（American Journal of Clinical Nutrition) , 63 , 627S (1996 ) ; バイオ/テクノロジー（Bio/Technology) , 9 , 830 ( 1991 )] に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産させ る方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 抗体分子をコードする匪 Aを導入したトランスジェニヅク非ヒ ト動物を飼育し、 抗体組成物を該動物中'に生成 ·蓄積させ、 該動物中より抗体組成物を採取す ることにより、 抗体組成物を製造することができる。 該動物中の生成'蓄積場所としては、 例 えば、 該動物のミルク （特開昭 63-309192) または卵等をあげることができる。 この際に用い られるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモーターである カゼインプロモーター、 ?カゼインプロモー 夕一、 ；5ラクトグロブリンプロモーター、 ホエー酸性プロテインプロモ一夕一等が好適に用い られる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば抗体分子をコ一ドする DNAを 導入したトランスジェニヅク植物を公知の方法 [組織培養， 0 ( 1994) ; 組織培養， 21 ( 1995 ) ; トレンド 'イン 'バイオテクノロジー（Trends in Biotechnology) , 15 , 45 ( 1997 )] に準じて 栽培し、 抗体組成物を該植物中に生成 ·蓄積させ、 該植物中より該抗体組成物を採取すること により、 抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする 伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、 例えば 抗体組成物が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回 収し、 水系緩衝液に懸濁後、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザ 一、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離する ことにより得られる上清から、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩 析法、脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル（DEAE) -セファロース、 DIAI0N HPA-75 (三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ一法、 S- Sepharose FF (Pharmacia社） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 プチルセファロ —ス、 フエ二ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用い たゲルろ過法、 ァフィ二ディークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電 気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 抗体組成物の精製標品を得 ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に'不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破碎し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。 回収した抗体組 成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。 該可溶化液を希釈または透析することにより、 該 抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、 上記と同様の単離精製法により'該抗体 «物の精製 標品を得ることができる。 '
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該抗体組成物あるいはその誘導体を 回収することができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理すること により培養上清を取得し、 該培養上清から、 上記と同様の単離精製法を用いることにより、 抗 体組成物の精製標品を得ることができる。
以下に、 本発明の抗体組成物の取得のより具体的な例として、 ヒト化抗体の組成物の製造方 法について記すが、 他の抗体組成物を当該方法と同様にして取得することもできる。
( 1 ) ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子が組み込まれ た動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CHおよび CLを 3— ドする遺伝子をそれそれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体の C領域としては、 任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、 例えば、 ヒ ト抗体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域（以下、 Mァ 1と表記する）およびヒト抗体の L鎖の だクラスの C領域 （以下、 hC cと表記する） 等があげられる。
ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子としてはェキソンとイントロンから成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 mRNAから逆転写して作製された cDNAを用いることもできる。 動物細胞用発現べクタ一としては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み発現でき るものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー (Cytotec nology), 3, 133 (1990)]、 pAGE103 [ジャーナル 'ォブ ·バイオケミストリー（J. Biochem.), 101, 1307 (1987)]、 pHSG274 [ジーン (Gene), 27, 223 (1984)]、 pKCR [プロシ —ディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. ), 78, 1527 (1981 )]、pSGl ?d2- 4 [サイ トテクノロジー（Cytotechnology), 173 (1990)] 等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモ一夕一とェンハンサー [ジャーナル ·ォブ 'バイオケミストリ一（J. Biochem. ),101 1307 (1987)] 、 モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR [バイオケミカル ·アンド ·バイオフィ ジカル'リサーチ 'コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun . ) , 149, 960 (1987)]、 免疫グロプリン Η鎖のプロモーター [セル（Cell), 11, 479 (1985)]とェンハンサー [セル（Cell) , ， 717 (1983)]'等があげられる。
ヒト化抗体発現用べクタ一は、 抗体 H鎖及び L鎖が別々のぺク-ター上に存在するタイプある いは同一のベクタ一上に存在するタイプ （以下、 タンデム型と表記する） のどちらでも用いる ことができるが、 ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、 動物細胞への導入の容易さ、 動物 細胞内での抗体 H鎖及び L鎖の発現量のバランスが均衡する等の点から夕ンデム型のヒト化抗 体発現用ベクターの方が好ましい [ジャーナル ·ォブ ·ィムノロジカル ·メソヅズ（J. Immunol . Methods), 167, 271 (1994)] 。 タンデム型のヒト化抗体発現ベクターとしては、 pKANTEX93 [モ レキユラ一 ' ィムノロジー（Mol.I腿皿 ol.), 37, 1035 (2000)]、 ρΕΕ18 [ハイプリ ドーマ (Hybridoma), 17, 559 (1998)]などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、 ヒト型キメラ抗体及びヒト型 CDR移植抗体の動物細 胞での発現に使用できる。 '
( 2 ) ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以下のよう にして取得することができる。
ヒト CCR4に特異的に結合する抗体を産生するハイプリドーマ細胞から抽出した mRNAを鎵型 として用い、 cDNAを合成する。 合成した cDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターに揷 入して cDNAラィブラリ一を作製する。該ラィブラリーより、既存のマウス抗体の C領域或いは V領域をコードする DNAをプローブとして用い、 H鎖 V領域をコードする cDNAを有する組換え ファージ或いは組換えプラスミド及び L鎖 V領域をコードする cDNAを有する組換えファージ或 いは組換えプラスミドをそれそれ単離する。 組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的 のマウス抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定し、 塩基配列より VHおよび VLの全アミノ酸 配列を推定する。
ヒト CCR4に特異的に結合できるヒト以外の動物の抗体を生産するハイプリドーマ細胞は、配 列番号 36で示されるヒト CCR4をヒト以外の動物に免疫し、 周知の方法 （アンティボディズ： ァ ·ラボラ卜リー ·マ二ユアレ (Antibodies: A Laboratory Manual ) , Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998) に従って、 免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞 とでハイブリド一マを作製し、次いで単一細胞化したハイブリド一マを選択し、これを培養し、 培養上清から精製し、 取得することができる。 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラヅ ト、 ハムスター、 ゥサギ等、 ハイプリ ドーマ細胞を 作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。
ノヽィプリ ド一マ細胞から全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァニジン-トリフル ォ tf酢酸セシウム法 [メソヅズ.イン.ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymol . ) , 154, 3 (1987)]、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT)固定化セルロースカラム法 [モレキ ユラ一.クロ—ニング：ァ.ラボラトリー.マニュアル (Molecular Cloning: A Laboratory Manual ) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 等があげられる。 また、 ハイブリ ドーマ細 胞から mRNAを調製するキヅトとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製） 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） 等があけ:られる。
cDNAの合成及び cDNAライブラリー作製法としては、 常法 [モレキュラー ·クロ一ニング： ァ ·ラボラトリ—マ二ユアノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989；カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー (Current Protocols in MolecularBiology) , Supplement 1-34] -、 或いは市販のキヅ卜、 例え ば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社 製） や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製） を用いる
方法などがあげられる。
cDNAライブラリーの'作製の際、 ハイ 'プリ ドーマ細胞から抽出した mRNAを錶型として合成し た cDNAを組み込むベクタ一は、 該 cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用い る'ことができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジーズ（Strategies) , 5, 58 (1992)]、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイヅク 'ァシヅズ' リサーチ（Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)]、 λΖΑΡ II (Stratagene社製）、 え gtlO、 人 gtll [ディーェヌエー 'クローニング： ァ.プラクティカル ·アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach), I, 49 (1985)]、 Lambda BlueMid (Clontech社製） 、 AExCelU pT7T3 18U (Pharmacia社製） 、 pcD2 [モレキュラー ' アンド.セルラ一'バイオロジー (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)]及び p(JC18 [ジーン（Gene) , 33, 103 (1985)]等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクタ一により構築される cDNA ライブラリ一を導入する大腸菌 としては該 cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用い ることができる。例えば、 XLl-BlueMRF' [ストラテジーズ（Strategies) , 5, 81 (1992)]、 C600 [ジエネティヅクス（Genetics), , 440 (1954)]、 Y1088、 Y1090 [サイエンス（Science) , 1 , 778 (1983)]、 丽 522 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー（J. Mol. Biol'. ), 166, 1 (1983)]、 K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジーお Mol. Biol.), 16, 118 (1966)]及び JM105 [ジーン（Gene), 38, 275 (1985)] 等が用いられる。
cDNAラィブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコ一ドする cDNAクローン を選択する方法としては、 アイソトープ或いは蛍光などで標識したプローブを用いたコロニ ― ·ハイブリダィゼーシヨン法或いはブラ"ク ·ハイプリダイゼーシヨン法 [モレキュラー · クロ一ニング：ァ'ラボラトリー'マニュアル (Molecular Cloning: A Laboratory Ma皿 al) , Cold Spring Harbor Lab. Press Ne York, 1989] により選択することができる。 また、 プライマー を調製し、 cDNA或いは cDNAライブラリーを鐯型として、 PCR [モレキュラー 'クロ一ニング： ァ ·ラボラトリ一'マニュアル (Molecular Cloning: A Laboratory Manual ) , Cold Spring Harbor Lab . Press New York, 1989；カレント 'プロトコ一ルス' 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー (Current Protocols in Molecular Biology) , Supplement 1-34] により VHおよび VLをコード する cDNAを調製することもできる。 ，
上記方法により選択された cDNA を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製）等のプラスミドにクローニングし、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例 えば、 サンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー 'ォブ 'サイエンス（Proc . Natl . Acad. Sci . 'U. S .A. ) , 74 , 5463 (1977 )] 等の反 応を行い、 塩基配列自動分析装置、 例えば、 ABI PRISM377 DNA シークェンサ一 （Applied Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより該 cDNAの塩基配列を決 定することができる。
決定した塩基配列から VHおよび VLの全ァミノ酸配列を推定し、 既知の抗体の VHおよび VL の全アミノ酸配列 [シーケンシズ ·オフ' ·プロティンズ ·ォブ ·ィムノロジカル ·インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immunologicallnterest ) , US Dept . -Health and Human Services , 1991] と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VL を完全に含んでいるァミノ酸配列をコ一ドしているかを確認することができる。
さらに、 抗体可変領域のアミノ酸配列または該可変領域をコードする DNAの塩基配列がすで に公知である： 合には、 以下の方法を用いて製造することができる。
