CN118339189A - 具有改变的糖基化修饰的Fc多肽 - Google Patents

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Abstract

一种包含2，6‑唾液酸化的糖基化修饰的Fc变体。所述Fc变体对人FcRn具有增高的亲和力，同时具有提高的2，6‑唾液酸化程度。所述Fc变体可降低血液IgG水平，同时其2，6‑唾液酸具有抗炎作用。

Description

具有改变的糖基化修饰的Fc多肽 技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种包含唾液酸修饰的Fc变体。
背景技术
静脉注射人免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIG)制剂由来自数千名捐赠者血清的IgG抗体组成，最初被用作免疫功能低下患者的IgG替代疗法。自从30多年前发现IVIG疗法可以改善免疫性血小板减少症以来，IVIG制剂的使用已经扩展到广泛的自身免疫性和炎症性疾病。尽管已经是一种有效的临床疗法，IVIG仍存在不足，例如高达1-2g/kg临床使用剂量影响患者肾功能、IgA杂质导致过敏反应、潜在病毒感染等。因此，需要治疗自身免疫疾病和炎性疾病的改良手段，例如采用具有同等功效的重组产品进行替代。
近年来，随着对IVIG机理的研究，包括占据FcRn位点加快病理性IgG的代谢、少量2，6-唾液酸发挥抗炎作用等，已经有一些可发挥单一功能的替代品。比如增加FcRn亲和力的突变体Abdegs，用于降低血清中IgG含量(Vaccaro，C.等，(2005).″Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels.″Nat Biotechnol 23(10)：1283-1288)。CN107847586A提出向受试者施用有效量的唾液酸修饰多肽，可调节受试者体内Treg细胞水平，达到抑制炎症效果。
但是这些产品都只替代了IVIG部分功能。因此，亟需一种可以替代IVIG产品，解决高蛋白质负担、患者使用不便、感染风险、IgA过敏反应和可获得性受限的问题，降低血液致病性IgG同时具有抗炎功效。
发明内容
本发明通过如下各项技术方案解决了现有技术中存在的上述技术问题：
1.一种包含2，6-唾液酸化的糖基化修饰的Fc变体，所述变体与野生型IgG相比对FcRn具有增高的亲和力。
2.根据项1所述的Fc变体，所述变体对FcRn在中性和/或弱酸性条件下具有增高的亲和力，优选所述中性条件为pH6.5-7.4，优选所述弱酸性条件 为pH5.0-6.5。
3.根据项1或2所述的Fc变体，其中，所述Fc变体是基于选自下组的野生型IgG通过突变得到的：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，优选所述Fc变体是基于野生型IgG1或其同种异型通过突变得到的。
4.根据项1-3中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体与野生型IgG1的野生型Fc片段相比，包含选自下组的突变(EU编号)：M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、M252Y/S254T/T256E、N434A、N434W、N434Y、M428L/N434S、T250Q/M428L、T307Q/N434A、M252Y/V308P/N434Y、T307P/L309Q/Q311R、H285D/T307Q/A378V、L309D/Q311H/N434S、M252Y/T256D、T256D/T307Q、T256D/T307W。
5.根据项1-4中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体与野生型IgG1的野生型Fc片段相比，包含选自下组的突变(EU编号)：V264A、Δ446G、Δ447K、V262E、ΔE293、ΔE294、V264E、F241A、F243A、Y300A。
6.根据项1-5中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体在其糖基化位点上连接有N-聚糖，其中所述N-聚糖是高唾液酸化的，优选所述糖基化位点为N297(EU编号)。
7.根据项6所述的Fc变体，其中所述N-聚糖具有高于20％，优选高于25％，优选高于30％，优选高于35％，优选高于40％，优选高于45％，优选高于50％，优选高于55％，优选高于60％，优选高于65％，优选高于70％，优选高于80％，优选高于85％，优选高于90％，更优选高于95％的2，6-唾液酸化程度。
8.根据项6所述的Fc变体，其中所述每摩尔Fc变体具有高于0.1mol，高于0.2mol，优选高于0.3mol，优选高于0.4mol，优选高于0.5mol，优选高于0.6mol，优选高于0.7mol，优选高于0.8mol，优选高于0.9mol，优选高于1.0mol，优选高于1.1mol，优选高于1.2mol，优选高于1.3mol，优选高于1.4mol，优选高于1.5mol，优选高于1.6mol，优选高于1.7mol，优选高于1.8mol，优选高于1.9mol，更优选高于2.0mol的2，6-唾液酸化程度。
9.根据项6所述的Fc变体，其中所述N-聚糖中大于40％是糖链末端包含1～4个2，6-唾液酸修饰，且所述N-聚糖中少于60％是G0、G1、G0F、G1F、G2或G2F形式的糖基，其中G0-G2分别表示被0-2个半乳糖化的糖基，F表示被岩藻糖化的糖基。
10.根据项1-9中任一项所述的Fc变体，其中所述2，6-唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)、N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物，优选其中所述2，6-唾液酸是NANA。
11.根据项10所述的Fc变体，其中所述Fc变体不包含α-半乳糖修饰。
12.根据项1-11中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体中岩藻糖的含量低于50％，优选的低于10％。
13.一种蛋白，其包含项1-12中任一项所述的Fc变体和任选的有益于所述Fc变体表达的元件；优选所述蛋白在所述Fc变体的N末端包含信号肽和/或在所述Fc变体的C末端包含组氨酸标签；更优选所述蛋白在所述Fc变体的N末端连接有分泌信号序列并在所述分泌序列的N末端连接有甲硫氨酸；更优选所述蛋白从N末端至C末端包含如下或由如下组成：甲硫氨酸、分泌信号序列和所述Fc变体。
14.一种组合物或试剂盒，包含项1-12中任一项所述的Fc变体或项13所述的蛋白。
15.一种制备根据项1-12中任一项所述的Fc变体的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)对野生型IgG1的野生型Fc片段进行突变以获得相应的Fc变体，其中所述野生型Fc片段序列如SEQ ID NO：12所示；和
(b)采用β-1，4半乳糖基转移酶(β1，4-GT)和/或α-2，6唾液酸转移酶(α2，6-ST)对所述Fc变体进行处理，优选所述β1，4-GT和/或α2，6-ST为哺乳动物来源，更优选为人来源。
16.根据项15所述的方法，其中步骤(a)中的所述突变选自下组：M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、V264A、Δ446G、Δ447K、V262E、T307P/L309Q/Q311R、V264E、ΔE293、ΔE294、M252Y/S254T/T256E、N434A、N434W、N434Y、F241A、F243A、M428L/N434S、L309D/Q311H/N434S、M252Y/T256D、T250Q/M428L、T307Q/N434A、M252Y/V308P/N434Y、H285D/T307Q/A378V、T256D/T307Q、T256D/T307W、Y300A。
17.一种分离的核酸，其编码根据项1-12中任一项所述的Fc变体或项13所述的蛋白。
18.一种载体，其包含根据项17所述的核酸。
19.一种宿主细胞，其包含根据项17所述的核酸或根据项18所述的载 体。
20.一种制备根据项1-12中任一项所述的Fc变体的方法，所述方法包括如下步骤：
(i)在允许所述Fc变体表达的条件下在培养基中培养如项19所述的宿主细胞；和
(ii)任选的，从所培养的细胞或细胞的培养基中纯化所述Fc变体。
21.根据项1-12中任一项所述的Fc变体、根据项13所述的蛋白或根据项14所述的组合物或试剂盒在制备用于降低血液IgG的药物中的用途。
22.根据项1-12中任一项所述的Fc变体、根据项13所述的蛋白或根据项14所述的组合物或试剂盒在制备用于治疗抗体介导的病症的药物中的用途，优选地其中所述抗体介导的病症是自身免疫性疾病或高球蛋白血症。
23.根据项22所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自下组：阿狄森氏病、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、抗GBM肾小球肾炎、抗NMDAR脑炎、抗磷脂血症综合征、自身免疫性胃炎、自身免疫性失聪、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺机能减退、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性大疱性皮肤病、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多种内分泌病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、炎症性脱髓鞘性多神经病、急性运动性轴索神经病、丘-施氏综合征、腹部疾病、自身免疫性荨麻疹、克罗恩病、CREST综合征、乳糜泻、德戈斯病、抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎症、自身免疫性中性白细胞减少症、后天性大疱性表皮松解、原发性混合冷凝球蛋白血栓、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫斯病、格林巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、川崎氏病、美尼尔综合征、混合性结缔组织病、莫伦溃疡、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、僵人综合征、完全性先天性心脏阻滞、获得性大疱性表皮松懈病、落叶性天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多腺性自身免疫综合征类型、原发性胆汁性肝硬化、多腺性自身免疫综合征类型、多腺性自身免疫综合征类型、多发性肌炎/皮肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺综合征、莱特尔综合征、风湿性心脏病、血友病-获得性FVIII缺乏、Lambert-Eaton肌无力综合症、多发性骨髓瘤、肉状瘤病、胶原沉着病、干燥综合征、 亚急性甲状腺炎、交感性眼炎、全身性红斑狼疮、高安氏动脉炎、 s综合症、I型糖尿病、白癜风、伏格特-小柳-原田三氏综合征或韦格纳肉芽肿病、急性哮喘或慢性哮喘、器官移植排斥、原发性进行性多发性硬化症、系统性硬化症、血清病和免疫复合物超敏反应；其中，所述免疫复合物例如抗药抗体和药物形成的免疫复合物。
