JP2023078479A - 複数のガイドｒｎａを使用して免疫寛容を破綻させるための方法 - Google Patents

複数のガイドｒｎａを使用して免疫寛容を破綻させるための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】自己抗原とエピトープを共有するまたは自己抗原と相同である目的の外来標的抗原（例えば、目的のヒト標的抗原）上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を作製するための組成物及び改善された方法を提供する。【解決手段】本発明の方法は、２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して単一標的ゲノム遺伝子座内の異なる部位における対の二本鎖切断を生成することにより、げっ歯類など（例えば、マウスまたはラット）の非ヒト動物（任意選択的に、ヒト化免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖遺伝子座をそれらの生殖細胞系内に含む）における外来抗原に対する寛容を抑制することを含む。【選択図】図３

Description

ＥＦＳ ＷＥＢを利用しテキストファイルで提出した配列表の参照
２０１７年５月１８日に作製されたファイル４９７０２３ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載の配列表は３８．３キロバイトであり、参照として本明細書に組み込まれる。
「非自己」タンパク質を用いた非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどのげっ歯類）の免疫化は、モノクローナル抗体などの特定の抗原結合タンパク質を得るために一般的に使用されている方法である。しかしながら、この手法は、非ヒト動物の天然タンパク質と、非ヒト動物の免疫機構が免疫原を非自己（すなわち、外来）と認識可能となるように免疫化されたタンパク質の間における、配列の相違に依存している。自己抗原との高度な相同性を有する抗原に対する抗体の産生は、免疫寛容に起因して困難な課題となる場合がある。タンパク質の機能的に重要な領域は種を超えて保存される傾向があることから、自己抗原に対する免疫寛容が、これらの重要なエピトープに対する抗体の産生における問題を提起する場合が多い。
様々なゲノム遺伝子座への標的化が進展してはいるが、依然として、従来の標的化戦略では効率的に標的化できない多くのゲノム遺伝子座、または、効率的に達成できない多くのゲノム改変が残っている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムがゲノム編集のための新しいツールを提供してはいるが、依然として問題点は残っている。例えば、特に真核細胞及び真核生物において、大きな標的ゲノム欠失またはその他の大きな標的遺伝子改変を生成しようとする一部の状況において、依然として問題が発生することがある。
加えて、それに続く交配工程を伴わずに標的遺伝子改変にホモ接合性な細胞または動物を効率的に作製することが困難な場合があり、一部の遺伝子座においては、その他と比較して、ホモ接合性標的改変を生成するために標的とすることがより困難となる場合がある。例えば、従来の標的化戦略により、大きな標的ゲノム欠失にヘテロ接合性なＦ０世代マウスを得られる場合があるが、それに続くこれらヘテロ接合性マウスの交配では、欠失にホモ接合性なＦ１世代マウスを作製することが必要となる。これら追加の交配工程には費用と時間がかかる。
目的の外来抗原に対する寛容が抑制された非ヒト動物を作製するための方法及び組成物、ならびに、このような動物を使用して目的の外来抗原に結合する抗原結合タンパク質を産生するための方法及び組成物を提供する。一態様では、本発明は、（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞のゲノムを、（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、（ｉｉ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ（第１の標的ゲノム遺伝子座は、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第１の自己抗原の発現に影響を及ぼす）、及び（ｉｉｉ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ（第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を産生し、第１の自己抗原の発現は抑制される）と接触させること、（ｂ）改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入すること、及び（ｃ）宿主胚を代理母に移植して、第１の自己抗原の発現が抑制されるように、第１の標的ゲノム遺伝子座が第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変された遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製すること、を含む、目的の外来抗原に対する寛容が抑制された非ヒト動物を作製するための方法を提供する。任意選択的に、多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である。任意選択的に、接触させることは、Ｃａｓ９タンパク質、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを、ヌクレオフェクションで非ヒト動物多能性細胞に導入することを含む。任意選択的に、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物多能性細胞に導入され、第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物多能性細胞に導入され、第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物多能性細胞に導入される。
一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、（ｉｖ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び／または、（ｖ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡと接触させることを更に含む。一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、（ｉｖ）第２の標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ（第２の標的ゲノム遺伝子座は、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第１の自己抗原または第２の自己抗原の発現に影響を及ぼす）、及び／または、（ｖ）第２の標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡと接触させることを更に含む。
一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートと接触させることを更に含む。任意選択的に、外来修復テンプレートは、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを更に含む。一部のこのような方法では、核酸インサートは、第１の標的ゲノム遺伝子座に対して相同またはオルソロガスである。一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド長～約１ｋｂ長である。一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは、約８０ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長である。一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは、少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、及び／または、外来修復テンプレートは、ＬＴＶＥＣの５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームの総合計が少なくとも１０ｋｂ長のＬＴＶＥＣである。
一部のこのような方法は、（ｄ）工程（ｃ）で作製した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を目的の外来抗原で免疫化すること、（ｅ）遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を、目的の外来抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下に維持すること、及び（ｆ）遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列、及び／または、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を得ること、を更に含む。
一部のこのような方法では、目的の外来抗原で遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を免疫化した後に得られた目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質は、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を免疫化した後に得られた抗原結合タンパク質と比較して、より高い力価を有している。一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を免疫化した後に得られた抗原結合タンパク質と比較して、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のより多様なレパートリーは、目的の外来抗原で遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を免疫化した後に得られる。
一部のこのような方法では、第１の自己抗原の発現は排除される。
一部のこのような方法では、目的の外来抗原は第１の自己抗原のオルソログである。一部のこのような方法では、目的の外来抗原は、ヒトタンパク質の全てまたは一部を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、または、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む。一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含む。一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートと接触させることを含み、ゲノムが１細胞期胚内に存在する場合、外来修復テンプレートは５ｋｂ長以下であり、外来修復テンプレートは、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを含み、核酸インサートは、欠失核酸配列に対して相同またはオルソロガスであり、核酸インサートは欠失核酸配列を置換する。一部のこのような方法では、欠失は、ランダムな挿入及び欠失（インデル）を伴わない正確な欠失である。一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートと接触させることを含み、ゲノムが１細胞期胚内に存在する場合、外来修復テンプレートは５ｋｂ長以下であり、欠失核酸配列は、５´標的配列と３´標的配列の間の核酸配列からなる。
一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部のホモ接合性欠失を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンのホモ接合性破壊を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、第２のガイドＲＮＡ認識配列は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含むか、または、終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。任意選択的に、第１のガイドＲＮＡ認識配列は開始コドンを含み、第２のガイドＲＮＡ認識配列は終止コドンを含む。一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は第１のＣａｓ９開裂部位を含み、第２のガイドＲＮＡ認識配列は第２のＣａｓ９開裂部位を含み、第１の標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、第１のＣａｓ９開裂部位と第２のＣａｓ９開裂部位の間の欠失を含む。任意選択的に、欠失は正確な欠失であり、欠失核酸配列は、第１のＣａｓ９開裂部位と第２のＣａｓ９開裂部位の間の核酸配列からなる。
一部のこのような方法では、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。任意選択的に、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは開始コドンを含む。
一部のこのような方法では、第１の核酸配列及び／または第２の核酸配列は、遺伝子組換え非ヒト動物のリンパ球から、または、リンパ球から作製したハイブリドーマから得られる。
一部のこのような方法では、非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む。一部のこのような方法では、非ヒト動物はげっ歯類である。一部のこのような方法では、げっ歯類はマウスである。任意選択的に、マウス系統はＢＡＬＢ／ｃ系統を含む。任意選択的に、マウス系統は、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含む。任意選択的に、マウス系統は、５０％ ＢＡＬＢ／ｃ、２５％ Ｃ５７ＢＬ／６、及び２５％ １２９である。任意選択的に、マウスのＭＨＣハプロタイプはＭＨＣｂ／ｄである。
一部のこのような方法では、マウスは、内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に挿入されたヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む。任意選択的に、ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは重鎖遺伝子セグメントであり、マウス免疫グロブリン遺伝子座は重鎖遺伝子座である。任意選択的に、ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは軽鎖セグメントであり、マウス免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖遺伝子座である。任意選択的に、軽鎖遺伝子セグメントはヒトカッパまたはラムダ軽鎖遺伝子セグメントである。一部のこのような方法では、マウスは、マウス定常領域遺伝子と機能的に連結したヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含み、マウスはヒト定常領域遺伝子を欠き、マウス定常領域遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する。一部のこのような方法では、マウスは、（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｂ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ａ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。一部のこのような方法では、マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座以外の位置に存在する。
一部のこのような方法では、マウスは、軽鎖定常領域と機能的に連結した１つ以下または２つ以下の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座をその生殖細胞系内に含む。任意選択的に、軽鎖定常領域遺伝子はマウス遺伝子である。一部のこのような方法では、マウスは、重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した少なくとも１つの非再構成ヒトＶセグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤセグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を更に含む。任意選択的に、重鎖定常領域遺伝子はマウス遺伝子である。一部のこのような方法では、マウスはヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座及びヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含み、マウスは単一軽鎖を発現する。一部のこのような方法では、マウスは、（ａ）免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）（単一再構成ヒトＶＬ／ＪＬ領域は、ヒトＶκ１－３９／Ｊ遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３－２０／Ｊ遺伝子セグメントから選択される）、及び（ｂ）内在重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントへの置換（ヒトＶＨ遺伝子セグメントは内在重鎖定常（ＣＨ）領域遺伝子と機能的に連結し、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）を含む。一部のこのような方法では、マウスは抗体の集団を発現し、マウスの生殖細胞系は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子である単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子のみを含み、マウスは、１つのコピーのみを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にヘテロ接合性であるか、または、２つのコピーを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にホモ接合性であるかのいずれかであり、マウスは、（ｉ）集団のそれぞれの免疫グロブリンカッパ軽鎖は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子またはその体細胞変異体によりコードされる軽鎖可変ドメインを含み、（ｉｉ）集団は、その軽鎖可変ドメインが再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体、及び、その軽鎖可変ドメインがその体細胞変異体によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体を含み、（ｉｉｉ）マウスは、免疫グロブリンカッパ軽鎖と成功裏にペアとなり集団の抗体を形成する体細胞変異高親和性重鎖の多様な集団を産生するために、活性な親和性成熟を特徴とする。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｂ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。一部のこのような方法では、マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座以外の位置に存在する。
一部のこのような方法では、マウスは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有し、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、マウスは、非ヒト動物ＡＤＡＭ６タンパク質、またはそのオルソログもしくは相同体、もしくは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能性フラグメントをコードする核酸配列を更に含む。任意選択的に、マウスのゲノムは、（ａ）ＡＤＡＭ６遺伝子の異所性配置、及び（ｂ）内在非ヒト動物重鎖遺伝子座内への、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座、を含み、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントが重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結しているために、マウスは、（ｉ）生殖能力があり、（ｉｉ）抗原で免疫化した場合に、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる重鎖定常ドメインと機能的に連結した１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントによりコードされる重鎖可変ドメインを含む抗体を産生すること（抗体は抗原に対する特異的結合を示す）を特徴とする。
一部のこのような方法では、非ヒト動物は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、目的の外来抗原は、第１の自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含み、第１のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含み、第２のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含み、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部のホモ接合性欠失を含み、それにより第１の自己抗原の発現は排除される。任意選択的に、マウスは、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。
一部のこのような方法では、非ヒト動物は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、目的の外来抗原は、第１の自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含み、第１のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含み、第２のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含み、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンのホモ接合性破壊を含み、それにより第１の自己抗原の発現は排除される。任意選択的に、マウスは、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。
一部の方法では、非ヒト動物多能性細胞はハイブリッド細胞であり、方法は、（ａ’）第１の標的ゲノム遺伝子座内の相同染色体対の対応する第１の染色体の配列と第２の染色体の配列を比較して、第１の標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択した後に、第１の標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体のペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する標的領域に基づいて接触工程（ａ）を実施することを更に含む。任意選択的に、標的領域は、第１の標的ゲノム遺伝子座の残部と比較して、相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する。任意選択的に、標的領域は、対応する第１の染色体と第２の染色体の間の少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、第１の標的ゲノム遺伝子座の残部は、対応する第１の染色体と第２の染色体の間の９９．８％以下の配列同一性を有する。任意選択的に、標的領域は、相同染色体対の対応する第１及び第２の染色体において同一である。任意選択的に、標的領域は、第１の標的ゲノム遺伝子座内の連続対立遺伝子配列同一性の最長可能ストレッチ内に存在する。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列、及び、第１のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列、ならびに、第２のガイドＲＮＡ認識配列、及び、第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、ゲノム内の他の箇所には存在しない異なるガイドＲＮＡ認識配列、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する２つのセグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内のそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列に相当するがゲノム内の他の箇所には存在しないセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間の領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有するセグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当するセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間の領域、及び、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有するセグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当するセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上の非連続セグメントを比較して（それぞれの非連続セグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他の非連続セグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する非連続セグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数の非連続セグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当する非連続セグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間のゲノム領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上の非連続セグメントを比較して（それぞれの非連続セグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他の非連続セグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する非連続セグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数の非連続セグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当する非連続セグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列に隣接する領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列に隣接及び含有する領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列及び／または３´標的配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）の標的ゲノム遺伝子座は、５´標的配列及び３´標的配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域、及び、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域、及び、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
別の態様では、本発明は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを、（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、（ｉｉ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ（第１の標的ゲノム遺伝子座は、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第１の自己抗原の発現に影響を及ぼす）、及び（ｉｉｉ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させること（第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、二対立遺伝子改変を生成し、第１の自己抗原を発現する改変非ヒト動物１細胞期胚は減少する）、及び（ｂ）改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、第１の自己抗原の発現が抑制されるように、第１の標的ゲノム遺伝子座が第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変された遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製すること、を含む、目的の外来抗原に対する寛容が抑制された非ヒト動物を作製するための方法を提供する。任意選択的に、接触させることは、Ｃａｓ９タンパク質、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡを、ヌクレオフェクションで非ヒト動物１細胞期胚に導入することを含む。任意選択的に、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物１細胞期胚に導入され、第１のガイドＲＮＡは、第１のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物１細胞期胚に導入され、第２のガイドＲＮＡは、第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物１細胞期胚に導入される。
一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、（ｉｖ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び／または、（ｖ）第１の標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡと接触させることを更に含む。一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、（ｉｖ）第２の標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ（第２の標的ゲノム遺伝子座は、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第１の自己抗原または第２の自己抗原の発現に影響を及ぼす）、及び／または、（ｖ）第２の標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡと接触させることを更に含む。
一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートと接触させることを更に含み、外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド長～約５ｋｂ長である。任意選択的に、外来修復テンプレートは、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを更に含む。一部のこのような方法では、核酸インサートは、第１の標的ゲノム遺伝子座に対して相同またはオルソロガスである。一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド長～約１ｋｂ長である。一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは、約８０ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長である。一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。
一部のこのような方法は、（ｃ）工程（ｂ）で作製した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を目的の外来抗原で免疫化すること、（ｄ）遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を、目的の外来抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下に維持すること、及び（ｅ）遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列、及び／または、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を得ること、を更に含む。
一部のこのような方法では、目的の外来抗原で遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を免疫化した後に得られた目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質は、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を免疫化した後に得られた抗原結合タンパク質と比較して、より高い力価を有している。一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を免疫化した後に得られた抗原結合タンパク質と比較して、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のより多様なレパートリーは、目的の外来抗原で遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を免疫化した後に得られる。
一部のこのような方法では、第１の自己抗原の発現は排除される。
一部のこのような方法では、目的の外来抗原は第１の自己抗原のオルソログである。一部のこのような方法では、目的の外来抗原は、ヒトタンパク質の全てまたは一部を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、または、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む。一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含む。一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートと接触させることを含み、ゲノムが１細胞期胚内に存在する場合、外来修復テンプレートは５ｋｂ長以下であり、外来修復テンプレートは、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを含み、核酸インサートは、欠失核酸配列に対して相同またはオルソロガスであり、核酸インサートは欠失核酸配列を置換する。一部のこのような方法では、欠失は、ランダムな挿入及び欠失（インデル）を伴わない正確な欠失である。一部のこのような方法では、接触工程（ａ）は、ゲノムを、標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートと接触させることを含み、ゲノムが１細胞期胚内に存在する場合、外来修復テンプレートは５ｋｂ長以下であり、欠失核酸配列は、５´標的配列と３´標的配列の間の核酸配列からなる。
一部のこのような方法では、第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部のホモ接合性欠失を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンのホモ接合性破壊を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、第２のガイドＲＮＡ認識配列は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含むか、または、終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。任意選択的に、第１のガイドＲＮＡ認識配列は開始コドンを含み、第２のガイドＲＮＡ認識配列は終止コドンを含む。一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は第１のＣａｓ９開裂部位を含み、第２のガイドＲＮＡ認識配列は第２のＣａｓ９開裂部位を含み、第１の標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、第１のＣａｓ９開裂部位と第２のＣａｓ９開裂部位の間の欠失を含む。任意選択的に、欠失は正確な欠失であり、欠失核酸配列は、第１のＣａｓ９開裂部位と第２のＣａｓ９開裂部位の間の核酸配列からなる。
一部のこのような方法では、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。任意選択的に、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは開始コドンを含む。
一部のこのような方法では、第１の核酸配列及び／または第２の核酸配列は、遺伝子組換え非ヒト動物のリンパ球から、または、リンパ球から作製したハイブリドーマから得られる。
一部のこのような方法では、非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む。一部のこのような方法では、非ヒト動物はげっ歯類である。一部のこのような方法では、げっ歯類はマウスである。任意選択的に、マウス系統はＢＡＬＢ／ｃ系統を含む。任意選択的に、マウス系統は、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含む。任意選択的に、マウス系統は、５０％ ＢＡＬＢ／ｃ、２５％ Ｃ５７ＢＬ／６、及び２５％ １２９である。任意選択的に、マウスのＭＨＣハプロタイプはＭＨＣｂ／ｄである。
一部のこのような方法では、マウスは、内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に挿入されたヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む。任意選択的に、ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは重鎖遺伝子セグメントであり、マウス免疫グロブリン遺伝子座は重鎖遺伝子座である。任意選択的に、ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは軽鎖セグメントであり、マウス免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖遺伝子座である。任意選択的に、軽鎖遺伝子セグメントはヒトカッパまたはラムダ軽鎖遺伝子セグメントである。一部のこのような方法では、マウスは、マウス定常領域遺伝子と機能的に連結したヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含み、マウスはヒト定常領域遺伝子を欠き、マウス定常領域遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する。一部のこのような方法では、マウスは、（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｂ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ａ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。一部のこのような方法では、マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座以外の位置に存在する。
一部のこのような方法では、マウスは、軽鎖定常領域と機能的に連結した１つ以下または２つ以下の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座をその生殖細胞系内に含む。任意選択的に、軽鎖定常領域遺伝子はマウス遺伝子である。一部のこのような方法では、マウスは、重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した少なくとも１つの非再構成ヒトＶセグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤセグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を更に含む。任意選択的に、重鎖定常領域遺伝子はマウス遺伝子である。一部のこのような方法では、マウスはヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座及びヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含み、マウスは単一軽鎖を発現する。一部のこのような方法では、マウスは、（ａ）免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）（単一再構成ヒトＶＬ／ＪＬ領域は、ヒトＶκ１－３９／Ｊ遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３－２０／Ｊ遺伝子セグメントから選択される）、及び（ｂ）内在重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントへの置換（ヒトＶＨ遺伝子セグメントは内在重鎖定常（ＣＨ）領域遺伝子と機能的に連結し、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）を含む。一部のこのような方法では、マウスは抗体の集団を発現し、マウスの生殖細胞系は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子である単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子のみを含み、マウスは、１つのコピーのみを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にヘテロ接合性であるか、または、２つのコピーを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にホモ接合性であるかのいずれかであり、マウスは、（ｉ）集団のそれぞれの免疫グロブリンカッパ軽鎖は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子またはその体細胞変異体によりコードされる軽鎖可変ドメインを含み、（ｉｉ）集団は、その軽鎖可変ドメインが再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体、及び、その軽鎖可変ドメインがその体細胞変異体によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体を含み、（ｉｉｉ）マウスは、免疫グロブリンカッパ軽鎖と成功裏にペアとなり集団の抗体を形成する体細胞変異高親和性重鎖の多様な集団を産生するために、活性な親和性成熟を特徴とする。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｂ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。一部のこのような方法では、マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する。任意選択的に、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座以外の位置に存在する。
一部のこのような方法では、マウスは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有し、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、マウスは、非ヒト動物ＡＤＡＭ６タンパク質、またはそのオルソログもしくは相同体、もしくは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能性フラグメントをコードする核酸配列を更に含む。任意選択的に、マウスのゲノムは、（ａ）ＡＤＡＭ６遺伝子の異所性配置、及び（ｂ）内在非ヒト動物重鎖遺伝子座内への、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座、を含み、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントが重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結しているために、マウスは、（ｉ）生殖能力があり、（ｉｉ）抗原で免疫化した場合に、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる重鎖定常ドメインと機能的に連結した１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントによりコードされる重鎖可変ドメインを含む抗体を産生すること（抗体は抗原に対する特異的結合を示す）を特徴とする。
一部のこのような方法では、非ヒト動物は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、目的の外来抗原は、第１の自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含み、第１のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含み、第２のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含み、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部のホモ接合性欠失を含み、それにより第１の自己抗原の発現は排除される。任意選択的に、マウスは、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。
一部のこのような方法では、非ヒト動物は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、目的の外来抗原は、第１の自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、第１の標的ゲノム遺伝子座は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含み、第１のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含み、第２のガイドＲＮＡ認識部位は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含み、改変は、第１の自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンのホモ接合性破壊を含み、それにより第１の自己抗原の発現は排除される。任意選択的に、マウスは、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。
一部の方法では、非ヒト動物１細胞期胚はハイブリッド１細胞期胚であり、方法は、（ａ’）第１の標的ゲノム遺伝子座内の相同染色体対の対応する第１の染色体の配列と第２の染色体の配列を比較して、第１の標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択した後に、第１の標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体のペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する標的領域に基づいて接触工程（ａ）を実施することを更に含む。任意選択的に、標的領域は、第１の標的ゲノム遺伝子座の残部と比較して、相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する。任意選択的に、標的領域は、対応する第１の染色体と第２の染色体の間の少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、第１の標的ゲノム遺伝子座の残部は、対応する第１の染色体と第２の染色体の間の９９．８％以下の配列同一性を有する。任意選択的に、標的領域は、相同染色体対の対応する第１及び第２の染色体において同一である。任意選択的に、標的領域は、第１の標的ゲノム遺伝子座内の連続対立遺伝子配列同一性の最長可能ストレッチ内に存在する。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列、及び、第１のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列、ならびに、第２のガイドＲＮＡ認識配列、及び、第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、ゲノム内の他の箇所には存在しない異なるガイドＲＮＡ認識配列、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する２つのセグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内のそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列に相当するがゲノム内の他の箇所には存在しないセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間の領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有するセグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当するセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間の領域、及び、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有するセグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当するセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上の非連続セグメントを比較して（それぞれの非連続セグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他の非連続セグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する非連続セグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数の非連続セグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当する非連続セグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間のゲノム領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）は、第１の標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上の非連続セグメントを比較して（それぞれの非連続セグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他の非連続セグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する非連続セグメントを標的領域として選択すること、を含む。任意選択的に、１つまたは複数の非連続セグメントは、第１の標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当する非連続セグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列に隣接する領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列に隣接及び含有する領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列及び／または３´標的配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。任意選択的に、工程（ａ’）の標的ゲノム遺伝子座は、５´標的配列及び３´標的配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域、及び、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域、及び、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一部のこのような方法では、工程（ａ’）の標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域の両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。
別の態様では、（ａ）（ｉ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、（Ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、（ＩＩ）標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ（標的ゲノム遺伝子座は、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む）、及び（ＩＩＩ）標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ（標的ゲノム遺伝子座は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を産生し、自己抗原の発現は排除される）、を導入すること、及び（ｉｉ）改変非ヒト動物１細胞期胚または改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製すること（標的ゲノム遺伝子座は、自己抗原の発現が排除されるように、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変される）、を含む、目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製すること、（ｂ）工程（ａ）で作製した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を目的の外来抗原で免疫化すること、及び（ｃ）遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を、目的の外来抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下に維持すること（遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物は、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生する）、を含む、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生するための方法を提供する。
一部の方法では、工程（ａ）（ｉ）の細胞は非ヒト動物の多能性幹細胞であり、工程（ａ）（ｉｉ）における遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の作製は、（Ｉ）改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入すること、及び（ＩＩ）宿主胚を代理母に移植して、自己抗原の発現が排除されるように、標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変された遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製すること、を含む。任意選択的に、多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部の方法では、工程（ａ）（ｉ）の細胞は非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ａ）（ｉｉ）における遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の作製は、改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、自己抗原の発現が排除されるように、標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変された遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含む。
一部のこのような方法は、免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から単離したＢ細胞からハイブリドーマを作製することを更に含む。一部のこのような方法は、免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列、及び／または、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を得ることを更に含む。任意選択的に、第１の核酸配列及び／または第２の核酸配列は、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物のリンパ球（例えば、Ｂ細胞）から、または、リンパ球から作製したハイブリドーマから得られる。任意選択的に、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、第１の核酸配列はヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードし、第２の核酸配列はヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする。
一部のこのような方法では、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質は、標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を目的の外来抗原で免疫化した後の対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より高い力価を有している。一部のこのような方法では、標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を目的の外来抗原で免疫化した後の対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のより多様なレパートリーは、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を目的の外来抗原で免疫化した後の遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物により産生される。一部のこのような方法では、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質は、標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を目的の外来抗原で免疫化した後の対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より多様性が大きい重鎖Ｖ遺伝子セグメント及び／または軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを使用する。一部のこのような方法では、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質の一部は、自己抗原と交差反応する。
一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、標的ゲノム遺伝子座内における第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´であり、工程（ａ）（ｉ）は、保持アッセイを実施して、５´領域及び第１のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内における及び／または３´領域及び第２のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内におけるコピー数が、２であることを確認することを更に含む。
一部のこのような方法では、目的の外来抗原は自己抗原のオルソログである。一部のこのような方法では、目的の外来抗原は、ヒトタンパク質の全てまたは一部を含む。
一部のこのような方法では、標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、または、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む。任意選択的に、欠失は、ランダムな挿入及び欠失（インデル）を伴わない正確な欠失である。
一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、第２のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含むか、または、終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。一部のこのような方法では、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。
一部のこのような方法では、標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、約０．１ｋｂ～約２００ｋｂの二対立遺伝子欠失を含む。一部のこのような方法では、改変は、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含む。一部のこのような方法では、改変は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含む。
一部のこのような方法では、導入工程（ａ）（ｉ）は、非ヒト動物多能性細胞または非ヒト動物１細胞期胚に、（ｉｖ）標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び／または、（ｖ）標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡを導入することを更に含む。
一部のこのような方法では、工程（ａ）（ｉ）の細胞は非ヒト動物の多能性幹細胞であり、Ｃａｓ９タンパク質、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、ＤＮＡの形態で非ヒト動物の多能性幹細胞に導入される。一部のこのような方法では、工程（ａ）（ｉ）の細胞は非ヒト動物の多能性幹細胞であり、Ｃａｓ９タンパク質、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションにより非ヒト動物の多能性幹細胞に導入される。一部のこのような方法では、工程（ａ）（ｉ）の細胞は非ヒト動物１細胞期胚であり、Ｃａｓ９タンパク質、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、ＲＮＡの形態で非ヒト動物１細胞期胚に導入される。一部のこのような方法では、工程（ａ）（ｉ）の細胞は非ヒト動物１細胞期胚であり、Ｃａｓ９タンパク質、第１のガイドＲＮＡ及び第２のガイドＲＮＡは、前核注入または細胞質注入により非ヒト動物１細胞期胚に導入される。
