KR100779761B1 - 인슐린 억제 및 사람 ｉｄｅ 유전자로 형질전환된 동물 및그 제조방법 - Google Patents

인슐린 억제 및 사람 ｉｄｅ 유전자로 형질전환된 동물 및그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인슐린억제 및 사람 IDE 유전자로 형질전환된 동물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인슐린 유전자의 발현을 억제하는 동시에 CMV 프로모터와 기능적으로 연결된 인간 IDE 유전자가 통합되어 있는 염색체를 가지도록 제작한 형질전환 동물 및 이러한 동물 모델을 제조하기 위한 발현카세트, 재조합 플라스미드, 재조합 벡터 및 그 제조방법에 관한 것이다.
인슐린, 유전자발현억제, 형질전환 동물, 사람 IDE 유전자

Description

인슐린 억제 및 사람 ＩＤＥ 유전자로 형질전환된 동물 및 그 제조방법 {Transgenic mice expressing insulin siRNA and human IDE gene and the method for producing thereof}
도 1은 pH1/siRNAinsulin 재조합 벡터에 사용될 인슐린 억제유전자 서열을 보여준다.
도 2는 H1프로모터에 연결된 인슐린 억제유전자(pH1/siRNAinsulin)를 발현하는 카세트를 보여준다.
도 3은 pH1/siRNAinsulin 재조합 벡터의 제한효소절단 전기영동과 염기서열분석 사진이다.
도 4는 pCMV/hIDE 재조합 벡터의 클로닝 과정을 보여주는 모식도이다.
도 5는 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 재조합 벡터의 클로닝 과정을 보여주는 모식도이다.
도 6은 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 재조합 벡터의 제한효소 절단과 염기서열분석 사진이다.
도 7은 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 형질전환 마우스의 유전형을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 8은 종래 NOD 마우스, 본 발명에 의한 형질전환 마우스(Tg) 및 정상 마우스(Non-Tg)의 글루코오스 수준을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 인슐린억제 및 사람 IDE 유전자로 형질전환된 동물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인슐린 유전자의 발현을 억제하는 동시에 CMV 프로모터와 기능적으로 연결된 인간 IDE 유전자가 통합되어 있는 염색체를 가지도록 제작한 형질전환 동물 및 이러한 동물 모델을 제조하기 위한 발현카세트, 재조합 플라스미드, 재조합 벡터 및 그 제조방법에 관한 것이다.
산업사회로의 급속한 발달로 인하여 노령인구의 증가는 새로운 다양한 질병의 증가를 초래하였으며, 사회적으로 막대한 자본이 이러한 질병의 치료에 투입되고 있다. 이러한 질병들은 하나의 원인에 의해 발병되는 단순 질병이 아니라 여러 가지 원인이 복합적으로 작용하는 질병으로 치료나 원인기작을 연구하기가 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 특히 기존의 세포수준에서 연구의 한계성을 극복하고 다양한 질환모델동물을 이용한 연구들이 활발히 진행되고 있다.
대부분의 경우에 당뇨병은 크게 두 가지 원인에 의해서 발병되는 것으로 알려져 있다. 하나는 췌장의 베타세포에서 인슐린의 생성·분비 능력이 감소하는 경우로 베타세포의 급속한 파괴가 이루어진다. 다른 하나는 인슐린이 표적장기에 작용하는 기작에 이상이 발생하여 신호를 세포내로 전달하지 못하는 경우이다. 이러한 질병의 발생은 유전적인 요인과 환경적인 요인 등의 다양한 원인으로 인해 치료나 발병기작 연구가 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 대부분의 제 2형 당뇨환자에서 유전적 원인과 병태생리학적 기작은 아직도 명확히 알려져 있지 않다(1).