优选的，所述自身免疫性疾病选自下组：抗肾小球基底膜抗体病(抗GBM抗体病)、致病性IgG抗体介导的血栓性低血小板症、格林巴利综合征(GBS)、自身免疫性脑炎(AE)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、器官移植术后抗体介导的排斥反应(AMR)、重症肌无力(MG)；其中所述致病性IgG抗体介导的血栓性低血小板症优选为血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症(VITT)。
24.根据项22所述的用途，其中所述抗体介导的病症是可使用静脉注射免疫球蛋白(IVIG)、皮下注射免疫球蛋白(SCIG)、血浆去除术和/或免疫吸附治疗的。
25.根据项22所述的用途，其中所述的高球蛋白由白细胞产生，其中所述白细胞选自B细胞、异常B细胞；所述球蛋白包括γ球蛋白；所述高球蛋白血症选自下组：原发性单克隆丙种球蛋白血症、结缔组织病、肝脏病、传染病、类肉瘤病、重症肌无力、霍奇金病、白塞(Behcet)病、肾炎、过敏性紫癜、免疫性(或自发性)血小板减少症、恶性单克隆丙种球蛋白血症(如多发性骨髓瘤、重链病、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症等)、继发性单克隆丙种球蛋白血症(如非淋巴网状系统肿瘤、单核细胞白血病、冷球蛋白血症等)、良性M蛋白血症、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、华氏巨球蛋白血症、AL型淀粉样变性、孤立性浆细胞瘤(骨或骨外)、POMES综合征、反应性浆细胞增多症、转移性癌的溶骨性病变、浆母细胞性淋巴瘤和单克隆免疫球蛋白相关肾损害(MGRS)，优选所述所述高球蛋白血症为多发性骨髓瘤。
26.根据项1-12中任一项所述的Fc变体、根据项13所述的蛋白或根据项14所述的组合物或试剂盒在制备用于预防和/或治疗受试者中的实体器官移植后自身抗体介导的器官排斥的药物中的用途。
27.根据项26所述的用途，其中所述器官选自下组：肾脏、胰岛、胰腺、 心脏、肝脏、肺或小肠。
28.根据项1-12中任一项所述的Fc变体、根据项13所述的蛋白或根据项14所述的组合物或试剂盒在制备用于基因治疗的药物中的用途。
29.根据项1-12中任一项所述的Fc变体、根据项13所述的蛋白或根据项14所述的组合物或试剂盒在制备用于以病毒载体为基础的基因治疗前清除体内预存的抗病毒载体的中和抗体的药物中的用途。
30.根据项1-12中任一项所述的Fc变体、根据项13所述的蛋白或根据项14所述的组合物或试剂盒在制备用于清除受试者中的自身抗体以使得含Fc剂更好发挥疗效的药物中的用途。
31.根据项1-12中任一项所述的Fc变体、根据项13所述的蛋白或根据项14所述的组合物或试剂盒在制备用于在已施用含Fc剂的受试者中降低所述含Fc剂的血清水平的药物中的用途。
32.根据项30或31所述的用途，其中所述含Fc剂是治疗剂或诊断剂，优选所述含Fc剂是抗体、Fc融合蛋白抗体药物缀合物。
33.根据项21-32中任一项所述的用途，其中将所述Fc变体与另外的治疗剂同时或依次适用于所述受试者，其中所述另外的治疗剂是抗炎剂、白细胞消耗剂、B细胞消耗剂；其中所述B细胞消耗剂优选用于肿瘤治疗的抗体，更优选所述抗体与CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD70、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD3、CD11a、CD14、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD103、CD134、CD137、CD138、CD152、CD3、IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-12、IL-23、C5、BAFF、BLyS、BCMA、CXCR-4、ICAM-1、SLAMF7/CS1、TNFα、IgE、CD85或CD86特异性结合。
34.根据项33所述的用途，其中所述另外的治疗剂选组下组：利妥昔单抗、达克珠单抗、巴利昔单抗、莫罗单抗-CD3、英夫利昔单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、依法利珠单抗、那他珠单抗、托珠单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、卡那单抗、优特克单抗、贝利木单抗、达雷妥尤单抗、Isatuximab或其组合。
本发明的一个或多个实施方案的详细内容如下所示。本发明的其它特征、目的和优点在说明书和权利要求中将是显而易见的。
附图说明
图1显示本发明的不同变体(m1、m4和m6)对自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型的疾病评分的影响，其中PBS(磷酸盐缓冲盐水)为阴性对照，IVIG为阳性对照。疾病评分越低代表健康程度越高；
图2显示本发明的不同变体(m1、m4和m6)对EAE小鼠模型中Treg细胞占比(CD25 +foxp3 +/CD3 +CD4 +×100％)的影响，其中PBS为阴性对照，IVIG为阳性对照。Treg细胞占比越高代表抗炎功效越好；
图3显示本发明的不同突变体(m1、m4和m6)在EAE小鼠模型中对血液IgG含量的影响，其中PBS为阴性对照，IVIg为阳性对照；
图4显示本发明的不同突变体(m1、m4和m6)在EAE小鼠模型中对血液中特异性抗MOG抗体含量的影响，其中PBS为阴性对照，IVIg为阳性对照。
发明详述
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有抗炎作用、同时可降低血液病理性IgG水平的Fc变体，制备它们的方法。
具体的，本发明涉及一种包含2，6-唾液酸修饰的Fc变体。所述Fc变体包含20％以上的2，6-唾液酸修饰。同时，发明人意外的发现，本发明提高FcRn亲和力的突变，叠加增加唾液酸修饰突变后，相对于单独的增加唾液酸修饰突变，具有增加的唾液酸修饰水平，同时不影响FcRn亲和力。且所述Fc变体在包含降低血液IgG水平、抗炎功能同时，具有延长的血液半衰期。
1.定义
术语“Fc片段”“Fc区域”是指排除第一免疫球蛋白恒定区结构域的全长免疫球蛋白的恒定区。IgG的Fc片段包含CH2、CH3结构域和CH1和CH2之间的下铰链区。IgG1的Fc区由CH2-CH3下铰链，即从氨基酸C226到羧基末端的部分构成，编号根据EU编号或Kabat等效物表示。其他IgG亚类的类似结构域可以通过IgG亚类的重链或重链片段的氨基酸序列与人IgG1的氨基酸序列的比对来确定。本文中“EU编号”或“EU编号或Kabat等效物”是指人IgG抗体残基的编号。
根据本发明使用的Fc片段还可以包含226位上游(EU编号)的上部铰链区的一部分。在这种情况下，优选使用包含位于位置216和226之间的区域 的一部分的人IgG1的Fc片段。在这种情况下，“人IgG1的Fc片段”是指从氨基酸216，217，218，219，220，221，222，223，224或225至羧基末端的部分。术语“Fc片段”也指单链Fc片段，为通过由多肽接头连接的两个Fc单体的基因融合而获得的单链Fc片段。单链Fc片段自然折叠成功能性二聚体Fc区域。
术语“野生型Fc片段”是指野生型Fc区中的参考多肽或任选含有除所考虑之外突变的变体。术语“野生型”或“WT”在本文中是指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，即其是天然来源的(包括等位基因变异)，并且尚未通过分子生物学技术有意修饰如诱变。例如，“野生型”Fc区特别指具有序列SEQ ID NO：13的IgG1 Fc区(G1m1，17同种异型)，SEQ ID NO：12(G1m3同种异型)的IgG1 Fc区。
术语“Fc变体”是指在Fc区域进行一个或多个氨基酸的取代、添加、缺失所得到的Fc片段。Fc变体可包含其他区域，包括但不限于Fab、scFv、VHH等。
术语“半衰期”是指Fc片段一旦存在于施用其的患者的血清中，从循环中或从其他组织消除一半的时间量。
术语“Fcγ受体”或“FcγR”是指称为CD64(FcγRI)、CD32(FcγRII)和CD 16(FcγRIII)的IgG型免疫球蛋白受体，特别是五种表达的受体(FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb)。除了人FcγRIIb(其是抑制免疫细胞活化的受体)之外，它们都是效应细胞活化受体(Muta T等，Nature，1994，368：70-73)。
术语“FcRn”指新生Fc受体。意指结合IgG抗体Fc区并且至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。如本领域所已知的，功能FcRn蛋白包含两条多肽，它们通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文中另外指明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合体。示例性的FcRn分子包括由RefSeq NM_004107中所示的FCGRT基因编码的人FcRn。
术语“效应细胞”是指任何带有Fc受体的细胞，例如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、树突细胞、郎格罕细胞和血小板。
