MX2007005107A - Metodo para la produccion masiva de lectina de union a manosa multimerica. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion masiva de lectina de union a manosa humana recombinante multimerica (RhMBL) en la linea de celulas CHO transfectada con un vector que contiene la secuencia de la region de codificacion MBL humano. Ademas esta invencion se refiere a la construccion de la una linea de celula recombinante a partir de la cual se puede producir el MBL en mas de 80% como forma polimerica altamente funcional. Ademas esta invencion se refiere a la construccion de una linea de celula recombinante que puede producir 50 ug/millon celulas/dia en un sistema de cultivo de matraz para la produccion de MBL. Ademas esta invencion describe metodos para el cultivo de alta densidad de la celula en un medio libre de proteina utilizando un bio-reactor y para purificacion selectiva de la forma molecular alta de MBL del medio de cultivo. Esta invencion tambien describe un metodo para la produccion de RhMBL funcional que podria utilizarse para desarrollar un agente terapeutico para el tratamiento de infecciones virales, bacterianas, o fungicas.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN MASIVA DE LECTINA DE UNION A MAÑOSA MULTIMERICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al desarrollo de procedimientos a través de los cuales es posible la producción masiva de lectina unida a mañosa humana recombinante ultimérica (RhMBL) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La lectina unida a mañosa (referida como "MBL" de aquí en adelante, por sus siglas en inglés) es una proteína de suero involucrada en la inmunidad natural (inmunidad innata) . El peso molecular de MBL es de 32 kDa. MBL se compone del dominio de reconocimiento de carbohidrato C-terminal (CRD, por sus siglas en inglés) , el dominio de colágeno, y la región rica en cisteína en el extremo terminal amino. Tres moléculas MBL forman un complejo a través de la formación de la hélice triple utilizando dominios de colágeno, y después hasta 6 complejos pueden combinarse juntos a través del enlace de disulfuro inter-molecular (-s-s-) entre los residuos de cisteína en el extremo N-terminal, dando como resultado la formación de la molécula MBL multimérica que consiste de hasta 18 moléculas de MBL. La forma oligomérica de MBL puede formar un Ref. 181656 complejo con otras proteínas tales como las proteasas de serina asociadas a (MBSP-1, MASP-2 o MASP-3) o proteína asociada a MBL (Mapl9). Aunque la estructura molecular general y la función de MBL involucradas en la activación de complementos son similares a Ciq, el cual es un primer componente del sistema complemento, a diferencia de ClqMBL que activa el sistema de complemento a través de la división de C4 y C2. Este procedimiento de activación de complemento denominado trayectoria de lectina se logra a través de proteasa de serina asociada con MBL activada sobre el enlace de MBL a microsonda. La activación del sistema de complemento a través de MBL es una de las funciones de MBL en la defensa principal contra la infección microbiana antes de tomar lugar las respuestas inmunes adaptables. La unión MBL a los microorganismos a través de los dominios de reconocimiento de carbohidrato (CRD) que reconoce los patrones de glicosilación únicos de la proteína de superficie de microorganismo es el pre-requisito de la activación de complemento. La unión de MBL al microorganismo activa los precursores asociados con MBL de proteasas de serina, MASP-1 y MASP-2, conduciendo a la división de C4 y C2 del sistema de complemento, generando C4b2 y C3b. Algunas de las proteínas generadas en la activación del complemento directamente se unen a la superficie de un microorganismo como opsonina, y MBL también puede funcionar como opsonina para hacer la fagocitosis de los microbios unidos a MBL más eficientemente a través de células fagocíticas. Algunas proteínas de complemento activadas directamente lisan los microorganismos invasores a través de la formación de un complejo que ataca la membrana (MAC, por sus siglas en inglés) , y otros fragmentos de proteína de complemento producidos durante el procedimiento de la activación promueven la secreción de la citosina que causa inflamación. Los reportes previos describen la expresión del gen MBL en una variedad de células tales como las células CHO, células de hematoma HLF, o células EBNA HEK293. En particular, el nivel de expresión de las células CHO puede ser muy alto pero el MBL producido fueron principalmente monómeros y dímeros (Katsukí OTAN y otros, J". Im unol . Methods, 222: 135-144, 1999). Se ha logrado la producción de la forma oligomérica de MBL en células EBNA HEK293, pero la productividad en bruto fue menor de 1 µg/Mf (T. Vorup-Jensen y otros, Internacional Immunopharmacology, 1:677-687, 2001). La producción de la forma oligomérica de MBL es críticamente importante, para los monómeros y dímeros que consisten de 3 subunidad y 6 subunidades, respectivamente, que tienen poca si existe alguna, actividad. También es un aspecto importante en el desarrollo de un producto farmacéutico de MBL desarrollar una línea de células altamente productora, ya que es requerida en muchas cantidades en miligramos.

MBL también puede jugar un papel importante en la inmunidad de adaptación. Las células involucradas en la fagocitosis tales como neutrófilos y macrófagos juegan un papel importante en la eliminación de microorganismos foráneos invasores a través de fagocitosis. Además de esto, el macrófago es una célula presentadora de antígeno (APC, por sus siglas en inglés), que activa las células T, dando como resultado la inducción de la respuesta inmune adquirida. Por consiguiente, el MBL multimérico involucrado en la activación del sistema de complemento y como opsonina juega un papel importante no solamente en la defensa principal como un componente del sistema inmune innato sino también en la inducción de las respuestas inmunes adquiridas. La cantidad de MBL en suero humano varía de acuerdo con los individuos, en la escala de 50 ng/ Mí a varios µg/ Mí debido a la variación genética del gen MBL. Por ejemplo, cuando ocurre una mutación de punto en el codón 52, 54 o 57 del exón 1 del gen MBL, la moléculas MBL no forman formas oligoméricas, produciendo complejos más pequeños no funcionales que consisten de no más de 3 moléculas MBL. Cuando ocurre la mutación en las regiones promotoras del gen MBL, el nivel de expresión de MBL se disminuye, dando como resultado una variación tremenda del nivel de sangre en MBL entre los individuos afectados. En general, aquellos infantes o pacientes con neutropenia que tienen un cierto nivel bajo de MBL que tienen una débil inmunidad, se hacen altamente susceptibles a infecciones microbianas (Sumiya, M. y otros, Lancet, 337:1569-1570, 1991; Summerfield, J. A. y otros, Lancet, 345:886, 1995; Garred, P. y otros, Lancet , 346: 941, 1995; Summerfield, J. y otros, Br . Med. J. , 314:1229, 1997; Mullighan, C. G. y otros, Scand . J. I munol . , 51:111-122, 2000; Neth, O. y otros, Lancet , 358:614-618, 2001; Peterslund, N. A. y otros, Lancet, 358:637-638, 2001; Mullighan C. G, y otros, Blood, 3524-3529, 2002) . De acuerdo con un estudio en pacientes crónicos con el virus de hepatitis B, el nivel de MBL en la sangre es un factor crítico en la prognosis de la enfermedad (Hakozaki Y. y otros, Liver 22, 29-34, 2002). Particularmente, entre los pacientes que desarrollaron una falla hepática fulminante de la infección crónica del virus de hepatitis B, la mortalidad de aquellos que tuvieron más de 3 µg/ Mí de MBL en el nivel sanguíneo fue de 0%, mientras aquellos que tuvieron 1.5 µg/ Mí y por debajo de 0.5 µg/ Mí de MBL del nivel de la sangre fue de 58% y sobre 80%, respectivamente. Este estudio muestra la relación dramática entre el nivel sanguíneo de MBL y la mortalidad de los pacientes con una enfermedad infecciosa. Este estudio también sugiere que el suplemento del MBL en pacientes con MBL bajo o sin ningún MBL puede ser benéfico. Con el fin de utilizar MBL recombinante como un agente terapéutico, la proteína MBL recombinante tiene que ser producida en una cantidad masiva a un precio razonable en la forma de moléculas oligoméricas activas. A diferencia de las citocinas se requiere en muchos miligramos por pacientes en cada aplicación. Por ejemplo, el volumen de sangre humana es de un promedio de aproximadamente 5 litros, requiriendo 25 mg para formar 5 µg/ml de MBL. Tomando en cuenta el otro volumen de fluidos en el cuerpo, podría requerirse mucho más en cada aplicación. Por consiguiente, ha sido un aspecto críticamente importante en el desarrollo del producto comercial sin MBL que se establezca no solamente una línea de células recombinante altamente productora sino también la línea de células que produce formas activas de MBL polimérico .