인슐린 분해효소(Insulin degrading enzyme, IDE, insulysin, insulinase, EC3.4.24.56)는 보존된 7개 잔기(H-x-x-E-H-x(76)-E)를 포함하는 아연-금속 엔도펩티다아제(zinc-metallo endopeptidase)의 하나이다(2). 이러한 단백질은 인슐린-민감성(insulin-sensitive) 및 인슐린-비민감성(insulin-insensitive) 조직에서 발현하며, 세포내에서는 세포질이나 세포표면에 발현하는 것으로 보고되었다(3, 4). 최근에 일부 논문에서는 28-51 아미노산 길이의 폴리펩타이드가 IDE의 기질로 보고되었다. 이러한 기질로는 인슐린, 글루카곤(glucagon)(5), 나트륨 이뇨성 인자(atrial natriuretic factor)(6), TGF-α(7, 8), 나트륨 이뇨성 펩타이드(atrial natriuretic peptide)(9), β-엔도르핀 및 다이호르핀(β-endorphin and dyhorphins)(10), 아밀린(amylin)(11), 및 아밀로이드 β 펩타이드(amyloid β peptide)(12) 등이 포함되는 것으로 보고되었다. 또한, IDE는 발생과정과 전사조절과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 최근에 Duckworth 등은 IDE가 유비퀴틴-의존성 세포내 단백질 손상(ubiquitin-dependent intracellular protein degradation)에 매우 중요한 26S 프로테아좀(proteasome)과 복합체를 이루는 것을 보고하였다 (13).
이중-가닥 RNA-기초 유전자 침묵 현상(Double-strand RNA-based gene silencing) 혹은 소간섭 RNA(small interfering RNA)는 다양한 종에서 유전자 특이적 전사후 유전자 침묵 현상(post-transcriptional gene silencing)을 위한 기작으로 보고되었다 (14, 15). 이러한 시스템은 긴(long) dsRNA를 짧은(short) siRNA로 분해하는 꼬마선충(C. elegans)에서 가장 잘 알려져 있다. 최근까지 이러한 기술은 포유동물에서 적용되지 않았지만, Elbashir 그룹은 포유동물 세포로 21-23 nt의 RNA를 도입하여 유전자발현을 억제하는 것으로 보고하였다 (16). 그러나 이러한 방법의 한계점을 극복하기 위하여 벡터-기초 기술(vector-based technique)을 도입하여 siRNA를 합성하고자 하였다. 더불어 특정유전자의 발현을 억제하는 동시에 다른 유전자의 발현을 촉진하는 새로운 벡터를 이용하여 마우스 조직에서 유전자를 발현하는 시스템이 보고되었다 (17). 그러나 아직까지 당뇨모델동물을 개발하기 위하여 이러한 방법은 적용되지 않았다.
지금까지 주로 사용된 당뇨모델동물은 자연적으로 발견된 동물의 계통을 확립한 NOD (non-obese diabetic) 마우스가 있다. 이들 마우스는 약 10주령 이상에서 암컷의 60% 이상이 수컷의 30% 정도에서 250 이상의 혈당치를 나타내어 Type II 당뇨모델로서 사용되고 있다. 그러나 이렇게 당뇨가 발생된 동물은 4-5개월 이상 생존이 불가능하여 인간의 당뇨에 직접 적용하기가 어려운 단점이 있다. 그 이외의 일부 형질전환 동물은 인슐린 프로모터를 사용하여 다른 유전자를 췌장에서 발현시 킴으로서 인슐린의 기능을 방해하는 모델이거나 면역질환을 위한 모델을 개발한 것 중 당뇨의 특성을 나타내는 동물이 보고되고 있다. 그리고 대부분의 동물은 마우스보다 큰 랫트에서 많이 개발되어 이용되고 있는 상황이다.
이에 본 발명자은 궁극적으로 인슐린 유전자의 발현을 억제하면서 동시에 인슐린분해효소를 발현하는 발현카세트를 염색체내에 포함하는 형질전환동물을 제공하여 당뇨관련질병의 원인기전 연구와 치료제 개발에 기여할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인슐린억제 및 사람 IDE 유전자로 형질전환시켜 제작함으로써 새로운 당뇨질병관련 동물모델로 사용될 수 있는 형질전환 동물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 인슐린 유전자의 발현을 억제하는 염기서열을 발현하는 발현카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인슐린분해효소를 발현하는 발현카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인슐린 유전자의 발현을 억제하면서 동시에 인슐린분해효소를 발현하는 발현카세트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1 내지 5로 표시되는 5개의 siRNA 억제 염기서열 중 어느 하나를 H1 네오 벡터의 BamHI과 HindIII 자리에 결합하여 HI 프로모터에 연결시켜 제작한 것으로서, 인슐린 유전자의 발현을 억제하는 염기서열을 발현하도록 제작한 도 2에 도시된 pH1/siRNAinsulin 발현카세트를 제공한다.
