JP4450438B2 - タンパク質の増強された生産方法 - Google Patents

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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的には、遺伝子工学技術で作製された哺乳類細胞系から生物学的に活性のあるタンパク質を生産することに関する。具体的には、本発明は、CMVプロモーターのすぐ下流でかつタンパク質コーディング配列の上流にある、エプスタイン−バールウイルス由来の5’−イントロン配列(5’−IS)のMISを含んでいる新規な発現ベクターに関する。
【0002】
【従来の技術】
遺伝子増幅は、哺乳類細胞におけるタンパク質生産を増大するために最も一般的に用いられる方法である。目的のタンパク質コーディング配列の増幅のためには、通常、そのタンパク質をコードしている機能的転写単位を増幅マーカーに共有結合的に連結する。次に、転写単位及び増幅マーカーを含んでなる発現ベクターを適切な細胞にトランスフェクトし、続いて付随する選択を可能とする薬剤を用いて増幅する。
【0003】
最も広く用いられる遺伝子増幅方法は、メトトレキサート(MTX)の増加する濃度を用いてジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)を欠失したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞と共にdhfr発現ベクターを使用することを含む(Kellems、Curr.Opin.Biotechnol.2:723−729、1991)。組織プラスミノーゲンアクチベータ、エリスロポエチン及び因子VIIIを初めとする多数の商業価値のあるタンパク質がこの方法により生産されている(Kaufmanへの米国特許第4,740,461号及びKaufman等、Mol.Cell.Biol.5:1750−1759、1985を参照)。この方法は、通例、内在性dhfr遺伝子の存在のために、dhfrを欠失していない細胞宿主には拡張されていない。
【0004】
しかしながら、dhfr陽性の細胞宿主を治療タンパク質を発現するために用いた成功例も報告されている。米国特許第4,965,199号(Wood等、1990)には、dhfr陽性のベイビーハムスター腎臓細胞(BHK−21細胞)での因子VIIIの生産方法が記述されている。この方法は、(i)dhfr配列に連結した因子VIIIをコードするDNA配列及びネオマイシン耐性を与える選択マーカーで宿主細胞を同時トランスフェクションし、(ii)G418を含んでいる選択培地でトランスフェクションされたものを選択し、そして(iii)メトトレキサート(MTX)の増加する量を含んでいる培地中でG418耐性細胞を増幅することを含む。
【0005】
Walls等(Gene、81:139−149、1989)は、ヒト胚腎臓細胞で機能的プロテインCを発現するためにdhfr/MTX同時増幅方法を使用することに関して報告している。Okamoto等(Biotechnol.、8:550−553、1990)も、ヒトリンパ球様細胞における顆粒球刺激因子(GM−CSF)の増幅及び発現を記述している。
【0006】
組み換えDNA技術の最近の進歩にもかかわらず、因子VIIIの高い生産性を有する組み換え細胞クローンの誘導は依然として困難なままである。Gorman(1987年9月17日に開示された欧州特許出願公開第0260148号、引用することにより本明細書の内容となる)は、プロモーターの下流でかつ因子VIIIをコードしているDNAの上流に安定化配列(CISと表示されるイントロン配列)を有する発現ベクター(pCIS−F8)の構築を記述している。このベクターは、サイトメガロウイルス(CMV)のプロモーター及びエンハンサー、因子VIIIをコードしているDNA及び3’転写終結配列で構築された。この安定化配列が存在しないと、因子VIIIの発現は試験したどの細胞型にも見られなかった。この安定化配列は、プロレラキシンをコードしているDNA配列にも連結された。一時的(transient)トランスフェクションアッセイにおける両タンパク質の分泌は、安定化配列の存在に依存した。
【0007】
Stolzenburg等(Chromosoma、103:209−214、1994)は、muNTS2の180bp相同領域が哺乳類細胞における増幅促進活性のために必須であることを述べた。しかしながら、この配列を用いた安定な遺伝子発現は認められなかった。
【0008】
【発明の構成】
本発明者は、利用できる技術を用いて構築された新規な発現ベクターを用いることにより、タンパク質発現を著しく増加することが可能であることを見いだした。ベクターの詳細並びにその作製及び使用方法を以下に記述する。