术语“N-聚糖”、“N-连接的聚糖”、“糖蛋白”、“糖基化”和“糖形式”是指N- 连接的寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺键连接至多肽的天冬酰胺残基的寡糖。在糖蛋白上发现的主要糖是葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和唾液酸(SA，包括NANA，NGNA及其衍生物和类似物，包括乙酰化的NANA或乙酰化的NGNA)。在糖工程毕赤酵母中，唾液酸仅是N-乙酰基神经氨酸(NANA)(Hamilton等，Science 313(5792)：1441-1443(2006))。N-聚糖具有共同的五糖核心，即Man3GlcNAc2，其中“Man”是指甘露糖，“Glc”是指葡萄糖，“NAc”是指N-乙酰基，而GlcNAc是指N-乙酰基葡糖胺。N聚糖的区别在于，添加到Man3GlcNAc2(“Man3”)核心结构中的外围糖(例如，GlcNAc，半乳糖，岩藻糖和唾液酸)所包含的分支(触角)的数量，也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“低聚甘露糖核心”。N-聚糖根据其分支成分(例如，高甘露糖，复合物或杂化物)分类。一个N-聚糖末端最多可被修饰上4个唾液酸。
术语“G0”是指没有半乳糖或岩藻糖的复杂的双向触角寡糖(GlcNAc 2Man 3GlcNAc 2)，“G1”是指没有岩藻糖并且包含一个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖(GalGlcNAc 2Man 3GlcNAc 2)，“G2”是指没有岩藻糖并且包含两个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖(Gal 2GlcNAc 2Man 3GlcNAc 2)，“G0F”是指包含一个核心岩藻糖并且没有半乳糖的复杂的双向触角寡糖(GlcNAc 2Man 3GlcNAc 2F)，“G1F”是指包含一个核心岩藻糖以及一个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖(GalGlcNAc 2Man 3GlcNAc 2F)，“G2F”是指包含一个核心岩藻糖以及两个半乳糖残基的复杂的双向触角寡糖(Gal 2GlcNAc 2Man 3GlcNAc 2F)。
术语“杂合”N-聚糖是指在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端具有至少一个GlcNAc并且在1上具有零个或多个一个甘露糖的N-聚糖。三甘露糖核心的6个甘露糖臂。
术语“唾液酸修饰水平”是指Fc变体总的N-聚糖末端唾液酸修饰数量和/或其占总Fc变体的比例。例如，每个Fc变体分子平均具有0.1个、0.2个、0.5个、1个、2个、4个唾液酸修饰；或者，Fc变体的N-聚糖具有高于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，优选高于65％的2，6-唾液酸化程度。唾液酸可以在蛋白表达时被修饰，也可以通过体外在添加唾液酸转移酶等酶的溶液中被修饰。修饰水平高意指每个Fc变体分子平均具有的N-聚糖末端的唾液酸数量高。
术语“高唾液酸化”是指将一个或多个唾液酸基团添加到Fc区域的N-聚糖上。一个或多个唾液酸基团的添加可以通过酶促反应、通过细胞反应或通过靶向Fc唾液酸化中涉及的一个或多个氨基酸的Fc的定向诱变来进行。一个N-聚糖末端最多可被修饰上4个唾液酸。高唾液酸化具体指Fc变体的N-聚糖具有高于20％的至少1个唾液酸修饰，或者每个Fc变体分子平均至少具有0.2个唾液酸修饰。
IgG是血液中主要的血清免疫球蛋白。它是由两条相同的重链和两条轻链组成的糖蛋白，重链和轻链依次由可变区和恒定区组成。IgG在其两条重链的每一个的CH2结构域的Asn297位置上含有单个的、N-连接的聚糖。该共价连接的、复杂的碳水化合物是由一个核心的、双分支的含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和甘露糖(Mannose)的戊多糖(penta-polysaccharide)组成。
术语“载体”或“表达载体”在此用于意指根据本发明作为用于将期望基因引入到细胞中并在细胞中表达该期望基因的媒介物(vehicle)使用的载体。本领域技术人员知道，这样的载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。一般来说，适于本发明的载体将包含选择标志物、有利于克隆期望基因的合适限制性位点以及进入真核生物或原核生物细胞和/或在其中复制的能力。
多种表达载体系统均可用于本发明的目的。例如，一类载体利用来源于动物病毒的DNA元件，所述动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另一些涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外地，已使DNA整合到其染色体中的细胞可通过引入允许选择经转染宿主细胞的一种或更多种标志物来选择。所述标志物可赋予营养缺陷型宿主原养型、赋予杀生物剂抗性(例如，抗生素)或针对重金属(例如铜)的抗性。可使可选择标志物基因与待表达的DNA序列直接连接，或者通过共转化将其引入到同一细胞中。mRNA的最佳合成还可需要其他元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
更一般地，一旦已经制备了编码Fc变体的载体或DNA序列，就可将表达载体引入到合适的宿主细胞中。即，可转化宿主细胞。质粒向宿主细胞中的引入可通过本领域技术人员公知的多种技术来完成。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与有包膜的DNA的细胞融合、微注射和用完整病毒感染。更优选地，通过电穿孔来将质粒引 入宿主中。将经转化的细胞在适于产生Fc变体的条件下培养，并测定Fc变体的表达。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
本文中使用的术语“转化”应以广泛含义使用，指将DNA引入接受者宿主细胞中，从而改变基因型并由此导致接受者细胞的改变。
同样地，“宿主细胞”指已转化有载体的细胞，所述载体使用重组DNA技术构建并且编码至少一种异源基因。除非另外明确指出，否则在描述用于从重组宿主分离多肽的方法时，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，指代Fc变体的来源。换言之，从“细胞”回收Fc变体可意指从沉降的全细胞，或者从同时含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。
2.本发明的Fc变体
本发明涉及一种包含2，6-唾液酸化的糖基化修饰的Fc变体、其组合物以及它们的用途。所述Fc变体与野生型IgG相比对至少一种Fc受体具有增高的亲和力，其中所述至少一种Fc受体选自下组：FcRn、Fcγ受体和补体C1q，优选所述Fc受体为人FcRn。
在一个实施方案中，所述变体对人FcRn在中性条件下具有增高的亲和力，优选所述中性条件为pH 6.5-7.4。在一个实施方案中，所述变体对FcRn在弱酸性条件下具有增高的亲和力，优选所述弱酸性条件为pH 5.0-6.5。
在一个实施方案中，所述Fc变体是基于选自下组的野生型IgG通过突变得到的：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，优选所述Fc变体是基于野生型IgG1通过突变得到的。
在一个实施方案中，所述Fc变体与野生型IgG1的野生型Fc片段相比，包含选自下组的突变(EU编号)：N434A、N434W、N434Y、M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T250Q/M428L、T307Q/N434A、M252Y/V308P/N434Y、T307P/L309Q/Q311R、H285D/T307Q/A378V、L309D/Q311H/N434S、M252Y/T256D、T256D/T307Q、T256D/T307W。
在一个实施方案中，所述野生型Fc片段如SEQ ID NO：12所示。在本文所述的一些实施例中，可对抗体的恒定区作出氨基酸替换。例如，可在本发明的Fc片段中使用不同的IgG1同种异型，诸如熟知的G1m17同种异型、G1m3同种异型或G1m1同种异型，或它们的组合。
可用于本发明的Fc变体可进一步包含另外的突变，所述突变包括但不限于Dall′Acqua等描述的突变(WF，D.A.等，(2002).Journal of immunology(Baltimore，Md.：1950)169(9)：5171-5180)、Shan等描述的突变(Shan，L.等，(2016).PLoS One 11(8)：e0160345)、Lee等描述的突变(Lee，C.H.等，(2019).Nat Commun 10(1)：5031)、Mackness等描述的突变(Mackness，B.C.等，(2019).MAbs 11(7)：1276-1288)、Christophe等描述的突变(Dumet Christophe，Pottier Jérémy，Gouilleux-Gruart Valérie等，MAbs，2019，11：1341-1350)。
可用于本发明的Fc变体可进一步包含另外的突变，所述突变包括能够提高Fc和FcγR亲和力的突变或者糖修饰，所述突变优选为S239D/I322E/A330L、S239D/I322E、I322E、I322E/A330L、K326W/E333S；所述糖修饰优选为无岩藻糖修饰。本发明的Fc变体可以为单体、二聚体、多聚体。可用于本发明的Fc变体可进一步包含另外的突变，所述突变包含包括但不限于Wang等描述的突变(Wang Xinhua，Mathieu Mary，Brezski Randall J，(2018)，Protein Cell，9(1)，63-73.doi：10.1007/s13238-017-0473-8)。
Fc变体的糖基化修饰
Fc的糖基化修饰参与抗体功能的发挥。所述糖基化修饰包括但不限于：甘露糖基化、岩藻糖基化、半乳糖基化和唾液酸化。其中，唾液酸化的修饰有多种结构，包括2，3-连接的唾液酸修饰、2，6-连接的唾液酸修饰、2，8-连接唾液酸的修饰等，其中仅2，6-连接唾液酸修饰具有抗炎功能。研究表明，2，6-连接唾液酸修饰是IVIG抗炎的机理之一(Li，D.等，(2021).Theranostics 11(11)：5430-5446)。
Fc的2，6-连接的唾液酸修饰可以通过氨基酸序列的突变得到提高。本发明的Fc变体与野生型IgG1的野生型Fc片段相比具有提高的2，6-连接的唾液酸修饰。在一个实施方案中，本发明的Fc变体与野生型IgG1的野生型Fc片段相比，包括选自下组的突变(EU编号)：V264A、Δ446G、Δ447K、V262E、ΔE293、ΔE294、V264E、F241A、F243A、Y300A。