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De esta forma, los presentes inventores llevan a cabo todos los esfuerzos necesarios para establecer una línea de célula recombinante que podría producir MBL en una cantidad comercial, y al mismo tiempo que podría producir la forma oligomérica funcional de MBL, que es capaz de activar el sistema de complemento a través de la unión específica a glicoproteínas de unión MBL en la presencia de MASP. Como resultado de este esfuerzo, los presentes inventores han completado esta invención a través de la confirmación de que el RhMBL activo adecuado para uso terapéutico podría producirse en cantidad masiva en la forma de polímero multimérico en una línea de células CHO transfectadas con un vector de clonación que contiene una secuencia de codificación de polinucleótido para RhMBL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra el mapa genético del vector de plásmido pMSG-MBL. La Figura 2A y la Figura 2B son fotografías del MBL producido de la línea de células CHO recombinante, CHO MBL/D1-3, que se transforma con pMSG-MBL. La Figura 2A es el patrón de análisis SDS-PAGE, y 2B muestra el patrón de análisis Western Blot utilizando un anticuerpo monoclonal específico de MBL. La Figura 3 es una fotografía del microscopio de electrón que muestra las formas oligoméricas de MBL. Las moléculas MBL oligoméricas que consisten de 2 , 3, 4, 5 y 6 subunidades triméricas de MBL se ven claramente. La Figura 4 es una fotografía del microscopio de electrón que muestra el complejo de la proteína MBL recombinante y la nanopartícula de oro recubierta con pre S en la presencia de un ion del calcio. La Figura 5A y la Figura 5B muestran que RhMBL se une específicamente a pre-S, una glicoproteína, o mañano con una actividad cuantitativamente similar al MBL natural.

La Figura 6 muestra la capacidad de unión relativa de la forma de polímero más grande de MBL y la forma más pequeña que consiste principalmente de monómeros y dímeros de subunidades triméricas. Las formas más pequeñas tienen poca, si existe alguna, capacidad de unión. La Figura 7 muestra la comparación de las capacidades de activación C4 de la forma más grande y la forma más pequeña de RhMBL . La Figura 8 muestra que RhMBL se une específicamente a varios microorganismos. La Figura 9 muestra que RhMBL inhibe la infección de SARS-CoV en células embriónicas de riñon de mono (FRhK-4) . Las Figuras 10A-10F son un grupo de imágenes microscópicas de contraste de fase que muestra las células FRhk-4 infectadas con SARS-CoV. Sin el tratamiento RhMBL, las células no se ven sanas, mientras las células con MBL sanas están presentes. La Figura 11 es un diagrama esquemático que muestra el kit de diagnóstico preparado a través del uso de MBL humano recombinante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Es objeto de la presente invención construir una línea de células CHO que se transfecta con un vector que contiene una secuencia de codificación de polinucleótido de MBL humano para el propósito de producir la forma oligomérica funcional de MBL en cantidad masiva a ser utilizada para propósito comercial. Además es objeto de la presente invención establecer un método para la purificación de RhMBL del medio de cultivo de la línea de células CHO recombinante. La presente invención provee un vector de expresión pMSG-MBL que contiene la secuencia de la región de codificación RhMBL representada en el mapa de plásmido de la Figura 1. La presente invención también provee una línea de células huésped transfectadas con el vector de expresión. La presente invención además provee un método para la producción masiva de MBL humano recombinante multimérico de acuerdo con los siguientes pasos: (1) preparar las células huésped transfectadas con un vector de expresión que contiene la secuencia de la región de codificación MBL; (2) producir un MBL humano recombinante de la línea de células transformadas con el vector de expresión con la secuencia de la región de codificación MBL humana en un sistema de cultivo; y (3) purificar el MBL humano recombinante preparado en el paso (2 ) . La presente invención también provee un kit de detección para el MBL humano recombinante que comprende i) un soporte sólido con una línea de prueba y una línea de control en donde los anticuerpo de lectina que se una a mañosa antihumana de ratón se fijan en la línea de prueba y los anticuerpos IgG anti-ratón o anticuerpos anti-pre-S se fijan en la línea de control; ii) una almohadilla de colorante adsorbida con un conjugado de colorante y conectada a la parte inferior del soporte sólido, en donde si están fijos los anticuerpos IgG anti-ratón en la línea de control, el conjugado de colorante es un conjugado de anticuerpos de lectina de unión a mañosa anti-humana de ratón-oro y se fijan los anticuerpos anti-pre-S en la línea de control, el conjugado de colorante es el conjugado de pre-S-oro; y iii) una almohadilla de muestra conectada a la parte inferior de la almohadilla de colorante, sobre la cual se carga una muestra . La presente invención provee un vector de expresión pMSG-MBL que contiene un polinucleótido que codifica RhMBL representado en el mapa de plásmido de la Figura 1, que es suficiente para expresar el MBL humano recombinante oligomérico que puede activar el sistema de complemento a través de la combinación específica con una glicoproteína de unión a MBL en la presencia de proteasas de serina asociadas con MBL. En una modalidad preferida de la presente invención, el ADNc de MBL humano (Gene Bank NM_000242) se insertó en el vector pMSG (No. de Acceso KCCM (centro de cultivo de microorganismos Coreano) 10202) que contiene el elemento MAR (elemento de la región de unión de matriz nuclear) del gen beta-globina, poli-A del virus SV40 y el complejo terminador de la trascripción del gen de gastrina, dando como resultado la construcción de un vector único denominado pMSG-MBL. La presente invención también provee células huésped transfectadas con el vector de expresión que contiene la codificación del polinucleótido para RhMBL que es suficiente para expresar el MBL humano recombinante, que es capaz de activar el sistema complemento a través de la unión específica a una glicoproteína sobre la superficie del microorganismo en la presencia de proteasa de serina asociada con MBL. Las células huésped utilizadas en la presente invención son células de animal en general, y preferiblemente seleccionadas de un grupo que consiste de células CHO (ovario de hámster Chino), hepatocitos, células HEK (riñon embriónico humano) , etc . En una modalidad preferida de la presente invención, se preparó un transformante a través de la introducción de un vector de clonación pMSG-MBL que contiene RhMBL de codificación de polinucleótido, que es suficiente para expresar un MBL recombinante capaz de activar el sistema complemento a través de la unión específica a glicoproteínas sobre la superficie de los microorganismos en la presencia de una proteasa de serina asociada con MBL, dentro de una línea de células huésped tal como una célula CHO, y después adaptando los transformantes a la condición con MTX (metrotexato) , conduciendo a la selección del transformante que fue capaz de la expresión masiva de la proteína RhMBL en la forma de polímero multimérico. El transformante seleccionado se nombró como MBL Dl-3 (línea de células CHO) y se depositó en la Colección Coreana por