一部のこのような方法では、外来修復テンプレートは工程（ａ）（ｉ）で導入されない。一部のこのような方法では、導入工程（ａ）（ｉ）は、工程（ａ）（ｉ）の細胞が非ヒト動物１細胞期胚であり、外来修復テンプレートの長さが約５ｋｂ以下である場合、非ヒト動物多能性細胞または非ヒト動物１細胞期胚に、標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートを導入することを更に含む。任意選択的に、外来修復テンプレートは、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを更に含む。任意選択的に、核酸インサートは、標的ゲノム遺伝子座に対して相同またはオルソロガスである。任意選択的に、外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド長～約１ｋｂ長である。任意選択的に、外来修復テンプレートは、約８０ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長である。任意選択的に、外来修復テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。任意選択的に、工程（ａ）（ｉ）の細胞は非ヒト動物多能性細胞であり、（ａ）外来修復テンプレートは少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、または、（ｂ）外来修復テンプレートはＬＴＶＥＣ（ＬＴＶＥＣの５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームの総合計は少なくとも１０ｋｂ長）である。任意選択的に、標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、欠失核酸配列は、５´標的配列と３´標的配列の間の核酸配列からなる。任意選択的に、外来修復テンプレートは、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを含み、核酸インサートは欠失核酸配列に対して相同またはオルソロガスであり、標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、核酸インサートは欠失核酸配列を置換する。
一部のこのような方法では、非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む。一部のこのような方法では、非ヒト動物はげっ歯類である。任意選択的に、げっ歯類はマウスである。任意選択的に、マウス系統はＢＡＬＢ／ｃ系統を含む。任意選択的に、マウス系統は、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含む。任意選択的に、マウス系統は、５０％ ＢＡＬＢ／ｃ、２５％ Ｃ５７ＢＬ／６、及び２５％ １２９である。任意選択的に、マウスのＭＨＣハプロタイプはＭＨＣｂ／ｄである。
一部のこのような方法では、マウスは、内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に挿入されたヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む。任意選択的に、ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは重鎖遺伝子セグメントであり、マウス免疫グロブリン遺伝子座は重鎖遺伝子座であり、及び／または、ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントはカッパまたはラムダ軽鎖セグメントであり、マウス免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖遺伝子座である。任意選択的に、マウスは、マウス定常領域遺伝子と機能的に連結したヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含み、マウスはヒト定常領域遺伝子を欠き、マウス定常領域遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する。任意選択的に、マウスは、（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｂ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ａ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。
一部のこのような方法では、マウスは、マウス軽鎖定常領域と機能的に連結した１つ以下または２つ以下の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座をその生殖細胞系内に含み、マウスは、マウス重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した少なくとも１つの非再構成ヒトＶセグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤセグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を更に含む。任意選択的に、マウスはヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座及びヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含み、マウスは単一軽鎖を発現する。任意選択的に、マウスは、（ａ）免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）（単一再構成ヒトＶＬ／ＪＬ領域は、ヒトＶκ１－３９／Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３－２０／Ｊκ１遺伝子セグメントから選択される）、及び（ｂ）内在重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントへの置換（ヒトＶＨ遺伝子セグメントは内在重鎖定常（ＣＨ）領域遺伝子と機能的に連結し、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）を含む。任意選択的に、マウスは抗体の集団を発現し、マウスの生殖細胞系は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子である単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子のみを含み、マウスは、１つのコピーのみを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にヘテロ接合性であるか、または、２つのコピーを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にホモ接合性であるかのいずれかであり、マウスは、（ｉ）集団のそれぞれの免疫グロブリンカッパ軽鎖は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子またはその体細胞変異体によりコードされる軽鎖可変ドメインを含み、（ｉｉ）集団は、その軽鎖可変ドメインが再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体、及び、その軽鎖可変ドメインがその体細胞変異体によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体を含み、（ｉｉｉ）マウスは、免疫グロブリンカッパ軽鎖と成功裏にペアとなり集団の抗体を形成する体細胞変異高親和性重鎖の多様な集団を産生するために、活性な親和性成熟を特徴とする。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｂ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。
一部のこのような方法では、マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能しており、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する。
一部のこのような方法では、非ヒト動物は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、目的の外来抗原は自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、第２のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含むか、または、終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、改変は、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含み、それにより自己抗原の発現は排除される。一部のこのような方法では、非ヒト動物は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、目的の外来抗原は、自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含み、第２のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、改変は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含み、それにより自己抗原の発現は排除される。任意選択的に、マウスは、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座（ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する）、及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座（ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、を含み、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない。任意選択的に、マウスは、その生殖細胞系内において、（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列（ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能する）、（ｂ）（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性である。
一部のこのような方法では、非ヒト動物多能性細胞はハイブリッド細胞であり、または、非ヒト哺乳動物１細胞期胚はハイブリッド１細胞期胚であり、方法は、（ａ’）標的ゲノム遺伝子座内の対応する第１の染色体と第２の染色体のペアの配列を比較して、標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択した後に、標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する標的領域に基づいて接触工程（ａ）を実施すること、を更に含み、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列、及び、第１のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、及び／または、第２のガイドＲＮＡ認識配列、及び、第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、を含む。任意選択的に、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座の残部と比較して、対応する第１と第２のペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する。任意選択的に、標的領域は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア間の少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、標的ゲノム遺伝子座の残部は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア間の９９．８％以下の配列同一性を有する。
別の態様では、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質、（ｉｉ）標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ（標的ゲノム遺伝子座は、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む）、及び（ｉｉｉ）標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡ（標的ゲノム遺伝子座は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を産生し、自己抗原の発現は排除される）、を導入すること、及び（ｂ）改変非ヒト動物１細胞期胚または改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製すること（標的ゲノム遺伝子座は、自己抗原の発現が排除されるように、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変される）、を含む、目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法を提供する。
このような方法は、例えば、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生するための方法として上記で開示したバリエーションのいずれかを含んでいてもよい。例えば、一部のこのような方法では、工程（ａ）の細胞は非ヒト動物の多能性幹細胞であり、工程（ｂ）における遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の作製は、（Ｉ）改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入すること、及び（ＩＩ）宿主胚を代理母に移植して、自己抗原の発現が排除されるように、標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変された遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製すること、を含む。任意選択的に、多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部のこのような方法では、工程（ａ）の細胞は非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ｂ）における遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の作製は、改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、自己抗原の発現が排除されるように、標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変された遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含む。一部のこのような方法では、目的の外来抗原は自己抗原のオルソログである。一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、第２のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含むか、または、終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。一部のこのような方法では、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。一部のこのような方法では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、標的ゲノム遺伝子座内における第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´であり、工程（ａ）（ｉ）は、保持アッセイを実施して、５´領域及び第１のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内における及び／または３´領域及び第２のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内におけるコピー数が、２であることを確認することを更に含む。一部のこのような方法では、改変は、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含む。一部のこのような方法では、改変は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含む。一部のこのような方法では、非ヒト動物はマウスである。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（ＶＩ－３；ＩｇＨとＩｇκの両方においてホモ接合性にヒト化された）における免疫寛容を破綻させるための従来の手法を示す図である。従来の手法では、目的の外来標的抗原に相同な自己抗原をコードする遺伝子のヘテロ接合性ノックアウト（ヌル）対立遺伝子は、Ｆ１Ｈ４胚性幹（ＥＳ）細胞内で作製される。標的化ベクターの設計からノックアウトにヘテロ接合性なＦ０マウスの作製までの期間は約５ヶ月間である。それから、ＶＩ－３マウスを、目的の外来標的抗原に相同な自己抗原をコードする内在遺伝子にヘテロ接合性ノックアウト変異を有するＦ０マウスに改良する。免疫化に好適な三重ホモ接合性マウス（目的の標的においてホモ接合性ヌル、及びＩｇＨとＩｇκの両方においてホモ接合性にヒト化）を作製するためには、更に２世代の交配が必要となる。標的化ベクターの設計から三重ホモ接合性マウスの作製までの全体のプロセスには約１５～１６ヶ月間を要する。 ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ－３）マウスまたはユニバーサル軽鎖（ＵＬＣまたは共通軽鎖）マウスにおける免疫寛容を破綻させるための、加速したプロセスを示す図である。このプロセスでは、ＶＩ－３マウスまたはＵＬＣマウスに由来するＥＳ細胞を標的として、目的の外来標的抗原に相同な自己抗原をコードする内在遺伝子のヘテロ接合性ヌル対立遺伝子を作製する。ホモ接合性ヌルＶＩ－３またはＵＬＣ ＥＳ細胞クローンを得るには連続的な標的化工程が必要となる。 ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ－３）マウスまたはユニバーサル軽鎖（または共通軽鎖）（ＵＬＣ）マウスにおける寛容を破綻させるための、更に加速したプロセスを示す図である。このプロセスでは、ＶＩ－３またはＵＬＣ ＥＳ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及び対のガイドＲＮＡで標的化して、目的の外来標的抗原に相同な自己抗原をコードする内在遺伝子のホモ接合性崩壊を単一工程で生成する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）スクリーニングは、例えば、対立遺伝子の喪失アッセイと保持アッセイの両方を含んでいてもよい。 大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）及び対の上流及び下流ガイドＲＮＡ（ｇＵ及びｇＤ）を使用した、目的の外来標的抗原に相同な自己抗原をコードするマウス遺伝子の同時欠失及びネオマイシン選択マーカーへの置換の一般的な概略を示す図である。２つのガイドＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９開裂部位の位置については、マウス遺伝子配列下部の矢印で示している。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイプローブは水平線で示しており、保持アッセイプローブ、及び、上流、中央及び下流の対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイプローブを含む。図の下部は予想される標的対立遺伝子型を示している。 大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）及びそれぞれがマウスＡＴＧ開始コドンを標的とする３つのオーバーラップしたガイドＲＮＡを使用した、目的の外来標的抗原に相同な自己抗原をコードするマウス遺伝子の同時欠失ならびにｌｏｘＰに挟まれたネオマイシン選択マーカー及びｌａｃＺへの置換の一般的な概略を示す図である。ガイドＲＮＡは水平矢印で示しており、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイプローブは円で囲んだ水平線で示している。図の下部は予想される標的対立遺伝子型を示している。 標的８（自己抗原８）にオルソロガスな自己抗原をコードする内在遺伝子にホモ接合性ヌルである野生型ユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ １－３９）マウス及びＵＬＣ １－３９マウスにおけるヒト標的抗原（標的８）の抗体力価データを示す図である。 ハイブリッドＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４）ＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ６（ＸＢ６）／１２９Ｓ６（Ｙ１２９））を作製するために実施した交配を示す図である。 ＬＴＶＥＣならびに、１つまたは２つの５´領域、中央領域及び３´領域ｇＲＮＡのいずれかを使用した、マウス遺伝子またはマウス遺伝子の一部の同時欠失及び対応するヒト型への置換の概略を示す図である。ＬＴＶＥＣは図の上部に示しており、マウス遺伝子座は図の下部に示している。８つのガイドＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９開裂部位の位置については、マウス遺伝子配列下部の垂直矢印で示している。 図９Ａは、ＬＴＶＥＣ及び２つのガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡ Ａ及びＢ）を使用した、マウス遺伝子の同時欠失及び対応するヒト型への置換の一般的な概略を示す図である。ＬＴＶＥＣは図９Ａの上部に示しており、マウス遺伝子座は図９Ａの下部に示している。２つのガイドＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９開裂部位の位置については、マウス遺伝子配列下部の矢印で示している。図９Ｂ～Ｅは、２つのガイドＲＮＡを使用する際により高い頻度で生じる固有二対立遺伝子改変（対立遺伝子型）を示す図である。斜線陰影付き太線はマウス遺伝子を示しており、点線はマウス遺伝子内の欠失を示しており、太い黒線はヒト遺伝子の挿入を示している。図９Ｂはホモ接合性崩壊対立遺伝子（大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失）を示している。図９Ｃはホモ接合性標的対立遺伝子を示している。図９Ｄはヘミ接合性標的対立遺伝子を示している。図９Ｅは複合ヘテロ接合性対立遺伝子を示している。 図１０Ａ及び１０Ｂは、選択したクローンの遺伝子型を確認するためのＰＣＲアッセイを示す図である。図１０Ａは、プライマーｍ－ｌｒ－ｆ及びｍ－５´－ｒを使用して選択したＥＳ細胞クローンのロングレンジＰＣＲアッセイの結果を示しており、それらプライマーは、ヒトインサートと５´ホモロジーアームに相同な配列外側の配列の間の連結を作ることにより、正確な標的化をもたらす。図１０Ｂは、５´Ｄｅｌ Ｊ、５´Ｉｎｓ Ｊ、Ｄｅｌ Ａ ＋ Ｆ、及びＤｅｌ Ａ ＋ Ｅ２のＰＣＲアッセイの結果を示している。５´Ｄｅｌ Ｊは、ｍ－５´－ｆプライマー及びｍ－５－ｒプライマーを使用したＰＣＲ産物を示しており、それらプライマーは、ｇＲＮＡ Ａ開裂部位を囲む野生型配列の保持または喪失を確認するためにこの配列を増幅させる。５´Ｉｎｓ Ｊは、ｍ－５´－ｆプライマー及びｈ－５´－ｒプライマーを使用したＰＣＲ産物を示しており、それらプライマーは、ヒトインサートとマウスゲノムの間の連結を作る。アッセイは、標的クローンとランダム組み込みクローンの両方において陽性結果を示している。Ｄｅｌ Ａ ＋ Ｆは、想定アンプリコンサイズ（３５９ｂｐ）、及び、クローンＢＯ－Ｆ１０及びＡＷ－Ａ８内におけるデュアルｇＲＮＡ Ａ及びＦ開裂が関与した大きな欠失による実際のバンドを示している。Ｄｅｌ Ａ ＋ Ｅ２はクローンＢＡ－Ａ７における同様の事象を示している。ＮＴはテンプレートが無いことを示し、＋／＋は親ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞野生型対照を示し、Ｈ／＋はヘテロ接合性ヒト化遺伝子型を示し、Ｈ／Δはヘミ接合性ヒト化遺伝子型を示し、Ｈ／Ｈはホモ接合性ヒト化遺伝子型を示し、Δ／Δはホモ接合性欠失遺伝子型を示している。 図１１Ａ～１１Ｃは、Ｃａｓ９及び２つのｇＲＮＡと組み合わされてＬｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣが標的としたマウスＥＳ細胞クローンＡＷ－Ｄ９（図１１Ａ）及びマウスＥＳ細胞クローンＢＡ－Ｄ５（図１１Ｃ）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析、及びＬＴＶＥＣ単独が標的としたマウスＥＳ細胞クローンＢＳ－Ｃ４（図１１Ｂ）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を示す図である。矢印は、１９番染色体のバンドＢ上のハイブリダイゼーションシグナルの位置を示している。赤色シグナルは、マウスプローブのみとのハイブリダイゼーションを示している（破線矢印、図１１Ｂ）。黄混合色シグナルは、赤色マウスプローブと緑色ヒトプローブの両方とのハイブリダイゼーションを示している。赤色シグナル（破線矢印）を有する一方の１９番染色体バンドＢ及び黄色シグナル（実線矢印）を有するもう一方の１９番染色体バンドＢにより、ＢＳ－Ｃ４クローンにおける正確な遺伝子座への標的化及びヘテロ接合性遺伝子型が確認された（図１１Ｂ）。黄色シグナル（実線矢印、図１１Ａ及び図１１Ｃ）を有する両方の１９番染色体のＢバンドにより、ＡＷ－Ｄ９クローン及びＢＳ－Ｃ４クローンにおける正確な遺伝子座への標的化及びホモ接合性遺伝子型が確認された。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内のヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を解析することにより２つのガイドＲＮＡが関与する遺伝子変換または有糸分裂組換え事象を確認するように設計されたアッセイを有する１９番染色体の概略を示す図である。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｑＰＣＲ染色体コピー数（ＣＣＮ）プローブのおおよその位置は矢印で示している。構造多型（ＳＶ）多型ＰＣＲプローブのおおよその位置は、Ｌｒｐ５遺伝子座からのそれらの距離（Ｍｂ）を示すシェブロン（上側に記載）で示している。一塩基多型（ＳＮＶ）ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別プローブのおおよその位置は、Ｌｒｐ５遺伝子座からのそれらの距離（Ｍｂ）を示す矢じり（下側に記載）で示している。Ｆ、Ｅ２、Ｄ、Ｂ２及びＡ用のｇＲＮＡ認識配列の位置は、Ｌｒｐ５遺伝子表記上側の斜め矢印で示している。 図１３Ａ及び１３Ｂは、Ｃａｓ９及び２つのｇＲＮＡと組み合わされてＨｃヒト化ＬＴＶＥＣが標的としたマウスＥＳ細胞クローンＱ－Ｅ９（図１３Ａ）及びマウスＥＳ細胞クローンＯ－Ｅ３（図１３Ｂ）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析を示す図である。矢印は、２番染色体のバンドＢ上のハイブリダイゼーションシグナルの位置を示している。赤色シグナルは、マウスプローブのみとのハイブリダイゼーションを示している（破線矢印、図１３Ａ）。黄混合色シグナルは、赤色マウスプローブと緑色ヒトプローブの両方とのハイブリダイゼーションを示している（実線矢印）。赤色シグナル（破線矢印）を有する一方の２番染色体バンドＢ及び黄色シグナル（実線矢印）を有するもう一方の２番染色体バンドＢにより、Ｑ－Ｅ９クローンにおける正確な遺伝子座への標的化及びヘテロ接合性遺伝子型が確認された（図１３Ａ）。黄色シグナル（実線矢印、図１３Ｂ）を有する両方の２番染色体のＢバンドにより、Ｏ－Ｅ３クローンにおける正確な遺伝子座への標的化及びホモ接合性遺伝子型が確認された。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内のヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を解析することにより２つのガイドＲＮＡが関与する遺伝子変換または有糸分裂組換え事象を確認するように設計されたアッセイを有するマウスＣ５遺伝子含有染色体の概略を示す図である。構造多型（ＳＶ）多型ＰＣＲプローブのおおよその位置は、Ｃ５遺伝子座からのそれらの距離（Ｍｂ）を示す水平矢印（上側に記載）で示している。Ｅ２及びＡ用のｇＲＮＡ認識配列の位置は、Ｃ５遺伝子座表記上側の斜め矢印で示している。 図１５Ａ～１５Ｅは、ＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４）、１２９及びＢ６ ＤＮＡを対照として用いた、クローンＢＲ－Ｂ４、ＢＰ－Ｇ７、ＢＯ－Ｇ１１、ＢＯ－Ｆ１０、Ｂ０－Ａ８及びＢＣ－Ｈ９の構造多型（ＳＶ）アッセイの結果を示す図である。Ｌｒｐ５遺伝子座に対してテロメア側への以下の距離、１３．７Ｍｂ（図１５Ａ）、２０．０Ｍｂ（図１５Ｂ）、３６．９Ｍｂ（図１５Ｃ）、４８．３Ｍｂ（図１５Ｄ）、及び５６．７Ｍｂ（図１５Ｅ）でアッセイを実施した。Ｂ６対立遺伝子及び１２９対立遺伝子のＰＣＲ産物の位置は矢印で示している。 図１６Ａ～１６Ｃは、Ｌｒｐ５のセントロメア側０．３２Ｍｂの対立遺伝子識別プロット（図１６Ａ）、Ｌｒｐ５のテロメア側１．２Ｍｂの対立遺伝子識別プロット（図１６Ｂ）、及びＬｒｐ５のテロメア側５７．２Ｍｂの対立遺伝子識別プロット（図１６Ｃ）を示す図である。それぞれの軸上の値は相対蛍光強度を示している。プロットはそれぞれの試料における４連試験について示しており、塗りつぶしドット（Ｂ６対立遺伝子）、空白ドット（１２９対立遺伝子）及び斜線付きドット（Ｂ６／１２９対立遺伝子の両方）で示されている。 図１７Ａ～１７Ｃは、ヘテロ接合性の喪失により検出されるホモ接合性事象及び広範囲に及ぶ遺伝子変換を生じさせ得る、細胞周期のＧ２期の間に起こり得る有糸分裂組換え機構を示す概略である。図１７Ａは、１２９相同体上の標的ヒト化にヘテロ接合性なハイブリッド１２９／Ｂ６ ＥＳ細胞内における２つの染色分体を示す複製相同染色体を示している。両矢印は、相同染色体上の染色分体間の相同組換えによる相互交換を促進するデュアルｇＲＮＡ誘導Ｃａｓ９開裂により生成される潜在的な二本鎖切断を示しており、図１７Ｂに示すハイブリッド染色分体をもたらす標的対立遺伝子のセントロメア側の交差として示されている。図１７Ｃは有糸分裂と細胞分裂の後を示しており、娘細胞への４種類の染色体分離が可能である。ヘテロ接合性を維持した２つ、親型ヘテロ接合体（Ｈｕｍ／＋、上部左側）及び均等交換によるヘテロ接合体（Ｈｕｍ／＋、上部右側）については、ＬＯＨアッセイでは識別不可能である。その他の２つ、テロメア側Ｂ６対立遺伝子を喪失したヒト化ホモ接合体（Ｈｕｍ／Ｈｕｍ、例えば、クローンＢＯ－Ａ８、下部左側）及びテロメア側１２９対立遺伝子を喪失した野生型ホモ接合体（＋／＋、下部右側）は、ヘテロ接合性の喪失を示している。この後者のタイプは、ヒト化対立遺伝子の薬剤耐性カセットを保持していないために失われる。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１つの半数染色体組及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１つの半数染色体組を有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化実験におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む観察結果を説明する、起こり得る機構を示す図である。ゲノム複製前またはゲノム複製後にヘテロ接合性改変が１２９染色体上で起こり、続いて、姉妹染色分体間の遺伝子変換が起こる、有糸分裂交差による相互染色分体交換を示している。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１つの半数染色体組及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１つの半数染色体組を有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化実験におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む観察結果を説明する、起こり得る機構を示す図である。単一の１２９染色分体がゲノム複製後に改変される、有糸分裂交差による相互染色分体交換を示している。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１つの半数染色体組及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１つの半数染色体組を有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化実験におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む観察結果を説明する、起こり得る機構を示す図である。ＬＴＶＥＣ標的化は起こっていないが、１２９染色体上またはＢ６染色体上のいずれかでＣａｓ９開裂が生じている（Ｂ６開裂を示している）、有糸分裂交差による相互染色分体交換を示している。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１つの半数染色体組及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１つの半数染色体組を有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化実験におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む観察結果を説明する、起こり得る機構を示す図である。ゲノム複製前またはゲノム複製後にヘテロ接合性改変が１２９染色体上で起こり、続いて、姉妹染色分体間の遺伝子変換が起こる、切断誘導複製による染色分体複製を示している。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１つの半数染色体組及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１つの半数染色体組を有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化実験におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む観察結果を説明する、起こり得る機構を示す図である。単一の１２９染色分体がゲノム複製後に改変される、切断誘導複製による染色分体複製を示している。 １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス系統に由来する１つの半数染色体組及びＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）マウス系統に由来する１つの半数染色体組を有するＦ１ハイブリッドマウスＥＳ細胞を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化実験におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を含む観察結果を説明する、起こり得る機構を示す図である。ＬＴＶＥＣ標的化は起こっていないが、１２９染色体上またはＢ６染色体上のいずれかでＣａｓ９開裂が生じている（Ｂ６開裂を示している）、切断誘導複製による染色分体複製を示している。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒトＬＲＰ５遺伝子座への置換の標的となる、マウスＬｒｐ５遺伝子座の概略を示す図である。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒト型への置換の標的となる、マウスＨｃ遺伝子座の概略を示す図である。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒト型への置換の標的となる、マウスＴｒｐａ１遺伝子座の概略を示す図である。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒト型への置換の標的となる、マウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子座の概略を示す図である。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒト型への置換の標的となる、マウスＦｏｌｈ１遺伝子座の概略を示す図である。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒト型への置換の標的となる、マウスＤｐｐ４遺伝子座の概略を示す図である。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒト型への置換の標的となる、マウスＲｏｒ１遺伝子座の概略を示す図である。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 膜貫通タンパク質をコードする遺伝子を含むマウス遺伝子座の概略を示す図であり、マウス遺伝子座は、ＶＧＦ１ハイブリッドＥＳ細胞内においてＬＴＶＥＣ及び１つまたは複数のｇＲＮＡを使用した欠失及び対応するヒト型への置換の標的となる。長方形は、標的ゲノム領域内の異なる遺伝子を示している。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統ＭＰ変異体、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統ＲＧＣ変異体、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。ＭＰ変異体及びＲＧＣ変異体は、同一系統由来の異なるマウスである。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。 図２７Ａ～２７Ｃは、局所的なヘテロ接合性の喪失により検出されるホモ接合性事象及び遺伝子変換を生じさせ得る、細胞周期のＧ２期の間に起こり得る有糸分裂組換え機構を示す概略である。図２７Ａは、１２９相同体上の標的ヒト化にヘテロ接合性なハイブリッド１２９／Ｂ６ ＥＳ細胞内における２つの染色分体を示す複製相同染色体を示している。ゲノム複製前に１２９相同体上のヘテロ接合性改変が起こるまたはゲノム複製後に単一の１２９染色分体が改変され、続いて、染色分体間の遺伝子変換が起こる。両矢印は、デュアル鎖侵入及び合成誘導修復を促進するデュアルｇＲＮＡ誘導Ｃａｓ９開裂により生成される潜在的な二本鎖切断を示しており、図２７Ｂに示すように、一方の改変染色分体における少しの部分を複製する遺伝子変換事象により生成されるハイブリッド染色分体をもたらすことについて、斜めの破線矢印で示されている。図２７Ｃは有糸分裂及び細胞分裂の後を示しており、娘細胞への２種類の染色体分離、ヘテロ接合性の喪失を伴うことなくヘテロ接合性を維持している１つ（親型ヘテロ接合体（Ｈｕｍ／＋、上部））、及び標的改変を囲む局所的なヘテロ接合性の喪失を伴っている１つ（Ｈｕｍ／Ｈｕｍ、下部、１２９対立遺伝子を保持）、が可能である。 自己抗原をコードする遺伝子の開始及び終止コドン領域を標的とする対のガイドＲＮＡを単独でまたは大きな標的化ベクターと共に使用した、ＶＩ－３及びＵＬＣ １－３９胚性幹（ＥＳ）細胞内における異なるサイズの異なる自己抗原標的のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介欠失の効率を示す図である。 自己抗原をコードする遺伝子の開始及び終止コドン領域を標的とする対のガイドＲＮＡを使用して、欠失させる異なるサイズの異なる自己抗原標的を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でＶＩ－３及びＵＬＣ １－３９ １細胞期胚の標的化を行った後に、崩壊対立遺伝子を有するように作製された仔マウスのパーセンテージを示す図である。 図３０Ａ及び３０Ｂは、標的９を発現するように遺伝子改変された親ＶＩ－３Ｔ３細胞及びＶＩ－３Ｔ３細胞の標的９全長ＤＮＡによる免疫化後の、野生型ＶＩ－３－Ａｄａｍ６マウス（図３０Ｂ）、及び標的９（自己抗原９）にオルソロガスな自己抗原をコードする内在遺伝子にホモ接合性ヌルであるＶＩ３－Ａｄａｍ６マウス（図３０Ａ）におけるヒト標的抗原（標的９）の抗体力価データを示す図である。 図３１Ａ及び３１Ｂは、ヒト標的抗原（標的４）及び対応するオルソロガスマウス自己抗原（自己抗原４）の抗体力価データを示す図である。図３１Ａは、自己抗原４をコードする内在遺伝子にホモ接合性ヌルであるＶＩ３－Ａｄａｍ６マウスにおけるヒト標的４及びマウス自己抗原４の抗体力価データを示している。図３１Ｂは、自己抗原４をコードする内在遺伝子にホモ接合性ヌルであるＵＬＣ １－３９マウスにおける、ヒト標的４とマウス自己抗原４の組み合わせの抗体力価データを示している。 それぞれが５０％ ＢＡＬＢ／ｃＴａｃ、２５％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、及び２５％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃの遺伝的背景を有するＶＩ３－Ａｄａｍ６マウス及びＵＬＣ １－３９マウスにおける免疫グロブリン重鎖遺伝子座（上部）及び免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（下部）の概略を示す図である。ＶＩ３－Ａｄａｍ６マウスでは、内在マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域は、再挿入マウスＡｄａｍ６遺伝子（Ａｄａｍ６ｂ及びＡｄａｍ６ａ、台形で示す）に加えて、対応するヒトＤＮＡへと置換されている。ユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ １－３９）マウスでは、内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域は、再挿入マウスＡｄａｍ６遺伝子に加えて、対応するヒトＤＮＡへと置換されており、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ｈＶκ３－１５プロモーターと機能的に連結した単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列（Ｖκ１－３９／Ｊκ５）を含む。ヒトセグメントは黒色で示しており、マウスセグメントは斜線で示している。
定義
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は本明細書において同じ意味で用いられ、任意の長さを有するポリマー形態のアミノ酸を含み、コード及び非コードアミノ酸、ならびに、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む。この用語はまた、修飾されたポリマー、例えば、修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドなどを含む。
タンパク質は「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」を有すると言われている。用語「Ｎ末端」は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端に持つ、タンパク質またはポリペプチドの開始端に関する。用語「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を末端に持つ、アミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終末端に関する。
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において同じ意味で用いられ、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそのアナログもしくは修飾型を含む、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含む。それらとしては、一本鎖、二本鎖及び多本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびに、プリン塩基、ピリミジン塩基、またはその他の天然、化学修飾、生化学的修飾、非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられる。
核酸は、１つのモノヌクレオチドペントース環の５´リン酸がホスホジエステル結合を介して隣接モノヌクレオチドペントース環の３´酸素に一方向に結合するような様式でモノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを形成するために、「５´末端」及び「３´末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、その５´リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３´酸素に結合していない場合、「５´末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３´酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５´リン酸に結合していない場合、「３´末端」と呼ばれる。より大きなオリゴヌクレオチドの内部であっても、核酸配列は５´末端及び３´末端を有すると言われることもある。直鎖状または環状いずれかのＤＮＡ分子において、個々のエレメントは、「上流」エレメント、「下流」エレメントの５´、または３´エレメントと呼ばれる。
用語「野生型」は、正常な（変異、異常、変化などと対比して）状態または状況に見られる構造及び／または活性を有する構成要素を含む。野生型遺伝子及びポリペプチドは多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在している。
タンパク質及び核酸に関する用語「単離」は、通常はｉｎ ｓｉｔｕで存在し得るその他の細菌成分、ウイルス成分または細胞成分を基準として比較的精製されたタンパク質及び核酸を含み、最高で、実質的に純粋なタンパク質製剤及びポリヌクレオチド製剤を含む。用語「単離」はまた、天然対応物がなく化学合成されているために、その他のタンパク質または核酸による汚染が実質的にないタンパク質及び核酸、または、天然に共に存在するその他の細胞成分（例えば、その他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチドまたは細胞成分）の大部分から分離または精製されたタンパク質及び核酸を含む。
「外来」分子または配列は、通常はその形態では細胞内に存在しない分子または配列を含む。正常な存在は、細胞における特定の発生段階及び環境条件に関する存在を含む。外来分子または配列は、例えば、細胞内の対応する内在配列の変異型（例えば、内在配列のヒト化型など）を含んでいてもよく、または、細胞内の内在配列に対応してはいるが形態の異なる配列（すなわち、染色体内ではない）を含んでいてもよい。対照的に、内在分子または配列は、通常、特定の環境条件下における特定の発生段階の特定の細胞内にその形態で存在する分子または配列を含む。
「コドン最適化」は、一般に、天然アミノ酸配列を維持しつつ、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子内でより頻繁にまたは最も頻繁に利用されているコドンに置換することにより、特に宿主細胞内における発現を高めるための核酸配列改変プロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、天然核酸配列と比較して、任意の原核細胞または真核細胞（細菌細胞、イースト菌、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意のその他の宿主細胞を含む）においてより高頻度で使用されているコドンに置換してもよい。コドン利用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に利用可能である。これらの表を様々な方法に適用してもよい。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。特定宿主内で発現させるための特定配列におけるコドン最適化を実施するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照のこと）。
用語「遺伝子座」とは、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列における特定の位置、または、生物ゲノムにおける染色体上の位置のことを意味する。例えば、「Ｌｒｐ５遺伝子座」とは、Ｌｒｐ５遺伝子、Ｌｒｐ５ＤＮＡ配列、ＬＲＰ５コード配列における特定の位置、または、このような配列が存在することが同定された生物ゲノムにおける染色体上のＬｒｐ５位置のことを意味し得る。「Ｌｒｐ５遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５´ＵＴＲ及び／または３´ＵＴＲ、ならびにこれらの組み合わせを含む、Ｌｒｐ５遺伝子の調節エレメントを含んでいてもよい。
用語「遺伝子」とは、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードし、非コードイントロンが介在したコード領域、及び、遺伝子が全長ｍＲＮＡ（５´及び３´非翻訳配列を含む）に相当するように５´末端上と３´末端上の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含む、染色体内におけるＤＮＡ配列のことを意味する。用語「遺伝子」はまた、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、インスレーター配列、及びマトリックス付着領域を含む、その他の非コード配列を含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、１０ｋｂ以内）していてもよく、または離れた部位にあってもよく、遺伝子の転写及び翻訳のレベルまたは比率に影響を及ぼす。
用語「対立遺伝子」とは、遺伝子の変異体形態のことを意味する。一部の遺伝子は、染色体上における同一位置または遺伝子座に位置する、様々な異なる形態を有している。二倍体生物は、それぞれの遺伝子座に２つの対立遺伝子を有している。対立遺伝子のそれぞれのペアは、特定の遺伝子座の遺伝子型を表している。遺伝子型は、２つの同一対立遺伝子が特定の遺伝子座に存在する場合にホモ接合と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合にヘテロ接合と記載される。
「プロモーター」は、通常は、特定のポリヌクレオチド配列の適切な転写開始部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させることのできるＴＡＴＡボックスを含む、ＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼすその他の領域を追加的に含んでいてもよい。本明細書で開示するプロモーター配列は、機能的に連結したポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書で開示する細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはこれらの組み合わせ）の１つまたは複数において活性であってもよい。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されるプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってもよい。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる（その全体は参照として本明細書に組み込まれる）。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーターまたはｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、またはエクジソン受容体のプロモーター）、または、金属調節プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）及び光調節プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または、免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であってもよい。
発生的に調節されるプロモーターとしては、例えば、胚発生期中にのみ活性なプロモーター、または、成熟細胞においてのみ活性なプロモーターが挙げられる。
「機能的な連結」または「機能的に連結」したとは、２種またはそれ以上の構成要素（例えば、プロモーター及び別の配列エレメント）が、両方の構成要素が正常に機能して、構成要素の少なくとも１種が、その他の構成要素の少なくとも１種が発揮した機能を媒介可能とすることを実現させるように、並列することを含む。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが１つまたは複数の転写調節因子の有無に応じてコード配列の転写レベルを調節する場合、コード配列と機能的に連結してもよい。機能的な連結は、互いに連続しているような配列、または、トランスに作用する（例えば、調節配列はコード配列の転写を調節する距離で作用し得る）ような配列を含んでいてもよい。別の例では、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列は、免疫グロブリンの重鎖配列または軽鎖配列へと適切な配列間組換えがなされるように、免疫グロブリン定常領域の核酸配列と機能的に連結してもよい。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基基の方向に起因して、相対する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は通常、ＡとＴ、及びＣとＧである。ＲＮＡの相補的塩基は通常、ＣとＧ、及びＵとＡである。相補性は完全または実質的／十分であってもよい。２つの核酸間の完全な相補性とは、２つの核酸が、二重鎖内の全ての塩基がワトソンクリック対で相補的塩基に結合した二重鎖を形成可能であることを意味する。「実質的」または「十分」に相補的とは、一方の鎖の配列が、規定のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）において、相対する鎖の配列に対して完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）及び／または完全（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ）には相補的ではないが、２本の鎖上の塩基間に十分な結合が生じて安定したハイブリッド複合体を形成するということを意味する。配列、及びハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するための標準的な数学的計算を使用することにより、または、通常の方法を使用してＴｍを実験的に求めることにより、このような条件を予測することは可能である。Ｔｍは、２本の核酸鎖間で形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる）温度を含む。Ｔｍ未満の温度でハイブリダイゼーション複合体が形成されることが好ましく、それに対し、Ｔｍ超の温度でハイブリダイゼーション複合体の鎖が融解または分離することが好ましい。核酸の構造特性にその他既知のＴｍ計算値を考慮に入れるが、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することにより、１ＭのＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸のＴｍを推定してもよい。
「ハイブリダイゼーション条件」は、１本の核酸鎖が相補鎖相互作用及び水素結合により第２の核酸鎖に結合してハイブリダイゼーション複合体を生成する累積環境を含む。このような条件としては、核酸を含有する水溶液または有機溶液の化学成分及びその濃度（例えば、塩、キレート化剤、ホルムアミド）、ならびにその混合液の温度が挙げられる。インキュベーション時間の長さまたは反応チャンバ寸法の長さなどのその他の因子は、環境に寄与し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．１．９０－１．９１，９．４７－９．５１，１ １．４７－１１．５７（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
ハイブリダイゼーションには、塩基間のミスマッチが発生し得るが、相補的な配列を含有する２種類の核酸が必要となる。２種類の核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、核酸の長さ及び相補性の度合い、当該技術分野において周知の変動要因によって決まる。２種類のヌクレオチド配列間の相補性の度合いが高いほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドにおける融解温度（Ｔｍ）の数値は高くなる。相補性の短いストレッチ（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または、１８以下超のヌクレオチドの相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションにおいては、ミスマッチの位置が重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，１１．７－１１．８を参照のこと）。通常、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長としては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び、少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。更に、相補性領域の長さ及び相補性の度合いなどの因子に応じて、必要に応じ、温度及び洗浄液の塩濃度を調節してもよい。
特異的にハイブリダイズ可能となるために、ポリヌクレオチドの配列が、その標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション事象に介在セグメントまたは隣接セグメントが含まれないように、１つまたは複数のセグメントにわたりハイブリダイズしてもよい（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とする標的核酸配列内の標的に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含んでいてもよい。例えば、２０ヌクレオチド中１８ヌクレオチドが標的に対して相補的であるために特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性を示すだろう。この例において、残りの非相補的なヌクレオチドは密集していてもよく、または、相補的なヌクレオチド間に散在していてもよく、互いに連続するまたは相補的なヌクレオチドに連続する必要はない。
核酸内の核酸配列における個々のストレッチ間のパーセント相補性は、当該技術分野において周知のＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６）を使用することにより、または、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用した初期設定を用いたＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することにより、慣例的に算出することができる。
本明細書で提供する方法及び組成物は、様々な異なる構成要素を使用している。本明細書の全体にわたり、一部の構成要素が活性変異体及び活性フラグメントを有し得るということを理解されたい。このような構成要素としては、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びガイドＲＮＡが挙げられる。これら構成要素それぞれの生物学的活性については、本明細書中の他の箇所に記載している。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列との関係における「配列同一性」または「同一性」とは、特定の比較窓にわたり最大一致性についてアラインするときに同一である、２つの配列内の残基について言及するものである。パーセンテージの配列同一性を使用してタンパク質について言及するとき、同一ではない残基位置が多くの場合、アミノ酸残基が類似した化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有するその他のアミノ酸残基で置換されることにより分子の機能的性質に変化がもたらされていない保存的アミノ酸置換により異なるということを理解されたい。配列が保存的置換により異なる場合、パーセント配列同一性を上方調節して置換の保存性を補正してもよい。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この補正を実施するための方法は当業者に周知である。通常、この方法は、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングすることによりパーセント配列同一性を高めることを含む。それゆえ、例えば、同一アミノ酸に１のスコアを与え、また非保存的置換にゼロのスコアを与える場合、保存的置換にはゼロ～１のスコアが与えられる。例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を実施することにより、保存的置換のスコアを算出する。
「パーセンテージの配列同一性」は、比較窓にわたり最適にアラインした２つの配列を比較することにより算出された値を含み、比較窓内におけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を最適にアライメントするための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在している位置の数を算出してマッチ位置の数を得て、マッチ位置の数を比較窓内における位置の合計数で割り、その結果に１００を掛けてパーセンテージの配列同一性を得ることにより、パーセンテージを算出する。
特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータ、５０のＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ及び３のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用したヌクレオチド配列の％同一性及び％類似性；８のＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ及び２のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用したアミノ酸配列の％同一性及び％類似性；を用いたＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０または任意のその同等プログラムを使用して得られた値を含む。「同等プログラム」は、任意の問題の２つの配列について、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ
１０で作成した対応するアライメントと比較した場合に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチ及び同一のパーセント配列同一性を有するアライメントを作成する任意の配列比較プログラムを含む。
本発明で使用する場合、用語「実質的な同一性」とは、対応する位置に同一残基を含有する配列を含む共有エピトープのことを意味する。例えば、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が関連ストレッチにわたり同一である場合、実質的に同一であるとみなすことができる。関連ストレッチは、例えば、完全な配列であってもよく、または、少なくとも５、１０、１５、またはそれ以上の残基であってもよい。