在一个实施方案中，所述野生型Fc片段如SEQ ID NO：12所示。在本文所述的一些实施例中，可对抗体的恒定区作出氨基酸替换。例如，可在本发明的Fc片段中使用不同的IgG1同种异型，诸如熟知的G1m17同种异型、G1m3同种异型或G1m1同种异型，或它们的组合。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体在其糖基化位点上具有N-聚糖， 其中所述N-聚糖具有双触角和/或三触角和/或四触角型聚糖结构，带有短链，是高唾液酸化的。优选地，所述N-聚糖具有双触角型聚糖结构。优选地，所述糖基化位点为Asn297(EU编号)。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体的N-聚糖中的大于40％、优选大于40％是糖链末端包含1～4个2，6-唾液酸修饰，且本发明的Fc变体的N-聚糖中少于60％、优选少于50％是G0、G1、G0F、G1F、G2或G2F形式的糖基。其中：G0-G2分别表示被0-2个半乳糖化的糖基，F表示被岩藻糖化的糖基。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体的N-聚糖具有高于20％，优选高于25％，优选高于30％，优选高于35％，优选高于40％，优选高于45％，优选高于50％，优选高于55％，优选高于60％，优选高于65％，优选高于70％，优选高于80％，优选高于85％，优选高于90％，更优选高于95％的2，6-唾液酸化程度。在一个实施方案中，每摩尔本发明的Fc变体具有高于0.1mol，高于0.2mol，优选高于0.3mol，优选高于0.4mol，优选高于0.5mol，优选高于0.6mol，优选高于0.7mol，优选高于0.8mol，优选高于0.9mol，优选高于1.0mol，优选高于1.1mol，优选高于1.2mol，优选高于1.3mol，优选高于1.4mol，优选高于1.5mol，优选高于1.6mol，优选高于1.7mol，优选高于1.8mol，优选高于1.9mol，更优选高于2.0mol的2，6-唾液酸化程度。
在一个实施方案中，所述2，6-唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)、N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物。在一个实施方案中，所述2，6-唾液酸是NANA。在一个实施方案中，其中所述Fc变体不包含α-半乳糖修饰。在一个实施方案中，其中所述Fc变体不包含NGNA和α-半乳糖修饰。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体的N-聚糖中岩藻糖的含量低于50％，优选低于40％，优选低于30％，优选低于20％，优选低于10％。
在一个实施方案中，本发明还涵盖包含本发明的Fc变体一种分离的结合分子，所述结合分子为包含下列的重组多肽：(i)能够结合在细胞上或与细胞结合的靶分子的结合结构域，和(ii)具有人IgG1重链的CH2和CH3恒定结构域的氨基酸序列的Fc结构域；其特征在于所述结合分子能够结合在靶细胞上的靶分子。所述结合分子例如全长IgG抗体、Fc融合蛋白等。
3.本发明Fc变体的制备方法
在一个实施方案中，本发明提供了提高Fc或其变体的2，6-唾液酸修饰的方法，所述方法包括采用半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶对所述Fc或 其变体进行处理以提高2，6-唾液酸的修饰。在一个实施方案中，用这两种酶通过体外修饰途径和/或体内修饰途径修饰Fc。在一个实施方案中，体外修饰途径为：将半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶与Fc蛋白一起在缓冲液中反应，从而增加末端唾液酸修饰。在一个实施方案中，体内修饰途径为：将半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶的基因和Fc基因转到细胞中，Fc在表达时即被修饰上唾液酸。
本文所述的方法包括使用半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶，例如β-1，4半乳糖基转移酶(例如B4GALT1基因编码的β1，4-半乳糖基转移酶1)，例如α-2，6唾液酸转移酶(例如ST6Gal-1)。许多ST6Gal唾液酸转移酶是本领域已知的并且可商购(参见，例如，Takashima，Biosci.Biotechnol.Biochem.72：1155-1167(2008)；Weinstein等，J.Biol.Chem.262：17735-17743(1987))。β-1，4-半乳糖基转移酶1是将半乳糖转移到末端的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的关键酶。ST6Gal-1催化唾液酸通过α-2，6键从唾液酸供体(例如胞苷5′-单磷酸-N-乙酰基神经氨酸)转移至聚糖的末端半乳糖残基。
在一个实施方案中，本发明提供了制备本发明的Fc变体的方法，所述方法包括：(a)对野生型IgG1的野生型Fc片段进行突变以获得相应的Fc变体，其中所述野生型Fc片段序列如SEQ ID NO：12所示；和(b)采用β-1，4半乳糖基转移酶和/或α-2，6唾液酸转移酶对所述Fc变体进行处理。在一个实施方案中，所述β1，4-GT和/或α2，6-ST为哺乳动物来源，更优选的为人来源。
在一个实施方案中，步骤(a)中的所述突变选自下组：M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、V264A、Δ446G、Δ447K、V262E、T307P/L309Q/Q311R、V264E、ΔE293、ΔE294、M252Y/S254T/T256E、N434A、N434W、N434Y、F241A、F243A、M428L/N434S、L309D/Q311H/N434S、M252Y/T256D、T250Q/M428L、T307Q/N434A、M252Y/V308P/N434Y、H285D/T307Q/A378V、T256D/T307Q、T256D/T307W、Y300A。
在一个实施方案中，步骤(a)中的Fc变体是通过如下获得的：
(i)在允许本发明的Fc变体表达的条件下在培养基中培养包含编码本发明的Fc变体的核酸的宿主细胞；和
(ii)任选地从所培养的细胞或细胞的培养基中纯化本发明的Fc变体。
在一个实施方案中，所述宿主细胞不产生具有免疫原性的NGNA和α-半乳糖。
在一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的Fc变体的分离的核酸；包括所述核酸的载体；和包括所述核酸和/或载体的宿主细胞。通常将编码本文中公开的Fc变体的多核苷酸插入在表达载体中以用于引入宿主细胞中，所述宿主细胞可用于产生期望量的所要求保护的Fc变体，即本发明的Fc变体。因此，在某些方面，本发明提供了包含本文中公开的多核苷酸的表达载体以及包含这些表达载体和多核苷酸的宿主细胞。
在一个实施方案中，编码本文所述的Fc变体的核酸在宿主细胞中与一种或多种β-1，4半乳糖基转移酶和/或α-2，6唾液酸转移酶共表达，并且该酶唾液酸化本文所述的Fc变体。
在一些实施方案中，在宿主细胞中表达Fc变体，并且宿主细胞内源性表达或重组表达β-1，4半乳糖基转移酶和/或α-2，6唾液酸转移酶。另外或可替代地，在增加细胞中β-1，4半乳糖基转移酶和/或α-2，6唾液酸转移酶的活性的条件下培养宿主细胞，从而产生具有Fc区的糖蛋白，其具有如本文所述唾液酸化的分支聚糖，例如在培养基中添加Mn 2+。
在一些实施方案中，通过将纯化β-1，4半乳糖基转移酶和/或α-2，6唾液酸转移酶，与含有本文所述的Fc变体接触，从而唾液酸化本文所述Fc变体。在一个实施方案中，用于表达本发明的Fc变体的宿主细胞系来源于哺乳动物；本领域技术人员可确定最适用于表达期望基因产物的特定宿主细胞。示例性的宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR -)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、293(人肾)。在一个实施方案中，所述细胞系使得由其表达的Fc变体的糖基化改变，例如无岩藻糖基化(例如，PER.C6或FUT8敲除CHO细胞系)。在一个实施方案中，可使用NS0细胞。特别地优选CHO细胞。宿主细胞系通常可从商业服务美国组织培养物保藏中心(AmericanTissue Culture Collection)获得，或者可从公开文献获得。
体外产生允许扩大规模以得到大量的本发明的Fc变体。哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的并且包括在例如生物反应器中的均匀悬浮培养，或者在例如中空纤维、微胶囊中或在琼脂糖微珠上的固定化或截留式细胞培养。如果需要和/或期望的话，可通过常规的纯化方法(例如凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水层析等)纯化Fc变体的溶液。
还可在非哺乳动物细胞(例如酵母或植物细胞)中表达编码本发明Fc变体的基因。真核微生物中最常用的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常 见的面包酵母(baker’s yeast)，但是多种其他菌株通常也是可利用的。
除基于细胞的表达系统之外，还可使用无细胞或化学合成方法来产生Fc变体。在某些实施方案中，通过体外化学合成来产生Fc变体。
本发明还涉及包含本发明的Fc变体的蛋白。
在一些实施方案中，所述蛋白包含本发明的Fc变体和有益于所述变体表达的元件。在一些实施方案中，所述蛋白在所述变体的N末端包含信号肽。在一些实施方案中，所述蛋白在所述变体的N末端连接有分泌信号序列并在所述分泌序列的N末端连接有甲硫氨酸；和/或在所述变体的C末端连接有组氨酸标签。在一些实施方案中，所述蛋白从N末端至C末端包含如下或由如下组成：甲硫氨酸、分泌信号序列和所述变体。
4.包含本发明Fc变体的组合物或试剂盒
本发明涉及一种组合物或试剂盒，其包括本发明的Fc变体或其编码核酸。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物或试剂盒进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