アミノ酸配列が公知である場合には、 コドンの使用頻度 [シ一ケンシズ ·ォブ ·プロティン ズ-ォブ'ィムノロジカル'ィン夕レスト (Sequences of Proteins of Immunological Interest ) , US Dept . Health and Human Services , 1991] を考慮して該可変領域をコードする DNA配列を 設計し、 設計した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長さからなる数本の合成 DNAを合成し、 それらを用いて PCR法を行うことにより DNAを得ることができる。塩基配列が公知である場合 には、 その情報を基に 100塩基前後の長さからなる数本の合成 DNAを合璃し、 それらを用いて PCR法を行うことにより DNAを得ることができる。 . —
( 3 ) ヒト以外の動物の抗体の V領域のァミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、 既知の抗体 の VHおよび VLのアミノ酸配列 [シーケンシズ 'ォブ 'プロテインズ'ォブ ·'ィムノロジカル · イン夕レスト (Sequences of Proteins of I腿麵 logical Interest ) , US Dept . Health and Human Services , 1991] と比較することにより、 分泌シグナル配列の長さ及び N末端アミノ酸配列を 推定でき、更には抗体が属するサブグループを知ることができる。 また、 VHおよび VLの各 CDR のアミノ酸配列についても、 同様の方法で見出すことができる。
( 4 ) ヒト型キメラ抗体発現べクタ一の構築 '
本項 2の （1 ) に記載のヒト化抗体発現用べクタ一のヒト抗体の CHおよび CLをコードする 遺伝子の上流に、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコ一ドする cDNAを挿入し、 ヒト型キ メラ抗体発現べクタ一を構築することができる。 例えば、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、 ヒト以外の動物の抗体 VHおよび VLの 3 '末端側の塩基配列とヒト抗 体の CHおよび CLの 5 '末端側の塩基配列とからなり、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に 有する合成 DNAとそれそれ連結し、 それそれを本項 2の （1 ) に記載のヒト化抗体発現用べク ターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するよう に揷入し、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
( 5 ) ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、以下のようにして構築することが できる。 まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRを移植するヒト抗体の VH および VL © FRのァミノ酸配列を選択する。ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列とし ては、 ヒト抗体由来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。例えば、 Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共通ァミノ酸配列 [シーケンシズ 'ォブ 'プ 口ティンズ ·ォブ ·ィムノロジカル 'インタレスト (Sequences of Proteinsof Immunological Interest ) , US Dept . Health and Human Services , 1991] 等があげられるが、 その中でも、 十 分な活性,を有するヒト型 CDR移植抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の VH および VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも 60%以上） を有するアミ ノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体の VH'および VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体 の VHおよび VLの CDRのァミノ酸配列を移植し、 ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ 酸配列を設計する。 設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用 頻度 [シーケンシズ'ォブ.プロテインズ'ォブ ·ィムノロジカル ·インタレスト（Sequences of Proteins of Immunological Interest ) , US Dept . Health and Human Services , 1991] を考慮 して DNA配列に変換し、 ヒト型 CDR移植抗体の VH ^Sよび VLのアミノ酸配列をコードする DNA 配列を設計する。 設計した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長さからなる数本の合成 DNAを 合成し、 それらを用いて PCR法を行う。 この場合、 PCRでの反応効率及び合成可能な DNAの長 さから、 H鎖、 L鎖とも 4〜6本の合成匪 Aを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成 DNAの 5 '末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、 本 項 2の （1 ) で構築したヒト化抗体発現用べクタ一に容易にクローニングすることができる。 PCR後、増幅産物を pBluescript SK (- ) (Stratagene社製）等のプラスミドにクローニングし、 本項 2の（2 )に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型 CDR移植抗体の VHおよ び VLのァミノ酸配列をコードする DNA配列を有するプラスミドを取得する。
( 6 ) ヒト型 CDR移植抗体の V領域のァミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのみをヒト抗体の VH および VLの FRに移植しただけでは、 その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて 低下してしまうことが知られている [バイォ /テクノ口ジー（BI0/TECHN0L0GY) , £, 266 ( 1991 )]。 この原因としては、 元のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLでは、 CDRのみならず、 のい くつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、 それらアミノ酸 残基が CDRの移植に伴い、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの異なるアミノ酸残
基へと変化してしまうことが考えられている。 この問題を解決するため、 ヒト型 CDR移植抗体 では、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与している アミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、 抗体の立体構造を維持し、 間接的に抗 原との結合に関与しているァミノ酸残基を同定し、 それらを元のヒト以外の動物の抗体に由来 するアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている [バイオ/ テクノロジー (BIO/TECHNOLOGY) , 9 , 266 ( 1991 )]。
ヒト型 CDR移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わる FRのァミノ酸残基を如 何に効率よく同定するかが、 最も重要な点であり、 そのために X線結晶解析 [ジャーナル -ォ ブ.モレキュラー 'バイオロジー（J. Mol . Biol . ) , HI, 535 ( 1977 )] 或いはコンピューター モデリング [プロテイン ·エンジニアリング (Protein Engineering) , 7 , 1501 (1994)]等によ る抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立 «造の情報は、ヒト型 CDR 移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来た。 しかしながら、 あらゆる抗体に適応可 能なヒト型 CDR移植抗体の作製法は未だ確立されていない。 現状ではそれぞれの抗体について 数種の改変体を作製し、 それそれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必 要である。
ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸残基の改変は、改変用合成 DNAを用いて本項 2の（ 5 ) に記載の PCR法を行うことにより、 達成できる。 PCR後の増幅産物について本項 2の （2 ) に 記載の方法により、 塩基配列を決定し、 目的の改変が施されたことを確認する。
( 7 ) ヒト型 CDR移植抗体発現べク夕一の構築
本項 2の （1 ) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする 遺伝子の上流に、 本項 2の （5 ) および （6 ) で構築したヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VL をコードする cDNAを揷入し、 ヒト型 CDR移植抗体発現べクタ一を構築することができる。例え ば、 本項 2の （5 ) および （6 ) でヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる 合成 DNAのうち、両端に位置する合成 DNAの 5 '末端に適当.な制限酵素の認識配列を導入するこ とで、 本項 2の （1 ) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺 ί云子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、 ヒト型 CDR移植抗体発現べク 夕一を構築することができる。
( 8 ) ヒト化抗体の安定的生産
本項 2の （4 )及び （7 ) に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入するこ とによりヒト型キヌラ抗体及びヒト型 CDR移植抗体 （以下、 併せてヒト化抗体と称す） を安定 に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、 エレクトロボレ一シヨン法 [特閧 平 2 - 257891 ; サイトテクノロジー（Cytoteclmology) , 3 , 133 ( 1990 )] 等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、 ヒト化抗体を生産させることができ る動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、 チャイニーズハムスター 卵巣細胞 CHO/dhf r-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラヅトミエローマ細胞 YB2/0細胞、 IR983F細胞、 シ リアンハ.ムス夕一腎臓由来である BHK細胞、 ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあ げられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラヅトミエ ローマ YB2/0細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、 ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、 特閧平 2-257891に鬨示されている方法に従い、 G418硫酸塩（以下、 G418と表記する； SIGMA社製）等 の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。 動物細胞培養用培地としては、 RPMI1640 培地 （日水製薬社製） 、 GIT培地 （日本製薬社製） 、 EX- CELL302培地 （JRH社製） 、 IMDM培地 (GIBC0 BRL社製)、 Hybridoma- SFM培地 (GIBC0 BRL社製) 、 またはこれら培地に牛胎児血清 (以下、 FCS と表記する） 等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得られた 形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。 培養上清中のヒト化抗体の生産量及ひ'抗原結合活性は酵素免疫抗体法 [以下、 ELISA法と表記 する；アンティボディズ：ァ 'ラボラトリー ·マニュアル (Antibodies : A Laboratory Manual ) , Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 , 1998、 モノクローナル ·アンティボディズ： プ リ.ンシプルズ *アンド · プラクティス（Monoclonal Antibodies : Principles and Practice ) , Academic Press Limited, 1996]等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特開平 2-257891 に鬨示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させ ることができる。
ヒト化抗体は、 形質転換株の培養上清よりプロティン Aカラムを用いて精製することができ る [アンティボディズ：ァ 'ラボラトリー'マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual ) , Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8 , 1988、 モノクローナル ·アンティポディズ： プリンシ 'フリレズ ·ァンド ·フ。ラクテイス (Monoclonal Antibodies : Principles and Practice j , Academic Press Limited, 1996] 。 また、 その他に通常、 蛋白質の精製で用いられる'精製方法を使用する ことができる。 例えば、 ゲル濾過、 ィォン交換ク口マトグラフィ一及び限外濾過等を組み合わ せて行い、 精製することができる。 精製したヒト化抗体の H鎖、 L鎖或いは抗体分子全体の分 子量は、 SDS変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [以下、 SDS- PAGEと表記する；ネイチヤー. (Nature ) , 227 , .680 ( 1970)]'やウエスタンブロヅティング法 [アンティボディズ：ァ ·ラボラ 卜リー ·マ二ユアノレ (Antibodies : A Laboratory Manual ) , Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12 , 1988, モノクローナル ·アンティボディズ： プリンシプルズ ·アンド · プラクテ イス (Monoclonal Antibodies : Principles and Practice ) , Academic Press Limited, 1996」 等で測定することができる。
以上、 動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、 上述したように、 酵母、 昆 虫細胞、 植物細胞または動物個体あるいは植物倜体においても動物細胞と同様の方法により抗 体組成物を製造することができる。 '
すでに宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、 上記 1に記載した方法を用い て抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、 該細胞を培養し、 該培養物から目的とする抗体 組成物を精製することにより、 本発明の抗体組成物を製造することができる。
3 · 抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、 抗原との結合活性あるいは細胞傷害活性を測定する方法とし ては、 モノクローナルアンチボディズ、 あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公 知の方法を用いることができる。 .
具体的な例としては、 抗体組成物がヒト化抗体の場合、 抗原との結合活性、 抗原陽性培養細 胞株に対する結合活性は ELISA法及び蛍光抗体法 [キャンサー 'ィムノロジー 'ィムノセラビ 一（Cancer Immunol . I腿 unother . ) , 36 , 373 ( 1993 )] 等により測定できる。 抗原陽性培養細胞 株に対する細胞傷害活性は、 CDC活性、 ADCC活性等を測定することにより、 評価することがで きる [キャンサー 'ィムノロジ一 'ィムノセラピ一（Cancer Immunol. I醒 mother. ) , 36. 373 (1993)] 。
また、 抗体組成物のヒトでの安全性、 治療効果は、 力二クイザル等のヒトに比較的近い動物 種の適当なモデルを用いて評価することができる。 '
4. 抗体組成物の糖鎖の分析 、
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、 通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行 うことができる。 例えば、 IgG分子に結合している糖鎖はガラクトース、 マンノース、 フコー スなどの中性糖、 N-ァセチルグルコサミンなどのアミノ糖、 シアル酸などの酸性糖から構成さ れており、 糖組成分析および二次元糖鎖マヅプ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用 ヽて 行うことができる。
(1) 中性糖-アミノ糖組成分析
抗体組成物の糖鎖の組成分析は、 トリフルォロ酢酸等で、 糖鎖の酸加水分解を行うことによ り、 中性糖またはアミノ糖を遊離し、 その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。 BioLC は HPAEC-PAD ( high performance ani on-exchange chromatography - pulsed am erorae trie detection)法 [ジャーナル'ォブ' ύキッド 'クロマトグラフィー（J.Liq.Chromatogr.) ,6, 1577 (1983)] によって糖組成を分析する装置である。.