用語「保存的アミノ酸置換」とは、サイズ、電荷または極性が類似した異なるアミノ酸を有する配列中に通常は存在するアミノ酸の置換のことを意味する。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリンまたはロイシンなどを別の非極性残基に置換することを含む。同様に、保存的置換の例としては、ある極性（親水性）残基を、別の残基に置換すること、例えば、アルギニンとリシンとの間で、グルタミンとアスパラギンとの間で、または、グリシンとセリンとの間で置換することを含む。更に、１つの塩基性残基（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなど）を別の塩基性残基に置換すること、または、１つの酸性残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸など）を別の酸性残基に置換することは、保存的置換の追加例である。非保存的置換の例としては、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニンまたはメチオニンなどを、極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリシンなどに置換すること、及び／または、極性残基を非極性残基に置換することを含む。代表的なアミノ酸分類について以下にまとめている。
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免疫グロブリン核酸配列に関する用語「生殖細胞系」は、後代に受け継がれる核酸配列を含む。
用語「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する任意のタンパク質を含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、ｂｉｓ－ｓｃＦＶ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）、または、Ｄａｖｉｓｂｏｄｙ（米国特許番号８，５８６，７１３（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））が挙げられる。
用語「抗原」とは、完全な分子であるか分子内のドメインであるかにかかわらず、その物質に対する結合特異性を有する抗体の産生を誘導可能な物質のことを意味する。用語「抗原」はまた、野生型宿主生物においては自己認識により抗体産生が誘導されないが、適切な遺伝子操作を施して免疫寛容を破綻させた宿主動物ではこのような応答を誘導可能な、物質を含む。
用語「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する、抗原上の部位のことを意味する。エピトープは、連続アミノ酸、または、１つまたは複数のタンパク質の三次フォールディングにより並んだ非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープ（直鎖状エピトープとしても周知）は通常、変性溶媒に対する曝露を維持する一方で、三次フォールディングから形成されたエピトープ（構造的エピトープとしても周知）は通常、変性溶媒による処理により失われる。エピトープは通常、独特な立体配座で、少なくとも３つの、より一般的には、少なくとも５つの、または、８～１０のアミノ酸を含む。エピトープの立体配座を同定するための方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
抗原またはエピトープと共に使用する場合の用語「自己」とは、通常は宿主種により生合成される物質中に含まれているがゆえに、または通常は宿主種が曝露されているがゆえに、宿主種における野生型メンバーのＢ細胞受容体には認識されないまたは不十分にしか認識されないであろう抗原またはエピトープのことを意味する。このような物質は宿主免疫機構の寛容を誘導する。抗原またはエピトープと共に使用する場合の用語「外来」とは、自己抗原または自己エピトープではない抗原またはエピトープのことを意味する。外来抗原は、宿主種によって通常は産生されない任意の抗原である。
用語「抗体」は、４本のポリペプチド鎖、ジスルフィド結合で互いに連結した２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む、免疫グロブリン分子を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖及び軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が挿入された相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へと、更に細分化することができる。それぞれの重鎖及び軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲをＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略記してもよく、軽鎖ＣＤＲをＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と略記してもよい）で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。用語「高親和性」抗体とは、その標的エピトープに対して、約１０－９Ｍ以下（例えば、約１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、または、約１×１０－１２Ｍ）のＫＤを有する抗体のことを意味する。一実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）で測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡで測定される。
用語「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」は、任意の生物由来の、免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖配列を含む。重鎖可変ドメインは、特に明記しない限り、３つの重鎖ＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域を含む。重鎖のフラグメントとしては、ＣＤＲ、ＣＤＲとＦＲ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。通常の重鎖は、以下の可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端の順）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有している。重鎖の機能性フラグメントは、エピトープを特異的に認識可能な（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモル範囲のＫＤを有するエピトープを認識）、細胞から発現及び分泌可能な、少なくとも１つのＣＤＲを含む、フラグメントを含む。重鎖可変ドメインは可変領域ヌクレオチド配列によりコードされており、通常、生殖細胞系内に存在するＶＨ、ＤＨ及びＪＨセグメントのレパートリーに由来するＶＨ、ＤＨ及びＪＨセグメントを含む。様々な生物におけるＶ、Ｄ及びＪ重鎖セグメントの配列、位置及び命名法については、ＩＭＧＴデータベース内で見つけることができ、ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ（ｗｗｗ）のＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」においてインターネットを介してアクセス可能である。
用語「軽鎖」は、任意の生物由来の免疫グロブリン軽鎖配列を含み、特に明記しない限り、ヒトカッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖ならびにＶｐｒｅＢに加え、代替軽鎖を含む。軽鎖可変ドメインは通常、特に明記しない限り、３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。通常、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端にかけてＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む可変ドメイン、及び軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインは軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によりコードされており、通常、生殖細胞系内に存在する軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する軽鎖ＶＬ及び軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを含む。様々な生物における軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの配列、位置及び命名法については、ＩＭＧＴデータベース内で見つけることができ、ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ（ｗｗｗ）のＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」においてインターネットを介してアクセス可能である。軽鎖としては、例えば、第１または第２のエピトープが存在する場合に、エピトープ結合タンパク質が選択的に結合する第１または第２のエピトープのいずれかと選択的には結合しないようなものが挙げられる。軽鎖としてはまた、エピトープが存在する場合に、エピトープ結合タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープと結合及び認識するか、または、エピトープ結合タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープとの重鎖の結合及び認識を補助するようなものが挙げられる。
本発明で使用する場合、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、通常は（すなわち、野生型動物）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域間に存在する生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列がコードするアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系配列または再構成配列によってコードされていてもよく、また例えば、ナイーブまたは成熟したＢ細胞またはＴ細胞によってコードされていてもよい。ＣＤＲは、体細胞変異（例えば、動物の生殖細胞系がコードする配列によって異なる）、ヒト化していてもよく、及び／または、アミノ酸置換、付加または欠失により改変されていてもよい。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３）では、ＣＤＲは、連続（例えば、非再構成核酸配列内において）してはいないが、例えば、配列（例えば、Ｖ－Ｄ－Ｊ）がスプライシングまたは連結により組換えられて重鎖ＣＤＲ３が形成された結果として、Ｂ細胞核酸配列内においては連続している、２つまたはそれ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によってコードされていてもよい。
用語「非再構成」は、Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント（重鎖においては、Ｄ遺伝子セグメントも）が別々に維持されてはいるが、結合して、Ｖ（Ｄ）Ｊレパートリーの単一のＶ、（Ｄ）、Ｊを含む再構成Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子を形成可能である、免疫グロブリン遺伝子座の状態を含む。
用語「重鎖可変領域遺伝子座」は、野生型の重鎖可変（ＶＨ）、重鎖多様性（ＤＨ）、及び重鎖結合（ＪＨ）領域ＤＮＡ配列が見つかっている、染色体（例えば、マウス染色体）上の位置を含む。
用語「カッパ軽鎖可変領域遺伝子座」は、野生型のκ可変（Ｖκ）及びκ結合（Ｊκ）領域ＤＮＡ配列が見つかっている、染色体（例えば、マウス染色体）上の位置を含む。
用語「ラムダ軽鎖可変領域遺伝子座」は、野生型のλ可変（Ｖλ）及びλ結合（Ｊλ）領域ＤＮＡ配列が見つかっている、染色体（例えば、マウス染色体）上の位置を含む。
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列に対して同一であるかまたは実質的に類似しているかのいずれかである配列を含む。相同配列としては、例えば、オルソロガス配列及びパラロガス配列を挙げることができる。例えば、相同遺伝子は通常、共通祖先のＤＮＡ配列から、種分化イベント（オルソロガス遺伝子）または遺伝子重複イベント（パラロガス遺伝子）のいずれかによって伝わる。「オルソロガス」遺伝子は、種分化により共通祖先の遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を含む。オルソログは通常、進化の過程において同一機能を維持している。「パラロガス」遺伝子は、ゲノム内重複に関連する遺伝子を含む。パラログは、進化の過程において新しい機能を発達させ得る。
用語「インビトロ」は、人工環境、及び人工環境（例えば、試験管）内で生じるプロセスまたは反応を含む。用語「インビボ」は、天然環境（例えば、細胞、生物または生体）、及び天然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。用語「エクスビボ」は、個体の生体から取り出された細胞、及びこのような細胞内で生じるプロセスまたは反応を含む。
用語「ハイブリッド」は、相同染色体対内における第１の染色体と第２の染色体の間の１つまたは複数の標的ゲノム遺伝子座に、１つまたは複数の配列変異を有する（例えば、対立遺伝子変異を有する）細胞または株を含む。例えば、ハイブリッド細胞は、遺伝的に異なる２個体の親間の交配（すなわち、１つまたは複数の遺伝子が異なる親間の交配）による後代に由来していてもよい。一例として、ハイブリッドは、２種類の異なる近交系（すなわち、遺伝的等質性を持たせた交配系）を交配させることにより作製してもよい。全てのヒトはハイブリッドであるとみなされる。
１つまたは複数の列挙要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、明示的に列挙していないその他の要素を含んでいてもよい。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を、単独でまたはその他の成分と組み合わせて含んでいてもよい。
値の範囲に関する表記は、その範囲内のまたはその範囲を定義する全ての整数、及びその範囲内の整数が定義する全ての下位範囲を含む。
文脈から特に明らかではない限り、用語「約」は、記載した値の測定値（例えば、ＳＥＭ）における標準誤差内の値を包含する。
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に定めない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「ａ Ｃａｓ９タンパク質」または「少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質」は、これらの組み合わせを含む複数のＣａｓ９タンパク質を含み得る。
統計上有意とは、ｐ≦０．０５のことを意味する。
Ｉ．概要
本明細書では、自己抗原とエピトープを共有するまたは自己抗原と相同である目的の外来標的抗原（例えば、目的のヒト標的抗原）上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を作製するための組成物及び改善された方法を提供する。このような方法は、２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して単一標的ゲノム遺伝子座内の異なる部位における対の二本鎖切断を生成することにより、げっ歯類など（例えば、マウスまたはラット）の非ヒト動物（任意選択的に、ヒト化免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖遺伝子座をそれらの生殖細胞系内に含む）における外来抗原に対する寛容を抑制することを含む。任意選択的に、標的ゲノム遺伝子座を含む細胞はハイブリッド細胞であり、方法は、標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、標的領域が相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間のより高度な配列同一性を有するように、標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択して標的遺伝子改変を実施することを更に含む。このような対の二本鎖切断は、自己抗原の発現に影響を及ぼして、自己抗原の発現を抑制または排除するか、または、外来抗原と共有する自己抗原由来のエピトープの発現を抑制または排除する。そのため、ヒト化免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含みまた標的ゲノム遺伝子座内にこのような変異を有するこのような遺伝子組換え非ヒト動物を、外来抗原で免疫化してもよく、非ヒト動物を、非ヒト動物が外来抗原に対する免疫応答を生じるのに十分な条件下に維持してもよく、外来抗原に結合する抗原結合タンパク質を非ヒト動物または非ヒト動物由来の細胞から得ても良い。
ヒト抗原に対する抗体を作製するために使用するマウス、例えば、ヒト化免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖遺伝子座をそれらの生殖細胞系内に含むマウスなどは通常、その他のマウス系統と比較して抗体の多様なレパートリーを産生する能力がＢＡＬＢ／ｃ系統において高いことから、ＢＡＬＢ／ｃを含む系統の組み合わせに由来する。しかしながら、マウスにおける標的遺伝子改変を生成するのに通常使用される胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、本明細書に記載するＦ１Ｈ４（ＶＧＦ１）細胞）と比較して、このような系統の抗体産生マウスに由来するＥＳ細胞は通常、培養物内において標的となる能力が低く、及び／または、標的遺伝子改変を有し生殖細胞系を介して標的改変を遺伝させるＦ０世代マウスを作製する能力が低い。結果として、標的ノックアウトマウスを作製して寛容を克服するための従来の方法は、複数ラウンドの交配及び／または連続標的化を含み、目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性のマウスを出産させて免疫化の準備を整えるための全体のプロセスには、約１５～１６ヶ月間を要する。
本明細書に記載の方法は、この期間を約４～５ヶ月間に有利に短縮する（目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性の仔マウスを約３ヶ月間で出産させることができる）。より短い期間に加えて、本明細書に記載の方法は、ホモ接合性改変の生成に必要なエレクトロポレーションのラウンド数を減少させ、培養に必要な継代回数を減少させて培養に必要な期間を短縮し、必要な細胞の数を減少させ、標的化ベクターを必要とせずその分スクリーニングが簡略化されることによりプロセスを合理化する。本明細書に記載の方法は有利に、自己抗原の発現が止まっていないマウスと比較して、重鎖及び軽鎖Ｖ遺伝子セグメントの使用が増加することにより、目的の外来抗原による免疫化後に抗体の多様性増加をもたらす。加えて、本明細書に記載の方法は、対応する自己抗原と交差反応する抗体（すなわち、自己抗原と目的の外来抗原の間にオーバーラップするエピトープに結合する抗体）を産生することにより、目的の外来抗原による免疫化後に、より多様性が大きいエピトープに対して産生された抗体をもたらし、その結果、目的の外来抗原に対するより大きなプールの抗体を産生することが可能となる。
ＩＩ．標的ゲノム遺伝子座を改変して寛容を破綻させるための方法
「非自己」タンパク質を用いた、ヒト化免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖遺伝子座をそれらの生殖細胞系内に含む非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどのげっ歯類）の免疫化は、モノクローナル抗体などの特定の抗原結合タンパク質を得るために一般的に使用されている方法である。この免疫化手法は、インビボで成熟した高親和性抗原結合タンパク質をもたらす可能性を有し費用効果と時間効果の両方において優れている場合があるために魅力的である。しかしながら、この手法は、非ヒト動物の天然タンパク質と、非ヒト動物の免疫機構が免疫原を非自己（すなわち、外来）と認識可能となるように免疫化されたタンパク質の間における、配列の相違に依存している。
Ｂ細胞受容体は、一連の組換え事象により、順に並んだ遺伝子セグメント（例えば、Ｖ、Ｄ及びＪ）からアセンブリされるが、遺伝子セグメントのこのアセンブリは不正確であり、自己抗原を含む様々な抗原に対する親和性を有する受容体を産生することが知られている。自己分子に結合するＢ細胞受容体を産生するこの能力にもかかわらず、免疫機構は、このような自己反応性Ｂ細胞受容体の発生及び増殖を防止し、自己を非自己と区別することにより自己免疫を回避するための、いくつかの自己寛容機構を備えている。例えば、Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２８：１８－２８、及びＫｕｍａｒ ａｎｄ Ｍｏｈａｎ（２００８）４０（３）：２０８－２３を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。それゆえ、非ヒト動物の自己抗原と高度な相同性（例えば、構造相同性または配列相同性）を有するヒト抗原に対するヒト化免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物におけるヒト抗体の産生は、免疫寛容に起因して困難な課題となる場合がある。タンパク質の機能的に重要な領域は種を超えて保存される傾向があることから、自己抗原に対する免疫寛容が、これらの重要なエピトープに対する抗体の産生における問題を提起する場合が多い。極めて類似または「相同」な外来（例えば、ヒト）抗原を用いて非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどのげっ歯類）を免疫化することにより、弱い抗体応答が生じるかまたは抗体応答が皆無となり、それにより、このようなヒト抗原に向かう結合性を有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を得ることが不確実となる。一例として、内在タンパク質（自己抗原）と外来標的抗原が共有する配列同一性の総計は、免疫機構が標的抗原を外来と認識しないような、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってもよい。例えば、非ヒト動物における外来抗原と自己抗原の間の共有エピトープは、免疫寛容が、外来抗原に対する中和抗体を発現するＢ細胞を減少及び／または除去するため、非ヒト動物における外来抗原に対する効果的な免疫応答の備えを不確実なものする場合がある。この寛容を克服して、非ヒト動物内において自己抗原またはその相同体（例えば、ヒト相同体）に結合するモノクローナル抗体を得るために、特定の遺伝子組換えまたはノックアウト非ヒト動物を作製して、有意な相同性を共有する非ヒト動物タンパク質をコードする遺伝子（または目的の共有エピトープ）、及び／または、免疫化に利用される抗原をコードするそのヒト対応遺伝子に高く保存された遺伝子（または目的の共有エピトープ）を除去してもよい。例えば、米国特許番号７，１１９，２４８を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。しかしながら、このような非ヒト動物の作製には費用と時間の両方がかかる場合がある。
標的ノックアウトマウスを作製して寛容を克服するための従来の方法は、複数ラウンドの交配及び／または連続標的化を含む。ヒト抗原に対する抗体を作製するために使用するマウス、例えば、ヒト化免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖遺伝子座（例えば、ＩｇＨ遺伝子座とＩｇκ遺伝子座の両方においてホモ接合性にヒト化されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス）をそれらの生殖細胞系内に含むマウスなどは通常、その他のマウス系統と比較して抗体の多様なレパートリーを産生する能力がＢＡＬＢ／ｃ系統において高いことから、ＢＡＬＢ／ｃを含む系統の組み合わせに由来する。しかしながら、マウスにおける標的遺伝子改変を生成するのに通常使用される胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、５０％ １２９ＳｖＳ６株及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる、本明細書に記載するＦ１Ｈ４（ＶＧＦ１）細胞）と比較して、このような系統の抗体産生マウスに由来するＥＳ細胞は通常、培養物内において標的となる能力が低く、及び／または、標的遺伝子改変を有し生殖細胞系を介して標的改変を遺伝させるＦ０世代マウスを作製する能力が低い。それゆえ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスなどの抗体産生マウスにおける免疫寛容を破綻させるための従来の手法は、標的化を受けやすいＥＳ細胞株（例えば、Ｆ１Ｈ４）内の自己抗原をコードする遺伝子を最初に標的化してから、生殖細胞系を介して標的改変を遺伝させることを含む。このような手法では、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を設計し、Ｆ１Ｈ４ ＥＳ細胞内にノックアウト（ヌル）対立遺伝子を作製して、目的の標的にヘテロ接合性ノックアウト変異を有するＦ０マウスを作製する（通常の期間は５ヶ月間）。そのためＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、目的の標的にヘテロ接合性ノックアウト変異を有するＦ０マウスに改良する。免疫化に好適な三重ホモ接合性マウス（目的の標的においてホモ接合性ヌル、及びＩｇＨとＩｇκの両方においてホモ接合性にヒト化）を作製するためには、更に２世代の交配が必要となる。全体のプロセスには約１５～１６ヶ月間を要し（例えば、図１を参照のこと）、以下で説明する連続標的化手法（例えば、図２を参照のこと）と比較してより効果的である。
代替的に、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を設計及び構築してから、抗体産生マウス（例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、または機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（「ＶＩ－３マウス」））から誘導した胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションして、標的抗原と相同であるまたは標的抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする内在遺伝子内にヘテロ接合性改変を生成してもよい。その後、第２ラウンドの標的化を実施してホモ接合性改変を生成する。上記の交配手法と比較して時間を必要としないが、このプロセスは依然として時間を要する場合があり、標的抗原による免疫化の準備が整ったＦ０マウスの作製には約９～１０ヶ月間かかる（例えば、図２を参照のこと）。加えて、このような方法は、複数ラウンドのエレクトロポレーション、及びより多くの継代を用いたより長い培養期間を必要とし、その全てにより、多能性が低下し、抗原結合タンパク質産生用Ｆ０マウスの作製能が低下することになる。例えば、Ｂｕｅｈｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １３５：１２８７－１２９８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １３５（７）：１２９９－１３１０；及び、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０９：８５－９１を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
本明細書に記載の方法は、この期間を約４～５ヶ月間に有利に短縮する（例えば、図３（目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性の仔マウスを約３ヶ月間で出産させることができるが、その後、免疫化の前に４～５週間成長させる）を参照のこと）。より短い期間に加えて、本明細書に記載の方法は、ホモ接合性改変の生成に必要なエレクトロポレーションのラウンド数を減少させ、培養に必要な継代回数を減少させて培養に必要な期間を短縮し、必要な細胞の数を減少させる。スクリーニングは、例えば、対立遺伝子プローブの回収が不要となり、コピー数較正が不要となるために、より簡略化され合理化される。本明細書に記載の方法はまた、自己抗原の発現が止まっていないマウスと比較して、重鎖及び軽鎖Ｖ遺伝子セグメントの使用が増加することにより、目的の外来抗原による免疫化後に抗体の多様性増加をもたらす。加えて、本明細書に記載の方法は、対応する自己抗原と交差反応する抗体（すなわち、自己抗原と目的の外来抗原の間にオーバーラップするエピトープに結合する抗体）を産生することにより、目的の外来抗原による免疫化後に、より多様性が大きいエピトープに対して産生された抗体をもたらすことができ、その結果、目的の外来抗原に対するより大きなプールの抗体を産生することが可能となる。
本明細書では、標的ゲノム遺伝子座を改変して寛容を破綻させるための様々な方法を提供する。本方法はエクスビボまたはインビボで実施可能であり、これらの方法は、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原の発現に影響を及ぼす単一標的ゲノム遺伝子座内の異なる領域を標的とする２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡ（例えば、２つのｇＲＮＡ、３つのガイドＲＮＡ、または４つのガイドＲＮＡ）を利用して、Ｃａｓタンパク質との２つまたはそれ以上の複合体を形成して、標的核酸を開裂させることができる。細胞が１細胞期胚である場合、２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを単独でまたは外来修復テンプレートと組み合わせてのいずれかで使用してもよく、例えば、外来修復テンプレートは５ｋｂ長未満であってもよい。このような方法は、標的遺伝子座における二対立遺伝子の遺伝子改変の生成を促進させ、ゲノム崩壊またはその他の標的改変、例えば、ゲノム内核酸配列の同時欠失及び外来核酸配列への置換などを含んでいてもよい。１つのｇＲＮＡを用いた標的化（低頻度で二対立遺伝子改変を生成）と比較して、２つまたはそれ以上のｇＲＮＡを用いた標的化は、極めて高い比率で二対立遺伝子改変の生成（例えば、ホモ接合性に標的化された細胞、ホモ接合性に欠失した細胞、及びヘミ接合性に標的化された細胞を含む複合ヘテロ接合性に標的化された細胞）をもたらす。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に対応する修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路（非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ））を介して行われる。Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端同士を直接ライゲーションすること、または切断末端を外来配列に直接ライゲーションすることによる、核酸内における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非連続配列のライゲーションは多くの場合、二本鎖切断部位付近の欠失、挿入または転座をもたらし得る。
外来修復テンプレートが関与する標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間における任意の遺伝情報交換プロセスを含んでいてもよい。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外来修復テンプレートの末端に直接ライゲーションすること（すなわち、ＮＨＥＪに基づいた補足）による、外来修復テンプレートの標的導入をもたらし得る。このようなＮＨＥＪ介在性標的導入は、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に利用可能ではない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、及び相同性に基づいたＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）、外来修復テンプレートの挿入に好ましい場合がある。加えて、相同組換え修復とは対照的に、開裂部位前後における広い領域の配列同一性（Ｃａｓ媒介開裂により生成されたオーバーハングを越える）に関する情報（ゲノム配列情報が限られたゲノムを有する生物への標的挿入を試みる場合に有用であり得る）は必要ではない。導入は、Ｃａｓタンパク質によって生成された開裂ゲノム配列内のオーバーハングと適合性のあるオーバーハングに隣接する外来修復テンプレートを使用して、外来修復テンプレートと開裂ゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションにより、または、付着末端（すなわち、５´または３´オーバーハングを有する）のライゲーションにより、進行し得る。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、及びＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。平滑末端をライゲートする場合、フラグメントの結合に必要なマイクロホモロジー領域を生成するために標的及び／またはドナーの切断が必要となる場合があり、それにより、標的配列内に不必要な改変が生成され得る。
修復はまた、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）により行われ得る。ＨＤＲまたはＨＲはヌクレオチド配列相同性を必要とし得る核酸修復形態を含み、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けた分子）を修復するためのテンプレートとしての「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらす。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、このような移行は、切断標的とドナーの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、及び／または、ドナーを使用して標的の一部となる遺伝情報を再合成する合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、及び／または、関連プロセスを伴い得る。一部の例においては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、または、ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡ内に導入される。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
目的の外来標的抗原に対する寛容が抑制された非ヒト動物を作製するために、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原とエピトープを共有する自己抗原の発現に影響を及ぼす１つまたは複数の標的ゲノム遺伝子座を標的として、自己抗原の発現を抑制してもよい。自己抗原の発現を排除することが好ましい。自己抗原がもはや発現されなくなった場合（例えば、自己抗原がタンパク質である場合、タンパク質がもはや発現されなくなる、または、自己抗原がタンパク質上の特定のエピトープである場合、エピトープを含むタンパク質がもはや発現されなくなる）、自己抗原の発現は排除されたとみなされる。
１つの例では、１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞）のゲノムを、Ｃａｓタンパク質、標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ、及び、標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させてもよい。別の例では、非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを、Ｃａｓタンパク質、標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡ、及び、標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させてもよい。
本明細書で提供する一部の方法では、標的となる細胞は、本明細書中の他の箇所で定義するハイブリッド細胞である。このような方法はまた、本明細書中の他の箇所で説明する標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択することを含んでいてもよい。標的ゲノム遺伝子座または標的ゲノム遺伝子座の残部におけるその他のセグメントと比較して、標的領域が相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の高いパーセンテージの配列同一性を有するように、標的領域を選択してもよい。一例として、標的領域の選択は、標的ゲノム遺伝子座内の相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の配列を比較して、標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する標的領域を選択すること、を含んでいてもよい。標的領域を選択するための方法については、本明細書中の他の箇所においてより詳細に記載されている。
任意選択的に、ゲノムを、標的ゲノム遺伝子座内の（または、自己抗原の発現に影響を及ぼす、または目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第２の自己抗原の発現に影響を及ぼす、第２の標的ゲノム遺伝子座内の）ガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする別のガイドＲＮＡと更に接触させてもよく、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、または、標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ及び第４のガイドＲＮＡなどである。接触は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを、本明細書中の他の箇所において更に詳細に記載している任意の形態で、また任意の方法で、細胞に導入することを含んでいてもよい。ガイドＲＮＡはＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を標的ゲノム遺伝子座のガイドＲＮＡ認識配列に誘導し、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ認識配列内のＣａｓタンパク質開裂部位において標的ゲノム遺伝子座を開裂させる。Ｃａｓタンパク質で開裂させることで、二本鎖切断または一本鎖切断が生成され得る（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合）。本方法に使用可能なＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの例及びバリエーションについては、本明細書中の他の箇所に記載している。Ｃａｓタンパク質で標的ゲノム遺伝子座を開裂させることで、標的ゲノム遺伝子座が第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、自己抗原の発現を抑制する二対立遺伝子改変が生成され得る。
目的の外来抗原は、抗原結合タンパク質が望まれる任意の外来抗原であってもよい。例えば、目的の外来抗原は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、哺乳動物タンパク質、サルタンパク質、イヌタンパク質、ネコタンパク質、ウマタンパク質、ウシタンパク質、げっ歯類タンパク質（例えば、ラットまたはマウス）、またはヒトタンパク質の全てまたは一部を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。例えば、目的の外来抗原は、１つまたは複数の変異または変化を有するヒトタンパク質を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。目的の外来抗原、及び自己抗原は、相同であってもよい。例えば、目的の外来抗原、及び自己抗原は、オルソロガスまたはパラロガスであってもよい。代替的にまたは加えて、目的の外来抗原、及び自己抗原は、共有エピトープを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。共有エピトープは相同タンパク質間に存在していてもよく、または、相同ではない異なるタンパク質間に存在していてもよい。エピトープの直鎖アミノ酸配列及び／または構造適合性（例えば、一次配列相同性がない状態であっても類似した抗原表面）の一方を共有していてもよい。例えば、共有エピトープは、実質的に同一なエピトープを含む。エピトープが２つの抗原間で共有されている場合、第１の抗原上のエピトープに対する抗体は通常、第２の抗原上のエピトープにも結合する。
接触は、標的ゲノム遺伝子座と組換えを起こして標的遺伝子改変を生成する外来修復テンプレートの不在下または外来修復テンプレートの存在下で実施可能である。例えば、細胞は１細胞期胚であってもよく、外来修復テンプレートは５ｋｂ長未満であってもよい。外来修復テンプレートの例については、本明細書中の他の箇所に記載されている。
一部のこのような方法では、外来修復テンプレートによる標的核酸の修復は、相同組換え修復（ＨＤＲ）により行われる。相同組換え修復は、Ｃａｓタンパク質が標的ゲノム遺伝子座におけるＤＮＡの両方の鎖を開裂させて二本鎖切断を生成するとき、Ｃａｓタンパク質が標的ゲノム遺伝子座におけるＤＮＡの１本の鎖を開裂させて一本鎖切断を生成するニッカーゼである場合、または、対のＣａｓニッカーゼを使用して２つのオフセットニックにより形成された二本鎖切断を生成するとき、実施可能である。このような方法では、外来修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座の５´標的配列及び３´標的配列に対応する５´ホモロジーアーム及び３´ホモロジーアームを含む。ガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位は、５´標的配列に隣接していてもよく、３´標的配列に隣接していてもよく、５´標的配列と３´標的配列の両方に隣接していてもよく、または、５´標的配列にも３´標的配列にも隣接していなくてもよい。互いに隣接する配列は、互いに約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１、０００ヌクレオチド以内の配列を含む。任意選択的に、外来修復テンプレートは、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを更に含んでいてもよく、核酸インサートは、５´標的配列と３´標的配列の間に挿入される。核酸インサートが存在しない場合、外来修復テンプレートは、５´標的配列と３´標的配列の間のゲノム配列を除去するように機能し得る。
代替的に、外来修復テンプレートによる標的核酸の修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）介在性ライゲーションにより行われ得る。このような方法では、外来修復テンプレートの少なくとも１つの末端は、標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓ媒介開裂により生成された少なくとも１つのオーバーハングに対して相補的な短い一本鎖領域を含む。外来修復テンプレート内の相補的末端は、核酸インサートに隣接していてもよい。例えば、外来修復テンプレートのそれぞれの末端は、標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓ媒介開裂により生成されたオーバーハングに対して相補的な短い一本鎖領域を含んでいてもよく、外来修復テンプレート内のこれら相補領域は、核酸インサートに隣接していてもよい。オーバーハング（すなわち、付着末端）は、Ｃａｓ媒介開裂により生成された二本鎖切断の平滑末端の切断により生成されてもよい。このような切断によりフラグメント結合に必要なマイクロホモロジー領域が生成され得るが、このことにより、標的核酸内に不必要または制御不能な改変が生成され得る。代替的に、対のＣａｓニッカーゼを使用することで、このようなオーバーハングを生成してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合、標的ゲノム遺伝子座を、ＤＮＡの相対する鎖を標的とする第１及び第２のガイドＲＮＡと接触させてもよく、それにより、ダブルニッキングを介してゲノムが改変される。このことは、標的ゲノム遺伝子座を、標的ゲノム遺伝子座内の異なるガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする２つのガイドＲＮＡと接触させることにより実施可能である。２つのガイドＲＮＡはＣａｓニッカーゼと２つの複合体を形成し、Ｃａｓニッカーゼは、一方のガイドＲＮＡ認識配列内の標的ゲノム遺伝子座の第１の鎖にニックを生じさせ、もう一方のガイドＲＮＡ認識配列内の標的ゲノム遺伝子座の第２の鎖にニックを生じさせる。それから、外来修復テンプレートが標的ゲノム遺伝子座と組換えを起こして標的遺伝子改変を生成する。
一部の方法では、核酸インサートは、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部に対して相同またはオルソロガスな配列を含む。このことは、例えば、自己抗原のノックアウトが胚の致死をもたらし得る場合に有用となり得る。核酸インサートは、本明細書に記載する任意の形態（例えば、標的化ベクター、ＬＴＶＥＣ、ｓｓＯＤＮなど）で外来修復テンプレート内にあってもよく、核酸インサートは、選択カセット（例えば、自己欠失選択カセット）を更に含んでいてもよく、または、選択カセットを欠いていてもよい。このような方法では、例えば、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を欠失させて対応する相同配列またはオルソロガス配列で置換してもよい。例えば、自己抗原をコードする遺伝子の全てを欠失させて対応する相同配列またはオルソロガス配列で置換してもよく、または、自己抗原の特定のモチーフまたは領域をコードする遺伝子の一部を欠失させて対応する相同配列またはオルソロガス配列で置換してもよい。任意選択的に、対応する相同配列またはオルソロガス配列は別の種由来であってもよい。例えば、自己抗原がマウス抗原である場合、対応する相同配列またはオルソロガス配列は、例えば、相同またはオルソロガスな、ラット、ハムスター、ネコ、イヌ、カメ、キツネザルまたはヒトの配列であってもよい。代替的にまたは加えて、相同配列またはオルソロガス配列は、置換された配列と比較して、１つまたは複数の点変異（例えば、１、２、３、４、５つまたはそれ以上）を含んでいてもよい。このような点変異は、例えば、自己抗原内の１つまたは複数のエピトープの発現を排除するように機能してもよい。このようなエピトープは、目的の外来抗原と共有するエピトープであってもよい。任意選択的に、このような点変異は、コードポリペプチド内における保存的アミノ酸置換（例えば、アスパラギン酸［Ａｓｐ，Ｄ］のグルタミン酸［Ｇｌｕ，Ｅ］への置換）をもたらし得る。このようなアミノ酸置換は、野生型自己抗原の機能を維持しているが目的の外来抗原上に存在し野生型自己抗原と共有するエピトープを欠いている自己抗原の発現をもたらし得る。同様に、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を欠失させて、目的の外来抗原と自己抗原の間で共有されたエピトープを欠く対応する相同配列またはオルソロガス配列で置換することにより、野生型自己抗原の機能を維持しているが目的の外来抗原上に存在し野生型自己抗原と共有するエピトープを欠いている自己抗原の相同体またはオルソログの発現がもたらされ得る。その後、それらエピトープに対する抗原結合タンパク質を作製してもよい。
それから、本明細書中の他の箇所に記載する方法を用い、改変非ヒト動物多能性細胞を使用して遺伝子組換え非ヒト動物を作製してもよい。例えば、改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入してもよく、宿主胚を代理母に移植して、自己抗原の発現が抑制または排除されるように、標的ゲノム遺伝子座が第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて二対立遺伝子改変を有する遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製してもよい。１細胞期胚の例においては、遺伝子組換え胚を選択してから、代理母に移植して、自己抗原の発現が抑制または排除されるように、標的ゲノム遺伝子座が第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて二対立遺伝子改変を有する遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製してもよい。それから、本明細書中の他の箇所に記載する方法を用い、Ｆ０世代非ヒト動物を使用して目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を作製してもよい。
Ａ．標的領域の選択
外来修復テンプレート（例えば、標的化ベクター）と標的ゲノム遺伝子座の間の相同組換えによる標的遺伝子改変は、特にげっ歯類胚性幹細胞以外の細胞型において極めて非効率的な場合がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導開裂による１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断の誘導は、外来修復テンプレート（例えば、標的化ベクター）と標的ゲノム遺伝子座の間の相同組換え（ＨＲ）によるホモ接合性の標的遺伝子組換えを促進し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９はまた、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復機構による、ホモ接合性の挿入変異または欠失変異（すなわち、同一の二対立遺伝子改変）を促進し得る。極めて大規模なヒト化を伴う遺伝子改変のために、標的化ベクターを、単一標的ゲノム遺伝子座を標的とする２つのガイドＲＮＡによりガイドされるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムと組み合わせることにより、１つのガイドＲＮＡで達成する以上に標的化効率を更に向上させることができる。１つのガイドＲＮＡを用いた標的化（低頻度で二対立遺伝子改変を生成する、または全く生成しない）と比較して、２つのガイドＲＮＡを用いた標的化は、極めて高い比率でホモ接合性に標的化された細胞、ホモ接合性に欠失した細胞、及び複合ヘテロ接合性に標的化された細胞（ヘミ接合性に標的化された細胞を含む）の生成をもたらす。しかしながら、一部のゲノム遺伝子座において、ホモ接合性標的細胞またはホモ接合性欠失細胞を得ることは依然として困難な場合がある。
ラボ環境で通常使用される近交系のマウス系統及びラット系統（事実上それらのゲノム遺伝子座の全てにおいてホモ接合性）とは異なり、ハイブリッド細胞（例えば、全てヒトの）内の標的ゲノム遺伝子座における２つの対立遺伝子の配列は通常、１００％同一性とはならない。しかしながら、本明細書で提供する実施例において示すように、ホモ接合性ゲノム改変の頻度は、最初のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導改変がＨＲにより生成されるかまたはＮＨＥＪにより生成されるかにかかわらず、標的ゲノム遺伝子座における２つの対立遺伝子間の配列類似性の程度に依存する。この所見は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導ホモ接合性遺伝子改変が相同性に依存する現象であることを示している。このことを裏付けるものとして、本明細書の実施例において示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導ホモ接合性改変は多くの場合、対立遺伝子配列におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）、及び、同一染色体上の標的ゲノム遺伝子座に結合した構造多型（一塩基多型（ＳＮＶ）または構造多型（ＳＶ））を伴う。ＬＯＨは、片方の標的ゲノム遺伝子座上における変異体の局所的な遺伝子変換機構、または、標的ゲノム遺伝子座のテロメア側上における全ての変異体を含む広範囲の遺伝子変換（極性遺伝子変換）のいずれかを伴い得る。このような遺伝子変換事象は、相同性駆動有糸分裂組換え機構によるものであるに違いない。
この知見は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ホモ接合性標的化実験を設計するためのガイダンスを提供する。２つの対立遺伝子が高度な配列同一性を共有する標的領域を選択することにより、成功の可能性が最大となる。２つの対立遺伝子間の高度な配列相違を有する標的領域におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ホモ接合性標的化はほとんど成功しないようである。高密度のＳＮＶ及びＳＶを有する遺伝子座であっても、標的ゲノム遺伝子座内の連続対立遺伝子配列同一性の最長可能ストレッチ内の配列、または、対立遺伝子配列同一性が最大化された標的ゲノム遺伝子座のストレッチ内の配列を認識するガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼ試薬の使用により、成功率は向上し得る。
本明細書に記載の方法は、相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の標的領域の全てまたは一部において配列同一性が最大化され得るように、標的領域を選択することを含んでいてもよい。ハイブリッド細胞において、相同染色体対の一方のコピー上の配列は通常、染色体対のもう一方のコピーと比較したとき若干の差異（例えば、一塩基多型）を有している。それゆえ、このような方法は、標的ゲノム遺伝子座内の相同染色体対（例えば、ヒト細胞は２３の相同染色体対を有している）の対応する第１の染色体と第２の染色体の配列を比較してから、相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の標的領域の全てまたは一部において配列同一性が最大化されるように、標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択することを含んでいてもよい。利用可能な配列がない場合、このような方法は、配列を比較する前に、相同染色体対内のそれぞれの単一染色体上の標的ゲノム遺伝子座をシークエンシングすることを更に含んでいてもよい。
標的領域は、例えば、本明細書で開示する方法における２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡのうちの１つまたは１つまたは複数の外来修復テンプレートが標的とする任意のセグメントまたは領域、または、本明細書で開示する方法における２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡのうちの１つまたは１つまたは複数の外来修復テンプレートが標的とするセグメントまたは領域に隣接する任意のセグメントまたは領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。標的領域は連続ゲノム配列または非連続ゲノム配列であってもよい。例えば、標的領域は、本明細書で開示する方法による欠失の標的となるゲノムセグメントまたは領域、置換の標的となるゲノムセグメントまたは領域、または、挿入の標的となるゲノムセグメントまたは領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、及び／または、本明細書で開示する方法による欠失、置換または挿入の標的となるゲノムセグメントまたはゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。好ましくは、標的領域は、本明細書で開示する方法による欠失、置換または挿入の標的となる領域のすぐ上流の配列及び／またはすぐ下流の配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる（例えば、２つのガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位間の領域の上流及び／または下流の配列、または、外来修復テンプレートの５´標的配列と３´標的配列の間の領域の上流及び／または下流の配列）。一例として、２つのガイドＲＮＡを使用する場合、標的領域は、ガイドＲＮＡ認識配列またはＣａｓ開裂部位間の領域に隣接する５´（すなわち、上流）及び３´（すなわち、下流）の配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。隣接配列の長さの例については本明細書中の他の箇所に開示されている。
一部の方法では、例えば、外来修復テンプレートを最初に設計してもよく、それから、外来修復テンプレートの５´標的配列と３´標的配列に隣接する領域内にガイドＲＮＡを設計して、ガイドＲＮＡ認識配列内及び／または隣接する（５´側、３´側または両側）（例えば、２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを使用する場合、最も離れた２つのガイドＲＮＡ認識配列間の領域に隣接する）領域の配列同一性を最大化させてもよい。代替的に、一部の方法では、例えば、２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを最初に設計してもよく、それから、５´標的配列及び３´標的配列が２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡ認識配列に隣接するように、５´標的配列及び３´標的配列内及び／または隣接する（５´側、３´側または両側）（例えば、５´標的配列と３´標的配列の間の領域に隣接する）領域における配列同一性が最大化されるように、外来修復テンプレートを設計してもよい。
一例として、標的領域は、２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡのうちの１つのためのガイドＲＮＡ認識配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。代替的にまたは加えて、標的領域は、ガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
別の例では、標的領域は、２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡ認識配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。代替的にまたは加えて、標的領域は、ガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、例えば、標的領域は、２つのガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位に隣接するゲノム領域、または、２つのガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位に隣接及び含有するゲノム領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。代替的にまたは加えて、標的領域は、２つのガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位間の領域に隣接する５´配列及び／または３´配列、または、２つのガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位間の領域及び２つのガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位を含む領域に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。２つのガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位に隣接する上記のゲノム領域の代わりに、最も離れた開裂部位のガイドＲＮＡ認識配列に隣接するゲノム領域であろう場合を除いて、３つ以上のガイドＲＮＡを使用する方法に類似の標的領域を選択してもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
外来修復テンプレートを使用する方法では、例えば、標的領域は、５´標的配列と３´標的配列に隣接する領域、または、５´標的配列と３´標的配列に隣接及び含有する領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。代替的にまたは加えて、標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列、または、５´標的配列と３´標的配列の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
対立遺伝子配列同一性は、標的領域の全てにおいてまたは標的領域の一部において最大化されてもよい。一例として、対立遺伝子配列同一性は、少なくとも１つのまたはそれぞれのガイドＲＮＡ認識配列に相当するゲノム領域において、または、少なくとも１つのまたはそれぞれのガイドＲＮＡ認識配列を含む領域において最大化されてもよい。例えば、対立遺伝子配列同一性は、少なくとも１つのまたはそれぞれのガイドＲＮＡ認識配列において最大化されてもよい。代替的に、対立遺伝子配列同一性は、少なくとも１つのまたはそれぞれのガイドＲＮＡ認識配列において、及び少なくとも１つのまたはそれぞれのガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列において最大化されてもよい。代替的に、対立遺伝子配列同一性は、少なくとも１つのまたはそれぞれのガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列において最大化されてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
代替的にまたは加えて、対立遺伝子配列同一性は、外来修復テンプレート用の５´標的配列及び／または３´標的配列に相当するゲノム領域において、または、５´標的配列と３´標的配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれを含む領域において最大化されてもよい。例えば、対立遺伝子配列同一性は、５´標的配列と３´標的配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれにおいて最大化されてもよい。代替的に、対立遺伝子配列同一性は、５´標的配列と３´標的配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれにおいて、及び５´標的配列と３´標的配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれに隣接する５´配列及び／または３´配列において最大化されてもよい。代替的に、対立遺伝子配列同一性は、５´標的配列と３´標的配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれに隣接する５´配列及び／または３´配列において最大化されてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