药物载剂可以是液体，并且药物组合物可以为溶液形式。液体载剂用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。活性成分可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载剂中，例如水、有机溶剂、二者的混合物或药学上可接受的油或脂肪。
所述药物组合物可配制成用于通过推注肠胃外施用(例如，静脉内或肌内)。所述组合物可采用例如在油性或水性载剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可为用于与合适载剂(例如，无热原水)组合的散剂的形式。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物进一步包含：抗体、小分子靶向药物和/或降解IgG的蛋白。
在一个具体的实施方案中，所述抗体的靶点选自下组：细胞表面蛋白、细胞因子、激素、酶、胞内信使、胞间信使和免疫检查点。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物进一步包含：病毒载体药物或基因治疗药物，优选地，所述病毒载体药物选自下组：溶瘤病毒、基因治疗病毒和病毒载体疫苗。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物进一步包含：能降低血液IgG水平的药物。
本发明还提供了一种产品，所述产品含有本发明的变体、蛋白和/或组合物和另外的治疗剂；所述另外的治疗剂选自下组：病毒载体药物、抗体、能降低血液IgG水平的多肽药物。
本发明还提供了一种试剂盒或套装药盒，所述试剂盒包含：1)治疗有效量的包含本发明的变体、蛋白和/或组合物的药物；和2)治疗有效量的另外的治疗剂；所述另外的治疗剂选自下组：病毒载体药物、抗体、能降低血液IgG水平的多肽药物；所述病毒载体药物优选溶瘤病毒、基因治疗病毒。
该试剂盒可以包含涉及治疗有效量的本发明的变体、蛋白和/或组合物和治疗有效量的另外的治疗剂施用(例如，剂量信息、给药时间间隔信息)的说明书。所述另外的治疗剂选自下组：病毒载体药物、抗体、能降低血液IgG水平的多肽药物；所述病毒载体药物优选溶瘤病毒、基因治疗病毒。
5.本发明Fc变体的用途及其治疗疾病的方法
本发明还涉及本发明的变体、蛋白、组合物和/或试剂盒用于治疗疾病的方法或在制备药物中的用途。在一些实施例中，所述药物用于治疗受试者中的自身抗体介导的病症。在一些实施例中，所述药物用于降低受试者中的IgG水平，所述血液IgG为人体血液免疫球蛋白G和/或治疗型免疫球蛋白G。在一些实施例中，所述药物用于预防和/或治疗受试者中的实体器官移植后自身抗体介导的器官排斥。在一些实施例中，所述药物用于基因治疗。在一些实施例中，所述药物用于在病毒载体为基础的基因治疗前清除体内预存的抗病毒载体的中和抗体。在一些实施例中，所述药物用于治疗受试者中的肿瘤。在一些实施例中，所述药物用于清除受试者中的自身抗体以使得含Fc剂更好发挥疗效。在一些实施例中，所述药物用于在已施用含Fc剂的受试者中降低所述含Fc剂的血清水平。
本发明提供本发明的Fc变体或包含所述变体的蛋白、组合物或试剂盒在制备用于降低受试者中的IgG或血液IgG的药物中的用途。本发明还提供本发明的Fc变体或包含所述变体的蛋白、组合物或试剂盒在制备用于治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病的药物中的用途。所述用途包括给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的Fc变体或其编码核酸。本发明还提供本发明的Fc变体或包含所述变体的蛋白、组合物或试剂盒用于治疗抗体介导的病症(优选自身免疫性疾病和/或炎性疾病)的方法。
在一些实施例中，所述自身免疫性疾病选自下组：阿狄森氏病、斑秃、 强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、抗GBM肾小球肾炎、抗NMDAR脑炎、抗磷脂血症综合征、自身免疫性胃炎、自身免疫性失聪、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺机能减退、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性大疱性皮肤病、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多种内分泌病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、炎症性脱髓鞘性多神经病、急性运动性轴索神经病、丘-施氏综合征、腹部疾病、自身免疫性荨麻疹、克罗恩病、CREST综合征、乳糜泻、德戈斯病、抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎症、自身免疫性中性白细胞减少症、后天性大疱性表皮松解、原发性混合冷凝球蛋白血栓、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫斯病、格林巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、川崎氏病、美尼尔综合征、混合性结缔组织病、莫伦溃疡、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、僵人综合征、完全性先天性心脏阻滞、获得性大疱性表皮松懈病、落叶性天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多腺性自身免疫综合征类型、原发性胆汁性肝硬化、多腺性自身免疫综合征类型、多腺性自身免疫综合征类型、多发性肌炎/皮肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺综合征、莱特尔综合征、风湿性心脏病、血友病-获得性FVIII缺乏、Lambert-Eaton肌无力综合症、多发性骨髓瘤、肉状瘤病、胶原沉着病、干燥综合征、亚急性甲状腺炎、交感性眼炎、全身性红斑狼疮、高安氏动脉炎、 综合症、I型糖尿病、白癜风、伏格特-小柳-原田三氏综合征或韦格纳肉芽肿病、急性哮喘或慢性哮喘、器官移植排斥、原发性进行性多发性硬化症、系统性硬化症、血清病和免疫复合物超敏反应；其中，所述免疫复合物例如抗药抗体和药物形成的免疫复合物。在一些实施例中，所述自身免疫性疾病选自抗肾小球基底膜抗体病(抗GBM抗体病)、致病性IgG抗体介导的血栓性低血小板症、格林巴利综合征(GBS)、自身免疫性脑炎(AE)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、器官移植术后抗体介导的排斥反应(AMR)、重症肌无力(MG)；其中所述致病性IgG抗体介导的血栓性低血小板症优选为血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症(VITT)。
在一些实施例中，所述抗体介导的病症是可使用静脉注射免疫球蛋白 (IVIG)、皮下注射免疫球蛋白(SCIG)、血浆去除术和/或免疫吸附治疗的。在一些实施例中，所述抗体介导的病症为高球蛋白血症。在一些实施例中，所述的高球蛋白由白细胞产生，所述白细胞选自B细胞、异常B细胞；所述球蛋白包括γ球蛋白；所述的高球蛋白血症选自下组：原发性单克隆丙种球蛋白血症、结缔组织病、肝脏病、传染病、类肉瘤病、重症肌无力、霍奇金病、白塞(Behcet)病、肾炎、过敏性紫癜、免疫性(或自发性)血小板减少症、恶性单克隆丙种球蛋白血症(如多发性骨髓瘤、重链病、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症等)、继发性单克隆丙种球蛋白血症(如非淋巴网状系统肿瘤、单核细胞白血病、冷球蛋白血症等)、良性M蛋白血症、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、华氏巨球蛋白血症、AL型淀粉样变性、孤立性浆细胞瘤(骨或骨外)、POMES综合征、反应性浆细胞增多症、转移性癌的溶骨性病变、浆母细胞性淋巴瘤、单克隆免疫球蛋白相关肾损害(MGRS)等。所述病症优选多发性骨髓瘤。
器官移植中宿主IgG会引起急性移植排斥反应。移植排斥反应(transplant rejection)分为两种情况，一种是宿主抗移植物反应(host versus graft reaction，HVGR)，另一种是移植物抗宿主反应(graft versus host reaction，GVHR)。在实体器官移植中，主要为宿主抗移植物反应，移植物抗宿主反应罕见。在骨髓移植中，则以移植物抗宿主反应常见。
移植物抗宿主反应GVHR是指受者进行同种异体组织或器官移植后，外来的组织或器官等移植物作为一种异己成分被受者免疫系统识别，后者发起针对移植物的攻击、破坏和清除的免疫学反应。对于人类淋巴细胞抗原(human lymphocyte antigen，HLA)高度敏感的病人，其移植排斥反应更易发生。排斥反应的发生机制主要包括细胞免疫和体液免疫两个方面，其中体液免疫(humoral immunity)是以效应B细胞产生抗体IgG来达到保护目的的免疫机制。
本发明提供本发明的Fc变体或包含所述变体的蛋白、组合物或试剂盒在制备用于预防和/或治疗受试者中的实体器官移植后自身抗体介导的器官排斥的药物中的用途。在一些实施例中，所述器官选自下组：肾脏、胰岛、胰腺、心脏、肝脏、肺或小肠。
在病毒载体为基础的基因治疗中，部分患者体内在治疗前已经存在抗病毒的抗体，其中的中和抗体会导致基因治疗效果减弱甚至失效。另一方面，接受了以病毒为载体的基因治疗的患者，会产生抗病毒抗体导致短期内无法 给药。本发明的变体即可解决该问题。本发明提供本发明的Fc变体或包含所述变体的蛋白、组合物或试剂盒在制备用于在以病毒载体为基础的基因治疗前清除体内预存的抗病毒载体的中和抗体的药物中的用途。
药物的施用和治疗方法
本发明还涉及施用本发明的变体、蛋白、药物组合物和/或试剂盒的方法以及施用本发明的变体、蛋白、药物组合物和/或试剂盒来治疗疾病或病症的方法。
优选地，本发明的变体、蛋白和/或组合物可在机体内已产生抗药抗体或易产生抗药抗体的另外的治疗剂给药前施用。
优选地，本发明的变体、蛋白和/或组合物可在机体内已产生抗药抗体或易产生抗药抗体的另外的治疗剂给药前、同时和/或给药后施用。
在本发明的应用中，本发明变体、蛋白和/或组合物与另外的治疗剂作为用于同时、分开或依次使用的联合制剂存在。
在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：1)向受试者施用本发明的变体、蛋白和/或组合物；随后，2)向所述受试者施用所述另外的治疗剂。优选地，本发明的变体、蛋白和/或组合物与所述另外的治疗剂的施用存在时间间隔。