ま广こ、 2-アミノビリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。 具体的に は、 公知の方法 [ァグリカルチュラル · アンド ·バイオロジカル · ケミス ト リ一 (Agric.Biol.Chem.), 55(1 ), 283-284 (1991 )] に従って酸加水分解した試料を 2-アミノビリ ジル化で蛍光ラペル化し、 HPLC分析して組成比を算出することができる。
(2) 糖鎖構造解析
抗体組成物の糖鎖の構造解析は、 次元糖鎖マヅプ法 [アナリティカル ·バイオケミストリ ― (Anal.. Biochem.) , 171, 73 (1988)、 生物化学実験法 23-糖蛋白質糖鎖研究法 （学会出版 センター）高橋禮子編' (1989年） ]により行うことができる。 2次元糖鎖マヅプ法は、例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、 Υ軸には順相クロマ トグラフィ一による糖鎖の保持時間または溶出位置を、 それぞれプロヅ トし、 既知糖鎖のそれ らの結果と比較することにより、 糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、 2-ァミノピリジン（以下、 ΡΑと略記する）による糖鎖の蛍光標識 [ジャーナル 'ォブ 'バイオケミストリ一（J. Biochem.) , 95, 197 (1984)] を行った後、 ゲルろ過により糖鎖を過剰の PA化試薬などと分離し、 逆相クロ マトグラフィーを行う。 次いで、 分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを 行う。 これらの結果をもとに、 2次元糠鎖マヅプ上にプロットし、 糖鎖スタンダード （TaKa¾a 社製） 、 文献 [アナリティカル 'バイオケミストリー （Anal. Biochem.) , 171, 73 (1988)] とのスポヅトの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖の MALDI-T0F- MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マップ法により推定される 構造を確認することができる。
5. 抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法 抗体組成物は、 抗体の Fc領域に結合する糖鎖構造^異なつた抗体分子から構成されている。 本発明の抗体組成物は、 Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末 端の N-ァセチルグルコサミンにフ 3—スが結合していない糖鎖の割合が 100°/。であり、高い ADCC 活性を示す。 このような抗体組成物は、 上記 4 . に記載の抗体分ネの糖鎖構造の分析法を用い ることにより識別できる。 また、 レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによつても 識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、 文献 [モノクロ ーナル ·アンティボディズ： プリンシプルズ 'アンド 'アブリケ一シヨンズ（Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wiley-Liss , Inc . , (1995 ) ; 酵素免疫測定法， 第 3版， 医学書院 （1987) ； 改訂版， 酵素抗体法， 学際企画 （1985) ] 等に記載のウエスタン 染色、 RIA (Radioimmunoassay) 、 VIA (Viroi腿漏 assay) 、 EIA (Enzymoi腿画 assay) 、 FIA
(Fluoroimmunoassay) 、 MIA (Metalloi麵 unoassay) などの免疫学的定量方法に準じて、 例え ば、 以下のように行うことができる。 - 抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、 標識したレクチン と試料である抗体組成物を反応させる。 次に、 標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測 定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、 例えば、 WGA (T. vulgaris ί来 の wheat- germ agglutinin)、 ConA (C. ensiformis由来の concanavalin A)、 RIC (R. communis 由来の毒素)、 L-PHA (P. vulgaris由来の leukoagglutinin)、 LCA (L. culinaris由来の lentil agglutinin)、 PSA (P. sativum 由来の Pea lectin)s AAL (Aleuria aurantia Lectin)^ ACL (Amaranthus caudatus Lectin) BPL (Bauhinia purpurea Lectin)N DSL (Datura stramonium Lectin)、 DBA (Dolichos bif lorus Agglutinin)s EBt (Elderberry Balk Lectin) ECL (Erythrina cristagalli Lectin)ヽ' EEL (Euonymus europaeus' Lectin )、 GNL (Galanthus nivalis Lectin)^ GSL (Griffonia simplicifolia Lectin) HPA (Helix pomatia Agglutinin)N HHL (Hippeastrum Hybrid Lectin)、 Jacalin、 LTL (Lotus tetragonolobus Lectin)s LEL (Lycopersicon esculentum Lectin)^ MAL (Maackia amurensis Lectin)、 MPL (Maclura pomifera Lectin)、 NPL (Narcissus pseudonarcissus Lectin) ヽ PNA (Peanut Agglutinin) ヽ E-PHA (Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin) s PTL (Psophocarpus, tetragonolobus Lectin) RCA (Ricinus communis Agglutinin)^ STL (Solan腿 tuberosum Lectin)s SJA (Sop ora japonica Agglutinin)^ SBA (Soybean Agglutinin)s UEA (Ulex europaeus Agglutinin )s WL (Vicia villosa Lectin)^ FA (Wisteria floribiinda Agglutinin)があげられる。
N-グルコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合してい る糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、 その具体的な例としては、 レンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin)エンドゥマメレクチン P SA (Pis価 sativum由来の Pea Lectin)、 ソラマメレクチン VFA (Vicia 'f aba由来の AggluUn in)、 ヒィロチャワン夕ケレクチン ML (Aleuria aurantia由来の Lectin) を挙げることがで ぎる。 '
6 . 本発明の抗体組成物の利用
本発明の抗体組成物は、ヒト CCR4に特異的に結合し、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する ため、癌疾患、炎症性疾患をはじめとする各種 CCR4発現細胞関連疾患の予防および治療におい て有用である。
本発明の抗体組成物による治療が有効な癌疾患としては、 血液癌、 特に白血病あるいはリン パ腫を挙げることができる。具体的には成人 T細胞白血病； ATL、菌状息肉症、セザリ一症候群、 未分化大細胞リンパ腫、 非特定 T細胞リンパ腫などなどがあげられる。 .
本発明の抗体組成物による治療が有効な炎症性疾患としては、 急性ある ヽは慢性の気道過敏 症または気管支喘息、 アトピー性皮膚炎を含むアトピー性皮膚疾患、 慢性副鼻腔炎、 Churg-Strauss症候群、' 尊麻疹、 天疱瘡、 好酸球性心筋炎、 アレルギー性胃腸炎、 アレルギー 性肉芽腫性血管炎、 アレルギー性鼻炎または花粉症、 など、 Th2 細胞が介在する免疫疾患があ げられる。
癌、すなわち悪性腫瘍は癌細胞が増殖し、例えば B細胞性リンパ腫においては特定の B細胞が、 異常増殖する。 通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。 しかし、 高い抗体 依存性細胞傷害活性を有する抗体は、 殺細胞効果により抗原を発現している癌細胞を傷害する ことにより癌を治療することができるため、 通常め抗癌剤よりも.治療薬として有用である。 特 に癌の治療薬において、 現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分であり、 '化学療法との併 用療法が行われているが [サイ ンス（Science ) , , 1197 ( 1998 )]、 本発明の抗体組成物単 独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、 化学療法に対する依存度が低くなり、 副作用の低 減にもなる。
慢性気道過敏性喘息や気管支喘息、 アトピー性皮膚炎を含むアトピー性皮膚疾患、 アレルギ 一性鼻炎または花粉症などの炎症性疾患では、 Th2細胞から産生される IL- 4、 IL-5および IL- 13 などのサイトカイン ·ケモカインによって好酸球や肥満細胞を始めとする炎症性細胞が増殖ま たは分化し、 これらの炎症性細胞が産生する生 |«能分子を介して組織傷害ゃァレルギー反応 が誘発される。 これまでに知られている Th2介在性免疫疾患の治療薬としては、 Τ1ι2細胞から産 生される IL-4、 IL- 5または IL- 13などの個々のサイトカインに対する拮抗剤、それらのサイトカ ィンの産生抑制剤、炎症性細胞や炎症性生体機能分子に対する阻害剤などが開発されているが、 これらの治療薬はサイトカイン .ケモカイン ·炎症性細胞間の機能の一部を阻害するだけで、 根治的な治療薬ではない。 本発明の抗体組成物は、 CCR4の細胞外領域に特異的に結合し、 CCR4 発現細胞に対して強い細胞傷害活性を示すので、 アレルギー反応の上流部にある CCR4が発現し た細胞である Th2細胞を選択的に排除すること、さらに Τ1ι2細胞から IL-4、 It- 5および IL- 13の産 生を抑制することができる。 したがって、 上述の炎症性疾患の治療薬として有用である。
本発明の抗体組成物はフコースが結合した糖鎖を有する抗体分子を含まないため細胞傷害活 性が増強されている。 そのため、 フコースが結合した糖鎖を有する抗体分子を含む抗体組成物 では治癒することができない、 上述の癌、 炎症'注疾患などの患者を治療することができる。 特に、 上述の疾患の中でも、 癌、 気管支喘息、 慢性副鼻腔炎などの疾患は、 CCR4を発現した 細胞の浸潤部位に薬物が届きにくいため、 少量の薬物でも治療効果を有することが好ましい。 本発明の抗体組成物は少量でも高い ADCC活性を有するためこれらの疾患の治療に有用である。 本発明の抗体 «物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野 においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与、 または口 腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、 抗体 製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、 カプセル剤、錠剤、顆粒剤、 シロップ剤、乳剤、座剤、 射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等が あげられる。 - 乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコ一ル類、 ごま油、 ォリーブ油、 大 豆油等の油類、 P -ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 ストロベリーフレーバー、ぺパ —ミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステ ル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製され る。 または、 抗体 物を常法に従って凍結乾燥し、 これに塩化ナトリウムを加えることによ て粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、 噴霧剤は該抗体組成物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。 担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該抗体組成物および用いる担体の 性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤に おいても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により 異なるが、 有効成分の量として、 通常成人 1日当たり 10 g/kg〜20mg/kgである。
また、 抗体組成物の各種腫癟細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、 インビト口実験と しては、 CDC活性測定法、 ADCC活性測定法等があげられ、 インビボ実験としては、 マウス等の 実験動物での腫瘍系を用レ、た抗腫瘍実験等があげられる。
CDG活性、 ADCC活性、抗腫瘍実験は、文献 [キヤンサー 'ィムノロジー 'ィ.ムノセラピー（Cancer Immunology Immunotherapy) , 36. 373 ( 1993 )；キャンサー · リサ一チ (Cancer Research) , 54 , 1511 ( 1994 ) ] 等記載の方法に従って行うことができる。 以下に、 実施树により本発明を説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。 図面の簡単な説明 - 第 1図は、 プラスミド pKOFUT8Neoの構築を示した図である。
第 2図は、 CH0/DG44細胞の FUT8対立遺伝子を 1コピー破壌したへミノヅクアウト'クローン のゲノムサザンの解析結果を示した図である。 レーンは左からそれそれ分子量マーカー、 へミ ノヅクアウトクローン 50- 10- 104および親株である CH0/DG44細胞のゲノムサザンである。 第 3図は、 CH0/DG44細胞の FUT8両対立遺伝子を破壊したダブルノヅクアウトクローン WK70 4のゲノムサザン解析結果を示した図である。 矢印は、 相同組換えが起こった際に検出される 陽性断片の換出位置を示す。
第 4図は、 CH0/DG44細胞の FUT8両対立遺伝子を破壊したダブルノヅクアウトクローンより 薬剤耐性遺伝子を除去したクローンのゲノムサザン解析結果を示した図である。 レーンは左か らそれそれ分子量マ一カー、ダブルノックアウトクローンの薬剤耐性遺伝子除去クローン 4 - 5- C3、 ダブルノックアウトクローン WK704、 へミノヅクアウトクローン 50- 10- 104および親株で ある CH0/DG44細胞のゲノムサザンである。 .