代替的にまたは加えて、対立遺伝子配列同一性は、欠失、置換または挿入の標的となる領域に隣接する配列において最大化されてもよい。例えば、２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、対立遺伝子配列同一性は、２つの開裂部位または２つのガイドＲＮＡ認識配列間の領域に隣接する５´配列及び／または３´配列において最大化されてもよい。３つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを使用する方法では、対立遺伝子配列同一性は、最も離れた２つの開裂部位または２つのガイドＲＮＡ認識配列間の領域に隣接する５´配列及び／または３´配列において最大化されてもよい。別の例における外来修復テンプレートを使用する方法では、対立遺伝子配列同一性は、外来修復テンプレート用の５´標的配列と３´標的配列の間の領域（すなわち、外来修復テンプレートによる欠失の標的となるゲノム領域）に隣接する５´配列及び／または３´配列において最大化されてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の標的領域の全てまたは一部において配列同一性が最大化されるように標的領域を選択することは、相同染色体対の第１の染色体と第２の染色体上の標的ゲノム遺伝子座を調べてから、標的ゲノム遺伝子座の残部と比較して最も高い対立遺伝子配列同一性を有する領域を選択することを必ずしも意味せず、その代わりにその他の因子を考慮に入れてもよい。例えば、標的領域が、１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列及び／または１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列に隣接する配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる場合、考慮に入れてもよいその他の因子としては、例えば、どの推定上のガイドＲＮＡ認識配列が領域内に位置しているか、推定上のガイドＲＮＡ認識配列が固有であるかどうか、推定上のガイドＲＮＡ認識配列がどの領域内に位置しているか、領域内における推定上のガイドＲＮＡ認識配列をどのように成功裏または正確に予測するか、領域内における推定上のガイドＲＮＡ認識配列をどのように成功裏または正確に外来修復テンプレート用の好適な５´標的配列及び３´標的配列に近接させるか、領域内における推定上のガイドＲＮＡ認識配列をどのように成功裏または正確にその他の推定上のガイドＲＮＡ認識配列に近接させるか、領域内における推定上のガイドＲＮＡ認識配列をどのように成功裏または正確に修復の標的となる変異に近接させるか、などが挙げられる。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、ゲノム内の他の箇所には存在しない固有の標的部位であることが好ましい。例えば、ＵＳ２０１４／０１８６８４３を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。同様に、ガイドＲＮＡの特異性は、ＧＣ含有量及び標的化配列の長さに関係してそれらを変化させることにより最適化してもよく、ガイドＲＮＡのオフターゲット結合または相互作用を最小限に抑えるガイドＲＮＡ標的化配列を設計または評価するためのアルゴリズムが利用可能である。例えば、ＷＯ２０１６／０９４８７２を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。一部の方法では、異なる種由来のＣａｓ９タンパク質を検討または使用して（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９及びＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９）、利用可能なＰＡＭ配列数の増加により潜在的なガイドＲＮＡ認識配列数を増加させてもよい。
１つの例では、標的領域の全てまたは一部が相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の高いパーセンテージの配列同一性を有するように標的領域を選択してもよい。例えば、標的領域の全てまたは一部が相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の最低パーセンテージの配列同一性、少なくとも９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．５５％、９９．６％、９９．６５％、９９．７％、９９．７５％、９９．８％、９９．８５％、９９．９％、９９．９５％または１００％の配列同一性などを有するように標的領域を選択してもよい。
別の例では、標的領域の全てまたは一部が相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の少ない数または低密度の一塩基多型を有するように標的領域を選択してもよい。例えば、標的領域の全てまたは一部が相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の最大密度、配列のｋｂあたり５、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下またはゼロなどの一塩基多型を有するように標的領域を選択してもよい。
任意選択的に、標的領域は、相同染色体対の対応する第１及び第２の染色体において同一であってもよい。任意選択的に、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座内の連続配列同一性の最長可能ストレッチ内に存在していてもよい。
代替的にまたは加えて、標的ゲノム遺伝子座内のその他の領域と比較して、標的領域の全てまたは一部が高いパーセンテージの配列同一性または相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間の少ない数もしくは低密度の一塩基多型を有するように標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択してもよい。
例えば、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、より高いパーセンテージの配列同一性またはより低密度の一塩基多型を有していてもよい。例えば、標的領域は、対応する第１の相同染色体と第２の相同染色体の間の少なくとも９９．９％の配列同一性を有していてもよく、標的ゲノム遺伝子座の残部は、対応する第１の染色体と第２の染色体の間の９９．８％以下の配列同一性を有する。
例えば、標的領域は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列に相当する１つまたは複数の標的ゲノム領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列に相当するゲノム領域などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。１つの例では、標的領域は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。別の例では、標的領域は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれ、及び１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれに隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列及びそれらの５´隣接配列及び／または３´隣接配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。更に別の例では、標的領域は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ認識配列のうちの少なくとも１つまたはそれぞれに隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列の５´隣接配列及び／または３´隣接配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列に相当する第１の標的ゲノム領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、及び／または、第２のガイドＲＮＡ認識配列に相当する第２の標的ゲノム領域内にあってもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列に相当するゲノム領域などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。例えば、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。別の例では、標的領域は、高いパーセンテージの第１のガイドＲＮＡ認識配列及び第１のガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列及び第２のガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列及びそれらの５´隣接配列及び／または３´隣接配列に相当するゲノム領域などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。更に別の例では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他の潜在的なガイドＲＮＡ認識配列に隣接する５´配列及び／または３´配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
それゆえ、標的領域を選択するのに１つのガイドＲＮＡを検討する方法では、例えば、標的領域の選択は、標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、ゲノム内の他の箇所には存在しない異なるガイドＲＮＡ認識配列、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有するセグメントを標的領域として選択すること、を含む。２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを使用する場合、方法は、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する２つまたはそれ以上のセグメントを標的領域として選択することを含んでいてもよい。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、標的ゲノム遺伝子座内のそれぞれのガイドＲＮＡ認識配列に相当するがゲノム内の他の箇所には存在しないセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。
代替的にまたは加えて、２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間または第１の開裂部位と第２の開裂部位の間の領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他のペアの潜在的なガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位の間の領域などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。３つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを使用する場合、関連領域は、最も離れた２つのガイドＲＮＡ認識配列または２つの開裂部位の間の領域であるだろう。
それゆえ、２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、例えば、標的領域の選択は、標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有するセグメントを標的領域として選択すること、を含んでいてもよい。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当するセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
代替的にまたは加えて、２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間または第１の開裂部位と第２の開裂部位の間の領域、及び第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間または第１の開裂部位と第２の開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他のペアの潜在的なガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位の間の領域、及び１つまたは複数のその他のペアの潜在的なガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。好ましくは、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間または第１の開裂部位と第２の開裂部位の間のゲノム領域、及び第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列または第１の開裂部位と第２の開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他のペアの潜在的なガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位の間の領域、及び１つまたは複数のその他のペアの潜在的なガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び３´配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。３つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを使用する場合、関連領域は、最も離れた２つのガイドＲＮＡ認識配列または２つの開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列であるだろう。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
それゆえ、２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、例えば、標的領域の選択は、標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上のセグメントを比較して（それぞれのセグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他のセグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有するセグメントを標的領域として選択すること、を含んでいてもよい。任意選択的に、１つまたは複数のセグメントは、標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当するセグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
代替的にまたは加えて、２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間または第１の開裂部位と第２の開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他のペアの潜在的なガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。好ましくは、標的領域は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間または第１の開裂部位と第２の開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメント、例えば、標的ゲノム遺伝子座内の１つまたは複数のその他のペアの潜在的なガイドＲＮＡ認識配列または開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び３´配列などと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。３つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを使用する場合、関連領域は、最も離れた２つのガイドＲＮＡ認識配列または２つの開裂部位の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列であるだろう。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
それゆえ、２つのガイドＲＮＡを使用する方法では、例えば、標的領域の選択は、標的ゲノム遺伝子座の２つまたはそれ以上の非連続セグメントを比較して（それぞれの非連続セグメントは、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間の領域、及び、異なるガイドＲＮＡ認識配列ペア間のゲノム領域の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂまたは１５０ｋｂの隣接配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない）、その他の非連続セグメントと比較して最も高いパーセンテージの配列同一性を有する非連続セグメントを標的領域として選択すること、を含んでいてもよい。任意選択的に、１つまたは複数の非連続セグメントは、標的ゲノム遺伝子座内にそれぞれの異なるガイドＲＮＡ認識配列ペアに相当する非連続セグメントを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなり、ガイドＲＮＡ認識配列はゲノム内の他の箇所には存在しない。
外来修復テンプレートを使用する方法では、標的領域は、５´標的配列と３´標的配列の間の領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。代替的にまたは加えて、標的領域は、５´標的配列及び／または３´標的配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。好ましくは、標的領域は、５´標的配列及び３´標的配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。例えば、標的領域は、５´標的配列と３´標的配列に隣接及び含有する領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。
同様に、外来修復テンプレートを使用する方法では、標的領域は、外来修復テンプレートの５´標的配列と３´標的配列の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列、または、外来修復テンプレートの５´標的配列及び３´標的配列間のゲノム領域及び外来修復テンプレートの５´標的配列及び３´標的配列を含むゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。好ましくは、標的領域は、外来修復テンプレートの５´標的配列と３´標的配列の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び３´配列、または、外来修復テンプレートの５´標的配列及び３´標的配列間のゲノム領域及び外来修復テンプレートの５´標的配列及び３´標的配列を含むゲノム領域に隣接する５´配列及び３´配列内の５´配列及び３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。代替的に、標的領域は、外来修復テンプレートの５´標的配列と３´標的配列の間の領域、及び５´標的配列と３´標的配列の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び／または３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。好ましくは、標的領域は、外来修復テンプレートの５´標的配列と３´標的配列の間の領域、及び５´標的配列と３´標的配列の間のゲノム領域に隣接する５´配列及び３´配列を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、標的領域は、標的ゲノム遺伝子座のその他のセグメントと比較して、高いパーセンテージの配列同一性または低密度の一塩基多型を有していてもよい。５´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。同様に、３´隣接配列は、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｂｐの隣接配列、または、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｋｂの隣接配列であってもよい。
本明細書で開示する方法により改変した標的領域は、細胞内のＤＮＡにおける任意のセグメントまたは領域（連続または非連続）を含んでいてもよい。標的領域は、細胞由来であってもよく、細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種または外来セグメントであってもよく、または、これらの組み合わせであってもよい。このようなＤＮＡの異種または外来セグメントとしては、導入遺伝子、発現カセット、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、または、ゲノムＤＮＡの異種または外来領域を挙げることができる。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
本明細書で開示する方法は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム、または細胞内のゲノムを改変するためのこのようなシステムの構成要素を利用している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ遺伝子の発現またはＣａｓ遺伝子の活性誘導に関与する転写産物及びその他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のシステムであってもよい。代替的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、Ｖ型システム（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であってもよい。本明細書で開示する方法及び組成物は、核酸の部位特異的開裂にＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを採用している。
本明細書で開示する方法に使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは非天然である。「非天然」システムは、人間の手の関与を示す全て、例えば、構成要素の天然状態から変化または変異した、構成要素が実際に自然に結合する少なくとも１つのその他の構成要素を少なくとも実質的に含まない、または、構成要素が自然に結合しない少なくとも１つのその他の構成要素と関連する、１つまたは複数のシステム構成要素などを含む。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、共に自然に生じないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む非天然ＣＲＩＳＰＲ複合体を採用している。その他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは自然に生じないＣａｓタンパク質を採用しており、またその他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは自然に生じないｇＲＮＡを採用している。
（１）Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質は通常、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、以下でより詳細に説明する）と相互作用可能な、少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及びその他のドメインを含んでいてもよい。ヌクレアーゼドメインは核酸開裂のための触媒活性を有し、触媒活性には核酸分子における共有結合の切断が含まれる。開裂により平滑末端または付着末端が生成されてもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は通常、平滑な開裂産物を生成する。代替的に、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖上のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後方及び標的鎖上の２３番目の塩基の後方で生じる開裂により、５ヌクレオチド５´オーバーハングを有する開裂産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、標的核酸内の二本鎖切断（例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断）を生成するための完全な開裂活性を有していてもよく、または、標的核酸内の一本鎖切断を生成するニッカーゼであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６、ならびに、その相同体または修飾型が挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、またはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するＣａｓ９タンパク質から誘導したタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来しており、通常は、保存構造を有する４つのキーモチーフを共有している。モチーフ１、２及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、または、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来である。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例については、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２で登録）は例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（Ｓａ Ｃａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｊ７ＲＵＡ５で登録）は別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ０Ｐ８９７で登録）は別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１４５００を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。
Ｃａｓタンパク質の別の例はＣｐｆ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに対して相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインに加えて、Ｃａｓ９の固有アルギニンリッチクラスターの同等物を含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質内に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長いインサートを含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインはＣｐｆ１配列内において連続している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ０Ｑ７Ｑ２で登録）は例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然に存在するタンパク質）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質変異体）、または野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関与する活性変異体またはフラグメントであってもよい。触媒活性に関与する活性変異体またはフラグメントは、野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質またはその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含んでいてもよく、活性変異体は所望の開裂部位で切断する機能を維持しており、それゆえ、ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を維持している。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性のアッセイは周知であり、通常は、開裂部位を含有するＤＮＡ基質上におけるＣａｓタンパク質の全体活性及びを特異性を測定する。
修飾Ｃａｓタンパク質の１つの例は、非特異的なＤＮＡ接触を抑制するように設計された改変を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のハイファイ変異体（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）である、修飾ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を抑制するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９変異体（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。その他のＳｐＣａｓ９変異体としては、Ｋ８５５Ａ及びＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質を修飾して、核酸の結合親和性、核酸の結合特異性及び酵素活性のうちの１つまたは複数を上昇または低下させてもよい。またＣａｓタンパク質を修飾して、タンパク質の任意のその他の活性または性質、例えば、安定性などを変化させてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを修飾、欠失または不活性化してもよく、または、Ｃａｓタンパク質をトランケートして、タンパク質の機能に不可欠ではないドメインを除去、または、Ｃａｓタンパク質の活性を最適化（例えば、向上または抑制）してもよい。
Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン、例えば、ＤＮａｓｅドメインなどを含んでいてもよい。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は通常、標的ＤＮＡの両方の鎖を開裂させるＲｕｖＣ様ドメイン（おそらく二量体構造で）を含んでいる。Ｃａｓタンパク質はまた、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン、例えば、ＤＮａｓｅドメインなどを含んでいてもよい。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は通常、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含んでいる。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡ内に二本鎖切断を生成することができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
ヌクレアーゼドメインの一方または両方を、それらがもはや機能しなくなるようにまたはヌクレアーゼ活性が抑制されるように、欠失または変異させてもよい。ヌクレアーゼドメインのうちの一方が欠失または変異している場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）はニッカーゼと呼ばれてもよく、二本鎖ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列に一本鎖切断を生成できるが、二本鎖切断は生成できない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を開裂させることはできるが、両方は不可能である）。両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異している場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルＣａｓタンパク質）を開裂させるための低い機能を有することになる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の一例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメイン内におけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９のＨＮＨドメイン内におけるＨ９３９Ａ（８３９位のアミノ酸におけるヒスチジンからアラニンへの）、またはＨ８４０Ａ（８４０位のアミノ酸におけるヒスチジンからアラニンへの）またはＮ８６３Ａ（Ｎ８６３位のアミノ酸におけるアスパラギンからアラニンへの）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異のその他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９に対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９２７５－９２８２、及びＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲによる変異誘発または全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを生成するその他の変異の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２及びＷＯ２０１３／１４２５７８に見出すことができる（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ヌクレアーゼドメインの全てがＣａｓタンパク質内で欠失または変異している（例えば、ヌクレアーゼドメインの両方がＣａｓ９タンパク質内で欠失または変異している）場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を開裂させるための低い機能を有することになる。１つの特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異、または、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に最適にアラインした場合の別種由来のＣａｓ９内の対応する二重変異である。別の特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異、または、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に最適にアラインした場合の別種由来のＣａｓ９内の対応する二重変異である。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメイン内における不活性化変異の例もまた知られている。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を作製するために、Ｎ５８０位の置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）及びＤ１０位の置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含んでいてもよい。例えば、ＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメイン内における不活性化変異の例もまた知られている。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１タンパク質（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６由来のＣｐｆ１タンパク質（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１タンパク質（ＬｂＣｐｆ１）及びＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７由来のＣｐｆ１タンパク質（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）に関しては、このような変異は、ＡｓＣｐｆ１の９０８位、９９３位もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログ内の対応する位置における変異、または、ＬｂＣｐｆ１の８３２位、９２５位、９４７位もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログ内の対応する位置における変異を含み得る。このような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１のＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ及びＤ１２６３Ａの変異またはＣｐｆ１オルソログ内の対応する変異、または、ＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ及びＤ１１８０Ａの変異またはＣｐｆ１オルソログ内の対応する変異のうちの１つまたは複数を含み得る。例えば、ＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドと機能的に連結してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質を、開裂ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインと融合させることができる。ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。またＣａｓタンパク質を異種ポリペプチドと融合させて、安定性の向上または低下をもたらしてもよい。融合ドメインまたは融合異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端または内部に位置していてもよい。
Ｃａｓ融合タンパク質の一例は、細胞内局在をもたらす異種ポリペプチドに融合したＣａｓタンパク質である。このような異種ポリペプチドとしては、例えば、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、核を標的とするＳＶ４０ ＮＬＳ、ミトコンドリアを標的とするミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保留シグナルなどを挙げることができる。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１－５１０５を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。その他の好適なＮＬＳとしてはαインポーチンＮＬＳが挙げられる。このような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端または任意の場所に位置していてもよい。ＮＬＳは塩基性アミノ酸のストレッチを含んでいてもよく、１つの部分からなる配列または２つの部分からなる配列であってもよい。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、αインポーチンＮＬＳ）及び／またはＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）を含む２つまたはそれ以上のＮＬＳを含む。
Ｃａｓタンパク質はまた細胞貫通ドメインと機能的に連結してもよい。例えば、細胞貫通ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２由来のＴＬＭ細胞貫通モチーフ、単純ヘルペスウイルス由来の細胞貫通ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列から誘導することができる。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。細胞貫通ドメインは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端または任意の場所に位置していてもよい。
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易とするための異種ポリペプチド、例えば、蛍光タンパク質、精製タグまたはエピトープタグなどと機能的に連結してもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、青緑色蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙黄色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意のその他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓ９タンパク質をまた、外来修復テンプレートまたは標識核酸にテザリングしてもよい。このようなテザリング（すなわち、物理的連結）は共有結合相互作用または非共有結合相互作用を介して達成可能であり、テザリングは直接（例えば、タンパク質上のシステイン残基またはリシン残基の修飾またはインテイン修飾により達成可能な、直接融合または化学的コンジュゲートを介して）であってもよく、または、１つまたは複数の介在リンカーまたはアダプター分子（ストレプトアビジンまたはアプタマーなど）を介して達成可能である。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ． Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７；及び、Ｋｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合戦略としては、ビオチン－ストレプトアビジン法及びニッケル－ヒスチジン法が挙げられる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、多種多様な化学反応を使用して、官能化核酸をタンパク質と適切に連結させることにより合成可能である。これらの化学反応の一部は、タンパク質表面上のアミノ酸残基（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を伴い、その一方で、その他のより多くの複合体スキームは、タンパク質の翻訳後修飾、または、触媒性または反応性のタンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質を核酸に共有結合させるための方法としては、例えば、オリゴヌクレオチドをタンパク質のリシン残基またはシステイン残基に化学架橋させること、発現タンパク質ライゲーション、化学酵素法、及びフォトアプタマーの使用を挙げることができる。外来修復テンプレートまたは標識核酸を、Ｃａｓ９タンパク質内のＣ末端、Ｎ末端または内部領域にテザリングしてもよい。外来修復テンプレートまたは標識核酸をＣａｓ９タンパク質のＣ末端またはＮ末端にテザリングすることが好ましい。同様に、Ｃａｓ９タンパク質を、外来修復テンプレートまたは標識核酸内の５´末端、３´末端または内部領域にテザリングしてもよい。つまり、任意の方向及び極性で外来修復テンプレートまたは標識核酸をテザリングしてもよい。Ｃａｓ９タンパク質を外来修復テンプレートまたは標識核酸の５´末端または３´末端にテザリングすることが好ましい。
Ｃａｓタンパク質を任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の形態、例えば、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などで提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質を、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどで提供してもよい。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物内のタンパク質へと効率的に翻訳されるようにコドン最適化されていてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を修飾して、天然ポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、イースト菌、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意のその他の目的の宿主細胞においてより高頻度で使用されているコドンに置換してもよい。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞内で一時的に、条件的にまたは構成的に発現してもよい。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれてもよく、細胞内で活性化しているプロモーターと機能的に連結してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物内のプロモーターと機能的に連結してもよい。発現構築物は、目的の遺伝子またはその他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を誘導可能な任意の核酸構築物、及び、このような目的の核酸配列を標的細胞へと移行させることができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含む標的化ベクター内及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内にあってもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含む標的化ベクターから分離された及び／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターから分離された、ベクターまたはプラスミド内にあってもよい。発現構築物に使用可能なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つまたは複数において活性化しているプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってもよい。任意選択的に、プロモーターは、一方の方向へのＣａｓタンパク質の発現ともう一方の方向へのガイドＲＮＡの発現の両方の発現を誘導する二方向性プロモーターであってもよい。このような二方向性プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）及びＴＡＴＡボックスを含む、完全で通常で一方向性のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、及び（２）ＤＳＥの５´末端に逆方向で融合したＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを含む、第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなっていてもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスに隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを付加することにより逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作製することにより、プロモーターは二方向性となり得る。例えば、ＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。二方向性プロモーターを使用して、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、輸送を促進するコンパクトな発現カセットの作製が可能となる。
（２）ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合してそのＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置へと向かわせるＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント、「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を含んでいてもよい。「セグメント」は、分子の区画または領域、例えば、ＲＮＡ内におけるヌクレオチドの連続ストレッチなどを含む。一部のｇＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９のｇＲＮＡなどは、２つの独立したＲＮＡ分子：「活性化ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び「標的化ＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含んでいてもよい。その他のｇＲＮＡは単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれることもある。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、及びＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｃａｓ９において、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡ（例えば、リンカーを介して）を含んでいてもよい。例えば、Ｃｐｆ１において、ｃｒＲＮＡのみが標的配列への結合または開裂を達成する必要がある。用語「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」は、二重分子ｇＲＮＡ（すなわち、モジュールｇＲＮＡ）と単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」、または「標的化ＲＮＡ」、または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」、または「活性化ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖における一方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖におけるもう一方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチに対して相補的であり、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチにハイブリダイズしてｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。このように、それぞれのｃｒＲＮＡは対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われることもある。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とするシステムでは、ｃｒＲＮＡと対応するｔｒａｃｒＲＮＡはハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみを必要とするシステムでは、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。ｃｒＲＮＡは更に、ガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをもたらす。細胞内の修飾に使用する場合、任意のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子を使用する種に特異的となるように設計してもよい。例えば、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７－２２９；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９；及び、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
任意のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の配列（すなわち、ガイドＲＮＡ認識配列）に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的な様式で標的ＤＮＡと相互作用する。このように、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は様々であり得、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。本ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズさせるために改変してもよい。天然ｃｒＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び生物によって異なるが、多くの場合、２１～４６ヌクレオチド長の２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に隣接する２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含有している（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの例においては、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３´に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに対して相補的であり、対応するｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズして、更にはＣａｓタンパク質に結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、または、少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有していてもよい。このようなＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、または、約１２ヌクレオチド～約２０ヌクレオチドの長さを有していてもよい。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、または、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、もしくは、約２０ヌクレオチド）であってもよい。例えば、ＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９において、標準的なＤＮＡ標的化セグメントは１６～２０ヌクレオチド長または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９において、標準的なＤＮＡ標的化セグメントは２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１において、標準的なＤＮＡ標的化セグメントは少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長である。
ｔｒａｃｒＲＮＡは任意の形態（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な不完全ｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよく、また様々な長さであってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは一次転写産物またはプロセスされた形態を含んでいてもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部としての、または２分子ｇＲＮＡの一部である独立した分子としての）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、約または約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５超もしくはそれ以上のヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）の全てまたは一部を含むかまたはそれらからなっていてもよい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド型、８９ヌクレオチド型、７５ヌクレオチド型及び６５ヌクレオチド型が挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７；ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８型、＋５４型、＋６７型及び＋８５型（「＋ｎ」は、最大＋ｎヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡ内に含まれることを示す）内に見られるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられる。ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であってもよい。ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の間のパーセント相補性は、約２０連続ヌクレオチドにわたり少なくとも６０％であってもよい。一例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の５´末端において１４連続ヌクレオチドにわたり１００％であり、またその残部にわたりたった０％である。このような場合、ＤＮＡ標的化配列は１４ヌクレオチド長であるとみなすことができる。別の例では、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の５´末端において７連続ヌクレオチドにわたり１００％であり、またその残部にわたりたった０％である。このような場合、ＤＮＡ標的化配列は７ヌクレオチド長であるとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化配列内の少なくとも１７ヌクレオチドは標的ＤＮＡに対して相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化配列は２０ヌクレオチド長であってもよく、標的ＤＮＡ（ガイドＲＮＡ認識配列）との１、２または３のミスマッチを含んでいてもよい。ミスマッチはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していないことが好ましい（例えば、ミスマッチはＤＮＡ標的化配列の５´末端内にあり、または、ミスマッチはＰＡＭ配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに対して相補的な２つのストレッチのヌクレオチドを含んでいてもよい。タンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。本ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、またｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントを介して結合Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列へと誘導する。
単一ガイドＲＮＡはＤＮＡ標的化セグメント及びスキャフォールド配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合配列またはＣａｓ結合配列）を有している。例示的なスキャフォールド配列としては、ＧＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ（配列番号：１５０）、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ（配列番号：１５１）、及び、ＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ（配列番号：１５２）が挙げられる。
ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性、細胞内標的化、蛍光標識による追跡、タンパク質またはタンパク質複合体用の結合部位、など）をもたらす修飾または配列を含んでいてもよい。このような修飾の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３´ポリアデニル化テール（すなわち、３´ポリ（Ａ）テール）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質複合体による調節された安定性及び／または調節された接近性を可能とするための）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）へと向かわせる修飾または配列；追跡（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲート、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲート、蛍光検出を可能とする配列、など）をもたらす修飾または配列；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチル基転移酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチル基転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素などを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）用の結合部位をもたらす修飾または配列；及びこれらの組み合わせが挙げられる。修飾のその他の例としては、遺伝子改変ステムループ二重鎖構造、遺伝子改変バルジ領域、ステムループ二重鎖構造の遺伝子改変ヘアピン３´、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最低限のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成された二重鎖内におけるヌクレオチドの不対領域であってもよい。バルジは、二重鎖の片側上に不対５´－ＸＸＸＹ－３´（Ｘは任意のプリンであり、Ｙは反対側の鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであってもよい）を、二重鎖のもう片側上に不対ヌクレオチド領域を含んでいてもよい。
ガイドＲＮＡは任意の形態で提供されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（独立したｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で提供されてもよく、また任意選択的に、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態で提供されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写により調製することができる（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０及びＷＯ２０１４／０６５５９６を参照のこと（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。ガイドＲＮＡはまた化学合成により調製することができる。
ｇＲＮＡはまたｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または独立したＲＮＡ分子（例えば、独立したｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする独立したＤＮＡ分子として提供されてもよい。