在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：1)向所述受试者施用所述另外的治疗剂；随后，2)向受试者施用本发明的变体、蛋白和/或组合物。优选地，本发明的变体、蛋白和/或组合物与所述另外的治疗剂的施用存在时间间隔。
优选的是，本发明的变体、蛋白和/或组合物的施用量和时间间隔足以将受试者体内的免疫球蛋白水平降至起始水平的60％。更优选的是，本发明的变体、蛋白和/或组合物的施用量和时间间隔足以将受试者体内的免疫球蛋白水平结合降低至低于该患者体内起始水平的50％、40％、30％、20％或10％。本发明的变体、蛋白和/或组合物可以在一个单一时间点施用或在设定的时间内施用。
优选的是，其中本发明的变体、蛋白和/或组合物通过静脉输液、腹腔注射、肌肉注射、关节注射、皮内注射或者皮下注射施用，优选的注射方式为静脉输液方式。并且/或者所施用的本发明的变体、蛋白和/或组合物的量为1mg/kg体重至100mg/kg体重、4至50mg/kg体重、5mg/kg体重至50mg/kg体重或5mg/kg体重至10mg/kg体重。
优选的是，其中本发明的变体、蛋白和/或组合物和所述另外的治疗剂的 给药时间间隔至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少4小时、至少5小时或至少6小时；并且最多35天、最多28天、最多21天、最多18天、最多14天、最多13天、最多12天、最多11天、最多10天、最多9天、最多8天、最多7天、最多6天、最多5天、最多4天、最多3天、最多2天、最多24小时、最多18小时、最多12小时、最多10小时、最多8小时、最多7小时或最多6小时。
在又一实施方式中，所述方法包括以下步骤：1)用本发明的变体、蛋白和/或组合物对来自所述受试者的血液进行离体处理；2)将血液返回所述受试者；3)向所述受试者施用所述另外的治疗剂。
在又一实施方式中，所述方法包括以下步骤：1)向所述受试者施用所述另外的治疗剂；2)用本发明的变体、蛋白和/或组合物对来自所述受试者的血液进行离体处理；3)将血液返回所述受试者。
在优选的实施方式中，本发明的变体、蛋白和/或组合物与另外的治疗剂组合用于预防和/或治疗癌症。
在优选的实施方式中，本发明的变体、蛋白和/或组合物与另外的治疗剂组合用于预防和/或治疗基因缺陷相关疾病。
在优选的实施方式中，本发明的变体、蛋白和/或组合物与另外的治疗剂组合用于治疗由致病性IgG抗体介导的疾病或病症。
本发明还提供了将所述药物组合施用于受试者来治疗或预防基因缺陷相关疾病或癌症或感染或由致病性IgG抗体介导的疾病或病症的方法。其中所述方法导致所述病毒载体结合抗体减少20-50％，50-75％，75-90％，90-95％或95％或95％以上的抗体；其中所述方法导致所述致病性IgG抗体减少20-50％，50-75％，75-90％，90-95％或95％或95％以上。优选的是，所述药物用于治疗基因缺陷相关疾病的方法。优选的是，所述药物用于治疗癌症、预防癌症、预防感染的方法。所述感染优选为病毒感染、细菌感染或真菌感染。优选的是，所述药物用于癌症的治疗方法。优选的是，所述药物用于治疗由致病性IgG抗体介导的疾病或病症的方法。
优选地，其中所述另外的治疗剂为病毒载体药物；优选地，所述病毒载体药物为溶瘤病毒、病毒疫苗、基因治疗病毒。
优选地，其中所述另外的治疗剂为抗体。
优选地，其中所述另外的治疗剂为能降低血液IgG水平的多肽药物，例 如免疫球蛋白降解酶。更优选地，所述能降低血液IgG水平的多肽药物用于上述由致病性IgG抗体介导的疾病治疗。
优选的，其中所述药物组合的成分单独给药，或所述药物组合的成分同时给药。
如上所述的这些用途和方法中，还可以进一步与另外的治疗剂，例如抗炎剂组合。
在一些实施例中，所述另外的治疗剂是白细胞消耗剂。
在一些实施例中，所述另外的治疗剂是B细胞消耗剂。
在一些实施例中，所述的B细胞消耗剂是抗体，优选用于肿瘤治疗的抗体，更优选所述抗体与CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD70、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD3、CD11a、CD14、CD25、CD28、CD30、CD33、CD36、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD103、CD134、CD137、CD138、CD152、CD3、IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-6R、IL-12、IL-23、C5、BAFF、BLyS、BCMA、CXCR-4、ICAM-1、SLAMF7/CS1、TNFα、IgE、CD85或CD86特异性结合。
在一些实施例中，所述另外的治疗剂是利妥昔单抗、达克珠单抗、巴利昔单抗、莫罗单抗-CD3、英夫利昔单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、依法利珠单抗、那他珠单抗、托珠单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、卡那单抗、优特克单抗、贝利木单抗、达雷妥尤单抗、Isatuximab或其组合。
在一些实施例中，所述含Fc剂是治疗剂或诊断剂，优选所述含Fc剂是抗体、Fc融合蛋白抗体药物缀合物。
6.本发明的优势和有益效果
本发明的Fc变体，与对照变体相比具有以下优点：1)增加的抗炎特性；2)意外的具有增高的唾液酸修饰水平，同时不影响FcRn亲和力；3)可降低血液IgG水平；4)具有增加的药时曲线下面积；5)与FcγRI结合不变或者增加；和/或，6)在多种Fcγ受体中，与FcγRI结合的选择性增加。
具体实施方式
在符合本领域常识的基础上，上面详述的各种条件可任意组合，从而得到本发明的各较佳实例。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均为商业上可得的。
实施例1.蛋白制备
序列合成：合成表1中具有不同突变的Fc变体，构建至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1载体中。为达到CHO细胞中最高2，6-唾液酸修饰，合成人半乳糖转移酶(β1，4-galactosyltransferase，缩写为GT)和人α2，6-唾液酸转移酶(ST6Gal1，缩写为ST)酶同变体一起表达。
表达及纯化：将不同变体组合GT、ST同时瞬时转染至ExpiCHO-S细胞中，转染第6-8天收液，以9500rpm离心20分钟收集上清。用ProteinA进行纯化。
表1：具有不同突变的Fc变体
实施例2.变体唾液酸修饰检测
Sambucus Nigra Lectin(SNA)凝集素特异与唾液酸结合，对于2，6连接的唾液酸结合效果好于2，3连接的唾液酸。采用ELISA方式检测变体与SNA的结合。取纯化后的变体蛋白0.5μg包被酶标板，用1％PVA(PBS)溶液300μl在37℃孵育2小时。用PBST稀释SNA-Biotin(Biotinylated Sambucus Nigra Lectin，Vectorlab，货号：B-1305-2)至2μg/ml，100μl每孔在37℃结合1小时。
用PBST稀释HRP标记Streptavidin(碧云天，货号：A0303)1000倍，每孔加入100ul，在37℃结合1小时后显色。
结果显示：不同的突变组合，对唾液酸修饰产生的效果差异大。其中唾液酸增加阳性对照m2，相对于无相关突变的m1，唾液酸修饰增加有限。同时意外的发现，组合变体m3～m7、m11，具有比阳性对照m2显著增加的唾液酸修饰。
表2：不同Fc变体的2，6连接的唾液酸增加情况
变体 2，6-SA增加(OD450nm)
m1 0.62
m2 1.08
m3 2.44
m4 2.30
m5 2.34
m6 2.10
m7 2.34
m8 0.04
m9 0.05
m10 0.08
m11 1.71
实施例3.变体与FcRn的结合
取变体蛋白，检测其与FcRn在pH为7.0条件下的亲和力大小。采用Fortebio检测抗体片段与受体亲和力，用HIS1K探针将FcRn(Acro Biosystems)上样0.8nm，与不同浓度的变体蛋白结合60秒，解离300秒。
结果显示变体m2、m11与FcRn的中性亲和较低。其他变体和FcRn亲和水平与对照m1接近，Kd值接近。说明m11与对照m1相比增加的突变，会负面影响Fc与FcRn的结合。
表3：不同Fc变体与FcRn的特异性结合情况
变体 FcRn结合Ka(1/Ms)
m1 2.14E+05
m2 1.18E+04
m3 2.72E+05
m4 2.98E+05
m5 3.47E+05
m6 2.12E+05
m7 2.21E+05
m8 1.15E+05
m9 2.08E+05
m10 2.21E+05
m11 3.83E+04
实施例4.变体稳定性检测
取变体蛋白，采用高通量蛋白质稳定性分析系统Uncle检测抗体的热稳 定性。纯化后的变体样品1.0mg/ml上机检测：采用Tm&Tagg with optional DLS程序，温度区间设定为25-95℃，样品设置一个复孔。通过分析结果参数Tm(蛋白熔解温度)、Tagg266(蛋白聚集温度)，分析热稳定性。
结果除了m4，其他变体都具有50℃以上的Tm1值。说明不同突变的组合，对蛋白热稳定性的影响不同，某些突变会使Fc变体的热稳定性降低。
表4：不同Fc变体的热稳定性
变体 浓度(mg/ml) Tonset(℃) Tm1(℃) Tm2(℃) Tm3(℃) Tagg 266(℃)
m1 0.74 49.28 61.00 61.00 78.40 77.06
m2 0.99 57.43 61.35 69.40 80.00 65.10
m3 0.63 46.36 50.94 69.00 78.37 70.90
m4 0.69 43.15 48.20 68.10 78.71 66.08
m5 0.69 47.47 58.60 67.60 78.78 70.04
m6 0.71 41.25 55.11 67.33 78.57 69.30
m7 0.65 46.88 55.45 63.10 77.00 74.70
m8 0.22 54.74 61.89 61.89 76.99 76.50
m9 0.16 59.71 65.65 65.65 78.39 --
m10 0.27 50.13 55.40 55.40 78.26 80.33
m11 0.12 48.62 52.91 68.60 78.70 --
实施例5.变体和FcγR的结合
