KR100313559B1 - 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주 및 전기세포주를 이용한 암치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TGFβ 수용체 단백질의 세포외 영역("수용성 TGFβ 수용체")을 과다발현하는 재조합 세포주를 제조하고, 전기 세포주를 생체에 투여하여 수용성 TGFβ 수용체를 발현 및 분비시킴으로써, 종양세포로부터 분비되는 TGFβ에 의한 면역억제 및 종양유도 증폭효과를 차단하여 궁극적으로 종양의 성장 및 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 마우스 흉선종 세포주인 E14를 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켜 수용성 TGFβ 수용체를 과다발현, 분비하는 재조합 세포주를 제조하였다. 전기 재조합 세포주는 정상 El4 세포에 비하여 종양유도 능력이 현저히 저하되어 있으며, 전기 재조합 세포주를 세포분열 억제제로 처리한 다음 종양이 유도된 쥐에 투여하여 일시적으로 수용성 TGFβ 수용체를 공급한 결과, 종양형성이 효과적으로 억제되는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 암치료 방법을 이용함으로써 TGFβ를 다량분비하여 면역체계를 혼란시키는 여러가지 암세포들의 전이 및 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며, TGFβ가 관여하는 각종 병리현상도 완화시킬 수 있으리라 사료된다. 아울러, 본 발명의 암치료 방법에서는 TGFβ 수용체의 공급을 단기간만 지속할 수 있으므로, 부작용의 최소화 및 치료비용 절감 등의 장점을 제공한다.

Description

수용성 ＴＧＦβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주 및 전기 세포주를 이용한 암치료 방법
본 발명은 수용성 TGFβ(transforming growth factor-β, 이하 'TGFβ'라 약함) 수용체를 발현하는 재조합 세포주 및 전기 세포주를 이용한 암치료 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 TGFβ 수용체 단백질의 세포외 영역(extracellular domain)을 과다발현하는 재조합 세포주를 제조하고, 전기 세포주를 생체에 투여하여 TGFβ 수용체의 세포외 영역(이하, 편의상 "수용성 TGFβ 수용체"라 하기도 함)을 발현 및 분비시킴으로써, 종양세포로부터 분비되는 TGFβ에 의한 면역억제 및 종양유도 증폭효과를 차단하여 궁극적으로 종양의 성장 및 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다.
TGFβ는 부착성 성장형(anchorage dependent growth) 세포주인 쥐의 섬유아세포를 비부착성 성장형(anchorage independent growth)으로 가역화하는 인자, 즉 형질전환(transformation)을 유도하는 물질로 처음 알려졌다. 일반적으로 TGF는 정상세포를 종양화시키는 반면에, 정상세포의 증식을 강력하게 억제하는 작용도 한다. TGF는 α,β,γ2의3가지 아형이 보고되어 있으며, 그중 TGFβ는 비교적 안정된 단백질로서 세포표면에 존재하는 친화성 수용체와 결합하여 작용하는 특징이 있다. TGFβ가 면역시스템에 미치는 효과는 아직 체계적으로 설명되고 있지 않으나, IL-2에 의한 T 임파세포의 성장억제(참조: Kehrl et al., J. Exp. Med., 163:1037-1050, 1986; Fischer et al., Eur. J. Cancer, 30A:2125-2129, 1994), 싸이토카인 및 싸이토카인 수용체의 발현억제, 세포독성활성의 저해, Ts세포의 분화촉진, Th타입I 세포의 분화억제 및 MHC type Ⅱ의 발현억제(참조: Czarnieki et al., J. Immunol, 140:4217-4223, 1998)와 같이 주로 면역기능, 특히 세포면역성(cellular immunity)을 약화시키는 것으로 알려져 있다.