ｇＲＮＡをＤＮＡの形態で提供する場合、ｇＲＮＡは、細胞内で一時的に、条件的にまたは構成的に発現してもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定的に組み込まれてもよく、細胞内で活性化しているプロモーターと機能的に連結してもよい。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物内のプロモーターと機能的に連結してもよい。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、外来修復テンプレートを含むベクター内及び／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクター内にあってもよい。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、外来修復テンプレートを含むベクター及び／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターから独立したベクターまたはプラスミド内にあってもよい。このような発現構築物に使用可能なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つまたは複数において活性化しているプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、例えば、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってもよい。このようなプロモーターはまた、例えば、二方向性プロモーターであってもよい。好適なプロモーターの特定の例としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどが挙げられる。
（３）ガイドＲＮＡ認識配列
用語「ガイドＲＮＡ認識配列」は、結合のための十分な条件が存在している場合、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列を含む。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計された配列を含み、そこでは、ガイドＲＮＡ認識配列とＤＮＡ標的化配列のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在する場合、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡ認識配列はまた、以下でより詳細に説明するＣａｓタンパク質のための開裂部位を含む。ガイドＲＮＡ認識配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内または細胞の細胞小器官（ミトコンドリアまたは葉緑体など）内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに標的とされ（すなわち、それらが結合、それらとハイブリダイズ、またはそれらに対して相補的である）てもよい。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件としては、通常は細胞内に存在する生理学的条件が挙げられる。その他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系内の条件）は当技術分野において周知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに対して相補的でありそれらにハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖を「相補鎖」と呼んでもよく、また「相補鎖」に対して相補的な（それゆえ、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに対して相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖を「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼んでもよい。
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列の内部または外部の部位で核酸を開裂させることができる。「開裂部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズしてＣａｓタンパク質と複合体を形成したｇＲＮＡを含む）は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列の内部または近傍（例えば、その核酸配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれ以上の塩基対内の）の一方の鎖または両方の鎖の開裂をもたらし得る。開裂部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外部にある場合、開裂部位はなおも「ガイドＲＮＡ認識配列」の内部にあるとみなされる。開裂部位は、核酸の一方の鎖上にのみまたは両方の鎖上にあってもよい。開裂部位は、核酸の両方の鎖上の同一位置（平滑末端を生成）にあってもよく、または、それぞれの鎖上の異なる部位（付着末端（すなわち、オーバーハング）を生成）にあってもよい。例えば、そのそれぞれが異なる鎖上の異なる開裂部位において一本鎖切断を生成することにより二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することで、付着末端を生成することができる。例えば、オーバーハング配列が生成されるように、第１のニッカーゼは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上の一本鎖切断を生成可能であり、第２のニッカーゼはｄｓＤＮＡの第２の鎖上の一本鎖切断を生成可能である。一部の例においては、第１の鎖上におけるニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００または１，０００塩基対だけ、第２の鎖上におけるニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列から離れている。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的な結合及び開裂は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対相補性と（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる標的ＤＮＡ内における短いモチーフの両方によって決まる位置で生じ得る。ＰＡＭはガイドＲＮＡ認識配列に隣接していてもよい。任意選択的に、ＰＡＭはガイドＲＮＡ認識配列の３´末端に隣接していてもよい。代替的に、ＰＡＭはガイドＲＮＡ認識配列の５´末端に隣接していてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質の開裂部位は、ＰＡＭ配列の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流であってもよい。一部の例（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連したＣａｓ９を使用する場合）においては、非相補鎖のＰＡＭ配列は５´－Ｎ１ＧＧ－３´（Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の３´にじかに接している）であってもよい。このように、相補鎖のＰＡＭ配列は５´－ＣＣＮ２－３´（Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列の５´にじかに接している）であるだろう。一部のこのような例においては、Ｎ１及びＮ２は相補的であってもよく、Ｎ１－Ｎ２塩基対は任意の塩基対（例えば、Ｎ１＝ＣでありＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧでありＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡでありＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝ＴでありＮ２＝Ａ）であってもよい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の例においては、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号：１４６）またはＮＮＧＲＲ（配列番号：１４７）であってもよい（ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであってもよく、ＲはＧまたはＡであってもよい）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の例においては、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであってもよい（ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであってもよく、ＲはＧまたはＡであってもよい）。一部の例（例えば、ＦｎＣｐｆ１）においては、ＰＡＭ配列は、５´末端の上流にあってもよく、配列５´－ＴＴＮ－３´を有していてもよい。
ガイドＲＮＡ認識配列の例としては、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントに対して相補的なＤＮＡ配列、またはＰＡＭ配列に付加されるこのようなＤＮＡ配列が挙げられる。例えば、標的モチーフは、Ｃａｓ９タンパク質が認識する先行するＮＧＧモチーフ、例えば、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号：１）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号：２）などにじかに接している２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であってもよい（例えば、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。５´末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進し得る。ガイドＲＮＡ認識配列のその他の例としては、Ｔ７ポリメラーゼによる効率的なインビトロ転写を促進する５´末端の２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号：３）を挙げることができる。例えば、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。その他のガイドＲＮＡ認識配列は、５´ＧまたはＧＧ及び３´ＧＧまたはＮＧＧを含む配列番号：１～３の４～２２ヌクレオチド長を有していてもよい。更にその他のガイドＲＮＡ認識配列は、配列番号：１～３の１４～２０ヌクレオチド長を有していてもよい。
ガイドＲＮＡ認識配列は、細胞に内在するまたは細胞に外来の任意の核酸配列であってもよい。ガイドＲＮＡ認識配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節配列）であってもよく、または、その両方を含んでいてもよい。
Ｃ．外来修復テンプレート
本明細書で開示する方法及び組成物は、Ｃａｓタンパク質で標的ゲノム遺伝子座を開裂させてから標的ゲノム遺伝子座を改変するために外来修復テンプレートを利用することができる。例えば、細胞は１細胞期胚であってもよく、外来修復テンプレートは５ｋｂ長より短くてもよい。１細胞期胚以外の細胞型では、外来修復テンプレート（例えば、標的化ベクター）はより長くてもよい。例えば、１細胞期胚以外の細胞型では、外来修復テンプレートは、本明細書中の他の箇所で説明する大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）（例えば、少なくとも１０ｋｂの長さを有する標的化ベクター、または少なくとも１０ｋｂの総合計を有する５´ホモロジーアーム及び３´ホモロジーアームを有する標的化ベクター）であってもよい。Ｃａｓタンパク質と組み合わせて外来修復テンプレートを使用すると、相同組換え修復の促進により、標的ゲノム遺伝子座のより正確な改変がもたらされ得る。
このような方法では、Ｃａｓタンパク質は標的ゲノム遺伝子座を開裂させて一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断を生成し、外来修復テンプレートは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）介在性ライゲーションまたは相同組換え修復事象を介して標的核酸を組換える。任意選択的に、外来修復テンプレートによる修復を行うと、標的とした対立遺伝子がＣａｓタンパク質によって再標的化され得ないようにガイドＲＮＡ認識配列またはＣａｓ開裂部位が除去または破壊される。
外来修復テンプレートはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含んでいてもよく、それらは一本鎖または二本鎖であってもよく、それらは直鎖状形態または環状形態であってもよい。例えば、外来修復テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってもよい。例えば、Ｙｏｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０４３１を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。例示的な外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂ長であり、約５０ヌクレオチド～約３ｋｂ長であり、または、約５０～約１，０００ヌクレオチド長である。その他の例示的な外来修復テンプレートは約４０～約２００ヌクレオチド長である。例えば、外来修復テンプレートは、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、または、約１９０～約２００ヌクレオチド長であってもよい。代替的に、外来修復テンプレートは、約５０～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、約７００～約８００、約８００～約９００、または、約９００～約１，０００ヌクレオチド長であってもよい。代替的に、外来修復テンプレートは、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、または、約４．５ｋｂ～約５ｋｂ長であってもよい。代替的に、外来修復テンプレートは、例えば、５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、９００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、または、５０ヌクレオチド以下の長さであってもよい。１細胞期胚以外の細胞型では、外来修復テンプレート（例えば、標的化ベクター）はより長くてもよい。例えば、１細胞期胚以外の細胞型では、外来修復テンプレートは、本明細書中の他の箇所で説明する大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であってもよい。
１つの例において、外来修復テンプレートは約８０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド長のｓｓＯＤＮである。別の例では、外来修復テンプレートは約８０ヌクレオチド～約３ｋｂ長のｓｓＯＤＮである。このようなｓｓＯＤＮは、例えば、それぞれが約４０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド長であるホモロジーアームを有していてもよい。このようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれが約３０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド長であるホモロジーアームを有していてもよい。ホモロジーアームは対称（例えば、それぞれ４０ヌクレオチド長またはそれぞれ６０ヌクレオチド長）であってもよく、または、非対称（例えば、３６ヌクレオチド長の１本のホモロジーアーム、及び９１ヌクレオチド長の１本のホモロジーアーム）であってもよい。
外来修復テンプレートは、追加の望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性、蛍光標識による追跡または検出、タンパク質またはタンパク質複合体用の結合部位、など）をもたらす修飾または配列を含んでいてもよい。外来修復テンプレートは、１つまたは複数の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。例えば、外来修復テンプレートは、１つまたは複数の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質またはその他の蛍光体もしくは染料）、例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識を含んでいてもよい。例示的な蛍光標識としては、蛍光体、例えば、フルオレセイン（例えば、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ））、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、５－（及び－６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、及びＣｙ７などが挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するための幅広い蛍光染料が市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。例えば、このような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）を使用して、外来修復テンプレートの末端に適合する突出末端を有する開裂標的核酸に直接組み込んだ外来修復テンプレートを検出してもよい。標識またはタグは、外来修復テンプレート内の５´末端、３´末端、または内部であってもよい。例えば、外来修復テンプレートは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩＲ７００蛍光体（５´ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）と５´末端でコンジュゲートしていてもよい。
外来修復テンプレートはまた、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれるためのＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートを含んでいてもよい。標的ゲノム遺伝子座に核酸インサートを導入することにより、目的の核酸配列の標的ゲノム遺伝子座への付加、標的ゲノム遺伝子座における目的の核酸配列の欠失、または、標的ゲノム遺伝子座における目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失及び挿入）がもたらされ得る。一部の外来修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座における対応する欠失を何ら伴わずに、標的ゲノム遺伝子座に核酸インサートを挿入するように設計される。その他の外来修復テンプレートは、核酸インサートの対応する挿入を何ら伴わずに、標的ゲノム遺伝子座における目的の核酸配列を欠失させるように設計される。更にその他の外来修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座における目的の核酸配列を欠失させて核酸インサートで置換するように設計される。
核酸インサート、または欠失及び／または置換される標的ゲノム遺伝子座における対応する核酸は、様々な長さであってもよい。例示的な核酸インサート、または欠失及び／または置換される標的ゲノム遺伝子座における対応する核酸は、約１ヌクレオチド～約５ｋｂ長であり、または、約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド長である。例えば、核酸インサート、または欠失及び／または置換される標的ゲノム遺伝子座における対応する核酸は、約１～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、または、約１９０～約２００ヌクレオチド長であってもよい。同様に、核酸インサート、または欠失及び／または置換される標的ゲノム遺伝子座における対応する核酸は、約１～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、約７００～約８００、約８００～約９００、または、約９００～約１，０００ヌクレオチド長であってもよい。同様に、核酸インサート、または欠失及び／または置換される標的ゲノム遺伝子座における対応する核酸は、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、または、約４．５ｋｂ～約５ｋｂ長であってもよい。標的ゲノム遺伝子座から欠失される核酸はまた、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約７０ｋｂ、約７０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約９０ｋｂ、約９０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約５００ｋｂ、約５００ｋｂ～約６００ｋｂ、約６００ｋｂ～約７００ｋｂ、約７００ｋｂ～約８００ｋｂ、約８００ｋｂ～約９００ｋｂ、約９００ｋｂ～約１Ｍｂであってもよく、またはそれより長くてもよい。代替的に、標的ゲノム遺伝子座から欠失される核酸は、約１Ｍｂ～約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ～約２Ｍｂ、約２Ｍｂ～約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ～約３Ｍｂ、約３Ｍｂ～約４Ｍｂ、約４Ｍｂ～約５Ｍｂ、約５Ｍｂ～約１０Ｍｂ、約１０Ｍｂ～約２０Ｍｂ、約２０Ｍｂ～約３０Ｍｂ、約３０Ｍｂ～約４０Ｍｂ、約４０Ｍｂ～約５０Ｍｂ、約５０Ｍｂ～約６０Ｍｂ、約６０Ｍｂ～約７０Ｍｂ、約７０Ｍｂ～約８０Ｍｂ、約８０Ｍｂ～約９０Ｍｂ、または、約９０Ｍｂ～約１００Ｍｂであってもよい。
核酸インサートは、ゲノムＤＮＡまたは任意のその他のタイプのＤＮＡを含んでいてもよい。例えば、核酸インサートは、原核生物、真核生物、酵母菌、トリ（例えば、ニワトリ）、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物、農業用哺乳動物、カメ、または任意のその他の目的の生物由来であってもよい。
核酸インサートは、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部に対して相同またはオルソロガスな配列（例えば、自己抗原の特定のモチーフまたは領域をコードする遺伝子の一部）を含んでいてもよい。相同配列は異なる種由来または同一種由来であってもよい。例えば、核酸インサートは、標的ゲノム遺伝子座において置換の標的となった配列と比較して、１つまたは複数の点変異（例えば、１、２、３、４、５つまたはそれ以上）を含む配列を含んでいてもよい。任意選択的に、このような点変異は、コードポリペプチド内における保存的アミノ酸置換（例えば、アスパラギン酸［Ａｓｐ，Ｄ］のグルタミン酸［Ｇｌｕ，Ｅ］への置換）をもたらし得る。
核酸インサート、または欠失及び／または置換される標的ゲノム遺伝子座における対応する核酸は、コード領域、例えば、エキソンなど；非コード領域、例えば、イントロン、非翻訳領域または調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、または転写抑制因子結合エレメント）など；またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。
核酸インサートはまた、条件的対立遺伝子を含んでいてもよい。条件的対立遺伝子は、ＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているような多機能性対立遺伝子であってもよい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。例えば、条件的対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に対してセンス方向の作動配列、（ｂ）センス方向またはアンチセンス方向の薬剤選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、及び（ｄ）逆方向の逆位による条件的モジュール（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｂｙ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ）（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロン及び逆位遺伝子トラップ様モジュールを利用）を含んでいてもよい。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。条件的対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼに曝露すると組換わり、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き（ｉｉ）センス方向のＮＳＩ及びアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む条件的対立遺伝子を形成する、再組換え可能なユニットを更に含んでいてもよい。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
核酸インサートはまた、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。代替的に、核酸インサートは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを欠いていてもよい。選択マーカーは選択カセットに含まれていてもよい。任意選択的に、選択カセットは自己欠失カセットであってもよい。例えば、ＵＳ８，６９７，８５１及びＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。一例として、自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターと機能的に連結したＣｒｅｉ遺伝子（イントロンにより分離された、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンを含む）、及びヒトユビキチンプロモーターと機能的に連結したネオマイシン耐性遺伝子を含んでいてもよい。Ｐｒｍ１プロモーターを使用することにより、特にＦ０動物の雄胚細胞内において自己欠失カセットが欠失され得る。例示的な選択マーカーとしては、ネオマイシンリン酸基転移酵素（ｎｅｏｒ）、ヒグロマイシンＢリン酸基転移酵素（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチル基転移酵素（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳ脱アミノ酵素（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシル基転移酵素（ｇｐｔ）、もしくは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とする細胞内で活性化しているプロモーターと機能的に連結してもよい。プロモーターの例については、本明細書中の他の箇所に記載している。
核酸インサートはまた、レポーター遺伝子を含んでいてもよい。例示的なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びアルカリホスファターゼをコードするようなものが挙げられる。このようなレポーター遺伝子は、標的とする細胞内で活性化しているプロモーターと機能的に連結してもよい。プロモーターの例については、本明細書中の他の箇所に記載している。
核酸インサートはまた、１つまたは複数の発現カセットまたは欠失カセットを含んでいてもよい。任意のカセットは、発現に影響を及ぼす様々な調節構成要素と共に、目的のヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及びレポーター遺伝子のうちの１つまたは複数を含んでいてもよい。含まれ得る選択マーカー及びレポーター遺伝子の例については、本明細書中の他の箇所において詳細に記載されている。
核酸インサートは、部位特異的組換え標的配列に隣接する核酸を含んでいてもよい。代替的に、核酸インサートは１つまたは複数の部位特異的組換え標的配列を含んでいてもよい。完全な核酸インサートはこのような部位特異的組換え標的配列に隣接し得るが、核酸インサート内における任意の領域または個々の目的ポリヌクレオチドもまた、このような部位に隣接し得る。核酸インサートまたは核酸インサート内の任意の目的ポリヌクレオチドに隣接し得る部位特異的組換え標的配列としては、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。１つの例では、部位特異的組換え部位は、核酸インサート内に含まれる選択マーカーをコードするポリヌクレオチド及び／またはレポーター遺伝子に隣接する。標的遺伝子座に核酸インサートを導入した後に、部位特異的組換え部位間の配列を除去してもよい。任意選択的に、それぞれが部位特異的組換え部位を含む核酸インサートを有する２つの外来修復テンプレートを使用してもよい。外来修復テンプレートは、目的の核酸に隣接する５´領域及び３´領域を標的としてもよい。標的ゲノム遺伝子座に２つの核酸インサートを導入した後に、２つの挿入済み部位特異的組換え部位間の目的の核酸を除去してもよい。
核酸インサートはまた、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型のエンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）用の１つまたは複数の制限部位を含んでいてもよい。Ｉ型及びＩＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼは特定の認識部位を認識するが、通常は、開裂部位（認識部位）から数百塩基対離れ得るヌクレアーゼ結合部位の様々な位置で開裂させる。ＩＩ型システムでは、制限活性は任意のメチル化酵素活性に依存せず、開裂は通常、結合部位内の特定部位または結合部位近傍の特定部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素はパリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は非パリンドローム認識部位を認識して認識部位の外側を開裂させ、ＩＩｂ型酵素は認識部位の外側の両方の部位において配列を２回切断し、またＩＩｓ型酵素は非対称認識部位を認識して認識部位から約１～２０ヌクレオチドの所定の距離離れた片側を開裂させる。ＩＶ型制限酵素はメチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素については、例えば、ＲＥＢＡＳＥ ｄａｔａｂａｓｅ（ウェブページｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８－４２０；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１８０５－１８１２；及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００２） ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１－７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ））において更に記載及び分類されている。
（１）非相同末端結合介在性挿入用の修復テンプレート
一部の外来修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓタンパク質媒介開裂により生成された１つまたは複数のオーバーハングに対して相補的な５´末端及び／または３´末端に短い一本鎖領域を有する。これらのオーバーハングは５´ホモロジーアーム及び３´ホモロジーアームと呼ばれることもある。例えば、一部の外来修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座の５´標的配列及び／または３´標的配列におけるＣａｓタンパク質媒介開裂により生成された１つまたは複数のオーバーハングに対して相補的な５´末端及び／または３´末端に短い一本鎖領域を有する。一部のこのような外来修復テンプレートは、５´末端にのみまたは３´末端にのみ相補領域を有する。例えば、一部のこのような外来修復テンプレートは、標的ゲノム遺伝子座の５´標的配列に生成されたオーバーハングに対して相補的な５´末端にのみ、または、標的ゲノム遺伝子座の３´標的配列に生成されたオーバーハングに対して相補的な３´末端にのみ、相補領域を有する。その他のこのような外来修復テンプレートは、５´末端と３´末端の両方に相補領域を有する。例えば、その他のこのような外来修復テンプレートは、５´末端と３´末端の両方に相補領域（例えば、それぞれ標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓ媒介開裂により生成された第１及び第２のオーバーハングに対して相補的な）を有する。例えば、外来修復テンプレートが二本鎖である場合、一本鎖相補領域は、修復テンプレートのトップ鎖の５´末端及び修復テンプレートのボトム鎖の５´末端から延びて、それぞれの末端上に５´オーバーハングを生成し得る。代替的に、一本鎖相補領域は、修復テンプレートのトップ鎖の３´末端及びテンプレートのボトム鎖の３´末端から延びて、３´オーバーハングを生成し得る。
相補領域は、外来修復テンプレートと標的核酸の間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さの相補領域であってもよい。例示的な相補領域は、約１～約５ヌクレオチド長、約１～約２５ヌクレオチド長、または、約５～約１５０ヌクレオチド長である。例えば、相補領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であってもよい。代替的に、相補領域は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０ヌクレオチド長であってもよく、またはそれより長くてもよい。
このような相補領域は、２つのニッカーゼ対により生成されたオーバーハングに対して相補的であってもよい。ＤＮＡの相対する鎖を開裂させて第１の二本鎖切断を生成する第１及び第２のニッカーゼ、ならびに、ＤＮＡの相対する鎖を開裂させて第２の二本鎖切断を生成する第３及び第４のニッカーゼを使用することにより、付着末端を有する２つの二本鎖切断を生成することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３及び第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列にニックを生じさせてもよい。第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列は、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第１及び第２のニッカーゼにより生成されたニックが二本鎖切断を生成するように、第１の開裂部位を生成するために配置されてもよい（すなわち、第１の開裂部位は、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列内のニックを含む）。同様に、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列は、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第３及び第４のニッカーゼにより生成されたニックが二本鎖切断を生成するように、第２の開裂部位を生成するために配置されてもよい（すなわち、第２の開裂部位は、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックを含む）。好ましくは、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列及び／または第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックは、オーバーハングを生成するオフセットニックであってもよい。オフセット窓は、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、またはそれ以上であってもよい。Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：８３３－８３８；及び、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３９９－４０４を参照のこと（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような例においては、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列内のニックならびに第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列内のニックにより生成されたオーバーハングに対して相補的な一本鎖相補領域を有するように、二本鎖外来修復テンプレートを設計してもよい。その後、非相同末端結合介在性ライゲーションにより、このような外来修復テンプレートを挿入してもよい。
（２）相同組換え修復による挿入用の修復テンプレート
一部の外来修復テンプレートはホモロジーアームを含む。外来修復テンプレートが核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは核酸インサートに隣接していてもよい。参照し易くするために、本明細書においては、ホモロジーアームを５´及び３´（すなわち、上流及び下流）のホモロジーアームと呼ぶ。この用語は、外来修復テンプレート内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関連している。５´ホモロジーアーム及び３´ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の領域（本明細書においては、それぞれ「５´標的配列」及び「３´標的配列」と呼ぶ）に対応している。
ホモロジーアームと標的配列は、２つの領域が互いに十分な度合いの配列同一性を共有して相同組換え反応の基質として働く場合、互いに「対応する」または「対応している」。用語「相同性」は、対応する配列と同一であるかまたは配列同一性を共有しているかのいずれかであるＤＮＡ配列を含む。任意の標的配列と外来修復テンプレート内に見られる対応するホモロジーアームの配列同一性は、相同組換えを生じさせる任意の度合いの配列同一性であってもよい。例えば、外来修復テンプレートのホモロジーアーム（またはそのフラグメント）と標的配列（またはそのフラグメント）が共有する配列同一性の総計は、配列が相同組換えを受けるような、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってもよい。更に、ホモロジーアームと対応する標的配列の間の相同性の対応する領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さの対応する領域であってもよい。例示的なホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂ長、約２５ヌクレオチド～約１．５ｋｂ長、または、約２５～約５００ヌクレオチド長である。例えば、任意のホモロジーアーム（またはホモロジーアームのそれぞれ）及び／または対応する標的配列は、ホモロジーアームが十分な相同性を有して、標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるような、約２５～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、または、約４５０～約５００ヌクレオチド長の相同性の対応する領域を含んでいてもよい。代替的に、任意のホモロジーアーム（またはそれぞれのホモロジーアーム）及び／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、または、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ長の相同性の対応する領域を含んでいてもよい。例えば、ホモロジーアームはそれぞれ、約７５０ヌクレオチド長であってもよい。ホモロジーアームは、対称（それぞれがおよそ同一のサイズ長）であってもよく、または、非対称（一方がもう一方よりも長い）であってもよい。
ホモロジーアームは細胞由来の遺伝子座（例えば、標的遺伝子座）に対応していてもよい。代替的に、例えば、ホモロジーアームは、例えば、導入遺伝子、発現カセット、またはＤＮＡの異種もしくは外来領域を含む、細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種または外来セグメントの領域に対応していてもよい。代替的に、標的化ベクターのホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体の領域、または適切な宿主細胞内に含まれる任意のその他の遺伝子改変領域に対応していてもよい。また更に、標的化ベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリ、コスミドライブラリまたはＰ１ファージライブラリの領域に対応するまたは由来していてもよく、または、合成ＤＮＡに由来していてもよい。
外来修復テンプレートと組み合わせてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する場合、５´標的配列及び３´標的配列は、Ｃａｓ開裂部位における一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断が生成され次第、標的配列とホモロジーアームの間の相同組換え事象の発生が促進されるように、Ｃａｓ開裂部位に十分近接して（例えば、ガイドＲＮＡ認識配列に十分近接して）位置していることが好ましい。用語「Ｃａｓ開裂部位」は、Ｃａｓ酵素（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によりニックまたは二本鎖切断が生成されるＤＮＡ配列を含む。外来修復テンプレートの５´ホモロジーアーム及び３´ホモロジーアームに対応する標的遺伝子座内の標的配列は、Ｃａｓ開裂部位における一本鎖切断または二本鎖切断が生成され次第、５´及び３´標的配列とホモロジーアームの間の相同組換え事象の発生が促進されるような距離である場合、Ｃａｓ開裂部位に「十分近接して位置」している。それゆえ、外来修復テンプレートの５´及び／または３´ホモロジーアームに対応する標的配列は、例えば、任意のＣａｓ開裂部位の少なくとも１ヌクレオチド以内、または、任意のＣａｓ開裂部位の少なくとも１０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド以内にあってもよい。一例として、Ｃａｓ開裂部位は、標的配列の少なくとも一方または両方にじかに隣接していてもよい。
代替的に、任意の開裂部位は、５´標的配列、３´標的配列、または両方の標的配列からの様々な距離にあってもよい。例えば、２つのガイドＲＮＡを使用する場合、第１及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列または第１及び／または第２の開裂部位は、５´標的配列と３´標的配列の間に位置していてもよく、または５´標的配列及び／または３´標的配列に隣接していてもよく、または、例えば、５´標的配列及び／または３´標的配列の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２５０ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、４５０ｋｂまたは５００ｋｂ以内などで、５´標的配列及び／または３´標的配列に近接していてもよい。代替的に、第１及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列または第１及び／または第２の開裂部位は、５´標的配列及び／または３´標的配列から、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または、少なくとも５００ｋｂに位置していてもよい。例えば、第１及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列または第１及び／または第２の開裂部位は、５´標的配列及び／または３´標的配列から、約５０ｂｐ～約１００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３００ｂｐ、約３００ｂｐ～約４００ｂｐ、約４００ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約６００ｂｐ、約６００ｂｐ～約７００ｂｐ、約７００ｂｐ～約８００ｂｐ、約８００ｂｐ～約９００ｂｐ、約９００ｂｐ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約５ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約４００ｋｂ、または、約４００ｋｂ～約５００ｋｂに位置していてもよい。代替的に、第１及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列または第１及び／または第２の開裂部位は、５´標的配列及び／または３´標的配列から、５０ｂｐ超、１００ｂｐ超、２００ｂｐ超、３００ｂｐ超、４００ｂｐ超、５００ｂｐ超、６００ｂｐ超、７００ｂｐ超、８００ｂｐ超、９００ｂｐ超、１ｋｂ超、２ｋｂ超、３ｋｂ超、４ｋｂ超、５ｋｂ超、６ｋｂ超、７ｋｂ超、８ｋｂ超、９ｋｂ超、１０ｋｂ超、２０ｋｂ超、３０ｋｂ超、４０ｋｂ超、５０ｋｂ超、６０ｋｂ超、７０ｋｂ超、８０ｋｂ超、９０ｋｂ超、または、１００ｋｂ超に位置していてもよい。例えば、第１のガイドＲＮＡ認識配列または第１の開裂部位は、５´標的配列からまたは５´標的配列と３´標的配列の両方から、５０ｂｐ超、１００ｂｐ超、２００ｂｐ超、３００ｂｐ超、４００ｂｐ超、５００ｂｐ超、６００ｂｐ超、７００ｂｐ超、８００ｂｐ超、９００ｂｐ超、１ｋｂ超、２ｋｂ超、３ｋｂ超、４ｋｂ超、５ｋｂ超、６ｋｂ超、７ｋｂ超、８ｋｂ超、９ｋｂ超、１０ｋｂ超、２０ｋｂ超、３０ｋｂ超、４０ｋｂ超、５０ｋｂ超、６０ｋｂ超、７０ｋｂ超、８０ｋｂ超、９０ｋｂ超、または、１００ｋｂ超に位置していてもよい。同様に、第２のガイドＲＮＡ認識配列または第２の開裂部位は、３´標的配列からまたは５´標的配列と３´標的配列の両方から、５０ｂｐ超、１００ｂｐ超、２００ｂｐ超、３００ｂｐ超、４００ｂｐ超、５００ｂｐ超、６００ｂｐ超、７００ｂｐ超、８００ｂｐ超、９００ｂｐ超、１ｋｂ超、２ｋｂ超、３ｋｂ超、４ｋｂ超、５ｋｂ超、６ｋｂ超、７ｋｂ超、８ｋｂ超、９ｋｂ超、１０ｋｂ超、２０ｋｂ超、３０ｋｂ超、４０ｋｂ超、５０ｋｂ超、６０ｋｂ超、７０ｋｂ超、８０ｋｂ超、９０ｋｂ超、または、１００ｋｂ超に位置していてもよい。
外来修復テンプレートのホモロジーアームに対応する標的配列の空間関係及びＣａｓ開裂部位は様々であり得る。例えば、標的配列はＣａｓ開裂部位の５´側に位置していてもよく、標的配列はＣａｓ開裂部位の３´側に位置していてもよく、または、標的配列はＣａｓ開裂部位に隣接していてもよい。
１細胞期胚以外の細胞において、外来修復テンプレートは、細胞内の相同組換えを実施することを目的としたその他の手法で通常使用する核酸配列よりも大きな核酸配列に対応及び由来するホモロジーアームを含む標的化ベクターを含む「大きな標的化ベクター」すなわち「ＬＴＶＥＣ」であってもよい。ＬＴＶＥＣとしてはまた、細胞内の相同組換えを実施することを目的としたその他の手法で通常使用する核酸配列よりも大きな核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターが挙げられる。例えば、ＬＴＶＥＣは、従来のプラスミド系標的化ベクターではそのサイズ制限により対応不可能であった大きな遺伝子座の改変を可能とする。例えば、標的遺伝子座は、従来の方法を使用することでは標的化が不可能であった、または、不正確にしか標的化できなかった、もしくは、ヌクレアーゼ試薬（例えば、Ｃａｓタンパク質）により誘発されたニックまたは二本鎖切断の不在下で極めて低い効率でしか標的化できなかった、細胞の遺伝子座であってもよい（すなわち、５´ホモロジーアーム及び３´ホモロジーアームは、そのような遺伝子座に対応していてもよい）。
ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）由来のベクターが挙げられる。ＬＴＶＥＣの非限定例及びそれらを作製するための方法については、例えば、米国特許番号６，５８６，２５１、６，５９６，５４１及び７，１０５，３４８、ならびにＷＯ２００２／０３６７８９に記載されている（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＬＴＶＥＣは直鎖状形態または環状形態であってもよい。
ＬＴＶＥＣは任意の長さのＬＴＶＥＣであってもよく、通常は少なくとも１０ｋｂ長であってもよい。例えば、ＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂ～約３００ｋｂ、約５０ｋｂ～約７５ｋｂ、約７５ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約２７５ｋｂ、または、約２７５ｋｂ～約３００ｋｂであってもよい。ＬＴＶＥＣはまた、約５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１２５ｋｂ、約３００ｋｂ～約３２５ｋｂ、約３２５ｋｂ～約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約３７５ｋｂ、約３７５ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約４２５ｋｂ、約４２５ｋｂ～約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ～約４７５ｋｂ、または、約４７５ｋｂ～約５００ｋｂであってもよい。代替的に、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または、少なくとも５００ｋｂであってもよく、またはそれより長くてもよい。ＬＴＶＥＣのサイズは、通常のアッセイ、例えば、サザンブロット及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ～５ｋｂ）ＰＣＲによる標的化事象のスクリーニングを可能とするには大き過ぎる場合がある。
ＬＴＶＥＣ内における５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームの総合計は通常、少なくとも１０ｋｂである。一例として、５´ホモロジーアームは約５ｋｂ～約１００ｋｂの範囲で変動してもよく、及び／または、３´ホモロジーアームは約５ｋｂ～約１００ｋｂの範囲で変動してもよい。別の例では、５´ホモロジーアームは約５ｋｂ～約１５０ｋｂの範囲で変動してもよく、及び／または、３´ホモロジーアームは約５ｋｂ～約１５０ｋｂの範囲で変動してもよい。それぞれのホモロジーアームは、例えば、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約７０ｋｂ、約７０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約９０ｋｂ、約９０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ～約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ～約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ～約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ～約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ～約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ～約１９０ｋｂ、または、約１９０ｋｂ～約２００ｋｂであってもよい。５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームの総合計は、例えば、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約７０ｋｂ、約７０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約９０ｋｂ、約９０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ～約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ～約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ～約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ～約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ～約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ～約１９０ｋｂ、または、約１９０ｋｂ～約２００ｋｂであってもよい。５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームの総合計はまた、例えば、約２００ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約３５０ｋｂ、または、約３５０ｋｂ～約４００ｋｂであってもよい。代替的に、それぞれのホモロジーアームは、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または、少なくとも２００ｋｂであってもよい。同様に、５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームの総合計は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または、少なくとも２００ｋｂであってもよい。それぞれのホモロジーアームはまた、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、または、少なくとも４００ｋｂであってもよい。
ＬＴＶＥＣは、細胞内の相同組換えを実施することを目的としたその他の手法で通常使用する核酸配列よりも大きな核酸配列を有する核酸インサートを含んでいてもよい。例えば、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約４００ｋｂの範囲の核酸インサート、またはそれより長い核酸インサートを含んでいてもよい。ＬＴＶＥＣはまた、例えば、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約４００ｋｂ～約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ～約５００ｋｂの範囲の核酸インサート、またはそれより長い核酸インサートを含んでいてもよい。代替的に、核酸インサートは、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または、少なくとも５００ｋｂであってもよい。
Ｄ．細胞のゲノムの接触及び核酸またはタンパク質の細胞内への導入
細胞のゲノムを接触させることは、細胞が１細胞期胚である場合、１つまたは複数のＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸（すなわち、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及び１つまたは複数のｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び、１つまたは複数の外来修復テンプレートを細胞に導入することを含んでいてもよく、例えば、外来修復テンプレートは５ｋｂ長未満であってもよい。細胞のゲノムを接触させること（例えば、細胞を接触させること）は、上記構成要素のうちの１つのみ、構成要素のうちの１つまたは複数、または、構成要素の全てを細胞に導入することを含んでいてもよい。「導入すること」は、配列が細胞の内部に侵入するような方法で核酸またはタンパク質を細胞に提示することを含む。導入することは任意の方法により実施可能であり、構成要素のうちの１つまたは複数（例えば、構成要素のうちの２つまたは構成要素の全て）を任意の組み合わせで同時または連続的に細胞に導入してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入に先立って外来修復テンプレートを導入してもよく、または、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入後に外来修復テンプレートを導入してもよい（例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８または７２時間前または後に外来修復テンプレートを投与してもよい）。例えば、ＵＳ２０１５／０２４０２６３及びＵＳ２０１５／０１１０７６２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の形態、例えば、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などで、または、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態、例えば、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡで細胞に導入してもよい。ＤＮＡの形態で導入する場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞内で活性化しているプロモーターと機能的に連結してもよい。このようなＤＮＡは１つまたは複数の発現構築物内にあってもよい。
ガイドＲＮＡを、ＲＮＡの形態またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入してもよい。ＤＮＡの形態で導入する場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞内で活性化しているプロモーターと機能的に連結してもよい。このようなＤＮＡは１つまたは複数の発現構築物内にあってもよい。例えば、このような発現構築物は単一核酸分子の構成要素であってもよい。代替的に、このような発現構築物は、２つまたはそれ以上の核酸分子を含む任意の組み合わせに分離していてもよい（すなわち、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ及び１つまたは複数のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、独立した核酸分子の構成要素であってもよい）。
一部の方法では、ヌクレアーゼ試薬（例えば、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ及び／または外来修復テンプレートをコードするＤＮＡを、ＤＮＡミニサークルを介して細胞に導入してもよい。例えば、ＷＯ２０１４／１８２７００を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡミニサークルは、複製起点も抗生物質選択マーカーも有さない非ウイルス遺伝子導入法に使用可能なスーパーコイルＤＮＡ分子である。それゆえ、ＤＮＡミニサークルは通常、プラスミドベクターよりもサイズが小さい。これらのＤＮＡは細菌ＤＮＡを含有せず、それゆえ、細菌ＤＮＡに見られる非メチル化ＣｐＧモチーフを欠いている。
本明細書で提供する方法は、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部に浸入することを除いては、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存しない。核酸及びタンパク質を様々な細胞型に導入するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、安定トランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、及びウイルス媒介法が挙げられる。
トランスフェクションプロトコルに加え、核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコルは様々であってもよい。限定されないトランスフェクション法としては、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４，及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）；デンドリマー；または、ＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースのトランスフェクション法が挙げられる。非化学的方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション及び光学トランスフェクションが挙げられる。粒子ベースのトランスフェクションとしては、遺伝子銃の使用、またはマグネットを利用したトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が挙げられる。ウイルス法もまたトランスフェクションに使用可能である。
核酸またはタンパク質の細胞への導入はまた、エレクトロポレーション、細胞質内注入、ウイルス感染、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションを介していてもよい。核酸またはタンパク質の細胞への導入はまた、アデノ随伴ウイルスを介していてもよい。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質にだけではなく核膜を通過させて核にも送達することを可能とする優れたエレクトロポレーション技術である。加えて、本明細書で開示する方法におけるヌクレオフェクションの使用は通常、通常のエレクトロポレーションと比較してはるかに少ない細胞しか必要としない（例えば、通常のエレクトロポレーションによる７百万と比較してわずか約２百万）。１つの例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して実施される。
核酸またはタンパク質の細胞（例えば、１細胞期胚）への導入はまた、マイクロインジェクションにより実施可能である。１細胞期胚では、マイクロインジェクションは、母性及び／または父性前核へと、または細胞質へと実施されてもよい。マイクロインジェクションを１つの前核のみへと実施する場合、そのより大きなサイズにより父性前核が好ましい。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは細胞質へと実施することが好ましく（例えば、ｍＲＮＡを直接翻訳機構に送達するために）、その一方で、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするもしくはＲＮＡをコードする核酸のマイクロインジェクションは、核／前核へと実施することが好ましい。代替的に、マイクロインジェクションは核／前核と細胞質の両方へと注入することにより実施可能であり、最初に核／前核へと針を挿入して第１の量を注入してもよく、また１細胞期胚から針を抜きながら第２の量を細胞質へと注入してもよい。Ｃａｓタンパク質を細胞質へと注入する場合、Ｃａｓタンパク質は、核／前核への送達を確実なものとするための核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを実施するための方法はよく知られている。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１５０２２－１５０２６及びＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：９３５４－９３５９を参照されたい。１細胞期胚への導入はまた、エレクトロポレーションにより実施可能である。
核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのその他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞貫通ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイス媒介送達を挙げることができる。
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、一定期間にわたり１回または複数回実施可能である。例えば、導入は、一定期間にわたり少なくとも２回、一定期間にわたり少なくとも３回、一定期間にわたり少なくとも４回、一定期間にわたり少なくとも５回、一定期間にわたり少なくとも６回、一定期間にわたり少なくとも７回、一定期間にわたり少なくとも８回、一定期間にわたり少なくとも９回、一定期間にわたり少なくとも１０回、一定期間にわたり少なくとも１１回、一定期間にわたり少なくとも１２回、一定期間にわたり少なくとも１３回、一定期間にわたり少なくとも１４回、一定期間にわたり少なくとも１５回、一定期間にわたり少なくとも１６回、一定期間にわたり少なくとも１７回、一定期間にわたり少なくとも１８回、一定期間にわたり少なくとも１９回、または、一定期間にわたり少なくとも２０回実施可能である。