Tipo de Cultivo, Daejeon, Corea, el 16 de mayo, del 2003 (No. de Acceso: KCTC 10472BP) . El MBL humano recombinante producido del transformante descrito en la presente invención está principalmente en la forma de formas multiméricas, que es similar al MBL natural de la sangre humana. La línea de células establecida en la presente invención produjo principalmente la forma multimérica funcional de MBL y mostró un nivel de alta expresión, haciendo posible el uso de la línea de células CHO transformada para la producción masiva de la proteína RhMBL funcional. La presente invención además provee un método para la producción de un MBL humana recombinante, que comprende los siguientes pasos: (1) Un método para proveer las células huésped transfectadas con una construcción de ADN que incluye un vector de clonación que contiene MBL humano de codificación de polinucleótido, que es suficiente para expresar una MBL humana recombinante capaz de activar el sistema de complemento a través de la unión específica a una glicoproteína sobre la superficie de los microorganismos en la presencia de proteasa de serina asociada con MBL. (2) El método para producir MBL humana recombinante a través de la expresión de MBL humana de codificación de polinucleótido en la célula animal y de la célula que utiliza un sistema de cultivo de célula masivo; (3) El método para purificar el MBL recombinante producido en el paso (2) . Particularmente, la exploración de los caracteres de la unión de MBL a la glicoproteína del paso (1) y la glicoproteína de unión MBL se ejemplifica a través de la proteína de cubierta viral glicosilada que contiene pre-S de HBV, la proteína bacteriana glicosilada, proteína fúngica glicosilada, y la glicoproteína sintética. En una modalidad preferida de la presente invención, el paso de producción de un MBL recombinante del paso (2) se caracteriza a través de los pasos de suspensión-cultivo de células en un medio libre de suero/libre de proteína y sub-cultivando esas células adaptadas bien al medio libre de suero/libre de proteína para aumentarse gradualmente, dando como resultado la producción masiva de la proteína RhMBL en la forma de un polímero multimérico. En el paso (3), una proteína MBL recombinante se purificó a partir del medio de cultivo de los transformantes del gen MBL a través del uso de cromatografía de intercambio de anión y la capacidad de enlace de MBL a pre-S del virus de hepatitis B. El método de purificación de MBL está compuesto de los siguientes pasos: (a) fraccionar las muestras que contienen el MBL humano recombinante multimérico a través del uso de cromatografía de intercambio de anión; (b) preparar la columna empacando el sustrato que se inmovilizó a partir del virus pre-S de hepatitis B; (c) capturar el MBL recombinante específicamente sobre el virus pre-S de hepatitis B inmovilizado pasando a través de la columna una muestra que contiene las proteínas MBL recombinantes en la presencia de un ion de calcio, después de equilibrar la columna con un regulador de pH conteniendo el ion de calcio; y (d) eluyendo las proteínas MBL recombinantes a través de la adición de una solución reguladora de pH suplementada con EDTA o EGTA a la columna sobre la cual el MBL recombinante fue capturado en el paso (c) . En el paso (a) , se utilizó un material que generalmente se utilizó para la cromatografía de intercambio de anión, y Q-sefarosa fue uno de los materiales de columna utilizados. La muestra que contenía las proteínas MBL en la forma de monómero o dímero se fraccionó en la presencia de 150 - 200 mN de NaCl, y la otra porción conteniendo una proteína MBL de alto peso molecular en la forma de copolímero se eluyó en la presencia de 350 - 400 mN de NaCl. En el paso (b) , un sustrato que generalmente se utilizó para cromatografía de afinidad se utilizó, y la sefarosa fue uno de los sustratos generales . En el paso (c) , se realizó el equilibrio de la columna a través de la adición de una solución reguladora de pH o la misma solución que se utilizó para la unión de afinidad de un MBL recombinante y el virus pre-S de la hepatitis B. La unión del MBL recombinante al virus pre-S de la hepatitis B preferiblemente se llevó a cabo en la presencia del ion de calcio, y en ese momento, la concentración del calcio fue preferiblemente 2- 20 mM. Una muestra conteniendo la proteína MBL recombinante podría ser el sobrenadante obtenido del medio de cultivo trasformando de la célula productora de MBL o la solución MBL eluida de la columna de fraccionamiento MBL mencionada anteriormente. En el paso (d) , la elusión de la proteína RhMBL se llevó a cabo utilizando una solución reguladora de pH EDTA o EGTA en la ausencia del ion de calcio. La solución reguladora de pH podría ser la solución conteniendo EDTA o EGTA a la concentración de 2-10 mM, por ejemplo agua destilada o regulador de pH Tris-Cl, pH 7.4. El eluyente preparado en el paso (d) se liofilizó y se dializó antes de la liofilización, dando como resultado una proteína MBL recombinante purificada. El método de purificación de la proteína RhMBL de la presente invención también es aplicable para purificar el MBL obtenido de muestras biológicas naturales, además de la proteína MBL recombinante preparada del transformante. La muestra biológica se puede ejemplificar a través de sangre, plasma o suero. La presente invención también provee un kit de detección para el MBL humana recombinante que comprende i) un soporte sólido que comprende de una línea de prueba y una línea de control en donde los anticuerpos de lectina de unión a mañosa anti-humana de ratón se fijan a la línea de prueba y los anticuerpos IgG de anti-ratón o anticuerpos anti-pre-S se fijan a la línea de control; ii) una almohadilla de colorante adsorbida con un conjugado de colorante y conectada a la parte inferior del soporte sólido, en donde si los anticuerpos IgG anti-ratones están fijos a la línea de control, el conjugado de colorante es un conjugado de anticuerpos de lectina de enlace a mañosa anti-humanos de ratón-oro y si los anticuerpos anti-pre-S se fijan en la línea de control, el conjugado de colorante es un conjugado pre-S-oro; y (iii) una almohadilla de muestra conectada a la parte inferior de la almohadilla de colorante, sobre la cual se cargó la muestra. En la presente invención, se puede utilizar una membrana de nitrocelulosa, difluoruro de polivinilideno (PVDF), y membrana de nylon como el soporte sólido. Como la almohadilla de colorante, se puede utilizar poliéster, fibra de vidrio, etc., pero no se limita a esto. La presente invención también provee un método de preparación del kit de detección para el MBL humano recombinante que comprende los siguientes pasos: (1) preparar los conjugados de colorante a través de la unión de los anticuerpos de lectina de unión a mañosa anti-humana o la proteína pre-S a partículas de oro; (2) adsorber el conjugado de colorante en una almohadilla de colorante; (3) unir anticuerpos de lectina de unión a mañosa anti-humanos en la línea de prueba del soporte sólido y anticuerpos anti-pre-S sobre la línea de control del soporte sólido si el conjugado del colorante son anticuerpos de lectina de enlace a mañosa anti-humana-partículas de oro o anticuerpos anti-pre-S al soporte sólido como la línea de control si los conjugados de colorante son anticuerpos MBL anti-humanos de ratón-partículas de oro; y (4) unir la almohadilla de muestra y la almohadilla de colorante en la parte inferior del soporte sólido . En la presente invención, las proteínas pre-S o los anticuerpos MBL anti-humano se pueden utilizar como el conjugado de colorante, pero no se limita a esto. La presente invención también provee un método para la detección de MBL a través del uso del un kit de detección MBL, que comprende los siguientes pasos: (1) aplicar una muestra que contiene MBL a una almohadilla de colorante conectada con la parte inferior del soporte sólido; y (2) confirmar que los anticuerpos están unidos a la línea de prueba y a la línea de control del soporte sólido . El MBL humano recombinante de la presente invención es similar a la forma natural purificada de sangre humana.