또한 본 발명에서는 서열번호 8의 인간 IDE cDNA를 pGEM T 이지 벡터(pGEM T easy vector)에 클로닝한 후 pEGFP C-1 벡터(BD bioscience, #6084-1)의 AgeI과 XbaI 부위에 결합하여 CMV 프로모터에 연결시켜 제작한 것으로서, 인슐린분해효소를 발현하도록 제작한 pCMV/hIDE 발현카세트를 제공한다.
또 본 발명에서는 하기 단계를 포함하고, 인슐린 유전자의 발현을 억제하면서 동시에 인슐린분해효소를 발현하도록 제작한 랫트 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 발현카세트를 제공한다:
1) pH1/siRNAinsulin 염기서열을 pGEM T 이지 벡터에 클로닝하는 단계;
2) 상기 pH1/siRNAinsulin-T 벡터를 AseI 제한효소를 이용하여 pEGFP C-1 벡터에 결합하여 pH1/siRNAinsulin-pEGFP C-1 벡터를 제작하는 단계; 및
3) 상기 pH1/siRNAinsulin-pEGFP C-1 벡터로부터 AgeI과 XbaI 부위를 절단하여 GF 단백질을 절단한 다음 서열번호 8의 hIDE cDNA 결합하여 pH1/siRNAinsulin- pCMV/hIDE 발현카세트를 제작하는 단계.
부가적으로, 상기 랫트 pH1/siRNAinsulin -pCMV/hIDE 발현카세트를 이용하여 랫트 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 융합 유전자를 크로모좀 내로 삽입하여 형질전환시킨 기탁번호 KCTC10839BP의 마우스 수정란 및 이 마우스 수정란을 이식한 마우스와 정상 마우스를 교배하여 생산한 형질전환 마우스도 본 발명의 범주에 속한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
인슐린은 췌장의 베타세포에서 합성 분비되어 혈액내 포도당의 농도를 조절하는 중요한 단백질이다. 본 발명에서 사용된 랫트의 인슐린 유전자의 염기서열은 GENBANK(번호: NM_019129)(서열번호 11)와 같은 기관으로부터 서열에 관한 정보를 쉽게 입수할 수 있다. 인슐린 분해효소는 간, 뇌 등을 비롯한 여러 가지 조직에서 단백질을 합성하고 체내에 과량으로 생성된 인슐린을 청소하는 기능을 수행하며, 본 발명에서 사용된 인슐린 분해효소 유전자의 염기서열은 인간의 유전자로부터 유래되었으며 GENBANK(번호: NM_004969)(서열번호 8)와 같은 기관으로부터 서열에 관한 정보를 쉽게 입수할 수 있다. 본 발명에서는 이들 두 가지 카세트를 동시에 결합하여 인슐린의 합성을 억제하면서 동시에 발현된 인슐린을 제거하는 기능을 동시에 수행하는 카세트를 제작하였다(도 5 참조).
본 발명에 의한 형질전환 동물은 염색체 안에 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 유전자가 통합되어 있는 것으로서, 상기 유전자는 H1 프로모터에 인슐린억제 유전자가 기능적으로 연결되고 CMV 프로모터에 인슐린분해효소가 기능적으로 연결된 두 가지 카세트가 동시에 연결되어 있으며, 또한 이들은 β-카제인 프로모터에 기능적으로 연결되어 있어(operably linked) 상기 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 유전자 발현에 의해 당뇨관련질환이 발생하도록 제작한 것이다.