TGFβ가 대부분의 세포에 대하여 성장억제 활성을 가지므로, TGFβ는 정상적인 TGFβ 수용체를 발현하는 암세포에 대해서도 성장억제 활성을 가진다(참조: Twardzik et al., J. Natl. Cancer Institute, 81:1182-1185, 1989). 따라서, 종양세포는 자체의 TGFβ 수용체 발현을 억제함으로써 TGFβ에 의한 성장저해로부터 벗어나기도 하며(참조: Wang et al., J. Biol. Chem., 271:17366-17371, 1996; Capocasale et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:5501-5505, 1995), 뇌종양 및 유방암, 장암 등을 포함한 많은 종류의 암세포처럼 TGFβ 수용체 유전자 상의 돌연변이나 손실(참조: S. Markowitz et al., Science, 268:1336-1338, 1995; K. Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:8772-8776, 1994) 또는 신호전달 체계의 손상으로 인하여 TGFβ에 의한 성장억제 효과를 받지 않게 되기도 한다.
이와는 달리 많은 종류의 암세포가 TGFβ를 분비함으로써 종양 생성능력(tumorigenicity)을 증대시키기도 한다(참조: Arteaga et al., Cell Growth Differ., 4:193-201, 1993; Evelyn Barrack, The Prostate, 31:61-70, 1997). 특히, 뇌종양, 유방암, 위암, 대장암, 전립선암 및 폐암 등은 다량의 TGFβ를 분비하여 면역체계를 혼란시키는 것으로 알려져 있으며, 말기로 진행된 암세포주의 대부분이 자신은 TGFβ에 대한 성장억제 효과를 받지 않음과 동시에 TGFβ의 공급원이 됨으로써, 암세포 주위에 존재하는 면역 세포들의 성장 및 기능을 약화시켜 암세포 증식에 더 유리한 입장에 놓이게 한다(참조: Roszman et al., Immunology Today, 12:370-374, 1991).
한편, TGFβ에 의하여 성장저해를 받는 암세포주라 할지라도 생체내 조건(in vivo)에서 TGFβ의 발현이 종양발달에 더 유리하게 작용하기도 하는데, 이는 암세포주가 분비하는 TGFβ의 암세포 자신에 대한 성장저해 효과보다도 주위에 존재하는 면역세포에 대한 기능억제 및 세포간의 교류 증대 등에 의한 효과가 암세포 중식에 더 크기 때문인 것으로 추론되고 있다(참조: Chang et al., Cancer Res., 53:4391-4398, 1993). 실제로 TGFβ는 혈관형성, 세포의 부착성 및 침윤 등을 증대시켜 암세포주의 전이를 유도함이 보고되었다(참조: Ueki et al., Jpn. J. Cancer Res., 84:589-593, 1993; Mooradian et al., J. Natl. Cancer Institute, 84:523-527, 1992; Nakashio et al., Int. J. Cancer, 70:612-618, 1997; Steiner M.S. and E.R. Barrack, Mol. Endocrinol., 6:15-25, 1992).
상기와 같은 연구보고들은 TGFβ의 작용억제가 암의 치료로 연결될 수 있는 기능성을 제시하였으며, 실제로 TGFβ의 발현 및 분비, 확산을 방지하거나 기능을 억제하는 방법이 암치료에 상당히 효과적인 것으로 보고된 바 있다. 예를 들어, 뇌종양을 인위적으로 유도하고, 그로부터 5일째 되는 날 안티센스(antisense) TGFβ2유전자가 주입된 변형된 뇌종양 세포주를 투여한 결과, 종양억제 효과를 나타내었으며, 그 후 12주 후에 정상 종양세포를 재투여하여도 종양이 발생하지 않음이 관찰되었다(참조: Fakhrai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:2909-2914, 1996). 이러한 결과는 안티센스 TGFβ2를 발현하는 암세포를 조사(irradiation)시켜 투여함으로써 종양치료는 물론 종양 재발생 예방까지도 가능함을 시사하였다.
