CN102575264A - 增加的转基因表达和加工的产品和方法 - Google Patents

Abstract

公开了用于转基因表达的方法和真核宿主细胞。所述细胞可被处理和/或修饰以在所述细胞中增加同源重组(HR)、降低非同源末端连接(NHEJ)和/或增加HR/NHEJ比。可用包括转基因的载体转染这种细胞，所述转基因有利地整合进所述细胞的基因组以形成可包括大于200个转基因拷贝的串联结构。某些表达增强元件如MARs被有利地提供以进一步增加和/或促进转基因表达。还公开了重组真核宿主细胞，特别是非灵长类宿主细胞，包括编码在跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的蛋白质和/或RNA，特别是灵长类蛋白质和/或RNA的转基因序列。

Description

增加的转基因表达和加工的产品和方法

相关申请的交叉引用

该申请要求2009年9月18日提交的美国临时申请号61/243,950的权益，其以其全部通过引用被并入本文。

发明领域

本发明涉及用于转基因表达的方法和真核宿主细胞。通过偏爱同源重组(HR)超过非同源末端连接(NHEJ)，转基因表达被推进。本发明还涉及在非灵长类真核宿主细胞中提供在灵长类，特别是人类中涉及的蛋白质，介导或影响跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌的途径。

发明背景

治疗性蛋白的生物技术产生以及基因和细胞疗法取决于导入到真核细胞中的转基因的成功表达。成功的转基因表达常常要求转基因整合进宿主染色体并受整合的转基因拷贝数目的限制和受外遗传效应等的限制，外遗传效应可引起低的或不稳定的转录和/或高克隆变异性。转基因表达产物不能或降低的转运出细胞也常常限制治疗性蛋白的产生以及基因和细胞疗法。

出版物和其它材料——包括本文中用于说明本发明，特别是用于提供关于实施的另外细节的专利和登录号——以其全部通过引用被并入本文。为方便起见，在下文中出版物通过作者和日期被引用并在文献目录中按作者字母顺序列出。

真核生物的DNA被高度压缩成染色质的事实允许全部真核基因组在几微米直径的细胞核内适合。然而，该事实使得基因表达通过染色质的局部和暂时的压缩和解压缩而被控制，其包括高度调节的和复杂的细胞结构。此外，转基因整合进宿主染色体在大多数情况下是随机事件，其导致随机的整合位置和变化的拷贝数。通常在稳定的转基因表达中观察到的独立转化体中的高度变异性被认为依赖在宿主基因组内整合的转基因拷贝数目并依赖在转基因整合位点的染色质环境(Kalos and Fournier，1995；Recillas-Targa et al.，2002)。整合进随机位置的转基因的表达可受在整合位置的调控元件的任意存在的影响以及受与整合位置相邻的染色体结构域的染色质结构影响。例如，由于活性基因靠近抑制性异染色质，被称作位置效应变化的现象可引起活性基因随着时间沉默(Robertson et al.，1995；Henikoff，1996；Wakimoto，1998)。

已发展了很多方法，如磷酸钙DNA共沉淀、聚乙稀亚胺法、电穿孔和聚阳离子脂质来促进具有可变的转染率的基因转移。扩大转基因拷贝数并因此增加转基因表达的一个方法是基因扩增(Kaufman，2000)。可选的方法是通过插入合成的或天然调节序列来优化表达载体。

为了增加和稳定在哺乳动物细胞中的转基因表达，外遗传调节子正日益增加地用于保护转基因抵御负位置效应(Bell and Felsenfeld，1999)并包括边界或绝缘子元件、基因座控制区(LCRs)、稳定和抗阻抑物(STAR)元件、无所不在地作用染色质开放(ubiquitously acting chromatin opening)(UCOE)元件和上述的基质附着区(MARs)。所有这些外遗传调节子已用于哺乳动物细胞系中重组蛋白质产生(Zahn-Zabal et al.，2001；Kim et al.，2004)并用于基因疗法(Agarwal et al.，1998；Allen et al.，1996；Castillaet al.，1998)。

如上所述，失败或降低的转基因表达产物转运出细胞还常常限制治疗用蛋白质的产生以及基因和细胞疗法。转基因表达产物常常遇到不同的瓶颈：只装备有处理和转运细胞固有蛋白质的结构的细胞才能通过某些类型的转基因表达产物转运而变得容易地过多装载，尤其是当转基因表达产物以如通常期望的异常高的水平产生，使产物聚集在细胞内和/或，例如，防止功能蛋白质产物的正确折叠时。

已追求不同的方法来克服转运和加工瓶颈。例如，具有改进的分泌性质的CHO细胞通过充当膜状囊泡转运和此后分泌的蛋白质胞吐的调节子的SM蛋白Munc18c或Sly1的表达而被工程改造(美国专利申请20090247609)。X盒结合蛋白质1(Xbp1)——调节分泌细胞分化和ER保持和扩大的转录因子、或各种蛋白质二硫化异构酶(PDI)——也已用于降低ER应激和增加蛋白质分泌(Mohan et al.2007)。增加蛋白质分泌的其它尝试包括在CHO细胞中蛋白伴侣ERp57、钙联接蛋白、肌钙网蛋白的表达(Chung et al.，2004)。最后，冷休克诱导的蛋白质——冷诱导的RNA结合蛋白质(CIRP)——的表达显示增加重组γ-干扰素的产量。还进行了尝试来过量表达分泌性复合体的蛋白质。然而，例如，Lakkaraju等(2008)报道了WT人类细胞中(例如在未被工程改造以表达低SRP14水平的细胞中)的外源性SRP14表达没有提高分泌型碱性磷酸酶蛋白的分泌效率。

因此，存在有效的、更可靠的转基因表达，例如，重组蛋白质产生的需求和基因疗法的需求。还存在成功地将转基因表达产物转运到细胞外的需求。

本领域中需求这和其它需求通过本发明的某些实施方式来解决。

发明概述

本发明涉及转基因表达方法，包括(a)提供真核生物优选哺乳动物的宿主细胞，其中所述宿主细胞已被修饰或处理以在所述细胞中增加同源重组(HR)，降低非同源末端连接(NHEJ)和/或提高HR/NHEJ比，和(b)用至少一种包括所述转基因的载体，并任选地，用基质附着区(MAR)元件，转染所述细胞，其中所述MAR元件以顺式或反式提供给所述转基因。

(b)中的转染可以是随后的转染，包括只是单个随后的转染，并可以在用核酸如载体或核酸片段的最初的转染——包括只是单个最初的转染——之后。所述细胞的细胞群体的细胞周期可被同步，例如，通过使细胞群体经受化学或温度处理。当群体的大部分细胞在细胞周期的G1期时，最初和随后的转染可发生。细胞群体的超过30％、超过31％、32％、33％、34％、35％、36％、36％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％的细胞可处于G1期。优选，在初始转染之前，可给予HR酶、HR激活剂和/或NHEJ抑制剂。细胞还可以是重组真核宿主细胞并可包括编码HR酶、HR激活剂和/或NHEJ抑制剂的转基因序列。细胞的NHEJ或HR基因还可被突变。可选地或另外，所述细胞基因组可被突变以使NHEJ失活，以增加至少一个HR酶、至少一个HR激活剂和/或至少一个NHEJ抑制剂的表达或活性。

所述最初转染的核酸在某些实施方式中是包括转基因的载体。最初转染的载体和所述至少一个随后转染的至少一个载体在整合进细胞基因组之前和/或之后可形成串联结构(concatemeric structures)。串联结构可包括所述转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝。细胞的HR/NHEJ比比分别不包括所述转基因序列和未被突变的细胞中发现的比可高达2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍。细胞的NHEJ活性可等于约0。

所述至少一个随后的转染之后，整合进所述细胞基因组的所述转基因的整合拷贝数可以是大于代表通过用(b)的载体直接转染细胞获得的整合拷贝数的参考值两倍。

最初转染的核酸可以是包括MAR元件和所述转基因的载体。最初转染，例如，单个最初转染之后，所述转基因的表达可达到最初的水平，随后的转染，例如，单个随后的转染之后，转基因的表达可达到随后的水平，该水平超过累加的，优选超过所述最初水平的两倍、三倍或四倍。可选地或另外，最初转染之后，整合进细胞基因组的转基因拷贝数等于(n)，至少一个随后的转染之后，整合进基因组的转基因拷贝数可大于2(n)、3(n)或4(n)。转基因可在单个基因座作为串联结构而整合进所述细胞的基因组。

(b)中的MAR元件可改善表达，基本上或完全防止来自包括转基因的载体的多重拷贝的共整合的抑制效应。

至少一个随后转染的载体的大于过50％、60％、70％、80％被运送进细胞核。

最初的转染之后，可达到转基因表达产物的最初水平和最初转基因拷贝数。所述至少一个随后的转染之后，转基因表达产物的水平可增加到随后的水平，最初转基因拷贝数可增加到随后的转基因拷贝数，其中转基因表达产物的第一和第二水平之间的增加可超过最初的转基因拷贝数和随后的转基因拷贝数之间的增加20％、30％、40％、50％或60％。

至少一个第一转染的所述载体的载体序列可与至少所述随后的转染(或多个)的第一个的载体的载体序列具有100％或至少95％、90％、85％或80％序列同一性。最初转染的载体可包括MAR元件，所述MAR元件可与至少所述随后的转染(或多个)的第一个的载体的MAR元件具有100％或至少95％、90％、85％或80％序列同一性。最初转染的载体可包括转基因，该转基因可与至少所述随后的转染(或多个)的第一个的载体的转基因具有100％或至少95％、90％、85％或80％序列同一性。MAR元件可作为(b)中载体的部分以顺式被提供。在某些实施方式中，至少两个MAR元件位于转基因侧翼。MAR元件可位于所述转基因的启动子/增强子序列的上游。

MAR序列可与SEQ ID NOs：1-3具有至少90％的序列同一性或是其变体。

本发明还涉及重组真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，包括

(a)表达NHEJ抑制剂的转基因序列，

(b)表达一个或多个HR酶或HR激活剂的转基因序列，

(c)灭活或下调NHEJ基因的突变，和/或

(d)增强HR酶、HR激活剂或NHEJ抑制剂的表达或活性的突变，

其中重组真核宿主细胞具有的HR/NHEJ比比在不包括(a)和/或(b)所述的转基因序列的细胞中发现的比高超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍，和

包括，任选地，基质附着区(MAR)元件。

本发明还涉及重组真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，包括

(a)表达NHEJ抑制剂的转基因序列，

(b)表达一个或多个HR酶或HR激活剂的转基因序列，

(c)灭活或下调NHEJ基因的突变，和/或

(d)增强HR酶、HR激活剂或NHEJ抑制剂的表达或活性的突变，

整合进所述细胞基因组的转基因，和

任选地，MAR元件，其中所述MAR元件以顺式或反式提供给所述转基因。

一个或多个HR酶可以是Rad 51、Rad 52、RecA、Rad 54、RuvC或BRCA2和/或HR激活剂可以是RS-1和/或NHEJ抑制剂可以是NU7026和/或渥曼青霉素。

转基因可功能地连接到可诱导表达的控制元件如诱导型启动子，其中所述诱导型启动子任选地是物理上活化的启动子如热休克启动子或化学上活化的启动子如IPTG或四环素活化的启动子。

(c)或(d)中的突变(或多个)可以是在xrcc4基因、RAD51链转移酶基因、依赖DNA的蛋白激酶基因、Rad 52基因、RecA基因、Rad 54基因、RuvC基因和/或BRCA2基因中的突变(或多个)。

转基因可被整合进细胞基因组的单一基因座并可形成串联结构。串联结构可包括转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝。

本发明还涉及重组真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，包括

整合进基因组单个基因座功能地连接到启动子的转基因的串联结构，其中串联结构包括转基因的至少300、400、500或600个拷贝和至少一个MAR元件，其中所述MAR元件以顺式或反式提供给所述转基因，其中所述细胞优选是已被同步的细胞群体的部分。

至少一个MAR可以顺式提供，对于所述转基因中的每个，可将MAR提供给多数所述转基因，和/或所述MAR元件中至少两个可位于转基因侧翼。至少一个MAR元件可与SEQ ID NOs：1-3具有至少90％的序列同一性或可以是SEQ ID NOs：1-3的变体和/或可位于所述转基因的启动子/增强子序列的上游。细胞可以是CHO细胞、HEK 293细胞、干细胞或祖细胞。

本发明还涉及本文提到的重组真核宿主细胞中任何一个的用途，特别是用于所述转基因表达的用途。

本发明还涉及试剂盒，其包括

a.在第一容器中，任选地包括MAR元件和转基因整合进所述载体的限制位点的载体，

b.在第二容器中，本文提到的重组真核宿主，和

c.如何在转染所述细胞中使用所述载体用于转基因表达的说明书。

试剂盒还可含有同步化剂或关于如何使包括所述细胞(或多个)的细胞群体同步化的说明书。载体可用于转染细胞至少两次，每次是当所述细胞群体的多数细胞处于G1期时。

本发明还涉及非灵长类重组真核宿主细胞，其包括

编码跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的至少一个灵长类蛋白质或灵长类RNA——如信号识别颗粒(SRP)的蛋白质或RNA或分泌复合体(易位子)的蛋白质或其亚基——的转基因序列。

细胞可进一步包括功能地连接到信号肽编码序列的转基因，其中所述转基因可以以多个拷贝，优选以串联结构的形式存在于细胞中。细胞可包括转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝。由所述信号肽编码序列编码的信号肽可包括氨基酸的疏水段并可具有与SRP54相互作用的一个或多个序列。细胞还可包括外遗传调节子元件，如MAR元件，其以顺式或反式位于所述转基因。跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的蛋白质或RNA可以是SRP，特别是SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68、SRP72和/或7SRNA的蛋白质或RNA。SRP的蛋白质可以是人类SRP14，优选与跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的所述蛋白质或RNA中的一个或多个其它的组合。所述蛋白质中的一个或多个其它的蛋白质可以是人类SR和/或人类易位子蛋白。SRP的蛋白质可以是人类SRP54，优选与跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的所述蛋白质或RNA中的一个或多个其它的蛋白质或RNA组合。所述蛋白质中的一个或多个其它的蛋白质可以是人类SR和/或人类易位子蛋白。

在跨过细胞质膜分泌和/或易位中涉及的蛋白质或RNA可以是易位子蛋白质，特别是Sec61αβγ、Sec62、Sec63和/或其亚基中的一个。在跨过细胞质膜分泌和/或易位中涉及的蛋白质或RNA可以是SRP9、SR14和易位子蛋白的组合。转基因可以是免疫球蛋白、其亚基或片段或融合蛋白。非灵长类细胞可以是啮齿动物细胞，优选CHO细胞。信号序列编码序列可与SEQ ID NOs：4-11具有至少90％的序列同一性或可以是所述序列中任一个的变体。

本发明还涉及非灵长类重组真核宿主细胞在转基因表达产物跨过细胞的细胞质膜分泌和/或易位中的用途。

本发明还涉及试剂盒，其包括

(a)在一个容器中，非灵长类重组宿主细胞，其包括作为细胞基因组的部分，编码跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的至少一个蛋白质或RNA——如信号识别颗粒(SRP)的蛋白质或RNA或分泌复合体(易位子)的蛋白质或其亚基——的转基因序列，

(b)在独立的容器中，至少一个包括转基因整合进所述载体的限制位点和任选地MAR元件的载体，和

(c)利用所述细胞表达和分泌所述转基因的转基因表达产物的说明书。

本发明进一步涉及转基因的蛋白质分泌的方法，包括：

提供非灵长类真核宿主细胞，该细胞包括

(a)编码在跨过内质网和/或内质网和/或细胞质膜分泌和/或易位中涉及的至少一个灵长类蛋白质或灵长类RNA——如信号识别颗粒(SRP)的蛋白质或RNA或分泌复合体(易位子)的蛋白质或其亚基——的转基因序列，和

(b)功能地连接到信号肽编码序列的转基因。

转基因序列可增加存在于所述细胞的在跨过细胞质膜分泌和/或易位中涉及的蛋白质或RNA的总量高于在包括/表达所述转基因序列之前在细胞中发现的水平超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

转基因可作为整合进细胞基因组的串联结构存在于细胞中，其中串联结构优选包括转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝，并可在所述细胞基因组的单个基因座被整合。