第 5図は、 作製した抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体の発現ベクターの概略図を示した図である。 第 6図は、精製した MS705/CCR4抗体および DG44/CCR4抗体の CCR4部分べプチドに対する EL ISA法における反応性を、 '抗体濃度を変化させて測定した図である。 横軸に抗体濃度を、 縦軸 に各抗体濃度における吸光度を示す。口は DG44/CCR4抗体、騸が Ms705/CCR4抗体をそれそれ示 す。 . - 第 7図は、 精製した MS705/CCR4抗体および DG44/CCR4抗体のヒト CCR4高発現細胞 （CCM/E L-4) に対する ADCC活性を、 抗体濃度を変化させて測定した図である。 横軸に抗体濃度を、 縦 軸に各抗体濃度における細胞傷害活性を示す。 *が DG44/CCR4抗体、〇が Ms705/CCR4抗体をそ れそれ示す。
第 8図は、 3.7ng/mL ©Ms705/CC! 抗体に、 0〜300ng/mLの DG44/CCR4抗体もしくは Ms705/CCR4 抗体を添加して調製した抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物の、 CCM/EL4細胞に対する in vitro ADCC活性を示した図である。グラフ縦軸に細胞傷害活性、横軸に添加した抗体濃度をそれそれ 示す。 は 3.7ng/mLの Ms705/CCR4抗体に DG44/CCR4抗体を添加して調製した抗体組成物、 ,〇 は 3.7ng/mLの Ms705/CCR4に Ms705/CCR4抗体を添加して調製した抗体組成物の活性をそれそれ 示す。 図中の※は、 3.7ng/mLの Ms705/CCR4.抗体に DG44/CC 抗体を添加して調製した抗体組 成物のうち、フコースが結合しない糖鎖を有する糖鎖を有する抗体の割合が 20%以上の抗体組 成物を示す。 '
第 9図は、 Ms705/CCR4抗体のみからなる抗体組成物と、 Ms705/CCR4抗体に 9倍量の DG44/CC 抗体を混合した抗体組成物の、 CCM/EL4細胞に対する in vitro ADCC活性を示した図である。 グラフ縦軸に細胞傷害活性を示す。グラフ横軸に示した数値は、上段から Ms705/CCR4抗体の濃 度 （ng/mL：)、 添加した DG44/CCR4抗体の濃度 （ng/mL：)、 総抗体濃度 （ng/mL) をそれそれ示す。 口は MS705/CCR4抗体のみからなる抗体組成物、 酾は Ms705/CCR4抗体に 9倍量の DG44/CCR4抗 体を混合した抗体組成物の活性を示す。 , 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ゲノム上のひ 1 , 6-フコシルトランスフェラ一ゼ （以下、 FUT8と表記する）両対立遺 伝子を破壊した CH0/DG44細胞の造成
FUT8両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失させた CH0/DG44細胞株を以下 の手順で造成した。
1.チャイニーズハムスター FUT8遺伝子のェクソン 2を含む夕ーゲティングベクター pK0FUT8Ne 0の構築
.¥002/31140の実施例 13の 1項に記載の方法で構築ざれたチャイニーズハムスター FUT8遺伝 子のェクソン 2を含む夕ーゲティングベクター pKOFUT8Puroおよび pKOSelectNeo (Lexicon社 製）を用いて、 以下の様にして pKOFUT8Neoを構築した。
pKOSelectNeo (Lexicon社製）を制限酵素 I (New England Biolabs社製）で消化後、 ァガ ロースゲル電気泳動に供し、 GENECLEAN Spin Kit (BI0101社製） を用いてネオマイシン耐性遺 伝子発現ュニットを含む約 1 .6Kbの ^I断片を回収した。 - 次に、 pKOFUT8Puroを制限酵素 I (New England Biol abs社製）で消化後、，大腸菌 C15株由 来 Alkaline Phosphatase (宝酒造社製）により、 DNA断片の末端を脱リン酸化させた。 反応後、 フエノール/クロロホルム抽出処理およぴェ夕ノール沈殿法を用いて、 DNA断片を精製した。 上記で得た pKOSelectNeo由来の I断片 （約 1 .6Kb)0. 1 zgと pKOFUT8Puro由来の 断 片 （約 10. 1Kb ) 0. i〃gに滅菌水を加えて 5〃Lとし、 Ligation High (東洋紡社製） 5 /Lを加 えて 16°Cで 30分間反応させることにより、 連結反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 株を形質転換し、 得られたアンピシリン耐性クローンより各々プラスミド DNAを調製し、 Bi gDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems社製) を 用いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNAシーケンサ ABI PRISM 377により塩基配列を 解析した。 この様にして第 1図に示した pKOFUT8Neoを得た。 pK0FUT8Neoは CH0細胞の FUT8遺 伝子へミノヅク ゥト細胞株を作製するための夕ーゲティングぺクタ一として用いた。
2. ゲノム上の FUT8遺伝子の 1コピーを破壊したへミノヅクァゥト細胞株の作製
(1 ) 夕ーゲティングぺク夕一 pKOFUT8Neo導入株の取得
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 (dhfr) を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来 CH0/DG44 細胞 [Somatic Cell and Moleculer Genetics , 12 , 555 , 1986] に、 実施例 1の 1項で構築し たチャイニーズハムスター FUT8ゲノム領域夕ーゲティングベクター pKOFUT8Neoを以下の様に ' して導入した。
pKOFUT8Neoを制限酵素 I (New England Biolabs社製）で消化して線状化し、線状化した 4 の pK0FUT8Neoを 1 . 6 x 106個の CH0/DG44細胞へェレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロ ジー (Cytotechnology) , 3 , 133 (1990 ) ]により導入した後、 IMDM-dFBS ( 10 )-HT(1 ) [透析 FB S (インビトロジェン社製）を 10 %、 HT supplement (インビトロジェン社製）を 1倍濃度で含む I MDM培地（インビトロジェン社製）] に懸濁し、接着細胞培養用 10cmデヅシュ （Falcon社製）へ 播種した。 5%C02インキュベーター内で 37°C、 24時間培養後、 G418 (ナカライテスク社製） を 600 g/mLの濃度で含む IMDM-dFBS ( 10 ) [透析 FBSを 10%で含む IMDM培地] lOmLに培地交換し た。 この培地交換作業を 3〜4日毎に繰り返しながら 5%C02インキュベーター内で 37°C、 15日 間の培養を行い、 G418耐性クローンを取得した。 (2) ゲノム PGRによる相同組換えの診断
本項（ 1 )で取得した G418耐性クローンの相同組換えの診断を、 ゲノム DNAを用いた PCRによ り、 以下の様に行った。
96穴プレート上の G418耐性クローンに対してトリプシン処理を行った後、 2倍容量の凍結培 地 [20% DMSOs 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM] を各ゥエルに添加、 懸濁した。 各ゥヱル中の細 胞懸濁液の半量を接着細胞用平底 96穴プレート（旭テクノグラス社製）へ播種してレプリカプ レートとする一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
レプリカプレート上のネオマイシン耐性クローンは、 G418を 600 zg/mLの濃度で含む IMDM - dFBS.(lO)で 5%C02インキュベータ一内で 37°C、 1週間培養した後、 細胞を回収し、 回収した細 胞から公知の方法 [アナリティカル ·バイオケミストリ一 (Analytical Biochemistry), 201, 331 (1992)]に従って各クローンのゲノム DNAを調製し、各々 30〃Lの TE- RNase緩衝液 (pH8.0)
[lOmmol/L Tris-HCK lmmol/L EDTAヽ 200 zg/mL RNase A] に一晩溶解した。
ゲノム PCR 用いるプライマ一は以下の様に設計した。 まず、 WO03/31140の実施例 12に記 載の方法により取得した FUT8ゲノム領域の配列（配列番号 13) の中から、 配列番号 39または 配列番号 40でそれそれ示されるプライマーをフォワードプライマーとした。また、夕ーゲティ ングベクターの loxP配列に特異的に結合するプライマー（配列番号 41または配列番号 42) を リバースプライマーとし、 '以下のポリメラーゼ連鎖反応（PCR) に用いた。上記で調製したゲノ 厶 DNA溶液を各々 10 zL含む 25〃Lの反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製)、 ExTaq buf fer (宝酒造社製)、 0.2腿 ol/L dNTPs 0.5 mol/L上記プライマー（フォワードプライマーとリ バースプライマ一を組み合わせて使用する） ]を調製し、 94°Cで 3分間の加熱の後、 94°Cで 1 分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとした条件で PCRを行った。
PCR後、 該反応液を 0.8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 相同,組換えによって生じ る約 1.7Kbの特異的増幅産物が認められた株を陽性クローンと判定した。
(3) ゲノムサザンブロヅトによる相同組換えの診断
本項（ 2 )で取得された陽性クローンの相同組換えの診断を、ゲノム DNAを用いたサザンブロヅ トにより、 以下の様に行った。
本項 (2)で凍結保存したマスタープレートのうち、 本項 (2)で見出された陽性クローンを含む 96穴プレートを選択し、 5%C02インキュベーター内で 37°C、 10分間静置した後、 陽性クローン に該当するゥヱル中の細胞を接着細胞用平底 24穴プレート （グライナ一社製） へ播種した。 G 418を 600〃g/mLの濃度で含む IMDM- dF'BS(lO)を用いて 5%C02インキュベーター内で 37°C、 1週 間培養した後 接着紬胞用平底 6穴プレート (グライナ一社製)へ播種した。該プレートを 5% C02インキュベーター内で 37°Cにて培養し、細胞を回収した。回収した細胞より公知の方法 [ヌ クレイヅク 'アシッド 'リサーチ（Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)]に従って各ク ローンのゲノム DNAを調製し、 各々 150〃L の TE-RNase緩衝液 (ρΗ8·0) に一晩溶解した。
上記で調製したゲノム DNA 12 gを制限酵素 l HI(New England Biolabs社製）で消化し、ェ 夕ノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 20〃Lの TE緩衝液（pH8.0) [lOmmol/L Tris - HC1、 lmmol/L EDTA]に溶解し、 0.6%(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、 公知の 方法 [プロシーディングス 'ォブ 'ザ ·ナショナル 'アカデミー 'ォブ 'サイエンス（Proc. N atl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979)] に従って、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行い、 固定化した。
一方、 サザンプロヅ トに用いるプローブを以下のように調製した。 W003/31140の実施例 12 に記載の方法により取得した FUT8ゲノム領域の配列 （配列番号 13) の中から、配列番号 43お よび配列番号 44でそれそれ示されるプライマーを作製し、 以下の PCRに用いた。 WO02/31140 の実施例 12に記載の pFUT8fgE2- 2 4.0ngをテンプレートとして含む 0 Lの反応液 [DNAポリ メラ一ゼ ExTaq (宝酒造社製)、 ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0.2腿 ol/L dNTPsヽ 0.5 mol/L上 記プライマー]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1 分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCRを行った。
PCR後、 該反応液を 1.75%(Wv) ァガロースゲル電気泳動に供し、 GENECLEAN Spin Kit (BIO 101社製） を用いて約 230bpのプローブ DNA断片を回収した。 得られたプローブ DNA溶液のう ち 5〃Lを、 [«-32P] dCTP l,75MBqおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersh am Pharmacia Biotech社製） を用いて放射線標識した。
ハイブリダィゼ一シヨンは以下の様に行った。 まず、 上記のゲノム DNA消化物が転写された ナイロン膜をローラ一ポトルへ封入し、 15mLのハイブリダィ ーシヨン液 [5xSSPE、 50xDen haldt's液、 0.5%(w/v) SDS、 100 /g/mLサケ精子 DNA] を加えて 65°Cで 3時間のプレハイプリ ダイゼーシヨンを行った後、 32P標識したプローブ DNAを熱変性してボトルへ投入し、 65°Cで一 晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。
ハイブリダィゼーシヨン後、 ナイロン膜を 50mLの一次洗浄液 [2xSSC_0.1%(w/v) SDS] に 浸漬し、 65°Cで 15分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、ナイロン膜を 50mLの二次洗浄液 [0.2xSSC-0.1%(w/v) SDS] に浸漬し、 65°Cで 15分間加温して洗浄した。 洗浄後、 ナイロン膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。
第 2図には、 親株である CH0/DG44細胞、 および本項 (2) で取得した陽性クローンである 50 - 10-104株のゲノ 匪 Aを本法により解析した結果を示した。 CH0/DG44細胞では、野生型 FUT8 対立遺伝子由来の約 25.5Kbの断片のみが検出された。 一方、 陽性クローン 50- 10- 104株では、 野生型 FUT8対立遺伝子由来の約 25.5Kbの断片に加え、 相同組換えされた対立遺伝子に特異的 な約 20.0Kbの断片が検出された。両断片の量比は 1： 1であったことから、 50-10- 104株は、 F UT8対立遺伝子のうち 1コピーが破壊されたへミノックアウトクローンであることが確認され た。
3. ゲノム上の FUT8遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞の作製
( 1 ) ターゲティングベクタ一 pK0FUT8Pur 0導入株の作製
本実施例の 項で得た FUT8遺伝子へミノックアウトクローンのもう一方の FUT8対立遺伝子 を破壊するために、 WO02/31U0の実施例 13の 1項に記載のチャイニーズハムスター FUT8遺伝 子ェクソン 2夕ーゲティングベクタ一である pK0FUT8Puroを以下の様にして導入した。
pK0FUT8Puroを制限酵素 MI (New England Biolabs社製）で消化して線状化し、線状化した 4〃gの pKOFUT8Puroを 1.6X106個の FUT8遺伝子へミノヅクアウトクローンへエレクトロポレ ーシヨン法 [サイトテクノロジー （Cytotechnology) , 3, 133 (1990)]により導入後、 IMDM- dF BS (10)-HT(1) に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmデッシュ （Falcon社製） へ播種した。 5%C02 インキュベーター内で 37°C、 24時間培養後、 ピューロマイシン (SIGMA社製） を 15〃g/mLの 濃度で含む IMDM- dFBS (10)-HT(l) lOmLに培地交換した。 この培地交換作業を 7日毎に繰り返 しながら 5%C02インキュベーター内で 37°C、 15曰'間の培養を行い、 ピュー口マイシン耐性ク ,ローンを取得した。
(2) ゲノムサザンプロットによる相同組換えの診断. .