Sus formas oligoméricas y activas en la unión a microorganismos por lo tanto activando el sistema de complemento. Y el nivel de producción con alto rendimiento (50 µg/millón de células/día) asegura la producción comercial de MBL funcional para el desarrollo del producto. El RhMBL así producido puede ser efectivamente utilizado para el tratamiento de un individuo infectado con virus, bacteria u hongo. También se puede utilizar para la producción de un kit de diagnóstico para detectar el MBL humana recombinante.

Ejemplos Las modalidades prácticas y actualmente preferidas de la presente invención se ilustran como se muestra en los siguientes ejemplos. Sin embargo, se apreciará por los expertos en la técnica, tomando en consideración esta descripción, que se pueden hacer modificaciones y mejoras dentro del espíritu y alcance de la presente invención. Ejemplo 1 Preparación de un transformante de gen MBL y expresión de un MBL humano recombinante <!-!> Construcción de un vector de expresión Se construyó pEZ-MBL 2-5 a través de la clonación de ADNc de MBL obtenido de PCR de la colección de ADNc de hepatocito humano en el vector pEZ, y después de la secuencia de nucleótido de ADNc de MBL se confirmó como siendo auténtica a partir de la secuencia de nucleótido conocida de MBL (Gene Bank NM_000242) . PCR se llevó a cabo a través del uso de pEZ-MBL 2-5 como una plantilla utilizando un grupo iniciador (iniciador hacia delante 1 e iniciador inverso 2) para amplificar el ADNc de MBL aproximadamente a un tamaño de 750 kb. Cada iniciador contiene el sitio de reconocimiento de enzima de restricción y la secuencia Kozak, por lo que la región de codificación completa se amplificó. Después se preparó pMSG-MBL a través de la clonación de ADNc de MBL en el vector pMSG (No. de Acceso KCCM 10202), y después de la secuencia de nucleótido insertada de MBL se confirmó (Figura 1) . Iniciador hacia delante 1 (SEC ID No. 1) ctagctagcc accatgtccc tgtttccatc actc (34mer) Iniciador inverso 2 (SEC ID No . 2) gaagatctca gatagggaac tcacagacg (29mer) <l-2> Transformación de la célula huésped con pMSG-MBL <l-2-l> Preparación del ADN de plásmido de expresión de pMSG-MBL Se transfectó E . coli con pMSG-MBL, y el transformante resultante se cultivó en 100 Mí de medio LB suplementado con 100 µg/ Mí de ampicilina (Sigma, USA). El ADN pMSG-MBL se separó a través del kit de purificación de plásmido (QUIAPREP Plasmad Midi Kit, Quiagen, USA) . El ADN purificado se digirió con enzima de restricción Sea I para convertirlo en lineal, el cual se separó a través del kit de purificación del producto PCR (kit de purificación del producto PCR QIAQuick, Quiagen, USA) . <l-2-2> Preparación de las células huésped Después de cultivar las células huésped DG44 CHO (dhfr-/dhfr-) en medio a-MEM suplementado con 10% de cFBS, el número de células se contó a través de un hematocitómetro .

Las células se distribuyeron (2 x 105 células/cavidad) en un medio a-MEM suplementado con 10% de cFBS, que se cultivó en un incubador con C0 durante 24 horas. <l-2-3> Transformación Se mezclaron 2 µg del vector pMSG-MBL con 5.3 µí de Dosper™ y 15 ng de ADN del vector pDCHlP (gen DHFR conteniendo plásmido, Venolia, L. y otros, 1987, Somat . Cell Mol . Genet . 13, 491-501) para inducir la reacción a temperatura ambiente durante 45 minutos. El producto resultante se agregó a las células huésped. Las células se cultivaron a 37 aC durante 6 horas, después el medio se reemplazó con un medio a-MEM fresco conteniendo 10% de cFBS (3 Mí /cavidad), seguido por cultivo adicional. 2-3 días después, cuando las células transformadas crecieron lo suficiente, se agregó tripsina y 2 Mí de a-MEM (v/o) conteniendo 10% dFBS se agregaron a las células (4 x 105 células/cavidad), seguido por cultivo adicional otra vez. Cada 2-3 días, el medio se reemplazo con uno fresco, y la condición de las células y la formación de una sola colonia se observó bajo microscopio. Diez días después, se obtuvieron las células anteriores adaptadas . <l-3> Selección de una línea de células que expresa MBL y amplificación del gen MBL. Después de obtener las células anteriores adaptadas, la concentración de MTX (metotrexato) en medio se incrementó gradualmente para inducir la amplificación del gen MBL insertado en las células transformadas. Las células se distribuyeron mediante 4 x 105 células/cavidad, y después se cultivaron en un medio (a-MEM + 10% dFBS) suplementado con 10 mM de MTX hasta la confluencia, durante la cual el medio se reemplazo con un fresco cada 2-3 días. Las células se distribuyeron otra vez por 4 x 105 células/cavidad, y se adaptaron a un medio suplementado con 10 nM de MTX siguiendo el mismo procedimiento utilizado anteriormente, y después se volvieron a adaptar a una condición de 1 uM MTX. Durante la amplificación del gen MBL, se realizó al análisis western blot en cada etapa para observar los cambios de nivel de expresión de MBL. En esta expresión el MBL se incrementó con el aumento del contenido MTX en el medio. <l-4> Selección de una sola línea de células Con el fin de separar una sola línea de células que mostrara una velocidad de expresión MBL alta, las células cultivadas en un medio (aa-MEM + 10% dFBS) conteniendo 1 uM MTX se distribuyeron en una placa de 96 cavidades para formar 0.5 células/cavidad, después se cultivaron en un medio conteniendo 1 uM MTX. Después de 2 semanas, cuando se confirmó la formación de una sola colonia, las células se transfirieron a una placa de 94 cavidades, que además se cultivó hasta que las células se proliferaron lo suficiente. Algunas de estas se congelaron y se almacenaron, y algunas de éstas se utilizaron para comparación de expresiones a través del análisis Western blot. Y, se seleccionó una sola célula transformante Dl-3, la cual probó que produce una forma de alto peso molecular de MBL en una gran cantidad, como la línea de células de la presente invención. El transformante seleccionado se nombró MBL Dl-3 (línea de células CHO) y se depositó en la Colección Coreana por Tipo de Cultivo, Daejeon, Corea, el 16 de mayo del 2003 (No. de Acceso: KCTC 10472BP) . El análisis PAGE de la proteína MBL recombinante expresada del transformante se desarrolló a una condición no de desnaturalización y se encontró que es una forma multimérica de MBL, que es muy similar a las características del MBL natural de origen humano. <l-5> Cuantificación del MBL recombinante expresado en un transformante. Con base en la cantidad estándar del MBL purificado obtenido del ser humano, se estimó el nivel de expresión de la proteína MBL recombinante de células MBL/D1-3 CHO transformadas. Las células se distribuyeron en un recipiente T25 a una