由信号肽编码序列编码的信号肽可包括氨基酸的疏水段并可具有与SRP54相互作用的序列。

(b)中的转染可以是随后的转染并可在用核酸如载体或核酸片段的最初转染之后。

最初转染的载体可对应于(b)中的载体。

转基因序列可与选自SEQ ID NOs：4-11的序列具有至少90％的序列同一性或可以是所述序列中任一个的变体。

本发明还涉及鉴定转基因序列的蛋白质分泌和/或易位增加活性的方法，包括：

监测包括编码重组蛋白的转基因的第一哺乳动物细胞，其中所述重组蛋白由所述细胞以第一水平分泌，

监测包括编码所述重组蛋白的所述转基因的第二哺乳动物细胞，其中重组蛋白由所述细胞以第二水平分泌，

其中所述第二水平超过所述第一水平，

将编码在跨过细胞质膜分泌和/或易位中涉及的至少一个蛋白质或RNA的转基因序列导入到所述第一哺乳动物细胞，和

测定在所述第一细胞中所述重组蛋白的分泌水平改变，

其中超过第一水平的增加鉴定到所述转基因序列的蛋白质分泌增加活性。

附图简述

图1(A)至(F)：MAR和连续转染对基因转移和表达的作用的分析和通过含有MAR的表达载体的双转染获得的转基因表达水平的图解。

图2(A)至(D)：通过细胞分裂周期测定连续转染和细胞培养进展之间的最佳时机。

图3(A)至(E)：连续转染之后DNA转运、整合和表达以及平均GFP荧光和单克隆细胞群体中转基因拷贝数之间的关系。

图4(A)至(C)：转染的DNA的亚细胞分布和DNA构象对基因转移和表达的影响。

图5(A)至(E)：通过MARS的高转基因表达、质粒同源性和同源重组和通过用MAR的重复转染的提高的表达模式。

图6(A)至(C)：通过高和低重组IgG生产CHO克隆表达的免疫球蛋白的重链和轻链的鉴定。

图7：高和低IgG生产者的ER折叠和UPR结构(machinery)的鉴定。

图8(A)、(B)：重组的产生IgG的CHO克隆的SRP14转染消除轻链聚集和挽救IgG分泌。

图9：表达SRP9、SRP14、SRP54、SR和易位子的多种组合的CHO细胞库(pools)中Mab产生的增加。

图10：显示SGE位于侧翼的目的转基因的表达盒的表达载体图。

多种优选实施方式的详细描述

本发明上下文中使用的转基因是分离和纯化的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，其编码给定的成熟蛋白质(本文也被称作编码蛋白的DNA)或前体蛋白或功能RNA。根据本发明的一些优选的转基因是编码免疫球蛋白(Igs)和Fc-融合蛋白和其它蛋白，特别是具有治疗活性的蛋白(“生物治疗药物”)的转基因。如本文所用，术语转基因在DNA编码蛋白的上下文中将不包括未转录的侧翼区如RNA转录起始信号、多聚腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。通常，当提到通过转染导入进细胞如真核宿主细胞的DNA序列时，术语转基因在本发明上下文中使用(在本发明的上下文中，该术语还包括通过病毒载体导入外源DNA的过程，其有时还被称作转导)，其编码目的产物——本文也称作“转基因表达产物”或“异源蛋白质”。转基因可功能地连接到信号肽编码序列，其编码信号肽，信号肽反过来介导和/或促进跨过内质网和/或细胞质膜易位和/或分泌并在分泌之前或期间被除去。另一方面，当提到通过转染导入进细胞如真核宿主细胞的DNA序列时，使用术语“转基因序列”，其增加目的产物的表达和/或分泌。转基因序列常常编码蛋白质或RNA序列。本发明的转基因序列是，例如，特异地增强HR(同源重组)或降低非同源末端连接(NHEJ)的那些转基因序列。下面更详细地讨论各自的蛋白质。其它“转基因序列”是编码在加工、跨过内质网和/或细胞质膜分泌和/或易位中涉及的蛋白质(或多个)或RNA(或多个)那些转基因序列。“转基因序列”可包括非翻译控制序列。

相对于从不包括各自的转基因序列的对照细胞获得的值来测量表达和/或分泌的增强。相对于对照值的任何统计学上显著的增加都称作促进。

HR/NHEJ比(或HR/NHEJ活性比)是在细胞如真核细胞，例如，重组的真核宿主细胞中存在的HR(同源重组)与NHEJ(非同源末端连接)活性之比。HR/NHEJ比通常在细胞群体——即，一组，例如，同样类型的真核细胞，例如，CHO细胞克隆——中测量。当本文提到，例如，优化或增强(增加)，例如，细胞的HR/NHEJ比时，应当理解在各自的细胞群体中发生的这种优化或增强的事实。任何这种优化或增强的参考点是在相应的细胞群体中存在的比，在该细胞群体中没有进行测量来增强或优化HR/NHEJ比。这是，例如，所述细胞的亲本细胞群体，即，获得增强或优化的细胞的细胞群体。HR/NHEJ比(或HR/NHEJ活性比)可被增加以超过参照细胞群体的HR/NHEJ比大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍，本文中参照细胞群体可被称作，例如，“不包括所述转基因序列和/或未被突变的细胞”。优化和增强测量包括处理，其中细胞被通常“处理”，不被遗传上地改变。这种处理包括同步化细胞群体的简单测量以便，例如，群体的多数细胞在转染时处于G1期。已知不同的方法实现这种同步，包括但不限于，化学剂(同步化学品)的使用和低温。Golzio等(2002)描述了通过使细胞经受用丁酸钠处理的细胞同步。Grosjean等(2002)描述了在施用含羞草氨酸作为同步化学品之后，多数细胞停滞在G1和S期的边界。Bjursell等(1973)描述了利用胸苷同步CHO细胞。

HR已被报道需要一组RAD51相关蛋白质(West 2003)。因此，可通过将补充的HR蛋白(HR酶)提供给细胞而增强HR，其包括，例如，Rad 51、Rad 52、RecA、Rad54、RuvC或BRCA2。还可以利用HR激活剂。那些包括，但不限于，RS-1(RD51-刺激化合物)。RS-1通过促进活性突触前丝的形成而增强hRAD51的同源重组活性(Jayathilaka et al.2008)。NHEJ已被报道在哺乳动物细胞中包括两个蛋白质复合体，与DNA-PKcs相关的异二聚体Ku80-Ku70和具有辅因子XRCC4的连接酶IV(

et al.，2002)。NHEJ的抑制剂——其还可在本发明的上下文中使用——包括NU7026(2-(吗啉-4-基)-苯并(h)chomen-4-酮)，一种DNA-PK抑制剂。利用化学品NU7026的NHEJ功能的抑制可促进DNA末端进入未受损的同源重组修复途径(Yanget al.2009)。另一个NHEJ抑制剂是渥曼青霉素，一种p110PI 3激酶的PI3k抑制剂，其还抑制依赖DNA的蛋白激酶——已知其介导DNA双链修复(Boulton et al.，1996)。

通过过量表达那些HR酶、HR激活剂和/或NHEJ抑制剂或通过HR活化或NHEJ抑制物理或化学处理可提高细胞的HR/NHEJ比。实现这种过量表达的一个方法是通过将编码这种酶等的“转基因序列”导入各自的细胞。这种序列被称作“转基因序列”以表示它不是相应的未修饰细胞的部分。转基因序列常常被整合进细胞的基因组。

以上描述的蛋白质，如HR酶、激活剂和/或NHEJ抑制剂可在修饰的细胞中诱导地或组成地表达。技术人员可容易地确定允许诱导或组成性表达的适当载体的构建。

同样地，细胞已通过突变被修饰以增加HR和/或降低NHEJ和/或提高细胞的HR/NHEJ比。几个出版物将NHEJ途径、负责细胞中多核苷酸随机整合的途径的抑制描述为增加HR/NHEJ比的方法(参见例如Krappmann et al.，2006)。可被灭活以阻断NHEJ的基因和/或蛋白质包括Ku80、Ku70、连接酶IV或XRCC4(还参见本文对V3.3突变体的引用)并可在本发明的上下文中导致HR/NHEJ比的非常显著的增加和转基因表达的提高，如达转基因表达平均值之上的5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或甚至达60倍增加。同样地，某些突变可增加HR，例如，通过提高细胞的某些内源性HR酶或激活剂的表达。

HR/NHEJ峰(或HR/NHEJ活性峰)是真核细胞细胞群体的细胞周期过程中的时期，在该时期HR/NHEJ比升高并是峰。在本发明的上下文中，如果提到细胞的HR/NHEJ峰，应当理解为提到相同种类的细胞群体——例如，由转基因序列修饰以表达HR酶的细胞群体——的细胞。“HR/NHEJ峰”包括绘制时间对代表HR/NHEJ或仅仅HR的值的图中最高HR/NHEJ升高(峰的尖端，峰尖端)周围的时间间隔。用于转染的优选时间间隔是在HR/NHEJ峰之前(例如在细胞周期的G1期)，以便随着峰尖端周围的时间(峰尖端，例如S期晚期和G2期)DNA到达细胞核，峰尖端由时间点确定，在该时间点已达到来自值的HR/NHEJ(或仅仅HR)的50％上升或更多，线在该值朝着峰的尖端开始上升(“最低值(bottom value)”)到峰的尖端。峰开始存在，例如，当细胞群体中最低数量的细胞处于G1或S期早期——当已知HR活性低的期，和/或当多数细胞处于S期或处于G2期时，当已知HR活性是最高时。

当细胞群体中的多数细胞处于G1期时的时间点也显示在图2(B)所示的图中。这里显示与每个细胞周期状态(G1、S、G2/M)相关的群体百分比。如从该图可以看出，超过80％、超过85％、超过90％或甚至超过95％的描述的群体细胞被鉴定为处于G1、S期或G2/M期。在发现的处于这些期之一的细胞中，在该实例中发现21小时之后，多数处于G1期。与S或G2/M期细胞的百分率相比，G1期细胞的百分率因此是最高的。

功能RNA包括在细胞中产生直接或间接作用的任何类型的RNA，其区别于被翻译成蛋白质。典型的实例是反义RNAs或小干扰RNAs(si RNAs)。

真核宿主细胞是“容纳(host)”或被设计以“容纳”根据本发明的转基因的细胞。重组真核宿主细胞在遗传上被修饰，即含有另外的序列，该序列或作为基因组的部分或作为染色体外元件如载体的部分，通常来提高转基因表达产物的表达或分泌。

多连体或串联结构是长的连续的DNA序列段或含有多重拷贝的串联连接的相同单体DNA序列的分子。在本发明的上下文中，单体DNA序列是或常常包括转基因。转基因——其可包括，例如，启动子和增强子序列——的串联结构通常整合进宿主细胞的基因组。该整合可发生在宿主染色体的多个位置(基因座)(整合位点)或单个基因座。单个串联结构可包括超过200、300、400、500、600、700或超过800个包括所述转基因的单体DNA序列。优先地观察到单体DNA序列的头对尾排列。所述的以多重拷贝存在于细胞中的转基因可具有串联结构。

根据本发明的MAR元件、MAR构建物、MAR序列、S/MAR或仅仅MAR是核苷酸序列，其与天然存在的“SAR”或“MAR”共享一个或多个(如两个、三个或四个)特性并具有至少一个促进由所述MAR影响的任何基因的蛋白表达的性质。MAR元件还具有成为具有MAR活性，特别是具有转录调节，优选增加活性，但还具有，例如表达稳定活性和/或还在“提高的MAR构建物”下描述的其它活性的分离和/或纯化的核酸的特征。MAR元件属于较宽的组的外遗传调节子元件，该元件还包括边界或绝缘子元件、基因座控制区(LCRs)、稳定和抗阻抑物(STAR)元件、无所不在地作用染色质开放(UCOE)元件。MAR元件可基于它们主要基于的经鉴定的MAR而被限定：因此，MAR S4构建物是多数核苷酸(50％以上)基于MAR S4的MAR元件。常常在SARs和/或MARs内已发现A和T含量高的几个简单序列模体，但是对于大部分，还未解决它们的功能重要性和潜在的作用方式。这些包括A盒、T盒、DNA解旋模体、SATB1结合部位(H盒，A/T/C25)和针对脊椎动物或果蝇属的共有序列拓扑异构酶II位点。

如通常在MAR元件中发现的富含AT/TA二核苷酸的弯曲DNA区(以下称作“富含AT区”)是包括大量A和T特别是以二核苷酸AT和TA形式的弯曲DNA区。在优选实施方式中，它在100个连续碱基对的一段序列上含有至少10％二核苷酸TA和/或至少12％二核苷酸AT，优选在100个连续碱基对的一段序列上(或当富含AT区具有较短的长度时在各自较短的一段序列上)含有至少33％二核苷酸TA和/或至少33％二核苷酸AT，而具有弯曲的二级结构。然而，“富含AT区”可以是短如约30个核苷酸或更少，但优选是约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、约150、约200、约250、约300、约350或约400个核苷酸长或更长。

一些结合部位还常常具有相对高的A和T含量，如SATB1结合部位(H盒，A/T/C25)和针对脊椎动物(RNYNNCNNGYNGKTNYNY)或果蝇属(GTNWAYATTNATNNR)的共有序列拓扑异构酶II位点。然而，通过比较区的弯曲模式，结合部位区(模块)，特别是包括一群结合部位的TFBS区，可容易地与来自A和T含量高的MAR元件的富含AT和TA二核苷酸区(“富含AT区”)区分。例如，对于人类MAR 1_68，后者可具有超过约3.8或约4.0的平均曲率度，而TFBS区可具有低于约3.5或约3.3的平均曲率度。识别的MAR区还可被可选的方法确定，如但不限于，如本文别处所描述的相对解链温度。然而，这样的值是种特异的并因此可在种与种之间变化，并可以，例如，较低。因此，各自富含AT和TA二核苷酸区可具有较低曲率度如从约3.2至约3.4或从约3.4至约3.6或从约3.6至约3.8，TFBS区可具有按比例较低的曲率度，这样的低于约2.7、低于约2.9、低于约3.1、低于约3.3。在SMAR Scan II中，各自的较低的窗口大小将由熟练的技术人员选择。

术语MAR元件、MAR构建物、MAR序列、S/MAR或仅仅MAR还包括提高的MAR构建物，提高的MAR构建物具有构成超过天然存在和/或识别的MAR的增加的性质，根据本发明的MAR构建物可基于天然存在和/或识别的MAR。这种性质包括，但不限于，相对于天然存在和/或识别的MAR的全长的减少的长度、基因表达/转录增加、表达的稳定性、组织特异性、诱导性增强或其组合。因此，被提高的MAR元件可，例如，包括小于约90％，优选小于约80％，甚至更优选小于约70％，小于约60％，或小于约50％的识别的MAR序列的核苷酸数。MAR元件可提高用所述构建物转化合适的细胞之后转基因的基因表达和/或转录。

MAR元件优选插入到启动子区的上游，目的基因可操作地连接或可以可操作地连接到启动子区。然而，在某些实施方式中，MAR元件位于目的基因/核苷酸序列的上游以及下游或只是下游是有利的。其它的多个顺式和/或反式MAR排列也处于本发明的范围内。

本发明还涉及与一个或多个非MAR外遗传调节子如，但不限于，组蛋白改性物如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)，其它DNA元件(外遗传调节子元件)如基因座控制区(LCRs)、绝缘子如cHS4或抗阻抑物元件(例如，稳定剂和抗阻抑物元件(STAR或UCOE元件)或热点(Kwaks THJ和Otte AP)联合的MAR元件的用途。

当在MAR/MAR元件的上下文中使用时，合成物指MAR，该MAR的设计不只是包括识别的MARs或基于此的MARs的序列/区或部分区的简单改组、复制和/或缺失。特别地，合成的MARs/MAR元件通常包括一个或多个，优选一个识别的MAR的区，然而，在某些实施方式中其可以是合成的或修饰的，以及特异地设计的、良好表征的元件，如单个或一系列TFBSs，其在优选实施方式中被合成地产生。这些设计者元件在许多实施方式中是相对短的，特别地，它们通常不超过约300bps长，优选不超过约100、约50、约40、约30、约20或约10bps长。在某些实施方式中，这些元件可被多聚化。这种合成的MAR元件也是本发明的一部分并且应当理解，通常本说明书可被理解为所述适用于“MAR元件”的任何事物同样地适用于合成的MAR元件。

识别的MAR元件的核苷酸序列的功能片段也包括在以上限定中，只要它们保持如上面所述的MAR元件的功能。

一些优选识别的MAR元件包括，但不限于MAR 1_68、MARX_29、MAR 1_6、MAR S4、MAR S46，其包括如WO2005040377和美国专利申请20070178469中所公开的所有它们的变换，由于公开这些和其它MAR元件的序列，它们也通过引用被具体地并入本申请。鸡溶菌酶MAR也是优选的实施方式(参见，US专利号7,129,062，由于其公开MAR元件，其也被具体地并入本文)。

顺式指在同一核酸分子如，但不限于，同一载体或染色体上的两个或多个元件(如染色质元件)的放置。

反式指在两个或多个核酸分子如，但不限于，两个或多个载体或染色体上的两个或多个元件(如染色质元件)的放置。

当序列发挥它的来自顺式/反式位置的活性时，可以说序列在，例如，基因上以顺式和/或反式作用。

本发明的转基因或转基因序列常常是载体的一部分。

根据本发明的载体是能转运另一个核酸——如将由该载体表达的转基因——的核酸分子，该转基因已被连接到该载体上，通常它已被整合进该载体。例如，质粒是一种类型的载体，反转录病毒或慢病毒是另一种类型的载体。在本发明的优选实施方式中，载体在转染之前被线性化。

载体的载体序列是载体的DNA或RNA序列，排除任何“其它”核酸如转基因以及遗传元件如MAR元件。

当本说明书提到“质粒”或“载体”同源性时，该术语指包括MARs和基因的整个质粒或载体的同源性(本文使用的与序列同一性同义)。

根据本发明，包括哺乳动物细胞，如重组的真核宿主细胞的真核生物，能在细胞培养条件下被维持。这种类型细胞的非限制的例子是非灵长类真核宿主细胞如中国仓鼠卵巢(CHOs)细胞和幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)。灵长类真核宿主细胞包括，例如，人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)和用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL-1587)。重组的真核宿主细胞表示已被修饰，例如，通过用转基因序列转染和/或通过突变的细胞。真核宿主细胞能进行由所述细胞表达的蛋白质的转录后修饰。在本发明的某些实施方式中，真核(例如，非灵长类)宿主细胞的细胞负体具有完全的功能，即，未被，例如，突变灭活。除了它的细胞负体(例如，非灵长类)，转基因序列(例如，灵长类)被表达。