또한, 인간 유방암 세포주의 일종으로 타입 Ⅲ TGFβ 수용체가 적게 발현되는 MDA-MB-231 세포주에서 타입 Ⅲ TGFβ 수용체를 발현시킴으로써, 전기 암세포주로부터 분비되는 TGFβ1과 TGFβ2를 암세포 표면에 고정하여, TGFβ의 주위로의 확산을 억제하는 방법 역시 종양성장을 억제시키는 효과를 보였다(참조: L.Sun and C. Chen, J. Biol. Chem., 272:25367-25372, 1997). 한편, TGFβ와 상반되는 역할을 하는 것으로 알려진 인터루킨-2를 뮤린 사코마 EMT6(murine sarcoma EMT6)에 주입하여 발현시킨 경우, 종양 생성이 억제되었으며, 이는 IL-2에 의한 세포독성 임파세포(CTL)의 발달(development) 증대에 의한 효과임이 보고된 바 있다(참조: McAdam et al., J. Immunother., 5:155-164, 1991).
종래의 TGFβ를 목적으로 하는 암치료 방법은 TGFβ에 의해 마비된 면역체계의 복원에 치중한 경향이 있었다. 그러나, TGFβ는 종양의 성장 및 전이를 촉진시키는 역할 이외에도, HCV(hepatitis C virus) 환자의 혈액 및 간에서 다량 검출되어 만성 간염 및 간암으로의 진행에 주요 역할을 하는 것으로 제시된 바 있으며(참조: Kanto et al., J. Clin. Immunol., 17(6):462-471, 1997), 신장염(참조: Kagami et al., Exp. Cell. Res., 229(1):1-6, 1996; Zoja et al., Pediatr. Nephrol., 9(4):495-502, 1995) 및 페로니 병(Peyronie's disease, 참조: El-Sakka et al., J. Urol., 158(6):2284-2290, 1997)의 진행에도 관여하는 것으로 보인다. 따라서, 면역체계의 복원 뿐만 아니라, 이미 분비된 TGFβ와 결합하여 그 기능을 마비시킴으로써 과분비된 TGFβ에 의하여 파생되는 병리현상까지도 완화, 치료할 수 있는 방법이 요구되어 왔다. 이와 관련하여, TGFβ를 분비함으로써 대식세포에 의한 산화질소(nitric oxide) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α)의 분비를 억제하는 한편(참조: Maeda et al., Jpn. J. Cancer Res., 85:1137-1143, 1994), 세포면역성에 중요한 Th타입I 임파세포의 분화도 억제하는 것으로 알려진, 마우스 흉선종(mouse thymoma)으로부터 유래된 E14 세포주로 종양을 유도한 쥐에 항-TGFβ 항체를 동시에 투여할 경우, 대식세포의 기능저해와 Th타입I 임파세포로의 전환이 억제된다는 연구결과가 보고된 바 있다. 따라서, 암세포주에서 TGFβ 수용체의 세포외 영역만을 수용성 단백질의 형태로 발현시키면, 항-TGFβ 항체와 유사한 원리로 암세포로부터 분비되는 TGFβ를 효과적으로 차단하여, TGFβ를 분비함으로써 면역을 억제하고 종양유도 능력을 증대시키는 암세포주들에 의한 종양 및 TGFβ에 의하여 유도되는 여러가지 병리현상들을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있을 것으로 예상되었다.
이에, 본 발명자들은 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 세포주 및 그를 이용한 암치료 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 재조합 수용성 TGFβ 수용체, 즉 TGFβ 수용체의 세포외 영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하고, 전기 재조합 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 재조합 세포주를 제조하는데 성공하였다. 이어서, 전기 재조합 세포주를 쥐에 투여하여 수용성 TGFβ 수용체를 발현, 분비시킴으로써 암세포의 종양유도 능력을 현저히 저하시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 수용성 TGFβ 수용체 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 재조합 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 재조합 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 재조합 세포주를 이용한 암치료방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 네오마이신 저항성 유전자를 포함하는 MFG-유래의 재조합 레트로바이러스 벡터 MFG/neo의 유전자 지도이다.