concentración 5 x 105, y se cultivaron en un medio (a-MEM (v/o) + 10% dFBS) hasta un 90% de confluencia. Después, se agregaron 3 Mí de medio (a-MEM (v/o) + 5% de dFBS) al mismo y además se cultivaron durante 4 días. El medio de cultivo se diluyó 10 veces, seguido por el análisis Western blot. El resultado se comparó con la cantidad estándar del MBL natural. A partir de este nivel de expresión de la proteína MBL recombinante se confirmó como siendo alrededor de 50 µg/106 células/día, según cultivado en un recipiente de cultivo de célula. Ejemplo 2 Método para producción masiva de la protßína RhMBL <2-l> Preparación de una línea de células adaptada para cultivo de suspensión en un medio libre de suero Se cultivó una línea de células expresando MBL dependiente del anclaje en un medio a-MEM (v/o) suplementado con 10% de dFBS y 1 uM MTX. Después de recuperar las células viables, se inocularon en un recipiente centrífugo de 250 ml conteniendo 100 ml de medio CHO SFM4 libre de proteína (Hydroclone, USA), suplementado con 0.15% de bicarbonato de sodio al tamaño de inoculo de 5 x 105 células/ml. El cultivo en el recipiente centrífugo se llevó a cabo a 372C en un incubador de CO5 al 5%, el cual se agitó a 40 rpm todo el tiempo. Cuando se alcanzó el número de células 1.0 - 2.0 x 106 células/ml , las células se inocularon otra vez en 100 ml de medio CHO HyQ SFM4 suplementado con 0.15% de bicarbonato de sodio con el tamaño inoculo de 5 x 105 células/ml. La viabilidad de las células se determinó a través del método de exclusión de azul tripano. En particular, se confirmó sobre el 90% de viabilidad en el periodo de adaptación anterior. Las células adaptadas al medio libre de proteína/libre de suero se cultivaron hasta que alcanzó una densidad de célula de 2.5 x 106 células/ Mí. Después, las células se recuperaron y se volvieron a suspender en medio de congelamiento. Las células se distribuyeron en criorecipientes para hacer la concentración de 2.8 x 107 células /Mí , que después se almacenaron en un tanque de nitrógeno líquido. <2-2> Desarrollo del cultivo del bio-reactor utilizando una línea de células adaptada para cultivo de suspensión libre de suero Las células para el cultivo de suspensión se inocularon en un recipiente centrífugo de 250 Mí conteniendo 100 Mí de medio libre de suero/libre de proteína (medio CHO HyQ SFM4) suplementado con 0.15% de bicarbonato de sodio con un tamaño de inoculo de 5 x 10 células/ Mí . Cuando el número de células se incrementó a 1.0-2.0 x 106 células/ Mí, las células se inocularon en un recipiente centrífugo de 500 Mí conteniendo 200 Mí de medio CHO HyQ SFM4 con un tamaño de inoculo de 5 x 105 células/ Mí. Después, cuando se volvió a incrementar el número de células a 2 x 106 células/ Mí, las células se inocularon en un recipiente centrífugo de 1,000 Mí conteniendo 400 ml de medio CHO HyQ SFM con un tamaño de inoculo de 5 x 105 células/ Mí. En esta forma las células se cultivaron aumentando gradualmente, dando como resultado la preparación de 1 litro de cultivo de siembra con la concentración de 2.5 x 106 células/ Mí. El cultivo de célula de siembra preparado anteriormente se inoculó en un birreactor de 7.5 litros (volumen de trabajo 5 litros) y se cultivaron a 342C durante 5 días (50 rpm, DO 50, pH 7.2 - 7.4). Ejemplo 3 Método para la purificación de proteina MBL humana recombinante multimérica Se cultivó la célula CHO expresando MBL en medio CHO HyQ SFM4 , y después el medio de cultivo se centrifugó y se pasó a través de un filtro de membrana de 0.45 µm para remover la célula. Se llevaron a cabo la cromatografía de intercambio de anión y cromatografía de afinidad para purificar las proteínas MBL recombinantes. La cantidad de proteínas purificadas se determinó a través del uso del kit ELISA MBL. <3-l> Fraccionamiento de polímero multimérico conteniendo la muestra utilizando columna Q-sefarosa Después de optimizar el pH y la conductividad del sobrenadante, se removió la forma más pequeña de MBL tal como monómero y dímero a través del uso de una columna empacada con Q-sefarosa, y solamente se recolectó el MBL en las formas más grandes. La muestra conteniendo la forma más pequeña de MBL se fraccionó pasándola a través de una solución reguladora de pH de 150-200 mM de NaCl, y la muestra conteniendo la forma más grande de MBL se eluyó con solución reguladora de pH de 350-400 mM de NaCl. Este resultado mostró que más del 80% se expresaron en la forma de copolímero molecular alto de MBL de la línea de células que se estableció en está invención (Figura 2A) . <3-2> Preparación de la columna pre-S-sefarosa La proteína pre-S recombinante utilizada en la presente invención se obtuvo a través de la expresión del gen pre-S, el cual es una porción de la proteína de superficie del virus de hepatitis B, en Sacharomyces cerevisiae, y después se purificaron en la forma de moléculas altamente glicosiladas (Publicación de Patente Internacional No. WO 02/094866) . Se disolvió 1 g de polvo 4B de sefarosa activada a través de CNBr en 1 mM de HCl, seguido por lavado varias veces. Con el fin de utilizar la proteína pre-S recombinante como un ligando, se disolvieron 6.4 mg de la proteína pre-S en regulador de pH de acoplamiento (0.2 M de NaHC03 , 0.5 M de NaCl y pH 8.3), haciendo la concentración de 0.5 - 10 mg/ Mí. Las resinas 4B de CNBr activadas de Sefarosa se mezclaron con la solución pre-S y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Después, la mezcla se transfirió a regulador de pH de bloqueo (0.1 M Tris-Cl, pH 8.0), seguido por la reacción adicional a temperatura ambiente durante 2 horas. Después del lavado, se confirmó pre-S inmovilizado para Sefarosa a través del análisis western blot y se encontró que casi todas las proteínas recombinantes pre-S se inmovilizaron para la columna de Sefarosa, la cual se utilizó para la purificación de una proteína MBL recombinante. Finalmente, la columna pre-S para la purificación del MBL humano recombinante se preparó a través del empaque de la resina 4B de pre-S-sefarosa en una columna. <3-3> Purificación de un MBL humano recombinante La columna rellena con pre-S-sefarosa se equilibró con un regulador de pH de unión (20 mM Tris, 150 mM de NaCl y mM de CaCl pH 7.6), La fracción de la columna de las proteínas MBL recombinantes conteniendo Q-Sefarosa o medio de cultivo conteniendo MBL se cargaron sobre una columna para adsorber el MBL. Después, la columna se lavó varias veces con el regulador de pH de enlace. El regulador de pH de elusión (20 mM Tris, 150 mM de NaCl y 5 mM de EDTA, pH 7.6) sin Ca2+ se pasó a través de la columna para eluir el MBL humano recombinante. El eluyente obtenido se investigó con SDS-PAGE.