根据本发明的转染是将核酸导入容易接受的真核细胞，如但不限于，通过电穿孔、脂转染，通过病毒载体(有时被称作“转导”)或通过化学方法，其包括包含聚阳离子脂质的那些化学方法。

如本文所用，转化指通过加入核酸而修饰真核细胞。例如，转化的细胞包括已用转基因序列转染的细胞，例如，通过包括该序列的载体的电穿孔。然而，在本发明的许多实施方式中，将本发明的转基因序列导入细胞的方法不限于任何特定方法。

单一转染指描述的转染只进行一次。

转录指从DNA模板合成RNA。“有转录活性的”指正被转录的转基因。

同一性指如由两条这样的序列——如完全和全部序列——之间匹配的同一性所确定的两个核苷酸序列之间的序列关联性程度。同一性可被容易地计算。虽然存在许多测量两个核苷酸序列之间同一性的方法，术语“同一性”对熟练的技术人员是熟知的(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，andGriffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。通常利用的测定两个序列之间同一性的方法包括，但不限于Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，1994，和Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J Applied Math.48：1073(1988)中公开的那些方法。测定同一性的优选方法被设计成给出被检测的两个序列之间的最大匹配。将这样的方法整理在计算机程序中。优选的测定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于，GCG (遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，Madison Wis.)程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research12(1).387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul et al.(1990)；Altschul et al.(1997))。众所周知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。

作为例证，包括与参考核苷酸序列具有至少，例如，95％“同一性”的核苷酸序列的核酸指核酸的核苷酸序列与参考序列相同，除了该核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸达五个点突变。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的核苷酸，参考序列中达5％的核苷酸可缺失或由其它核苷酸置换，或参考序列中全部核苷酸的达5％的核苷酸可被掺入到参考序列。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任何地方，其单独地分散在参考序列或参考序列内一个或多个连续的组的核苷酸中。约60％、约70％、约75％、约85％或约90％的序列同一性也处于本发明的范围内。

与另一个核酸序列具有大量同一性的核酸序列指在它的序列中具有点突变、缺失或添加的序列，该点突变、缺失或添加对描述的各自的方法没有影响或具有最低的影响，并且该核酸序列常常表现为100bp中一、二、三或四个突变。

本发明涉及多核苷酸和多肽变体。“变体”指与本发明多核苷酸或多肽不同但保留其基本性质的多核苷酸或多肽。通常，变体与本发明的多核苷酸或多肽总体上非常相似并在许多区中相同。

变体在编码区、非编码区、或这两个区可含有改变。尤其优选的是含有改变的多核苷酸变体，这些改变产生沉默置换、添加或缺失，但不改变编码的多肽的性质或活性。由于遗传密码的简并性，由沉默置换产生的核苷酸变体是优选的。而且，其中5-10、1-5或1-2个氨基酸以任何组合被置换、缺失或添加的变体也是优选的。

本发明还包括所述多核苷酸的等位基因变体。等位基因变体表示占据相同染色体基因座的基因的两个或多个可选形式中的任何一个。等位基因变异通过突变而自然地发生，并可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是基因的等位基因变体编码的多肽。

启动子序列或仅仅启动子是被宿主细胞识别用于特定核酸序列表达的核酸序列。启动子序列含有调节多核苷酸表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，并可从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因而获得。如果特异的核酸序列在所述启动子上运用它的功能，那么启动子被“功能地连接”到特异的核酸序列。

增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至约300个核苷酸长，其作用到启动子上以增加它的转录。可利用来自珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白的增强子和胰岛素增强子。然而，可利用来自病毒的增强子；例子包括复制起点近侧上的SV40，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点近侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。

如本文所用指数地不是确切的数学术语，但描述细胞的生物学生长曲线，其中这样的生长的图不是作为直线，而是向上指和，超过一定时期，连续地变得更陡的曲线。无论如何，它意味着不只是添加，例如增加。

如在本发明的上下文中所用的表达的变异性指一个转化的细胞对另一个相同种类转化的细胞的表达的变异性。该变异性是区分转基因拷贝和/或转基因整合位点的结果。同样，在相同基因座的转基因多重拷贝的共整合可导致沉默并因此有助于变异性。

而且，术语包括和其衍生不排除其它元件或步骤。而且，不定冠词“一(a)”和其衍生不排除多数。权利要求中提到的特征中的几个的功能可通过整体实现。与特性或值连接的术语基本上、约、大约和类似的术语特别地还准确地限定该特性或准确地限定该值。

同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)和转基因表达变异性的降低

独立的转化体中转基因表达的变异性受稳定地整合进细胞基因组的许多基因的影响和受整合位点的影响。虽然研究MARs，特别是虽然确定为什么MARs产生较高的转基因表达，但是进行了一些观察，其导致较宽的、不依赖MAR的发现：

首先，通过定量PCR可证明MAR元件增加整合进转基因的转基因拷贝数。这些结果证实了先前的半定量的观察结果(Kim et al.，2004；Girod et al.，2005)。此外，稳定的细胞库中的中期染色体的荧光原位杂交分析显示在用MARs转染的细胞中较高的荧光强度，因此证实转基因整合的增加。

进一步的研究导致这样的发现，用转基因和各自的MAR的单一转染之后，MAR对转染之后转运到细胞核的质粒的量没有发挥显著的作用。可能的解释是连环化和/或整合解释整合进细胞基因组的高拷贝数。最初想法是MARs可作为DNA重组信号发挥作用。由于它们的结构性质，如它们的解旋和不配对潜能，存在它们可增加转染的质粒之间同源重组的频率的可能性，因此允许较大的多联体的形成和高质粒拷贝数的整合。

其次，研究现象，在某些情况下，用转基因，接下来是MAR的两个连续的转染(单个最初转染和随后的转染)允许转基因表达超过累加的增加而不是提供仅仅累加，例如，两倍增加，其是人们将从，例如，两个独立的转染期望的。

通过定量PCR显示，与连续的MAR转染相关的高转基因表达基于与一个单个事件相比，多个转染事件之后整合的转基因拷贝数的相似的高的增加。

虽然存在进入细胞核的质粒数的增加，但是进一步研究是否连续的MAR转染中整合的高转基因拷贝数可，至少部分，是由于连续转染期间导入细胞的同源质粒之间的较好的连环化。包括同源重组的过程被怀疑并通过研究质粒同源性的作用而被检测。特别地，用转基因、质粒骨架和/或MARs的不同组合进行双重转染(doubletransfection)。FACS分析显示，高质粒同源性(载体序列同源性和转基因以及MAR同源性)通常是整合的较高效率和转基因表达所需要的。改变表达基因和载体序列或MARs降低整合的效率和转基因表达。事实上，当所有的序列不相同时，观察到的双重转染的作用被完全消除。

此外，连续转染之间的时机显示对获得最佳的蛋白表达是非常重要的。假设，在第二转染时，细胞应处于有利于较高重组率的细胞周期状态，导致形成较大的多联体和更多的质粒整合进宿主基因组。如上面所讨论的，转基因的连环化可由存在于真核细胞的两个主要机制产生，一个是HR，另一个是NHEJ。因此，检测一个或另一个对双重转染的影响。对此，利用在非同源末端连接或同源重组中缺失的不同的CHO突变体。发现NHEJ途径对抗有效的转基因整合和表达，而同源重组途径和转染的载体上的同源DNA序列支持高水平表达。当使用单独依赖同源重组的突变的CHO细胞时，与非突变的细胞相比，含有MAR的载体的转染产生转基因表达水平非常高的增加。同样，FISH分析没有显示在特定时间间隔——这里是21小时——伴随连续转染的任何多个整合事件，表明所有的转基因在一个染色体基因座整合。

因此，非同源末端连接或同源重组中缺失的宿主细胞对MAR影响的转基因的整合的作用导致与MARs无关的较宽的概念，即HR支持转基因整合而NHEJ不支持转基因整合。因此，我们设计方法和构建物，其利用该发现以增加转基因整合和因此增加转基因表达。该方法包括在整合时用处理——如化学或温度处理或允许细胞群体同步的其它处理——增加HR、降低NHEJ和/或增加HR/NHEJ比的方法。上面在HR/NHEJ比的讨论中描述了其它的处理和修饰。构建物主要是细胞，其具有合适的组成以允许HR增加、NHEJ降低和/或HR/NHEJ比增加。

在宿主细胞中NHEJ降低和/或HR或HR/NHEJ比增加在可包括或可不包括MAR的连续转染的背景下也具有特别有利的作用。

然而，虽然不依赖MAR的过程在转基因整合和表达方面提供相当大的进展，但是MARs和其它外遗传调节子仍然提供另外有利的性质，该有利的性质部分可通过有利地影响同源重组以及通过其它机制而被解释，这些机制中的一些先前已讨论了(参见，例如，美国专利申请US 2007/0178469)。

MAR元件已被描述具有通过保护转基因抵御沉默效应而减少表达低蛋白质水平的群体而改善转基因表达的能力，这可能由在非允许的异染色质基因座中的整合产生(Bell and Felsenberg，1999)。在存在MAR的情况下观察到的抗沉默效应可由染色质修饰如在转基因整合位点的组蛋白高度乙酰化介导(Recillas-Targa et al.，2002；Yasuiet al.，2002)或亚核定位的改变介导。另外，MARs可招募调节蛋白，其修饰染色质以接受转录上更允许的状态，或它们可招募活化基因表达的转录因子(Yasui et al.，2002；Hart and Laemmli，1998)。可选地，但不是排他地，MAR可招募蛋白质以朝着更允许整合事件的开放状态而改造染色质结构。同样转基因的转录可通过MAR进行的转基因启动子或增强子的活化而被提高。MAR还可支持染色体内允许基因座中的整合。最后，它们可通过与HR不相关的机制增加在宿主基因组中整合的转基因拷贝数。

在该上下文中，应注意较高的拷贝数总是支持较强的转基因表达的理解不是必然有效的，因为整合进宿主基因组的多重拷贝的存在支持沉默，其由重复的元件在异染色质中向配对和聚集的倾向引起。可选地，重复基因的表达可导致形成双链和/或小干扰RNAs，这反过来可导致外遗传沉默。然而，在本发明的上下文中，应显示转基因拷贝数和细胞荧光水平被显示在存在MAR时非常相关联。因此，转基因表达的增加可能不仅由更多的转基因拷贝在细胞基因组中的整合引起，还将得到MAR介导的外遗传沉默事件的抑制的支持，该外遗传沉默事件与串联基因拷贝的整合相关。

如上所述，尤其是在连续转染的上下文中，在进行的实验中转基因整合/表达的增加可通过定量在细胞核中转运的转基因的量而被部分解释。实际上，可能显示细胞核通过两个转染，特别是用MARs的转染，并且特别是在第二转染期间接受更多的质粒，因为第一转染可促进第二转染期间细胞进行的DNA摄取和细胞核转运。实际上，每个转染之后通过评价DNA的细胞内运输和定量细胞的细胞器如溶酶体、细胞核和细胞溶胶中标记的pDNA的百分率，可显示负荷MAR的质粒DNA似乎逃避溶酶体降解和在第二转染期间更有效得多地进入细胞核。解释可以是，质粒，特别是第一转染那些质粒，可使细胞降解结构饱和，因此允许第二转染期间更有效的DNA转运到细胞核。

因此，将具有提高的HR/NHEJ比、提高的HR和/或降低的NHEJ的细胞与MAR元件组合可以是非常有效的并是本发明的一部分。

同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)的机制

转基因利用重组系统以在双链断裂处整合进宿主基因组。

双链断裂(DSBs)是生物学上最有害的基因组损伤类型，潜在地导致细胞死亡或各种各样的基因重排。准确的修复对遗传信息的成功保持和增殖是必要的。

有两种主要的DSB修复机制：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。同源重组是共享同源性的DNA序列之间的基因交换过程并只在细胞周期的S/G2期工作，而NHEJ简单地拼接两个断裂的DNA末端——通常没有序列同源性，它在细胞周期的所有时期起作用但在有丝分裂的细胞的G0-G1和S期早期特别重要(Wong andCapecchi，1985；Delacote and Lopez，2008)。在脊椎动物中，HR和NHEJ有区别地有助于DSB修复，这取决于DSB的性质和细胞周期的时期(Takata et al.，1998)。

NHEJ：基本机制

概念上地，NHEJ过程的分子机制似乎简单：1)一组酶捕获断裂的DNA分子，2)形成使两个DNA末端在一起的分子桥和3)断裂的分子重新连接。为了进行这样的反应，哺乳动物细胞中的NHEJ结构包括两个蛋白复合体，与DNA-PKcs(依赖DNA的蛋白激酶的催化亚基)相关的异二聚体Ku80/Ku70和具有其辅因子XRCC4(X线互补中国仓鼠基因4)和许多蛋白因子如Artemis和XLF(XRCC4样因子或Cernunnos)的DNA连接酶IV(et al.，2002)。NHEJ经常被认为易错DSB修复，因为它简单地拼接两个断裂的DNA末端——通常没有序列同源性并且它产生小的插入和缺失(Moore and Haber，1996；Wilson et al.，1999)。NHEJ提供贯穿细胞周期的DSBs修复的机制，但在有丝分裂的细胞的G0-G1和S期早期特别重要(Takata et al.，1998；Delacote and Lopez，2008)。在从细菌到哺乳动物的生物体中观察到通过NHEJ的DSBs修复，表明在进化过程中它已被保存。

DSB形成之后，NHEJ修复途径中的关键步骤是断裂的DNA末端的物理并列。Ku70/80异二聚体蛋白复合体与断裂的DNA分子两端的结合启动NHEJ以将末端捕获、拴在一起和产生用于其它NHEJ关键因子组装的支架。DNA结合的Ku异二聚体复合体将DNA-PKcs招募到DSB，一种属于PIKK (蛋白激酶的磷酸肌醇3-激酶样家族)的460kDa的蛋白(Gottlieb and Jackson，1993)，并活化它的丝氨酸/苏氨酸激酶功能(Yaneva et al.，1997)。两个DNA-PKcs分子跨过DSB一起相互作用，因此在两个断裂的DNA末端之间形成分子桥并抑制它们的降解(DeFazio et al.，2002)。然后，DNA末端可被直接地连接，尽管在结扎之前从DSB产生的多数末端不得不被适当地处理(Nikjoo et al.，1998)。依赖断裂的性质，通过填充缺口、去除断裂周围的损伤的DNA或二级结构，可需要加工酶的不同组合的作用以产生相容的突出端。NHEJ处理中的该步骤被认为是与NHEJ修复相关的核苷酸的偶然丢失的原因。哺乳动物NHEJ中的一个关键的末端加工酶是Artemis——酶的金属-β-内酰胺酶超家族的成员，其在多数放射敏感的重症联合免疫缺陷(SCID)患者中被发现为突变的基因(Moshous etal.，2001)。Artemis对含有DNA的ds-ss转换和DNA发夹具有5’→3’外切核酸酶活性和DNA-PKcs依赖的内切核酸酶活性(Ma et al.，2002)。它的活性还被ATM调节。因此，Artemis似乎可能参与多重DNA损伤反应。然而，只有一组DNA损害似乎被Artemis修复，因为在缺少Artemis的细胞中没有观察到DSB修复的主要缺点(Wang etal.，2005，Darroudi et al.，2007)。

DNA缺口必须被填充以能够进行修复。将核苷酸加入到DSB受聚合酶μ和λ的限制(Lee et al.，2004；Capp et al.，2007)。通过与XRCC4相互作用，多核苷酸激酶(PNK)也被招募到DNA末端以允许DNA聚合和连接(Koch et al.，2004)。最后，通过DNA末端的连接完成NHEJ——由含有XRCC4、DNA连接酶IV和XLF的复合体实现的步骤(Grawunder et al.，1997)。其它连接酶可部分代替DNA连接酶IV，因为NHEJ可在缺少XRCC4和连接酶IV时发生(Yan et al.，2008)。此外，研究显示XRCC4和连接酶IV在NHEJ外面不具有作用，然而相反，KU在其它过程如转录、凋亡和对微环境的反应中起作用(Monferran et al.，2004；Müller et al.，2005；Downs and Jackson，2004)。

如本领域技术人员将容易理解的，上面提到的蛋白(例如，异二聚体Ku80/Ku70、DNA-PKcs，但特别是DNA连接酶IV、XRCC4、Artemis和XLF(XRCC4样因子或Cernunnos)、PIKK(蛋白激酶的磷酸肌醇3-激酶样家族)的基因之一中或周围的任何突变——将降低或关闭NHEJ——位于本发明的范围内。同样地，作用于以上途径中的任何一个以降低它或关闭它的任何蛋白质或转基因序列位于本发明的范围内。

HR：基本机制

同源重组(HR)是非常精确的修复机制。同源染色单体充当断裂链的修复模板。HR发生在细胞周期的S期和G2期期间，那时获得姊妹染色单体。典型的HR主要被表征为三个步骤：1)断裂末端的5’的切除，2)用同源的DNA双链体的链侵入和交换，和3)重组中间体的分解。不同的途径可完成DSB修复，取决于进行链进入的能力，并包括合成依赖的链退火(SDSA)途径、典型的双链断裂修复(DSBR)(Szostak etal，1983)、断裂引起的复制(BIR)，和可选地，单链退火(SSA)途径。所有的HR机制是相互联系的和共享许多酶促步骤。

