CN1262663C - 用于动物细胞的表达载体 - Google Patents

用于动物细胞的表达载体 Download PDF

Info

Publication number
CN1262663C
CN1262663C CNB018135579A CN01813557A CN1262663C CN 1262663 C CN1262663 C CN 1262663C CN B018135579 A CNB018135579 A CN B018135579A CN 01813557 A CN01813557 A CN 01813557A CN 1262663 C CN1262663 C CN 1262663C
Authority
CN
China
Prior art keywords
carrier
expression
gal
gene
expression vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB018135579A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1444657A (zh
Inventor
金锺默
金正燮
吴先模
尹在承
白光熙
郑守一
朴斗鸿
尹烨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Expect Exhibition Bioisystech Co Ltd
Mogam Biotechnology Research Institute
Original Assignee
PAN-GEN BIOTECH LABORATORIES Inc
Mogam Biotechnology Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PAN-GEN BIOTECH LABORATORIES Inc, Mogam Biotechnology Research Institute filed Critical PAN-GEN BIOTECH LABORATORIES Inc
Publication of CN1444657A publication Critical patent/CN1444657A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1262663C publication Critical patent/CN1262663C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4717—Plasma globulins, lactoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/595—Gastrins; Cholecystokinins [CCK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于动物细胞的表达载体。特别是，本发明涉及的一种表达载体，pMS载体，pSG载体和pMSG载体，包括人β-珠蛋白5’MAR的互补序列和/或胃泌素基因的转录终止位点。采用本发明的表达载体的表达体系可以成功地在各种动物细胞中生产重组蛋白，并且重组蛋白具有单一的结构和功能。