【0009】
本明細書に記述された発現ベクターは、CMVのプロモーター及びエンハンサー、2個の同一なドナー部位及びそれに続く単一のアクセプター部位を含んでいるイントロン配列、レポーター遺伝子を挿入するための唯一の制限酵素部位(HpaI)並びにポリ−A領域、それに続く選択マーカー及びプラスミドバックボーンを含んでなる。好ましい態様において、イントロン配列はエプスタイン−バールウイルス由来であり、MISと表示される。このベクターをpSM97と称する。このベクターは、レポーター遺伝子、すなわち、所望する適切なDNAコーディング配列を哺乳類細胞に導入して、これらの細胞によるタンパク質発現を増加し、そして長期間の培養におけるタンパク質の発現を安定化するために用いられる。一つの好ましい態様において、レポーター遺伝子の配列は可溶性tICAM−1(453)(Grove等、J.Virol.65:6015−6023、1991を参照)をコードする。得られたベクターは、pSM98である。
【0010】
上流(5’)イントロン配列、例えば、MISを含んでいる発現ベクターは、5’−ISを含まないベクターの増幅と比較した場合、意外にも、dhfr/MTX系で発現ベクターの増大した増幅を示した。ベクターの効率よい増幅により、レポーター遺伝子産物、例えば、可溶性tICAM−1(453)をより多量に安定に発現できた。
【0011】
好ましい増幅マーカーは、グルタミンシンテターゼ(GS)及び多剤耐性遺伝子(mdr)のような他のマーカーを代用することができるけれども、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)である。トランスフェクトする細胞宿主はあらゆる哺乳類細胞であることができ、そしてdhfr欠失である必要はない。染色体DNAに選択遺伝子を組み込むことが知られている細胞系が最も望ましく、例えば、ヒト胚腎臓(293S)、ヒトB−細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、ベイビーハムスター腎臓(BHK−21)及びマウス骨髄腫細胞系である。
【0012】
5’−ISを含むまたは含まないベクターでトランスフェクトした細胞からのtICAM−1(453)の分泌は、一時的トランスフェクションアッセイ及び増幅工程の間の初期でさえほとんど同じであった。しかしながら、ベクターpSM98から誘導された(MTXを用いた遺伝子増幅後の)個々のクローンからのtICAM−1(453)分泌は、5’−IS配列を欠くベクターpSH92から誘導されたクローンのものより多量でかつ安定であった。多量に分泌する細胞系は、5’−ISを含むベクターからのtICAM−1(453)コーディング配列のより多い(サザン分析から概算された、細胞当たり20コピーより多い)組み込まれたベクターコピー数を保有していた。一方、5’−ISを含んでいないベクター由来の細胞系は、長期間の培養で不安定であり、tICAM−1(453)のより少ない組み込まれたベクターコピー数を保有していた(サザン分析から概算された、細胞当たり2、3コピー)。従って、5’−ISを含んでいるベクターを用いて、トランスフェクトされた哺乳類細胞系の生産性を高め、かつ安定化することができる。
【0013】
【好適な態様の記述】
発現ベクターの構築
エプスタイン−バールウイルス(EBV)のBMLF1と命名された読み枠からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりMIS配列を作製した。このMIS配列は、B95−8 EBVの84,122から84,227までのイントロン配列を含んでいるB95−8エプスタイン−バールウイルスの84,105から84,262までのDNA配列を包含している(Farrell、Advances in Viral Oncology、第8巻、G.Klein編集、Raven Press、Ltd.、New York、1989;ジーンバンク登録番号X00784)。2個のプライマー(5’GGATCGATAACTAGCAGCATTTCCT3’(配列番号2)及び(5’GGGTTAACTTCCAGAATGTGGCTCT3’(配列番号3))は、指向性クローニングのためにフラグメント(MIS)のそれぞれ5’及び3’末端にClaI(ATCGAT)及びHpaI(GTTAAC)配列の伸長した制限酵素部位を有する。PCR増幅には、AmpliTaq DNAポリメラーゼキット(PerkinElmer Cetus #N8008−0070)に記述されたプロトコルを用い、DNAサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus #N801−0150)で反応を行った。PCR反応混合物中のMgCl2濃度は1.5mMから4.0mMまでで変えた。