Como resultado, el MBL humano recombinante purificado mostrando 99.9% de pureza se obtuvo (Figura 2A y Figura 2B) . Ejemplo 4 Verificación de un MBL humano recombinante multimérico a través de la actividad de unión de EM y a través de MBL a la superficie de microorganismo <4-l> Confirmación de la formación de un MBL humano recombinante multimérico Con el fin de confirmar si un MBL humano recombinante purificado formó o no formó un polímero multimérico en la forma de un ramo de flores, el MBL humano recombinante purificado se trató con carbono amorfo, y después la forma de la proteína se observo bajo transmisión de microscopio de electrón (Tecnai 12, FEI, Netherlands) y se encontró el MBL humano recombinante purificado son polímeros multiméricos en la forma de un ramo (Figura 3) . <4-2> Unión de MBL humano recombinante a partículas de oro recubiertas con pre-S La capacidad de unión del MBL humano recombinante a la superficie de un microorganismo se observó a través del uso de pre-S, una proteína de superficie del virus de hepatitis B. Las proteínas pre-S se unieron a la superficie de las partículas de oro que es de un tamaño de 20-40 nm, el cual, de esta forma, se forma como un microorganismo. Los MBL humanos recombinantes se agregaron al mismo en la presencia de calcio. Después, siempre que el MBL humano recombinante se unió a las proteínas pre-S se observó bajo transmisión de microscopio de electrón Tecnai 12, dando como resultado la confirmación de una formación del complejo. Como se muestra en la Figura 4, las proteínas pre-S recubiertas sobre partículas de oro se rodearon por MBL humano recombinante en la presencia de un ion del calcio. Esto demuestra como se ve la unión RhMBL a la superficie de un microorganismo. En el caso actual, la unión MBL al microorganismo podrían mecánicamente bloquear la inefectividad del organismo especialmente, tales como virus s a la células, además de activar el sistema de complemento y actuar como un opsonina. Ejemplo 5 Confirmación de la actividad de unión del MBL humano recombinante Con el fin de investigar la actividad biológica de RhMBL, la actividad de unión a pre-S y mañano, se evaluó en la presencia del ion de calcio. Mañano o la proteína pre-S del virus de hepatitis B disuelto en 50 mM de solución reguladora de pH de carbonato-bicarbonato se distribuyeron en una placa de microtitulación (Nunc Maxisorp Immunoplate) para hacer 1 µg por cavidad, lo cual después se incubó durante la noche a 5SC. La placa cubierta con pre-S o mañano se lavó con un regulador de pH de lavado (20 mM Tris, 150 mM de NaCl, 10 M de CaCl2, 0.05% de Tween-20, pH 7.6) cuatro veces, seguido por bloqueo con 0.2% de BSA a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado con un regulador de pH de lavado tres veces, se agregó suficiente MBL a cada cavidad para hacer la cantidad de MBL en cada cavidad como indica en la figura. Para hacer esto se hizo una dilución serial de 1 µg de MBL humano recombinante en 1 ml de regulador de pH de unión (20 mM Tris, 1 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, 0.1% de BSA, 0.05% de Tween-20, pH 7.6) para hacer la cantidad necesaria de MBL en 100 µí , la cual después se agregó a cada cavidad y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas . Las placas se lavaron con regulador de pH de lavado seis veces otra vez. Después, se diluyeron anticuerpos MBL anti-humanos monoclonales de ratón (MBL8F6, Dobeel Corp., Corea) 10,000 veces y se agregaron 100 µí sobre cada cavidad seguido por incubación a 372C durante 1 hora. El IgG-HRP anti-ratón se diluyó 10,000 veces y se agregaron 100 ul a cada cavidad. La placa se incubó a 372C durante 1 hora y después, se desarrolló el color a través de la adición de 150 µí de solución de TMB. Después de 20 minutos, la reacción se terminó a través de la adición de 50 µí de 2 M de H2S04. Se midió la DO 50 utilizando un lector de placas ELISA (Multiskan Ex, Labsystems, USA) . La Figura 5A muestra la unión de MBL natural purificado de suero humano a la proteína de mañano y pre-S, y la Figura 5B muestra la unión de MBL humana recombinante a pre-S y mañano. En conclusión, el MBL humano recombinante y el MBL natural para seres humanos tuvo una actividad de unión similar a pre-S y mañano, pero ambos no se unen a Albúmina de Suero de Bovino (Figura 5A y Figura 5B) . Ejemplo 6 Comparación de la actividad biológica entre MBL humana recombinante multimérica de alto peso molecular y MBL humana recombinante oligomérica de bajo peso molecular La actividad biológica de la forma más grande y más pequeña del MBL humano recombinante se investigó con el fin de confirmar cual de las proteínas MBL humanas recombinantes, la forma más grande o la forma más pequeña que incluye el monómero y dímero, se unen más eficientemente a pre-S y a mañano en la presencia de un ion de calcio. <6-l> MBL uniéndose a la proteína pre-S glicosilada Las proteínas pre-S se cubrieron sobre una placa (Nuc Maxisorp Immunoplate) bajo las mismas condiciones descritas en el Ejemplo 5. Después la forma más grande o la más pequeña se disolvió en regulador de pH de enlace (30 mM Tris, 1 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, 0.1% de BSA, 0.05% de Tween-20, pH 7.6) y se agregó sobre una placa recubierta con pre-S a concentraciones diferentes para hacer la cantidad deseada en cada cavidad. Y el resto de los ensayos de unión se llevaron a cabo como en el Ejemplo 5. Como se describió anteriormente, la actividad de unión de MBL a las proteínas pre-S fue mucho mayor con MBL humana recombinante multimérico comparado con la forma más pequeña conteniendo principalmente monómeros y dímeros (Figura 6) . <6-2> Activación de C4 en el sistema de complemento Se cubrieron Nunc Maxisorp Immunoplate con 500 ng de proteínas pre-S por cavidad, a la cual se agregaron diferentes concentraciones de MBL humano recombinante, permitiendo la unión de MBL a pre-S a temperatura ambiente durante 2 horas. Como una fuente de la proteína MASP, se agregaron 100 ul de suero libre de MBL diluido 100 veces a cada cavidad y se incubaron 90 minutos a temperatura ambiente . La placa se lavó con un regulador de pH de lavado 6 veces , después se agregaron 500 mg de C4 seguido por la reacción adicional a temperatura ambiente durante 2 horas . Se diluyó el anticuerpo HRP anti-C4 diluido 2000 veces y se agregaron 100 ul a cada cavidad . Después , se dej ó que la reacción tomará lugar a temperatura ambiente durante 1 hora . Se agregaron 150 µí de solución OPD y el color se desarrolló