Description

用于动物细胞的表达载体
技术领域
本发明涉及一种用于动物细胞的表达载体，特别是，含有核基质着丝溢痕成分(在其后称作“MAR成分”)和胃泌素基因的转录终止位点的表达载体。
背景技术
各种各样的表达体系，如微生物，植物，酵母，昆虫细胞和动物细胞通过可获得的所期望的大分子蛋白表达而被普遍的用于药物治疗。在多种多样的表达体系中，微生物最易于用作表达体系，各种各样的微生物体系已被作为表达体系而研究和利用。
然而，微生物表达体系的应用在某些方面是有限的。首先，尽管基因在微生物中被表达，但被表达的蛋白的结构和特性与其动物蛋白的并不同，因为微生物具有不同的表达蛋白的机制和蛋白的修饰机制，如糖基化，磷酸化和胺基化。因此，由微生物产生的重组蛋白几乎没有被修饰，或者它在蛋白质的修饰和结构的差别不足以影响蛋白产物的功能的蛋白质的产生中受限制。另外，使用微生物表达的重组蛋白时，被污染的微生物或毒素的清洗步骤是必要的。
虽然动物细胞适用于动物蛋白的表达，但一般不使用采用动物细胞的表达体系，因为与微生物和动物细胞的表达体系相比，归因于重组蛋白的更低表达效率，采用动物细胞的表达体系会造成更高的生产成本。
用于工业生产的动物细胞，它目前被用于包括CHO(中国鼠的卵巢)、BHK(幼鼠的肾)和骨髓瘤的表达体系，表达载体被导入到这种动物细胞并像在微生物中一样产生希望的外源蛋白。
由于通常表达少量的外源蛋白，因此，通过各种方法修饰基因表达体系。例如，CHO的细胞毒株在含有氨甲蝶呤(其后称作“MTX”)的培养基中培养，氨甲蝶呤是DHFR(二氢叶酸还原酶)的抑制剂，以便获得存活依赖于MTX浓度的CHO的毒株，并且归因于基因复制数的增加更高地表达蛋白。
通常，当外源基因在一种动物细胞中被表达时，外源基因被具有选择性标记物的载体共转染，在选择性培养基培养数小时后选择转化的细胞。然而，能够完成的高表达细胞的克隆的频率是低的。外源基因表达的低频率是由于在动物体系中外源基因的染色体的插入不像微生物那样。另外，尽管外源基因的插入过程是成功的，但不能期待外源基因的表达，原因是每个基因的插入位点不同而且基因表达要依靠插入位点。(Grindley等，1987.Trends Genet.3，16-22；Kucherlapati等，1984.Crit.Rev.Biochem.16，349-381；Palmiter等，1986.Annu.Rev.Genet.20，465499)。所以，尽管外源基因是稳定地完整的，其表达量也可能很低，因为在动物细胞中大部分的基因表达被邻近的核苷酸抑制(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Palmiter等，1986.AnnuRev.Genet.20，465-499)。
为了保护外源基因的表达不受位置效应，在几个体系中应用核基质成分的可能性已有报道。可效仿的核成分包括绝缘体成分，核基质着丝溢痕(其后称作“MAR”)，支架结构着丝溢痕(其后称作“SAR”)。
Kalos(Kalos等，1995 Mol.Cell.Biol.15，198-207)提出当阿朴脂蛋白BMAR组合最小的启动子反基因构建子时，外源基因被稳定的导入到宿主的染色体，这样转录物的表达量增加了200倍。和上述方法类似，已经报道小鸡溶解酶A MAR和β-干扰素SAR能够增加外源基因在脊椎动物细胞中的表达水平，而不用考虑染色体的插入位点(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Klehr等，1991.Biochemistry 30，1264-1270)。然而，并没有核实M AR和SAR能够增加在CHO细胞毒株中蛋白的产生，或者MAR和SAR适用于常规用途。
当动物细胞基因被表达，mRNA的合成从启动子出现并在终止位点停止。蛋白的表达水平通常受转录终止的效率以及合成mRNA的稳定性的影响。
包含在表达载体中的转录的终止位点控制聚腺苷酸化，并影响mRNA的稳定性。终止位点包括聚-A信号，分裂位点，终止位点，并且聚腺苷酸化信号是AATAAA，它已经被很好地研究。然而，发生聚腺苷酸化的分裂位点和基因转录通过RNA聚合酶II完成的终止位点是未知的。另外，尽管报道了除了三种临界区域外富含GU/U的区域控制mRNA的聚腺苷酸化，但其详细机理是未知的。
通常用于动物细胞的表达载体包含SV40病毒和BGH(牛生长素)的聚一A信号，并且没有提出为了使用动物细胞表达载体而研发这种提高mRNA稳定性和表达水平的特别终止子。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种表达载体，它在用于动物细胞体系的外源蛋白的表达中具有增加的外源基因表达效率和水平。
为了达到这些目的，本发明提供一种表达载体，包括SV40病毒启动子或CMV病毒启动子；和位于所述启动子5’-末端上的β-珠蛋白MAR(核基质着丝溢痕)成分或其互补序列。
同样，本发明提供了一种包括SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因转录终止位点组成的构建子的动物细胞的表达载体，其中的构建子具有序列SEQ ID No.3。
同样，本发明提供了一种序列SEQ ID No.8的pMSG KCCM 10202载体，包括人β-珠蛋白5’MAR(核基质着丝溢痕)的互补序列，和由SV40病毒的聚-A信号和胃泌素基因的转录终止位点组成的构建子。
同样，本发明提供了一种通过使用动物细胞的表达载体制备生物活性物质的方法，载体包括在启动子5’-末端的β-珠蛋白MAR成分，或者β-珠蛋白互补序列，包括如序列SEQ ID No.3所示的SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因的转录终止位点的载体，和pMSG载体。
附图说明
图1显示表达载体的结构，载体通过组合SV40启动子和基因表达报道用的β-gal基因制备；
图2显示本发明使用的种种MAR和SAR成分诱导的β-Gal的表达频率；
图3显示表达的β-Gal的活性，它表明本发明的MAR和SAR成分对β-Gal表达的影响；
图4显示基于本发明β-珠蛋白MAR DNA序列的MAR成分的各种突变株构建子形式；
图5显示含MAR成分的载体转染到CHO细胞后，β-Gal蛋白的表达频率和表达数量；
图6显示在以pMS-β-gal或作为对照的pSV-β-gal转化的动物细胞中用于确认β-Gal基因复制数(a：对照组，b：本发明)，RNA数(c：对照组，d：本发明)，以及作为选择性标记的新基因的复制数(e：对照组，f：本发明)的DNA和RNA印迹。
图7显示在以pMS-β-gal或作为对照的pSV-β-gal转化的动物细胞中，表示β-Gal基因的复制数和β-Gal表达产量之间关系的曲线；
图8显示在各种细胞系中pMS-β-gal载体的表达效价；
图9显示在以pMS-β-gal载体或对照载体转化的细胞中依靠MTX浓度的外源蛋白的表达量；
图10显示与对照组相比，scu-PA(单链尿激酶)被插入到pMS载体和pMC载体之后，scu-PA的表达效价；
图11显示包括胃泌素基因的转录终止位点和SV40的聚-A信号的构建子；
图12显示在包括含胃泌素基因转录终止位点和SV40聚-A信号的构建子的表达载体中β-Gal的表达量；
图13显示本发明的pMSG的结构；
图14显示通过抗原-抗体反应证实的pMSG载体中TGF-βSRII的表达；
图15显示TGF-βSRII表达量，它通过将TGF-βSRII基因克隆到βMSG载体，在CHO细胞中转染它们，在加入MTX的条件下培养而制备。
具体实施方式
下文将详细地说明本发明。
发明人克服了当外源基因在动物细胞系中表达时特异位点效应引起的问题，并设计增加了基因的表达量的最佳表达载体。
本发明的动物细胞表达载体包括合适的碱基序列，并进一步加入了常规的表达载体。合适的碱基序列包括核基质着丝溢痕(下文称作“MAR”)和支架结构着丝溢痕(下文称作“SAR”)，它们从插入位点的位置效应刺激如CHO(中国鼠卵巢)和BHK(幼鼠肾)的宿主外源基因的表达，增加了外源基因的表达量。
MAR或SAR成分加入到启动子5’-末端，分析本发明的表达载体的效率。从细胞分离染色体DNA，接着通过PCR(聚合酶链式反应)和亚克隆在大肠杆菌E.coli中克隆染色体DNA，这样以致于获得含MAR和SAR成分的DNA。
更优选的，MAR或SAR成分从由小鸡溶解酶5’MAR(Phi-Van，L.andStratling，W.H.，Biochemistry 35，10735-10742(1996)，gene bank #：X98408)，小鸡pia珠蛋白5’MAR(Krevskii，V.A.，Mikhailov，V.S.andRazin，S.V.，Mol.Biol.26，672-678(1992)，gene bank #：X64113)，人β-珠蛋白5’MAR(Yu，J.，Bock，J.H.，Slightom，J.L.and Villeponteau，B.，Gene139(2)，139-145(1994)，gene bank #：L22754)，CHO DHFR内含子MAR((Kas，E.and Chasin，L.A.，J.Mol.Biol.198(4)，677-692(1987)，gene bank#：X06654)，人HPRT内含子MAR(Sykes，R.C.，Lin，D.，Hwang，S.J.，Framson，P.E.and Chinaμlt，A.C.，Mol.Gen.Genet.212.301-309(1988)，genebank #：X07690)，人CSP-B基因旁侧的SAR(Handson，R.D.and Ley，T.J.，gene bank #：M62716)，和人干扰素β-基因旁侧的SAR(Mielke，C.，Kohwi，Y.，Kohwi Shigematsu，T.and Gode，J.，Biochemistry 29，7475-7485(1990)，genen bank #：M83137)组成的组中选择。
在动物细胞表达载体中整合MAR和SAR，为了确定MAR/SAR和表达效价之间的关系，诱导载体的β-Gal表达。
pSV-β-gal启动子的5’-末端通过体外PCR诱变与多克隆位点(下文称作“MCS”)结合，这样获得了重组载体(I和II型载体)，如图1所示。插入MAR或SAR至重组载体pSV-β-gal I或II型的SV40启动子的5’-末端的前面，准备好试验载体，试验载体被转化到CHO DG44中。在包含G418(新霉素)的培养基上选择转化的CHO DG44，通过着色β-Gal(用IPTG和X-Gal的蓝着色)计算表达效价。为测量表达效价，计算表达频率、表达细胞数量、和β-Gal表达的数量。
图2显示本发明使用的种种MAR和SAR成分诱导的β-Gal的表达频率。pSV-β-gal载体的β-Gal表达频率为大约20到30％，而包括β-珠蛋白MAR，和CSP-B SAR或干扰素βSAR的试验载体增加了在阳性细胞系中的表达频率，更优选，包括β-珠蛋白MAR的试验载体的β-Gal表达频率为大约70到80％。
另外，依照各种MAR成分和SV40启动子组合制备构建子，并且SV40病毒启动子与重组蛋白表达的影响进行比较。为了比较β-Gal产物的产量，实施β-Gal着色法和β-Gal酶计算法，并且在相同数目的阳性细胞系中分析β-Gal活性，原因是表达频率依每个MAR成份而不同；
图3显示使用β-珠蛋白MAR，CSP-B SAR和干扰素β-SAR成分时，与pSV-β-gal的相比，根据各种MAR和SAR成分、每阳性细胞的β-Gal的量或者β-Gal增加的活性，表达的的β-Gal的活性。据观察含β-珠蛋白MAR成分的载体表达量增加了7倍或更多。
从而，在MAR成分中，β-珠蛋白MAR成分在本发明中是更优选的。
为了研究β-珠蛋白MAR成分的影响和效率，分析MAR成分的βNA序列。
β-珠蛋白成分包括2,999个碱基，它们的功能未被详细了解。β-珠蛋白MAR成分包括共有序列和位于800bp区域的3’端的alu成分244个碱基对，并且这里存在富含A+T(腺嘌呤，胸腺嘧啶)的序列。据报道alu位点包括两条直接重复单体单元的300个碱基对，其重组经常发生在这个位点，原因是在真核细胞的染色体中存在成千上万的同源位点。(Jagadeeswaran等，1982.Nature 296，469-470；Rogers.1985.Int.Rev.Cytol.93，187-279)。当β-珠蛋白MAR的alu位于SV40启动子的上游时，细胞进行较长时间的培养，重组可以发生。
因此，发明人设计了没有上述不好的效应的β-珠蛋白MAR突变株。
图4显示了β-珠蛋白MAR突变株，它通过制备MAR的互补序列b，缺失突变体c，d，e，f，g和i，以及将它们整合到pSV-β-GalI型中而生产。
包括β-珠蛋白MAR的突变株的载体被导入到CHO细胞之后，计算β-Gal表达的细胞数和β-Gal的数量，结果如图5所示。大多数的β-珠蛋白MAR突变株的β-Gal表达效价降低；相反，以包括β-珠蛋白MAR互补序列的pMS-β-gal载体转化的细胞系的效价高。图6和7显示重组蛋白表达量和整合基因的复制数之间的关系，pSV-β-Gal的表达量独立于整合基因的复制数，含pMS-β-Gal的转化载体的表达量和整合基因的复制数是成比例的。由于β-珠蛋白MAR的互补序列允许alu存在于启动子的另一侧，载体重组的可能性减少，通过防止插入位点的特异性作用使得表达量增加。因此，3-珠蛋白MAR互补序列在本发明是优选的。
经核实MAR或SAR成分位于载体的启动子的常规表达的5’端，并且MAR或SAR突变株，或互补序列被整合到常规的表达载体中，这样外源蛋白的表达效价增加。因此，本发明提供一种包括MAR或SAR成分的表达载体，和包括MAR或SAR突变株的表达载体，或者它们的互补序列。MAR或SAR是从由pi-a MAR(小鸡piα-珠蛋白5’MAR)，β-珠蛋白MAR(人β-珠蛋白5’MAR)，DHFR MAR(CHO DHFR内含子MAR)，HPRT MAR(人HPRT内含子MAR)，CSP-B SAR(人CSP-B基因旁侧的SAR成分)，干扰素-βSAR成分(人干扰素-β基因旁侧的SAR成分)，和溶MAR(小鸡溶菌酶5’MAR)组成的组中优选。
在它们中间，本发明的载体pMS(KCCM 10203)由包含在SV40病毒启动子的5’末端的人β-珠蛋白MAR互补序列和多克隆位点的6287个碱基对组成，并且能够通过基因整合到多克隆位点表达重组蛋白。pMS碱基序列被编译为序列表软件中的序列SEQ ID No.1。
使用β-珠蛋白MAR互补序列时，与仅使用SV40启动子时外源基因的表达频率和表达量相比，外源基因的表达频率和表达量分别增加3到4倍，和7到10倍。此外，pMS-β-gal载体适于图8显示的各种各样的动物细胞，并且pMS-β-gal载体系统优选适用于BHK，CHO，NIH3T3，和HEK 293。图9表示当外源基因在pMS-β-gal载体系统表达时借助于加入MTX(新霉素)的表达效价增量。
为依照MAR或SAR来计算外源蛋白的表达效价，使用CMV启动子(巨细胞病毒)。由于依靠于启动子的种类和细胞株的不同，外源基因的表达效价也不同，因此CMV启动子也在被测试。为了验证β-珠蛋白MAR互补序列对CMV启动子功能的影响，通过与制备pMS相类似的方法制备pMC载体，并将scu-PA基因整合到pMS，pMC，和对照载体中。
图10显示的为scu-PA在由pMSPUK，pMCPUK，pSPUK，和pMCPUK载体转化的CHO中的表达效价，它通过将scu-PA整合到pMS，pMC，pSV，和pCMV中来制备，pMS和pMC的基因表达比pSV和pCMV的增加了4倍。
因此，本发明所述的β-珠蛋白MAR互补序列可以通过与所期望的启动子适当的结合用于动物细胞的蛋白表达。
由于本发明包括β-珠蛋白MAR互补序列的载体和外源基因被整合成为宿主细胞，以常规的方法可从动物细胞中获得有用的蛋白。
在本发明中，制备人胃泌素基因的转录聚-A信号、分裂位点和人胃泌素终止位点，它们被应用于本发明的表达载体中以便增加mRNA的稳定性，从而增加了表达载体的效率。
人胃泌素基因，3’端的转录调节区域包括包含信号聚-A、分裂位点、终止位点和人胃泌素基因的碱基序列的605个碱基对，3’端的转录调节区域如序列SEQ ID No.2所示。分裂位点位于从信号聚-A开始下游的第15个碱基对，终止位点位于从信号聚-A开始下游的第220个碱基对。胃泌素在终止位点完成转录，在分裂位点发生分裂和mRNA的聚腺苷酸化。
本发明人期望由SV40聚-A和胃泌素基因的转录终止位点组成的构建子如图11所示，它能够增加基因的表达效价。
图11显示由胃泌素基因的转录终止位点和SV40聚-A组成的构建子，这类构建子优选从pSV-SPA(SPA；SV40聚腺苷酸化的信号)为″a″，pSV-SPA-GTF(GTF；胃泌素基因的转录终止位点)为″b″，pSV-SPA-GTR(GTR；GTF的互补序列)为″c″，pSV-GPA(GPA；胃泌素的聚腺苷酸化的信号)为″d″，pSV-GPA-GTF为″e″，pSV-GPA-GTR为″f″，pSV-GMPA(GMPA；GPA突变体)为″g″，pSV-GMPA-GTF为″h″，pSV-GMPA-GTR为″i″中选择。SPA-GTF，SPA-GTR，SPA-GPA，SPA-GPMA的基本序列在序列表中分别为SEQ ID No.3，No.4，No.5，和No.6。为了计算3-Gal的表达效价，所有的构建子被分别整合到pSV-β-gal中，并进一步导入到COS-7细胞株中。表达效价是β-Gal的表达量，如图12所示。含有由SV40信号聚-A和胃泌素基因转录终止位点组成的构建子的pSG载体，具有增加蛋白表达量4倍的作用。因此，终止位点优选使表达效价增加的SPA-GTF(SV40信号聚-A和胃泌素基因转录终止位点)。本发明中，构建子用做常规的表达载体的终止位点，这样以致于外源蛋白的表达量增加。可效仿的本发明表达载体包括pSG.。
pSG载体是一种在其终止位点与SPA-GTF整合的载体，含3309碱基对。pSG.载体的碱基序列列于序列表SEQ ID No.7。β-Gal插入pSG.载体以便计算表达效价，从通过由胃泌素基因的转录终止位点和SV40病毒的信号聚-A组成的构建子而稳定的mRNA中得到pSG.的表达效价是pSV载体的4倍多。
因此，包含SPA-GRF的载体可以在动物宿主中以常规的方法表达外源基因，可以获得如具有生物活性物质的有用的蛋白。
另外，本发明提供了一种表达载体，它包括两个可以增加外源基因表达效价的位点。这两个位点是以SV40聚-A，和β-珠蛋白MAR互补序列连接胃泌素基因转录终止位点的转录终止位点。
图13显示了本发明的pMSG结构，总碱基序列为6347个碱基对，如序列表列出的SEQ ID No.8，pMSG被保藏在韩国微生物保藏中心KCCM10202。下述表1是pMSG的详细说明图。
  序号   功能
  1-419   SV40的早期的启动子和增强子
  420-448   多克隆位点(MCS)
  449-656   转录终止位点
  3365-6329   β-珠蛋白MAR互补序列
  1272-2132   β-内酰胺酶(AmpR)
                             表1
TGF-βS RII基因的蛋白，能够通过选择性结合活性人蛋白TGF-β而预防TGF-β副作用。为了分析本发明的pMSG的作用和效率，表达TGF-βSRII。结果如图14所示，由于TGF-βSRII蛋白具有一个糖基化结构，该蛋白具有比其同源蛋白大的分子量，和典型的动物细胞具有的一样。TGF-βSRII初始的表达量为大约100ng/106细胞/天，大部分细胞被相同的表达。另外，如图15所示，当1μM的MTX加入到TGF-βSRII细胞时，至多获得的10μg/106细胞/天。TGF-β在人体中具有许多种功能，特别是，已发现它是导致炎症的因子，如肾小球硬化体，肝硬变，表皮细胞角质化和软骨咬合面，TGF-βSRII可以用于TGF-β-过度表达疾病的治疗。
本发明的pMSG载体克服了一个常见的问题，即低表达产量和获得转化突变型的困难，并且它能够大量产生各种重组蛋白，如具有生物活性的物质。
另外，pMS载体(KCCM-10203)被开发，它不会被插入位点的邻近碱基而抑制它的表达，pMS产生的重组蛋白大约是常规的SV40启动子的8倍多。
而且，制备pSG载体，它包括转录终止位点，该转录终止位点能够在特定的转录位点感应转录子的转录终止位点并比常规的聚-A位点组成增加了3倍。
本发明的pMSG载体(KCCM-10202)是通过功能性DNA片断和可适用于外源基因的多克隆位点的连接来制备的，并且TGF-β在动物细胞中被表达时，表达量为10μg/106细胞/天。从而，本发明的表达载体适合于表达重组蛋白，依照本发明，来源于在原核生物中表达的真核细胞的蛋白可以在动物细胞中生产为具有和野生型蛋白相同的结构和功能的重组蛋白。
下述实施例进一步详细说明本发明，但并不构成对其范围的限制。
实施例1：pMS-β-gal载体的制备
(1)pMS-β-gal载体的制备
按如下方法制备pMS-β-gal载体。
①为了获得人β-珠蛋白MAR的碱基序列，从G-2细胞分离基因组DNA：
用Wizard基因组DNA纯化试剂(Promega Co.生产的)从人宿主的G-2细胞分离基因组DNA，接着是生产公司提供的实验方法后的纯化步骤。
②基因组PCR和亚克隆的完成：
为了获得人β-珠蛋白5’MAR的片段，纯化的基因组DNA用作模板，β-珠蛋白MAR的正向引物BML 1和反向引物BMR 1用于基因组聚合酶链式反应(PCR)中。BML 1和BMR 1在序列表中分别为SEQ ID No.9和SEQID No.10。PCR循环执行32次。表2中显示循环次数。
  试验条件   循环数
  1   94℃，2分钟   1
  2   94℃，30秒-＞60℃，45秒-＞72℃，45秒   2-31