본 발명에서 제작한 동물은 기존의 방식과는 다른 새로운 접근법을 이용하여 마우스 내에 다른 인자의 변화를 최소화한 상태에서 지속적으로 인슐린의 양을 저하시킴으로서 인간의 만성당뇨질병과 유사한 특성을 나타내도록 유도하였다. 급성적으로 당뇨가 발생한 후 바로 사망하는 동물 모델이 아니라 지속적으로 고혈당을 나타내는 동물로서 당뇨의 치료와 발병기전 연구에 활용성이 매우 크다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] 인슐린 억제 염기서열의 확보 및 pH1 / siRNA insulin 발현카세트의 제작
랫트의 인슐린 발현을 억제하기 위한 siRNA 염기서열은 siRNA 표적 검출 프로그램(siRNA Target Finder program; Ambion, USA)을 이용하여 분석하였으며, 도 1에 도시된 서열번호 1 내지 5로 표시되는 5개의 siRNA 억제 염기서열을 확인하여 GibcoBRL로부터 제작하여 사용하였다. 제작된 각 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)는 1 ug/ul로 뉴클레아제가 없는 물(nuclease-free water)에 녹여서 준비하였고, 각각의 센스 단일 뉴클레오타이드(sense single nucleotide)와 안티센스 단일 뉴클레오타이드(anti-sense single nucleotide)를 1x 어닐링 완충액(annealing buffer)에 혼합하여 90℃에서 3분 동안 변성(denaturation)하였고, 37℃까지 서서히 식힌 후 37℃에서 1시간동안 어닐링을 실시하였다. 어닐링된 이중 가닥 뉴클레오타이드는 12% 아크릴아미드 겔(acrylamide gel)에서 80 volt로 2시간동안 러닝(running)한 후 EtBr로 염색하여 관찰하였다. 확인된 5종류의 이중염기서열은 pSilencer 3.1-H1 네오 벡터(neo vector)(Ambion #5770)의 H1 프로모터에 연결하기 위하여 BamHI과 HindIII 자리로 결합하였으며(도 2), 제한효소 절단과 염기서열분석방법(ABI Prism BigDye Terminator Kit)을 이용하여 확인하였다. 결합된 재조합 카세트는 BamHI과 HindIII로 절단하여 68-bp 단편이 생성됨을 확인하였고, 확인된 pH1/siRNAinsulin 벡터는 염기서열을 분석하여 5종류의 인슐린 억제 서열이 정상적으로 합성된 후 결합되었음을 확인하였다(도 3).
[ 실시예 2] 인간의 인슐린분해효소 유전자 확보 및 pCMV / hIDE 발현카세트의 제조
사람의 인슐린분해효소 cDNA는 사람의 간세포주인 HepG2 세포주로부터 RNAzol (Tel-Test Inc., CS104)의 전체 RNA를 이용하여 합성하였다. RNA 분리를 위 해 각각의 조직을 마우스로부터 100 mg씩 분리하여 RNAsol (Teltest)을 첨가한 후 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 조직을 분쇄하였다. 분쇄된 조직은 제조사의 권장방법에 따라 분리하여 260 nm 흡광도에서 양을 측정하고 5 ug을 역전사(RT)에 사용하였다. 역전사 반응은 먼저 5 ug의 RNA에 0.5 ug의 올리고 dT를 처리하고 70℃에서 10분 동안 반응하여 올리고 dT를 RNA에 결합시켰다. 여기에 5x 완충용액, 10 mM dNTP, 0.1 M DTT, 슈퍼스크립트 Ⅰ(Superscript I, 200 U/ul)를 첨가하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 42℃에서 50분 동안 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 반응이 끝나면 90℃에서 5분 동안 처리하여 RNA와 cDNA를 분리하고 RNaseH를 3.2 U/ul 처리하여 37℃에서 20분 동안 반응하여 RNA를 분해하였다. 이들 cDNA로부터 hIDE 특이-프라이머(specific-primer)를 이용하여 94℃에서 45초간 변성, 62℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 확장하는 30회 사이클로 PCR을 실시하여 증폭하였다(도 6A)(센스; 5'-CGA CCG GTG ACT GCG CTG GCT AAT GCG GTA-3'(서열번호 6), 안티센스; 5'-GCT CTA GAC TTC AGA GTT TTG CAG CCA TGA AG-3'(서열번호 7)). 증폭된 사람의 IDE cDNA는 RT-PCR을 이용하여 합성한 후 전기영동하여 서열번호 8의 3092bp가 생성됨을 확인하였으며(도 6A), pGEM T 이지 벡터(pGEM T easy vector)에 클로닝한 후 pEGFP C-1 벡터(BD bioscience, #6084-1)의 AgeI과 XbaI 부위에 결합하여 CMV 프로모터에 연결하였다(도 4).