本項 (1)で取得された薬剤耐性クローンの相同組換えの診断を、ゲノム DNAを用いたサザンブ ロットにより以下の様に行つた。
ピュ一ロマイシン耐' |·生クローンを、 公知の方法 [Gene Targeting, Oxford University Pres s, (1993)]に従って接着細胞用平底プレート （旭テクノグラス社製）へ採取し、 ピュー口マイ シン （SIGMA社製） を 15 g/mLの濃度で含む IMDM- dFBS (10)-HT(1)を用いて 5%C02インキュ ベー夕一内で 37°C、 1週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリブシン処理を行い、接着細胞用平底 24穴プレ ート （グライナ一社製） へ播種した。.ピューロマイシン （SIGMA社製） を 15〃g/mLの濃度で含 む IMDM-dFBS (10)- HT(1)を用いて 5%C02インキュベータ一内で 37°C、 1週間培養した後、同様 にトリプシン処理を行い、 接着細胞用平底 6穴プレート （グライナ一社製） へ播種した。 該プ レートを 5%C02インキュベーター内で 37°Cにて培養し、回収した細胞より公知の方法 [ヌクレ ィヅク 'アシッド · ύサーチ（Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)]に従って各クロー ンのゲノム DNAを調製し、 '各々 150 zLの TE- RNase緩衝液（pH8.0)にー晚溶解した。
, 上記で調製したゲノム DNA 12 /gを制限酵素 £ HI(New England Biolabs社製）で消化し、ェ 夕ノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 20//Lの TE緩衝液 (pH8.0) に溶解し、 0.6%(w /v) ァガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ - ナショナル ·アカデミー.ォブ ·サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (197 9)] に従って、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。転写後、 ナイロン膜に対し 80°Cで 2時間 の熱処理を行い、 固定ィ匕した。
一方、 サザンプロヅトに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 ターゲティングべ クタ一に含まれる FUT8ゲノム領域よりもさらに 5'側の配列に特異的に結合するプライマー (配 列番号 45および配列番号 46)を作製し、以下の PCRに用いた。 WO02/31U0の実施例 12に記載 のプラスミド pFUT8fgE2-2 4.0ngをテンプレートとして含む 20〃Lの反応液' [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製)、 ExTaq buff er (宝酒造社製)、 0.2腿 ol/L dNTPs、 0.5〃mol/L上記プライマ 一]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒阛、 74°Cで 1分間からな る反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCRを行った。
PCR後、 該反応液を 1.75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 GENECLEAN Spin Kit (BIO 101社製）'を用いて約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液のう ち 5〃Lを、 [ひ-32 P] dCTP 1.75MBqおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersh am Pharmacia Biotech社製） を用いて放射線標識した。
ハイブリダィゼーシヨンは以下の様に行つ 。 まず、 上記のゲノム DNA消化物が転写された ナイロン膜を口一ラーボトルへ封入し、 15mLのハイ.ブリダィゼーシヨン液 [5xSSPE、 50 x Den haldt' s液、 0.5%(w/v) SDS、 ΙΌΟ zg/mL サケ精子 DNA] を加えて 65°Cで 3時間のプレハイブ リダイゼ一シ aンを行った後、 32P標識したプローブ DNAを熱変性してボトルへ投入し、 65°Cで 一晩ハイブリダイゼーションを行った。 ハイブリダィゼーシヨン後、 ナイロン膜を 50mLの一次洗浄液 [2xSSC—0.1%(w/v) SDS] に 浸漬し、 65°Cで 15分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、ナイ口ン膜を 50mLの二次洗浄液 [0.2xSSC-0.1%(w/v) SDS] に浸漬し、 65°Cで 15分間加温して洗浄した。 洗浄後、 ナイ口ン膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。
第 3図には、 50- 10- 104株から本項（1)に記載の方法により取得したピューロマイシン耐性ク ローンの 1つである WK704株のゲノム DNAを本法により解析した結果を示した。 WK704株では、 野生型 FUT8対立遺伝子由来の約 25.5Kbの断片が消失し、 相同組換えされた対立遺伝子に特異 的な約 20.0Kbの断片 （図中に矢印で示す） のみが検出された。 この結果から WK704株は、 FUT 8両対立遺伝子が破壊されたクローンであることが確認された。
4. FUT8遺伝子をダブルノヅクアウトした細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
(1) Creリコンビナーゼ発現ベクターの導入
本実施例の 3項で取得した FUT8遺伝子ダブルノヅクアウトクローンの薬剤耐性遺伝子を除去 することを目的として、 Creリコンビナーゼ発現べクタ一 pBS185 {Life Technologies社製）を 以下の様にして導入した。 ·'
の pBS185を 1.6 X 106個の FUT8遺伝子ダブルノ'ヅクアウトクローンへェレクト口ポレー シヨン法 [サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 3, 133 (1990)]により導入後、 IMDM-dFBS (10)-HT(1) 10mL に懸濁し、 さらに同培地を用いて 2万倍に希釈した。 該希釈液を接着細胞培 養用 10cmディッシュ （Falcon社製） 7枚へ播種後、 5%C02インキュベーター内で 37°C、 10日 間の培養を行い、 コロニーを形成させた。
(2) Creリコンピナーゼ発現べク夕一導入株の取得
本項（1)で取得したコロニーのうち、 任意のクローンを公知の方法 [Gene Targeting, Oxfor d University Press, (1993)] に従って接着細胞用平底プレート （旭テクノグラス社製） へ採 取し、 IMDM- dFBS(10)- HT(1)を用いて 5%C02インキュベーター内で 37° 1'週間培養した。 培養後、上記プレートの各クローンに対してトリプシン処理を行い、 2倍容量の凍結培地 [2 0% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 0% 頂 DM]を各ゥエルに添加、 懸濁した。各ゥエル中の細胞顕濁 液の半量を接着細胞用平底 96穴プレート（旭テクノガラス社製）へ播種してレプリカプレート とする一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存した。
次にレプリカプレート上の細胞を、 G418を 600〃g/mL、ピューロマイシンを 15/zg/mLの濃度 で含む IMDM-dFBS (10)- HT(1)を用いて 5%C02インキュベーター内で 37° 一週間培養した。 Cr eリコンビナーゼの発現により ΙοχΡ配列に挟まれた薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローン は、 G418およびピューロマイシン存在下で死滅する。 本法により陽性クローンを選択した。 (3) ゲノムサザンブロヅトによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項 (2)で選択した陽性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロヅトによる薬剤耐性 遺伝子除去の診断を行った。 ,
本項 (2)で凍結保存したマスタープレートのうち、 上記陽性クローンを含む 96穴プレートを 選択し、 5%C02インキュベーター内で 37°C、 10分間静置した。 静置後、 上記クローンに該当す るゥエルから細胞を接着細胞用平底 24穴プレート （グライナ一社製）へ播種した。 DM-dFBS (10)- HT(1)を用いて 1週間培養した後、 トリプシン処理を行い、 接着細胞用平底 6穴プレート (グライナ一社製） へ播種して 5%C02インキュベー ー内で 37°Cで培養し、 増殖した細胞を回 収した。 回収した細胞より公知の方法 [ヌクレイヅク · ァシヅド . リサーチ（Nucleic Acids R esearch) , 3 , 2303 , (1976 )] に従って各クローンのゲノム DNAを調製し、 各々 150〃Lの TE- R Nase緩衝液 (pH8.0) に一晩溶解した。
上 ffiで調製したゲノム DNA 12〃gを制限酵素 ii I (New England Biolabs社製)で消化し、 ェ 夕ノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 20〃L の TE緩衝液 (pH8.0 )に溶解し、 0. 6% (w /v) ァガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法 [プロシ一ディングス 'ォプ 'ザ' ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス（Proc . Natl . Acad . Sci . USA) , 76 , 3683 , (197 9)] に従って、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイロン膜に対し 80°Cで 2 時間の熱処理を行い、 固定化した。
一方、 サザンプロヅトに用いるプローブを J¾下のように調製した。 夕一ゲティングベクター に含まれる FUT8ゲノム領域よりもさらに 5'側の配列に特異的に結合するプライマー（配列番 号 4.5および配列番号 46) を用いて、 以下の PC を行った。 WO02/31140の実施例 12に記載の p FUT8fgE2-2 4.0n をテンプレートとして含む 20/zLの反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造 社製)、 ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0.2讓 ol/L dNTPsヽ 0. 5 ol/L上記プライマー]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反応を 1サ ィクルとした 25サイクルの条件で PCRを行った。
PCR後、 該反応液を 1 .7'5%(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 GENECLEAN Spin Kit (BIO 101社製） を用いて、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液の うち 5〃Lを、 [ひ-32 P] dCTP 1 .75MBqおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amer sham Pharmacia Biotech社製） を用いて;^射線標識した。
ハイブリダィゼーシヨンは以下の様に行った。 まず、 上記のゲノム DNA消化物が転写された ナイロン膜をローラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [5 X SSPE、 50 x Den aldt' s液、 0. 5%(w/v) SDS、 lOO^g/mL サケ精子 DNA] 15mLを加えて 65°Cで 3時間のプレハイブリ ダイゼ一シヨン後、 32P標識したプローブ DNAを熱変性してボトルへ投入し、 65°Cでー晚ハイブ リダィゼーシヨンを行った。
ハイブリダィゼーシヨン後、 ナイロン膜を 50mLの一次洗浄液 [2 X SSC— 0. 1%(W/V) SDS] に 浸漬し、 65°Cで 15分間加温して洗浄した。上記の洗浄操作を 1回繰り..返した後、ナイロン膜を 50mLの二次洗浄液 [0. 2 X SSC— 0.1%(W/V) SDS] に浸漬し、 65°Cで 15分間加温して洗浄した。 洗浄後、 ナイ口ン膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。 '
第 4図には、親株である CH0/DG44 ,細胞、本実施例の 2項に記載の 50- 10- 104株、本実施例の 3項に記載の WK704株、および WK704株から本項 (2 )に記載の方法により取得した薬剤感受性ク ローンの 1つである 4-5- C3株のゲノム DNAを、 本法により解析した結果を示した。 CH0/DG44 細胞では、 野生型 FUT8対立遺伝子に由来する約 8.0Kbの DNA断片のみが検出された。 また、 5 0-10-10 株や WK704株では、相同組換え^起こった対立遺伝子に由来する約 9 , 5K の DNA断片 が認められた。一方、 4-5- C3株では、 相同組換えが起こった対立遺伝子からさらにネオマイシ ン耐'性遺伝子（約 1 .6Kb)およびピューロマイシン耐 '性遺伝子（約 1 . 5Kb)が除去されて生じる 約 8.0Kbの DNA断片のみが検出された。 この結果から 4-5- C3株は、 Creリコンビナーゼにより 薬剤耐性遺伝子が除去されたことが確認された。 薬剤耐性遺伝子の除去された FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン （以下、 FUT8遺伝子 ダブルノックアウト細胞と表記する） は、 4-5- C3株以外にも複数株取得された。
実施例 2 FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞による抗 CCR4ヒト CDR移植抗体組成物の発現