取变体蛋白，检测其与FcγRI、FcγRIIa-131H、FcγRIIa-131R、FcγRIIb、FcγRIIIa-158F、FcγRIIIa-158V在pH为7.0条件下的亲和力大小。采用Fortebio检测抗体片段与受体亲和力，用HIS1K探针将不同FcγR(Acro Biosystems)上样0.5nm，与不同浓度的变体蛋白结合60秒，解离60秒。
表5：不同变体与FcγR受体的亲和力
*注：无结合，或结合低于定量限。
结果显示m6变体相对于对照m1，与FcγR的结合变化均小于2倍。而 m7则在FcγRI具有5倍增加的结合，而且在多种Fcγ受体中，与FcγRI结合的选择性显著增加。
实施例6.变体唾液酸含量检测
采用酸水解方法将糖蛋白中结合状态的唾液酸释放成游离状态，游离状态的唾液酸与荧光染料DMB(Sigma，货号：D4784-50mg)结合得到具有荧光特性的衍生物，通过高效液相色谱法(HPLC)，在激发波长为373nm、吸收波长为448nm条件下进行检测。唾液酸标准品(TCI，货号A1105)采用100pmol/μl、80pmol/μl、60pmol/μl、40pmol/μl、20pmol/μl共5个浓度。
结果显示，m4、m5、m6、m7的唾液酸含量显著高于m1。
表6：不同变体的唾液酸含量
变体 唾液酸含量(mol/mol蛋白) 唾液酸含量(mol/mol N糖)
m1 0.84 0.42
m4 3.20 1.60
m5 2.52 1.26
m6 3.00 1.50
m7 2.91 1.45
采用酶切后2-AB标记-色谱分析方法检测不同变体蛋白的N-聚糖类型。蛋白样品进行神经氨酸酶(瑞诺生物科技，货号：QPF-005)酶切作为无唾液酸修饰样品对照，以确认唾液酸N糖型峰。
将不同变体蛋白稀释至2mg/ml，采用50mM的NaH 2PO 4，pH＝7.5的缓冲液进行换液。采用PNGaseF(瑞诺生物科技，货号QPF-001)对蛋白的N糖型进行酶切，加入后37℃孵育24h。取酶切好的样品进行2-AB标记，得到可用于HPLC检测的样品。采用WATERS Acquity UPLC BEH Amide分析柱，波长λex＝330nm、λem＝420nm进行检测。采用100mM甲酸铵，(pH 4.5)、100％乙腈作为流动相进行实验。
结果显示，m4、m5、m6、m7的唾液酸修饰比例显著高于m1。
表7：不同变体的唾液酸修饰比例
实施例7.变体蛋白的体内施用
在急性免疫血小板减少的小鼠模型中，观察变体的治疗效果。C57BL/6小鼠注射1次0.1μg/g的抗血小板抗体6A6-IgG1，注射后的2h给药1g/kg的IVIG或0.1g/kg的变体(m1、m4、m5、m6)，PBS为对照。给6A6-IgG1抗体前、给药后4h检测小鼠血小板含量，以4h血小板含量占给药前血小板含量的比例为评价指标。
结果显示仅IVIG(72±15％)、m4(69±18％)、m5(77±20％)、m6(65±25％)均显示出血小板回升效果，而m1(19±22％)相对于PBS对照组(25±15％)，无显著差异。证明m4～m7这种变体在小鼠体内有明显的抑炎效果。
实施例8.变体蛋白在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的施用
使用下述规程免疫接种C57BL/6小鼠用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)：在PBS中2mg/ml MOG35-55和完全弗氏佐剂(CFA，通过向不完全弗氏佐剂(IFA，Sigma)中添加4mg/ml结核分枝杆菌菌株H37RA)以1∶1比率混合，得到MOG35-55/CFA乳化剂。每只小鼠皮下注射100μL乳化剂，皮下注射部位分别为：腹股沟两侧每侧注射40μL，后脚背每只注射10μL，并随后及第2天均尾静脉注射200ng/动物PTX。在免疫接种后第5、10、15和20天时，小鼠用不同高唾液酸修饰的变体蛋白进行给药(i.p.)。使用下述评分系统就疾病的临床病征跟踪动物：
0分：小鼠健康
1分：小鼠尾巴无力
2分：小鼠翻正反射受损
3分：小鼠一只后肢瘫痪
4分：小鼠两只后肢瘫痪
5分：小鼠体重减轻20％及以上
6分：小鼠死亡或濒临死亡(若发现濒临死亡立即人性化处死)
表8：EAE模型实验设计
组别 动物数量 药物 剂量(mg/kg) 给药方式 给药日期
1 10 PBS / i.p. D5、10、15、20
2 10 m1 100 i.p. D5、10、15、20
3 10 m4 100 i.p. D5、10、15、20
4 10 m6 100 i.p. D5、10、15、20
5 10 IVIg 1000 i.p. D5、10、15、20
在首次免疫接种后第28天结束实验。采用流式细胞术分析脾脏中Treg细胞占比。
采用ELISA检测终点血液IgG含量，取Rabbit anti-Mouse IgG Fc(Thermo，货号：31555)蛋白0.5μg包被酶标板，用1％PVA(PBS)溶液300μl在37℃孵育2小时。将血清样品稀释500倍后进行孵育，之后用PBST稀释Rabbit anti-Mouse IgG F(ab′)2-HRP(Thermo，货号：31451)至0.2μg/ml，100μl每孔在37℃结合1小时后显色。
采用ELISA检测终点MOG特异性IgG含量，取MOG多肽2ug包被酶标板，1％PVA(PBS)溶液300μl在37℃孵育2小时。将血清样品稀释100倍后进行孵育，之后用PBS-T稀释Rabbit anti-Mouse IgG F(ab′)2-HRP(Thermo，货号：31451)至0.4μg/ml，100μl每孔在37℃结合1小时后显色。
结果显示，本发明变体m4、m6可降低EAE小鼠模型中的疾病评分(如图1所示)，且均可上调EAE小鼠模型中的Treg细胞占比(如图2所示)。通过对其血液总IgG含量的检测及抗MOG多肽IgG的含量检测，结果发现两种IgG的含量相对于PBS组均显著下调。由此可知，本发明的变体能够实现与IVIG相当的抗炎效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (34)

  1. 一种包含2，6-唾液酸化的糖基化修饰的Fc变体，所述变体与野生型IgG相比对FcRn具有增高的亲和力。
  2. 根据权利要求1所述的Fc变体，所述变体对FcRn在中性和/或弱酸性条件下具有增高的亲和力，优选所述中性条件为pH6.5-7.4，优选所述弱酸性条件为pH5.0-6.5。
  3. 根据权利要求1或2所述的Fc变体，其中，所述Fc变体是基于选自下组的野生型IgG通过突变得到的：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，优选所述Fc变体是基于野生型IgG1或其同种异型通过突变得到的。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体与野生型IgG1的野生型Fc片段相比，包含选自下组的突变(EU编号)：M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、M252Y/S254T/T256E、N434A、N434W、N434Y、M428L/N434S、T250Q/M428L、T307Q/N434A、M252Y/V308P/N434Y、T307P/L309Q/Q311R、H285D/T307Q/A378V、L309D/Q311H/N434S、M252Y/T256D、T256D/T307Q、T256D/T307W。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体与野生型IgG1的野生型Fc片段相比，包含选自下组的突变(EU编号)：V264A、Δ446G、Δ447K、V262E、ΔE293、ΔE294、V264E、F241A、F243A、Y300A。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体在其糖基化位点上连接有N-聚糖，其中所述N-聚糖是高唾液酸化的，优选所述糖基化位点为N297(EU编号)。
  7. 根据权利要求6所述的Fc变体，其中所述N-聚糖具有高于20％，优选高于25％，优选高于30％，优选高于35％，优选高于40％，优选高于45％，优选高于50％，优选高于55％，优选高于60％，优选高于65％，优选高于70％，优选高于80％，优选高于85％，优选高于90％，更优选高于95％的2，6-唾液酸化程度。
  8. 根据权利要求6所述的Fc变体，其中所述每摩尔Fc变体具有高于0.1mol，高于0.2mol，优选高于0.3mol，优选高于0.4mol，优选高于0.5mol，优选高于0.6mol，优选高于0.7mol，优选高于0.8mol，优选高于0.9mol，优选高于1.0mol，优选高于1.1mol，优选高于1.2mol，优选高于1.3 mol，优选高于1.4mol，优选高于1.5mol，优选高于1.6mol，优选高于1.7mol，优选高于1.8mol，优选高于1.9mol，更优选高于2.0mol的2，6-唾液酸化程度。
  9. 根据权利要求6所述的Fc变体，其中所述N-聚糖中大于40％是糖链末端包含1～4个2，6-唾液酸修饰，且所述N-聚糖中少于60％是G0、G1、G0F、G1F、G2或G2F形式的糖基，其中G0-G2分别表示被0-2个半乳糖化的糖基，F表示被岩藻糖化的糖基。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的Fc变体，其中所述2，6-唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)、N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)或其混合物，优选其中所述2，6-唾液酸是NANA。
  11. 根据权利要求10所述的Fc变体，其中所述Fc变体不包含α-半乳糖修饰。
  12. 根据权利要求1-11中任一项所述的Fc变体，其中所述Fc变体中岩藻糖的含量低于50％，优选的低于10％。
  13. 一种蛋白，其包含权利要求1-12中任一项所述的Fc变体和任选的有益于所述Fc变体表达的元件；优选所述蛋白在所述Fc变体的N末端包含信号肽和/或在所述Fc变体的C末端包含组氨酸标签；更优选所述蛋白在所述Fc变体的N末端连接有分泌信号序列并在所述分泌序列的N末端连接有甲硫氨酸；更优选所述蛋白从N末端至C末端包含如下或由如下组成：甲硫氨酸、分泌信号序列和所述Fc变体。
  14. 一种组合物或试剂盒，包含权利要求1-12中任一项所述的Fc变体或权利要求13所述的蛋白。