鋳型DNAの変性は95℃で10分間行った。95℃で1分間の最初の融解工程で増幅サイクルを開始し、次に60℃で1分間のアニーリング工程及び72℃で1分間の伸長工程を続けた。このサイクルを30回繰り返し、そして反応を停止し、4℃で一晩保持した。PCR増幅したフラグメントをHpaI及びClaIで消化し、次に(因子VIII配列をまず除去した後に)pCIS−F8のClaI及びHpaI部位に挿入した。得られたMISを含むプラスミドをpSM95と称した。図2参照。このMIS配列は、ドナー部位を含む71bp配列の予期しない反復を含むことによって、元のEBV配列と異なる。従って、MIS配列(229bp)は、2個のドナー部位及び1個のアクセプター部位を有する(図1参照)。
【0014】
次に、SacII及びClaI消化によりpSM95からイントロン配列CISを除去した。残ったバックボーンをKlenowで平滑末端にし、再連結した。この得られたプラスミドpSM97は、ori及びampr遺伝子を含んでいるプラスミドバックボーンに、CMVプロモーター/エンハンサー(CMVe/p)、MIS、クローニングのための唯一のHpaI部位、ポリAシグナル及びSV40初期プロモーター−dhfrからなる。pHRR8−2(Greve、J.M.等、J.Virol.65:6015−6023、1991)からHindIII及びXbaIでの消化により調製したtICAM−1(453)コーディング配列を平滑末端にし、pSM97のHpaI部位に挿入した。pSM97中のtICAM−1(453)の正しい方向のものをpSM98と称した(図2)。pSH92は、MIS配列を欠いていることを除いてpSM98と同じである(図3)。プラスミドDNAは、Molecular Cloning(Maniatis等による編集、86−94、1982)に記述された方法により調製した。
【0015】
tICAM1(453)を測定するためのELISAアッセイ
ICAM−1に対するモノクローナル抗体C92.5(McClelland等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7993−7997、1991)を丸底マイクロタイタープレートに吸着させた。1% BSAを含んでいるPBSの溶液での処理によりこれらのプレートをブロックし、次にtICAM−1(453)を含んでいるサンプルとインキュベートした。次に、プレートを洗浄バッファー(PBS及び0.005% Tween20)で洗浄し、ビオチン化したtICAM−1(453)の異なるエピトープに対する第二のモノクローナル抗体C78.5(McClelland等、1991、上記)とインキュベートした。洗浄後、これらのプレートをHRP−ストレプトアビジンとインキュベートした。次に、プレートを洗浄バッファーで洗浄し、テトラメチルベンジジン(TMB)と反応させ、そして1N HClで反応を停止した。450/570nmでODを読み取り、そして精製したtICAM−1(453)の標準曲線と比較することにより、tICAM−1(453)濃度を測定した。
【0016】
発現ベクターを試験するための一時的トランスフェクションアッセイ
発現ベクターの生物学的活性を試験するために、ベクターpSH92及びpSM98で293S細胞をトランスフェクトした。各実験で、Life Technologiesから提供されたプロトコルに従って陽イオン性リポソームDMRIE−C(Life Technologies、#10459−014)とプレインキュベートした3μgの各ベクターDNAと同数の細胞(〜2x106細胞/ウェル)を混合した。ベクターDNA濃度をDNA蛍光光度計(Hoefer Science Instruments、Model TKO 100)を用いて注意深く測定し、そしてアガロースゲルで確認した。DNA及びDMRIE−Cのカクテル(1ml)と細胞を5時間インキュベーションした後、5%FBSを補足した新しい培地をウェルに加えた。トランスフェクション後2ないし3日目に細胞数を数えた。tICAM−1(453)分泌のレベルをELISAにより測定した。繰り返した一時的トランスフェクションアッセイから、我々は、(5’−イントロン配列(5’−IS)を含むまたは含まない)2種の異なるベクターでトランスフェクトした293S集団にtICAM−1(453)分泌の明らかな違いがないことを認めた。表1参照。これらの結果は、pSM98中の5’−ISが一時的トランスフェクションアッセイにおけるtICAM−1(453)の発現に対して直接的な影響を及ぼさないことを示す。この結果は、一時的トランスフェクションアッセイにおいてある種のタンパク質の発現に対して安定化効果を示したGormanの特許と異なる。
【0017】
【表1】
Figure 0004450438
【0018】