所有HR反应的第一步对应于用核酸酶在MRN复合体(MRE11、RAD50、NBN(先前的NBS1，针对Nijmegen断裂综合征1))和CtIP(CtBP-相互作用蛋白)(Sun et al.，1991；White and Haber，1990)的帮助下的5’末端断裂的DNA链的切除。3’单链DSB的最终产生能寻找同源序列。同源双链体的侵入通过由用RAD51重组酶蛋白包被的3’ss-DNA组成的核线进行(Benson et al.，1994)。复制蛋白A(RPA)、异三聚体的ssDNA结合蛋白——参与真核生物中与ssDNA相连的DNA代谢过程(Wold，1997)——的需要对RAD51丝的组装是必需的(Song and sung，2000)。然后RAD51与RAD52相互作用，RAD52具有环状结构(Shen et al.，1996)以替换RPA分子和促进RAD51装入(Song and sung，2000)。Rad52在酵母中对重组过程是重要的(Symington，2002)。然而，在脊椎动物中，BRCA2(乳腺癌2型敏感性蛋白)而不是RAD52似乎在链进入和交换中发挥重要作用(Davies and Pellegrini，2007；Esashi et al.，2007)。RAD51/RAD52相互作用被RAD54的结合而稳定。RAD54在D环形成之后在重组中间体的成熟中也发挥作用(Bugreev et al.，2007)。在其它方面，BRCA1(乳腺癌1)与BARD1(BRCA1相关的环状结构域1)和BACH1(BTB和CNC同源物1)相互作用以分别执行连接酶和螺旋酶DSB修复活性(Greenberg et al.，2006)。针对DNA损伤，BRCA1也与CtIP以CDK依赖的方式相互作用并进行泛素化(Limbo et al.，2007)。因此，BRCA1、CtIP和MRN复合体在细胞周期的S期和G2期HR介导的DNA修复的激活中发挥作用。

核线的侵入导致被称作替位环(D环)的异源双链体的形成并包括用侵入的链替换双链体的一条链和与另一条链配对。然后，几个HR途径可完成修复，利用同源序列作为模板来替换包围DSB的序列。依赖使用的机制，同源的模板和断裂的DNA分子之间的相互交换(交换)可与HR修复相关或可与HR修复相关。交换可具有重要的遗传后果，如基因组重排或杂合性丢失。

如本领域技术人员将容易理解的，上面提到的蛋白(例如，MRN复合体(MRE11、RAD50、NBN(先前的NBS1，针对Nijmegen断裂综合征1))的蛋白和CtIP(CtBP相互作用蛋白)、RAD51——复制蛋白A(RPA)、Rad52、BRCA2(乳腺癌2型敏感性蛋白)、RAD54、BRCA1(乳腺癌1)与BARD1(BRCA1相关的环状结构域1)、BACH1(BTB和CNC同源物1)相互作用)的基因之一中或周围的任何突变——该突变将增强HR——位于本发明的范围内。同样地，作用于以上途径中的任何一个以增加它的任何蛋白质或转基因序列位于本发明的范围内。

DNA DSB修复途径之间的选择

NHEJ和HR似乎是两个主要的真核生物DSB修复途径。然而，它们之间的平衡在物种中有很大不同。脊椎动物细胞较酵母使用NHEJ更频繁。一个解释是高等真核生物基因组的复杂度使寻找HR必需的同源物更困难。此外，高水平的重复性在异位重组的情况下对遗传稳定性可以是危险的。可选地，在脊椎动物而不是在酵母中发现了一些因子，如DNA-PKcs、BRCA1和Artemis。

在哺乳动物中，已知NHEJ和HR以竞争的和合作的方式起作用，对啮齿动物细胞和人类癌细胞系的研究已显示NHEJ和HR途径之间的选择取决于细胞周期阶段。NHEJ提供贯穿细胞周期的DSBs修复的机制，但在有丝分裂的细胞的G0-G1期和S期早期特别重要(Takata et al.，1998；Delacote and Lopez，2008)，而HR在S期晚期/G2期是活跃的。几个因素在两个途径之间的选择的调节中也是重要的，包括修复蛋白的调节的表达和磷酸化、修复因子的染色质接近性和同源修复模板的可用性。

调节HR效率的一个关键因素是模板的可用性。因此当姊妹染色单体是可得到的时，在细胞周期的S和G2期期间细胞上调HR是不令人惊奇的，因为它们是HR喜爱的模板(Dronkert et al.，2000)。这种偏爱可通过从姊妹染色单体在S期形成的时间直到它们在后期分离的姊妹染色单体之间的邻近效应来解释。但是同源模板的存在对HR能力是不够的。日益增加的证据表明，当细胞从G1进展到S/G2，从NHEJ到HR的转换被有效地调节。

实际上，在哺乳动物细胞中HR被依赖CDK的细胞周期控制紧密地调节。已证明，CDK介导的BRCA2丝氨酸3291的磷酸化阻断它在M期和G1期早期与RAD51的相互作用。这种磷酸化代表HR被下调的机制之一(Esashi et al.，2007)。另外，HR和NHEJ之间的基本差别是HR介导的修复需要DNA切除(大约100-200个核苷酸)用于同源性查找和链侵入(Sung and Klein，2006)。现在清楚DNA 5’末端的切除是通过启动HR和进一步抑制NHEJ的可能性而有助于DSB修复选择的关键步骤。切除依赖CDK1活性。有趣地，阻断CDK1导致在DSB位点MRE1的持久性，提示末端切除的调节而不是MRN募集到断裂的末端需要CDK1活性(Ira et al.，2004)。最后，RAD51和RAD52表达在S期期间增加并有助于HR激活(Chen et al.，1997)。相比之下，NHEJ在S期被DNA-PK活性的降低而下调(Lee et al.，1997)。

在HR/NHEJ界面的蛋白

修复途径之间的选择的调节可由在两个修复途径中都起作用的早期作用蛋白来控制。MRN复合体和ATM在它们之中，并连同它们的介质和转导蛋白形成感觉和信号传导任何DNA损伤的高效网络。该网络在损伤之后非常快速地开始工作并在任务完成之后不久被关闭。

MRN复合体参与DNA修复机制，如HR、NHEJ、DNA复制、端粒维护和参与将信号传导到细胞周期检查点(D’Amours and Jackson，2002；van den Bosch et al.，2003)。DNA损伤修复的第一步是通过MRE1的DNA结合模体，作为异四聚体(M2R2)的MRN复合体与DSBs断裂末端的结合(de Jager et al.，2001)。该结合被排列为具有RAD50WalkerA和B模体和桥DNA分子的球形的结构域。

MRN复合体因此是DSBs的第一传感器，它通过两步活化ATM (Mirzoeva andPetrini，2003；Lavin 2007)。首先，它将DNA末端的局部浓度增加到触发ATM单体化的水平。然后结合到ATM的NBN将它转化成活性构象(Dupre et al.，2006)。一旦被活化，ATM在DSB信号传导中发挥重要作用和磷酸化许多种蛋白质靶点。例如，ATM通过p53中间物的作用来诱导细胞周期停滞(Canman et al.，1998；Waterman etal.，1998)。其它底物，例如NBS、MRE1、BRCA1、CHK2、FANCD2、Artemis和DNA-PKcs被活化的ATM激酶磷酸化并通过在DNA修复、细胞周期控制和转录中发挥作用而对决定细胞命运是重要的。MRN复合体和ATM在DSBs的识别和信号传导中是相互独立的(Lavin，2007)。

在对DSBs的反应中还观察到ATM在C端S139残基对H2A的快速磷酸化(Burmaet al.，2001；Stiffet al.，2004)。在几秒内发现磷酸化的H2AX(γH2AX)在包围DSBs的兆碱基区上并通过充当几个蛋白的停泊位点而充当DNA损伤信号转导(Kim et al.，2006)。

已发现MRE11的核酸酶活性在哺乳动物细胞中通过加工3’-ssDNA——RPA的结合部位(White and Haber，19990)——而与CtIP合作来调节单链DNA的产生(Limbo etal.，2007；Sartori et al.，2007)。RPA-ssDNA复合体抑制任何另外的核酸酶活性并提供修复结构的作用位点(Sugiyma et al.，1997；Williams et al.，2007)。这之后是HR或A-NHEJ，取决于同源序列的存在、蛋白调节和切除的大小(Rass et al.，2009)。

CtIP被首先表征为转录阻抑物CtBP(羧基端结合蛋白)的辅因子和它结合细胞周期调节子，如视网膜母细胞瘤蛋白和BRCA1(Fusco et al.，1998；Schaeper et al.，1998；Wong et al.，1998)。已知CtIP在细胞周期进展中具有转录依赖的和不依赖的含义(Liuand Lee，2006；Wu and Lee，2006)。除了它在针对DNA DSB的细胞周期检查点中的重要作用，最近的工作提示CtIP通过启动DBS末端切除而控制HR进行的修复DSB损伤的决定(Sartori et al.，2007；You et al.，2009)。此外，它还可参与G1期期间MMEJ需要的DSB末端的有限切除(Yun and Hiom，2009)。因此，CtIP连接细胞周期控制、DNA损伤检查点和修复。由于MRN复合体对DSB末端切除也是必需的，可能CtIP提供MRN复合体和BRCA1之间的物理连接(Bernstein and Rothstein，2009；Takeda et al.，2007)。

DNA修复中涉及的这些基因中的突变分别导致基因组不稳定性综合征，如共济失调性毛细血管扩张症样病症(ATLD)(Steward et al.，1999；Taylor et al.，2004)、Nijmegen断裂综合征(NBS)和MRE11、NBS和RAD50中突变的Nijmegen断裂综合征的变体形式(Bendix-Waltes et al.，2005)。此外，无效突变导致小鼠中胚胎的致死现象(Xiao and Weaver 1997；Luo et al.，1999；Zhu et al.，2001)。ATM或ATR基因中的其它突变分别引起基因组不稳定性综合征，如共济失调性毛细血管扩张症(A-T)或Seckel综合征(SCKL1)(O’Driscoll et al.，2003)。Artemis缺乏症(Moshous et al.，2001)、DNA连接酶IV缺乏症(LigIV)(O’Driscoll et al.，2001)、Cernunnos-XLF(XRCC4样因子)缺乏症(Buck et al.，2006)、布卢姆综合征(BS)、维尔纳综合征(WS)和范康尼贫血(FA)与DNA损伤修复结构的其它成员相关(Taniguchi and D’Andrea，2006)。而且，除了基因组不稳定性异常，具有这样的综合征的患者常常遭受各种类型的恶性肿瘤，这表明未修复的DNA损伤与癌症发生之间的联系。因此DNA修复中涉及的基因在肿瘤预防中发挥关键性的作用。

如本领域技术人员将容易理解的，上面提到的基因之一中或周围的任何突变——将增加HR、降低NHEJ和/或增加HR/NHEJ比，例如，通过将修复途径之间的选择转换到HR——位于本发明的范围内。同样地，作用于以上途径中的任何一个以增加HR、降低NHEJ和/或增加HR/NHEJ比的任何蛋白质或转基因序列位于本发明的范围内。

转基因表达产物在非灵长类真核宿主细胞中的增加的分泌

在转染的细胞群体中通常有少数产生大量的转基因表达产物的细胞(显示分别超过10-100和100-1000相对光单位(RLUs)的中等或高生产者克隆/细胞)和几乎不产生任何转基因表达产物的细胞(低生产者克隆/细胞，例如，显示小于10RLUs)。然而，在某些情况下，没有高生产者克隆/细胞可从特异的转基因获得。可显示该转基因表达差别是产物特异的，存在某些“难于表达的“蛋白。针对这种难于表达的蛋白的低生产者细胞，但是在范围还有中等或高生产者细胞——例如，针对容易表达的蛋白，显示特别是前体蛋白的细胞内沉淀和潜在的多肽交联，因此指示在最终产物的加工、折叠和/或装配中的可能的问题。

本文提出的另外的数据提示在蛋白质分泌，特别是在ER易位和加工中的问题。尽管通过表达蛋白质分泌途径的组分来增加蛋白质分泌的先前不成功的尝试(Lakkaraju et al.，2008)，但是非灵长类细胞，如CHO细胞与编码这种组分的转基因序列，特别是灵长类，例如人类序列的组合导致不但低生产者细胞，而且在高生产者细胞中使人惊奇的分泌的提高。在测试的组分中，特定的组分和特定的组合产生特别有利的结果。例如，SRP14是被成功测试的蛋白之一。它可需要停止延伸直到在SRP54的帮助下新生的多肽可找到可用的SR。由于与易位子(Transl)的另外的组合提供特别高的分泌，为了易位发生，产生的复合体可需要与Transl结合，其自身导致信号肽在内质网中去除和导致适当加工和装配的蛋白质的分泌。然而，如本领域技术人员将容易理解的，其它组分的转基因序列和这种序列的组合的导入位于本发明的范围内。本文别处对蛋白质分泌途径的描述进行特别的引用。

在本文中，术语易位主要用于指跨过内质网膜的转运。然而，应认识到该术语在文献中常常使用来指更普通的概念。

蛋白质分泌途径

蛋白质的分泌是所有三个界的生物体共有的过程。该复合体分泌途径最显著地需要从细胞溶胶跨过细胞的细胞质膜的蛋白质易位。蛋白质到达它的最终目的地需要多个步骤和许多种因子。在哺乳动物细胞中，该分泌途径包括两个主要的大分子装配，信号识别颗粒(SRP)和分泌复合体(Sec复合体或易位子)。SRP由质量为9、14、19、54、68和72kDa的六个蛋白质和7S RNA组成(Keenan，Freymann et al.2001)，易位子是由Sec61αβγ、Sec62和Sec63组成的环状颗粒。

蛋白质分泌中的第一步依赖信号肽，信号肽包括在多肽氨基端的特异的肽序列，其介导新生蛋白质跨过膜易位并进入内质网(ER)腔。在该步骤期间，从前导翻译核糖体出现的信号肽与识别信号肽的SRP颗粒的亚基，即SRP54相互作用。SRP结合到信号肽阻断新生多肽的进一步延伸，导致翻译停滞。延伸停滞需要SRP9和-14蛋白(Walter and Blobel 1981)。在第二步中，核糖体-新生多肽-SRP复合体通过SRP54与SRP受体(SR)的相互作用锚定在ER膜(Gilmore，Blobel et al.1982；Pool，Stumm et al.2002)。SR是含有两个显示GTP酶活性的蛋白SRα和SRβ的异二聚复合体(Gilmore，Walter et al.1982)。SR与SRP54的相互作用依赖GTP的结合(Connolly，Rapiejko et al.1991)。SR协调SRP从核糖体-新生多肽复合体的释放和核糖体的出口位点与Sec61复合体(易位子)的结合。生长中的新生多肽通过易位子通道进入ER，翻译以其正常速度重新开始。核糖体受约束地待在易位子的细胞质面上直到翻译完成。除了核糖体，易位子与核糖体结合糖蛋白在细胞质面上紧密结合并与蛋白伴侣，如肌钙网蛋白和钙联接蛋白，并与蛋白质二硫键异构酶(PDI)和寡糖基转移酶在腔面上紧密结合。生长中的新生多肽挤进ER的腔里之后，信号肽由被称作信号肽酶的酶从前蛋白切割，由此将成熟蛋白释放进ER。翻译后修饰、正确折叠和多聚化之后，蛋白质离开ER并迁移到高尔基体，然后到分泌小泡。分泌小泡与质膜的融合在细胞外环境中释放小泡的内容物。

引人注意的是，分泌性蛋白已进化，具有特定的信号序列，该信号序列非常适合它们自己的跨过细胞膜的易位。作为不同的信号肽被发现的各种序列可以独特的方式与分泌器官相互作用。信号序列天然地主要是疏水性的——一种可参与引导新生肽到分泌性蛋白的特点。除了氨基酸的疏水段，多数哺乳动物分泌信号共享许多共有序列特点。不同的信号肽在它们引导异源蛋白质分泌的效率上不同，但是几个分泌信号肽(即白细胞介素-、免疫球蛋白-、组织相容性-信号序列的那些信号肽等)已被鉴定，其可用于引导异源的重组蛋白的分泌。尽管具有相似性，但是这些序列对促进一些难于表达的蛋白质的有效分泌不是最佳的，因为在天然的背景外，天然的信号肽不可正确地起作用，或因为与宿主细胞或与分泌过程连接的差别。切割的信号肽内的序列与成熟蛋白其它部分的相互作用进一步使对异源蛋白质有效分泌的合适信号序列的选择复杂化(Johansson，Nilsson et al.1993)。

图的详细描述

重复转染对转基因表达的影响

某些人类MARs，例如，MAR 1-68，已被发现当插入到启动子/增强子序列的上游时，在培养细胞以及小鼠中有效地增加和稳定基因表达(Girod et al.2007，Galbete etal.2009)。

MARs和连续转染对基因转移和表达的影响的分析显示在图1中。图1(A)描述GFP-表达细胞多克隆群体中的荧光分布。将CHO DG44细胞与缺乏MAR元件的GFP表达载体(GFP，左侧曲线)共转染，或与含有MAR 1-68的载体共转染(MAR1-68GFP，左起第二个曲线)，并与介导抵抗嘌呤霉素的pSVpuro质粒共转染。将这些细胞中的一些用相同的GFP表达载体——但是用介导新霉素抗性的选择质粒——在第一转染(右侧曲线)之后的一天或嘌呤霉素抗性选择2周之后(右起第二个曲线)进行第二转染。嘌呤霉素和/或新霉素抗性选择两周之后，eGFP荧光通过细胞荧光测定法来定量。显示的曲线代表四个独立的实验。在图1(B)中，柱状图显示对应显示小于10相对光单位(RLU)的非/低表达子的全部细胞，或显示中等和高(＞100RLU)或非常高(＞1000RLU)GFP荧光的细胞的百分比，如从如图A中所示的稳定细胞库的分析所确定的。在图1(C)中每个稳定的多克隆细胞库的平均GFP荧光被标准化到从MARGFP的转染获得的GFP荧光，四个独立转染的平均值和标准差显示为超过通过没有MAR的一个转染获得的荧光的成倍增加。星号表示GFP表达的显著性差异(斯氏t检验(Studuent’st-test)，P＜0.05)。图1(D)描述用或没有人类MAR单独或双重转染的细胞中eGFP转基因染色体整合位点的FISH分析的结果。将稳定的细胞库的中期染色体分散与没有MAR的GFP质粒杂交，显示了结果的代表性图解。在图1(E)中，显示了染色体的扩大以图示荧光强度的差异。