一部の例においては、本方法及び組成物に用いる細胞は、それらのゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有している。このような例においては、接触させることは、既にそのゲノムに安定的に組み込まれた構築物を有する細胞を提供することを含んでいてもよい。例えば、本明細書で開示する方法に用いる細胞は、そのゲノムに安定的に組み込まれた既存Ｃａｓコード遺伝子を有していてもよい（すなわち、Ｃａｓレディー細胞）。「安定的に組み込む（ｓｔａｂｌｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）」、「安定的に導入」または「安定的に組み込む（ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに統合されてその後代へとそのヌクレオチド配列を遺伝させることができるように、ポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。ＤＮＡ構築物または標的化ゲノム導入システムの様々な構成要素を安定的に組み込むために、任意のプロトコルを使用してもよい。
Ｅ．標的ゲノム遺伝子座、及びガイドＲＮＡ認識配列の位置
標的ゲノム遺伝子座は、目的の外来標的抗原と相同であるまたは目的の外来標的抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原の発現に影響を及ぼす任意のゲノム遺伝子座であってもよい。好ましくは、標的ゲノム遺伝子座は、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。一例として、標的ゲノム遺伝子座は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含む領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、または、遺伝子の完全なコード領域を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。代替的に、標的ゲノム遺伝子座は、自己抗原をコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす別のゲノム遺伝子座を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。このようなゲノム遺伝子座の一例は、自己抗原をコードする遺伝子の発現に必要な転写調節因子をコードする遺伝子の全てまたは一部である。一部の方法では、複数の標的ゲノム遺伝子座を標的としてもよい。一例として、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する複数の自己抗原をコードする複数の遺伝子が存在する場合、複数の遺伝子のそれぞれは、連続的にまたは同時にのいずれかで標的となり得る。
第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列は標的ゲノム遺伝子座内の任意の場所にあってもよい。例えば、第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列は、目的の外来標的抗原と相同であるまたは目的の外来標的抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部に隣接していてもよい。１つの例では、第１のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、第２のガイドＲＮＡ認識配列は、自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含むか、または、終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。例えば、第１のガイドＲＮＡ認識配列は開始コドンを含んでいてもよく、第２のガイドＲＮＡ認識は終止コドンを含んでいてもよい。第３及び第４のガイドＲＮＡも使用する場合、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列も標的ゲノム遺伝子座内の任意の場所にあってもよい。例えば、ガイドＲＮＡ認識配列のうちの２つ（例えば、第１及び第３（第１と第３のガイドＲＮＡ認識配列は異なり任意選択的にオーバーラップしている））は、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含んでいてもよく、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であってもよく、もう一方の２つのガイドＲＮＡ認識配列（例えば、第２及び第４（第２と第４のガイドＲＮＡ認識配列は異なり任意選択的にオーバーラップしている））は、自己抗原をコードする遺伝子の終止コドンを含んでいてもよく、または、終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であってもよい。開始コドンと終止コドンの両方を標的とすることにより、自己抗原をコードする遺伝子のコード配列の欠失をもたらすことができ、それにより、自己抗原の発現が排除される。
別の例では、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、それぞれは、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含むか、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である。例えば、第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は、オーバーラップしていてもよく、それぞれが開始コドンを含んでいてもよい。第３及び／または第４のガイドＲＮＡも使用する場合、第３及び第４のガイドＲＮＡ認識配列は標的ゲノム遺伝子座内の任意の場所にあってもよい。例えば、第３と第４のガイドＲＮＡ認識配列は互いに異なっていてもよく、また第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列とは異なっていてもよく、第３と第４のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれはまた、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンを含んでいてもよく、または、開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であってもよい。開始コドンを標的とすることにより、開始コドンを破壊することができ、それにより、自己抗原をコードする遺伝子の発現が排除される。
第３及び第４のガイドＲＮＡ（または別のガイドＲＮＡ）を使用する場合、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第１の自己抗原の発現に影響を及ぼすまたはその他の自己抗原（例えば、第２の自己抗原）の発現に影響を及ぼす別の標的ゲノム遺伝子座も標的として、第１の自己抗原及び／またはその他の自己抗原の発現を抑制してもよい。一例として、一部の方法では、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第１の自己抗原をコードする遺伝子を標的としてもよく、また、目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する第２の自己抗原をコードする第２の遺伝子を標的としてもよい。
Ｆ．組換え機構、及び、非相同末端結合、遺伝子変換または相同組換えの普及率を変化させるための方法
組換えは２つのポリヌクレオチド間における任意の遺伝情報交換プロセスを含み、任意の機構により生じ得る。二本鎖切断（ＤＳＢ）に対応する組換えは、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路（非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ））を介して行われる。Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。同様に、外来修復テンプレートが関与する標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間における任意の遺伝情報交換プロセスを含んでいてもよい。
ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端同士を直接ライゲーションすること、または切断末端を外来配列に直接ライゲーションすることによる、核酸内における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非連続配列のライゲーションは多くの場合、二本鎖切断部位付近の欠失、挿入または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外来修復テンプレートの末端に直接ライゲーションすること（すなわち、ＮＨＥＪに基づいた補足）による、外来修復テンプレートの標的導入をもたらし得る。このようなＮＨＥＪ介在性標的導入は、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に利用可能ではない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、及び相同性に基づいたＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）、外来修復テンプレートの挿入に好ましい場合がある。加えて、相同組換え修復とは対照的に、開裂部位前後における広い領域の配列同一性（Ｃａｓ媒介開裂により生成されたオーバーハングを越える）に関する情報（ゲノム配列情報が限られたゲノムを有する生物への標的挿入を試みる場合に有用であり得る）は必要ではない。導入は、Ｃａｓタンパク質によって生成された開裂ゲノム配列内のオーバーハングと適合性のあるオーバーハングに隣接する外来修復テンプレートを使用して、外来修復テンプレートと開裂ゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションにより、または、付着末端（すなわち、５´または３´オーバーハングを有する）のライゲーションにより、進行し得る。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、及びＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。平滑末端をライゲートする場合、フラグメントの結合に必要なマイクロホモロジー領域を生成するために標的及び／またはドナーの切断が必要となる場合があり、それにより、標的配列内に不必要な改変が生成され得る。
組換えはまた、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）により行われ得る。ＨＤＲまたはＨＲはヌクレオチド配列相同性を必要とし得る核酸修復形態を含み、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を受けた分子）を修復するためのテンプレートとしての「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらす。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、このような移行は、切断標的とドナーの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、及び／または、ドナーを使用して標的の一部となる遺伝情報を再合成する合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、及び／または、関連プロセスを伴い得る。一部の例においては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、または、ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡ内に導入される。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
組換えは、相同染色体対の第１の染色体と第２の染色体の間であってもよい。このような方法は、例えば、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）、遺伝子変換、または任意の周知の組換え機構により生じる交差事象を含み得る。理論に束縛されるものではないが、ＬＯＨは、例えば、有糸分裂組換え（遺伝子変換を伴うまたは伴わずに）を介して、または、染色体の喪失及び重複を介して生じ得る。例えば、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２５７－２５８を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。この場合の遺伝子変換は、ドナー配列から極めて相同なアクセプターへの遺伝物質の一方向性の転写（すなわち、１つの分子からその相同体への遺伝情報の非相互交換）を含み得る。遺伝子変換は、任意の周知の組換え機構による対立遺伝子を複製するための任意の方法を含む。例えば、遺伝子変換は、インタクト配列から二本鎖切断を含む相同領域への遺伝情報の非相互転写を伴い得、また、姉妹染色分体間、相同染色体間、または、同一染色分体上または異なる染色体上のいずれかにおける相同配列間で生じ得る。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．８：７６２－７７５を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。特定の例では、遺伝子変換は、相同染色体から遺伝情報を複製した結果としての相同組換えから直接もたらされる。このことは、相同配列同士が異なる場合、局所的なヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）をもたらし得る。
一例として、ＬＯＨは、有糸分裂交差による、または切断誘導複製による染色分体複製による、相互染色分体交換を介して生じ得る。いずれの例においても、ゲノム複製前に一方の染色体が標的となるヘテロ接合性改変は生じ得る。代替的に、単一染色分体はゲノム複製後に標的となり、続いて、染色分体間の遺伝子変換が生じ得る。
本明細書で開示する方法のいずれかにおいて、細胞は、改変されてＮＨＥＪ活性が上昇または低下した細胞であってもよい。同様に、細胞は、改変されて遺伝子変換またはＨＤＲ活性が上昇した細胞であってもよい。このような改変は、ＮＨＥＪ、遺伝子変換及び／またはＨＤＲの調節に関与する遺伝子の発現または活性における改変を含んでいてもよい。例えば、ＮＨＥＪの活性を低下させること及び／またはＨＤＲの活性を上昇させることにより、２つのヌクレアーゼ試薬（例えば、Ｃａｓタンパク質及び２つのガイドＲＮＡ）に対応するヌクレアーゼ認識配列（例えば、ガイドＲＮＡ認識配列）間のゲノム領域における二対立遺伝子崩壊が促進され得る。いかなる特定の理論に制限されるものではないが、二対立遺伝子ゲノム崩壊が生じ得る１つの機構は、第１の対立遺伝子内におけるＮＨＥＪ介在性修復またはＨＤＲ介在性修復、及びＨＤＲ機構を介した同一の第２の対立遺伝子の生成（例えば、遺伝子変換など）によるものである（実施例１を参照のこと）。それゆえ、ＨＤＲ介在性経路を促進する（例えば、ＮＨＥＪ活性を低下させることにより、またはＨＤＲ活性を上昇させることにより）ことにより、ゲノム領域の二対立遺伝子崩壊も促進され得る。同様に、いかなる特定の理論に制限されるものではないが、単一遺伝子座を標的とする対のヌクレアーゼ試薬（例えば、Ｃａｓタンパク質及び対のガイドＲＮＡ）を使用したヘテロ接合性細胞のホモ接合性細胞への変換は、ＮＨＥＪ活性が低下してＨＤＲ活性（例えば、遺伝子変換活性）が相対的に上昇する場合、促進され得る。
ＮＨＥＪ活性を上昇または低下させるためにまたはＨＤＲ活性を上昇または低下させるために、阻害剤を使用してもよい。このような阻害剤は、例えば、小分子または阻害核酸、例えば、遺伝子転写産物に特異的な低分子干渉核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどであってもよい。例えば、リン酸化、ユビキチン化及びスモ化を介した翻訳後修飾により、ＮＨＥＪもしくはＨＤＲに関与する酵素またはそれらの上流の調節に関与する酵素に、阻害剤を向かわせてもよい。
哺乳動物細胞において、ＮＨＥＪは優勢なＤＳＢ修復機構であり、細胞周期全体にわたり有効である。脊椎動物において、「標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」または「標準的な（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）」ＮＨＥＪ経路（Ｃ－ＮＨＥＪ）は、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｋｕ７０－８０、Ａｒｔｅｍｉｓ、リガーゼＩＶ（Ｌｉｇ４）、ＸＲＣＣ４、ＣＬＦ、及びＰｏｌ μを含む、ＤＳＢを修復するためのいくつかのコア因子を必要とする。Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＮＨＥＪの間、ＤＮＡ末端は、非常に豊富な末端保護Ｋｕタンパク質（その他のＮＨＥＪ構成要素を収容するドッキングステーションとして機能する）による結合を受ける。
それゆえ、本明細書で開示する方法の一部では、細胞は改変されて、Ｃ－ＮＨＥＪに関与する因子の発現または活性を抑制もしくは排除または上昇させることになる。例えば、一部の方法では、細胞は改変されて、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｋｕ７０－８０、Ａｒｔｅｍｉｓ、リガーゼＩＶ（Ｌｉｇ４）、ＸＲＣＣ４、ＣＬＦ及び／またはＰｏｌ μの発現または活性を抑制または排除することになる。特定の方法では、細胞は改変されて、ＤＮＡ－ＰＫの発現または活性を抑制または排除することになる、または、ＤＮＡ－ＰＫの発現または活性を上昇させることになる（例えば、ＤＮＡ－ＰＫｃｓの発現または活性；例示的なＵｎｉｐｒｏｔ配列はＰ９７３１３と呼ばれる）。ＤＮＡ－ＰＫｃｓ阻害剤の例としては、例えば、ＮＵ７０２６及びＮＵ７４４１が挙げられる。例えば、米国特許番号６，９７４，８６７（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。特定の方法では、細胞は改変されて、リガーゼＩＶの発現または活性を抑制または排除することになる、または、リガーゼＩＶの発現または活性を上昇させることになる。リガーゼＩＶ阻害剤の一例はＳＣＲ７である。
特定のＤＮＡ修復阻害剤の効果を相乗的に高めるため、または、細胞周期停止及び／またはアポトーシスのような意図しない副作用を防止するためのいずれかで、ＡＴＭ（例えば、ＫＵ５５９３３）、ＣＨＫ１／ＣＨＫ２（例えば、ＫＬＤ１１６２またはＣＨＩＲ－１２４）、及びＡＴＲ（例えば、ＶＥ ８２１）のような細胞周期チェックポイントタンパク質を標的とする阻害剤も使用してもよい（Ｃｉｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４０：１７９を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。
Ｃ－ＮＨＥＪの阻害は、「代替的な」ＮＨＥＪ（Ａ－ＮＨＥＪ）経路が介在する異常な結合の度合いを上昇させ得、またＨＲ修復も亢進させ得る。Ａ－ＮＨＥＪ経路はマイクロホモロジー媒介結合への偏向を示し、Ｃ－ＮＨＥＪよりも遅い動態に従う。ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＳ１）、ＣｔＩＰ、ＸＲＣＣ１、ＰＡＲＰ、Ｌｉｇ１及びＬｉｇ３を含むいくつかの因子の関与が提唱されている。Ｋａｓｐａｒｅｋ ＆ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７、及びＣｌａｙｂｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３８（２１）：７５３８－７５４５を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
それゆえ、本明細書で開示する方法の一部では、細胞は改変されて、Ａ－ＮＨＥＪに関与する因子の発現または活性を抑制もしくは排除または上昇させることになる。例えば、一部の方法では、細胞は改変されて、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＳ１、ＣｔＩＰ、ＸＲＣＣ１、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ１）、Ｌｉｇ１及び／またはＬｉｇ３の発現または活性を抑制または排除することになる。その他の方法では、細胞は改変されて、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＳ１、ＣｔＩＰ、ＸＲＣＣ１、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ１）、Ｌｉｇ１及び／またはＬｉｇ３の発現または活性を上昇させることになる。特定の方法では、細胞は改変されて、ＰＡＲＰ１の発現または活性を抑制または排除することになる、または、ＰＡＲＰ１の発現または活性を上昇させることになる（例示的なＵｎｉｐｒｏｔ配列はＰ１１１０３と呼ばれる）。ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、ＮＵ１０２５、イニパリブ、オラパリブ）の例としては、ニコチンアミド；イソキノリノン及びジヒドロイソキノリノン；ベンゾイミダゾール及びインドール；フタラジン－１（２Ｈ）－オン及びキナゾリノン；イソインドリノンならびにその類似体及び誘導体；フェナントリジン及びフェナントリジノン；ベンゾピロンならびにその類似体及び誘導体；不飽和ヒドロキシム酸誘導体ならびにその類似体及び誘導体；縮合ピリダジンならびにその類似体及び誘導体を含むピリダジン；及び／または、その他の化合物、例えば、カフェイン、テオフィリン及びチミジン、ならびにその類似体及び誘導体などが挙げられる。例えば、米国特許番号８，０７１，５７９（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
Ｃ－ＮＨＥＪはまた、Ｃ－ＮＨＥＪを阻害することによってもＨＲ修復の亢進につながり得るように、ＨＲとの競合関係を示す。ＮＨＥＪを阻害することが、相同組換えによるランダム導入の抑制及び場合により標的導入の増加を介して標的遺伝子組換えの増加につながり得るため、ＮＨＥＪとＨＲの間のこのような競合を利用することができる。
一本鎖アニーリング、遺伝子変換、交差、及び切断誘導複製を含む、いくつかの様式の相同組換え修復が存在している。一本鎖アニーリングとは、切断されたＤＳＢの両側の相同一本鎖配列同士がアニールすることにより染色体再構成が生じる、ＨＲ修復のマイナー様式である。一本鎖アニーリングは、２つの配列相同性領域を分ける距離に応じて様々なサイズの欠失を生成する。遺伝子変換は１つの分子からその相同体への遺伝情報の非相互交換を含み、相同染色体から遺伝情報を複製した結果としてのＨＲから直接もたらされる。このことは、相同配列同士が異なる場合、局所的なＬＯＨをもたらし得る。通常、遺伝子変換の長さは数百塩基対に限定される。しかしながら、ＲＡＤ５１Ｃ欠損を含む一部の遺伝的背景において、長トラクト遺伝子変換が報告されている。Ｎａｇａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８０７５－８０８６を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。交差は、例えば、相同染色体間で生じ得、Ｇ１期に生じる場合には相互転座をもたらす可能性があり、または、Ｇ２期に生じる場合には切断部位から末端テロメアにわたる非相互転座及びＬＯＨをもたらす可能性がある。切断誘導複製とは、鎖侵入後にＤＮＡ複製が染色体の末端まで続くＨＲの変異体である。それゆえ、ＨＲがＬＯＨを促進し得る多くの機構が存在する。
それゆえ、本明細書で開示する方法の一部では、細胞は改変されて、ＨＲに関与する因子の発現または活性を抑制もしくは排除または上昇させることになる。例えば、一部の方法では、細胞は改変されて、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２の発現または活性を上昇させることになる。その他の方法では、細胞は改変されて、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＢＲＣＡ１及び／またはＢＲＣＡ２の発現または活性を抑制または排除することになる。
一部の方法では、ＮＨＥＪ及び／またはＨＲの調節に関与する更にその他のタンパク質の発現または活性が変化され得る。例えば、一部の方法では、細胞は改変されて、Ｃｈｋ２の発現または活性を抑制または排除することになる、Ｃｌｓｐｎの発現または活性を抑制または排除することになる、Ｓｅｔｄ２の発現または活性を抑制または排除することになる、Ｋａｔ２ａの発現または活性を上昇させることになる、及び／または、Ｒａｄ５１の発現または活性を上昇させることになる。その他の方法では、細胞は改変されて、Ｃｈｋ２の発現または活性を上昇させることになる、Ｃｌｓｐｎの発現または活性を上昇させることになる、Ｓｅｔｄ２の発現または活性を上昇させることになる、Ｋａｔ２ａの発現または活性を抑制または排除することになる、及び／または、Ｒａｄ５１の発現または活性を抑制または排除することになる。
Ｃｈｋ２（Ｃｈｅｋ２及びＲａｄ５３としても周知；Ｓ．ｐｏｍｂｅ相同体はＣｄｓ１）は、チェックポイントによる細胞周期停止、ＤＮＡ修復の活性化、及びＤＮＡ二本鎖切断の存在に応答したアポトーシスに必要なセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。Ｂｌａｉｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：５６４４－５６５６を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。Ｃｌｓｐｎ（Ｃｌａｓｐｉｎとしても周知；Ｓ．ｐｏｍｂｅ相同体はＭｒｃ１）は、ＤＮＡ損傷に応答したチェックポイントによる細胞周期停止に必要なタンパク質である。Ｓ．ｐｏｍｂｅにおけるＣｈｋ２またはＣｌｓｐｎの相同体の欠失は、野生型と比較して著しく高いレベルの切断誘導遺伝子変換を示す過剰組換え表現型をもたらすと報告されている。具体的には、遺伝子変換のレベルが著しく上昇したと報告されている一方で、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、姉妹染色分体変換（ＳＣＣ）及びヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）のレベルが低下したと報告されている。Ｂｌａｉｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：５６４４－５６５６を参照されたい。
Ｋａｔ２ａ（Ｇｃｎ５及びＧｃｎ５ｌ２としても周知）は転写活性化を促進する遍在性のヒストンアセチル基転移酵素であり、二本鎖切断修復に関与していることが報告されている。Ｋａｔ２ａ依存性ヒストンＨ３リシン３６（Ｈ３Ｋ３６）のアセチル化により、クロマチンアクセシビリティが高まり、切断が増加し、また相同組換えが促進される一方で、非相同末端結合は抑制される。Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４０９１を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。Ｓｅｔｄ２（Ｋｉａａ１７３２、Ｋｍｔ３ａ及びＳｅｔ２としても周知）は、脱メチル化リシン３６（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２）を基質として使用して、ヒストンＨ３のリシン３６を特異的にトリメチル化（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）するヒストンメチル基転移酵素である。Ｓｅｔｄ２依存性Ｈ３Ｋ３６のメチル化により、クロマチンアクセシビリティが低下し、切断が減少し、またＮＨＥＪが促進される。Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：４０９１を参照されたい。
Ｒａｄ ５１（Ｒｅｃａ、Ｒａｄ５１Ａ、及びＤＮＡ修復タンパク質Ｒａｄ５１相同体１としても周知）とは、Ｒａｄ５２及びその他のタンパク質と共に機能して相同組換え中に鎖交換を達成し、ミスマッチ修復により分解されて遺伝子変換トラクトを得るヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成するタンパク質である。哺乳動物細胞において、Ｒａｄ５１及びＲａｄ５２が過剰発現することにより、相同組換え及び遺伝子変換の頻度が増加することが報告されている。Ｙａｎｅｚ ＆ Ｐｏｒｔｅｒ（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１２８２－１２９０、及びＬａｍｂｅｒｔ ＆ Ｌｏｐｅｚ（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ．１９：３０９０－３０９９を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
ＮＨＥＪ、遺伝子変換及び／または相同組換え修復の調節に関与する遺伝子の発現または活性における改変は、空間的または時間的に特異的であってもよく、また誘導性または一時的及び可逆的であってもよい。例えば、様々な形態のカセットは、特定の発生段階においてまたは導入時に、特定の細胞型または組織型内における欠失を可能とするように構築され得る。このようなカセットは、カセットがリコンビナーゼ認識部位の両側に隣接しているリコンビナーゼシステムを採用していてもよく、所望の細胞型で発現する、所望の発生段階に発現する、または、導入時に発現もしくは活性化するリコンビナーゼを使用して除去することができる。このようなカセットは更に、ＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）のとおり、ヌル対立遺伝子、条件的対立遺伝子、または条件的／ヌル対立遺伝子の組み合わせが生成されるように配置される様々なペアの異なるリコンビナーゼ認識部位を含むように構築され得る。リコンビナーゼ遺伝子の調節は様々な方法で制御可能であり、それら方法は例えば、細胞特異的なプロモーター、組織特異的なプロモーターまたは発生的に調節されるプロモーター（またはその他の調節エレメント）とリコンビナーゼ遺伝子を機能的に連結すること、あるいは、特定の細胞型、組織型または発生段階においてのみ活性化するｍｉＲＮＡ用の認識部位を含む３´－ＵＴＲとリコンビナーゼ遺伝子を機能的に連結することなどである。リコンビナーゼはまた、例えば、エフェクターまたは代謝産物（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２（その活性はタモキシフェンにより正に制御される））の制御下にリコンビナーゼを置く融合タンパク質を用いることにより、または、誘導性プロモーター（例えば、その活性がドキシサイクリン及びＴｅｔＲまたはＴｅｔＲ変異体により制御される誘導性プロモーター）の制御下にリコンビナーゼ遺伝子を置くことにより、調節することができる。様々な形態のカセット及びリコンビナーゼ遺伝子を調節するための方法の例については、例えば、ＵＳ８，５１８，３９２、ＵＳ８，３５４，３８９及びＵＳ８，６９７，８５１に提供されている（それぞれの記載内容全体は参照として本明細書に組み込まれる）。
本明細書で開示するその他の方法では、細胞は改変されて、細胞周期のある期、例えば、細胞周期のＭ期またはＳ期などにおいて細胞を阻止することにより、ＮＨＥＪ活性を上昇または低下させることになる、または、遺伝子変換またはＨＤＲ活性を上昇させることになる。例えば、ＷＯ２０１６／０３６７５４を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このことは、細胞周期を阻止する組成物を用いて実施することができる。このような組成物の例としては、ノコダゾール、ヒドロキシウレア；コルヒチン；デメコルチン（コルセミド）；ロバスタチン；ミモシン；チミジン；アフィジコリン；ラトランクリンＡ；及びラトランクリンＢが挙げられる。このような改変は、ＮＨＥＪ、遺伝子変換及び／またはＨＤＲの調節に関与する遺伝子の発現または活性における改変を含んでいてもよい。
Ｇ．標的遺伝子改変のタイプ
本明細書に記載の方法を使用して、様々なタイプの標的遺伝子改変を導入することができる。このような標的遺伝子改変は、目的の外来標的抗原と相同であるまたは目的の外来標的抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原の発現を抑制または排除する任意の改変を含んでいてもよい。このような改変が標的ゲノム遺伝子座を破壊することが好ましい。破壊の例としては、調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の改変、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、切断変異、ヌル変異、または、少数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失（例えば、フレームシフト変異を生じさせる）が挙げられる。破壊は、対立遺伝子の不活性化（すなわち、機能喪失）または喪失をもたらし得る。このような標的遺伝子改変は、例えば、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、または、１つまたは複数のヌクレオチドの置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ））を含み得る。このような挿入、欠失または置換は、例えば、点変異、目的の核酸配列またはその一部のノックアウト、目的の核酸配列またはその一部のノックイン、内在核酸配列の異種または外来核酸配列への置換、調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）の改変、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、切断変異、ヌル変異、またはこれらの組み合わせをもたらし得る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０またはそれ以上のヌクレオチドを変化（例えば、欠失、挿入または置換）させて標的遺伝子改変を生成してもよい。欠失、挿入または置換は、本明細書中の他の箇所で開示する任意のサイズの欠失、挿入または置換であってもよい。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４５７６８；及び、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような変異は、自己抗原の発現低下または発現（例えば、ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現）排除をもたらし得る（例えば、対立遺伝子の欠失）。
標的遺伝子改変（例えば、挿入、欠失または置換）は、標的ゲノム遺伝子座の１つまたは複数の位置で生じ得る。例えば、標的遺伝子改変は、２つの外来修復テンプレートを使用する場合、標的ゲノム遺伝子座内の２つの位置における２つの独立した改変を含んでいてもよい。
外来修復テンプレートを使用する方法では、例えば、欠失は５´標的配列と３´標的配列の間であってもよい。２つまたはそれ以上のガイドＲＮＡを使用する方法では、欠失は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間、または、第１のＣａｓ開裂部位と第２のＣａｓ開裂部位の間であってもよい。このような欠失は任意の長さであってもよい。欠失核酸は、例えば、約１ｂｐ～約５ｂｐ、約５ｂｐ～約１０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約５０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３００ｂｐ、約３００ｂｐ～約４００ｂｐ、約４００ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１５０ｋｂ、または約１５０ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約５００ｋｂ、約５００ｋｂ～約１Ｍｂ、約１Ｍｂ～約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ～約２Ｍｂ、約２Ｍｂ～約２．５Ｍｂ、または、約２．５Ｍｂ～約３Ｍｂであってもよい。
代替的に、欠失核酸は、例えば、少なくとも１ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、もしくは、少なくとも５００ｋｂであってもよく、またはそれより長くてもよい。一部の例においては、欠失核酸は、少なくとも５５０ｋｂ、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも６５０ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも７５０ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも８５０ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、少なくとも９５０ｋｂ、少なくとも１Ｍｂ、少なくとも１．５Ｍｂ、少なくとも２Ｍｂ、少なくとも２．５Ｍｂ、少なくとも３Ｍｂ、少なくとも４Ｍｂ、少なくとも５Ｍｂ、少なくとも１０Ｍｂ、少なくとも２０Ｍｂ、少なくとも３０Ｍｂ、少なくとも４０Ｍｂ、少なくとも５０Ｍｂ、少なくとも６０Ｍｂ、少なくとも７０Ｍｂ、少なくとも８０Ｍｂ、少なくとも９０Ｍｂ、または、少なくとも１００Ｍｂ（例えば、染色体の大部分）であってもよい。
特定の例では、欠失サイズは、約０．１ｋｂ～約１Ｍｂ、約０．１ｋｂ～約９００ｋｂ、約０．１ｋｂ～約４００ｋｂ、約０．１ｋｂ～約２００ｋｂ、約０．１ｋｂ～約１００ｋｂ、または、最大約１Ｍｂ、最大約９００ｋｂ、最大約４００ｋｂ、最大約２００ｋｂ、もしくは、最大約１００ｋｂであってもよい。特定の例では、欠失サイズは、約０．１～２００、０．１～１９０、０．１～１８０、０．１～１７０、０．１～１６０、０．１～１５０、０．１～１４０、０．１～１３０、０．１～１２０、０．１～１１０、０．１～１００、０．１～９０、０．１～８０、０．１～７０、０．１～６０、０．１～５０、０．１～４０、０．１～３０、０．１～２００．１～１０、０．１～９、０．１～８、０．１～７、０．１～６、０．１～５、０．１～４、０．１～３、０．１～２、または、０．１～１ｋｂであってもよい。標的細胞クローン、例えば、標的胚性幹細胞クローン内における二対立遺伝子欠失（崩壊）効率（すなわち、二対立遺伝子欠失でスクリーニングしたクローンのパーセンテージ）は、約１～１００％、１～９０％、１～８０％、１～７０％、１～６０％、１～５０％、１～４０％、１～３０％、もしくは、１～２７％であってもよく、または、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、もしくは、２５％であってもよい。例えば、一実施形態では、欠失サイズは約５０ｋｂ以下であり、二対立遺伝子欠失効率は約１～３０％または１～２７％であるか、または、欠失サイズは約５０ｋｂまたはそれより大きく（例えば、約５０ｋｂ～約２００ｋｂ）、二対立遺伝子欠失効率は約１～５％または１～３％である。１細胞期胚を標的とする実験において、１細胞期胚にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを注入した後に産まれた生仔における二対立遺伝子欠失（崩壊）効率（すなわち、二対立遺伝子欠失を有する生仔のパーセンテージ）は、約１～１００％、１～９０％もしくは１～８５％であってもよく、または、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは８５％であってもよい。例えば、一実施形態では、欠失サイズは約５０ｋｂ以下であり、二対立遺伝子欠失効率は約１～８５％または２０～８５％であるか、または、欠失サイズは約５０ｋｂまたはそれより大きく（例えば、約５０ｋｂ～約１００ｋｂ）、二対立遺伝子欠失効率は約１～２０％または１～１５％である。
外来修復テンプレートを使用する方法では、例えば、挿入は５´標的配列と３´標的配列の間であってもよい。このような挿入は任意の長さであってもよい。例えば、挿入核酸は、例えば、約１ｂｐ～約５ｂｐ、約５ｂｐ～約１０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約５０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３００ｂｐ、約３００ｂｐ～約４００ｂｐ、約４００ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ～約５００ｋｂであってもよく、またはそれより長くてもよい。代替的に、挿入は、少なくとも１ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または、少なくとも５００ｋｂであってもよい。
標的遺伝子改変は、正確な改変または不正確な改変であってもよい。例えば、外来修復テンプレートを使用する方法では、欠失は、改変標的ゲノム遺伝子座に別の挿入または欠失（インデル）が存在しないように、欠失核酸が５´ホモロジーアームと３´ホモロジーアームの間の核酸配列のみからなる、正確な欠失であってもよい。同様に、自己抗原をコードする遺伝子の完全なコード領域に隣接する対のｇＲＮＡを使用する場合、第１のＣａｓタンパク質開裂部位と第２のＣａｓタンパク質開裂部位の間の欠失は、改変標的ゲノム遺伝子座に別の挿入または欠失（インデル）が存在しないように、欠失核酸が第１のＣａｓタンパク質開裂部位と第２のＣａｓタンパク質開裂部位の間の核酸配列のみからなる、正確な欠失であってもよい。外来修復テンプレートと目的の領域に隣接する対のｇＲＮＡの両方を使用する方法では、欠失は、上記の正確な欠失のいずれかであってもよい。代替的に、第１のＣａｓタンパク質開裂部位と第２のＣａｓタンパク質開裂部位の間の欠失は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による不正確な修復と一致し、改変ゲノム遺伝子座に別の欠失及び／または挿入をもたらす、第１及び第２のＣａｓタンパク質開裂部位を越えてわたる不正確な欠失であってもよい。例えば、欠失は、第１及び第２のＣａｓタンパク質開裂部位を越えて、約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００ｂｐまたはそれ以上にわたっていてもよい。同様に、改変ゲノム遺伝子座は、約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００ｂｐまたはそれ以上の挿入など、ＮＨＥＪによる不正確な修復と一致する別の挿入を含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と共に外来修復テンプレート（例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ））を使用することにより、ＮＨＥＪではなく相同組換え修復を促進することによる正確な改変の可能性が高まり得る。
標的改変は、標的ゲノム遺伝子座における配列（例えば、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部、例えば、自己抗原の特定の領域またはモチーフをコードする遺伝子の一部など）を、対応する相同配列またはオルソロガス配列で置換することを含んでいてもよい。自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を欠失させて、目的の外来抗原と自己抗原の間で共有されたエピトープを欠く対応する相同配列またはオルソロガス配列で置換することにより、野生型自己抗原の機能を維持しているが目的の外来抗原上に存在し野生型自己抗原と共有するエピトープを欠いている自己抗原の相同体またはオルソログの発現がもたらされ得る。代替的にまたは加えて、標的改変は、標的ゲノム遺伝子座（例えば、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部）に１つまたは複数の点変異（例えば、１、２、３、４、５つまたはそれ以上）を含んでいてもよい。このような点変異は、例えば、目的の外来抗原と共有する自己抗原内の１つまたは複数のエピトープの発現を排除するように機能してもよい。任意選択的に、このような点変異は、コードポリペプチド内における保存的アミノ酸置換（例えば、アスパラギン酸［Ａｓｐ，Ｄ］のグルタミン酸［Ｇｌｕ，Ｅ］への置換）をもたらし得る。このようなアミノ酸置換は、野生型自己抗原の機能を維持しているが目的の外来抗原上に存在し野生型自己抗原と共有するエピトープを欠いている自己抗原の発現をもたらし得る。
本明細書に記載の方法は、二対立遺伝子改変、特にホモ接合性改変の頻度を促進及び増加させる。特に、標的ゲノム遺伝子座内の第１及び第２のガイドＲＮＡ認識配列を標的とする第１及び第２のガイドＲＮＡと細胞を接触させることにより、一方のガイドＲＮＡ単独と細胞を接触させることと比較して、二対立遺伝子改変の生成効率を向上させることができる。二対立遺伝子改変の生成効率はまた、標的ゲノム遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列を標的とする第１、第２及び第３のガイドＲＮＡ、または、標的ゲノム遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列を標的とする第１、第２、第３及び第４のガイドＲＮＡと細胞を接触させることにより向上させることができる。加えてまたは代替的に、二対立遺伝子改変、特にホモ接合性改変の生成効率は、標的ゲノム遺伝子座の全てまたは一部における相同染色体対の対応する第１の染色体と第２の染色体の間で配列同一性が最大化されるように、標的ゲノム遺伝子座を選択することにより向上させることができる。このような標的ゲノム遺伝子座を選択するための方法については、本明細書中の他の箇所に更に詳細に記載されている。
標的遺伝子改変は二対立遺伝子改変であることが好ましい。二対立遺伝子改変は、対応する相同染色体（例えば、二倍体細胞内の）上の同一遺伝子座に同一改変が生成される事象、または、対応する相同染色体上の同一遺伝子座に異なる改変が生成される事象を含む。相同染色体（すなわち、相同染色体対）は、同一遺伝子座に同一遺伝子を有するが場合により異なる対立遺伝子を有する染色体（例えば、減数分裂中に対となる染色体）を含む。用語「対立遺伝子」は、遺伝子配列の１つまたは複数の代替形態のうちのいずれかを含む。二倍体細胞または二倍体生物では、任意の配列における２つの対立遺伝子は通常、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占めている。
二対立遺伝子改変は標的遺伝子改変のホモ接合性をもたらし得る。ホモ接合性は、標的ゲノム遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）が標的遺伝子改変を有する状態を含む。例えば、二対立遺伝子改変は、自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部のホモ接合性欠失を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよく、または、二対立遺伝子改変は、開始コドンがもはや機能しなくなるように、自己抗原をコードする遺伝子の開始コドンのホモ接合性破壊を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなっていてもよい。
代替的に、二対立遺伝子改変は標的改変の複合ヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性）をもたらし得る。複合ヘテロ接合性は、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）が改変されているが、それらは別々の方法で改変されている（例えば、一方の対立遺伝子における標的改変、またもう一方の対立遺伝子の不活性化または破壊）状態を含む。例えば、標的改変を伴わない対立遺伝子において、Ｃａｓタンパク質により生成された二本鎖切断は、核酸配列の挿入または欠失を含む変異対立遺伝子が生成されることにより上記ゲノム遺伝子座の破壊がもたらされる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）介在性ＤＮＡ修復によって修復されていてもよい。例えば、二対立遺伝子改変は、標的改変を伴う一方の対立遺伝子及び発現できないもう一方の対立遺伝子を細胞が有する場合、複合ヘテロ接合性をもたらし得る。複合ヘテロ接合性はヘミ接合性を含む。ヘミ接合性は、標的遺伝子座の１つの対立遺伝子のみ（すなわち、２つの相同染色体のうちの１つの染色体上の対立遺伝子）が存在している状態を含む。例えば、二対立遺伝子改変は、一方の対立遺伝子内で標的改変が生じてもう一方の対立遺伝子の対応する喪失または欠失が生じる場合、標的改変のヘミ接合性をもたらし得る。
特定の例では、二対立遺伝子改変は、第１の相同染色体と第２の相同染色体のペア内における第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間またはＣａｓ開裂部位間のホモ接合性欠失を含んでいてもよい。代替的に、二対立遺伝子改変は、第１の相同染色体と第２の相同染色体のペア内における第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間またはＣａｓ開裂部位間の二対立遺伝子欠失を含んでいてもよい（すなわち、両方の染色体に欠失があるが、それぞれにおいて必ずしも同一欠失ではない）。欠失を同時に生じさせてもよく、または、第１の相同染色体内で最初に欠失を生じさせてから、例えば、遺伝子変換による相同組換えを介して第２の相同染色体内の１つまたは複数の二本鎖切断を修復するためのドナー配列として第１の相同染色体を使用する細胞を用いてホモ接合性を達成してもよい。
別の特定の例では、二対立遺伝子改変は、第１の相同染色体と第２の相同染色体のペア内における標的遺伝子の開始コドン領域のホモ接合性破壊を含んでいてもよい。代替的に、第１の相同染色体と第２の相同染色体のペア内における標的遺伝子の開始コドン領域の二対立遺伝子破壊である（すなわち、両方の染色体に破壊があるが、それぞれにおいて必ずしも同一改変ではない）。改変を同時に生じさせてもよく、または、第１の相同染色体内で最初に改変を生じさせてから、例えば、遺伝子変換による相同組換えを介して第２の相同染色体内の１つまたは複数の二本鎖切断を修復するためのドナー配列として第１の相同染色体を使用する細胞を用いてホモ接合性を達成してもよい。
ドナー配列（例えば、外来修復テンプレート）を使用する場合、二対立遺伝子改変は、第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間またはＣａｓ開裂部位間の欠失に加えて、第１の相同染色体と第２の相同染色体のペア内における５´標的配列と３´標的配列の間に核酸インサートの挿入を含んでいてもよく、それによって、ホモ接合性改変ゲノムがもたらされ得る。代替的に、二対立遺伝子改変は、５´標的配列と３´標的配列の間の欠失に加えて、第１の相同染色体と第２の相同染色体のペア内における５´標的配列と３´標的配列の間に核酸インサートの挿入を含んでいてもよく、それによって、ホモ接合性改変ゲノムがもたらされ得る。両方の染色体内で欠失と挿入を同時に生じさせてもよく、または、第１の相同染色体内で最初に欠失と挿入を生じさせてから、例えば、遺伝子変換による相同組換えを介して第２の相同染色体内の二本鎖切断（複数可）を修復するためのドナー配列として第１の相同染色体を使用する細胞を用いてホモ接合性を達成してもよい。例えば、いかなる特定の理論に制限されるものではないが、核酸インサートの挿入は第１の相同染色体内で生じてもよく（Ｃａｓタンパク質による開裂を伴ってまたは伴わずに）、その後、第２の相同染色体上のＣａｓタンパク質による開裂が促進する遺伝子変換事象により、第２の相同染色体が改変されてもよい。
代替的に、外来修復テンプレートが核酸インサートを含まない５´及び３´ホモロジーアームを含む場合、二対立遺伝子改変は、第１の相同染色体と第２の相同染色体のペア内における５´標的配列と３´標的配列の間の欠失を含んでいてもよく、それによって、ホモ接合性改変ゲノムがもたらされ得る。両方の染色体内で欠失を同時に生じさせてもよく、または、第１の相同染色体内で最初に欠失を生じさせてから、例えば、遺伝子変換による相同組換えを介して第２の相同染色体内の二本鎖切断（複数可）を修復するためのドナー配列として第１の相同染色体を使用する細胞を用いてホモ接合性を達成してもよい。例えば、いかなる特定の理論に制限されるものではないが、欠失は第１の相同染色体内で生じてもよく（Ｃａｓタンパク質による開裂を伴ってまたは伴わずに）、その後、第２の相同染色体上のＣａｓタンパク質による開裂が促進する遺伝子変換事象により、第２の相同染色体が改変されてもよい。
第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間の欠失または５´標的配列と３´標的配列の間の欠失は、改変ゲノム標的遺伝子座に別の欠失または挿入が存在しないように、欠失核酸が第１のヌクレアーゼ開裂部位と第２のヌクレアーゼ開裂部位の間の核酸配列のみからなるまたは５´標的配列と３´標的配列の間の核酸配列のみからなる、正確な欠失であってもよい。第１のガイドＲＮＡ認識配列と第２のガイドＲＮＡ認識配列の間の欠失はまた、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による不正確な修復と一致し、改変ゲノム遺伝子座に別の欠失及び／または挿入をもたらす、第１及び第２のヌクレアーゼ開裂部位を越えてわたる不正確な欠失であってもよい。例えば、欠失は、第１及び第２のＣａｓタンパク質開裂部位を越えて、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐまたはそれ以上にわたっていてもよい。同様に、改変ゲノム遺伝子座は、ＮＨＥＪによる不正確な修復と一致する別の挿入、例えば、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐまたはそれ以上の挿入を含んでいてもよい。
外来修復テンプレートを使用して生成する標的挿入は、任意のサイズの標的挿入であってもよい。外来修復テンプレート内における核酸インサートの例及び核酸インサートのサイズの例については、本明細書中の他の箇所に記載されている。
ホモ接合性標的遺伝子改変は、これらの改変（以下でより詳細に説明する）を用いた遺伝子組換え動物を作製するためのプロセスがより効率的かつより時間を要しないものとなり得るために、有利である。その欠如の影響を試験するために遺伝子を除去または破壊するような多くの状況において、標的遺伝子改変の単なるヘテロ接合性（すなわち、一方の対立遺伝子においては改変があり、もう一方の対立遺伝子では変化なし）は十分ではない。従来の標的化戦略では、大きな標的ゲノム欠失にヘテロ接合性なＦ０世代動物を得ることが可能となり得るが、欠失にホモ接合性なＦ１世代動物を作製するためには、それに続くそれらヘテロ接合性動物の交配が必要となる。これら追加の交配工程には費用と時間がかかる。標的遺伝子改変にホモ接合性なＦ０世代遺伝子組換え動物の作製が可能となることにより、必要な交配工程がより少なくなることによる大幅な効率獲得及び時間節約がもたらされる。
Ｈ．標的遺伝子改変を有する細胞の同定
本明細書で開示する方法は、改変標的核酸（例えば、改変ゲノム）を有する細胞を同定することを更に含んでいてもよい。様々な方法を使用して、標的遺伝子改変、例えば、欠失または挿入などを有する細胞を同定してもよい。このような方法は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を有する１つの細胞を同定することを含んでいてもよい。スクリーニングを行って、改変ゲノム遺伝子座を有するこのような細胞を同定してもよい。
スクリーニング工程は、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイ（例えば、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）及び／または対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイ）を含んでいてもよい。例えば、定量的ＰＣＲ、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などにより定量的アッセイを実施してもよい。リアルタイムＰＣＲは、標的ゲノム遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用していてもよい。プライマーセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含んでいてもよい。
ホモ接合性崩壊ＥＳ細胞クローンを同定するために、従来の方法と比較して効率及び精度がより優れたＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブｑＰＣＲ戦略を使用してもよい。「中央」ＬＯＡアッセイ（例えば、図４のｍＴＭプローブを参照のこと）を含みＧＯＡアッセイがないことにより、１枚のｑＰＣＲプレートでホモ接合性崩壊対立遺伝子を同定してもよい。ＥＳ細胞クローンをスクリーニングするために使用する全てのアッセイがＬＯＡアッセイであるため、任意の非マウスＤＮＡ標準物質を使用することなく、試験する全ての領域におけるコピー数を正確に算出することが可能となる。
スクリーニング工程はまた保持アッセイを含んでいてもよく、その保持アッセイは、標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートの正確な標的挿入と標的ゲノム遺伝子座の外側のゲノム位置への核酸インサートのランダム遺伝子組換え挿入を識別するために使用するアッセイである。正確な欠失と欠失の標的となる領域を越えてわたる欠失を識別するために保持アッセイをまた使用してもよい。標的改変をスクリーニングするための通常のアッセイ、例えば、ロングレンジＰＣＲまたはサザンブロットなどは、挿入標的化ベクターを標的遺伝子座に結合させる。しかしながら、ＬＴＶＥＣは、その大きなホモロジーアームサイズにより、このような通常のアッセイによるスクリーニングを可能としない。ＬＴＶＥＣ標的化をスクリーニングするために、対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）及び対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを使用してもよい（例えば、ＵＳ２０１４／０１７８８７９及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照のこと（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。対立遺伝子の喪失（ＬＯＡ）アッセイは通常のスクリーニング理論を逆転させたものであり、変異が誘導された天然遺伝子座のコピー数を定量するものである。正確に標的化された細胞クローンにおいて、ＬＯＡアッセイは２つの天然対立遺伝子（ＸまたはＹ染色体上ではない遺伝子の）の一方を検出し、もう一方の対立遺伝子は標的改変により破壊される。対立遺伝子の獲得（ＧＯＡ）アッセイとして同一原理を逆に適用して、挿入標的化ベクターのコピー数を定量してもよい。例えば、ＧＯＡアッセイとＬＯＡアッセイを併用することにより、天然標的遺伝子の１つのコピーを喪失し薬剤耐性遺伝子の１つのコピーまたはその他の挿入マーカーを獲得した、正確に標的化されたヘテロ接合性クローンが明らかとなる。
一例として、対立遺伝子を定量する方法として定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用してもよいが、標的遺伝子のゼロ、１及び２つのコピー間、または、核酸インサートのゼロ、１及び２つのコピー間の差異を確実に識別可能な任意の方法を使用して、ＭＯＡアッセイを開発してもよい。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用して、特に、参照遺伝子と比較することにより、ゲノムＤＮＡ試料内におけるＤＮＡテンプレートのコピー数を定量してもよい（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。参照遺伝子は、標的遺伝子（複数可）または標的遺伝子座（複数の遺伝子座）として同一ゲノムＤＮＡ内で定量される。それゆえ、２つのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）増幅（それぞれはその対応するプローブを有する）を実施する。一方のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは参照遺伝子の「Ｃｔ」（閾値サイクル）を決定する一方で、もう一方のプローブは、正常な標的化（すなわち、ＬＯＡアッセイ）により置換される標的遺伝子（複数可）または標的遺伝子座（複数の遺伝子座）の領域のＣｔを決定する。Ｃｔとは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブのそれぞれにおける開始ＤＮＡの量を反映する量のことであり、それはすなわち、配列がより豊富でないほど、閾値サイクルに達するのにより多くのＰＣＲサイクルが必要になるということである。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応用のテンプレート配列のコピー数を半分にまで減少させると、約１Ｃｔ単位増加することになる。標的遺伝子（複数可）または標的遺伝子座（複数の遺伝子座）の一方の対立遺伝子が相同組換えで置換された細胞におけるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応は、非標的細胞由来のＤＮＡと比較した場合、参照遺伝子におけるＣｔの増加を伴わずに、標的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応において１Ｃｔの増加をもたらす。ＧＯＡアッセイでは、別のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを使用して、正常な標的化により標的遺伝子（複数可）または標的遺伝子座（複数の遺伝子座）を置換する核酸インサートのＣｔを決定してもよい。
対のｇＲＮＡが標的ゲノム遺伝子座に大きなＣａｓ媒介欠失を生成し得るために、ＬＴＶＥＣによる正確な標的化を確認するための補完標準ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイが有用となり得る（すなわち、１細胞期胚以外の細胞において）。例えば、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイ単独では、特に、ＧＯＡアッセイがＬＴＶＥＣインサート内の選択カセットに対するプローブを用いる場合、正確に標的化された細胞クローンと、標的ゲノム遺伝子座の大きなＣａｓ誘導欠失がゲノム内の他の箇所におけるＬＴＶＥＣのランダム導入と同時に起こるクローンを識別することは不可能である。標的細胞内における選択圧が選択カセットに基づいているために、ゲノム内の他の箇所におけるＬＴＶＥＣのランダム遺伝子組換え導入は通常、ＬＴＶＥＣの選択カセット及び隣接領域を含むが、ＬＴＶＥＣのより遠位の領域は除外される。例えば、ＬＴＶＥＣの一部がゲノムにランダムに組み込まれ、３´ホモロジーアームに隣接した選択カセットを有する約５ｋｂ長またはそれ以上の長さの核酸インサートをそのＬＴＶＥＣが含む場合、通常は、５´ホモロジーアームではなく３´ホモロジーアームが選択カセットに遺伝子組換え的に組み込まれる。代替的に、選択カセットが５´ホモロジーアームに隣接する場合、通常は、３´ホモロジーアームではなく５´ホモロジーアームが選択カセットに遺伝子組換え的に組み込まれる。一例として、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイを使用してＬＴＶＥＣの標的導入を評価し、ＧＯＡアッセイが選択カセットに対するプローブを利用している場合、ＬＴＶＥＣのランダム遺伝子組換え導入と組み合わせた標的ゲノム遺伝子座におけるヘテロ接合性欠失は、標的ゲノム遺伝子座におけるＬＴＶＥＣのヘテロ接合性標的導入と同一のリードアウトをもたらす。ＬＴＶＥＣによる正確な標的化を確認するために、保持アッセイを単独で使用してもよく、または、ＬＯＡアッセイ及び／またはＧＯＡアッセイと組み合わせて使用してもよい。
保持アッセイは、５´標的配列（ＬＴＶＥＣの５´ホモロジーアームに対応する）内及び／または３´標的配列（ＬＴＶＥＣの３´ホモロジーアームに対応する）内におけるＤＮＡテンプレートのコピー数を定量する。特に、選択カセットに隣接するホモロジーアームに対応する標的配列内におけるＤＮＡテンプレートのコピー数を定量することが有用である。二倍体細胞では、２超のコピー数は通常、標的ゲノム遺伝子座においてではなく、標的ゲノム遺伝子座の外側においてＬＴＶＥＣがランダムに遺伝子組換え導入されていることを示し、望ましくない。正確に標的化されたクローンは２のコピー数を保有する。加えて、このような保持アッセイにおける２未満のコピー数は通常、欠失の標的となる領域を越えてわたる大きなＣａｓ媒介欠失を示し、これもまた望ましくない。