durante 20 minutos . Después, se midió el depósito C4b después de agregar 50 µí de 3 M de HCl y la lectura de la DO a D0 g2 utilizando un vector de placas ELISA (Figura 7 ) . Para los experimentos se utilizaron ambos MBL humano recombinantes multiméricos en la forma más grande provista por la presente invención y los MBL humanos recombinantes en la forma más pequeña tales como monómeros o dímeros respectivamente para la comparación de sus actividades . Como se muestra en la Figura 7 , C4 fue enormemente activada a través de MBL humano recombinante multimérico en la forma más grande pero fue duramente activado a través de aquellas proteínas en la forma más pequeña. Por consiguiente, se confirmó que el MBL humano recombinante en la forma de polímero multimérico provisto por la presente invención tiene una excelente actividad para la activación de C4. Ejemplo 7 Unión de MBL humano recombinante a varios microorganismos Se cultivaron 11 cepas incluyendo tanto la bacteria gram-positiva como la bacteria gram-negativa y hongos en medio líquido apropiado para cada uno de ellos. Para inmovilizar la célula bacteriana cultivada, se distribuyeron 100 ul de células cultivadas en una placa (Maxisorp Immunoplate, Nunc) para hacer 1 x 106 células/cavidad y se incubaron a 42C durante la noche. Se realizó el bloqueo utilizando 0.2% de BSA a 372C durante 1 hora. Se agregaron 500 ng de MBL humano recombinante disuelto en 100 ul de regulador de pH de unión (20 mM de Tris, 1 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, 0.1% de BSA, 0.05% de Tween-20, pH 7.6) a cada cavidad, seguido por reacción a 372C durante 1 hora. Se diluyó el anticuerpo MB1B5 monoclonal de ratón MBL antihumano (Dobeel Corp., Corea) 10,000 veces y se agregaron 100 µí a cada cavidad, seguido por la reacción a 372C durante 1 hora. Se diluyó IgG-HRP anti-ratón 10,000 veces y se agregaron 100 ul a cada cavidad, seguido por reacción a 37 aC durante 1 hora. Después, se agregaron 100 µí de solución de TMB al mismo y el color se desarrolló durante 30 minutos. La reacción se terminó a través de la adición de 50 µí de solución de detención (H2S04) , y después se midió la DO450 a través del uso de un lector de placas ELISA (Multiskan Ex, Labsystems, USA) . Los microorganismos utilizados en la presente invención mostraron diferente actividad de unión al MBL humano recombinante, y como se muestra en la Figura 8, C. albicans, H. influenzae ATCC 51907, S. aureus CCARN 3197 y S . aureus ATCC 29213 mostraron una actividad de unión muy alta a una proteína MBL recombinante, pero S. pyrogenes ATCC 8668, S. aureus CCARM 3114 y E. faecalis ATCC 29212 mostraron un nivel medio de actividad de unión. K. pneumoniae ATCC 10031, S. epidermis ATCC 12228, S. epidermis CCARM 35048 y E. faecium CCARM 5028 tuvieron una actividad de unión baja a MBL. En conclusión, se probó que un MBL humano recombinante, del tipo MBL natural, se une a los microorganismos, reconociendo el patrón de una proteína de superficie glicosilada y las actividades de unión varían con los microorganismos objetivo. Ejemplo 8 Inhibición de la infección SARS-CoV a través de MBL humano recombinante Se cultivaron células de riñon, células FRhk-4, en MEM. A la solución del cultivo, se agregó MBL humano recombinante, el cual después se infectó con SARS-CoV. El MBL humano recombinante se diluyó con medio de cultivo de célula serialmente cuatro veces partiendo de concentraciones de 2.5 µg/Z^Í , y SARS-CoV, aislado principalmente del paciente, se utilizó (Ksiazek TG y otros, N. Eng. J. Med 348, 1953-1966, 2003; Peiris y otros, Lancet 361, 1319-1325, 2003). Con el fin de confirmar si las células huésped se infectaron o no se infectaron con SARS-CoV y replicaron, se llevó a cabo el PCR en tiempo real cuantitativo (GeneAmp PCR systems, Applied Biosystems, USA) con un grupo de iniciadores específicos _SARS-CoV. Las células FRhk-4 infectadas con SARS-CoV y no tratadas con el MBL humano recombinante se utilizaron como un grupo de control. Como se muestra en la Figura 9, la infección con SARS-CoV se inhibió a través del tratamiento de MBL humano recombinante en una forma dependiente de dosis. Por ejemplo, cuando las células se cultivaron en la presencia de MBL humano recombinante a través de la concentración de 2.5 µg/ Mí, la proliferación del virus se inhibió enormemente (menos de 15% de proliferación), comparado con el grupo de control. Este 15% es más probablemente del inoculo virus. Las Figuras 10A-10F son una fotografía de microscopio de contraste de fase mostrando las células FRhk-4 infectadas con SARS-CoV. En la Figura 10A, las células sanas no se observaron en el grupo de control que no fue tratado con MBL humano recombinante, pero las Figuras 10B-10F, las células sanas se observaron en grupos de prueba tratados con MBL humano recombinante. En particular, el número de células sanas se incrementó con el aumento de la concentración de MBL humano recombinante . EJEMPLO 9 Cuantificación del MBL contenido en muestras clínicas Los presentes inventores desarrollaron un método para la cuantificación de MBL incluido en las muestras 7 clínicas tales como sangre, suero, saliva, etc., que se diseñó para tomar la ventaja de la capacidad de unión de la proteína pre-S del virus de hepatitis B a MBL. <9-l> Inmovilización de pre-S en la superficie de partículas de oro Se prepararon partículas de oro coloidal de tamaño 20-80 nm, y proteínas pre-S (aproximadamente 100 µg/ml) se agregaron al mismo bajo la condición de pH de 6.0-8.0, lo cual se agitó a temperatura ambiente para la reacción. Después de que se completó la reacción, se agregó suficiente BSA al 10% para hacer una concentración final de 0.3% (peso/volumen) , el cual se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos para la reacción adicional, dando como resultado el bloqueo de la superficie. Se llevó a cabo la centrifugación 12,000 rpm por 15 minutos para separa el sobrenadante. La pella se suspendió en una solución reguladora de pH suplementada con 2% BSA. Según se unen uniformemente las proteínas pre-S a la superficie de las partículas de oro coloidal, se han creado conjugados de colorante que se puedan utilizar en la preparación de un kit de prueba MBL. Los conjugados de colorante despliegan un color rojo o púrpura de las partículas de oro coloidal. <9-2> Preparación de la tira de diagnóstico Utilizando una impresora de inyección de tinta o una impresora de tipo aspersión, se dibujó una línea de prueba y una línea de control sobre la membrana de