这些图显示，当用流式细胞术分析时，GFP表达载体和抗生素抗性质粒共转染——之后是它们的基因组中具有稳定整合的转基因的细胞的抗生素选择——通常在多克隆细胞群体中产生荧光的双峰分布(图1A)。在该实验装置中重叠Y轴的第一细胞亚群对应于以不能检测到的水平表达GFP的细胞，而另一个细胞亚群表达显著的GFP水平。MAR 1-68的包含增加发荧光的细胞的表达水平和伴随地降低的沉默细胞的比例(15％对36％，图1B)。

当用不同的抗生素抗性基因共转染相同的GFP表达载体2周以后，对第二抗生素的抗性选择之后观察到平均2.4倍荧光的增加，这接近期望的2倍增加(图1A和1C)。相比之下，用两个抗生素的选择之后，从在连续的日子里进行的两个连续转染观察到GFP表达出乎意料地高(4至5倍)的增加。平均起来，遍及多克隆群体的所有细胞，相对于没有MAR的单一转染，通过含有MAR质粒的连续转染获得20倍表达增加(图1C)。另外，细胞中的一些显示非常高的表达水平，沉默细胞的出现几乎完全从多克隆群体中消除(0.5％，图1B)。没有MAR的连续转染产生适度的GFP表达，导致当与单一转染相比时全部荧光水平的3.2倍增加，并且它不消除沉默细胞的出现(图1C，数据未显示)。因此，MAR的存在和重复转染协同地作用以介导提高的表达水平。

总体上，从含有MAR质粒的两个连续(第一和随后的)转染获得的表达水平很高以致于在日光下，没有紫外光照射，就可从细胞培养单层容易地看到GFP荧光(图1F，其显示通过在白天细胞单层的可见的GFP荧光，从用MAR-GFP载体转染两次的稳定多克隆细胞库中获得的GFP表达水平)。该作用不限于在该研究中使用的GFP转基因或SV40启动子，因为用携带CMV启动子和DsRed报告基因的质粒获得相似的结果，而且连续转染之后还获得了非常高的治疗性免疫球蛋白表达(数据未显示)，并且图1G，其显示转基因表达和细胞分裂周期持续时间之间的关系。用抗生素抗性质粒共转染含有SV 40启动子上游的人类MAR 1-68和每个轻链和重链的免疫球蛋白G表达载体，选择抗生素抗性细胞三周。通过两轮有限稀释分离单克隆细胞群体，并测定分泌的IgG的量和平均细胞分裂时间。正方形和三角形分别显示一个或两个转染之后获得的克隆)。有意思的是，单克隆CHO细胞克隆表达的非常高水平的免疫球蛋白常常与增加的细胞分裂时间相关联。这表明在蛋白质合成方面细胞可能正在达到它们的生理极限。这可被预期，因为当它们自身的细胞蛋白质相比时，细胞正在合成相似量的重组蛋白(每个细胞大约100pg)。这将加倍每个细胞分裂时需要的能量输入。尽管如此，发现大比例的克隆以非常高的水平表达异源蛋白质而不干扰它们的自身代谢，因为它们没有显著减慢细胞分裂(图1G)。

重复转染之后转基因的共整合

发现重复转染之后驱动高表达的重要参数是转染之间的时间间隔。当两个转染表现为两个独立的和因此附加的事件时，当两周之后再转染细胞时未观察到表达的协同效应(图1C)。这提示每个转染的DNA可必须相互作用为细胞核内染色体外的附加体并可在整合进细胞基因组之前形成混合的多联体。这通过来自稳定的多克隆群体的中期染色体伸展的荧光原位杂交(FISH)分析来评价。将用或不用MAR元件转染一次的80个独立的中期细胞与由没有MAR的GFP质粒组成的探针杂交。观察到单个整合位点，但从用MAR转染的细胞观察到较高的荧光强度(图1D和E)。荧光强度由双重转染过程进一步增加，提示较高数目的转基因拷贝已整合。记录单个和两个连续转染之后所有情况下的独特的整合位点。然而，当几乎没有染色体外的附加型DNA应从第一转染保留时，在以一周间隔转染两次的细胞的大约一半细胞中观察到双重整合事件。这表明如果第二转染进行之前来自第一转染的DNA整合已被完成，那么独立的整合事件可发生。双重转染不导致可检测到的染色体重排，它们也没有可检测地导致在优选染色体基因座的插入，因为没有分析的细胞都不具有相同的整合位点。因此，两个转染之后的转基因整合似乎不被靶向至任何特异的染色体或染色体位点，如早期对含有MAR质粒的单一转染的报道(Girod et al.2007)。

高转基因表达和细胞周期的相和转染

因为转染之间的时间选择(时机)似乎在高的转基因表达中起作用，所以分析转染之间时间间隔的系统变异的作用。在模型细胞中，当第一转染之后21小时进行第二转染时，观察到最高的GFP表达水平，与单一转染相比，产生荧光的连贯地5倍增加。

图2描述如何确定连续转染之间的最佳时间选择。图2(A)显示稳定的多克隆群体由单一转染(减号)或被标明的时间间隔分开的MAR-GFP表达质粒的两个连续转染产生。选择两周之后，测定全部多克隆群体的平均GFP表达。将荧光水平标准化到获得的最大值并显示为超过从单一转染获得的表达的成倍增加，其中(n)对应于独立转染数。星号表示GFP表达的显著性差异(斯氏t检验，P＜0.05)。图2(B)显示细胞周期进展的分析。在第一和第二转染时，收获CHO细胞并用碘化丙啶染色和通过细胞荧光测定术分析荧光。相对的碘化丙啶(PI)荧光分布代表每个细胞的基因组DNA的量。与每个细胞周期状态(G1、S、G2/M)相关的群体百分比如所显示的。

结果显示当第二转染进行18h、24h和27h之后，获得相对于单一转染的3至3.5倍表达的增加。然而，该增加较21h之后获得的增加显著低(图2A)。因为细胞传代之后该时期接近细胞分裂周期的持续时间(图2C和D)，这提示连续转染之后高转基因表达可与细胞分裂周期的特定时期相关联。

沿着分裂周期的细胞分布通过DNA的碘化丙啶染色来测定。该分析显示细胞传代之后18h G1期细胞的过度表示，并发现这对应于从单一转染产生最高表达的时机(图2B，数据未显示)，和图2C和D，其通过细胞分裂周期显示细胞培养进展。图2(C)代表细胞周期进展的时间曲线。每两个小时收获CHO DG44细胞用于细胞周期分析，从细胞传代之后18小时开始，这对应于第一转染的最佳时机。在获得10’000个细胞的荧光水平之前，将细胞固定并用碘化丙啶染色DNA。图2(D)显示细胞周期持续时间的测定结果。传代细胞之后每两个小时测定G1期细胞的百分比。括弧显示两个最大值之间的时机，其被取作一个周期持续时间(14个小时)。由于在t＝0细胞传代，延长的18h的第一周期被扰乱，该延迟归因于细胞附着到培养皿表面和继续细胞分裂周期进展需要的4个额外小时)。G1细胞的相似模式和过度表示在第一转染之后21h获得，这再次对应于第二转染之后产生最高表达水平的时机。如果表达确实与细胞周期定相联系，那么当第二转染在对应于两个细胞分裂的间期进行时，应观察到转基因表达的另一个最适条件。42小时之后，两个转染的协同效应丧失，因为表达与一个转染获得的表达相似。然而，48小时之后观察到转基因表达的第二——虽然较低——协同作用的增加。从在18h的第一转染观察到的较高水平的表达和对于以21或48h间期进行的第二转染的较高水平的表达意味最佳DNA转移和/或表达可发生在特定的细胞分裂阶段。

MAR和连续转染对细胞DNA摄取的影响

FISH分析提示，连续转染之后提高的表达可部分地来自基因组中较高转基因拷贝数的整合(图1D)。一天间期的连续转染可导致细胞核中质粒附加体浓度的增加，因此增加转基因整合进细胞基因组的概率。为了评价每个转染时进入细胞核的转基因的量，分别进行瞬时单一和双重转染，之后是从第二转染之后1或2天分离的细胞核提取质粒和通过实时定量PCR(qPCR)定量转基因。

图3显示连续转染之后DNA转运、整合和表达。图3(A)显示用GFP或具有或没有MAR的DsRed(“RED”)质粒的单一和双重瞬时转染期间转运进细胞核的GFP转基因的量。MAR-GFP+MAR-RED对应于双重转染，其中在第一转染期间MAR-GFP被转移，而MAR-RED在第二转染中使用。分别在单一或第二转染之后分离细胞核和提取总DNA，转运进细胞核的GFP转基因数通过qPCR定量。将结果标准化到参考CHO细胞基因组GAPDH基因的结果，结果代表4个独立转染的平均值。图3(B)显示MAR和连续转染对整合的GFP转基因拷贝数的影响。稳定的多克隆细胞库的3周选择之后，将全部基因组-整合转基因DNA从先前描述的GFP-表达细胞中提取，将DNA如针对A一样定量。图3(C)显示MAR和连续转染对GFP表达的影响。B中分析的稳定细胞库的GFP荧光水平通过细胞荧光测定术来测定。

图3(D)和(E)显示单克隆细胞群体中平均GFP荧光和转基因拷贝数之间的关系。

在图3(D)中，将用GFP、MAR-GFP转染或用MAR-GFP转染两次的不同的稳定细胞克隆的平均GFP荧光水平显示为每个基因组它们的转基因拷贝数的函数，如通过qPCR所测定的。

在图3(E)中，被标准化到转基因拷贝数的GFP荧光水平之间的关系被表示为每个基因组整合的转基因拷贝数的函数。计算的回归曲线由虚线表示，R²表示相关系数。

结果显示用MAR-GFP双重转染的细胞显示它们的细胞核中GFP转基因拷贝较用MAR-GFP只转染一次的细胞多3.8倍(图3A)。当比较用这些不同质粒转染的表达GFP或DsRed(“RED”)的细胞时，观察到由MAR-GFP的第二转染产生的核递送较从该质粒的单一转染观察到的核递送高4.2倍。然而，第一转染的GFP质粒的核转运没有通过进行第二转染而显著地增加。得出这样的结论，来自第二转染的DNA到细胞核的转运通过进行先前的第一转染而得到支持。

这些结论通过DNA转运的共焦成像而被加强，其中将用于第一转染的质粒用罗丹明标记，而将第二转染的质粒用Cy5标记(分别为深色(小点)和白色(小点)的标记，图4A)。特别地，图4描述转染的DNA的亚细胞分布。图4(A)显示DNA细胞内运输的共焦显微镜检查分析。如所表示的，利用荷载或没荷载用罗丹明和Cy5荧光团标记的MAR的质粒，在CHO细胞中进行瞬时单一或双重转染。转染后3h、6h、21h，将转染的细胞固定并用DAPI染色(大的深色区点)。表达GFP的细胞在图片上呈现为大的亮的分布区点。图4(B)显示亚细胞质粒DNA分布的定量，其在针对A进行的共聚焦激光显微镜上进行，除了将内体/溶酶体区室用LysoTracker Red DND-99染色。来自罗丹明或Cy5荧光的簇的像素区用于估计大约120细胞中质粒DNA的量。

用或没用MAR的第一转染之后在细胞核中观察到相似数量的罗丹明标记的质粒簇，如通过qPCR评价的，这与缺少MAR对DNA转运的影响充分相关(图3A和4A)。两个转染之后在基本上所有细胞中观察到核质粒簇。然而只有很少数的细胞表达GFP，这与先前的观察结果一致：只有少量细胞能表达瞬时转染的基因(Akita et al.2007)。

转染的质粒DNA在CHO细胞中的转运——其已知包括细胞摄取、溶酶体逃逸和核输入——受内体/溶酶体降解的限制(Akita et al.2007)。因此，内体/溶酶体和核区室的特异染色以将它们与细胞溶胶区分之后，转染的质粒DNA的细胞内运输通过定量每个转染之后它在细胞器和细胞溶胶中的分布来评价。概述在图4B中的结果显示第一转染之后21h具有或没有MAR的质粒DNA的相似亚细胞分布，尽管在较早的时间点含有MAR的质粒的核转运似乎有些快。进行缺乏MAR的质粒的第二转染没有产生提高的核转运。然而，荷载MAR元件的质粒逃脱溶酶体截留并更有效地进入细胞核，因为与缺乏MAR的质粒的小于40％相比，第二转染之后21h在存在MAR时，全部Cy5-标记的pDNA的80％位于细胞核。更确切地说，大部分缺乏MAR的质粒在溶酶体/内体区室中终止，如也针对第一转染所发现的。MAR和重复基因转移对溶酶体逃逸的协同效应的意外发现因此为分离的细胞核中增加的附加体浓度提供解释(图3A和4B)。该现象可部分由第一转染的DNA进行的细胞降解区室的饱和产生的，因此允许第二转染的质粒保持在细胞质中，在细胞质中MAR可促进转运进细胞核。

MAR元件增加基因组整合的转基因拷贝数

接下来，检测是否由MAR和连续转染引起的增加的质粒DNA转运可增加转基因整合进CHO细胞基因组。如针对图1，选择稳定的多克隆细胞群体，利用qPCR在全部细胞DNA上测定每个基因组的稳定整合的GFP转基因拷贝平均数。转染的质粒中MAR元件的包含显著增加稳定细胞库的基因组中整合的转基因数(图3B)。由于单一转染之后MAR不起作用来增加核转运(图3A)，这意味着MAR可增加质粒本身的基因组整合。该发现证实先前的提议——MARs的使用增加在受体细胞基因组中整合的转基因拷贝数(Girod et al.2005，Kim et al.2004)。

连续转染还介导质粒整合4倍增加，其与在同瞬时转染中记录的游离细胞外附加体增加相当(图3A和3B)。可估计，当缺乏MAR转染一次时，平均起来48个GFP质粒拷贝已整合，而从用MAR的一个或两个连续转染分别获得平均大约163个拷贝和676个拷贝。总的来说，当与MAR驱动的质粒整合增加组合时，由MAR和连续转染协同地引起的增加的核转运产生转基因拷贝数大于10倍的增加。如从先前观察到的MAR的抗沉默效应所期望的，这还产生转基因表达甚至更高的增加(超过15倍，图3C)(Galbete et al.2009)。

当评价从多克隆群体分离的单个细胞克隆中的GFP表达和转基因拷贝数时，在转基因表达和拷贝数之间发现良好的总相关性(图3D)。这表示，转基因拷贝数是含有MAR的质粒的双重转染之后增加的表达的主要驱动者。另外，从含有MAR的克隆——具有共整合的非常高的转基因拷贝和MARs数目——没有检测到表达的显著降低(图3E)。因此，得出结论，MAR能阻止可由共整合的质粒的重复性质和/或反义转录——可归于该MAR元件有效力的抗沉默性质的效应——产生的抑制效应(Galbete et al.2009)。然而，平均的表达水平不总是与拷贝数完全匹配，如在用dsRED载体的共转染实验中，当分析单个细胞克隆时，或当比较来自第一或第二转染的DNA的GFP表达时所记录的(图3B和3C)。这得出这样的结论：含有MAR的质粒的两次转染之后观察到的增加的转基因表达可部分由提高的核输入和基因组整合和因此转基因拷贝数——沉默的缺少——来解释，以及由每个转基因拷贝的较高转基因表达来解释，但是取决于转染史和条件，其它的效应也可影响转基因表达。

DNA同源性对质粒整合和表达的影响

由于从含有MAR的质粒的连续转染观察到的高GFP荧光部分是由在单个染色体基因座的增加的转基因整合产生，所以评价该效应的分子基础。例如，第一转染期间含有MAR的质粒的整合可促进第二转染期间在相同基因组基因座的第二整合，如可从MAR保持染色质在可达状态和因此提供用于同源重组的适当的靶的能力所预期的。可选地，从连续转染观察到的高的整合的转基因拷贝数可由两个转染期间导入的质粒更有效的连环化而产生，其可由细胞核中高浓度的染色体外附加体介导。人们提出同源重组介导转染的质粒的大的多联体的形成(Folger et al.1985)，其可导致用基因组DNA重组之后多个质粒拷贝的共整合。在后者的模型中，同源重组可发生在第一和第二转染期间使用的质粒上的相似的质粒序列，因此转基因整合和表达的效能将取决于DNA序列同源性。

该后者的概率首先由通过用转基因(GFP或DsRed)、质粒主链(氨卡青霉素或卡那霉素细菌抗性)和/或MARs(鸡溶菌酶MAR或人类MAR 1-68)的不同组合进行连续转染而分析质粒同源性对转基因表达的影响来评价。