  3   72℃，10分钟   32
                          表2
PCR之后，PCR的产物插入到pT7blue载体中(Novagen Co.)，制备pT7blue/β-珠蛋白MAR载体。pT7blue载体是一种能够直接克隆PCR产物的TA克隆载体。
③制备包含多克隆位点(MCS)的重组载体pSV-β-gal I和II型：
为了在pSV-β-gal载体启动子的上游插入pT7blue载体的β-珠蛋白MAR，制备pSV-β-galI型和II型。
首先，为了制备pSV-β-gal载体I型，用Spe I和Hind III处理pSV-β-gal之后，包含SV40启动子的Spe I/Hind III的443个碱基对的片断被含基因清洗试剂III(BIO 101 Co.)的琼脂糖凝胶纯化。该片断通过Spe I/Hind III消化被连接到线性pBluescript SK(+)(Stratagene Co.)，并且制备pBluescrip/SV40I启动子载体。
然后，以Sca I和Hind III处理pBluescrip/SV40 I启动子载体，包含SV40启动子的片断采用如上述同样的方式由琼脂糖凝胶纯化，该片断通过Sca I和Hind III的消化被连接到线性的pSV-β-gal载体，这样I型载体制备完成。
另外，为了生产pSV-β-gal II型载体，在以EcoR I和Hind III处理pSV-β-gal之后，采用上述同样的方式通过琼脂糖凝胶纯化包含SV40启动子的EcoR I/Hind III的420个碱基对的片断，该片断通过EcoR I和Hind III的消化被连接到线性的pBluescript SK(+)，这样pBluescript/SV 40II型启动子载体制备完成。
为了按如上述相同的方式通过琼脂糖凝胶纯化包含SV40启动子的片断，以Sca I和Hind III处理pBluescript/SV 40 II型的启动子载体，该片断通过Sce I和Hind III的消化被连接到线性的pSV-β-gal载体，这样pSV-β-gal载体II型制备完成。
④制备pMS-β-gal载体：
以Spe I和Sma I处理pT7blue/β-珠蛋白MAR载体，琼脂糖凝胶纯化包含β-珠蛋白MAR的大小为3kb DNA片断，通过Sβe I和Sma I片断将片断连接到线性重组pSV-β-gal I型载体，这样克隆β-珠蛋白MAR。为了确定β-珠蛋白MAR的定向，位于pSV-β-gal I型载体和β-珠蛋白MAR中的Hind III限制性酶被处理，确定了β-珠蛋白MAR被逆向克隆到pSV-β-gal I型载体中。
(2)pMS-β-gal载体的表达效价：
包含pMS-β-gal载体的2μg试验载体采用DOSPER(Roche产品)被共转染到含pSV2neo载体的CHO DG44中，pSV-β-gal载体作为对照载体以相同方式共转染。在选择性培养基中培养转染的CHO DG44细胞，该培养基是包括补加10％热-非活性FBS和850μg/ml G418的硫酸盐的核苷的MEM-α培养基(Calbiochem Co.产品)。大约2周后产生staly-转染的G418-抗性转染子，表达了对照载体的β-Gal的20个稳定克隆与G418-抗性的转染子中pMS-β-gal载体分离。为了计算β-Gal和新基因的复制数以及从pSV-β-gal和pMS-β-gal转录的β-Gal RNA的量，通过DNA和RNA印迹来分析40阳性克隆。
图6显示在pSV-β-gal或pMS-β-gal载体表达β-Gal的阳性克隆(下文指“阳性克隆”)中，用于确认β-Gal基因复制数(a：对照组，b：本发明)，RNA数(c：对照组，d：本发明)，以及作为选择性标记的新基因的复制数(e：对照组，f：本发明)的DNA和RNA印迹，并且图7显示在pSV-β-gal或pMS-β-gal载体的阳性克隆中的β-Gal表达产量和β-Gal基因的复制数之间关系的曲线。如图6a和6b所示，由于β-Gal基因在每个阳性克隆中的复制数是不同的，每个阳性克隆可被分成两组，其一为具有β-Gal基因的高复制数，另一为具有β-Gal基因的相对的低复制数，各组相互分析。具有β-Gal基因高复制数的一组，尽管对照组具有表示为“a”的β-Gal基因的高复制数，在这些克隆中的β-Gal基因的RNA的量相对于DNA的复制数也是低的，如“c”所示。然而，本发明的pMS-β-gal中的阳性克隆的RNA量是高的，表示为“d”。另外，具有β-Gal基因低复制数的一组中，β-Gal的复制数和pMS-β-gal载体阳性克隆的RNA的量远远高于对照组载体的阳性克隆中的量，如图6中所示。图7表示基因的复制数和表达量之间的关系。在图7中，在pMS-β-gal载体克隆中的β-Gal基因平均复制数和表达水平(●)与对照载体克隆的那些(○)相比，相当于大约10倍。另外，β-Gal基因的高复制组中，β-Gal基因在对照载体克隆中的表达独立于基因的复制数，并且pMS-β-gal如图7所示。
(3)在各种细胞体系中pMS-β-gal载体的表达模式：
在动物细胞的外源基因的表达中，像CHO一样使用各种各样的细胞，外源基因的表达量在各种细胞中是不同的。本发明中，阐明了当在CHO细胞宿主中使用pMS-β-gal载体时，在转染CHO细胞中的外源基因的表达效价和表达频率增加了。所以，已经实验了本发明的载体是否适用于来源和形态与CHO细胞不同的动物细胞。
pSV-β-gal和pMS-β-gal载体分别与载体pSV2neo共转染到幼鼠肾细胞(BHK)，鼠纤维细胞(NIH3T3)，人胚肾细胞(HEK293)之后，在包含G418的培养基中培养它们大约14天，在稳定的转染子中，对于每个载体，阳性细胞表达β-Gal的频率和表达效价以与(2)相同的方式计算。
图8显示各种细胞系中pMS-β-gal的表达效价。当BHK用于宿主细胞系时，基因的表达和在CHO细胞系中的类似。当NIH 3T3用于宿主细胞系时，对表达量的增加的影响是低的。当HEK293用于宿主细胞时，表达作用和量与对照组相似。阳性克隆的频率与上述情况类似。因此，本发明所述的表达载体在各种细胞中的效果是不同的，特别是，它们适用于通常在动物细胞表达中使用的CHO，BHK和NIN 3T3细胞。
(4)pMS-β-gal载体的表达体系的确定：
在常规的表达载体体系中，应经冗长的步骤选择高表达克隆，以尽可能在主要的转染子的集合体中分离，并且长时间培养这些克隆以增加外源基因的表达水平。为了克服这些问题和最大化外源基因的表达水平，用CHODG44细胞系将DHFR/MTX放大系统建立在表达系统上。
pMS-β-gal载体被转染到DHFR-CHO DG44(下文称作“CHO DG44”)细胞系，pMS-β-gal载体的转染子适合于MTX，接着计算蛋白的表达量。pMS-β-gal载体和对照载体(pSV-β-gal载体)通过具有DHFR基因的pDCHlP载体分别共转染至缺失DHFR基因的CHO DG44。在选择培养基中培养DHFR-转染的细胞株，该培养基为缺失10％热非活性透析FBS补充的核苷的MEM-α培养基。稳定的DHFR+转染子在大约2周后产生，在稳定的DHFR+转染子中的表达β-Gal的阳性克隆通过β-Gal染色分离。对于染色为DHFR+转染子中的表达β-Gal的筛选阳性克隆的β-Gal，通过在含2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS中于4℃培育10分钟固色细胞，以PBS清洗两次，并用X-Gal处理。当β-Gal被表达时，由于归因于通过β-Gal蛋白的X-Gal分解产生蓝色产物，因此细胞出现蓝色。选择性克隆通过成倍地逐步增加MTX浓度如10nM，20nM，50nM，100nM，400nM和1μM来处理。克隆大约需要2到3周的时间以适合每种培养的MTX浓度。以传统的ELISA分析通过MTX适合的基因放大期间β-Gal的表达量。
图9表示重组蛋白在分别以pMS-β-gal和对照物转染的细胞中的重组蛋白的表达量，并且适应1μM MTX浓度。据报道，当重组蛋白的表达通过CHO细胞系中的DHFR.MTX放大系统放大时，表达水平上升到大约10μg/106细胞/天，相当于总蛋白量的2.5％(Kaufman，1997，Methods MolBiol 62，287-300)。本发明中，据观察，通过逐渐增加MTX的量，大约有100到1000复制数被放大。计算β-Gal在对照组pMS-β-gal载体克隆中的表达量。β-Gal在对照克隆的表达量与每个克隆不同。考虑到在动物细胞的重组蛋白的生产中20μg/106细胞的工业价值，对照载体的25％的克隆属于其中，本发明pMS-β-gal载体克隆88％产生了大于20μg/106细胞的重组蛋白。与具有最大表达量的细胞株相比，本发明的pMS-β-gal具有大量的表达的蛋白，大量的蛋白通过将外源基因插入到pMS(KCCM10203)而产生。因此，当本发明的表达载体被用于表达外源基因时，将带来高表达产量和高效率。
实施例2：制备pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和Pmcpuk：
(1)制备pCMV载体
为了易于克隆scu-PA基因的CMV启动子和SV40启动子，制备pCMV载体。实施得到CMV启动子、MCS位点和pcCDNA 3.1(+)(由Invitrogen Co.生产的)转录终止位点的PCR。PCR的正向引物为CMVL1(SEQ ID No.11)，反向引物为PAR1(SEQ ID No.12)。CMVL1引物具有Sac II，Cla I，Nru I位点，PAR1引物具有Bsm I位点。为了制备pCMV，14kb的PCR产物被Sac II和Bsm I消化后，连接到线性重组pMS-β-gal I型中。
(2)制备pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK：
为了在动物细胞中制备适于scu-PA表达的重组表达载体，通过PCR得到scu-PA基因，为了由来源于人TCL-598细胞株的具有scu-PA基因作为模板的CHO细胞株分离基因组DNA。正向引物PKL1为序列SEQ ID No.13，反向引物的PKR1序列为SEQ ID No.14。PKL1引物具有Hind III限制性位点，PKR1引物具有Sma I限制性位点。
从引物获得的大约1.3kb scu-PA的PCR产物(DNA片断，具有人scu-PA的碱基NO.-6-NO.1293)被Sma I和Hind III剪切，并且插入它到质粒中，和为了制备pCPUK表达载体通过Hind III和EcoR V剪切的pCMV。
另外，为了从中分离含SV40启动子的片断，以Sma I和Hind III处理重组pSV-β-gal I型载体。为了制备pSPUK表达载体，由Nru I和Hind III将片断插入并与对照的线性pCPUK连接。
为了插入MAR成分到其中，以Sac II和Nru I处理pCPUK。为了制备pMCPUK载体，线性的pCPUK插入β-珠蛋白MAR成分并与其连接，这种成分通过以Sma I和SacII处理pMS-β-gal载体制备。
为了将β-珠蛋白MAR成分插入其中，用Stu I和Sac II处理载体pSPUK。将用Stu I和Sac II处理pMS-β-gal载体产生的β-珠蛋白MAR成分，插入到pSPUK载体，pMSPUK载体制备完成。
简而言之，pSPUK载体构建子为通过插入scu-PA基因到重组载体和pSV-β-galI型产生的形式，其中pSV-β-galI型的β-Gal基因被除去，并且插入β-珠蛋白MAR互补序列到pSPUK载体中以便制备pMSPUK载体。pCPUK载体构建子是插入Scu-PA到pCMV载体而产生的形式，并且插入β-珠蛋白MAR互补序列到pCPUK中以便制备pMCPUK载体。
(3)pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK载体效率的检测：
①重组scu-PA基因转染到细胞中，选择基因的转化体和放大：
为了获得足够稳定的细胞系以表达scu-PA，将pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK四种重组表达质粒，分别地导入到DHFR-CHO细胞中(CHO DG44)。2×105的CHO细胞置于6-孔平板中，在含5％CO2，37℃的培养箱中培育24小时。1μg的pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK质粒和10ng的DHFR微量基因分别按100∶1的比率混合，混合物以细胞转染试剂，(GiboBRL)，或DOSPER(Loche)法转染到CHO细胞。6小时后，更换新鲜的常规培养基，细胞被进一步培养48小时。细胞按比率10∶1在培养基进行次培养到选择培养基大约2周或更长，为了形成细胞群落，大约每4或5天要更换培养基。单独或一起培养细胞群落。
②分泌在细胞的培养液中的scu-PA的活性的计算
采用S-2444作为基础计算细胞培养基的酰胺化活性，并将结果与相应的尿激酶活性相比较。1×106细胞被置于含2ml培养液的6-孔平板中，在含5％CO2，37℃的培养箱中培育17小时。为了计算上清液的活性，50μl连续稀释的上清液置于96-孔平板中，并和30μl缓冲液混合(50mM Tris/HCI(pH 8.8)，80mM NaCI，0.02％Twin 80)。为了活化重组scu-PA，将10μl纤溶酶(0.5U/ml)进一步混入到混合物中，混合物在37℃反应20分钟。为了抑制纤溶酶的活性将10μl抑酶肽(100KIU/ml)加入到混合物中，100μl显色底物溶液(缓冲溶液和6mM的S-2444的混合物)进一步加入到混合物中，在37℃反应1小时。scu-PA在培养基中的活性和浓度通过最后的溶液在微量阅读器的405nm处的吸收值(光学密度)来计算，结果与相应的尿激酶的相比较。
图10显示依照转染pMSPUK，pMCPUK，pSPUK和pCPUK至CHO细胞中的scu-PA的表达效价。pMS和pMC载体的表达水平比作为对照的pSV和pMC的增加了4倍多。
实施例3：pSG-β-gal载体的制备
(1)胃泌素基因的转录终止位点和pSG-β-gal载体的制备
合成胃泌素基因的正义链的转录终止位点SEQ ID No.15和反义链SEQID No.16之后，两者被退火。用BamH I和Pst I处理退火的片断，并由BamHI和Pst I在SV40p(A)3’末端消化，整合和连接到线性pSV-β-gal载体(由Promega Co.生产的载体)，这样pSG-β-gal载体完成制备。
(2)计算pSG载体的效率
为了计算β-Gal的表达效价，用DOSPER(Roche)将pSG-β-gal载体和pSV2neo载体共转染到Cos-7细胞中。
图12显示β-gal在pSG-β-gal载体中的表达效价，并且包括由SV40聚-A和胃泌素基因的转录终止位点组成的构建子的pSG-β-gal载体产生的β-Gal是包括SV40聚-A的常规载体的4倍多。因此，通过克隆在pSG载体中外源基因的转染可以产生大量的重组蛋白。
实施例4
(1)pMSG载体的制备
如图13所示，含有β-珠蛋白MAR互补序列和SPA-GTF的载体由PCR制备。为了制备pMSG载体，pMS-β-gal和pSG-β-gal用作模板，PCR实施三次，PCR的产物用特殊的限制性酶来处理，并连接在一起。
①β-珠蛋白MAR成分的PCR
正向引物ML1(序列17)和反向引物MR1(序列18)用于PCR。PCR产物以Sac II和Cla I处理后，与通过Sac II和Cla I消化的线性pMS-β-gal载体整合，pMS-β-gal/sc载体制备完成。
②包含多克隆位点和转录终止位点的PCR
正向引物TL1(序列19)和反向引物TR1(序列20)用于pSG载体的胃泌素基因转录终止位点的PCR。PCR产物以pGEM-T(Promega Co.生产)亚克隆，它是能够直接克隆PCR产物的一种TA克隆载体，这样pGEM-T/MCSp(A)制备完成。
③含SV40启动子和多克隆位点的PCR
正向引物PL1(序列21)和反向引物PR1(序列22)用于SV40启动子和图1所示的1型载体的多克隆位点的PCR。PCR产物用Apa I和BgI II处理，然后将其整合到被Apa I和BgI II消化的线性pGEM-T/MCSp(A)载体中，这样pGEM-T/SVMCSp(A)载体制备完成。
④pMS和pMSG载体的制备
为了纯化由SV40启动子，多克隆位点和SV40终止位点组成的DNA片断，用Apa I和BamH I处理实施例4中的pGEM-T/SVMCSp(A)，并将纯化的片断整合到实施例4的①中的由Apa I和BamH I消化的线性pMS-β-gal/sc载体，这样pMS载体制备完成。为了分离具有GTF碱基对的950bp的DNA片断，用BamH I和Sca I处理Psg载体，通过BamH I和ScaI消化将它与线性pMS载体连接，从而pMSG载体制备完成。
(2)pMSG载体的表达效价的计算
为了检验pMSG载体在CHO宿主细胞系中的表达效率和pMSG载体的工业应用，用正向引物TRI(SEQ ID NO.23)和反向引物TRR1(SEQ ID NO.24)完成TGF-βSRII(TGF-β可溶性受体II，糖基化蛋白)的PCR。PCR产物，放大的TGF-βSRII在Nhe I和Xho I位点插入到pMSG和pSV载体，生成的每个载体共转染到具有含DHFR基因的pDCH1P的CHO DG444细胞中。它们在选择性培养基中培养，这里仅有具有DHFR基因的细胞株可以生长。大约在2周后产生稳定的DHFR+转染子，分离20DHFR+克隆，用蛋白质印迹法分析这些克隆以便计算TGF-βSRII的量和寻找它的特性。
图14显示表明TGF-βSRII表达的蛋白质印迹图，其中“a”是TGF-βSRII在pSV载体的克隆表达，“b”是TGF-βSRII在pMSG载体的克隆表达。对照载体克隆的情形下，25个克隆中检测到一个克隆内的TGF-βSRII表达。同时在27个克隆中检测到23个克隆内的TGF-βSRII表达，更一步检测到高水平的更多的表达TGF-β的克隆。另外，当TGF-βSRII由pMSG表达载体表达时，它具有糖基化结构，这样如典型的动物细胞中糖蛋白一样它的分子量增加。pMSG载体的主要克隆的平均表达水平为100ng/106细胞/天。
通过MTX量逐步成倍地增加(如10nM，40nM，200nM，和1M)的处理，本发明的pMSG/TGF--βSRII载体的主要的稳定克隆适合于DHFR/MTX放大体系，以便增加TGF-βSRII的表达量。
图15显示TGF-βSRII的表达量，它通过将TGF-βSRII克隆到pMSG载体、将它们转染到CHO细胞中、以及适应1μM MTX浓度而生产。在对照载体的克隆中，许多克隆不能适应MTX处理的基因放大过程期间的每个MTX浓度，而与对照载体克隆相比，pMSG/TGF-βSRII载体的克隆良好地适应。假设pMSG表达载体的MAR成分增加了DHFR基因以及外源基因的表达量。如图15所示，当加入1μM浓度的MTX时，获得许多pMSG载体克隆，它以大约10μg/106细胞/天产生TGF-β。
据报道TGF-β，细胞生长的有效调节物和分化，是损伤反应中心。在大量的上皮细胞中，重复或延长的损伤导致了进行性纤维样变性和基本上不必的过度瘢痕的发展。另外，TGF-β导致疾病，例如如肾小球体化，肾硬化，肝硬化，表皮细胞角质化，和软骨炎症。TGF-βSRII如同TGF-β拮抗物一样起作用。因此，通过TGF-βSRII作为药物治疗阻止TGF-β。与从原核生物如大肠杆菌E.coli或Pichia pastoris表达的蛋白相比，从本发明的CHO细胞系表达的TGF-βSRII具有优良的治疗效果，本发明的具有提高的外源基因表达效价的表达载体可以用于动物细胞。
             微生物或其它生物材料的保藏证明
                      (PCT条约13bis)
  A.以下确认涉及关于在 16页， 3行提及的保藏微生物或其它生物材料。
  B.保藏确认                           更多保藏在附加页中确认□
  保藏机构名称：韩国微生物保藏中心
  保藏机构地址(包括邮政编码和国家)韩国      汉城市     120-091    Seodaemun-gu，Hongje-l-dong，YurimB/D，361-221
  保藏日期：2000.7.28   保藏号：KCCM 10202
  C.附加证明(如不适用则保留空白)             该信息在附加页中继续□
  D.对做出证明的指定国家(如果该证明不是对所有指定国家)
  E.须另行递交证明(如不适用则保留空白)
  如下证明须递交给国际局(指明证明的一般性特征，如保藏号)
        仅供受理局使用□该页随国际申请收到
  授权人：
        仅供国际局使用□国际局于_收到该页
授权人
          布达佩斯条约关于为递交专利而保藏微生物的国际证明
                               国际表
 I.微生物证明：
 保藏者出示的相关证明：Escherichia coli DH5α/pMSG   国际保藏局出示的保藏号：KCCM-10202
 II.科学描述和/或建议性分类名称
 如上第一栏中所述微生物附带以下文件：□科学性描述□建议性分类名称
 VII.接受并受理
 国际保藏局受理其于2000年7月24日收到的第一栏所示微生物(原始保藏日)
 IV.国际保藏局
 名称：韩国微生物保藏中心韩国汉城市120-091Seodaemum-guHongje-l-dong，Yurim B/D，361-221   国际保藏局代表签字：
适用于条约6.4(d)，该日期为获得国际保藏局资格的日期：其中当保藏是在布达佩斯条约之外且在得到国际保藏局身份之后进行时，该保藏被转成布达佩斯条约之下，该日期是微生物被国际保藏局收到的日期。