1. FUT8遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現 .
実施例 1の 4項に記載の FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞および親株である CH0/DG44細 胞を宿主細胞として用いて、 抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体の安定生産細胞を W002/31140の実施 例 1の 2項 （2) に記載の方法で作製した。 なお、 抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体の発現ベクター', は WO03/18635の実施例 1に記載の方法で作製した。 第 5図には、 作製した抗 CCR4ヒト型 CDR 移植抗体組成物の発現ベクターの概略図を示した。
最終的に G418を 500 g/mLの濃度で含む IMDM- dFBS (10 ) 培地で増殖可能かつ、抗 CCR4ヒト 型 CDR移植抗体を生産する形質転換株を取得した。親株の CH0/DG44細胞より得られた形質転換 株を DG44/CCR4株と、 FUT8遺伝子ダブルノヅクァゥト細胞より得られた形質転»を Ms705/C CR4株と名付けた。 -
2. 培養上清中のヒト IgG抗体濃度の測定 （ELISA法）
ャギ抗ヒト IgG(H&L)抗体 (American Qualex社製）を Phosphate. Buffered Saline (以下、 PBS と表記する） （インビトロジェン社製）で希釈して l〃g/mLとし、 96穴 © ELISA用プレート（グ ライナ一社製） に、 50 zL/ゥエルで分注し、 4°Cで一晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 BS Aを 1%の濃度で含む PBS (以下、 1%BSA- PBSと表記する） （和光純薬社製） を 100〃L/ゥエル で加え、 室温で 1時間反応させて残存する活性基をプロヅクした。 1%BSA- PBSを捨て、形質転 換株の培養上清、 または培養上清から精製した抗体の各種希釈溶液を ゥェルで加え、室 温で 1時間反応させた。反応後、 Tween20を 0. 05%の濃度で含む PBS (以下、 Tween- PBSと表記 する） （和光純薬社製） で各ゥヱルを洗浄後、 1%BSA-PBSで 2000倍に希釈したペルォキシダ ーゼ標識ャギ抗ヒト IgG(H&L)抗体溶液 （American Qualex社製） を二次抗体溶液として、 それ それ 50〃L/ゥヱルで加え、室温で 1時間反応させた。反応後、 Tween-PBSで洗浄後、 ABTS基質 液 [ 2 , 2 ' -ア^ノ-ビス ( 3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸）アンモニゥム（和光純薬社製） の 0. 55gを 1Lの 0. 1Mクェン酸緩衝液 (pH4. 2 )に溶解し、使用直前に過酸化水素 (和光純薬社製） を 1 zL/mLで添加した溶液]を 50 /L/ゥエルで加えて発色させ、 415腿の吸光度 （以下、 OD415 と表記する） を測定した。 '
3. 抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物の精製 ― 実施例 2の 1項で得られた形質転換細胞株 DG44/CH0株および MS705/CCR4株を用いて、 それ それが生産する抗 CCMヒト型 CDR移植抗体組成物を以下の様にして精製した。
各々の形質転 を、 （H18を 500〃g/mLの濃度で含む IMDM- dFBS ( 10 )に懸濁し、 30mLを 182cm2 フラスコ （グライナ一社製） に播種して 5%C02インキュベーター内で 37° 数日間培養した。 細胞密度がコンフルェントになった時点で培養上清を除去し、 25mLの PBSで細胞を洗浄後、 EXCELL301培地 （JRH Biosciences社製） 30mLを注入した。 5°/。C02インキュベーター内で 37°C、 7 日間培養後、細胞懸濁液を回収し、 3000rpm、 4°Cの条件で 5分間の違心分離を行って上清を回収 した後、 0.22〃m孔径 Millex GV フィルター （ミリポア社製） を用いて濾過滅菌した。 上述の 方法により取得した培養上清より、 Mab Select (Amersham Biosciences社製）カラムを用いて、 添付の説明書に従い、 抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物を精製した。 精製した抗 CCRヒト型 CDR 移植抗体組成物は、 DG44/CCM株より得られた抗体組成物を DG44/CCR4抗体と、 Ms705/CCR4株よ り得られた抗体組成物を MS705/CCR4抗体と名付けた。 なお、 取得した Ms705/CCR4株は、 平成 15 年 9月 9日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) に FERM BP-8467として寄託されている。
実施例 3 FUT8遺伝子ダブルノックアウト細胞が生産する抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体の生物 活性
1. 抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体のヒト CCM抗原に対する結合活性 （ELISA法）
実施例 の 3項で精製した DG44/CCR4抗体おょぴ MS705/CCR4抗体のヒト CCR4抗原に対する 結合活性を以下の様にして測定した。
抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体が反応し得るヒト CCR4細胞外領域べプチドとして、化合物 1 (配 列番号 38 ) を選択した。 ELISA法による活性測定に用いるため、以下の方法で BSA (Bovine Se rum Albumin) (ナカライテスク社製） とのコンジュゲートを作製し、 抗原として用いた。 すな わち、 10 mgの BSAを含む PBS溶液 900 〃Lに、 100 /Lの 25mg/mL SMCC [4- (N-マレイミドメ チル） シクロへキサン- 1-カルボキシリヅクァシヅド N-ヒドロキシサクシンィミ ドエステル] (シグマ社製)- DMS0溶液をボルテヅクスしながら滴下し、 30分間ゆつくりと攪拌した。 25mL P BS (インビトロジェン社製） で平衡化した NAP- 10カラムなどのゲルろ過カラムに反応液 ImL をアプライし、 1 . 5mLの PBSで溶出させた溶出液を BSA- SMCC溶液とした （A28。測定から BSA濃 度を算出）。 次に、 0. 5 mgの化合物 1に 250 L PBSを加え、 次いで 250 zL DM を加えて完全 に溶解させた後、前述の BSA-SMCC溶液 （BSA換算 1 . 25mg) をボルテックス下で添加して 3時間 ゆっくり攪拌した。反応液を PBSに対して 4°C、ー晚透析し、最終濃度 0. 05%となるようにアジ 化ナトリウムを添加して、 0.22 フィル夕一でろ過した後、 BSA-化合物 1溶液とした。 上述のように調製した BSA-化合物 1溶液を PBSで希釈して l〃g/mLとし、 96穴の ELISA用プ レート （グライナ一社製）に 50 zL/ゥエルで分注し、 4°Cで一晩放置して吸着させた。 PBSで洗 浄後、 1 BSA-PBSを 100〃L/ゥエルで加え、 室温で 1時間反応させて残存する活性基をプロヅ クした。 1%BSA-PBS 捨て、 各ゥヱルを Tween-PBSで洗浄後、 実施例 2の 3項で調製した DG4 4/CCR4抗体または MS705/CC 抗体の各種希釈溶液を 50〃L/ゥェルで加え、 室温で 2時間反応 させた。 反応後、 各ゥヱルを Tween-PBSで洗浄後、 1%BSA-PBSで 2000倍に希釈したペルォキ シダ ゼ標識ャギ抗ヒト IgG(H&L)抗体溶液を二次抗体溶液として、それそれ 50〃L/ゥエルで加 え、 室温で 1時間反応させた。反応後、 Tween- PBSで洗浄後、 ABTS基質液を 50 /L/ゥヱルで加 えて発色させ、 0M15を測定した。
第 6図には、 DG44/CCR4抗体および Ms705/CCR4抗体の CCR4細胞外領域部分べプチドに対す る結合活性を示した。両抗体は CCM細胞外領域部分べプチドに対して同等の結合活性を有して いた。
. 抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物の k xik^細胞傷害活性 （ADCC活性）
実施例 2の 3項で得られた DG44/CCR4抗体おょぴ Ms705/CCR4抗体の in 細胞傷害活性 を以下の様にして測定した。
(1 ) 標的細胞溶液の調製
WO01/6475 に記載のヒト CCMを高発現させたマウス胸腺種細胞 ΕΜ細胞株である CCR4/EL4 細胞を、 遠心分離操作及び懸濁により, RPMI1640- FCS ( 5 )培地 [5%FCSを含む RPMI1640培地 (ィ ンビトロジェン社製） ]で洗浄した後、 RPMI 1640- FCS ( 5 ) 培地によって 2 x 105細胞/ mLに調製し、 標的細胞溶液とした。
( 2 ) エフヱクタ一細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mLを採取し、へパリンナトリゥム （清水製薬社製） 0. 5mLを加え穏やかに混 せた。 これを Lymphoprep (AXIS SHIELD社製） を用いて、 添付の使用説明書に従い単核球層を 分離した。 RPMI1640-FCS ( 5 ) 培地で 3回遠心分離して洗浄後、 同培地を用いて 5 X 106細胞/ mL の濃度で懸濁し、 エフヱクタ一細胞溶液とした。
(3 ) ADCC活性の測定
96ゥヱル U字底プレート （Falcon社製） の各ゥエルに上記 （1 ) で調製した標的細胞溶液の 50/zL ( 1 X 104細胞/ゥエル） を分注した。 次いで （2 ) で調製したエフヱクタ一細胞溶液を 50 jul (2. 5 X 105細胞/ゥェル、エフヱクタ一細胞と標的細胞の比は 25 : 1となる） 添加した。更に、 各種抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体を各最終濃度 0 . 1~1000ng/mLとなるように加えて全量を 150 Lとし、 37°Cで 4時間反応させた。反応後、 プレートを遠心分離し、 上清中の乳酸デヒドロ ゲナーゼ（LDH)活性を、 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社製） を用 いて、 添付の説明書にしたがって吸光度を測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、 ェ フエクタ一細胞溶液および抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、 また、 エフヱク夕ー細胞自 然遊離の吸光度データは、 標的細胞溶液および抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、 上記と 同様の操作を行うことで取得した。 標的細胞全遊離の吸光度データは、 抗体溶液およびエフェ ク夕ー細胞溶液の代わりに培地を用い、 反応終了 45分前に 15〃Lの 9% Triton X- 100溶液を 添加し、上記と同様の操作を行い、 上清の LDH活性を測定することにより求めた。 ADCC活性を 次式により求めた。
[検体の吸光度]一 [ェフエクタ一細胞自然遊離の吸光度]一 [檫的細胞自然遊離の吸光度 ]χ ]00
細胞障害活性 (％〉 [標的細胞全遊離の吸光度]一 [檫的細胞自然遊離の吸光