图5显示MAR、质粒同源性和同源重组如何介导高转基因表达。对于图5(A)，稳定的多克隆细胞库通过荷载不同转基因(GFP或DsRed(“RED”))、MAR(针对人类1-68的MAR₁或针对鸡溶菌酶MAR的MAR2)、和/或细菌抗性基因(氨卡青霉素或卡那霉素)的质粒的转染而产生，四个独立转染的相对平均的GFP荧光被显示为超过从一个没有MAR的转染获得的荧光的成倍增加。星号显示GFP表达的显著性差异(斯氏t检验，P＜0.05)。对于图5(B)，用GFP或MAR1-68GFP质粒的稳定转染在亲代CHO细胞系(AA8)和缺乏同源重组(51D1)或非同源末端连接(V3.3)途径的突变体中进行。将从单一((B)的上图)或两个连续((B)的下图)转染产生的每个稳定的多克隆细胞库的平均GFP荧光标准化到从用缺乏MAR的质粒单一转染的AA8细胞获得的荧光。星号表示GFP表达的显著性差异(斯氏t检验，P＜0.05)。从51D1细胞的双重转染未获得稳定转染的细胞。

结果显示不同的MARs、转基因、或细菌抗性的转染都降低连续转染通常观察到的高表达(图5A)。当利用不同的MARs、转基因和载体元件(MAR₁-GFP+MAR₂-RED构建物)时，双重转染效应几乎被完全消除，这提示需要质粒同源性来从连续转染获得高表达。

在被称作同源重组修复(HRR，ADD REF)的过程中，同源重组常常被引出为双链断裂的DNA修复机制。因此，检测是否转染之前质粒线性化介导从连续转染获得的高表达。

图4(C)显示DNA构象对基因转移和表达的影响。为了比较用线性或环形质粒进行的单一或连续转染之后的转基因表达水平，使用相同等摩尔量的GFP和MAR-GFP环形DNA或PvuI-消化的质粒用于转染。两周选择之后，稳定转染的细胞群体的eGFP荧光通过细胞荧光测定术来分析。曲线显示GFP荧光水平较用缺乏MAR的质粒转染一次的对照细胞的荧光水平成倍增加。用线性或环形质粒获得的荧光值分别以黑色或淡灰色显示。星号表示GFP表达的显著性差异中的一些(斯氏t检验，P＜0.05)。

用环形质粒还观察到超过转基因表达的累加的增加，然而，全部表达较利用线性质粒获得的表达低(图4C)，这与同源重组过程中线性DNA的增加的重组基因性质一致(Wong et al.1986)。

同源重组介导增加的表达

需要质粒同源性和双链断裂以在双重转染之后达到较高的表达水平意味着可能涉及同源重组。转基因被提出以利用称作非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)的两个拮抗途径家族而整合进细胞基因组。这些途径在细胞周期的特定期期间更活跃，如HR所示例的，HR用于在细胞周期的S期和G2/M期的DNA复制期间或之后修复DNA损伤(Takata et al.1998)。缺少典型的NHEJ基因的细胞显示偏向支持HR的双链断裂(DSB)修复，这提示这两个主要途径通常竞争以修复这些DNA损害(Delacoteet al.2002)。因此，激活HR的一个方法是抑制或在遗传上灭活NHEJ，如在酵母和哺乳动物细胞中所看到的(Delacote et al.2002，Clikeman et al.2001，Allen et al.2002，Pierce et al.2001)。在由MAR和/或连续转染产生的增加的基因表达中，因此利用在任何一个途径的关键组分突变的CHO细胞系直接评价HR相关机制的可能含义，该细胞系因此只对HR或NHEJ是感受态的。

51D1CHO突变体衍生物缺少RAD51链转移酶并因此缺少同源重组，而V3.3CHO细胞缺少对启动NHEJ途径起重要作用的依赖DNA的蛋白激酶DNA-PK的催化活性(Jackson 1997，Hinz et al.2006，Jeggo 1997)。与没有MAR的稳定转染的细胞相比，全部GFP荧光的3倍增加由野生型亲代细胞系(AA8)的多克隆群体中的MAR介导(图5B)。然而，在抗生素抗性选择之后几乎没有稳定转染的克隆在51D1细胞系中存活，且GFP表达保持非常低。相比之下，在缺少NHEJ的细胞中观察到加重的MAR驱动的转基因表达活化，导致当与用没有MAR的GFP表达载体转染一次的细胞相比时转基因表达超过6倍的增加。

针对连续转染记录到相似的趋势，因为与亲代AA8细胞相比，来自V3.3细胞的GFP表达被MAR的存在和连续转染增加(图5B，注意上部和下部的图的不同比例)。总的来说，当与亲代细胞中对照质粒的单一转染相比时，从用MAR对缺少NHEJ的V3.3细胞的两个连续转染获得转基因表达的35倍增加。相比之下，NHEJ途径的灭活对缺乏MAR的质粒的表达几乎没有影响，这显示MAR和高HR活性的存在均是获得高转基因表达所必需的。一致地，HR缺乏的细胞产生低表达水平——在单一转染中MAR较小的作用，而从双重转染没有获得抗生素抗性的克隆。

这些结果阐明HR途径在连续的基因转移过程中使用的两个选择基因的整合和保持中的重要性。

图5(C)至(E)显示由用MAR的重复转染所得的一个提高的表达的模型。

如在图5(C)和(D)中显示的图中所看到的，质粒增加的进入和基因组整合进细胞核部分地解释转基因表达的指数性增加，该增加由MAR元件和双重转染过程产生。第一转染之后，MAR的存在可增加转染的质粒之间的同源重组频率，允许较大串联结构的形成和更多质粒拷贝的整合。此外，MAR可招募蛋白质以朝着开放状态重塑染色质结构。如可在图5(E)中所看到的，作为第一转染的结果和细胞降解区室可能饱和的结果，第二转染的质粒可被更有效地转运到细胞核。MAR元件可起作用以象以前一样促进重组，允许来自两个转染的同源质粒的更好的连环化。细胞周期状态也是获得最佳蛋白质表达的参数。通过当细胞处于G1期时进行转染，质粒可在更有利于同源重组的细胞周期的较晚期(例如S或G2/M)中到达细胞核，进一步有助于较大质粒多联体的形成和染色体整合。

蛋白质分泌

低和高生产者CHO克隆产生的重组IgG的鉴定

首先，我们研究可影响通过显示高或低Mab产生水平的CHO细胞克隆进行的IgG重链和轻链的表达和分泌的瓶颈或缺点。

产生表达不同的重组IgGs的CHO-K1S的各种克隆。

图6描述由高和低重组IgG-生产者CHO克隆表达的免疫球蛋白的重链和轻链的表征。

图6(A)显示利用抗人类IgG抗体的细胞内(细胞裂解物)和分泌的IgG(培养基)的蛋白质印迹。将高(HP)和低(LP)IgG-生产者CHO-K1-S进行总细胞提取并在LaemmliSDS-PAGE 8％上分析。免疫球蛋白重链和轻链在图中分别被标记为HC和LC。图6(B)描述TX-100溶解度分析。将细胞在含有1％Triton X100的PBS中裂解。以10.000×g离心10分钟之后，将含有Tx可溶性蛋白质的上清液和含有Tx不溶解性蛋白质的沉淀物在还原和非还原性SDS-PAGE 8％下分解。图6(C)描述IgG的折叠和分泌动力学的基于放线酮的追踪分析。将高(HP)和低(LP)IgG-生产者CHO-K1S克隆在存在100μM放线酮的情况下培养。在各个时间点，收获细胞并在含有1％TX-100的缓冲液中裂解。然后将Tx溶解的和不溶解的部分在非还原性SDS-PAGE 4-10％上解析。免疫球蛋白的游离的、二聚体和装配中间体复合体被分别标记为游离的HC或游离的LC；(LC)₂和(HC)₂；HC-LC和IgG。箭号表示适当加工的结构，而箭头表示异常结构。

如从图6可看出的，培养物上清中的Mab滴度根据过量表达的Mab蛋白而高度可变。然而，结果是高度可重现的，一些Mabs一致地产生低产生细胞克隆，而其它的一致地产生高产生细胞克隆。然而，表达水平与用于转染的质粒构建不相关，并且它不依赖使用的信号序列，其对所有Mabs实际上是相同的(数据未显示)。

分析每个克隆表达的细胞内重链和轻链(HC和LC)以找到不同克隆的多肽生物合成和IgG分泌水平之间的相关性。将CHO-K1S克隆在稳态产生的总细胞提取物和分泌的IgG免疫沉淀物在还原条件下通过SDS-PAGE解析。蛋白质迁移曲线分别显示高IgG-生产者克隆12B、16D和S29的HC和LC的预期的50kDa和25kDa带。然而，低IgG-生产者C24和C58表达的轻链以异常高的表观分子量迁移(图6A)。当分析分泌的蛋白质时记录到同样的异常行为。在细胞提取物和分泌的IgG上进行的PNGase F介导的去糖基化实验没有改变LC迁移率，显示低生产者的LC的慢的电泳迁移不是由于加入聚糖部分(数据未显示)。

为了评价异常LC的生物化学性质，我们在含有1％triton X-100(Tx)的PBS溶液中提取了细胞内HC和LC内容物和通过以10.000×g离心10分钟而从Tx不溶解的蛋白质中分离Tx溶解性蛋白质。在含有SDS的添加尿素9M的Laemmli’s缓冲液中完全的蛋白质溶解之后，通过还原性SDS-PAGE解析这些部分。如期望的只检测高IgG-生产者克隆的LC和HC的Tx溶解性部分(Fig 6(B)；S29泳道)。然而，C24和C58低生产者的LC的重要部分不能通过Tx处理而溶解，表明细胞内沉淀和潜在的多肽交联。令人惊奇的是，该LC的Tx不溶解的部分不能在非还原条件下解析，因为它保留在积层胶(stacking gel)中，这表明高分子量聚集物和二硫键的形成。这些数据提示LC折叠或装配过程的缺乏导致它以Tx抵抗的形式的聚集。

然后进行基于放线酮的追踪测定以研究IgG折叠和装配动力学以及IgG聚集物在CHO细胞克隆中的命运。高生产者克隆在非还原条件下的SDS-PAGE分析显示游离的LC种类的积累和HC和LC二聚体的形成。含有HC的种类似乎渐进地降低，伴随地掺入HC-LC复合体和在完成的IgG四聚体中(图6C)。相比之下，只在低IgG-生产者的聚集形式内检测到LC(图1C，Tx-100不溶解的图)或将LC掺入装配的中间体复合体如HC-LC和在完成的IgG中(图6C：Tx-100溶解的图)。有意思的是，去污剂不溶解性LC形式的量随着时间保持恒定并因此不参与IgG折叠过程(图6C：Tx-100不溶解的图，Agr-LC)。这证明LC聚集物不胜任任何进一步的折叠和装配过程。

这些结果引起以下假设：(1)通过大的生物合成和H-和LC的积累，高IgG-生产者的ER折叠结构和分泌能力接近饱和，但是细胞可仍然进行正常地构成的Mab的装配；(2)低IgG-生产者产生的不胜任装配的LC聚集物的积累解释这些克隆的分泌缺陷；和(3)LC信号肽切割的潜在缺乏和伴随的低IgG生产者中的LC的聚集，其可表示在ER中多肽的共翻译易位的缺乏。

为了评价低生产者克隆中ER潜在的功能失常，研究了ER蛋白质折叠和应激反应的不同传感器的表达。超过ER折叠能力的重组蛋白的过量表达已被显示触发一组细胞反应——被共同地称作解折叠的蛋白质反应(UPR)。虽然这些细胞机制可起作用以提高ER折叠能力、降低ER应激和恢复ER功能性，但是它们还可降低重组蛋白的产量(Khan SU et al，2008；Kang S-W et al，2006)。例如，UPR之后ERAD(ER相关的降解)基因表达的活化可使解折叠或错误装配的ER-保留的重组蛋白靶向到降解途径。而且，严重的ER应激的情况下，不能适应它们的蛋白质分泌结构的细胞可触发凋亡途径。

为了评价是否重组免疫球蛋白链的LC错误加工和/或过量表达可诱导ER应激和/或UPR，将低和高生产者克隆培养7天并在培养操作的各个时间进行分析。

图7显示高和低IgG-生产者的ER折叠和UPR结构的鉴定。将高(HP)、低(LP)IgG-生产者克隆和亲代细胞在分批培养中培养。在各个时间点，培养的0、3、5和7天，收获细胞。然后利用抗BiP抗体(上面的图)和抗CHOP抗体(中间的图)通过蛋白质印迹法分析细胞提取物。蛋白质加样对照通过GAPDH含量来估计(底部的图)。CHOP前体和活性形式分别用星号和箭头表示。

蛋白质印迹显示在两个低生产者克隆中增加的BiP表达——UPR活化的岗哨标志。相反，对于高生产者克隆没有检测到BiP水平的增加(图7)。这些结果提示，表达错误加工LC的低生产者克隆触发BiP过量表达介导的ER应激反应。相反，高生产者克隆表达的低水平的BiP蛋白提示，这些细胞可处理和分泌非常高水平的重组IgG而无需活化UPR级联。

还分析CHOP促凋亡转录因子的表达水平，当蛋白质折叠瓶颈或错误折叠不能由UPR解决时，CHOP促凋亡转录因子的表达可被诱导。当与不表达Mab的对照细胞相比时，低和高IgG-生产者CHO克隆显示CHOP蛋白的过量表达(图7)。有意思的是，CHOP蛋白在两个低生产者克隆中渐进地积累直到培养的第5天，而细胞CHOP水平和促凋亡途径在高生产者克隆中似乎被组成性地引出。

这些观察结果暗示，BiP介导的低生产者克隆的UPR反应导致UPR的末期和导致凋亡的细胞死亡程序的激活。相反，高生产者克隆不触发BiP介导的UPR反应，尽管CHOP介导的促凋亡反应这些克隆中被诱导。这提示，重组Mab的异常和巨大的过量表达可能已启动独立于主要的ER应激传感器BiP的细胞死亡程序。

还可显示，不同的IgG-生产者克隆显示重组IgG蛋白的各种折叠和加工状态，在它们的表达和分泌期间宿主细胞的不同的细胞和分子反应被诱导。因此，这些各种低和高生产者克隆均可面对可消极地影响容易或难以表达的重组蛋白的工业生产的局限性。我们因此继续利用这些高和低IgG-生产者CHO克隆作为细胞模型来鉴定新的方法以利用生物工程方法提高重组IgG产生。

纠正蛋白质加工和拯救有效的分泌的策略

低生产者克隆中LC溶解性的缺乏和它缓慢的迁移率提示肽信号的存在，并且它争辩支持LC前蛋白的无效的靶向和/或错误加工至ER区室。因此，可能重组IgG的IgG轻链的信号肽错误加工和聚集可由不适当的靶向和/或易位进ER产生。最近的研究提示，将要表达ER应激相关的蛋白质如BiP的宿主细胞系的生物工程可提高异源蛋白质的分泌(Peng and M.Fussenegger，2009)。然而，这不是可能在我们的情况下成功的选择，因为发现ER应激蛋白BiP在低生产者克隆中已经被自发地上调。

通过蛋白质易位结构组分的过量表达而提高蛋白质分泌的尝试还未在哺乳动物细胞系中被成功满足。例如，超过正常水平的SR14表达没有提高来自培养的人类细胞的分泌效率(Lakkaraju et al.，2008)。

不考虑这些结果，进行了尝试以通过表达信号识别颗粒(SRP)蛋白或与信号识别颗粒(SRP)相关的蛋白质来增加蛋白质分泌，信号识别颗粒是结合亲和性信号肽和介导SRP-RNA-核糖体复合体停靠到ER膜上的多蛋白-RNA复合体。具体地，(1)人类SRP14亚基，(2)参与细胞凋亡调节的FADD(FAS相关的死亡结构域)蛋白的显性负性突变体被表达，以及(3)不相关的GFP蛋白作为对照。

利用两个克隆细胞系，一个表达低产量的单克隆抗体(例如英夫利昔单抗(infliximab)——一个难以表达的蛋白质)和一个表达高产量MAb(例如曲妥珠单抗——一个容易表达的蛋白质)——包含相同信号肽，通过电穿孔(MICROPORATOR，1250V，20ms脉冲时间和3个脉冲)用5μg编码指示的蛋白质的质粒再转染5.1×10⁵细胞。致微孔(Microporation)之后，将细胞加入到添加8mM谷氨酰胺和2×HT的SFM4CHO培养基(HYCLONE)中。两天之后，以选择标记的适当稀释(300μg/ml G418)将细胞转移到T75平板中，并将细胞进一步培养。大约两周之后，抗药细胞在摇瓶中扩大，将SRP14-表达群体稀释用于有限稀释过程中的单细胞克隆化。以下显示的结果用表达指示的蛋白质的细胞克隆产生的。

通过SRP14表达的Mab产生的增加

首先，测定细胞内HC和LC的Tx溶解性和表达SRP相关蛋白质的高和低IgG-生产者克隆的分泌水平。

图8显示，产生重组IgG的CHO克隆的SRP14转染消除轻链聚集并拯救IgG分泌。用为各种对照或候选者蛋白——期望拯救重组IgG的正确加工和分泌——编码的cDNA构建物转染两个不同的CHO克隆——产生高(F9)和低(A37)重组IgG的CHO克隆(A：GFP；G：SRP14；H：FADD-DN)。