[ 실시예 3] pH1 / siRNA insulin - pCMV / hIDE 발현카세트의 제작 및 확인
랫트 pH1/siRNAinsulin -pCMV/hIDE 발현카세트를 제조하기 위하여 pH1/siRNAinsulin 벡터로부터 H1 프로모터-siRNAinsulin 염기서열을 특이적 프라이머 (센스; 5'-CGA TTA ATG GTT TTC CCA GTC ACG AC-3'(서열번호 9), 안티센스; 5-'CGA TTA ATG AGT TAG CTC ACT CAT TAG GC-3'(서열번호 10))를 이용하여 합성한 후 pGEM T 이지 벡터에 클로닝하였다. 5종류의 pH1/siRNAinsulin-T 벡터를 AseI 제한효소를 이용하여 pGEM T 이지 벡터로부터 분리하여 pEGFP C-1 벡터의 AseI 부위로 결합하였다. pH1/siRNAinsulin-pEGFP C-1 벡터로부터 AgeI과 XbaI 부위를 절단하여 GF 단백질을 절단하고 hIDE cDNA결합하여 pH1/siRNAinsulin- pCMV/hIDE 발현카세트를 완성하였다(도 5). 완성된 유전자 염기서열은 제한효소로 절단하여 유전자의 삽입을 확인하였고, 빅다이 종결자 사이클 서열화 준비 반응 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits; PE Biosystems)를 사용하여 염기서열을 확인하였다(도 6B, C).
[실시예 4] 형질전환 마우스 제작
유전자의 순수분리 및 마우스 수정란에 미세주입
재조합 유전자는 박테리아에서 기원된 유전자 부위를 절단하여 제거하고, 진핵세포 발현 부위만을 수확하여 물에 녹여 사용하였다. 순수분리된 재조합 유전자는 4 ng/㎕의 농도로 희석하여 마우스(BDF1)의 수정란에 미세주입하였다. 유전자가 주입된 수정란은 가임신한 ICR 마우스에 전달하여 새끼를 생산하였다.
형질전환 마우스의 확인
생산된 새끼는 꼬리를 절단하여 게놈 DNA를 분리한 후 IDE 특이적 프라이머를 이용한 PCR에 의한 해석을 통해 유전자의 삽입을 확인하였다(도 7). 확인된 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 형질전환 마우스는 정상 마우스와의 교배를 통해 이들 유전자가 후대로 전달됨을 확인하였다.
도 7에서, 세 개 계통의 형질전환 마우스(TG4023, TG4025 및 TG4027)의 형질전환된 염색체를 내에 유전자의 삽입을 확인하였으며, 378 bp 산물을 생산하였다.
본 발명자들은 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 융합 유전자를 진핵세포 발현부위로 삽입시켜 형질전환시킨 마우스의 수정란, 즉 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 유전자가 크로모좀 내로 삽입되어 형질전환된 당뇨질환 마우스의 수정란을 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2005년 8월 31일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC10839BP 를 부여받았다.
형질전환 마우스의 특성분석
생산된 형질전환 마우스에서 인슐린 및 글루코오스 대사를 관찰하기 위하여 글루코오스 내성 시험(glucose tolerance test)을 실시하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8을 살펴보면, 상기 실시예 4에서 제작한 형질전환 마우스(Tg)는 글루코오스 투여 후 15분 만에 460 mg/dl까지 상승하였으나, 정상마우스(Non-Tg)는 302 mg/dl 까지만 상승하는 것으로 관찰되었다. 이후 Tg 마우스는 485 mg/dl (30 min), 432 mg/dl (60 min), 256 mg/dl (120 min)으로 매우 높은 글루코오스 농도를 유지하면서 서서히 감소되었으나, Non-Tg 마우스는 335 mg/dl (30 min), 242 mg/dl (60 min) 및 138 mg/dl (120 min)으로 낮은 글루코오스 농도로 상승한 후 바로 정상 수준으로 감소하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 TG9381 라인(line)의 마우스의 인슐린 및 글루코오스 대사에 문제점이 있음을 암시한다.