                 微生物或其它生物材料的保藏证明
                          (PCT条约13bis)
  A.以下确认涉及关于在 12页， 10行提及的保藏微生物或其它生物材料。
  B.保藏确认                            更多保藏在附加页中确认□
  保藏机构名称：韩国微生物保藏中心
  保藏机构地址(包括邮政编码和国家)韩国      汉城市     120-091  Seodaemun-gu，Hongje-1-dong，YurimB/D，361-221
  保藏日期：2000.7.28   保藏号：KCCM 10203
  C.附加证明(如不适用则保留空白)         该信息在附加页中继续□
  D.对做出证明的指定国家(如果该证明不是对所有指定国家)
  E.须另行递交证明(如不适用则保留空白)
  如下证明须递交给国际局(指明证明的一般性特征，如保藏号)
        仅供受理局使用□该页随国际申请收到
        仅供国际局使用□国际局于_收到该页
          布达佩斯条约关于为递交专利而保藏微生物的国际证明
                               国际表
 I.微生物证明：
 保藏者出示的相关证明：Escherichia coli DH5α/pMS   国际保藏局出示的保藏号：KCCM-10203
 II.科学描述和/或建议性分类名称
 如上第一栏中所述微生物附带以下文件：□科学性描述□建议性分类名称
 VII.接受并受理
 国际保藏局受理其于2000年7月24日收到的第一栏所示微生物(原始保藏日)
 IV.国际保藏局
 名称：韩国微生物保藏中心韩国  汉城市  120-091  Seodaemum-guHongje-1-dong，Yurim B/D，361-221   国际保藏局代表签字：
适用于条约6.4(d)，该日期为获得国际保藏局资格的日期：其中当保藏是在布达佩斯条约之外且在得到国际保藏局身份之后进行时，该保藏被转成布达佩斯条约之下，该日期是微生物被国际保藏局收到的日期。
                            序列表
<110>Mogam Biotechnotogy Research Institute
     Pan-Gen Biotech Laboratories Inc.
<120>用于动物细胞的表达载体
<130>opp010629kr
<150>KR10-2000-43996
<151>2000-7-29
<160>24
<170>Kopatentln 1.55
<210>1
<211>6287
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pMS载体序列
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(419)
<223>SV40病毒
<220>
<221>基因
<222>(3305)..(6269)
<223>人β珠蛋白MAR成份
<400>1
gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag          60
gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc          120
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt          180
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca          240
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc          300
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg          360
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg          420
ctagcggccg cagatctgtt aactcgagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa          480
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg          540
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcctctaga gtcgacctgc          600
agggatgcaa gctggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg          660
ttaaacaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag          720
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga          780
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca          840
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg          900
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct          960
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg          1020
gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt          1080
caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac          1140
attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa          1200
aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat          1260
tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc          1320
agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga          1380
gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg          1440
cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc          1500
agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag          1560
taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc          1620
tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg          1680
taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg          1740
acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac          1800
ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac          1860
cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg          1920
agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg          1980
tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg          2040
agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac          2100
tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg          2160
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg          2220
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc          2280
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc          2340
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt          2400
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc          2460
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact          2520
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac          2580
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag          2640
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg          2700
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg          2760
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga          2820
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt          2880
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct          2940
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg          3000
aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt          3060
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta          3120
atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta          3180
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt          3240
aagccaagct cgaaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctc caccgcggcc          3300
cgggcctcct gagtagctgg gactacaggt gtacatcaca tgcctggcta attttttttt          3360
tttaagtaga gacgaggtct tgctatgttg tccaggataa tatcaaactc ttgagctcaa          3420
gcagtcctcc cacttctacc tctcaagtgc tggaattaca gacatgagcc accactcctg          3480
gcttgcagac tatttaaatg actaattcct gacactgctt gagggatact agacagtaga          3540
caacacatct ttaatatacc aaatgggtga ctgtagggtt gagagggaga ttagaattca          3600
atgttttatg accaaaaagg cttaaatcag gcacaagctt aggtcttttc aactgtgagg          3660
accggactga aagtgtgcag ttcaaggccc tgtagttgct gtttaactgt tcccaggtgg          3720
aagtctcttc aaagaaccac tggtgcaaaa agggaactac ctggggataa atatttcgtc          3780
cagaaagggg gaaagtgcaa gctcccctac caaaagcacc aggcaagtcc ttgtctattt          3840
tccctgaagt tctcaaagaa atgagaccct tgtttacctt taagattaga gaaggcttga          3900
aaagtttgag ctgtgccttt ggaggccaac aaacttttct cctttgttga ccaagttcag          3960
ctctcctgta tacttccaag gtctgttgca tcaagagtga gaattgaagg tcttagaagc          4020
tgggatctca gatgtaggga aaagaggaga tttcctgttc actcactgtt aagatatggc          4080
tgaaattttt tgatctagtc atctacaaag catgagttgt gggtcagaaa ttgtttttca          4140
catcttttga cttcctttga catcagaata taacctagga attgattact taagtgaagg          4200
caaggtactt tggtctggac aggaacattt tgaacaaggt agggagacag ctatgaaggc          4260
aagcatttat tctatctatc atctatctgt ctatctatct attctttcat ccacttattt          4320
atacatttaa acaaaaagta tagagcgtag tataatttgt aagtgctcag ggctgtgtgt          4380
gtatggattg tttgaaatga aactaaagtg ggagtataat tctactgccc ccttaaccct          4440
gtggtcccta cactaccctg caagactctt agctgcttag cttaattgtg aggctgattt          4500
ggggcatagc acccatcctc tctgtctttc aacatcctca taataacttg agataatttt          4560
ataaaatatc acaatagggt catgttcagt agggtgatat ataaaattag acaagccata          4620
gtttgagtta cccttttgaa taaatatatg acaaaaggca atttaattat ctttatgagt          4680
ttggaggtat ccagtatgaa atttagataa tacctgcctt ctagtgttga aattagaact          4740
taatgatata atgcatcaat gaacttatta tagttcctag cacaaagtaa gaatcctttc          4800
aatgtgtgtg tgtgtgtatg tatttatctg ttattaatag gaatcttata gggcattatc          4860
tcacttaatc cttattaata actatgaagc aggtatttat ttgagttttc caagtgagtt          4920
aagtatagct tgtaatactt aaggaaatat ccacaggtta catagctagt atataactga          4980
gaaataattt tatttatatt ataaaacatt ctaacaatac agatgtatat aaactaaaaa          5040
actgaaaggg ctcatgcaac cctaccttct caatatcact tcttcactta gaaaaaacca          5100
gccttagctg tctgctatga atcctttcaa aatatacttc tgagaaatga gagagagaaa          5160
tggggagggt agaaggaagg aagatagggt aagagacagg gaaggaggtg tggggaaaga          5220
aattaaatta ttcttttctc tgtctcttga aagagctctt tccattacat tgaatcaaag          5280
gtaatgttgc catttctgga ctcttgaaat aaagaaagac cgatgtatga aataattttg          5340
aaagtctatg gcattttcaa aatgcaaggt gatgtcttac taactagcct ttgctttatt          5400
attagaaatg gggaagtgag tatagacatt ttatcaggag atatattagg aaaaagggaa          5460
actggagaaa ctgggaggag tatccagatg tcctgtccct gtaaggtggg ggcacccacc          5520
ttcaatcaaa agggctcctt aacaacttcc ttgcttgggg ctccaccatc ttggaccatt          5580
agctccacag gtatcttctt ccctctagtg gtcataacag cagcttcagc tacctctcta          5640
aagagtcctg ccagatatag gtcaggaaat ataaccacta ataaaaagag aaacattttg          5700
actgtagttg tttgtttttt gtcattgtga ctatcaataa cattctcact ctttcatcag          5760
taatcactca ggttattctg tgaccaacag actgtgggaa aaatcagaga aggaggcatc          5820
ctcatgctta ctagcctaaa ctgaaattgc tatagcagag tgaaccagaa ggtttacaga          5880
tattttccac aaagagtaaa aggattgaeg ccttctccag atcaatgcat aggaaataat          5940
aatggaccat aaaacccata ttatgacgaa caacattagg ataagtccat atcaattttt          6000
aatccagtca taagcacaga ctacgtgaag cacgtccaag tgaaggcagg agaaatgaga          6060
ggagcaagaa agaggagcca tttgatcaag aatagcagaa aaaggaaagg caagtcatat          6120
taacaaatga ttgtcatgcc aacagtacag ataactctgc taataaaggt agaggcataa          6180
tacaggtagt agcagatatc tacatagtag ttaaaggaca tggccatcag tacagaagat          6240
tccataaagg agaacctaaa gaggaagaaa tcgataagct tgatccc                        6287
<210>2
<211>435
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含聚-a信号，终止密码的，由Hind III限制性酶消化的胃泌素片断