在图8(A)中将共表达蛋白质A、G或H的低和高生产者CHO克隆的细胞提取物的TX-100-溶解的和不溶解的部分在4％-10％梯度SDS-PAGE上分析，并通过化学发光来检测IgG蛋白。浅色箭头显示低IgG生产的游离的和未加工的LC(浅色箭头)和未加工的聚集的LC。G或H蛋白的转染之后，低IgG生产者克隆生产的游离的和适当加工的LC用黑色箭头标记。

图8(B)显示用SRP14表达载体转染之前(-)和之后(G)F9和A37克隆的比生产率分布，如从在细胞培养基上清液上进行的分泌性Mabs的ELISA测定所评价的。

有意思的是，蛋白质印迹分析显示全长人类SRP14(基因库登录号X73459.1，其以其全部通过引用被并入本文)的过量表达导致促LC转化成象胜任折叠和与HC装配的正常LC成熟形式迁移的种类，而HC的迁移不受影响(图8A，上图的泳道G，参见箭头)。更引人侧目地，SRP14过量表达完全消除TX不溶解的部分中的LC聚集(图8A，下图)。对照GFP蛋白的表达没有提高蛋白质的溶解性，也没有恢复LC的正确加工(图8A，泳道A)。SRP14的表达对从高生产者克隆获得的HC和LC迁移模式没有影响，但是与对照相比游离的HC和LC的量和完全装配的IgG的量有点增加(图8A，FP-F9克隆，泳道G)。

为了测定SRP14的外源性表达对重组IgG滴度的影响，然后通过ELISA分析上清液细胞培养物以对适当装配的Mab进行探测。低IgG-生产者中SRP14的过量表达导致来自低生产者克隆的IgG分泌的显著增加(图3B)。从低生产者细胞(LP-G群体)分离的克隆显示比生产率(Qp)平均7倍增加。而且，SRP14的外源性表达的确还提高HP克隆的分泌，因为可观察到Qp 30％的增加(HP-G克隆)。有意思的是，分离单个的克隆，该克隆对于难以和容易表达Mab可以以相同水平表达IgG(＞40pcd)，这提示易位中随后的步骤变得速度受限。

外源性SRP14表达的作用是意想不到的。假定该亚基在延伸停滞中的功能由SRP介导的，该表达在难以产生的IgG生产者克隆中可能已经引起LC延伸的延长的延迟。低生产者克隆的Mabs的适当加工可需要意想不到地长的翻译中止，可能因为介导这些特定IgGs易位到ER上的复合体的停靠动力学可以较其它分泌性蛋白质低。外源的SRP14组分进行的翻译动力学的调节作为结果可影响ER中促LC的共易位和因此恢复信号肽的有效加工。

另一个对照蛋白——即具有死亡结构域的FAS相关的蛋白(FADD)——的作用还通过表达FADD的显性负性突变体(FADD-DN)来评价(Newton，Harris et al.1998)。出乎意料地，还发现FADD-DN的过量表达消除LC聚集，如对于SRP14所发现的(图8A，下图，泳道H)。这不是期望的，因为已知FADD与通过形成诱导死亡的信号传导复合物(DISC)而在细胞中诱导凋亡的死亡受体(DR)蛋白家族相关联。细胞质定位的FADD的主要生理作用因此是触发细胞死亡，并因此进行了尝试以灭活FADD以阻止CHO细胞凋亡。然而，依赖修饰和亚细胞定位，最近的工作已将多个非凋亡活性归因于FADD。例如，FADD磷酸化和核进入调节基因表达和活化细胞周期和有丝分裂的进展(Tourneur and Chiocchia 2010)。此外，被称作RTN3的ER结合的蛋白可将FADD招募到ER膜，并且FADD自身可通过非典型的基于微泡的途径来分泌。然而，到目前为止，通过ER的蛋白质分泌调节中还未牵涉FADD。我们的发现因此可显示在提高过量表达的Mabs的加工的背景中FADD的新功能。可选地，FADD-DN的表达可已经使翻译结构饱和，以某种方式减慢该过程和允许适当的靶向ER。然而，均未发现FADD-DN和GFP过量表达显著恢复高水平的IgG分泌。因此，只有SRP14的外源性表达能恢复Mab产生。因此，假设SRP-复合体功能的调节对ER腔易位子配偶体的募集和/或对新合成的(neosynthetized)LC与ER折叠蛋白伴侣的相互作用可以是特别需要的。非常高的Mab分泌水平保持超过6个月，这表示它是SRP14-表达细胞的稳定的性质。在补料分批培养中，每升培养基获得超过8克的Mab，这是我们从未获得的无需用于该难以表达的蛋白质的SRP14表达的大滴度。

SRP14的表达之后获得的好的结果推动可有助于ER中新生多肽适当易位的其它蛋白质作用的测试。还测试信号识别颗粒(SRP)——其是结合亲和性-信号肽和介导SRP-RNA-核糖体复合体停靠到ER膜上的多蛋白质-RNA复合体——的其它蛋白质，或与SRP功能有关的蛋白质。具体地，我们表达(1)人类SRP54亚基，试图增加信号序列识别，(2)人类SRP9和/或SRP14亚基，因为这两个多肽在体内形成复合体，以可能减慢翻译，(3)试图增加易位结构能力的人类SRP受体(SR)亚基α和β，和(4)易位子Sec61人类亚基(Transl)，以可能提高ER中的易位。

图9描述表达SRP9、SRP14、SRP54、SR和易位子的各种组合的CHO细胞库中Mab产生的增加。将低生产者A37克隆用驱动指示的候选者蛋白表达的cDNA构建物进行转染。通过ELISA分析培养物上清液，并测定Mab分泌的滴度。

如可从图所看出的，SRP14或SRP54的表达导致Mab分泌的强有力的增加，而SR和Transl导致分泌的较小但仍然显著的增加，而单独SRP9没有显著增加表达(图9，数据未显示)。还测试这些蛋白质的组合。通过SRP14和/或54的表达(SRP9+SRP14+SRP54泳道)，SRP9完全消除积极的作用，这指示不是任何SRP蛋白的简单表达导致提高的分泌。SR表达适当地增加SRP14和Transl单独介导的作用，然而它强烈地增加存在SRP 9、14和54(比较SRP9+SRP14+SRP54泳道和SRP9+SRP14+SRP54+SR泳道)时获得的分泌。然而，当过量表达Transl加上SRP14和SR(SRP14+SR+Transl对SRP14+SR)时获得分泌的最高的增加。SRP14、SRP54、SR和Transl的其它组合也将有助于提高蛋白质分泌对本领域技术人员来说将是显而易见的，并且所有这样的组合因此包括在本发明中。

材料和方法

I.转基因整合和表达

质粒和构建物

pGEGFP对照含有SV40早期启动子、增强子和来自驱动来自pEGFP-N1(CLONTECH)eGFP基因表达的pGL3(PROMEGA)的载体骨架。pPAG01SV40EGFP由pGEGFP对照的SV40早期启动子的鸡溶菌酶MAR片段上游的插入产生(Girod etal.2005)。利用DNA结构性质通过SMARScan程序鉴定人类MAR 1-68。它在pBluescript中从人类细菌人工染色体被克隆，然后插入到SV40早期启动子上游的pGEGFP对照，导致p1-68(NcoI filled)SV40EGFP质粒(Girod et al.2007)。

在CMV启动子(包括增强子)的控制下，从pGL3-basic(PROMEGA)中的pCMV-DsRed(CLONTECH)，通过插入DsRed基因而建立pGL3-CMV-DsRed。然后通过用BspHI消化两个质粒交换pGL3-CMV-DsRed的氨卡青霉素基因和来自pCMV-DsRed(CLONTECH)的卡那霉素抗性基因来建立pGL3-CMV-DsRed-kan。然后，将鸡溶菌酶或人类1-68MAR插入到pGL3-CMV-DsRed-kan质粒。它们在pGL3-CMV-DsRed-kan CMV启动子的上游，作为含有鸡溶菌酶片段的KpnI/BglII片段，或作为KpnI/BamHI人类1-68MAR片段被插入，分别导致pPAG01GL3-CMV-DsRed和p1-68(NcoI)filledGL3-CMV-DsRed。

细胞培养和转染

将CHO DG44细胞系(Urlaub 1983)在添加HT(GIBCO)和10％胎牛血清(FBS，GIBCO)的DMEM：F12(GIBCO)中培养。亲代CHO细胞AA8、缺乏NHEJ的细胞V3.3和缺乏HR的细胞51D1(Adayapalam et al.，2008)由Dr.Fabrizio Palitti友好提供并在添加10％胎牛血清和抗生素的DMEM：F12培养基中培养。

根据制造厂商的说明书(INVITROGEN)，利用Lipofect-AMINE 2000对这些细胞进行转染。转染(瞬时转染)后一天、两天或三天，利用荧光激活细胞分选仪(FACS)分析GFP或DsRed荧光水平。表达GFP和/或DsRed的CHO-DG44细胞的稳定库通过抗性质粒pSVpuro(CLONTECH)的共转染获得。用针对CHO-DG44(针对AA8、V3.3和51D1，8μg/ml嘌呤霉素)的5μg/ml嘌呤霉素选择两周之后，通过FACS分析细胞。

多重转染如下进行：第一转染之后，如上所述将细胞第二次转染，除了抗性质粒携带另一个抗性基因，pSV2neo(CLONTECH)。除非本文另外指出，将两个转染定时以跟随细胞周期。第二转染之后二十四小时，将细胞传代并用250μg/ml G418和/或2、5μg/ml嘌呤霉素(针对AA8、V3.3和5A1D1，250μg/ml G418和4μg/ml嘌呤霉素)选择。选择3周之后，通过FACS分析GFP和/或DsRed表达。

荧光激活细胞分选

eGFP和DsRed蛋白的瞬时表达在转染之后24h、48h或72h利用FACScalibur流式细胞仪(BECTON DICKINSON)来定量，而抗生素选择至少2周之后测定稳定细胞库的表达。将细胞用PBS洗，在胰蛋白酶-EDTA中收获、集中并在无血清的合成的ProCHO5培养基(CAMBREX公司)中重悬浮。荧光分析在FACScalibur流式细胞仪(BECTON DICKINSON)上获得，对于瞬时表达具有GFP通道(FL-1)上350V和DsRed通道(FL-3)上450V的设定，而FL-1240V和FL-3380V的设定用于分析稳定的表达。对于稳定的转染，获得100’000个事件，对于瞬时转染，获得10’000个事件。利用WinMD软件进行数据处理。

细胞周期分析

用碘化丙啶(PI)染色DNA之后，在指定的时间，通过CHO细胞的流式细胞术分析细胞周期状态。将细胞首先用(PBS)洗、受胰蛋白酶作用(trypsinized)和通过在微量离心机中以1500rpm离心5min而在1ml生长培养基中收获。另外的PBS清洗之后，在涡旋中的搅拌下通过滴加500μl冷的70％乙醇到细胞悬浮液而用乙醇固定之前将细胞重悬浮于1ml PBS中。将样品在-20℃温育30分钟并将细胞如之前一样离心。将得到的细胞沉淀重悬浮于500μl冷的PBS中，补充50μg/ml RNaseA，将DNA在暗处用40μg/ml PI染色30分钟。然后将细胞用PBS洗、离心和在FACScalibur流式细胞仪(FL-3通道；BECTON DICKINSON)中分析之前重悬浮于500μl ProCHO5培养基(CAMBREX公司)。每个样品获取10’000个事件。

荧光原位杂交

如在Derouazi et al.(2006)和Girod et al.(2007)中所描述的，进行FISH(荧光原位杂交)。简言之，中期染色体伸展从用或不用1-68人类MAR转染的细胞获得并用秋水仙素处理。利用通过没有MAR的pSV40GEGFP质粒的直接切口平移制备的杂交探针进行荧光原位杂交。

细胞核和DNA的分离

瞬时转染(或多个)之后一天、两天或三天，从6孔板中生长的增殖和汇合的CHODG44细胞分离细胞核。将1×10⁶细胞用冷的PBS洗两次，重悬浮于2体积的冷缓冲液A(10mM HEPES(pH 7.5)、10mM KCl、1.5mM Mg(OAc)₂、2mM二硫苏糖醇)中并允许在冰上溶胀10min。利用杜恩斯匀浆器使细胞分裂。将匀浆在4℃以2000rpm离心2min。然后将破裂的细胞沉淀物重悬浮于150μl PBS和放置在缓冲液B(30％蔗糖、50mM Tris-HCl(pH 8.3)、5mM MgCl₂、0.1mM EDTA)的垫上，并以1200g离心9min。将细胞核沉淀物重悬浮于200μl缓冲液C(40％甘油、50mM Tris-HCl(pH8.3)、5mM MgCl₂、0.1mM EDTA)并在-80℃冷冻储存直到需要时(Milligan et al.2000)。

利用来自QIAGEN的DNeasy Tissue试剂盒从CHO DG44稳定的细胞库或从分离的细胞核分离总细胞DNA。对于稳定的细胞库，收集在6孔板中生长的1×10⁶个汇合的CHO DG44细胞。根据制造厂商的从培养的动物细胞分离总DNA的说明书进行DNA提取。对于分离的细胞核，在遵照与对于稳定细胞系相同的方案之后开始DNA提取之前，首先将冷冻的细胞核沉淀物解冻并以300g离心5min以去除缓冲液C。

转基因拷贝数测定核定量PCR

为了测定基因组中整合的转基因拷贝数，利用来自EUROGENTEC Inc.的SYBRGreen-Taq聚合酶试剂盒和ABI Prism 7700PCR机器通过定量PCR来分析大约6ng基因组DNA。以下引物用于定量GFP DNA：GFP-For：ACATTATGCCGGACAAAGCC和GFP-Rev：TTGTTTGGTAATGATCAGCAAGTTG，而引物GAPDH-For：CGACCCCTTCAT-TGACCTC和GAPDH-Rev：CTCCACGACATACTCAGCACC用于扩增GAPDH基因。如先前所描述的，计算GFP靶基因拷贝数相对于GAPDH参考基因拷贝数的比(Karlen et al.2007)。为了测定转染之后输入细胞核的转基因，利用与上面相同的GFP和GAPDH引物对，对从纯化的细胞核提取的DNA进行定量PCR。

对于小鼠基因组，估计用作参考的GAPDH基因和假基因拷贝的数目，因为CHO基因组序列还未得到。用通过小鼠基因组上GAPDH引物产生的190bp扩增子的DNA序列的NCBI软件进行的BLAST分析进行比对，这给出了每个单倍体基因组88命中(hits)的数值。因为CHO DG44是近二倍体细胞(Derouazi et al.2006)，所以我们估计176个拷贝GAPDH基因和假基因存在于CHO DG44细胞基因组。该数值用作标准化参考以测定GFP转基因拷贝数。

共焦显微术

将pGEGFP对照和p1-68(NcoI填充的)SV40EGFP质粒根据制造厂商的方案通过Label IT Tracker TH-罗丹明试剂盒用罗丹明标记或通过Label IT Tracker Cy 5试剂盒(MIRUS，MIRUSBIO)用Cy5标记，并通过乙醇沉淀来纯化。对于转染，根据供给者的说明书用Lipofectamine 2000试剂(INVITROGEN)进行DNA转染。在转染之后3、6和21h，去除培养基并将细胞用4％多聚甲醛在室温固定15min。当指示时，在固定之前根据制造厂商的说明书用LysoTracker^TM Red DND-99(分子探针，INVITROGEN)以75nM终浓度将细胞处理30min，以染色酸性的细胞器(例如，内体和溶酶体)。然后将固定的细胞用PBS洗两次并在DAPI/Vectashied溶液中封固以染色细胞核。

利用配备63×NA 1.4平视消色差物镜的CARL ZEISS LSM 510Meta倒置共焦激光扫描显微镜捕获荧光和明视野图像。从盖玻片的底部到细胞的顶部获得Z系列图像。每个8位(bit)TIFF图像被转移到ImageJ软件以定量每个目的区的总亮度和像素面积。对于数据分析，将细胞溶胶s_i(cyt)、细胞核s_i(nuc)和溶酶体s_i(lys)中每个簇的像素面积在每个XY平面分开合计。将这些值(S’_Z＝j(cyt)、S’_Z＝j(nuc)和S’_Z＝j(lys)分别地)通过所有Z系列图像和指示的S(cyt)、S(nuc)和S(lys)分别进一步合计。细胞中标记的pDNA的簇的总像素面积，S(tot)，被计算为S(cyt)、S(nuc)和S(lys)之和。每个区室中的pDNA部分被计算为F(k)＝S(k)/S(tot)，在那里代表每个亚细胞区室(细胞核、细胞溶胶或溶酶体)。

II.转基因表达产物分泌

质粒和构建物

表达载体含有来自Transposon Tn3(AmpR)的细菌β-内酰胺酶基因——给予氨卡青霉素抗性——和细菌ColE1复制起点。作为pGL3对照的衍生物(PROMEGA)，载体的终止子区负载定位于SV40多腺苷酸化信号下游的SV40增强子。人类促胃液素终止子已在SV40多聚腺苷酸信号和SV40增强子之间被插入。每个载体还包括在SV40启动子控制下位于表达盒侧翼的两个人类168SGE和整合的嘌呤霉素抗性基因。所有载体在hGAPDH启动子的控制下编码GOI(图10)。

遵从制造厂商的说明书(ROCHE)利用Pwo SuperYield DNA聚合酶试剂盒、人类通用cDNA作为模板

和CDS的5′和3′末端的特异引物(MICROSYNTHAG，瑞士，参见表1)——5′尾携带用于克隆进表达载体的相容的限制位点，通过PCR来扩大不同克隆的转基因。