도 1b는 수용성 TGFβ 수용체 유전자 및 네오마이신 저항성 유전자를 포함하는 MFG-유래의 재조합 레트로바이러스 벡터 MFG/Ts.neo의 유전자 지도이다.
도 2a는 El4/TS.NEO 재조합 세포주에서 전기 재조합 레트로바이러스 벡터가 게노믹 유전자 내로 삽입되었음을 PCR로 확인한 결과를 보여주는 젤 사진이다.
도 2b는 전기 El4/TS.NEO 재조합 세포주가 수용성 TGFβ 수용체를 발현함을 보여주는 세포침전물에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 2c는 전기 El4/TS.NEO 재조합 세포주가 수용성 TGFβ 수용체를 세포외로 분비함을 보여주는 세포배양액에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 3은 수용성 TGFβ 수용체의 발현 및 분비가 암세포에 의한 종양유도를 저해함을 보여주는 그래프이다.
본 발명자들은 마우스 흉선종(thymoma) 세포주인 E14를 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 레트로바이러스 벡터로 형질도입(transduction)시켜 수용성 TGFβ 수용체를 과다발현, 분비하는 재조합 세포주를 제조하였다. 전기 재조합 세포주와 형질도입되지 않은 정상 E14 세포를 각각 쥐에 투여하고, 종양유도 능력을 조사한 결과, 전기 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주의 경우 종양유도 능력이 현저히 저하되어 있음이 확인되었다. 또한, 쥐에 정상 El4 세포를 투여하여 종양을 유도하면서, 세포분열 억제제인 미토마이신 C로 처리된 전기 재조합 세포주를 동시에 투여하여 일시적으로 수용성 TGFβ 수용체를 공급한 결과, 정상 El4 세포에 의한 종양형성이 효과적으로 억제되었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다.
본 발명자들은 먼저 재조합 수용성 TGFβ 수용체 즉, TGFβ 수용체의 세포외 영역(아미노산 1부터 159까지)을 발현하는 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 전기 레트로바이러스 벡터를 포장세포주에 트랜스펙션시켜 레트로바이러스를 형성시킨 다음, 전기 레트로바이러스로 마우스 흉선종(thymoma) 세포주인 E14를 감염시켰다. G418을 이용하여 전기 레트로바이러스 유전자로 형질도입된 E14 세포주를 선별하고, 게노믹 PCR 및 웨스턴 블랏팅으로 재조합 수용성 TGFβ 수용체 유전자의 게노믹 유전자내로의 삽입 및 발현을 확인하였다. 전기 재조합 세포주는 약 28 내지 33 kDa의 다양한 정도로 글리코실화된 TGFβ 수용체를 발현, 분비하는데, 이는 재조합 El4 세포 자신의 종양유도 능력을 현저히 저하시키는 것으로 확인되었다. 한편, 전기 재조합 El4 세포의 종양유도 능력 저하가 세포의 변형 또는 세포성장 속도의 변화에 기인하는 것이 아님은, TGFβ 수용체 유전자가 결여된 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 재조합 El4 세포에 의한 종양유도 실험 및 세포성장 실험에 의하여 확인되었다. 또한, 쥐에서 E14 세포로 종양을 유도하면서, 세포분열 억제제인 미토마이신 C를 처리한 전기 재조합 세포주를 동시에 투여하여 수용성 TGFβ 수용체를 일시적으로 공급하여 준 결과, 정상적인 E14 세포에 의한 종양발생을 억제하는 효과를 보였다. 이러한 결과는 전기 재조합 세포주로부터 분비되는 수용성 TGFβ 수용체가 종양세포의 종양유도 능력(tumorigenicity)을 저하시켜, 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있음을 제시하였다,
한편, 본 발명의 바람직한 일실시예에서는 종양유도의 편의를 위하여, 마우스 흉선종 세포주인 El4 세포주를 모주로 하여 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주를 제조하였으나, 본 발명의 재조합 세포주의 모주로서 선택되는 세포주의 종류는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 수용성 TGFβ 수용체 발현벡터의 제조
pCEP 벡터(참조: Herbert Y., et al., Cell, 68:775-785, 1992)로부터 타입Ⅱ 인간 TGFβ 수용체의 세포외 영역(extracellular domain, 1-159 amino acids)을 코딩하는 유전자 절편을 PCR로 증폭시키고, 전기 유전자 졀편을 미합중국 종균협회(ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 입수한 MFG 레트로바이러스벡터(ATCC 68754)의 NcoI/BamHl 위치에 삽입하고, 네오마이신 저항성 유전자가 수용성 TGFβ 수용체와 IRES(internal ribosomal entry site)로 연결되도록 조작하여, TGFβ 수용체 유전자(TβRs)와 네오마이신 저항성 유전자(Neor)가 MFG LTR의 통제하에서 바이시스트로닉(bicistronic)하게 전사되는 MFG/Ts.neo 벡터를 제조하였다(참조: 도 1b). 한편, TGFβ 수용체를 발현하지 않는 대조군 벡터로서 네오마이신 저항성 유전자(Neor)만을 포함하는 MFG/neo 벡터를 제조하였다(참조: 도 1a).