. 度] 第 7図には、 DG44/CCR4抗体および Ms705/CCR4抗体の CCR4/EL4細胞に対する細胞傷害活性 を示した。 MS705/CCR4抗体はいずれの抗体濃度においても DG44/CCR4抗体よりも高い ADCC活 性を示した。
実施例 4 FUT8遺伝子ダブルノックアウト細胞が生産する抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物 の単糖組成分析
実施例 の 3項で精製した DG44/CCR4抗体おょぴ MS705/CCR4抗体の中性糖'アミノ糖組成分 析を、 以下の様にして行った。
抗体を遠心濃縮機で減圧下乾固した後、 2 . 0- 4. 0Mのトリフルォロ酢酸溶液を加えて 100°C、 2 - 4時間酸加水分解を行い、 夕ンパク質から中性糖 ·ァミノ糖を遊離した。 トリフルォロ酢酸溶 液を遠心濃縮機で除去し、脱イオン水に再溶解して Dionex社製糖分析装置 (DX- 500 )を用いて分 析を行った。 CarboPac PA- 1カラム、 CarboPac PA-1ガードカラム （Dionex社製）を用い、 溶離 液として 10-20mM水酸化ナトリゥム-脱ィオン水溶解液、洗浄液として 500mM水酸化ナトリウム -脱イオン水溶解液を使用して、 第 1表に示した溶出プログラムで分析した。 第 ' 1 表 中性糖 ·アミノ糖組成分析の溶出プログラム
時間 （分） 0 35 35.1 45 45.1 5¾
溶離液 （％) 100 100 0 0 100 100
洗浄液 （％) 0 0 100 100 0 0
. 得ら れた溶出フ。口ファイルの中性糖'アミノ糖成分のピーク面積から、 N-ァセチルグルコサミン比 を 4とした場合の各成分 （フコース、 ガラクトース、 マンノース） の組成比を算出した。 第 2表に各抗体の単糖組成比により計算される、 全 N-グリコシド結合複合型糖鎖に占める、 糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を示した。 DG 44/CCR4抗体ではフコースが結合していない糖鎖の割合が 8%であった。 一方、 MS705/CCR4抗 体ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、 フコースが結合していない糖鎖の 割合は ( ぼ 100%と見積も'られた。
以 ：の結果より、 MS705/CCR4抗体の N-グリコシド結合複合型糖鎖め還元末端の N-ァセチル ダルコサミンには、 フコースが結合していないことが示された。 第 2 表
抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物のフコースが結合していない糖鎖の割合
抗体名 フコースが結合していない糖鎖の割合 (％)
D(M4/CCR4抗体 8%
Ms705/ 抗体 -100% 実施例 5 フコースが結合していない糖鎖を有する抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物の生物活 性の解析
本発明の抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物の優位性をさらに明らかにするため、 フコースが 結合していない糖鎖を有する抗体組成物と、 フコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子 とフコースが結合する糖鎖を有する抗体分子とが混合された抗体 物との生物活性の比較を 行った。具体的には、フコースが結合していない糖鎖を有する抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物 である MS705/CC 抗体に、フコースが結合する糖鎖を有する抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体を混合さ せた抗体組成物の細胞傷害活性の変化を以下のようにして調べた。
( 1 )標的細胞溶液の調製
実施例 3の 2項の （1) に記載の方法に従って行った。
( 2 ) エフヱクタ一細胞溶液の調製 実施例 3の 2項の （2) に記載の方法に従って単核球層を分離し、 RPMI1640-FCS ( 5 )培地を用 いて 4 X 106細胞/ mLの濃度で懸濁し、'エフェクター細胞溶液とした。
3. ADCC活性の測定 '
96ゥエル U字底プレート （Falcon社製） の各ゥエルに、 上記 （1) で調製した標的細胞溶液を 50 L (1 X 104細胞/ゥエル） 分注した。 次いで （2) で調製したエフヱクタ一細胞溶液を 50〃L (2 X 105細胞/ゥヱル、 エフェクター細胞と標的細胞の比は 20 : 1となる） 添加した。 更に、 Ms705/CCR4'抗体および DG44/CCR4抗体をそれぞれ単独で、 または両者を混合して加えて全量を 150〃Lとし、 37°Cで 4時間反応させた。反応後、 プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロ ゲナーゼ (LDH)活性を LDH-Cytotoxic Test Wako (和光純薬社製） を用いて添付の説明書に従い 測定した。 ADCC活性は実施例 3の 2項に記載の方法に従って算出した。
一定量の MS705/CCR4抗体に DG44/CCR4抗体を添加することで、 フコーズ'が結合していない糖 鎖を有する抗体の割合を変化させた抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物を調製し、その ADCC活性を 測定した。 具体的には、 3.7ng/mLの MS705/CCR4抗体に 〜 300ng/mLの DG44/CCR4抗体を添加した 抗 CCR4ヒト型 CDR移植抗体組成物を調製した。調製した抗体組成物の ADCC活性を第 8図に示した
3 . 7ng/mLの MS705/CCR4抗体にさらに Ms705/CCR4抗体を添加すると、総抗体濃度の増加にとも なって ADCC活性の上昇が観察された力 3.7ng/mLの Ms705/CCM抗体にさらに DG44/CCM抗体を添 加しても、総抗伴濃度が増加するにも関わらず調製した抗体組成物の ADCC活性は逆に低下した。 このことは、 フコースが結合する糖鎖を有する抗体分子が、 フコースが結合していない糖鎖を 有する抗体分子の ADCC活性を阻害することを示している。 また、 フコースが結合する糖鎖を有 する抗体分子とフコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子が混合された抗体組成物にお いても、フコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子の割合が 20%以上の抗体組成物では、 該割合が 20%未満の抗体組成 に比べ顕著に高い ADCC活性を示した。 第 9図に、 10ng/mLの MS705/CCR4抗体サンプルと、 10ng/mLの Ms705/CCM抗体に 9倍量の 90ng/mLの DG44/CCR4抗体を加 えた抗体サンプルの ADCC活性をグラフとして示した。 MS705/CCR4抗体の ADCC活性は DG44/CCR4 抗体を加えることで大幅に低下した。 MS705/CCR4抗体と DG44/CCR4抗体の存在比が 1対 9のまま枋 体組成物の抗体濃度を 100倍以上に上昇させても、 10ng/mLの Ms 705/CCR4抗体サンプルの ADCC活 性には及ばなかった。 以上のことから、 フコースが結合した糖鎖を有する抗体分子が、 フコー スが結合しない糖鎖を有する抗体分子の ADCC活性を阻害していること、従来の抗体組成物では、 本発明の抗体組成物と同等の ADCC活性を発揮することはできないことが明らかとなった。 したがって、 本発明の抗体組成物によって、 従来の抗体組成物では治癒できなかった患者を 治療することができる。 ' 産業上の利用可能件
本発明によりヒト CCMに特異的に結合し、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する 遺伝子組換え抗体分子からなる組成物であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元 末端の N-ァセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物、該抗体組 成物を生産する形質転換体、 該抗体組成物の製造方法および該抗体組成物を含有する S薬提供 される。
本発明の抗体組成物は、 CCR が発現している細胞を傷害する活性が高いので、 CCR が関連す る癌または炎症性疾患等の疾患の治療のための医薬として臨床上有用である。
【配列表フリーテキスト】
配列番号 24-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 15-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域ァミノ酸配列
配列番号 26-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 27-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域ァミノ酸配列 ·
配列番号 28-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 29-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 30-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 31-人工配列の説日月：抗体重鎖可変領域ァミノ酸配列
配列番号 32-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域ァミノ酸配列
配列番号 33-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域ァミノ酸配列
配列番号 34-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域ァミノ酸配列
配列番号 35-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 39-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 40-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 41-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 42-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 43-人工配列の説明：合成 DNA '
配列番号 44-人工配列の説明：合成 DNA
配列番号 45-人工配列の説明：合成丽 A
配列番号 46-人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
I . ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4) に特異的に結合し、 N-グリコシド結合複合型糖鎖 を Fc領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体組成物であって、 N-グリコシド結合複合 型糖鎖が該糖攀の還元末端の N-ァセチルグルコサミンにフコ一スが結合して 、ない糖鎖であ る抗体組成物。
2 . N-グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位に フコースの 1位が α結合していなレ、糖鎖である、 請求項 1に Ϊ3載の抗体組成物。 .