表1. 5’−ISを含む及び含まない発現ベクターpSM98及びpSH92をそれぞれ用いた一時的トランスフェクションアッセイにおけるtICAM−1(453)発現の比較
主として、Transfector 300(BTX)セットを715V/cm及び300μFで用いたエレクトロポレーションで、5−10 x 106細胞を10μgの発現ベクターpSH92及びpSM98でトランスフェクションすることにより生産細胞系を樹立した。トランスフェクトした細胞を6ウェル(ウェル当たり3ml)型で10%ウシ胎児血清(FBS)を補足した培地18ml中で培養した。トランスフェクション後2ないし3日目に、トランスフェクション効率を調べるためにELISAアッセイを行った。10%の透析したFBSを補足した、ダルベッコの修正イーグル培地並びにヒポキサンチン及びチミジンを欠いた栄養混合物F−12(1:1)からなるメトトレキサート(50nM)を含んでいる選択培地で96ウェル型(200μl/ウェル)当たり約106細胞を培養した。このメトトレキサートを含んでいる選択培地をMTX−SMと呼んだ。各ウェルの培地の半分(100μl)を新しいMTX−SMと毎週交換した。
【0019】
tICAM−1(453)の生産性をトランスフェクション後3週目に96ウェルプレートからELISAにより測定した。96ウェル型の最も高いシグナルのウェルの細胞を6ウェル型に移した。生産性を繰り返して測定した後、発現ベクターを増幅するために、通常4−6集団の最もよく分泌している最初の集団を増加する濃度のMTX(50、100及び200nM)でさらに処理した。単一の細胞クローンを得るために、100nM及び200nM MTXの段階で96ウェル型(0.5−2細胞/ウェル)を用いて限界希釈クローニング(LDC)に付した。細胞を接種した後1週及び2週目に、各ウェルの単一細胞増殖を調べるために96ウェルプレートを顕微鏡下で試験した。LDCの間及びその後、MTXは選択培地から除かれたが、10%の透析したFBSは含まれた。接種後約2週目にELISAにより生産性を測定した。単一細胞から増殖した最も多量に分泌しているウェルの細胞を6ウェル型に移し、そして最も高いレベルのtICAM−1(453)を分泌するクローンを選択するために比生産性(pg/細胞/日)を繰り返し測定した。最もよいクローン(4−6クローン)の無血清培地への適応をT75組織培養瓶を用いて培養培地中の血清含有量を徐々に減少することにより行った。高い生産性を示すクローンを誘導する工程の要約の図4を参照。我々は、pSH92から誘導されたクローンが増加した増幅工程を通して生産不安定性を示すことを認めた。
【0020】
tICAM−1(453)分泌クローン中の組み込まれたゲノムコピー数
ポリメラーゼ連鎖反応により調製したtICAM−1(453)コーディング配列のフラグメント(663bp)をプローブとするサザンブロットハイブリダイゼーションから、細胞当たりの組み込まれたベクターコピー数を測定した。個々のクローンから調製された細胞DNAを用いて、基本的にSouthern(J.Mol.Biol.、98:503−517、1975)及びWahl等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76:3683−3687、1979)に従って、Amershamのプロトコルに記述されたようにサザン分析を行った。全細胞DNAを調製するために、対数増殖期の細胞を集め、リン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄した。このペレットを少量のPBS/溶解バッファー(2:1)に再懸濁した。溶解バッファーは3%サルコシル、75mMTris、pH 8及び25mM EDTAからなった。DNaseを含まないRNase(100μg/mlの最終濃度)と37℃で60分間インキュベーションした後、プロテイナーゼK(200μg/mlの最終濃度)を加え、50℃で一晩インキュベーションを続けた。0.1M Tris、pH 8で飽和したフェノールを等量加え、この懸濁液を穏やかに混合した。遠心分離後、DNAを含んでいる水相を有機相から分離した。きれいな中間相が見られるまでフェノール処理を繰り返し、続いてクロロホルムで同様に抽出した(2ないし3回)。2容量の冷えた無水エタノールを加え、そしてゆっくりと混合することにより、水相中のDNAを沈殿させた。白色の沈殿したDNAを封緘したパスツールピペットを用いて巻きつけた。アルコールを完全に乾燥した後、DNAを少量の10mMTris、pH 8、1mM EDTAに再懸濁した。260及び280nmで吸収を測定することによりDNA濃度を決定した。
【0021】