또한 형질전환동물에서 재조합 유전자에 의한 인슐린 억제 효과가 나타나는 지 관찰하기 위하여 혈청내 인슐린 양을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9를 살펴보면, TG9381 라인 마우스의 인슐린은 약 25 pmol/l로 Non-Tg (97 pmol/l)에 비하여 2-3배 이상 감소하는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 본 발명에 의한 형질전환 마우스에서 siRNA에 의한 인슐린 합성 억제와 hIDE 단백질의 과발현에 의한 인슐린 제거를 통하여 효과적으로 인슐린의 양을 감소시킨 것임을 알 수 있다.
[시험예 1]
전통적으로 사용되어 오던 종래의 NOD 마우스, 실시예 4에서 제작한 형질전환 마우스(Tg) 및 정상마우스(Non-Tg)에서 혈당의 수치를 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 상기 도 10의 결과를 살펴보면, 종래의 NOD 마우스는 250 이상의 고혈당을 나타내어 급성 고혈당으로 진행되지만 본 모델동물은 160-180 정도 의 고혈당치를 지속적으로 나타내는 것을 실험을 통하여 확인할 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 인슐린 억제서열 발현카세트와 인슐린분해효소 발현 카세트를 동시에 동물의 각 조직에서 발현시킴으로서 당뇨관련 질병을 유발하는 형질전환 모델 동물을 개발하였으며, 본 발명에서 개발한 인슐린 억제염기서열을 발현하는 카세트는 세포와 동물에서 인슐린 기능 연구와 이들 억제에 따른 세포내 신호전달 매커니즘 연구 등에 활용가능성이 매우 크다.
또한 사람의 인슐린분해효소를 발현하는 카세트는 세포와 동물에서 실제 인간에서 나타나는 생리적 변화와 유사한 결과가 관찰되는 모델을 확립하고 연구하는 과정에 활용될 수 있다.
두 가지 카세트를 모두 발현하는 카세트는 인슐린에 의한 대사효과를 동물에서 직접적으로 검증하고 새로운 모델동물을 생산하는 이러한 모델 동물은 현대인에게 만성적으로 다양하게 발병하고 있는 당뇨질병의 발생과정과 치료제의 평가 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
<참고문헌>
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Claims (5)

  1. 서열번호 1 내지 5로 표시되는 5개의 간섭 RNA(siRNA) 단편 억제 염기서열 중 어느 하나를 pSilencer 3.1-H1 네오 벡터의 BamHI과 HindⅢ 자리에 결합하여 HI 프로모터에 연결시켜 제작한 것으로서, 인슐린 유전자의 발현을 억제하는 염기서열을 발현하도록 제작한 도 2에 도시된 pH1/siRNAinsulin 발현 벡터.
  2. 삭제
  3. 1) H1 프로모터에 서열번호 1 내지 5에서 선택된 하나의 간섭 RNA(siRNA) 단편 억제 염기서열이 연결되어 있는 pH1/siRNAinsulin 염기서열을 pGEM T 이지 벡터에 클로닝하는 단계;
    2) 상기 pH1/siRNAinsulin-T 벡터를 AseI 제한효소를 이용하여 pEGFP C-1 벡터에 결합하여 pH1/siRNAinsulin-pEGFP C-1 벡터를 제작하는 단계; 및
    3) 상기 pH1/siRNAinsulin-pEGFP C-1 벡터로부터 AgeI과 XbaI 부위를 절단하여 GF 단백질을 절단한 다음 서열번호 8의 인간인슐린분해효소(hIDE) cDNA 결합하여 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 발현카세트를 제작하는 단계;
    를 거쳐 제작된 것으로서, 인슐린 유전자의 발현을 억제하면서 동시에 인슐린분해효소를 발현하도록 제작되고 도 5에 도시된 구조를 가지는 랫트 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 발현카세트.
  4. 제 3항에 의한 랫트 pH1/siRNAinsulin -pCMV/hIDE 발현카세트를 이용하여 랫트 pH1/siRNAinsulin-pCMV/hIDE 융합 유전자를 크로모좀 내로 삽입하여 형질전환시킨 기탁번호 KCTC10839BP의 마우스 수정란.
  5. 제 4항에 의한 마우스 수정란을 이식한 마우스와 정상 마우스를 교배하여 생산한 형질전환 마우스.
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