nitrocelulosa (S&S, USA) para hacer una tira de prueba MBL. Para crear una línea de prueba, se utilizó anticuerpo MB1B5 monoclonal de ratón MBL anti-humano (Dobeel Corp., Corea) y el anticuerpo monoclonal específico pre-S para la línea de control. Los conjugados de colorante preparados anteriormente se adsorbieron sobre la almohadilla de colorante que se hizo de poliéster o fibra de vidrio fija a la parte inferior del soporte sólido de la tira de diagnóstico. Cuando una gota del MBL humano incluyendo la muestra química se gotea sobre una almohadilla de muestra que está unida a la almohadilla de colorante de la tira de diagnóstico, la muestra migra sobre la membrana de nitrocelulosa a través del fenómeno capilar y de difusión. Cuando la muestra alcanza la línea de prueba, los complejos de partícula MBL-pre-S-oro se capturan a través de los anticuerpos monoclonales de ratón MBL anti-humanos en la línea de prueba, de tal forma que la línea de prueba se hace roja. Y cuando la muestra alcanza la línea de control, ambos complejos de partícula MBL-pre-S-oro y pre-S-oro se capturan a través del anticuerpo monoclonal contra pre-S, de tal forma que la línea de control se hace roja. Por consiguiente, cuando una muestra que contiene MBL, tanto la línea de prueba como la línea de control mostrarán la reacción positiva, volviéndose roja. Por el otro lado, cuando una muestra no incluye MBL, solamente la línea de control se hará roja, mostrando la reacción negativa (Figura 11) . Aplicabilidad Industrial Como se ejemplificó aquí anteriormente, los métodos para la producción de lecitina de unión a mañosa humana recombinante multimérica (RhMBL) en cantidad masiva presentada en esta invención es un avance significativo en el desarrollo de MBL como un producto comercial útil. En particular la forma multimérica de MBL eficientemente se une a microorganismos, por lo tanto eficientemente inhibe la infección del virus, bacteria u hongo, de tal forma que se puede utilizar para el desarrollo de una medicina para la prevención y/o tratamiento de infección con microorganismos tales como virus, bacteria, hongo, en particular SARS-CoV, y la producción del kit de diagnóstico para la detección de MBL humano . Los expertos en la técnica apreciarán que las concepciones y modalidades específicas descritas en la descripción anterior pueden fácilmente utilizarse como una base para modificar o diseñar otras modalidades para llevar a cabo los mismos propósitos de la presente invención. Los expertos en la técnica también apreciarán que dichas modalidades equivalentes no se apartar del espíritu y alcance de la invención según se establece en las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. - Un vector de expresión pMSG-MBL caracterizado porque contiene un polinucleótido que codifica la lectina de unión a mañosa humana.
2. 2.- Una línea de células huésped caracterizada porque se transfecta con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1.
3. 3. - La línea de células huésped de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la línea de célula se selecciona del grupo que consiste de células de ovario de hámster Chino (CHO) , hepatocitos y células de riñon embriónico humano (HEK) .
4. 4.- La línea de células huésped de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la línea células es la línea de células CHO MBL Dl-3 depositada en la Colección Coreana para el Cultivo de Tipo bajo el No. de Acceso KCTC 10472BP.
5. 5.- Un método caracterizado para la producción masiva de MBL humano recombinante multimérico, que comprende los siguientes pasos : (1) preparar células huéspedes transfectadas con un vector de expresión que contiene la secuencia de la región de codificación MBL humano; (2) producción de MBL humano recombinante a través de la expresión de la secuencia de la región de codificación de MBL humano en una célula animal y del cultivo de esa célula; y (3) purificar el MBL humano recombinante preparado en el paso (2) .
6. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula huésped es la línea de células CHO MBL Dl-3 depositada bajo el No. de Acceso KCTC 10472 BP.
7. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el paso (2) está caracterizado por los siguientes pasos: suspensión-cultivo de células en un medio de libre de suero/ libre de proteína; y sub-cultivar esas células adaptadas bien al medio libre de suero/libre de proteína para incrementarlas gradualmente, dando como resultado la producción masiva de la proteína RhMBL en la forma de polímero multimérico.
8. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el paso (3) se caracteriza por los siguientes pasos: (a) fraccionar las muestras que contienen el MBL humano recombinante multimérico a través del uso de cromatografía de intercambio de anión; (b) preparar la columna empacando el sustrato al cual se conjugó el virus pre-S de hepatitis B; (c) unir el MBL humano recombinante al virus pre-S de hepatitis B específicamente a través de la adición de una muestra que contiene MBL humano recombinante a la columna en la presencia de un ion de calcio, después de equilibrar la columna; (d) eluir el MBL humano recombinante través de la adición de una solución reguladora de pH suplementada con EDTA o EGTA de la columna sobre la cual se unió el MBL humano recombinante .
9. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la glicoproteína de unión MBL se recolecta de un grupo que consiste de proteína de envoltura viral glicosilada pre-S, proteína bacteriana glicosilada, proteína fúngica glicosilada, y glicoproteína sintética.
10. 10.- Un kit de detección para de MBL humano recombinante caracterizado porque comprende i) un soporte sólido que comprende una línea de prueba y una línea de control en donde los anticuerpos de lectina de unión a mañosa anti-humanos de ratón se fijan sobre la línea de prueba y los anticuerpos IgG anti-ratón o anticuerpos anti-pre-S se fijan sobre la línea de control; ii) una almohadilla de colorante adsorbida con un conjugado de colorante y conectada a la parte inferior del soporte sólido, en donde si los anticuerpos IgG anti-ratón se fijan sobre la línea de control, el conjugado de colorante es un conjugado de anticuerpos con oro de lectina de unión a mañosa anti-humanos de ratón y si los anticuerpos anti-pre-S se fijan a la línea de control, el conjugado de colorante es un conjugado de pre-S-oro; y (iii) una almohadilla de muestra conectada a la parte inferior de la almohadilla de colorante, sobre la cual se carga una muestra.