  15. 一种制备根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体的方法，所述方法包括如下步骤：
    (a)对野生型IgG1的野生型Fc片段进行突变以获得相应的Fc变体，其中所述野生型Fc片段序列如SEQ ID NO：12所示；和
    (b)采用β-1，4半乳糖基转移酶(β1，4-GT)和/或α-2，6唾液酸转移酶(α2，6-ST)对所述Fc变体进行处理，优选所述β1，4-GT和/或α2，6-ST为哺乳动物来源，更优选为人来源。
  16. 根据权利要求15所述的方法，其中步骤(a)中的所述突变选自下组：M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、V264A、Δ446G、Δ447K、V262E、 T307P/L309Q/Q311R、V264E、ΔE293、ΔE294、M252Y/S254T/T256E、N434A、N434W、N434Y、F241A、F243A、M428L/N434S、L309D/Q311H/N434S、M252Y/T256D、T250Q/M428L、T307Q/N434A、M252Y/V308P/N434Y、H285D/T307Q/A378V、T256D/T307Q、T256D/T307W、Y300A。
  17. 一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体或权利要求13所述的蛋白。
  18. 一种载体，其包含根据权利要求17所述的核酸。
  19. 一种宿主细胞，其包含根据权利要求17所述的核酸或根据权利要求18所述的载体。
  20. 一种制备根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体的方法，所述方法包括如下步骤：
    (i)在允许所述Fc变体表达的条件下在培养基中培养如权利要求19所述的宿主细胞；和
    (ii)任选的，从所培养的细胞或细胞的培养基中纯化所述Fc变体。
  21. 根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体、根据权利要求13所述的蛋白或根据权利要求14所述的组合物或试剂盒在制备用于降低血液IgG的药物中的用途。
  22. 根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体、根据权利要求13所述的蛋白或根据权利要求14所述的组合物或试剂盒在制备用于治疗抗体介导的病症的药物中的用途，优选地其中所述抗体介导的病症是自身免疫性疾病或高球蛋白血症。
  23. 根据权利要求22所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自下组：阿狄森氏病、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、抗GBM肾小球肾炎、抗NMDAR脑炎、抗磷脂血症综合征、自身免疫性胃炎、自身免疫性失聪、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺机能减退、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性大疱性皮肤病、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多种内分泌病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、炎症性脱髓鞘性多神经病、急性运动性轴索神经病、丘-施氏综合征、腹部疾病、自身免疫性荨麻疹、克罗恩病、CREST综合征、乳糜泻、德戈斯病、抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎症、自身免疫性中性 白细胞减少症、后天性大疱性表皮松解、原发性混合冷凝球蛋白血栓、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征、格雷夫斯病、格林巴利综合征、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、川崎氏病、美尼尔综合征、混合性结缔组织病、莫伦溃疡、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、僵人综合征、完全性先天性心脏阻滞、获得性大疱性表皮松懈病、落叶性天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多腺性自身免疫综合征类型、原发性胆汁性肝硬化、多腺性自身免疫综合征类型、多腺性自身免疫综合征类型、多发性肌炎/皮肌炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺综合征、莱特尔综合征、风湿性心脏病、血友病-获得性FVIII缺乏、Lambert-Eaton肌无力综合症、多发性骨髓瘤、肉状瘤病、胶原沉着病、干燥综合征、亚急性甲状腺炎、交感性眼炎、全身性红斑狼疮、高安氏动脉炎、 综合症、I型糖尿病、白癜风、伏格特-小柳-原田三氏综合征或韦格纳肉芽肿病、急性哮喘或慢性哮喘、器官移植排斥、原发性进行性多发性硬化症、系统性硬化症、血清病和免疫复合物超敏反应；其中，所述免疫复合物例如抗药抗体和药物形成的免疫复合物。
    优选的，所述自身免疫性疾病选自下组：抗肾小球基底膜抗体病(抗GBM抗体病)、致病性IgG抗体介导的血栓性低血小板症、格林巴利综合征(GBS)、自身免疫性脑炎(AE)、视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、器官移植术后抗体介导的排斥反应(AMR)、重症肌无力(MG)；其中所述致病性IgG抗体介导的血栓性低血小板症优选为血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症(VITT)。
  24. 根据权利要求22所述的用途，其中所述抗体介导的病症是可使用静脉注射免疫球蛋白(IVIG)、皮下注射免疫球蛋白(SCIG)、血浆去除术和/或免疫吸附治疗的。
  25. 根据权利要求22所述的用途，其中所述的高球蛋白由白细胞产生，其中所述白细胞选自B细胞、异常B细胞；所述球蛋白包括γ球蛋白；所述高球蛋白血症选自下组：原发性单克隆丙种球蛋白血症、结缔组织病、肝脏病、传染病、类肉瘤病、重症肌无力、霍奇金病、白塞(Behcet)病、肾炎、过敏性紫癜、免疫性(或自发性)血小板减少症、恶性单克隆丙种球蛋白血症(如多发性骨髓瘤、重链病、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋 白血症等)、继发性单克隆丙种球蛋白血症(如非淋巴网状系统肿瘤、单核细胞白血病、冷球蛋白血症等)、良性M蛋白血症、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、华氏巨球蛋白血症、AL型淀粉样变性、孤立性浆细胞瘤(骨或骨外)、POMES综合征、反应性浆细胞增多症、转移性癌的溶骨性病变、浆母细胞性淋巴瘤和单克隆免疫球蛋白相关肾损害(MGRS)，优选所述所述高球蛋白血症为多发性骨髓瘤。
  26. 根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体、根据权利要求13所述的蛋白或根据权利要求14所述的组合物或试剂盒在制备用于预防和/或治疗受试者中的实体器官移植后自身抗体介导的器官排斥的药物中的用途。
  27. 根据权利要求26所述的用途，其中所述器官选自下组：肾脏、胰岛、胰腺、心脏、肝脏、肺或小肠。
  28. 根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体、根据权利要求13所述的蛋白或根据权利要求14所述的组合物或试剂盒在制备用于基因治疗的药物中的用途。
  29. 根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体、根据权利要求13所述的蛋白或根据权利要求14所述的组合物或试剂盒在制备用于以病毒载体为基础的基因治疗前清除体内预存的抗病毒载体的中和抗体的药物中的用途。
  30. 根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体、根据权利要求13所述的蛋白或根据权利要求14所述的组合物或试剂盒在制备用于清除受试者中的自身抗体以使得含Fc剂更好发挥疗效的药物中的用途。
  31. 根据权利要求1-12中任一项所述的Fc变体、根据权利要求13所述的蛋白或根据权利要求14所述的组合物或试剂盒在制备用于在已施用含Fc剂的受试者中降低所述含Fc剂的血清水平的药物中的用途。
  32. 根据权利要求30或31所述的用途，其中所述含Fc剂是治疗剂或诊断剂，优选所述含Fc剂是抗体、Fc融合蛋白抗体药物缀合物。
  33. 根据权利要求21-32中任一项所述的用途，其中将所述Fc变体与另外的治疗剂同时或依次适用于所述受试者，其中所述另外的治疗剂是抗炎剂、白细胞消耗剂、B细胞消耗剂；其中所述B细胞消耗剂优选用于肿瘤治疗的抗体，更优选所述抗体与CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD70、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD3、CD11a、CD14、CD25、CD28、CD30、 CD33、CD36、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD59、CD56、CD103、CD134、CD137、CD138、CD152、CD3、IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-12、IL-23、C5、BAFF、BLyS、BCMA、CXCR-4、ICAM-1、SLAMF7/CS1、TNFα、IgE、CD85或CD86特异性结合。
  34. 根据权利要求33所述的用途，其中所述另外的治疗剂选组下组：利妥昔单抗、达克珠单抗、巴利昔单抗、莫罗单抗-CD3、英夫利昔单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、依法利珠单抗、那他珠单抗、托珠单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、卡那单抗、优特克单抗、贝利木单抗、达雷妥尤单抗、Isatuximab或其组合。
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