組み込まれたゲノムコピー数を測定するために、細胞当たり1、5、20及び50ゲノムに等しいEcoRI消化したpSM98 DNAを細胞DNAと一緒にゲルに添加した。細胞当たり2−3コピーに等しい内在性ICAM−1遺伝子由来の4.4kbの内部コントロールは、少ないコピー数(半数分裂の3倍体(haplotriploid)の染色体数を有する293S細胞の場合、3コピー)を測定するための優れた対照となった。サザン分析で検出されたtICAM−1(453)コーディング配列の大きさは、EcoRIで発現ベクターを消化した後、完全なCMVエンハンサー/プロモーター、MIS及び完全なtICAM−1(453)コーディング配列を含んでいる2.3kbであった。ベクターpSH92から誘導されたクローンの大部分において細胞当たりの組み込まれたtICAM−1(453)(2.3kbの大きさ)コーディング配列のコピー数は、293Sクローンの細胞当たりの内在性ICAM−1(4.4kbの大きさ)のコピー数と同等であった(図5及び6)。しかしながら、pSM98でトランスフェクトした293S及びCHO細胞から誘導されたクローンは、細胞当たりより多数の組み込まれたベクターコピー数(20−40)を保有した(図6、図7)。
【0022】
比生産性及び細胞当たりの組み込まれたベクターコピー数の比較
2群のクローンの間で顕著な相関関係が見られた(図7)。5’−ISを含む発現ベクターから誘導されたクローン群は、多数の組み込まれたベクターコピー数(〜20コピー/細胞)と共に高い生産性(〜20pg/細胞/日)を示した。ICAM−1コーディング配列の非翻訳領域に5’−ISを欠いたベクターから誘導されたクローン群は、より低いレベルのtICAM−1(453)(1−10pg/細胞/日)を分泌し、そしてより少数の組み込まれたベクターコピー数(2−3コピー/細胞)を保有した。後者の群は安定な生産体ではなく、すなわち、比生産性は長期間の培養中に減少し、そして凍結/解凍した細胞から元の生産性を回復することは非常に困難または不可能であった。これらの結果は、タンパク質コーディング配列の5’非翻訳領域に位置するイントロン配列がdhfr/MTX増幅系における発現ベクターDNAの増幅を高めることを示す。これは、mRNA安定化機能の以前の報告(Huang及びGorman、Nucleic Acid Research 18:937−946、1990)に加えた5’−ISの機能の意外な新しい報告である。
【0023】
【実施例】
tICAM−1(453)の連続生産
(pSM98でトランスフェクトした293S細胞から誘導された)クローン4H9−23を無血清培地に適応させ、そして生産性を減少せずに無血清培地MICT4.1中で1年以上保持した。この期間の間に、我々は、SFMに適応後6週、3カ月及び8カ月目で細胞を凍結した。保持した培養物及び凍結/解凍した細胞からtICAM−1生産性を測定し、そして〜20pg/細胞/日の比生産性及び80−100μg/mlの毎日の力価で安定であることが観察された。pSM98から誘導された3個のCHOクローン(B9−H12、B9−H12−G11及びB9−E10)を無血清培地に適応させた。3クローンは全て、生産性を減少せずに無血清培地中で5カ月以上安定であった(10−20pg/細胞/日)。293Sクローン(4H9−23)及びCHOクローン(B9−E10)を連続灌流しながらバイオリアクター中で保持した。3カ月培養後凍結したアンプルから解凍した4H9−23細胞は、2g/lのヒト血清アルブミン、10μg/lのインシュリン及び11μg/lのトランスフェリンを補足したMICT4.1中で10週の研究の間に300mg/l/日の最大の生産性(容量生産性)を示した。B9−E10は、100日の研究の間にヒト血清アルブミンを含まない同じ培地を用いて400−500mg/l/日の容量生産性を示した。詳細なファーメンター(fermenter)データは示さない。
【0024】
結論
安定なタンパク質発現を増大するために、哺乳類細胞系にタンパク質のDNAコーディング配列を導入するための新規な哺乳類細胞発現ベクターが開発された。このベクターは、CMVプロモーターのすぐ下流にあるエプスタイン−バーウイルス由来のイントロン配列(IS)及び唯一のクローニング部位(HpaI)をポリA領域と共に含んでなる。この発現ベクターは、トランスフェクトした細胞において向上した増幅効率を示し、そして大量に生産する安定な細胞クローンの誘導を助成する。このベクターは、いくつかの宿主哺乳類細胞におけるtICAM−1(453)の増加し、かつ安定した生産のために特に有用である。
【0025】
上記の実施例を与えられれば、当業者にとってその変形は容易に明らかであると認識される。従って、上記の実施例は具体例を挙げた説明とだけ解釈されるべきであり、そして本発明は以下の請求項によってのみ制限されるべきであると考えられる。
【0026】
本発明の特徴及び態様を示せば以下のとおりである。
【0027】
1. a)プロモーター、