<220>
<221>终止子
<222>(256)..(435)
<400>2
taacaatcct agaaccaagc ttcagagcct agccacctcc caccccacct ccagccctgt          60
cccctgaaaa actgatcaaa aataaactag tttccagtgg atcaatggac tgtgtcagtg          120
ttgtagggca gaggaggggg actcatctgg gctcatctgg gggtgaagtt gtggcaggga          180
ctaagagctg agtgcctctt aggggcaggg accgtccccc agagccccac attgaacgag          240
aatccacagg tatgggcagg ataatatatg gtagggttca tagccagagt aacctttttt          300
tttaattttt attttatttt atttttgaga tggagtttcg ctcttgtctc ccaggctgga          360
gtgcaataat gagacctcag ctcactgcaa cctctgcctc ctaggttcaa gcgattttcc          420
tgcctcagcc tccca                                                           435
<210>3
<211>214
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SV40病毒的聚-A信号和胃泌素的终止位点
<220>
<221>聚A-信号
<222>(1)..(135)
<220>
<221>终止子
<222>(136)..(214)
<400>3
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca          60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct          120
tatcatgtct ggatccagga taatatatgg tagggttcat agccagagta accttttttt          180
ttaattttta ttttatttta tttttgagct gcag                                      214
<210>4
<211>221
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SV40病毒的聚-A信号和胃泌素聚-A信号的颠倒
<220>
<221>polyA_signal
<222>(1)..(137)
<220>
<221>终止子
<222>(138)..(221)
<400>4
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca          60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct          120
tatcatgtct ggatcaactg cagctcaaaa ataaaataaa ataaaaatta aaaaaaaagg          180
ttactcaggc tatgaaccct accatatatt atcctgcagt t                              221
<210>5
<211>217
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SV40病毒聚-A信号和胃泌素聚-A信号
<220>
<221>聚A-信号
<222>(1)..(135)
<220>
<221>终止子
<222>(136)..(217)
<400>5
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca          60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct          120
tatcatgtct ggatccggga tcccctgaaa aactgatcaa aaataaacta gtttccagtg          180
gatcaatgga ctgtgtcagt gttgtagggc tgcagtt                                   217
<210>6
<211>217
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SV40病毒聚-A信号和最少的胃泌素聚-A信号
<220>
<221>polyA_signal
<222>(1)..(135)
<220>
<221>终止子
<222>(136)..(2t7)
<400>6
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca          60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct          120
tatcatgtct ggatccggga tcccctgaaa aactgatcaa aaataaacta gtttttccac          180
tgcattctag ttgtgttagt gttgtagggc tgcagtt                                   217
<210>7
<211>3309
<2t2>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pSG载体序列
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(419)
<400>7
gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag          60
gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc          120
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt          180
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca          240
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc          300
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg          360
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg          420
ctagcggccg cagatctgtt aactcgagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa          480
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg          540
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atccaggata atatatggta          600
gggttcatag ccagagtaac cttttttttt aatttttatt ttattttatt tttgagctgc          660
aggcatgcaa gctggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg          720
ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag          780
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga          840
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca          900
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg          960
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct          1020
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg          1080
gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcLtagacgt          1140
caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac          1200
attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa          1260
aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat          1320
tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc          1380
agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga          1440
gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg          1500
cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc          1560
agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag          1620
taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc          1680
tcacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg          1740
taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg          1800
acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac          1860
ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac          1920
cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg          1980
agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg          2040
tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg          2100
agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac          2160
tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg          2220
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg          2280
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc          2340
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc          2400
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt          2460
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc          2520
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact          2580
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac          2640
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag          2700
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg          2760
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg          2820
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga          2880
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt          2940
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct          3000
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg          3060
aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt          3120
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta          3180
atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta          3240
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt          3300
acgaattcg                                                                  3309
<210>8
<211>6347
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pSMG载体序列
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(419)
<220>
<221>终止子
<222>(449)..(656)
<220>
<221>基子
<222>(3365)..(6329)
<223>人β珠蛋白MAR成份
<220>
<221>gene
<222>(1272)..(2132)
<223>β-半乳糖苷酶
<400>8
gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag          60
gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc          120
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt          180
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca          240
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc          300
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg          360
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg          420
ctagcggccg cagatctgtt aactcgagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa          480
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg          540
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atccaggata atatatggta          600
gggttcatag ccagagtaac cttttttttt aatttttatt ttattttatt tttgagctgc          660
aggcatgcaa gctggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg          720
ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag          780
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga          840
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca          900
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg          960
acgggccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct          1020
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg          1080
gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt          1140
caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac          1200
attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa          1260
aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat          1320
tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc          1380
agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga          1440
gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg          1500
cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc          1560
agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag          1620
taggagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc          1680
tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg          1740
taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg          1800
acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac          1860
ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac          1920
cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg          1980
agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg          2040
tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg          2100
agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac          2160
tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg          2220
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg          2280
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc          2340
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc          2400
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt          2460
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc          2520
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact          2580
caagecgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac          2640
agcccagctt gaagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag          2700
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg          2760
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg          2820
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga          2880
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt          2940
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct          3000
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg          3060
aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt          3120
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta          3180
atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta          3240
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt          3300
acgccaagct cgaaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctc caccgcggcc          3360
cgggcctcct gagtagctgg gactacaggt gtacatcaca tgcctggcta attttttttt          3420
tttaagtaga gacgaggtct tgctatgttg tccaggataa tatcaaactc ttgagctcaa          3480
gcagtcctcc cacttctacc tctcaagtgc tggaattaca gacatgagcc accactcctg          3540
gcttgcagac tatttaaatg actaattcct gacactgctt gagggatact agacagtaga          3600
caacacatct ttaatatacc aaatgggtga ctgtagggtt gagagggaga ttagaattca          3660
atgttttatg accaaaaagg cttaaatcag gcacaagctt aggtcttttc aactgtgagg          3720
accggactga aagtgtgcag ttcaaggccc tgtagttgct gtttaactgt tcccaggtgg          3780
aagtctcttc aaagaaccac tggtgcaaaa agggaactac ctggggataa atatttcctc          3840
cagaaagggg gaaagtgcaa gctcccctac caaaagcacc aggcaagtcc ttgtctattt          3900
tccctgaagt tctcaaagaa atgagaccct tgtttacctt taagattaga gaaggcttga          3960
aaagtttgag ctgtgccttt ggaggccaac aaacttttct cctttgttga ccaagttcag          4020
ctctcctgta tacttccaag gtctgttgca tcaagagtga gaattgaagg tcttagaagc          4080
tgggatctca gatgtaggga aaagaggaga tttcctgttc actcactgtt aagatatggc          4140
tgaaattttt tgatctagtc atctacaaag catgagttgt gggtcagaaa ttgtttttca          4200
cattttttga cttcctttga catcagaata taacctagga attgattact taagtgaagg          4260
caaggtactt tggtctggac aggaacattt tgaacaaggt agggagacag ctatgaaggc          4320
aagcatttat tctatctatc atctatctgt ctatctatct attctttcat ccacttattt          4380
atacatttaa acaaaaagta tagagcgtag tataatttgt aagtgctcag ggctgtgtgt          4440
gtatggattg tttgaaatga aactaaagtg ggagtataat tctactgccc ccttaaccct          4500
gtggtcccta cactaccctg caagactctt agctgcttag cttaattgtg aggctgattt          4560
ggggcatagc acccatcctc tctgtctttc aacatcctca taataacttg agataatttt          4620
ataaaatatc acaatagggt catgttcagt agggtgatat ataaaattag acaagccata          4680
gtttgagtta cccttttgaa taaatatatg acaaaaggca atttaattat ctttatgagt          4740
ttggaggtat ccagtatgaa atttagataa tacctgcctt ctagtgttga aattagaact          4800
taatgatata atgcatcaat gaacttatta tagttcctag cacaaagtaa gaatcctttc          4860
aatgtgtgtg tgtgtgtatg tatttatctg ttattaatag gaatcttata gggcattatc          4920
tcacttaatc cttattaata actatgaagc aggtatttat ttgagttttc caagtgagtt          4980
aagtatagct tgtaatactt aaggaaatat ccacaggtta catagctagt atataactga          5040
gaaataattt tatttatatt ataaaacatt ctaacaatac agatgtatat aaactaaaaa          5100
actgaaaggg ctcatgcaac cctaccttct caatatcact tcttcactta gaaaaaacca          5160
gccttagctg tctgctatga atcctttcaa aatatacttc tgagaaatga gagagagaaa          5220
tggggagggt agaaggaagg aagatagggt aagagacagg gaaggaggtg tggggaaaga          5280
aattaaatta ttcttttctc tgtctcttga aagagctctt tccattacat tgaatcaaag          5340
gtaatgttgc catttctgga ctcttgaaat aaagaaagac cgatgtatga aataattttg          5400
aaagtctatg gcattttcaa aatgcaaggt gatgtcttac taactagcct ttgctttatt          5460
attagaaatg gggaagtgag tatagacatt ttatcaggag atatattagg aaaaagggaa          5520
actggagaaa ctgggaggag tatccagatg tcctgtccct gtaaggtggg ggcacccacc          5580
ttcaatcaaa agggctcctt aacaacttcc ttgcttgggg ctccaccatc ttggaccatt          5640
agctccacag gtatcttctt ccctctagtg gtcataacag cagcttcagc tacctctcta          5700
aagagtcctg ccagatatag gtcaggaaat ataaccacta ataaaaagag aaacattttg          5760
actgtagttg tttgtttttt gtcattgtga ctatcaataa cattctcact ctttcatcag          5820
taatcactca ggttattctg tgaccaacag actgtgggaa aaatcagaga aggaggcatc          5880
ctcatgctta ctagcctaaa ctgaaattgc tatagcagag tgaaccagaa ggtttacaga          5940
tattttccac aaagagtaaa aggattgaag ccttctccag atcaatgcat aggaaataat          6000
aatggaccat aaaacccata ttatgacgaa caacattagg ataagtccat atcaattttt          6060
aatccagtca taagcacaga ctacgtgaag cacgtccaag tgaaggcagg agaaatgaga          6120
ggagcaagaa agaggagcca tttgatcaag aatagcagaa aaaggaaagg caagtcatat          6180
taacaaatga ttgtcatgcc aacagtacag ataactctgc taataaaggt agaggcataa          6240
tacaggtagt agcagatatc tacatagtag ttaaaggaca tggccatcag tacagaagat          6300
tccataaagg agaacctaaa gaggaagaaa tcgataagct tgatccc                        6347
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人β珠蛋白核基质着丝溢痕成份的引物RML1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<400>9
ttcttcctct ttaggttctc                                                 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人β珠蛋白核基质着丝溢痕成份的引物BMR1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<223>primer
<400>10
cctcctgagt agctgggact                                                      20
<210>11
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcCNA3.1载体的引物CMVL1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(41)
<223>引物
<400>11
attccgcgga tcgattcgcg atgtacgggc cagatatacg c                              41
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcCDNA3.1载体的引物PAR1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(23)
<223>primer
<400>12
attgaatgca gtgaaaaaaa tgc                                                  23
<210>13
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>scu-PA基因的引物PKL1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(39)
<223>引物
<400>13
cccaagctta tgagagccct gctggcgcgc ctgcttctc                                 39
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>asc-PA基因的引物PKR1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(27)
<223>引物
<400>14
tcccccgggt cagagggcca ggccatt                                              27
<210>15
<21t>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在pSG载体中所用的胃泌素终止位点的正义序列
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(87)
<223>sense sequence of gastrin terminaticn site
<400>15
agcggatcca ggataatata tggtagggtt catagccaga gtaacctttt tttttaattt          60
ttattttatt ttatttttga gctgcag                                              87
<210>16
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在pSG载体中胃泌素终止位点的反义序列
vector
<220>终止子
<221>terminator
<222>(1)..(87)
<223>胃泌素的终止位点的反义序列
<400>16
ctgcagctca aaaataaaat aaaataaaaa ttaaaaaaaa aggttactct ggctatgaac          60
cctaccatat attatcctgg atccgct                                              87
<210>17
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人β珠蛋白MAR成份在pMS载体中放大的引物ML1
vector
<220>
<221>引物
<222>(1)..(35)
<223>引物
<100>17
tccccgcggc ccgggcctcc tgagtagctg ggact                                     35
<210>18
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在pMS载体中放大人β珠蛋白MAR成份的引物MR1
vector
<220>
<221>引物
<222>(1)..(35)
<223>primer
<400>18
ttggggccca tcgattttctt cctctttagg ttctc                                    35
<210>19
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>胃泌素在pSG载体中的终止位点的引物TL1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(39)
<223>引物
<400>19
gaagatctgt taactcgaga acttgtttat tgcagctta                                 39
<210>20
<211)20
<212>DMA
<213>Artificial Seguence
<220>
<223>胃泌素终止位点在pSG载体中的引物TR1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>20
gtgccagctt gcatgcctgc                                                      20
<210>21
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>熔融SV40病毒启动子和多克隆位点的引物PL1
<220>
<221>primer
<222>(1)..(34)
<223>primer
<400>21
ccatcgatgg gcccgcgcag caccatggcc tgaa                                      34
<210>22
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>熔融SV40病毒启动子和多克隆位点的引物PR1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(40)
<223>引物
<400>22
gaagatctgc ggccgctagc aagctttttg caaaagccta                                40
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TGF-β可溶受体II的引物TR1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(29)
<223>引物
<400>23
accgctagcc cacccatggg tcgggggct                                            29
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TGF的可溶受体II的引物TRR1
<220>
<221>引物
<222>(1)..(29)
<223>引物
<400>24
agcctcgagc tagtcaggat tgctggtgt                                            29