실시예 2: 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주의 제조
실시예 2-1: 재조합 유전자의 삽입 확인: 게노믹 PCR
상기 실시예 1로부터 수득한 MFG/Ts.neo와 MFG/neo 벡터를 각각 패키징 세포주인 BOSC에 트랜스펙션시키고, 24 내지 48 시간 동안 배양한 다음, 재조합 바이러스를 함유하고 있는 배양상등액을 0.45um 필터로 여과하여, 마우스 흉선종(mouse thymoma) 세포주인 E14 세포를 감염시키는데 사용하였다. 전기 감염된 El4 세포를 G418이 800 ug/ml의 농도로 함유된 배지에서 약 10 내지 14일 간에 걸쳐 배양하면서 형질도입된 세포를 선별하고, 전기 선별된 세포로부터 게노믹 DNA를 추출하여 PCR로 레트로바이러스 유전자의 El4 세포 게노믹 유전자 내로의 삽입(integration) 여부를 확인하였다. 그 결과, 예상한 바대로 MFG/Ts.neo로 형질도입된 클론에서 수용성 TGFβ 수용체를 코딩하는 약 0.45kb 크기의 유전자 절편이 확인되었으며(참조: 도 2a), 정상 E14 및 MFG/neo로 형질도입된 클론에서는 전기 절편이 발견되지 않았다. 도 2a에서, Ts1, Ts2 및 Ts3는 모두 MFG/Ts.neo로 형질도입된 클론을 나타내며, El4는 재조합 벡터로 형질도입되지 않은 정상 El4 세포를 나타낸다. 한편, 0.8kb 크기의 네오마이신 유전자는 MFG/Ts.neo로 형질도입된 클론과 MFG/neo로 형질도입된 클론 모두의 게노믹 DNA에서 발견되었다. 이에, 본 발명자들은 전기 MFG/neo로 형질도입된 클론은 'E14/NEO'로, MFG/Ts.neo로 형질도입된 클론은 'E14/TS.NEO'라 명명하고, 1998년 5월 14일자로 국제기탁기관인 재단법인 한국세포주연구재단(KCLRF, 대한민국 서울 종로구 연건동 28 소재)에 각각 기탁번호 KCLRF-BP-00016과 KCLRF-BP-00017로 기탁하였다.