二倍体細胞内の標的ゲノム遺伝子座における核酸インサートの標的挿入を識別するための例示的な保持アッセイでは、第１の標的配列にハイブリダイズする第１のホモロジーアームと第２の標的配列にハイブリダイズする第２のホモロジーアームに隣接する核酸インサートを含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と接触したゲノムを有する細胞からＤＮＡを最初に得るが、その核酸インサートは第１のホモロジーアームに隣接する選択カセットを含む。任意選択的に、選択カセットは薬剤耐性遺伝子を含んでいてもよい。その後、第１の標的配列内に結合するプローブ、核酸インサート内に結合するプローブ、及び、既知のコピー数を有する参照遺伝子内に結合するプローブにＤＮＡを曝露するが、それぞれのプローブは結合時に検出可能なシグナルを発生させる。その後、プローブのそれぞれの結合に由来するシグナルが検出される。参照遺伝子プローブに由来するシグナルを第１の標的配列プローブに由来するシグナルと比較して第１の標的配列のコピー数を定量し、参照遺伝子プローブに由来するシグナルを核酸インサートプローブに由来するシグナルと比較して核酸インサートのコピー数を定量する。１または２の核酸インサートコピー数及び２の第１の標的配列コピー数は通常、標的ゲノム遺伝子座における核酸インサートの標的挿入を示し、また１またはそれ以上の核酸インサートコピー数及び３またはそれ以上の第１の標的配列コピー数は通常、標的ゲノム遺伝子座以外のゲノム遺伝子座における核酸インサートのランダム挿入を示す。
第１の標的配列プローブの結合由来のシグナルを使用して第１の標的配列の閾値サイクル（Ｃｔ）値を決定してもよく、参照遺伝子プローブの結合由来のシグナルを使用して参照遺伝子の閾値サイクル（Ｃｔ）値を決定してもよく、また第１の標的配列Ｃｔ値と参照遺伝子Ｃｔ値を比較することにより第１の標的配列のコピー数を定量してもよい。同様に、核酸インサートプローブの結合由来のシグナルを使用して核酸インサートの閾値サイクル（Ｃｔ）値を決定してもよく、また第１の標的配列Ｃｔ値と参照遺伝子Ｃｔ値を比較することにより核酸インサートのコピー数を定量してもよい。
ＬＴＶＥＣ内の核酸インサートは、例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ｋｂであってもよい。第１の標的配列及び選択カセット内においてプローブが結合する配列間の距離は、例えば、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂまたは５ｋｂ以下であってもよい。
このような方法は、第２の標的配列のコピー数を定量するための別の保持アッセイを更に含んでいてもよい。例えば、このような方法は、第２の標的配列に結合するプローブに細胞のＤＮＡを曝露すること、第２の標的配列プローブの結合由来のシグナルを検出すること、及び、参照遺伝子プローブに由来するシグナルを第２の標的配列プローブ由来のシグナルと比較して第２の標的配列のコピー数を定量すること、を更に含んでいてもよい。
同様に、このような方法は、核酸インサート内における１つまたは複数の別の配列のコピー数を定量するための別のＧＯＡアッセイを更に含んでいてもよい。例えば、このような方法は、核酸インサートに結合する１つまたは複数の別のプローブに細胞のＤＮＡを曝露すること、１つまたは複数の別のプローブの結合由来のシグナルを検出すること、及び、参照遺伝子プローブに由来するシグナルを１つまたは複数の別の核酸インサートプローブ由来のシグナルと比較して核酸インサート内における１つまたは複数の別の配列のコピー数を定量すること、を更に含んでいてもよい。
同様に、標的ゲノム遺伝子座から内在配列を欠失させるようにＬＴＶＥＣを設計する場合または対のｇＲＮＡを使用する場合（例えば、単一ゲノム標的遺伝子座内の異なる部位における対の二本鎖切断を生成して介在内在配列を欠失させるために）、このような方法は、標的ゲノム遺伝子座における内在配列のコピー数を定量するためのＬＯＡアッセイを更に含んでいてもよい。例えば、このような方法は、標的ゲノム遺伝子座における内在配列に結合するプローブに細胞のＤＮＡを曝露すること、内在配列プローブの結合由来のシグナルを検出すること、及び、参照遺伝子プローブに由来するシグナルを内在配列プローブ由来のシグナルと比較して内在配列のコピー数を定量すること、を更に含んでいてもよい。
対のｇＲＮＡは使用するが外来修復テンプレートは必ずしも使用しない実験に、保持アッセイをまた使用してもよい。対のｇＲＮＡが標的ゲノム遺伝子座に大きなＣａｓ媒介欠失を生成し得るために、ＮＨＥＪ修復後のインデルに起因する、欠失の標的となる領域を越えてわたる欠失ではなく、対のｇＲＮＡによる正確な標的欠失を確認するための補完標準ＬＯＡアッセイが有用となり得る。
保持アッセイは、第１のガイドＲＮＡ認識配列を含む及び／または第１のガイドＲＮＡ認識配列の上流の領域（すなわち、５´ガイドＲＮＡ認識配列）内、及び／または、第２のガイドＲＮＡ認識配列を含む及び／または第２のガイドＲＮＡ認識配列の下流及び第２のガイドＲＮＡ認識配列に隣接する領域（すなわち、３´ガイドＲＮＡ認識配列）内における、ＤＮＡテンプレートのコピー数を定量する。二倍体細胞では、１未満のコピー数は、欠失の標的となる領域を越えてわたる大きなＮＨＥＪ介在性欠失を示し、望ましくない。正確に標的化されたクローンは２のコピー数を保有する。コピー数を定量するためのプローブは、例えば、ガイドＲＮＡ認識配列の約１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド、７００ヌクレオチド、８００ヌクレオチド、９００ヌクレオチド、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂまたは５ｋｂ以内であってもよい。
好適な定量的アッセイのその他の例としては、蛍光によるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数可）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ、または、ＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。標的改変をスクリーニングするための通常のアッセイ、例えば、ロングレンジＰＣＲ、サザンブロットまたはサンガーシークエンシングなども使用可能である。このようなアッセイは通常、挿入標的化ベクターと標的ゲノム遺伝子座の間の結合のエビデンスを得るために使用される。例えば、ロングレンジＰＣＲアッセイにおいて、一方のプライマーは挿入ＤＮＡ内の配列を認識する一方で、もう一方は標的化ベクターのホモロジーアームの末端を越える標的ゲノム遺伝子座配列を認識することができる。
スクリーニング、特に改変した１細胞期胚に、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）もまた使用可能である。次世代シークエンシングは、「ＮＧＳ」、「超並列シークエンシング」または「ハイスループットシークエンシング」と呼ばれることもある。このようなＮＧＳは、スクリーニングツールに加え、標的遺伝子改変の正確な内容を明確にするための、またモザイク現象を検出するためのＭＯＡアッセイ及び保持アッセイとして使用可能である。モザイク現象とは、単一の受精卵（すなわち、接合体）から発生した１つの個体内に異なる遺伝子型を有する２つまたはそれ以上の細胞集団が存在することを意味する。本明細書で開示する方法において、選択マーカーを使用して標的クローンをスクリーニングすることは必須ではない。例えば、本明細書に記載するＭＯＡ及びＮＧＳアッセイは、選択カセットを使用することなく信頼可能である。
目的の外来抗原と相同であるまたは目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原の発現を抑制または排除するために、標的細胞をまたスクリーニングしてもよい。例えば、自己抗原がタンパク質である場合、例えば、ウェスタンブロット解析またはタンパク質免疫染色を含むタンパク質発現をアッセイするための任意の周知の技術を用いて、発現を評価してもよい。
ＩＩＩ．遺伝子組換え非ヒト動物の作製方法
本明細書で開示する様々な方法を使用して遺伝子組換え非ヒト動物を作製してもよい。本明細書に記載の方法を含む遺伝子組換え生物を作製するための任意の簡便な方法またはプロトコルは、このような遺伝子組換え非ヒト動物を作製するのに適している。胚性幹（ＥＳ）細胞などの多能性細胞を遺伝子組換えすることから始めるこのような方法は通常、（１）本明細書に記載の方法を使用して、１細胞期胚ではない多能性細胞のゲノムを改変すること、（２）遺伝子組換え多能性細胞を同定または選択すること、（３）遺伝子組換え多能性細胞を宿主胚へと導入すること、及び（４）遺伝子組換え多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植して妊娠させること、を含む。そのため、代理母は、標的遺伝子改変を含み生殖細胞系を介して標的遺伝子改変を遺伝させることが可能なＦ０世代非ヒト動物を産むことができる。本明細書に記載の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイにより、遺伝子組換えゲノム遺伝子座を持つ動物を同定してもよい。任意の期、例えば、胚盤胞期または前桑実胚期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などに、ドナー細胞を宿主胚に導入してもよい。生殖細胞系を介して遺伝子改変を遺伝させることが可能な後代を生成する。多能性細胞は、例えば、本明細書中の他の箇所に記載のＥＳ細胞（例えば、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、またはラットＥＳ細胞）であってもよい。例えば、米国特許番号７，２９４，７５４を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
代替的に、１細胞期胚を遺伝子組換えすることから始めるこのような方法は通常、（１）本明細書に記載の方法を使用して、１細胞期胚のゲノムを改変すること、（２）遺伝子組換え胚を同定または選択すること、及び（３）遺伝子組換え胚を代理母に移植して妊娠させること、を含む。そのため、代理母は、標的遺伝子改変を含み生殖細胞系を介して標的遺伝子改変を遺伝させることが可能なＦ０世代非ヒト動物を産むことができる。本明細書に記載の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイにより、遺伝子組換えゲノム遺伝子座を持つ動物を同定してもよい。
核移植技術も使用して非ヒト哺乳動物を作製してもよい。要約すると、核移植をするための方法は、以下の工程、（１）卵母細胞を摘出するまたは摘出卵母細胞を提供する工程、（２）摘出卵母細胞と混合するドナー細胞またはドナー核を単離または提供する工程、（３）細胞または核を摘出卵母細胞に挿入して再構成細胞を生成する工程、（４）再構成細胞を非ヒト動物の子宮に移植して胚を形成させる工程、及び（５）胚を成長させる工程、を含んでいてもよい。このような方法では、卵母細胞は通常、死亡した動物から取り出される（卵母細胞は生きている動物の卵管及び／または卵巣のいずれかからも単離可能ではあるが）。当業者に周知の様々な培地で卵母細胞を成熟させてから除核してもよい。当業者に周知の多数の方法で卵母細胞の除核を実施してもよい。ドナー細胞またはドナー核を摘出卵母細胞に挿入して再構成細胞を生成することは、ドナー細胞を透明帯の下にマイクロインジェクションしてから融合することにより行ってもよい。接触／融合面全体にＤＣ電気パルスを印加すること（電気融合）により、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質に細胞を曝露させることにより、または、センダイウイルスなどの不活化ウイルスを介することにより、融合を誘導してもよい。核ドナーとレシピエント卵母細胞を融合する前、その間、及び／または、その後に、電気的方法及び／または非電気的方法により再構成細胞を活性化させてもよい。活性化方法としては、電気パルス、化学誘発性ショック、精子による貫入、卵母細胞内における二価カチオン濃度を上昇させること、及び卵母細胞内における細胞タンパク質のリン酸化を抑制すること（キナーゼ阻害剤により）、が挙げられる。活性化させた再構成細胞または胚を当業者に周知の培地で培養してから動物の子宮に移植してもよい。例えば、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、及びＵＳ特許番号７，６１２，２５０を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
本明細書で提供する様々な方法により遺伝子組換え非ヒトＦ０動物の作製が可能となり、その遺伝子組換えＦ０動物の細胞は標的遺伝子改変を含む。Ｆ０動物を作製するために使用する方法に応じて、Ｆ０動物内における標的遺伝子改変を有する細胞の数は変化し得るということを理解されたい。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を用いて、ドナーＥＳ細胞を対応する生物由来の前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）に導入することにより、Ｆ０動物におけるより高いパーセンテージの細胞集団に標的遺伝子改変を有する細胞を含ませることが可能となる。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を占める細胞は、標的遺伝子改変を有する細胞集団を含むことができる。加えて、Ｆ０動物における胚細胞のうちの少なくとも１つまたは複数は標的遺伝子改変を有し得る。
Ａ．非ヒト動物と細胞のタイプ
本明細書で提供する方法では、非ヒト動物ならびに非ヒト動物由来の細胞及び胚を使用する。このような非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、ラット、マウス及びハムスター）などであることが好ましい。その他の非ヒト哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜類（例えば、雌ウシ、去勢ウシなどのウシ種；例えば、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種；ならびに、ブタ及びイノシシなどのブタ種）が挙げられる。用語「非ヒト」はヒトを除外する。本明細書で提供する一部の方法では、非ヒト動物ならびに非ヒト動物由来の細胞及び胚はハイブリッドである。
本明細書で提供する方法に用いる非ヒト動物細胞は、例えば、全能性細胞または多能性細胞（例えば、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）であってもよい。全能性細胞は任意の細胞型を生じ得る未分化細胞を含み、また多能性細胞は、２種以上の分化細胞型への分化能を有する未分化細胞を含む。このような多能性及び／または全能性細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であってもよい。ＥＳ細胞は、胚に導入する際に分化胚の任意の組織をもたらすことが可能な、胚から誘導した全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は胚盤胞の内細胞塊から誘導することができ、３種類の脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）のいずれかの細胞へと分化させることができる。
本明細書で提供する方法に用いる非ヒト動物細胞としてはまた、１細胞期胚（すなわち、受精卵母細胞または接合体）を挙げることができる。１細胞期胚は、２つの配偶子間の受精事象により形成された真核細胞である。このような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはこれらの組み合わせ）に由来していてもよく、新鮮または凍結であってもよく、また自然交配または体外受精に由来していてもよい。
本明細書で提供する方法に用いるマウス及びマウス細胞は、例えば、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ系統、１２９系統とＣ５７ＢＬ／６系統のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ系統とＣ５７ＢＬ／６系統のミックス、１２９系統とＢＡＬＢ／ｃ系統のミックス、及び、ＢＡＬＢ／ｃ系統とＣ５７ＢＬ／６系統と１２９系統のミックス由来であってもよい。例えば、本明細書で提供する方法に用いるマウスまたはマウス細胞は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来していてもよい（例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、ＢＡＬＢ／ｃ系統に由来している、または、約２５％、約５０％、約７５％または約１００％、ＢＡＬＢ／ｃ系統に由来している）。１つの例では、マウスまたはマウス細胞は、５０％ ＢＡＬＢ／ｃ、２５％ Ｃ５７ＢＬ／６、及び２５％ １２９を含む株を有していてもよい。代替的に、マウスまたはマウス細胞は、ＢＡＬＢ／ｃを除く系統またはＢＡＬＢ／ｃを除く系統の組み合わせを含んでいてもよい。このようなマウスでは、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質の十分なレパートリーを産生するのにＢＡＬＢ／ｃ背景は必要とされない。
１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１及び１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０（８）：８３６を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。本明細書で提供する方法に用いるマウス及びマウス細胞はまた、上記１２９系統と上記Ｃ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％ １２９、５０％ Ｃ５７ＢＬ／６）由来であってもよい。同様に、本明細書で提供する方法に用いるマウス及びマウス細胞は、上記１２９系統のミックスまたは上記ＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）由来であってもよい。マウスＥＳ細胞の特定の例はＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスと雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスを掛け合わせることにより作製したハイブリッド胚からＶＧＦ１マウスＥＳ細胞（Ｆ１Ｈ４としても周知）を誘導した。例えば、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９，１０２４－１０２８を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
本明細書で提供する方法に用いるマウス及びマウス細胞はまた、ＭＨＣハプロタイプの任意の組み合わせを有していてもよい。ＭＨＣ分子の機能は、外来ペプチドフラグメントに結合して、適切なＴ細胞に認識されるようにそれらを細胞表面上に提示することである。例えば、マウス及びマウス細胞は、ＭＨＣｂハプロタイプ（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）、ＭＨＣｄハプロタイプ（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）を含んでいてもよく、または、ＭＨＣｂとＭＨＣｄの両方（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６とＢＡＬＢ／ｃの組み合わせ）を含んでいてもよい。このようなＭＨＣを組み合わせることにより、抗体力価の上昇をもたらすことができる。
本明細書で提供する方法に用いるラットまたはラット細胞は、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、または、Ｆｉｓｈｅｒ Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含む、任意のラット系統由来であってもよい。ラットまたはラット細胞はまた、上で列挙した２種またはそれ以上の系統のミックスに由来する系統から得ることができる。例えば、ラットまたはラット細胞は、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統由来であってもよい。ＡＣＩラット系統は、黒色のアグーチ、白色の腹部及び脚部、ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給業者から入手可能である。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の一例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチ毛及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴とする。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給業者から入手可能である。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株及びＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。一部の例においては、ラットまたはラット細胞は近交系ラット系統由来である。例えば、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。その他の例においては、ラットまたはラット細胞はハイブリッドラット系統由来である。
宿主胚に移植された細胞を「ドナー細胞」と呼ぶ場合もある。ドナー細胞は、宿主胚と同一株由来であってもよく、または、異なる株由来であってもよい。同様に、代理母は、ドナー細胞及び／または宿主胚と同一株由来であってもよく、または、代理母は、ドナー細胞及び／または宿主胚とは異なる株由来であってもよい。
本明細書で開示する方法及び組成物に様々な宿主胚を用いてもよい。例えば、ドナー細胞（例えば、ドナーＥＳ細胞）を対応する生物由来の前桑実胚期胚（例えば、８細胞期胚）に導入してもよい。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９；ＵＳ７，６５９，４４２；ＵＳ７，２９４，７５４；及びＵＳ２００８／００７８０００を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。その他の方法では、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期または６４細胞期の宿主胚にドナー細胞を移植してもよい。宿主胚はまた胚盤胞であってもよく、あるいは、前胚盤胞胚、前桑実胚期胚、桑実胚期胚、未融合桑実胚期胚、または、融合桑実胚期胚であってもよい。マウス胚を用いる場合、宿主胚の期は、Ｔｈｅｉｌｅｒ（１９８９）”Ｔｈｅ Ｈｏｕｓｅ Ｍｏｕｓｅ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているＴｈｅｉｌｅｒ Ｓｔａｇｅｓを参照すると、Ｔｈｅｉｌｅｒ Ｓｔａｇｅ １（ＴＳ１）、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５及びＴＳ６であってもよい。例えば、Ｔｈｅｉｌｅｒ Ｓｔａｇｅは、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３及びＴＳ４から選択することができる。一部の方法では、宿主胚は透明帯を含み、ドナー細胞は、透明帯の穴を通して宿主胚に導入されたＥＳ細胞である。その他の方法では、宿主胚は帯のない胚である。更にその他の方法では、桑実胚期の宿主胚は凝集している。
Ｂ．抗原結合タンパク質を産生するための非ヒト動物
本明細書で提供する方法に使用する非ヒト動物は、抗原結合タンパク質を産生可能な任意の非ヒト動物、例えば、哺乳動物、げっ歯類、ラットまたはマウスなどであってもよい。例えば、抗体産生を最適化するように遺伝子組換えされた非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）を使用してもよい。このような非ヒト動物は、ヒト用医薬品として使用可能な抗体の大規模産生を促進するように遺伝子改変された非ヒト動物であってもよく、ヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を含む。例えば、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）は、以下の改変、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）重鎖可変領域遺伝子座の全てまたは一部がヒト重鎖可変遺伝子座に置換されている、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）カッパ軽鎖可変領域遺伝子座の全てまたは一部がヒトカッパ軽鎖可変領域遺伝子座に置換されている、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ラムダ軽鎖可変領域遺伝子座の全てまたは一部がヒトラムダ軽鎖可変領域遺伝子座に置換されている、及び、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子座の全てがそのヒト相同体またはオルソログに置換されている、のうちの１つまたは複数をその生殖細胞系内に含んでいてもよい。非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）はまた、以下の改変、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）が非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）定常ドメインに融合したヒト可変ドメインを含むＢ細胞または抗体を産生するように、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）定常領域核酸配列と機能的に連結した完全ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子座、あるいは、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）が非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）定常領域に融合したヒト可変ドメインを含むＢ細胞または抗体を産生するように、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）定常領域核酸配列と機能的に連結したヒト重鎖及び／または軽鎖可変領域、のうちの１つまたは複数をそれらの生殖細胞系内に含んでいてもよい。一例として、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを使用してもよい。例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、ＵＳ８，７９１，３２３、ＵＳ８，８９５，８０２、ＵＳ８，８９５，８０１、ＵＳ７，１０５，３４８、ＵＳ２００２／０１０６６２９、ＵＳ２００７／００６１９００、ＵＳ２０１１／０２５８７１０、ＵＳ２０１１／０２８３３７６、ＵＳ２０１３／０２１０１３７、ＵＳ２０１４／００１７７８１、ＵＳ２０１４／００２０１２４、ＵＳ２０１４／００２０１２５、ＵＳ２０１４／００１７７８２、ＵＳ２０１４／００１８５２２、ＵＳ２０１４／００３３３３７、ＵＳ２０１４／００３３３３６、ＵＳ２０１４／００４１０６８、ＵＳ２０１４／００７３０１０、ＵＳ２０１４／００２３６３７、ＵＳ２０１４／００１７２３８、ＵＳ２０１４／００１３４５７、ＵＳ２０１４／００１７２２９、ＵＳ２００２／０１８３２７５、ＵＳ８，５０２，０１８、ＵＳ２０１２／０３２２１０８、ＵＳ２０１３／０２５４９１１、ＵＳ２０１４／０２１３７７３、ＵＳ２０１５／０２０１５８９、ＵＳ２０１５／０２１０７７６、ＵＳ２０１４／００１７２２８、ＵＳ８，６４２，８３５、ＵＳ８，６９７，９４０、及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３－５１５８を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、対応するヒト免疫グロブリン可変領域を内在遺伝子座に有するマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）とマウス免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）をコードする生殖細胞系可変領域の正確で大規模な置換を含んでいる。この正確な置換により、重鎖及び軽鎖にヒト可変領域とマウス定常領域を持たせたハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスがもたらされる。マウスＶＨ－ＤＨ－ＪＨセグメントとマウスＶκ－Ｊκセグメントを正確に置換することにより、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座において隣接するマウス配列がインタクトかつ機能的に維持される。そのマウスの液性免疫機構は、野生型マウスの液性免疫機構と同様に機能する。抗原誘発後のマウスにおいて、あらゆる重要な点でもＢ細胞の発生は妨げられず、多様性に富んだヒト可変領域が生成される。
上記の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）（例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス）はまた、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ＡＤＡＭ６遺伝子、またはその相同体、オルソログもしくは機能性フラグメントをコードする機能性異所核酸配列をそれらの生殖細胞系内に含んでいてもよい。例えば、このような非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）は、機能性内在ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いて、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ＡＤＡＭ６機能の喪失を補うための機能性異所核酸配列を含んでいてもよい。例えば、機能性異所配列は、１つまたは複数のＡｄａｍ６遺伝子、例えば、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子、マウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子、または、Ａｄａｍ６ａ遺伝子とＡｄａｍ６ｂ遺伝子の両方を含んでいてもよい。異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座または他の位置に存在していてもよい。例えば、ＵＳ２０１２／０３２２１０８；ＵＳ２０１３／０２５４９１１；ＵＳ２０１４／０２１３７７３；ＵＳ２０１５／０２０１５８９；ＵＳ２０１５／０２１０７７６；ＵＳ２０１４／００１７２２８；及び、ＵＳ２０１３／０１９８８７９を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、ヒト軽鎖可変ドメインの限定的なレパートリー、または、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの限定的なレパートリー由来の単一ヒト軽鎖可変ドメインを発現するように遺伝子組換えされた非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）が挙げられる。このような非ヒト動物は「ユニバーサル軽鎖」または「共通軽鎖」を産生し、二重特異性抗体の作製に有用であり得る。例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４；ＵＳ２０１２／００２１４０９；ＵＳ２０１２／０１９２３００；ＵＳ２０１５／００５９００９；ＵＳ２０１３／００４５４９２；ＵＳ２０１３／０１９８８８０；ＵＳ２０１３／０１８５８２１；ＵＳ２０１３／０３０２８３６；ＵＳ２０１３／０２４７２３４；ＵＳ２０１４／０３２９７１１；及び、ＵＳ２０１３／０１９８８７９を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。例えば、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）は、再構成されて、単一軽鎖を発現する（または２つの軽鎖の一方または両方を発現する）再構成ヒト軽鎖可変領域遺伝子（または２つの再構成軽鎖可変領域遺伝子）を形成する、単一の非再構成ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子組換えされてもよい。再構成ヒト軽鎖可変ドメインは、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）により選択された複数の親和性成熟ヒト重鎖とペアとなることが可能であり、重鎖可変領域は異なるエピトープに特異的に結合する。
軽鎖選択肢の限定的なレパートリーを得るために、天然非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）軽鎖可変ドメインを生成または再構成するその機能が非機能性または実質的に非機能性となるように、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）を遺伝子改変してもよい。このことは、例えば、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）の軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることにより達成可能である。その後、外来ヒト可変領域遺伝子セグメントが再構成されて内在非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）軽鎖定常領域遺伝子と組換えを起こし再構成リバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）定常）を生成するような方法で、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）軽鎖定常領域と機能的に連結した、選択した外来で好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントにより、内在非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）遺伝子座を改変してもよい。
上記の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）（例えば、「ユニバーサル軽鎖」または「共通軽鎖」）はまた、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ＡＤＡＭ６遺伝子、またはその相同体、オルソログもしくは機能性フラグメントをコードする機能性異所核酸配列をそれらの生殖細胞系内に含んでいてもよい。同様に、本明細書に記載するその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）のいずれかはまた、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ＡＤＡＭ６遺伝子、またはその相同体、オルソログもしくは機能性フラグメントをコードする機能性異所核酸配列をそれらの生殖細胞系内に含んでいてもよい。例えば、このような非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）は、機能性内在ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いて、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ＡＤＡＭ６機能の喪失を補うための機能性異所核酸配列を含んでいてもよい。異所性核酸配列は、ヒト重鎖可変領域遺伝子座または他の位置に存在していてもよい。例えば、ＵＳ２０１２／０３２２１０８；ＵＳ２０１３／０２５４９１１；ＵＳ２０１４／０２１３７７３；ＵＳ２０１５／０２０１５８９；ＵＳ２０１５／０２１０７７６；ＵＳ２０１４／００１７２２８；及び、ＵＳ２０１３／０１９８８７９を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、重鎖定常領域核酸配列と機能的に連結した非再構成軽鎖Ｖセグメント及び非再構成Ｊセグメントをその生殖細胞系内に含む非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１２／００９６５７２、ＵＳ２０１４／０１３０１９４、及びＵＳ２０１４／０１３０１９３を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の１つの例は、内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖遺伝子座における全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント、及び、全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメントの、複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（Ｖκ）遺伝子セグメント及び複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖結合（Ｊκ）遺伝子セグメントを含み内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖定常（ＣＨ）領域と機能的に連結したヌクレオチド配列への置換を含む改変内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座、をその生殖細胞系ゲノムが含む非ヒト動物であり、複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及び複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメントは、Ｂ細胞の発生中にＢ細胞内において再構成に関与し、改変内在重鎖遺伝子座において内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖ＣＨ領域と機能的に連結した再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ遺伝子配列を形成する。このような非ヒト動物の別の例は、内在非ヒト動物重鎖遺伝子座において内在非ヒト動物重鎖定常領域と機能的に連結した第１の非再構成ヒトカッパ軽鎖可変（Ｖκ）遺伝子セグメント及び非再構成ヒトカッパ軽鎖結合（Ｊκ）遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む非ヒト動物であり、第１の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメント及び非再構成ヒトＪκ遺伝子セグメントは、全ての機能性内在非ヒト動物重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、全ての機能性内在非ヒト動物多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント、及び、全ての機能性内在非ヒト動物重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメントを置換し、第１の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメント及び非再構成ヒトＪκ遺伝子セグメントは再構成に関与し、非ヒト動物における内在非ヒト動物重鎖定常領域と機能的に連結した再構成Ｖκ／Ｊκ配列を形成し、非ヒト動物は更に、非ヒト動物軽鎖定常遺伝子と機能的に連結した第２のヒト軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメント及びヒト軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む。このような非ヒト動物の更に別の例は、（ａ）改変されて、内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖遺伝子座における全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント、及び、全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）遺伝子セグメントの、第１の複数の非再構成ヒト軽鎖可変（Ｖκ）遺伝子セグメント及び第１の複数の非再構成ヒト軽鎖結合（Ｊκ）遺伝子セグメントへの置換を含む内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座（第１の複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントは、内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座において内在重鎖定常（ＣＨ）領域核酸配列と機能的に連結し、Ｂ細胞の発生中にＢ細胞内において再構成に関与し、内在非ヒト動物ＣＨ領域核酸配列と機能的に連結した第１の再構成ヒト軽鎖Ｖκ／Ｊκ遺伝子配列を生成する）、及び（ｂ）内在非ヒト動物軽鎖遺伝子座において内在非ヒト動物軽鎖定常（Ｃκ）領域核酸配列と機能的に連結した第２の複数の非再構成ヒト軽鎖可変（Ｖκ）遺伝子セグメント及び第２の複数の非再構成ヒト軽鎖結合（Ｊκ）遺伝子セグメントを含む改変免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（第２の複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントは、内在鎖遺伝子座において全ての機能性内在非ヒト動物軽鎖可変（Ｖκ）遺伝子セグメント及び全ての機能性内在非ヒト動物軽鎖結合（Ｊκ）遺伝子セグメントを置換し、Ｂ細胞の発生中にＢ細胞内において再構成に関与し、内在非ヒト動物Ｃκ領域核酸配列と機能的に連結した第２の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ領域遺伝子配列を形成する）、をそのゲノムが含む非ヒト動物である。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、内在非ヒト動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列と機能的に連結した再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系ゲノム内に含む非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／００２０２２４、ＵＳ２０１４／０２４５４６８、ＵＳ２０１６／０１００５６１、ＵＳ９，２０４，６２４、及びＵＳ１４／９６１，６４２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の１つの例は、内在重鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結した再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるその生殖細胞系ゲノム内に含む非ヒト動物であり、再構成重鎖可変領域ヌクレオチド配列はＶＨ３－２３／Ｘ１Ｘ２／ＪＨの配列をコードし、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は任意のアミノ酸である。このような非ヒト動物の別の例は、内在非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列と機能的に連結した再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子組換え内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系ゲノム内に含む非ヒト動物であり、非ヒト動物は、Ｂ細胞集団の点において野生型非ヒト動物と実質的に類似した液性免疫機構を示す。このような非ヒト動物の更に別の例は、スペーサーを介して重鎖Ｊセグメント（ＪＨ）配列と機能的に連結した重鎖Ｖセグメント（ＶＨ）配列を含む再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子組換え内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であり、スペーサーは少なくとも２つのアミノ酸残基を含んでコードし、再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は内在非ヒト動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列と機能的に連結する。１つの例において、ＶＨセグメントはＶＨ３－２３である。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列と機能的に連結した単一のヒト非再構成ＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒト非再構成ＤＨ遺伝子セグメント、及び、１つまたは複数のヒト非再構成ＪＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とする、制限された免疫グロブリン重鎖遺伝子座、をその生殖細胞系ゲノムが含む非ヒト動物が挙げられ、非ヒト動物は、制限された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来する再構成ヒト重鎖可変領域遺伝子配列を含むＢ細胞を更に含む。例えば、ＵＳ２０１３／０３２３７９１及びＵＳ２０１３／００９６２８７を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。一部のこのような非ヒト動物において、単一の非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントはＶＨ１－６９である。一部のこのような非ヒト動物において、単一の非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントはＶＨ１－２である。使用可能なその他の非ヒト動物としては、その内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び、１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、機能性内在免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含まないという点で制限された非ヒト動物が挙げられ、非ヒト動物は、１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントと機能的に連結した１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントを更に含み、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び、１つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結し、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントはＶＨ１－６９またはその多型変異体である。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子組換え免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系ゲノム内に含む非ヒト動物が挙げられ、非再構成重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヒスチジンコドンの付加、または、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンへの置換を含み、ヒスチジンコドンは、対応するヒト生殖細胞系重鎖可変領域遺伝子セグメントによってはコードされず、付加または置換ヒスチジンコドンは相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列内に存在する。例えば、ＵＳ２０１３／０２４７２３５、ＵＳ９，３０１，５１０、及びＵＳ１４／０４６，５０１を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、内在ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の欠失を含む生殖細胞系遺伝子改変を含む非ヒト動物が挙げられ、非ヒト動物は機能性ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭ定常領域遺伝子を発現し、非ヒト動物は、ＣＨ１ドメインの全てまたは一部を欠き関連軽鎖を欠くＩｇＧ抗体をその血清内において発現する。例えば、ＵＳ２０１１／０１４５９３７、ＵＳ２０１４／０２８９８７６、ＵＳ２０１５／０１９７５５３、ＵＳ２０１５／０１９７５５４、ＵＳ２０１５／０１９７５５５、ＵＳ２０１５／０１９６０１５、ＵＳ２０１５／０１９７５５６、ＵＳ２０１５／０１９７５５７、及びＵＳ８，７５４，２８７を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、生殖細胞系改変を含む非ヒト動物であり、その改変は、（ａ）内在ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失、及び（ｂ）１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの含有を含み、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは（ａ）の内在ＩｇＧ定常領域と機能的に連結し、非ヒト動物はインタクトＩｇＭ定常領域遺伝子を含み、非ヒト動物は、ヒト可変ドメインを含み、ＣＨ１ドメインの全てまたは一部を欠き、関連軽鎖を欠くＩｇＧ重鎖抗体を発現し、上記ＩｇＧ重鎖抗体をその血清内に分泌する。例えば、ＵＳ２０１１／０１４５９３７を参照されたい。このような非ヒト動物の別の例は、生殖細胞系改変を含む非ヒト動物であり、その改変は、（ａ）内在ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードする核酸配列の欠失、及び（ｂ）１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの含有を含み、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは（ａ）の内在ＩｇＧ定常領域と機能的に連結し、非ヒト動物はインタクトＩｇＭ定常領域遺伝子を含む。例えば、ＵＳ２０１５／０１９７５５３を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、生殖細胞系改変を含む非ヒト動物であり、その改変は、（ａ）内在ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列の欠失、（ｂ）内在ＩｇＧ２ａ定常領域遺伝子の欠失、（ｃ）内在ＩｇＧ２ｂ定常領域遺伝子の欠失、及び（ｄ）１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの含有を含み、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは（ａ）の内在ＩｇＧ定常領域と機能的に連結し、非ヒト動物はインタクトＩｇＭ定常領域遺伝子を含む。例えば、ＵＳ２０１５／０１９７５５４を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、生殖細胞系改変を含む非ヒト動物であり、その改変は、（ａ）内在ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードする核酸配列の欠失、（ｂ）内在ＩｇＧ２ａ定常領域遺伝子の欠失、（ｃ）内在ＩｇＧ２ｂ定常領域遺伝子の欠失、及び（ｄ）１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの含有を含み、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは（ａ）の内在ＩｇＧ定常領域と機能的に連結し、非ヒト動物はインタクトＩｇＭ定常領域遺伝子を含む。例えば、ＵＳ２０１５／０１９７５５５を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、生殖細胞系改変を含む非ヒト動物であり、その改変は、（ａ）内在ＩｇＧ１定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列の欠失、（ｂ）内在ＩｇＤ定常領域遺伝子の欠失、（ｃ）内在ＩｇＧ３定常領域遺伝子の欠失、（ｄ）内在ＩｇＧ２ａ定常領域遺伝子の欠失、（ｅ）内在ＩｇＧ２ｂ定常領域遺伝子の欠失、（ｆ）内在ＩｇＥ定常領域遺伝子の欠失、（ｇ）内在ＩｇＡ定常領域遺伝子の欠失、及び（ｈ）１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの含有を含み、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは（ａ）の内在ＩｇＧ１定常領域と機能的に連結し、非ヒト動物はインタクトＩｇＭ定常領域遺伝子を含む。例えば、ＵＳ２０１５／０１９６０１５を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、生殖細胞系改変を含む非ヒト動物であり、その改変は、（ａ）内在ＩｇＧ１定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列の欠失、（ｂ）内在ＩｇＧ２ａ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列の欠失、（ｃ）内在ＩｇＤ定常領域遺伝子の欠失、（ｄ）内在ＩｇＧ３定常領域遺伝子の欠失、（ｅ）内在ＩｇＧ２ｂ定常領域遺伝子の欠失、（ｆ）内在ＩｇＥ定常領域遺伝子の欠失、（ｇ）内在ＩｇＡ定常領域遺伝子の欠失、及び（ｈ）１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの含有を含み、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは（ａ）の内在ＩｇＧ１定常領域と機能的に連結し、非ヒト動物はインタクトＩｇＭ定常領域遺伝子を含む。例えば、ＵＳ２０１５／０１９７５５６を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、生殖細胞系改変を含む非ヒト動物であり、その改変は、（ａ）内在ＩｇＧ１定常領域遺伝子のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードする核酸配列の欠失、（ｂ）内在ＩｇＤ定常領域遺伝子の欠失、（ｃ）内在ＩｇＧ３定常領域遺伝子の欠失、（ｄ）内在ＩｇＧ２ａ定常領域遺伝子の欠失、（ｅ）内在ＩｇＧ２ｂ定常領域遺伝子の欠失、（ｆ）内在ＩｇＥ定常領域遺伝子の欠失、（ｇ）内在ＩｇＡ定常領域遺伝子の欠失、及び（ｈ）１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの含有を含み、１つまたは複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは（ａ）の内在ＩｇＧ１定常領域と機能的に連結し、非ヒト動物はインタクトＩｇＭ定常領域遺伝子を含む。例えば、ＵＳ２０１５／０１９７５５７を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、非ヒト動物κ軽鎖定常領域配列と連続したλ軽鎖可変領域配列（Ｖλ）及び少なくとも１つのＪ配列（Ｊ）を含む非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１２／００７３００４、ＵＳ２０１４／０１３７２７５、ＵＳ２０１５／０２４６９７６、ＵＳ２０１５／０２４６９７７、ＵＳ２０１５／０３５１３７１、ＵＳ９，０３５，１２８、ＵＳ９，０６６，５０２、ＵＳ９，１６３，０９２、及びＵＳ９，１５０，６６２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の１つの例は、（ａ）内在非ヒト動物軽鎖遺伝子座における少なくとも１２～少なくとも４０の非再構成ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメント及び少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメント、（ｂ）少なくとも１２～少なくとも４０のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪλ配列の間に位置するヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間配列を含む非ヒト動物であり、非ヒト動物は、ヒトＶλドメイン及び非ヒト動物Ｃκドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。このような非ヒト動物の更に別の例は、（ａ）複数の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｖ（ｈＶλ）遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｊ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む非再構成軽鎖可変領域（複数のｈＶλ遺伝子セグメント及び複数のｈＪλ遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域内における唯一の機能性可変領域遺伝子セグメントである）、及び（ｂ）非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子（複数の連続非再構成ヒトλ軽鎖Ｖ（ｈＶλ）遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成ヒトλ軽鎖Ｊ（ｈＪλ）遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域が再構成されて再構成ヒトλ軽鎖可変領域を生成可能なように、また再構成ヒトλ軽鎖可変領域によりコードされる可変領域及び非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常領域を含む軽鎖を含む抗体を非ヒト動物が発現するように、非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、をその生殖細胞系内の内在κ軽鎖遺伝子座に含む非ヒト動物である。このような非ヒト動物の更に別の例は、（ａ）（ｉ）少なくとも１２の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖可変領域（ｈＶλ）遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｊ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む非再構成軽鎖可変領域（少なくとも１２の機能性ｈＶλ遺伝子セグメント及び複数の機能性ｈＪλ遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域内における唯一の機能性可変領域遺伝子セグメントである）、及び（ｉｉ）連続ｈＶλ遺伝子セグメントと複数の連続ｈＪλ遺伝子セグメントの間に位置するヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間配列、を含む非再構成軽鎖可変領域、及び（ｂ）非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子（少なくとも１２の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｖ（ｈＶλ）遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｊ（ｈＪλ）遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域が再構成されて再構成ヒトλ軽鎖可変領域を生成可能なように、また再構成ヒトλ軽鎖可変領域によりコードされる可変領域及び非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常領域を含む軽鎖を含む抗体を非ヒト動物が発現するように、非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、をその生殖細胞系内の内在κ軽鎖遺伝子座に含む非ヒト動物である。このような非ヒト動物の更に別の例は、（ａ）複数の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｖ（ｈＶλ）遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｊ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む非再構成軽鎖可変領域（複数のｈＶλ遺伝子セグメント及び複数のｈＪλ遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域内における唯一の機能性可変領域遺伝子セグメントである）、及び（ｂ）非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子（複数の連続非再構成機能性ｈＶλ遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成機能性ｈＪλ遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域が再構成されて再構成ヒトλ軽鎖可変領域を生成可能なように、また再構成ヒトλ軽鎖可変領域によりコードされる可変ドメイン及び非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常ドメインを含む軽鎖を含む抗体を非ヒト動物が発現するように、非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物である。このような非ヒト動物の更に別の例は、（ａ）（ｉ）少なくとも１２の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｖ（ｈＶλ）遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成機能性ヒトλ軽鎖Ｊ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む非再構成軽鎖可変領域（少なくとも１２の機能性ｈＶλ遺伝子セグメント及び複数の機能性ｈＪλ遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域内における唯一の機能性可変領域遺伝子セグメントである）、及び（ｉｉ）連続ｈＶλ遺伝子セグメントと複数の連続ｈＪλ遺伝子セグメントの間に位置するヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間配列、を含む非再構成軽鎖可変領域、及び（ｂ）非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子（少なくとも１２の連続非再構成機能性ｈＶλ遺伝子セグメント及び複数の連続非再構成機能性ｈＪλ遺伝子セグメントは、非再構成軽鎖可変領域が再構成されて再構成ヒトλ軽鎖可変領域を生成可能なように、また再構成ヒトλ軽鎖可変領域によりコードされる可変ドメイン及び非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常ドメインを含む軽鎖を含む抗体を非ヒト動物が発現するように、非ヒト動物κ軽鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物である。このような非ヒト動物の更に別の例は、非ヒト動物κ定常ドメインと融合したヒトλ可変ドメイン配列を含む免疫グロブリン軽鎖を非ヒト動物が発現するように、非ヒト動物Ｃκ遺伝子と機能的に連結したヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン遺伝子座をそのゲノムが含む非ヒト動物である。例えば、ＵＳ９，２２６，４８４を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、その生殖細胞系内の内在非ヒト動物軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖可変領域配列を含む非ヒト動物が挙げられ、ヒトラムダ可変領域配列は、非ヒト動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列を含む軽鎖内で発現される。