b)そのプロモーターに適切に連結した、異種起源のタンパク質のコーディング配列、並びに
c)プロモーターの下流でかつコーディング配列の上流にある、2個の同一のドナー部位及び1個のアクセプター部位を含んでなるイントロン配列
を含んでなる発現ベクター。
【0028】
2. ベクターがさらに増幅マーカーを含んでなる上記1の発現ベクター。
【0029】
3. コーディング配列が、tICAM1(453)と実質的に同等な生物学的活性を有しているタンパク質をコードする上記1の発現ベクター。
【0030】
4. コーディング配列がtICAM1(453)をコードする上記1の発現ベクター。
【0031】
5. a)プロモーター、
b)そのプロモーターに適切に連結した、異種起源のタンパク質のコーディング配列、並びに
c)プロモーターの下流でかつコーディング配列の上流にあるMIS配列を含んでなる発現ベクター。
【0032】
6. ベクターがさらに増幅マーカーを含んでなる上記5の発現ベクター。
【0033】
7. 増幅マーカーが、デヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンテターゼ及び多剤耐性遺伝子からなる群から選択される上記6の発現ベクター。
【0034】
8. コーディング配列が、tICAM1(453)と実質的に同等な生物学的活性を有しているタンパク質をコードする上記5の発現ベクター。
【0035】
9. コーディング配列がtICAM1(453)をコードする上記5の発現ベクター。
【0036】
10. 以下のDNA配列
AACTAGCAGC ATTTCCTCCA ACGAGGATCC CGCAGGTAAG AAGCTACACC
GGCCAGTGGC CGGGGCCCGA TAACTAGCAG CATTTCCTCC AACGAGGATC
CCGCAGGTAA GAAGCTACAC CGGCCAGTGG CCGGGGCCGT GGAGCCGGGG
GCATCCGGTG CCTGAGACAG AGGTGCTCAA GGCAGTCTCC ACCTTTTGTC
TCCCCTCTGC AGAGAGCCAC ATTCTGGAA (配列番号:l)
を含んでなるDNA分子。
【0037】
11. a) 増幅マーカー及びMIS配列を含んでなる発現ベクターで哺乳類細胞群をトランスフェクトし、
b) 増幅剤の存在下でこれらの細胞を増殖させ、そして、
c) 工程bの細胞から、高い生産性を有している少なくとも一種の細胞系を選択する
工程を含んでなる哺乳類細胞系の安定なタンパク質発現を増大する方法。
【0038】
12. 哺乳類細胞が、ヒト胚腎臓細胞、ヒトB−細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞、マウス骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞由来の細胞、ヒトB−細胞由来の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞由来の細胞及びマウス骨髄腫細胞由来の細胞からなる群から選択される上記11の方法。
【0039】
13. a) プロモーター、コーディング配列並びにプロモーター及びコーディング配列の間に位置するイントロン配列を有し、さらに増幅マーカーを含んでなる発現ベクターで細胞の集団をトランスフェクトし、
b) 増幅剤の存在下でこれらの細胞を増殖させ、そして、
c) 工程bの細胞から、染色体DNAに組み込まれたベクターDNAの増加したコピー数を有している少なくとも一種の細胞を選択する
ことを含んでなる、細胞の染色体DNAに組み込まれたベクターからのDNAのコピー数を増加する方法。
【0040】
14. イントロン配列がMISである上記13の方法。
【0041】
15. 哺乳類細胞が、ヒト胚腎臓細胞、ヒトB−細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞、マウス骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞由来の細胞、ヒトB−細胞由来の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞由来の細胞及びマウス骨髄腫細胞由来の細胞からなる群から選択される上記13の方法。
【0042】
16. コーディング配列が、tICAM1(453)に実質的に同等な生物学的活性を有しているタンパク質をコードする上記13の方法。
【0043】
17. コーディング配列がtICAM1(453)をコードする上記13の方法。
【0044】
【配列表】
Figure 0004450438
Figure 0004450438

【図面の簡単な説明】