실시예 2-2: 수용성 TGFβ 수용체의 발현 및 분비 확인: 웨스턴 블랏팅
전기 실시예 2-1로부터 수득한 E14/TS.NEO 세포주의 세포 배양액과 세포침전물로부터, TGFβ 수용체의 발현 및 분비를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 이때, 세포배양액은 배양액 부피의 5배에 해당하는 아세톤을 가하고 -20℃에서 30분간 방치한 다음, 원심분리하여 단백질 침전물을 수득하고, 이를 PBS에 현탁시켜 사용하였다. 그 결과, 세포침전물에서는 약 20 내지 30 kDa의 재조합 TGFβ 수용체가, 그리고 세포배양액에서는 약 28 내지 33 kDa의 좀더 완성된 형태 즉, 다양한 정도로 글리코실화된 형태의 재조합 TGFβ 수용체가 발현되는 것이 확인되었다(참조: 도 2b 및 도 2c). 도 2b에서, Ts5ng은 정제된 수용성 TGFβ 수용체 5ng을 로딩한 결과를 나타내고; El4는 형질도입 되지않은 정상 El4 세포의 세포침전물을 로딩한 결과를 나타내며; E14/TS.NEO는 E14/TS.NEO 세포의 세포침전물을 로딩한 결과를 나타낸다. 한편, 도 2c에서, Ts50ng은 정제된 수용성 TGFβ 수용체 50ng을 로딩한 결과를 나타내고; El4는 형질도입 되지않은 정상 El4 세포의 세포배양액을 로딩한 결과를 나타내며; El4/NEO는 El4/NEO 세포의 세포배양액을 로딩한 결과를 나타내고; E14/TS.NEO는 E14/TS.NEO 세포의 세포배양액을 로딩한 결과를 나타낸다.
실시예 3: 재조합 세포주의 종양유도 능력 조사
E14 및 E14/TS.NEO 세포를 각각 1x104또는 5x104개씩 C57BL/6 쥐에 투여하고, E14를 투여한 대조구가 사망할 때까지 종양형성 여부를 관찰하였다. 그 결과, 1x104개의 세포를 투여한 그룹 중에서 E14를 투여한 쥐는 종양 투여 후 7 내지 10일 경부터 종양이 형성되기 시작하여, 4주째를 전후로 하여 모두 사망한데 비하여, E14/TS.NEO를 투여한 쥐는 4마리 중 한 마리에서만 종양이 유도되었으나 종양의 크기나 진행 속도가 전기 E14를 투여한 쥐보다 훨씬 작고 느린 경향을 보였다(참조: 도 3). 도 3에서, ▲와 ●는 1x104개의 E14 세포를 투여한 쥐를 나타내고; △는 1x104개의 E14/TS.NEO 세포를 투여한 쥐 중에서 종양이 유도된 쥐를 나타내며; ○는 1x104개의 E14/TS.NEO 세포를 투여한 쥐 중에서 종양이 유도되지 않은 쥐를 나타낸다. 한편, 5x104개의 세포를 투여한 그룹에서도 E14/TS.NEO를 투여한 쥐는 종양이 유도되지 않았다. 이와 같이, E14와 수용성 TGFβ 수용체를 분비하도록 변형된 E14/TS.NEO의 종양유도 능력을 비교해 볼 때, E14가 투여된 쥐는 100%의 종양유도율을 보였으나, E14/TS.NEO가 투여된 쥐는 0 내지 25%의 종양유도율을 보였다.
수용성 TGFβ 수용체 발현에 의한 종양유도 능력의 저하
투여된 암세포 종양 발생 빈도수
1 x 104 a 5 x 104 a
E14 2/2 3/3
E14/Ts.neo 1/4 0/6
a: 투여된 암세포의 갯수
비교실시예 1: 종양유도 실험 및 세포성장 실험
전기 E14/TS.NEO의 저하된 종양유도 능력이 유전자 조작으로 인한 암세포의 변형 때문인지 여부를 확인하기 위하여, E14와 E14/NEO를 사용하여 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 종양유도 실험을 수행하였다. 그 결과, E14/NEO는 유전자 조작을 하지않은 E14와 차이없이 종양을 유도하였으므로, TGFβ 수용체 발현에 의한 종양성장 억제효과는 유전자 조작으로 인한 암세포의 변형때문은 아님을 확인하였다.
한편, E14, E14/NEO 및 E14/TS.NEO는 실험실적 조건에서 배양하였을 때 모두 동일한 성장속도를 보인 바, E14/TS.NEO의 종양유도 능력 저하는 암세포의 성장속도에 기인한 것이 아님이 입증되었다.