Claims (8)

1.一种用于动物细胞的表达载体，包括SV40病毒启动子或CMV病毒启动子；位于所述启动子5’-末端上的β-珠蛋白MAR(核基质着丝溢痕)成分或其互补序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其中该用于动物细胞的表达载体是SEQ ID NO：1的pMS(KCCM 10203)载体。
3.如权利要求1所述的表达载体，其中该用于动物细胞的表达载体是pMC。
4.如权利要求1所述的表达载体，进一步包括转录终止位点，该转录终止位点包括SV40病毒聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因转录终止位点。
5.如权利要求4所述的表达载体，其中该转录终止位点是SEQ ID NO：3。
6.如权利要求4所述的表达载体，其中该表达载体是SEQ ID NO：8的pMSG(KCCM 10202)载体。
7.一种在动物细胞中由表达载体制备生物活性物质的方法，该表达载体选自按照权利要求1、4和6的表达载体组成的组。
8.按照权利要求7所述的方法，其中生物活性物质是由按照权利要求6的表达载体制备的TGF-βSRII。
CNB018135579A 2000-07-29 2001-07-27 用于动物细胞的表达载体 Expired - Lifetime CN1262663C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0043996A KR100408844B1 (ko) 2000-07-29 2000-07-29 동물세포 발현벡터
KR2000/43996 2000-07-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1444657A CN1444657A (zh) 2003-09-24
CN1262663C true CN1262663C (zh) 2006-07-05