【図1】(a)は、CMVプロモーター、5’−イントロン配列(MIS)及びHpaIクローニング部位の直線地図を示す。平行した地図は、MIS配列内の177bpイントロンの位置を示す。
(b)は、pSM98中のMISのヌクレオチド配列を示す。表示したものは、EBV由来のヌクレオチド配列(括弧でくくられた、229bp、配列番号1)並びにその2個のドナー部位(開き括弧記号)及び1個のアクセプター部位(閉じ括弧記号)である。2個の反復配列(2 x 71bp)に下線を引く(細線及び太線)。(図に挙げた全配列は配列番号4である。)
【図2】ベクターpSM98の構築方法を例示している流れ作業図を示す。
【図3】プラスミドpSH92及びpSM98からの最初の3,000bpの直線地図を示す。発現ベクターpSH92は、CMVプロモーターの3’末端に平滑末端にしたtICAM−1(453)コーディング配列(実線の矢印)を含む。pSM98は、tICAM−1(453)コーディン配列(実線の矢印)の非翻訳の5’末端に5’−イントロン配列MIS(線影をつけたボックス)を保有する。
【図4】tICAM1(453)分泌クローンを誘導する全体的な工程を例示している流れ作業図を示す。
【図5】pSH92でトランスフェクトした293S細胞から誘導されたtICAM−1(453)を分泌するクローンのゲル電気泳動後のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す図に代わる写真である。各レーンは、以下のものを示す。
1.細胞当たり50ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
2.細胞当たり20ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
3.細胞当たり5ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
4.細胞当たり1ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
5.293S細胞DNA
6ないし14.pSH92でトランスフェクトした293S細胞由来の9個のtICAM−1(453)分泌クローンから調製した細胞DNA。
【図6】pSH92またはpSM98のいずれかでトランスフェクトした293S細胞から誘導されたtICAM−1(453)分泌クローンのゲル電気泳動後のサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す図に代わる写真である。各レーンは、以下のものを示す。
1ないし4.pSM98でトランスフェクトした293S細胞由来の4個のtICAM−1(453)分泌クローンから調製した細胞DNA
5.細胞当たり50ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
6.細胞当たり20ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
7.細胞当たり5ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
8.細胞当たり1ゲノムコピーと等しい基準プラスミドDNA
9.293S細胞DNA
10ないし13.pSH92でトランスフェクトした293S細胞由来のtICAM−1(453)分泌クローンから調製した細胞DNA
14ないし17.pSM98でトランスフェクトした293S細胞由来のtICAM−1(453)分泌クローンから調製した細胞DNA。
【図7】サザン分析から概算した組み込まれたコピー数及びELISAにより測定したクローンの生産性を比較する図である。個々のクローンは、5’−イントロン配列を含むベクター(pSM98)または5’−イントロン配列を含まないベクター(pSH92)のいずれかを用いてトランスフェクトしたCHO細胞(CHO)または293S細胞(293S)のいずれかに由来する。

Claims (4)

  1. a)プロモーター、
    b)前記プロモーターに操作可能に連結した、異種起源のタンパク質のコーディング配列、並びに
    c)前記プロモーターの下流でかつ、前記コーディング配列の上流にある、配列番号:1のMIS配列
    を含んでなる発現ベクター。
  2. ベクターがさらに増幅マーカーを含んでなる請求項1記載の発現ベクター。
  3. コーディング配列が、tICAM1(453)をコードする請求項1の発現ベクター。
  4. 増幅マーカー、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンターゼ及び多剤耐性遺伝子からなる群より選ばれる請求項2記載の発現ベクター。
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