3 . ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4.) の細胞外領域に特異的に結合する、 請求項 1に記 載の抗体組成物。 '
4 . 細胞外領域が、 配列番号 36 で示されるアミノ酸配列の 1〜39、 98〜112、 176〜206お よび 271〜284番目からなる群から選ばれる細胞外領域である請求項 3に記載の抗体組成物。
. 5 . 細胞外領域が、 配列番号 36 で示されるアミノ酸配列の 2〜29番目に存在するェピト ープである請求項 3または 4項に記載の抗体組成物。 -
6 . 細胞外領域が、 配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜29番目に存在するェピト ープである請求項 3〜 5のいずれか 1項に記載の抗体組成物。 '
7 . 細胞外領域が、 配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目に存在するェピト —プである請求項 3〜 6のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
8 . .配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含むペプチドのうち、 16、 19、 2 0および 22番目の少なくとも 1つのチロシン残基が硫酸化されたぺプチドへの結合性が配列番 号 36で示されるアミノ酸配列の 13〜25番目を含むぺプチドへの結合性よりも低いことを特徴 とする請求項 7に記載の抗体組成物。 '
9 . ヒト血小板に反応性を示さない請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
1 0 . ヒト CCケモカイン受容体 ( CCR4) の細胞外領域に特異的に結合し、 CCR リガンド' である TARC (thymus and activation-regulated chemokine) または励 C unacrophage- derive d chemokine) の CCR4への結合を阻害する活性を有さない請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載 の抗体組成物。
I I . ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4)発現細胞に特異的に結合する請求項 1〜 1 0の いずれか 1項に記載の抗体組成物。
1 2 . ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4)発現細胞に対し細胞傷害活性を示す請求項 1〜 1 1のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
1 3 . ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4)発現細胞に対し、 非ヒト動物由来ハイプリドー マが生産するモノクローナル抗体よりも高い細胞傷害活性を示す請求項 1〜 1 2のいずれか 1 項に記載の抗体組成物。
1 4 . ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) 発現細胞が、 ヘルパー T細胞である、 請求項 1 ；!〜 1 3のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
1 5 . 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害 （ADCC ) 活性'である請求項 1 2または 1 3に記 載の抗体組成物。
1 6 . それぞれ配列番号 14、 15、 16で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 ( CDR) 1、 CDR2、 CDR3を含む、請求項 1〜 1 5のいずれ か 1項に記載の抗体組成物。
1 7 . それぞれ配列番号 17、 18、 19で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子軽鎖 (L鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 （CDR) 1、 CDR2S CDR3を含む、請求項 1〜 1 6のいずれ か 1項に記載の抗体組成物。
1 8 . それそれ配列番号 14、 15、 16で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） の相補性決定領域 ( CDR) 1、 CDR2S CDR3、 およびそれそれ配列番号 17、 1
8、 19で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖.（L鎖） V領域の相補性決定領域 ( CDR) 1、 CDR 1、 CDR3を含む、 請求項 1〜 1 7のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
1 9 . 遺伝子組換え抗体がヒト型キヌラ抗体またはヒト型 CDR移植抗体である請求項 1〜 1 8のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
2 0 . ヒト型キメラ抗体がヒト CCケモカイン受容体 (CCR4)に特異的に結合するモノクロ ーナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 (CDR ) を含む、 請求項 1 9に記載の抗体組成物。
2 1 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 21で示されるアミノ酸配 列を含む、 請求項 2 0に記載の抗体組成物。
2 2 . 抗体分子の軽鎖 （L鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 23で示されるアミノ酸配 列を含む請求項 2 0に記載の抗体組成物。
2 3 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 21で示されるアミノ酸配 列を含み、 かつ、 抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域が、 配列番号 23で示されるアミノ酸配列を含 む請求項 2 0〜 2 2のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
2 4 . ヒト型 CDR移植抗体がヒト CCケモカイン受容体（CCR4)に特異的に結合するモスク 口 ナル抗体の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖) V領域の相補性決定領域 (C DR)を含む、 請求項 1 9に記載の抗体組成物。
2 5 . ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4) に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 （CDR) とヒト抗体の H ' 鎖 V領域および L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR) を含む、 請求項 2 4に記載の抗体組成 物。 .
2 6 . ヒト CCケモカイン受容体 (CCR4) に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖 (H鎖） 可変領域 （V領域） および軽鎖 （L鎖） V領域の相補性決定領域 （CDR) とヒト抗体の H 鎖 V領域および L鎖 V領域のフレームワーク領域 （FR)、 ならびにヒト抗体の H鎖定常領域 （C 領域） および L鎖 C領域を含む、 請求項 2 4または 2 5に記載の抗体組成物。 '
2 7 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 24で示されるアミノ酸配 列、 または配列番号 24で示されるアミノ酸配列の 40番目の Al a、 42番目の Gly、 43番目の Ly s、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Al aから選ばれる少なくとも 1つのアミノ 酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、 請求項 2 4〜2 6のいずれか 1 項に記載の抗体組成物。
2 8 . 抗体分子の重鎖 （H鎖)'可変領域 （V領域） が、 配列番号 25で示されるアミノ酸配 列、または配列番号 25で示されるアミノ酸配列の 28番目の Thrおよび 97番目の Alaのうち少 なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含む、 請求項 2 4〜 2 6のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
2 9 . 抗体分子の軽鎖 （L鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号26で示されるアミノ酸配 列、 または配列番号 26で示されるアミノ酸配列の 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目 Gln、 および 8'8番目の Valから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換さ れたァミノ酸配列を含む、 請求項 2 4〜 2 6のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
3 0 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 24で示されるアミノ酸配 列、 または配列番号 24で示されるアミノ酸配列の 40番目の Ala、 42番目の Gly、 43番目の Ly s、 44番目の Gly、 76番目の Lys、 および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ 酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、抗体分子の軽鎖 （L鎖） V 領域が、配列番号 26、または配列番号 26で示されるアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列の 2 番目の Ile、' 3番目の Val、 50番目の Gln、 および 88番目の Valから選ばれる少なくとも 1つ のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含む、 請求項 2 4〜 2 7およ び 2 9のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
3 1 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、 配列番号 25で示されるアミノ酸配 列、または配列番号 25で示されるアミノ酸配列の 28番目の Thrおよび 97番目の Alaから選ば れる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 か つ、 抗体分子の軽鎖 （ L鎖） V領域が、 配列番号 26で示されるァミノ酸配列、 または配列番号 26で示されるアミノ酸配列の 2番目の Ile、 3番目の Val、 50番目の 01n、 および 88番目の Va 1から選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列 を含む、 請求項 2 4〜2 6、 2 8および 2 9のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
3 2 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域 が、 配列番号 24、 25、 27、 28、 29、 30、 31および 32で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む、 請求項 2 4〜2 8、 2 9〜 3 1のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
3 3 . 抗体分子の軽鎖 （L鎖） 可変領域 （V領域） が、配列番号26、 33s Mおよび 35で示 されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む、 請求項 2 4〜2 6、 2 9〜3 1のいず れか 1項に記載の抗体組成物。
3 4 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、配列番号 24、 25、 27、 28、 29、 30、 31および 32で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、 かつ、 抗体分子の軽 鎖 （L鎖） V領域が、配列番号 26、 33、 34および 35で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミ ノ酸配列を含む請求項 2 4 ~ 2 6、 3 2および 3 3のいずれか 1項に記載の抗体組成物。 .
3 5 . 抗体分子の重鎖 （H鎖） 可変領域 （V領域） が、配列番号 27または 28で示されるァ ミノ酸配列を含み、 かつ、 抗体分子の軽鎖 （L鎖） V領域が配列番号 35で示されるアミノ酸配 列を含む、 請求項 2 4〜2 6のいずれか 1項に記載の抗体組成物。
3 6 . ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) に特異的に結合する抗体分子をコードする DNA を宿主細胞に導入して得られる、 請求項 1 3 5のいずれか 1項に記載の抗体組成物を生産す る形質転換体。
3 7 . 宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素、 または N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサ ンの 6位にフコースの 1位が a 結合する糖鎖修飾に関与する酵素を失活するようにゲノムが改変された細胞である、 請求項 3 6に記載の形質転換体。
3. 8 . 宿主細胞が、細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素、 または N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ 結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞 である、 請求項 3 6に記載の形質転換体。
3 9 . 細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコーズの合成に関与する酵素が、 GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラ夕ーゼ（GMD)および GDP-4-ケト -6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼ（Fx) からなる群から選ばれる酵素である、 請求項 3 7または 3 8に記載の形質転換体。
4 0 . GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラターゼが、以下の（a)および (b )からなる群から選ばれ る DNAがコードする蛋白質である、 請求項 3 9に記載の形質転換体。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ GDP-マンノース 4 , 6-デヒドラ夕ーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
4 1 . GDP-マンノース 4, 6-デヒドラ夕一ゼが、 以下の （a) 〜（c ) からなる群から選ばれ る蛋白質である、 請求項 3 9に記載の形質転換体。
(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿人 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ GDP-マンノース 4, 6-デヒドラ夕ーゼ 活性を有する蛋白質；
( c ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ酸配列からな り、 かつ GDP-マンノース 4, 6-デヒドラ夕ーゼ活性を有する蛋白質。
4 2 . GDP-4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラ一ゼが、 以下の （a)および (b) からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 請求項 3 9に記載の形質転換体。
(a) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 3で表される塩基配列からなる DNAとストリ ジヱントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ GDP-4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース- 3 , 5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質を コードする DNA。 . '
4 3 . GDP-4-ケト- 6-デォキシ マンノース - 3 , 5-ェピメラーゼが、以下の （a)〜（c ) から なる群から選ばれる蛋白質である、 請求項 3 9に記載の形質転換体。
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置 、 揷入 および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ GDP - 4-ケト -6-デォキシ -D-マンノース -3 , 5-ェピメラーゼ活性を有する蛋白質；
(c ) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな り、 かつ GDP- 4-ケト- 6-デォキシ- D-マンノース- 3 , 5-ェピメラ一ゼ活性を有する蛋白質。
44. N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコース の 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素がひ 1,6—フコシルトランスフヱラーゼである請 求項 37または 38に記載の形 転換体。 .
45. «1,6—フ.コシルトランスフェラ一ゼが、 以下の （a)〜（d)からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 請求項 44に記載の形質転換体。 '
(a) 配列番号 5で表される塩基配列からなる DNA；
(b) 配列番号 6で表される塩基配列からなる DNA；
(c) 配列番号 5で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ《1，6—フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA；
(d) 配列番号 6で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダ ィズし、 かつ《1,6—フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。 '
46. ひ 1,6—フコシルトランスフェラーゼが、 以下の （a)〜（f)からなる群から選ばれる 蛋白質である、 請求項 44に記載の形質転換体。 -
(a) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(c) 配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入 および/または付加されたァミノ酸配列からなり、かつひ 1 , 6—フコシルトランスフエラーゼ活 性を有する蛋白質；
(d) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入 および/または付加されたァミノ酸配列からなり、かつ《 1 , 6—フコシルトランスフエラーゼ活 性を有する蛋白質；
(e) '配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな り、 かつひ 1,6—フコシルトランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質；
' (f) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな り、 かつひ 1,6—フコシルトランスフェラ一ゼ活性を有する蛋白質。
47. 形質転換体が FERM BP- 8467である請求項 4 6に記載の形質転換体。
48. 宿主細胞が、 下記の（a)〜（i)からなる群から選ばれる細胞である請求項 3 6〜47 のいずれか 1項に記載の形質転換体。
la チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CHO細胞；
(b ラヅトミエロ一マ細胞株 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；
(c マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
(d マウスミエローマ細胞株 SP2/0-Agl 細胞；
(e シリアンハムス夕一腎臓組織由来 BHK細胞； '
(f 抗体を産生するハイプリドーマ細胞；
(g ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h 胚性幹細胞；
(i 受精卵細胞。
4 9 . 請求項 3 6〜 4 8のいずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に 枋体組成物を生成蓄積させ、 該抗体組成物を採取し、 精製する、 請求項 1〜3 5のいずれか 1 項に記載の抗体組成物の製造方法。
5 0 . 請求項 4 9に記載の製造方法により得られる、 請求項 1〜3 5のいずれか 1項に記 載の抗体組成物。
5 1 . 請求項 1 ~ 3 5および請求項 5 0のいずれか 1項に記載の抗体組成物を有効成分と ύて含有する医薬。 :
5 2 . 請求項 1〜 3 5および 5 0のいずれか 1項に記載の抗体組成物を有効成分として含 有するヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) 関連疾患の治療薬。 '
5 3 . ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) 関連疾患が、 癌または炎症性疾患である請求項 5 2に記載の治療薬。
5 4 . 請求項 1 ~ 3 5および 5 0のいずれか 1項に記載の抗体組成物を患者に投与するこ とを特徴とする、 ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4) 関連疾患の治療方法。
5 5 . ヒト CCケモカイン受容体 4 (CCR4)関連疾患の治療薬を製造するための請求項 1〜 3 5および 5 0のいずれか 1項に記載の抗体組成物の使用。
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