将PCR产物和表达载体通过适当的限制性酶(NEW ENGLAND BIOLABS或PROMEGA)消化。将消化的DNA在1％w/v琼脂糖(EUROBIO，CHEMIEBRUNSCHWEIG AG)凝胶上电泳。在不损伤DNA的制备型UV灯下(UL-6L，VILBERLOURMAT)通过可视化将载体带和消化的PCR产物从凝胶切掉，转移到1.5mL微管中，并遵从制造厂商的说明书利用标准技术(WIZARD SV Gel和PCR CleanUpSystem^TM，PROMEGA)纯化。

遵从制造厂商的说明书，利用LigaFast^TM快速DNA连接系统(PROMEGA)将纯化的片段(消化的Selexis^TM表达载体和PCR产物)在10μL的终体积中于RT(＝室温)持续5min连接在一起。遵从制造厂商的说明书，全部连接混合物用于转化50μL感受态DH5α细胞(INVITROGEN)。新建立的质粒的完整性和正确结构通过限制性分析来检查。一个细菌克隆在振动的管中的5mL LB+100μg/mL氨卡青霉素中扩大，用于质粒DNA的大量提取。遵从制造厂商的说明书，利用WIZARD Plus SVMinipreps试剂盒(PROMEGA)来提取质粒。质粒的完整性通过测序GOI和相关的侧翼序列来确认。

确认之后，在添加100μg/mL氨卡青霉素的LB中用标准的DNA分离试剂盒(JETSTAR 2.0，GENOMED)从150mL过夜培养物进行载体的大量制备以获得非常纯的质粒DNA。纯化之后将DNA重悬浮于300μL无菌去离子水中。通过PvuI消化进行线性化，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒(INVITROGEN/分子探针)进行DNA定量。

表1：PCR反应中使用的以扩增不同的目的转基因的引物

CHO细胞的转染和稳定转染子的选择

转染之前一天将CHO细胞以300’000细胞/ml的密度传代。在转染当天，将细胞计数，并通过离心收获510’000个细胞。去除上清液并将细胞沉淀物重悬浮于30ul重悬浮缓冲液(缓冲液R，INVITROGEN)中。将编码即将被检测的一个蛋白质的四微克线性化质粒加入到细胞中，并利用来自DIGITAL BIO TECHNOLOGY的Microporator-迷你装置将细胞电穿孔。用于电穿孔的设定是1230伏、20us和3个脉冲。

将电穿孔的细胞在含有3ml添加8mM谷氨酰胺和2×HT的培养基(SFM4CHO，Hyclone^TM)的6孔板中培养。转染后一天，通过将500ug/ml G418加入到培养基中来启动稳定转染子的选择。在培养的第三天，通过离心收获细胞，并将培养基用10ml新鲜的添加抗生素的培养基更新。一周之后，将1.5×10⁶细胞转移到含有添加抗生素的5ml培养基的50ml微反应管(TBS)中并在振荡培养箱中温育。通过一周传代两次维持培养物。在继代培养的时候，记录细胞数并通过ELISA测定产物的浓度。那些数用于计算比生产率以比较测试的不同蛋白质的作用。

虽然本发明在附图和相应的说明书的基础上被详细说明和描述，但是该说明和该详细的描述将被理解是说明性和示例性的而不是限制本发明。不证自明的是本领域的技术人员可不脱离所附权利要求书的范围的情况下进行变化和改进。特别地，本发明还包括与不同实施方式相连的具有本文提到的特征的任何组合的实施方式。

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Claims (70)

1.一种转基因表达的方法，包括：

(a)提供真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，其中所述宿主细胞已被修饰或处理以在所述细胞中增加同源重组(HR)，降低非同源末端连接(NHEJ)和/或提高HR/NHEJ比，和

(b)用至少一种包括所述转基因的载体，并任选地，用基质附着区(MAR)元件，转染所述细胞，其中所述MAR元件以顺式或反式提供给所述转基因。

2.权利要求1所述的方法，其中(b)中所述的转染是随后的转染，并在用核酸如载体或核酸片段的最初的转染之后。

3.权利要求2所述的方法，其中所述细胞的细胞群体的细胞周期被同步。

4.权利要求2或3所述的方法，其中所述最初和随后的转染每次发生在当所述群体的多数所述细胞在所述细胞周期的G1期时。

5.权利要求4所述的方法，其中所述细胞群体的大于30％、大于31％、32％、33％、34％、35％、36％、36％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％的所述细胞处于G1期。

6.权利要求3和之后权利要求中任一个所述的方法，其中通过使所述细胞群体经受化学或温度处理，所述细胞周期被同步。

7.权利要求2或之后权利要求中任一个所述的方法，其中在所述初始转染之前给予所述细胞HR酶、HR激活剂和/或NHEJ抑制剂。

8.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述细胞是重组的真核宿主细胞并包括编码HR酶、HR激活剂和/或NHEJ抑制剂的转基因序列和/或其中所述细胞的NHEJ或HR基因被突变。

9.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述细胞是重组的真核宿主细胞，并且所述细胞的基因组被突变以使NHEJ失活，以增加至少一个HR酶、至少一个HR激活剂和/或至少一个NHEJ抑制剂的表达或活性。

10.权利要求2或之后权利要求中任一个所述的方法，其中所述最初转染的核酸是至少一个包括转基因的载体，其中所述最初转染的所述至少一个所述载体和所述至少一个随后转染的至少一个载体在整合进所述细胞基因组之前和/或之后形成串联结构。

11.权利要求10所述的方法，其中所述最初转染的至少一个载体和所述随后转染的所述至少一个载体形成整合进所述细胞基因组的串联结构，其中所述串联结构包括所述转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝。

12.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述细胞的所述HR/NHEJ比比分别不包括所述转基因序列和未被突变的细胞中发现的比高达2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍，或其中所述NHEJ活性等于0。

13.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述至少一个随后的转染之后，整合进所述细胞基因组的所述转基因的整合拷贝数比代表通过用(b)所述的载体直接转染所述细胞获得的整合拷贝数的参考值大两倍。

14.权利要求2和随后的权利要求中任一个所述的方法，其中所述至少一个最初转染是单一转染。

15.权利要求14所述的方法，其中所述最初转染的所述核酸是包括MAR元件和所述转基因的载体，其中，所述最初转染之后，所述转基因的表达达到最初的水平，其中，所述随后的转染之后，所述转基因的表达达到随后的水平，该水平超过累加的，优选，单个随后的转染之后，超过所述最初水平的两倍、三倍或四倍。

16.权利要求14所述的方法，其中(a)中的所述核酸是包括MAR元件和所述转基因的载体，其中，所述最初转染之后，整合进所述细胞基因组的所述转基因拷贝数等于(n)，其中，至少一个随后的转染之后，整合进所述基因组的所述转基因拷贝数大于2(n)、3(n)或4(n)。

17.权利要求15或16所述的方法，其中所述至少一个随后的转染是单一转染。

18.权利要求15或16所述的方法，其中所述转基因作为串联结构在单个基因座被整合进所述细胞的基因组。

19.以上权利要求中任一个所述的方法，其中(b)中的所述MAR元件改善表达，基本上或完全防止来自包括所述转基因的载体的多重拷贝的共整合的抑制效应。

20.权利要求2和之后权利要求中任一个所述的方法，其中所述至少一个随后转染的所述载体的超过50％、60％、70％、80％被运送进细胞核。

21.以上权利要求中任一个所述的方法，其中，所述最初的转染之后，达到转基因表达产物的最初水平和最初的转基因拷贝数，其中，所述至少一个随后的转染之后，所述转基因表达产物的水平增加到随后的水平，所述最初转基因拷贝数增加到随后的转基因拷贝数，其中转基因表达产物的所述第一和第二水平之间的增加超过所述最初的转基因拷贝数和所述随后的转基因拷贝数之间的增加20％、30％、40％、50％或60％。

22.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述至少一个第一转染的所述载体的所述载体序列与至少所述随后转染的第一个的所述载体的载体序列具有100％或至少95％、90％、85％或80％的序列同一性。

23.权利要求2或之后权利要求中任一个所述的方法，其中所述最初转染的所述载体包括MAR元件，所述MAR元件与至少所述随后转染的第一个的载体的MAR元件具有100％或至少95％、90％、85％或80％的序列同一性。

24.权利要求2或之后权利要求中任一个所述的方法，其中所述最初转染的所述载体包括转基因，所述转基因与至少所述随后的转染的第一个的载体的所述转基因具有100％或至少95％、90％、85％或80％的序列同一性。

25.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述MAR元件作为(b)中所述载体的部分以顺式被提供。

26.以上权利要求中任一个所述的方法，其中(b)中所述至少一个MAR元件作为(b)中所述载体的部分以顺式被提供，并且所述至少两个MAR元件位于所述转基因侧翼。

27.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述MAR元件位于所述转基因的启动子/增强子序列的上游。

28.以上权利要求中任一个所述的方法，其中所述MAR序列与SEQ ID NOs：1-3具有至少90％的序列同一性或是其变体。

29.一种重组真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，包括

(a)表达NHEJ抑制剂的转基因序列，

(b)表达一个或多个HR酶或HR激活剂的转基因序列，

(c)灭活或下调NHEJ基因的突变，和/或

(d)增加HR酶、HR激活剂或NHEJ抑制剂的表达或活性的突变，

其中所述重组真核宿主细胞具有的HR/NHEJ比比在不包括(a)和/或(b)所述的转基因序列的细胞中发现的比高大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍，和

包括，任选地，基质附着区(MAR)元件。

30.一种重组真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，包括

(a)表达NHEJ抑制剂的转基因序列，

(b)表达一个或多个HR酶或HR激活剂的转基因序列，

(c)灭活或下调NHEJ基因的突变，和/或

(d)增强HR酶、HR激活剂或NHEJ抑制剂的表达或活性的突变，和

整合进所述细胞基因组的转基因，和

任选地，MAR元件，其中所述MAR元件以顺式或反式提供给所述转基因。

31.权利要求29或30所述的细胞，其中所述一个或多个HR酶是Rad 51、Rad 52、RecA、Rad 54、RuvC或BRCA2和/或HR激活剂是RS-1和/或NHEJ抑制剂是NU7026和/或渥曼青霉素。

32.权利要求29或30所述的细胞，其中所述转基因功能地连接到可诱导表达的控制元件如诱导型启动子，其中所述诱导型启动子任选地是物理上活化的启动子如热休克启动子或化学上活化的启动子如IPTG或四环素活化的启动子。

33.权利要求29或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中(c)或(d)中的所述突变是xrcc4基因、RAD51链转移酶基因、依赖DNA的蛋白激酶基因、Rad 52基因、RecA基因、Rad 54基因、RuvC基因和/或BRCA2基因中的突变。

34.权利要求29或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述转基因被整合进所述细胞基因组的一个基因座并形成串联结构。

35.权利要求34或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述串联结构包括所述转基因的至少300、400、500或600个拷贝。

36.一种重组真核生物，优选哺乳动物的宿主细胞，包括

整合进所述基因组单个基因座、功能地连接到启动子的转基因的串联结构，其中所述串联结构包括所述转基因的至少300、400、500或600个拷贝和至少一个MAR元件，其中所述MAR元件以顺式或反式提供给所述转基因，其中所述细胞优选是已被同步的细胞群体的部分。

37.权利要求36所述的细胞，其中所述至少一个MAR以顺式被提供，并且所述多数转基因被提供，每个所述转基因具有MAR。

38.权利要求36所述的细胞，其中至少两个所述MAR元件位于所述转基因侧翼。

39.权利要求29或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述至少一个MAR元件与SEQ ID NOs：1-3具有至少90％的序列同一性或是SEQ ID NOs：1-3的变体。

40.权利要求29或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述MAR元件位于所述转基因的启动子/增强子序列的上游。

41.权利要求29或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述的细胞是CHO细胞、HEK 293细胞、干细胞或祖细胞。

42.权利要求29或之后权利要求中任一个所述的重组真核宿主细胞中任一个在所述转基因表达中的用途。

43.一种试剂盒，其包括

a.在第一容器中，任选地包括MAR元件和用于转基因整合进所述载体的限制位点的载体，

b.在第二容器中，权利要求28至42的重组真核宿主细胞，和

c.如何在转染所述细胞中使用所述载体用于转基因表达的说明书。

44.权利要求43所述的试剂盒，进一步包括同步化剂或关于如何使包括所述细胞的细胞群体同步化的说明书。

45.权利要求44所述的试剂盒，其中当所述细胞群体的多数细胞处于G1期时，所述载体用于转染所述细胞至少两次。

46.一种非灵长类重组真核宿主细胞，其包括

编码跨过内质网(ER)膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的至少一个灵长类蛋白质或灵长类RNA——如信号识别颗粒(SRP)的蛋白质或RNA或分泌复合体(易位子)的蛋白质或其亚基——的转基因序列。

47.权利要求46所述的细胞，其中所述细胞进一步包括功能地连接到信号肽编码序列的转基因，其中所述转基因以多个拷贝，优选以串联结构的形式存在于所述细胞中。

48.权利要求47所述的细胞，其中所述细胞包括所述转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝。

49.权利要求47或48所述的细胞，其中由所述信号肽编码序列编码的信号肽包括氨基酸的疏水段并具有与SRP54相互作用的序列。

50.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的细胞，进一步包括外遗传调节子元件，如MAR元件，其以顺式或反式位于所述转基因。

51.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中在跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的所述蛋白质或RNA是所述SRP，特别是SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68、SRP72和/或7SRNA的蛋白质或RNA。

52.权利要求51所述的细胞，其中所述SRP的所述蛋白质是人类SRP14，优选与跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的一个或多个其它的所述蛋白质或RNA组合。

53.权利要求52所述的细胞，其中所述一个或多个其它的所述蛋白质是人类SR和/或人类易位子蛋白。

54.权利要求51所述的细胞，其中所述蛋白质是人类SRP54，优选与跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的一个或多个其它的所述蛋白质或RNA组合。

55.权利要求54所述的细胞，其中所述一个或多个其它的所述蛋白质是人类SR和/或人类易位子蛋白。

56.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中在跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的所述蛋白质或RNA是易位子蛋白质，特别是Sec61αβγ、Sec62、Sec63和/或其亚基中的一个。

57.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中在跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的所述蛋白质或RNA是SRP9、SR14和易位子蛋白的组合。

58.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述转基因是免疫球蛋白、其亚基或片段或融合蛋白。

59.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述非灵长类细胞是啮齿动物细胞，优选CHO细胞。

60.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的细胞，其中所述信号肽编码序列与SEQ ID NOs：4-11具有至少90％的序列同一性或可以是所述序列中任一个的变体。

61.权利要求46或之后权利要求中任一个所述的非灵长类重组真核宿主细胞在跨过ER膜易位和/或跨过所述细胞的细胞质膜分泌中的用途。

62.一个试剂盒，包括

(a)在一个容器中，非灵长类重组宿主细胞，其包括作为所述细胞基因组的部分，编码在跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的至少一个蛋白质或RNA——如信号识别颗粒(SRP)的蛋白质或RNA或分泌复合体(易位子)的蛋白质或其亚基——的转基因序列，

(b)在独立的容器中，至少一个包括转基因整合进所述载体的限制位点和任选地MAR元件的载体，和

(c)利用所述细胞表达和分泌所述转基因的转基因表达产物的说明书。

63.转基因的蛋白质分泌的方法，包括：

提供非灵长类真核宿主细胞，该细胞包括

(a)编码在跨过内质网易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的至少一个灵长类蛋白质或灵长类RNA——如信号识别颗粒(SRP)的蛋白质或RNA或分泌复合体(易位子)的蛋白质或其亚基——的转基因序列，和

(b)功能地连接到信号肽编码序列的转基因。

64.权利要求63所述的蛋白质分泌的方法，其中所述转基因序列增加存在于所述细胞的在跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的蛋白质或RNA的总量高于在表达所述转基因序列之前在所述细胞中发现的水平超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

65.权利要求63或64所述的方法，其中所述转基因作为整合进所述细胞基因组的串联结构存在于所述细胞中，其中所述串联结构优选包括所述转基因的至少200、300、400、500或600个拷贝，并在所述细胞基因组的单个基因座被整合。

66.权利要求63或之后权利要求中任一个所述的方法，其中由所述信号肽编码序列编码的信号肽包括氨基酸的疏水段并具有与SRP54相互作用的序列。

67.权利要求63或之后权利要求中任一个所述的方法，其中(b)中所述的转染是随后的转染并在用核酸如载体或核酸片段的最初转染之后。

68.权利要求67所述的方法，其中所述最初转染的所述载体对应于(b)中所述的载体。

69.权利要求63或之后权利要求中任一个所述的方法，其中所述转基因序列与选自SEQ ID NOs：4-11的序列具有至少90％的序列同一性或是所述序列中任一个的变体。

70.鉴定转基因序列的蛋白质分泌和/或易位增加活性的方法，包括：

监测包括编码重组蛋白的转基因的第一哺乳动物细胞，其中所述重组蛋白由所述细胞以第一水平分泌，

监测包括编码所述重组蛋白的所述转基因的第二哺乳动物细胞，其中重组蛋白由所述细胞以第二水平分泌，

其中所述第二水平超过所述第一水平，

将编码在跨过ER膜易位和/或跨过细胞质膜分泌中涉及的至少一个蛋白质或RNA的转基因序列导入到所述第一哺乳动物细胞，和

测定在所述第一细胞中所述重组蛋白的分泌水平的改变，

其中超过第一水平的增加鉴定了所述转基因序列的蛋白质分泌增加活性。

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