Family

ID=19680759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018135579A Expired - Lifetime CN1262663C (zh) 2000-07-29 2001-07-27 用于动物细胞的表达载体

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7422874B2 (zh)
EP (1) EP1392835B1 (zh)
JP (1) JP4138479B2 (zh)
KR (1) KR100408844B1 (zh)
CN (1) CN1262663C (zh)
AT (1) ATE445704T1 (zh)
AU (1) AU2001278797A1 (zh)
DE (1) DE60140218D1 (zh)
ES (1) ES2333774T3 (zh)
WO (1) WO2002014525A2 (zh)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1395669B1 (en) * 2001-01-26 2009-07-22 Selexis S.A. Matrix attachment regions and methods for use thereof
EP2316921B1 (en) 2002-05-24 2014-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Neutralizing human anti-IGFR antibody
AU2003263161A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-08 Novo Nordisk A/S Method for making recombinant proteins
US6933136B2 (en) 2002-09-20 2005-08-23 Novo Nordisk A/S Method for making recombinant proteins
US7135338B2 (en) * 2003-06-11 2006-11-14 Dobeel Corporation Methods for overexpression of high molecular weight form of mannose binding lectin (MBL) and a specific formulation for active treatment for systemic infection with microorganism
KR100755931B1 (ko) * 2003-06-11 2007-09-06 (주)두비엘 고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 상기방법으로 제조된 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의제제화
PL2292754T3 (pl) 2003-10-24 2013-06-28 Selexis Sa Wysokowydajny transfer genu i ekspresja w komórkach ssaczych przez procedurę wielokrotnej transfekcji sekwencji regionu przylegania do macierzy
EP1694850B1 (en) * 2003-11-12 2011-06-29 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
AR046639A1 (es) 2003-11-21 2005-12-14 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti- igfr1
EP1812459B1 (en) * 2004-10-28 2011-03-30 Dobeel Co., Ltd. Method for the mass production of multimeric mannose binding lectin
KR20060096383A (ko) * 2005-03-04 2006-09-11 주식회사 셀트리온 １ 카피 이상의 ｍａｒ ｄｎａ 서열이 유전자의전사종결영역의 3′말단에 삽입된 동물세포 발현 벡터 및그를 이용한 외래 유전자의 발현 방법
KR100779761B1 (ko) * 2005-10-28 2007-11-30 대한민국 인슐린 억제 및 사람 ｉｄｅ 유전자로 형질전환된 동물 및그 제조방법
KR100836745B1 (ko) * 2007-01-31 2008-06-10 (주)두비엘 Ｈｂｖ 백신 및 그의 제조 방법
KR101258949B1 (ko) 2007-06-15 2013-04-30 재단법인 목암생명공학연구소 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
CN101348786B (zh) * 2007-07-20 2011-05-11 谭孟群 一种人β珠蛋白基因及其重组腺相关病毒载体
WO2009150456A1 (en) * 2008-06-10 2009-12-17 Isis Innovation Limited Protein expression
KR101054362B1 (ko) 2008-07-03 2011-08-05 재단법인 목암생명공학연구소 재조합 단백질의 푸코스 함량을 감소시키는 방법
US8137933B2 (en) 2008-11-12 2012-03-20 Schering Corporation Mammalian expression vector pUHAB
JP5688771B2 (ja) * 2009-03-27 2015-03-25 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅し高発現させる方法、および当該方法を実施するために用いられるキット
US20120231449A1 (en) * 2009-09-18 2012-09-13 Selexis S.A. Products and methods for enhanced transgene expression and processing
WO2011040285A1 (ja) * 2009-10-01 2011-04-07 Toto株式会社 Ｄｎａ構築物およびそれを用いた組み換えｃｈｏ細胞の製造方法
US20130034875A1 (en) * 2009-10-01 2013-02-07 Toto Ltd. Dna construct, and process for production of recombinant cho cell using same
KR101607734B1 (ko) 2010-10-08 2016-03-30 카딜라 핼쓰캐어 리미티드 재조합 단백질의 높은 레벨의 발현을 위한 발현 벡터
CN103492577B (zh) * 2011-03-30 2015-10-07 盼展生物技术有限公司 用于动物细胞的表达载体
US10175183B2 (en) 2011-03-31 2019-01-08 Kunimine Industries Co., Ltd. Agent for searching for protein crystallization conditions and method of searching for protein crystallization conditions
KR101420274B1 (ko) * 2011-06-13 2014-07-21 주식회사 종근당 Ｃｓｐ－ｂ ５＇ｓａｒ 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법
US8987422B2 (en) 2011-09-22 2015-03-24 Amgen Inc. CD27L antigen binding proteins
CN113896787A (zh) * 2011-12-22 2022-01-07 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
MX355625B (es) 2011-12-22 2018-04-25 Hoffmann La Roche Organizacion de vector de expresion, metodos novedosos de generacion de celulas de produccion y su uso para la produccion recombinante de polipeptidos.
AR091069A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Amgen Inc Proteinas de union a antigeno dirigidas contra el receptor st2
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9546203B2 (en) 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
CN103194455B (zh) * 2013-04-08 2014-10-15 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 高效表达的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因及其表达蛋白的用途
DK3456743T3 (da) 2013-05-30 2021-09-27 Kiniksa Pharmaceuticals Ltd Oncostatin m-receptorantigenbindingsproteiner
WO2015035231A1 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
JP6668241B2 (ja) 2013-09-05 2020-03-18 アムジエン・インコーポレーテツド 予測可能で、一貫性のある、且つ再現可能な糖型特性を示すＦｃ含有分子
KR101591823B1 (ko) 2013-12-27 2016-02-04 재단법인 목암생명공학연구소 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터
MX2017012966A (es) 2015-04-10 2018-06-06 Amgen Inc Muteinas de interleuquina 2 para la expansion de celulas t regulatorias.
WO2016164937A2 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of t-regulatory cells
CN107787332B (zh) 2015-04-24 2022-09-09 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗原结合蛋白
EP3353288A1 (en) 2015-09-22 2018-08-01 H. Hoffnabb-La Roche Ag Expression of fc-containing proteins
EP3359576A4 (en) 2015-10-08 2019-08-28 Zymeworks Inc. ANTIGENBINDING POLYPEPTIDE CONSTRUCTS WITH KAPPA AND LAMBDA LIGHT CHAINS AND USES THEREOF
PL3371206T3 (pl) 2015-11-02 2021-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby wytwarzania postaci fukozylowanej i niefukozylowanej białka
AU2017254106B2 (en) 2016-04-18 2024-07-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated with the acid alpha-glucosidase gene
WO2018150345A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 De Vita Bio Life Sciences An expression vector
MX2019015293A (es) 2017-06-30 2020-02-17 Zymeworks Inc Fab quimericos estabilizados.
CN110343718A (zh) * 2018-04-03 2019-10-18 新乡医学院 一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用
EP4013776A1 (en) 2019-08-13 2022-06-22 Amgen Inc. Interleukin-2 muteins for the expansion of t-regulatory cells
MX2022007712A (es) 2019-12-17 2022-09-26 Amgen Inc Agonista doble de interleucina-2/receptor de tnf para uso en terapia.

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4956288A (en) * 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5108901A (en) * 1988-09-02 1992-04-28 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
DE69331908T2 (de) 1992-10-05 2002-12-12 North Carolina State University, Raleigh Verfahren zur erhöhung der expression und zur verminderung der expressionsvariabilität von fremdgenen in pflanzenzellen
JP3901726B2 (ja) * 1993-04-02 2007-04-04 リジェル・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ウイルス複製の選択的不活性化のための方法
US5773695A (en) 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
WO1997046687A1 (en) * 1996-06-06 1997-12-11 Novartis Ag Vectors comprising sar elements
ES2238722T3 (es) 1996-06-11 2005-09-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotor central sintetico de plantas y elemento regulador aguas arriba.
US6245974B1 (en) 1997-08-06 2001-06-12 North Carolina State University Matrix attachment regions
KR100313559B1 (ko) * 1998-07-22 2002-03-08 허영섭 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주 및 전기세포주를 이용한 암치료 방법
WO2000018938A1 (en) * 1998-09-29 2000-04-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mar/sar elements flanking rsyn7-driven construct
EP1395669B1 (en) * 2001-01-26 2009-07-22 Selexis S.A. Matrix attachment regions and methods for use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002014525A2 (en) 2002-02-21
KR100408844B1 (ko) 2003-12-06
KR20020010327A (ko) 2002-02-04
AU2001278797A1 (en) 2002-02-25
US7422874B2 (en) 2008-09-09
CN1444657A (zh) 2003-09-24
WO2002014525A3 (en) 2003-11-20
JP4138479B2 (ja) 2008-08-27
ATE445704T1 (de) 2009-10-15
EP1392835B1 (en) 2009-10-14
EP1392835A2 (en) 2004-03-03
US20040038394A1 (en) 2004-02-26
JP2004506428A (ja) 2004-03-04
DE60140218D1 (de) 2009-11-26
EP1392835A4 (en) 2006-04-19
ES2333774T3 (es) 2010-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1262663C (zh) 用于动物细胞的表达载体
CN1196792C (zh) 新型的基于营养缺陷型互补的非抗生素筛选的大肠杆菌宿主/载体系统
CN1232644C (zh) 细胞内生基因活性化的优化方法
CN1280615A (zh) 通过载体构建体与细胞dna的非同源重组来表达内源基因
CN1416467A (zh) 锌指结构域及其鉴定方法
CN1454257A (zh) 重组凝血因子在人类细胞系中的生产
CN1639338A (zh) 修饰的Cry3A毒素及编码它的核酸序列
CN1796556A (zh) 控制基因表达
CN101035899A (zh) 通过改变CpG含量来调节基因表达的方法
CN1884556A (zh) 一种具有多重特异性抗癌机制的溶瘤腺病毒突变体
CN1286530C (zh) 通过基因治疗炎性细胞的自我调节的细胞凋亡
CN1509337A (zh) IFNα-17基因的新的多核苷酸和多肽
CN1384881A (zh) 非靶向活化内源基因的组合物和方法
CN1751065A (zh) 棉蚜(Aphis gossypii)抗性基因
CN1826350A (zh) 非糖基化人甲胎蛋白、制备方法及其应用
CN1602359A (zh) 靶向性载体的制备方法及其应用
CN1289523C (zh) 水稻钾、钠离子转运基因及其应用
CN1778918A (zh) 抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法
CN1170931C (zh) 血管发生相关分子
CN1222620C (zh) 新的启动子和使用该启动子的基因表达方法
CN1309830C (zh) 用作TNF－α信号传导途径抑制物的TRAF2变体
CN1708589A (zh) Cns中crh应答基因
JP4450438B2 (ja) タンパク質の増強された生産方法
CN1229493C (zh) 携带人原癌基因的哺乳动物癌细胞和转基因哺乳动物以及利用上述原癌基因的癌症诊断试剂盒
CN1157635A (zh) α-乳清蛋白基因构建物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: MOGAM BIOTECHNOLOGY RES INST; NEURAL SCIENCE & TEC

Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: MOGAM BIOTECHNOLOGY RES INST; PANZHAN BIOTECHNOLOGY LABORATORY CO., LTD.

CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Gyeonggi Do, South Korea

Co-patentee after: Neurotec Pharma, S. L.

Patentee after: Institute of animal science and technology

Address before: Gyeonggi Do, South Korea

Co-patentee before: Pan-Gen Biotech Laboratories Inc.

Patentee before: Institute of animal science and technology

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: PANZHAN BIOLOGY TECHNOLOGY CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SHENJING TECHNOLOGY PHARMACEUTICAL CO., LTD.

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: GYEONGGI-DO, SOUTH KOREA TO: YONGIN, GYEONGGI-DO, SOUTH KOREA

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20100823

Address after: South Korea Gyeonggi Do Yongin

Co-patentee after: Expect exhibition Bioisystech Co., Ltd

Patentee after: Mogam Biotechnology Research Institute

Address before: Gyeonggi Do, South Korea

Co-patentee before: Neurotec Pharma, S. L.

Patentee before: Mogam Biotechnology Research Institute

CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20060705

CX01 Expiry of patent term