실시예 4: 수용성 TGFβ 수용체에 의한 종양유도 억제효과
수용성 TGFβ 수용체의 종양유도 억제능력(tumor regression)을 조사하기 위하여, C57BL/6 쥐에 1x104개의 E14 세포를 투여하여 종양을 유도하면서, 세포분열 억제제인 미토마이신 C로 처리된 El4/NEO 또는 El4/TS.NEO 세포를 동시에 투여하였다. 즉, 1x107세포/ml 농도의 E14/NEO 및 E14/TS.NEO 세포배양액에 미토마이신 씨(mitomycin C)를 50 ug/ml의 농도로 처리하고 37℃에서 30분간 배양한 다음, 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지로 두 번, PBS로 한 번 세척하고 세포를 수득하였다. 전기 미토마이신 C로 처리된 세포를 1x106개씩 E14 종양세포 투여일부터 투여하기 시작하여 주당 2회, 3 내지 4일 간격으로 2주간 투여하였다. 약 1달에 걸쳐 종양의 진행상태를 관찰한 결과, 하기 표 2에서 보듯이, E14/NEO를 투여한 쥐에서는 종양이 100% 형성된 데 비하여, E14/TS.NEO를 투여한 쥐에서는 종양발생율이 40%에 그쳤다. 이와 같은 결과는 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주가 암세포에 의한 종양유도를 효과적으로 억제할 수 있음을 제시하였다.
수용성 TGFβ 수용체에 의한 종양유도 억제효과
투여된 암세포a 종양 발생 빈도수
14일b 22일b 34일b
E14/neo 1/5 5/5 5/5
E14/Ts.neo (clone) 0/5 1/5 2/5
a: 모든 쥐는 1x104개의 E14 세포를 투여한 다음, 상기 미토마이신 C로 처리하여 변 형된 재조합 E14 세포를 투여하였다.
b: 종양유도 후의 경과일 수
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주를 이용한 암치료 방법에 관한 것이다. 수용성 TGFβ 수용체는 종양의 전이 및 성장을 효과적으로 억제하므로, 본 발명의 암치료 방법을 이용함으로써 TGFβ를 다량분비하여 면역체계를 혼란시키는 것으로 알려져 있는 뇌암, 유방암, 위암, 대장암, 전립선암 및 폐암 세포 등의 전이 및 성장을 효과적으로 억제할 수 있으며, 암 이외에도 TGFβ에 의하여 야기되는 각종 병리현상, 예를 들면, HCV 감염에 의하여 유발된 간의 병리화, 신장염의 진행 등을 완화시킬 수 있으리라 사료된다. 아울러, 본 발명의 암치료 방법에서는 재조합 세포주에 의한 TGFβ 수용체의 공급을 단기간만 지속할 수 있으므로, 부작용의 최소화 및 치료비용의 절감 등의 장점을 제공한다.

Claims (6)

  1. TGFβ 수용체의 세포외 영역(아미노산 1부터 159까지)을 코딩하는 유전자 및 네오마이신 저항성 유전자를 포함하며 다음과 같은 유전자 지도를 가지는 MFG-유래 레트로바이러스 벡터 MFG/Ts.neo:
  2. 제 1항의 레트로바이러스 벡터 MFG/Ts.neo로 형질도입된 El4-유래 재조합 세포주 E14/TS.NEO(KCLRF-BP-00017).
  3. 수용성 TGFβ 수용체를 발현하는 재조합 세포주를 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 암치료 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    재조합 세포주는 E14/TS.NEO(KCLRF-BP-00017)인 것을 특징으로 하는
    암치료 방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    재조합 세포주는 세포분열 억제제로 처리된 것을 특징으로 하는
    암치료 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    세포분열 억제제는 미토마이신 C(mitomycin C)인 것을 특징으로 하는
    암치료 방법.
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