例えば、ＵＳ２０１３／０３２３７９０、ＵＳ２０１３／０３２６６４７、ＵＳ２０１５／００８９６８０、ＵＳ２０１５／０１７３３３１、ＵＳ２０１５／０１７６００２、ＵＳ２０１５／０１７３３３２、ＵＳ２０１２／００７０８６１、ＵＳ２０１５／０３２００２３、ＵＳ２０１６／００６０３５９、ＵＳ２０１６／００５７９７９、ＵＳ９，０２９，６２８、ＵＳ９，００６，５１１、ＵＳ９，０１２，７１７、ＵＳ９，２０６，２６１、ＵＳ９，２０６，２６２、ＵＳ９，２０６，２６３、及びＵＳ９，２２６，４８４を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、非ヒト動物定常領域と融合したヒトラムダ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する非ヒト動物であり、非ヒト動物は約１：１のκ使用率：λ使用率を示す。例えば、ＵＳ９，０２９，６２８を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、内在Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントのヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントへの置換を含む内在非再構成κ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座をそのゲノムが含む非ヒト動物であり、非ヒト動物κ定常領域と融合したヒトλ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を非ヒト動物が発現するように、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントは非ヒト動物Ｃκ遺伝子と機能的に連結する。例えば、ＵＳ９，００６，５１１を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、（ｉ）第１の内在Ｖλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターの欠失、及び（ｉｉ）第２の内在Ｖλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスター内の内在Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメントのフラグメントの、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントへの置換、を含む内在λ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座をそのゲノムが含む非ヒト動物であり、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントは少なくとも１つのヒトＶλ遺伝子セグメント及び少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントは非ヒト動物Ｃλ遺伝子と機能的に連結する。例えば、ＵＳ９，０１２，７１７を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有する非ヒト動物が挙げられ、改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、非ヒト動物は、非ヒト動物ＡＤＡＭ６タンパク質、またはそのオルソログもしくは相同体、もしくは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能性フラグメントをコードする核酸配列を更に含む。例えば、ＵＳ２０１２／０３２２１０８、ＵＳ２０１３／０２５４９１１、ＵＳ２０１４／０２１３７７３、ＵＳ２０１５／０２０１５８９、ＵＳ２０１５／０２１０７７６、ＵＳ２０１４／００１７２２８、ＵＳ８，６４２，８３５、及びＵＳ８，６９７，９４０を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、（ａ）ＡＤＡＭ６遺伝子の異所性配置、及び（ｂ）内在非ヒト動物重鎖遺伝子座内への、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入を含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座、をそのゲノムが含む非ヒト動物であり、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントが重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結しているために、非ヒト動物は、（ｉ）生殖能力があり、（ｉｉ）抗原で免疫化した場合に、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる重鎖定常ドメインと機能的に連結した１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントによりコードされる重鎖可変ドメインを含む抗体を産生すること（抗体は抗原に対する特異的結合を示す）を特徴とする。例えば、ＵＳ８，６４２，８３５を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、（ａ）非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への１つまたは複数のヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントの挿入、（ｂ）非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び、１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入、及び（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能性フラグメントをコードするヌクレオチド配列（ＡＤＡＭ６タンパク質は異所性ＡＤＡＭ６核酸配列から発現される）、を含む非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１３／０１６０１５３及びＵＳ２０１４／００１７２２８を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、（ａ）非ヒト動物免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子の上流への１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの挿入、（ｂ）非ヒト動物免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流への１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び、１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入、及び（ｃ）非ヒト動物ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列（非ヒト動物ＡＤＡＭ６タンパク質は異所性ヌクレオチド配列から発現される）、をそのゲノムが含む非ヒト動物である。例えば、ＵＳ２０１３／０１６０１５３を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンへの置換または少なくとも１つのヒスチジンコドンの挿入をＣＤＲ３コード配列内に含む非再構成免疫グロブリン可変遺伝子配列を含む免疫グロブリン遺伝子座、をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物が挙げられ、非ヒト動物は抗体の多様なレパートリーをインビボで更に含み、抗体の多様なレパートリーのそれぞれは、目的の抗原に特異的であり、非再構成免疫グロブリン可変遺伝子配列内の少なくとも１つのヒスチジンコドン置換または挿入によりコードされる少なくとも１つのヒスチジンアミノ酸を可変ドメインのＣＤＲ３内に含む。例えば、ＵＳ２０１３／０２４７２３６及びＵＳ２０１４／００８２７６０を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。１つの例では、第１の免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、非再構成ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを含む非再構成免疫グロブリン重鎖可変領域配列の機能性部分を含み、非再構成ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントのうちの１つまたは複数は、対応する野生型生殖細胞系遺伝子セグメントによってはコードされない挿入または置換ヒスチジンコドンを含む。別の例では、非再構成ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、非再構成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び非再構成ヒトＪＨ遺伝子セグメントである。別の実施形態では、少なくとも１つのヒスチジンコドンの挿入または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンへの置換を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む第２の免疫グロブリン可変領域遺伝子座をその生殖細胞系内に含み、挿入または置換ヒスチジンコドンは、対応する野生型生殖細胞系免疫グロブリン可変領域配列によってはコードされず、非ヒト動物は、非ヒト動物の生殖細胞系内におけるヒスチジン置換または挿入に由来するヒスチジンを含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する。例えば、ＵＳ２０１３／０２４７２３６を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、（ａ）非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントの挿入、（ｂ）非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントの挿入、及び（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能性フラグメントをコードするヌクレオチド配列（ＡＤＡＭ６タンパク質は異所性ＡＤＡＭ６核酸配列から発現される）、を含む非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１３／０２１２７１９を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、（ａ）非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子の上流への１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントの挿入（１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、（ｂ）非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流への１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントの挿入（１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、及び（ｃ）非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする挿入核酸配列（非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）ＡＤＡＭ６タンパク質は、２つの免疫グロブリン重鎖と対になった２つの免疫グロブリン軽鎖をそれぞれが含む抗体を非ヒト動物のＢ細胞が発現するように、挿入核酸配列から発現され、それぞれの軽鎖はヒト軽鎖可変ドメイン及び非ヒト軽鎖定常ドメインを含み、それぞれの重鎖はヒト軽鎖可変ドメイン及び非ヒト重鎖定常ドメインを含む）、をそのゲノムが含む非ヒト動物である。例えば、ＵＳ２０１３／０２１２７１９を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、（ａ）単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列、及び（ｂ）雄非ヒト動物において機能するＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列（ＡＤＡＭ６をコードする配列は、野生型非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子座とは異なる位置に配置される）、をその生殖細胞系内に有する非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１３／０３３３０５７を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、（ａ）単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む非再構成ヒトゲノム配列（単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２、ＶＨ１－６９、ＶＨ２－２６、ＶＨ２－７０、またはその多型変異体である）、及び（ｂ）雄非ヒト動物において機能するＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列（ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列は、野生型非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子座とは異なる位置に配置される）、をその生殖細胞系内に有する非ヒト動物である。例えば、ＵＳ２０１３／０３３３０５７を参照されたい。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、（ａ）免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）（単一再構成ヒトＶＬ／ＪＬ領域は、ヒトＶκ１－３９／Ｊ遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３－２０／Ｊ遺伝子セグメント（例えば、Ｖκ１－３９／Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３－２０／Ｊκ１遺伝子セグメント）から選択される）、及び（ｂ）内在重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントへの置換（ヒトＶＨ遺伝子セグメントは内在重鎖定常（ＣＨ）領域遺伝子と機能的に連結し、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト／非ヒト動物キメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）、を含む非ヒト動物が挙げられる。このような非ヒト動物を「ユニバーサル軽鎖」（ＵＬＣ）または「共通軽鎖」非ヒト動物と呼ぶ場合もある。例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４、ＵＳ２０１２／００２１４０９、ＵＳ２０１２／０１９２３００、ＵＳ２０１５／００５９００９、ＵＳ２０１３／００４５４９２、ＵＳ２０１３／０１９８８８０、ＵＳ２０１３／０１８５８２１、ＵＳ２０１３／０３０２８３６、ＵＳ２０１５／０３１３１９３、及びＵＳ１５／０５６，７１３を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。同様に、使用可能な別の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、抗体の集団を発現する非ヒト動物が挙げられ、非ヒト動物の生殖細胞系は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子である単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子のみを含み、非ヒト動物は、１つのコピーのみを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にヘテロ接合性であるか、または、２つのコピーを含有するという点で単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にホモ接合性であるかのいずれかであり、非ヒト動物は、（ｉ）集団のそれぞれの免疫グロブリンカッパ軽鎖は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子またはその体細胞変異体によりコードされる軽鎖可変ドメインを含み、（ｉｉ）集団は、その軽鎖可変ドメインが再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体、及び、その軽鎖可変ドメインがその体細胞変異体によりコードされる免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体を含み、（ｉｉｉ）非ヒト動物は、免疫グロブリンカッパ軽鎖と成功裏にペアとなり集団の抗体を形成する体細胞変異高親和性重鎖の多様な集団を産生するために、活性な親和性成熟を特徴とする。このような非ヒト動物の一例は、その生殖細胞系内において、（ａ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列（単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する）、及び単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在非ヒト動物κ定常領域と機能的に連結する）、を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在非ヒト動物κ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に、及び（ｂ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入に（ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／非ヒト動物キメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる）ヘテロ接合性またはホモ接合性な非ヒト動物である。配列番号：１４８は遺伝子改変ヒトＶκ１－３９Ｊκ５遺伝子座の配列であり、配列番号：１４９は遺伝子改変ヒトＶκ３－２０Ｊκ１遺伝子座の配列である。例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、（ｉ）免疫グロブリンハイブリッド鎖をコードするハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座（ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座は、そのそれぞれが少なくとも機能性ＣＨ１ドメインをコードする１つまたは複数の重鎖定常領域遺伝子を含む免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列と機能的に連結した非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含み、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは再構成されて、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列と機能的に連結した再構成ヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含むハイブリッド配列を形成することができる）、（ｉｉ）ヒトユニバーサル軽鎖をコードし、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列と機能的に連結したヒトユニバーサル再構成軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖遺伝子座、をその生殖細胞系ゲノム内に含む、ヒトＶＬ／ＣＨ ｘ ＵＬＣドメインの生成に有用な非ヒト動物が挙げられ、非ヒト動物は、ハイブリッド遺伝子座に由来するヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖及び軽鎖遺伝子座に由来する関連ヒトユニバーサル軽鎖を含む抗原結合タンパク質を産生することができ、ヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖は、機能性ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＡ領域に融合したヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ｈＶＬ／ＣＨ ｘ ＵＬＣ）ドメインを含み、ヒトユニバーサル軽鎖は軽鎖定常ドメインに融合したヒト免疫グロブリン軽鎖を含む。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２３２８９を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、（ｉ）全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変ＶＨ遺伝子セグメント、全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖多様性ＤＨ遺伝子セグメント、及び、全ての機能性内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖結合ＪＨ遺伝子セグメントの、そのそれぞれが少なくとも機能性ＣＨ１ドメインをコードする１つまたは複数の重鎖定常領域遺伝子を含む内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖定常領域核酸と機能的に連結した複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変Ｖκ遺伝子セグメント及び複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖結合Ｊκ遺伝子セグメントへの置換、を含む改変内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座（複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ遺伝子セグメント及び複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊκ遺伝子セグメントは、Ｂ細胞の発生中にＢ細胞内において再構成に関与し、内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖遺伝子座において内在非ヒト動物免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列と機能的に連結した第１の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域Ｖκ／Ｊκヌクレオチド配列を形成する）、及び（ｉｉ）再構成Ｖκ１－３９／Ｊκ５またはＶκ３－２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む改変内在軽鎖遺伝子座（単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、内在非ヒト動物免疫グロブリン軽鎖定常領域ｋ遺伝子配列と機能的に連結する）、をその生殖細胞系ゲノム内に含む、ヒトＶＬ／ＣＨ ｘ ＵＬＣドメインの生成に有用な非ヒト動物であり、非ヒト動物は、改変内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座に由来するヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖及び改変内在軽鎖遺伝子座に由来する関連ヒトユニバーサル軽鎖を含む抗原結合タンパク質を産生することができ、ヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖は、機能性ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＡ領域に融合したヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ｈＶＬ／ＣＨ ｘ ＵＬＣ）ドメインを含み、ヒトユニバーサル軽鎖は軽鎖定常ドメインに融合したヒト免疫グロブリン軽鎖を含む。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列と機能的に連結した再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖免疫グロブリン遺伝子座をその生殖細胞系ゲノム内（例えば、内在非ヒト軽鎖遺伝子座に）に含む非ヒト動物が挙げられ、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列と機能的に連結した再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列はユニバーサル軽鎖をコードし、非ヒト動物は、免疫グロブリンハイブリッド鎖及びユニバーサル軽鎖を含む抗原結合タンパク質を発現する細胞、例えば、リンパ球、例えば、Ｂ細胞を産生可能であるまたは実際に産生する。例えば、ＵＳ２０１３／０２４７２３４、ＵＳ２０１４／０３２９７１１、ＵＳ２０１４／００１３４５６、ＵＳ２０１５／０１１９５５６、ＵＳ２０１５／０２５０１５１、ＵＳ９，３３４，３３４、及びＵＳ９，３３２，７４２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。一部のこのような非ヒト動物は、再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列にホモ接合性である。一部のこのような非ヒト動物は、再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列にヘテロ接合性である。一部のこのような非ヒト動物において、軽鎖定常領域核酸配列はカッパ配列である。一部のこのような非ヒト動物において、軽鎖定常領域核酸配列はラムダ配列である。一部のこのような非ヒト動物において、第２の免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖カッパ遺伝子座である。一部の実施形態では、第２の免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖ラムダ遺伝子座である。このような非ヒト動物の一例は、ヒトＶκ及びＪκセグメント配列を含む単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物であり、Ｖκセグメント配列はヒトＶκ１－３９またはＶκ３－２０遺伝子セグメントに由来し、単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、Ｖκセグメント配列の少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１（ＩＭＧＴのナンバリングに従う）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される位置において発現されるヒスチジンコドンへの置換を含む。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、（ａ）重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した少なくとも１つの非再構成ヒトＶＨセグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤＨセグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪＨセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座、（ｂ）軽鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した１つ以下または２つ以下の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座、及び（ｃ）機能性非ヒト動物ＡＤＡＭ６タンパク質、またはその機能性オルソログもしくは機能性相同体もしくは機能性フラグメントを発現する異所性核酸配列、をそのゲノムが含む非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１３／０１９８８７９を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、（ａ）少なくとも１つの非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座（ヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座は免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、（ｂ）（ｉ）単一の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列（単一の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列は再構成ヒトＶκ１－３９／Ｊκ配列または再構成ヒトＶκ３－２０／Ｊκ配列である）、または（ｉｉ）１つ以下のヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及び１つ以下のヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（１つ以下のヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントはＶκ１－３９またはＶκ３－２０であり、ヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座は免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子と機能的に連結する）、を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座、及び（ｃ）雄非ヒト動物において機能する非ヒト動物ＡＤＡＭ６タンパク質、またはそのオルソログもしくは相同体もしくは機能性フラグメントを発現する異所性核酸配列、をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物である。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、（ａ）内在免疫グロブリン重鎖遺伝子座における少なくとも１つの内在免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列内の欠失または不活性化変異（少なくとも１つの内在免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはこれらの組み合わせである）、ならびに、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの非再構成免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの非再構成免疫グロブリン軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列（非再構成ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、組換えを起こして、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列内に欠失または不活性化変異を含む免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した再構成免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成可能である）、及び／または、（ｉｉ）ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含む単一再構成免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（単一再構成免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、の一方または両方、をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０２８９４８９を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、（ａ）非ヒト動物重鎖遺伝子座における全てまたは事実上全ての内在免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの、（ｉ）１つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、及び、１つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント（１つまたは複数のヒト非再構成免疫グロブリン重鎖ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する）、または（ｉｉ）１つまたは複数の非再構成ヒト軽鎖ＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒト非再構成軽鎖ＪＬ遺伝子セグメント（１つまたは複数の非再構成ヒト軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結し、非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列は、全長ＩｇＭ遺伝子、ならびに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるＩｇＧ遺伝子内におけるＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列内の欠失または不活性化変異を含む）、のいずれかへの置換、及び（ｂ）全てまたは事実上全ての内在免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの、単一再構成ヒト可変Ｖκ／Ｊκ遺伝子配列への置換、を含む非ヒト動物であり、非ヒト動物は、関連軽鎖と結合したＩｇＭ重鎖を含むＢ細胞受容体を発現する。
使用可能なその他の非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）としては、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列と機能的に連結した２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物が挙げられ、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントのそれぞれは、対応するヒト生殖細胞系ＶＬ遺伝子セグメントによってはコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、ヒトＶＬ遺伝子セグメント及びＪＬ遺伝子セグメントは、抗体のヒト軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることができる。例えば、ＵＳ２０１４／００１３４５６、ＵＳ２０１５／０１１９５５６、ＵＳ２０１５／０２５０１５１、ＵＳ２０１３／０２４７２３４、及びＵＳ９，３３２，７４２を参照されたい（それぞれの記載内容全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。このような非ヒト動物の一例は、そのそれぞれがヒトＪＬ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪＬセグメントから選択される）で再構成可能であり免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコード可能である、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む非ヒト動物であり、２つ以下のＶＬ遺伝子セグメントのそれぞれ及び／またはＪＬ遺伝子セグメントは、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基への置換を含む。例えば、ＵＳ２０１４／００１３４５６を参照されたい。このような非ヒト動物の更に別の例は、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列と機能的に連結した２つの非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメント及び１つまたは複数の非再構成ヒトＪκ遺伝子セグメント（複数可）を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物であり、２つの非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントは、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンへの１つまたは複数の置換をそれぞれが含むヒトＶκ１－３９及びＶκ３－２０遺伝子セグメントであり、ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントは再構成可能であり、ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントは、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１（ＩＭＧＴのナンバリングに従う）及びこれらの組み合わせからなる群から選択される位置に１つまたは複数のヒスチジンを含むヒト軽鎖可変ドメインをコードし、１つまたは複数のヒスチジンは１つまたは複数の置換に由来する。例えば、ＵＳ２０１５／０２５０１５１を参照されたい。
ＩＶ．抗原結合タンパク質の作製方法
本明細書で開示する方法により作製した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を使用して、目的の外来標的抗原に対する抗原結合タンパク質を作製してもよい。抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を作製するためのいくつかの技術について説明してきた。免疫化マウスのＢ細胞から抗原結合タンパク質を直接単離してもよく（例えば、ＵＳ２００７／０２８０９４５を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））、及び／または、免疫化マウスのＢ細胞を使用してハイブリドーマを作製してもよい（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７を参照のこと（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる））。本明細書に記載の非ヒト動物由来の抗原結合タンパク質（重鎖及び／または軽鎖）をコードするＤＮＡは、通常の手法を用いて容易に単離及びシークエンスすることができる。本明細書に記載の非ヒト動物に由来するハイブリドーマ及び／またはＢ細胞は、このようなＤＮＡの好ましいソースとして機能する。単離後、ＤＮＡを発現ベクター内に入れてから、その発現ベクターを、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクションして、組換え宿主細胞内におけるモノクローナル抗体の合成を得てもよい。
例えば、本明細書で開示する方法により作製した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を標的抗原に曝露して、目的の外来標的抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下に維持してもよい。その後、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列及び／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を得てもよい。代替的に、その後、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から抗原結合タンパク質を単離してもよい。一例として、目的の外来抗原に特異的に結合する抗体を発現する、クローン的に選択したリンパ球を同定してもよい。
１つの例では、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を目的の外来標的抗原で免疫化し、非ヒト動物に免疫応答を備えさせて、免疫化動物からリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取し、そのリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を作製し、そのハイブリドーマ細胞から標的抗原に特異的に結合するＶＨドメインをコードする核酸配列及び／または標的抗原に特異的に結合するＶＬドメインをコードする核酸配列を得て、免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖を作製するために、免疫グロブリン定常領域またはその配列の機能性フラグメントをコードする核酸配列とインフレーム（すなわち、機能的に連結）で核酸配列をクローニングして、抗原結合タンパク質を発現可能な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内で重鎖及び軽鎖を発現させること、により抗原結合タンパク質を作製してもよい。
別の例では、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を目的の外来標的抗原で免疫化し、非ヒト動物に免疫応答を備えさせて、免疫化動物からリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を採取し、そのリンパ球から標的抗原に特異的に結合するＶＨドメインをコードする核酸配列及び／または標的抗原に特異的に結合するＶＬドメインをコードする核酸配列を得て、免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖を作製するために、免疫グロブリン定常領域またはその配列の機能性フラグメントをコードする核酸配列とインフレーム（すなわち、機能的に連結）で核酸配列をクローニングして、抗原結合タンパク質を発現可能な細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内で重鎖及び軽鎖を発現させること、により抗原結合タンパク質を作製してもよい。
目的の外来抗原による免疫化は、目的の外来抗原を発現する、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または細胞を用いて実施することができる。得られたリンパ球は、例えば、免疫化動物の脾臓、リンパ節または骨髄を含む任意のソースに由来していてもよい。
一部のこのような方法では、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインはヒトであり（例えば、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物がＩｇＨとＩｇκの両方においてホモ接合性にヒト化されている場合）、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインは、ヒト定常領域をコードする核酸配列とインフレームでクローニングされ、また作製された抗原結合タンパク質は完全ヒト抗体である。
本明細書に記載の遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物（すなわち、第１の標的ゲノム遺伝子座において遺伝子組換えされている）内で産生された、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質の産生量は通常、対照非ヒト動物（すなわち、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型）と比較して、増加する。すなわち、本明細書に記載の遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物（すなわち、第１の標的ゲノム遺伝子座において遺伝子組換えされている）内で産生された、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質は通常、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を免疫化した後に得られた抗原結合タンパク質と比較して、より高い力価を有している。例えば、力価は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍高くてもよい。用語「抗体力価」は、血清内に存在する特定抗体の濃度の測定値を含む。例えば、抗体力価は、特定のエピトープを認識する抗体を生物がどの程度産生したかの測定値であってもよく、陽性結果がなおも認められる最大希釈の逆数として表される。同様に、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を免疫化した後に得られた抗原結合タンパク質と比較して、目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のより多様なレパートリーは通常、目的の外来抗原で遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を免疫化した後に得られる。対照非ヒト動物とは、第１の標的ゲノム遺伝子座において野生型である非ヒト動物のことを意味する。遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物と対照動物の間の唯一の実質的な差異は、第１の標的ゲノム遺伝子座の状態であることが好ましい。例えば、対照動物は、その他の実質的な遺伝子改変を有さないこと、非ヒト動物の同一種であること、非ヒト動物の同一系統であること、同一遺伝的背景（第１の標的ゲノム遺伝子座以外の）を有していること、及び、遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物と同齢であることが好ましい。
上記または以下に引用する全ての特許出願、ウェブサイト、その他の刊行物、受入番号などの全ては、あたかもそれぞれの個々の事項が明示的かつ個別に参照として組み込まれることが示されるように、あらゆる目的において同程度に参照として組み込まれる。別の期間における異なるバージョンの配列が受入番号と関連付いている場合、本出願の有効出願日における受入番号と関連付いているバージョンのことを意味する。適用可能な場合の受入番号に言及する有効出願日とは、実際の出願日または優先権出願の出願日のうちの早い方のことを意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが別の期間に公示されている場合、別途記載のない限り、本出願の有効出願日の直近に公示されたバージョンのことを意味する。別途特に記載のない限り、本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態または態様を、任意のその他のものと組み合わせて使用してもよい。明確性及び理解を目的とした例示及び例として本発明をある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内における一定の変更及び修正を実施可能であることは明らかである。
配列の簡単な説明
添付の配列表に記載したヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基用の標準的な文字略語及びアミノ酸用の３文字コードを使用して示している。ヌクレオチド配列は、配列の５´末端から始まり３´末端へと前方に（すなわち、それぞれの行において左から右へと）進む標準的な慣習に従っている。それぞれのヌクレオチド配列の一方の鎖のみを示しているが、相補鎖は示した鎖のいずれかを参照することにより含まれるということを理解されたい。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まりカルボキシ末端へと前方に（すなわち、それぞれの行において左から右へと）進む標準的な慣習に従っている。
Figure 2023078479000003
Figure 2023078479000004
Figure 2023078479000005
Figure 2023078479000006
Figure 2023078479000007
Figure 2023078479000008
Figure 2023078479000009
Figure 2023078479000010
実施例１．開始コドンと終止コドンを標的とする対のガイドＲＮＡを使用した、抗体産生用のＫＯ胚性幹（ＥＳ）細胞、１細胞期胚及びマウスの作製。
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術は、完全ヒト抗体の産生を可能とするＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの作製を可能としている。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、完全ヒト化可変領域がマウス定常領域と連結した免疫グロブリンカッパ鎖（Ｉｇκ）及び重鎖（ＩｇＨ）を発現する。タンパク質の機能的に重要な領域は種を超えて保存される傾向があることから、自己抗原に対する免疫寛容が、これらの重要なエピトープに対する抗体の産生における問題を提起する場合が多い。常法に従い、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、目的の自己抗原標的にヘテロ接合性ノックアウト変異を有するＦ０マウスに改良して、免疫寛容を克服した。免疫化に好適な三重ホモ接合性マウス（目的の標的においてホモ接合性ヌル、及びＩｇＨとＩｇκの両方においてホモ接合性にヒト化）を作製するためには、更に２世代の交配及び１５～１６ヶ月間の合計期間が必要となっていた。このプロセスを加速させるために、目的の標的にヌル対立遺伝子を作製するための標的となり得るＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）胚性幹（ＥＳ）細胞を誘導した。しかしながら、あいにく、ホモ接合性ヌルＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ＥＳ細胞クローンを得るには連続的な標的化工程が必要となり、時間がかかる。より重要なことに、完全ＥＳ細胞由来Ｆ０ ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（すなわち、ＥＳ細胞を８細胞期胚に注入することで得た完全ＥＳ細胞由来Ｆ０世代マウス）を作製するための低い能力を免疫化プロジェクト用にＫＯしたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ＥＳ細胞クローンが通常示す（例えば、表２を参照のこと）だけではなく、完全ＥＳ細胞由来Ｆ０ ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（すなわち、ＥＳ細胞を８細胞期胚に注入することで得た完全ＥＳ細胞由来Ｆ０世代マウス）を作製するための一層更に低い能力を連続的に標的化したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ＥＳ細胞クローンも示す。例えば、表３（標的遺伝子改変を生成するのに用いる標準的なＥＳ細胞株、及びＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（Ｆ１Ｈ４ ＥＳ細胞株）、及び２種類のユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ）ＥＳ細胞株、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ＥＳ細胞株（ＶＩ－３Ａｄａｍ６）を使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）作製効率を比較している）を参照されたい。
Figure 2023078479000011
Figure 2023078479000012
目的の外来ヒト標的抗原に対する寛容の低いマウスを作製するために、本発明者らは、機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ＥＳ細胞（目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性）を単一改変工程で迅速に作製するための方法を開発した。本発明者らは、機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ＥＳ細胞内の目的の標的における両方の対立遺伝子上の大きな欠失を一対のガイドＲＮＡを使用して効率的に生成するための手順を最適化することにより、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を設計及び作製する必要性を除去した。この手法を使用して、目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性であり免疫化の準備が整ったＦ０ ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、１５～１６ヶ月間ではなく４～５ヶ月間で出産させることができる（目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性の仔マウスを約３ヶ月間で出産させることができるが、その後、免疫化のために４～５週間成長させる）。この実験では、ホモ接合性欠失用にこれら目的の外来標的抗原にオルソロガスな自己抗原を標的とするための対のガイドＲＮＡを設計してクローニングした。自己抗原をコードする内在遺伝子の開始及び終止コドン領域を標的とするためのガイドＲＮＡを設計した。一部の標的用に２対のｇＲＮＡ（ｖ１及びｖ２）を設計した。ガイドＲＮＡの設計プロセスについては、以下の原料及び方法に記載している。機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子（ＶＩ－３ Ａｄａｍ６）マウス（再挿入マウスＡｄａｍ６遺伝子に加えて、内在マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を対応するヒトＤＮＡへと置換した）またはユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ １－３９）マウス（ヒトＶκ１－３９／Ｊ遺伝子セグメントである単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を有するマウス）を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに由来するＥＳ細胞内に、ガイドＲＮＡをＣａｓ９と共にエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションした。図３２を参照されたい。エレクトロポレーション及びヌクレオフェクションのプロトコルについては、以下の原料及び方法に記載している。一部の実験では、欠失させる自己抗原をコードする内在遺伝子を標的とする大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と共に、Ｃａｓ９及び対のガイドＲＮＡをエレクトロポレーションした（例えば、図４を参照のこと）。ＬＴＶＥＣの有無におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＣＣ９）の使用に同等の欠失効率が認められた（表４を参照のこと）。
Figure 2023078479000013
Figure 2023078479000014
実験の開始（ｇＲＮＡの設計）から終了（自己抗原をコードする内在遺伝子のホモ接合性ヌル対立遺伝子を有するＦ０マウスの遺伝子型決定）までの時間表は約３ヶ月間であった。一例として、標的１（自己抗原１）に対応する自己抗原にホモ接合性ヌルなＦ０マウスを作製するための時間表を表５に示す。
Figure 2023078479000015
Figure 2023078479000016
それぞれの自己抗原の開始及び終止コドン領域を標的とする対のガイドＲＮＡを単独でまたは欠失させる自己抗原を標的とする大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と共に使用して、ＶＩ－３－Ａｄａｍ６マウス及びＵＬＣ １－３９マウス由来の胚性幹（ＥＳ）細胞内の様々な欠失用自己抗原を標的とするため、いくつかの実験を実施した。Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡをＤＮＡの形態でＥＳ細胞に導入した。表６及び図２８に示すように、試験した全ての自己抗原において欠失（すなわち、崩壊）を達成したが、欠失サイズは０．１ｋｂ～１６５ｋｂの範囲であり、欠失（すなわち、崩壊）のサイズと欠失（すなわち、崩壊）の生成効率の間には負の相関が認められた。二対立遺伝子崩壊ははるかに大きなサイズでも達成され得る。例えば、本発明者らは、約４００ｋｂの欠失サイズで二対立遺伝子崩壊を達成した。同様に、２つの５´ｇＲＮＡ及び２つの３´ｇＲＮＡならびに修復ベクターを使用して、マウスＩｇＨ遺伝子座における約９００ｋｂ～１Ｍｂの二対立遺伝子崩壊を約１．２％の効率で達成した（データは省略）。
Figure 2023078479000017
Figure 2023078479000018
ＥＳ細胞を使用した手順同様、目的の外来ヒト標的抗原に対する寛容の低いマウスを作製するために、本発明者らはまた、１細胞期胚（目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性）を単一改変工程で迅速に作製するための方法を開発した。本発明者らは、１細胞期胚内の目的の標的における両方の対立遺伝子上の大きな欠失を一対のガイドＲＮＡを使用して効率的に生成するための手順を最適化することにより、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を設計及び作製する必要性を除去した。加えて、１細胞期胚を使用することにより、ＥＳ細胞株（例えば、ＵＬＣ １－３９ ＥＳ細胞株）の使用と比較して、標的マウスの作製効率を向上させることができる。この手法を使用して、目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性であり免疫化の準備が整ったＦ０マウスを、１５～１６ヶ月間ではなく４～５ヶ月間で出産させることができる（目的の標的においてヌル対立遺伝子にホモ接合性のＦ０仔マウスを約３ヶ月間で出産させることができる）。この実験では、ホモ接合性欠失用にこれら目的の外来標的抗原にオルソロガスな自己抗原を標的とするための対のガイドＲＮＡを設計してクローニングした。自己抗原をコードする内在遺伝子の開始及び終止コドン領域を標的とするためのガイドＲＮＡを設計した。ガイドＲＮＡの設計プロセスについては、以下の原料及び方法に記載している。要約すると、過排卵雌を種雄と交配して胚を生成した。ほんの数匹の雄しか利用できない場合は、体外受精を使用した。雌の齢範囲は３～１６週であり、ドナーあたりの卵母細胞は１５～４６の範囲（中央＝３２個の卵母細胞）であり、ドナーあたりの接合体は５～３２の範囲（中央＝１５個の接合体）であった。機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子（ＶＩ－３ Ａｄａｍ６）マウス（再挿入マウスＡｄａｍ６遺伝子に加えて、内在マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を対応するヒトＤＮＡへと置換した）またはユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ １－３９）マウス（ヒトＶκ１－３９／Ｊκ５遺伝子セグメントである単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を有するマウス）を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに由来する１細胞期胚に、ガイドＲＮＡをＣａｓ９ ｍＲＮＡと共にマイクロインジェクション（細胞質注入）した。注入した胚の数は９９～７８４の範囲（中央＝３３４）であり、生存胚のパーセンテージは５６％～７３％の範囲（中央＝６３％）であり、移植した胚の数は５９～４４２の範囲（中央＝２２６）であり、それぞれのプロジェクト用の仔の数は１０～４６の範囲（中央＝３２）であり、出生率は２％～５９％の範囲（中央＝１３％）であった。表７及び図２９に示すように、試験した全ての自己抗原において標的欠失（すなわち、崩壊）を有する生仔を作製したが、欠失サイズは０．１ｋｂ～９４ｋｂの範囲であり、欠失（すなわち、崩壊）のサイズと欠失（すなわち、崩壊）を有する仔マウスの作製効率の間には負の相関が認められた。
Figure 2023078479000019
Figure 2023078479000020
原料及び方法
ガイドＲＮＡ及びＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイの設計：それぞれの遺伝子座におけるコンセンサスコード配列（ＣＣＤＳ）を基準とし、５´ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｎｎＮＮＮＧＧ３´（配列番号：２）のフォーマット（式中、Ｎは任意のヌクレオチド）で、２３塩基対の長さを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計した。最後の３つのヌクレオチド（ＮＧＧ）はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）であり、Ｃａｓ９酵素による二本鎖平滑末端ＤＮＡ開裂は５´側からＮＧＧへと３ヌクレオチドのところ（上記の小文字残基間）で生じる。ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｓｇＲＮＡＳｃｏｒｅｒ／、及び、ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｒｎａｉ／ｐｕｂｌｉｃ／ａｎａｌｙｓｉｓ－ｔｏｏｌｓ／ｓｇｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎを含む様々なｇＲＮＡ検索エンジンから得たスコアを基準としてｇＲＮＡを選択した。簡潔に説明すると、開始ＡＴＧの５´及び３´に接する１００～１５０ｂｐの配列及び終止コドンの５´及び３´に接する１００～１５０ｂｐをそれぞれ、両方のＤＮＡ鎖上のｇＲＮＡ用にアッセイした。使用した全ての検索エンジンで高スコアを有するＡＴＧ近傍の２つのｇＲＮＡ（互いに２５％以下だけオーバーラップする）及び終止コドン近傍の２つのｇＲＮＡについて、マウスゲノム内における固有性及びユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ、または共通軽鎖）内において一塩基多型（ＳＮＶ）が無いこと、機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子（ＶＩ－３－Ａｄａｍ６）を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、ならびにＶＧＢ６ ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）株を更に照会した。上記検索仕様を使用して高スコアのガイドが見つからなかった場合には、２つの高品質なガイドが見つかるまでＡＴＧと終止コドンの周辺の別の配列を検索した。
プローブ配列がそれぞれのガイドにおけるｃａｓ９切断部位に常にオーバーラップするようなＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）Ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＭＧＢプローブを使用し、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）を使用してＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを設計した。Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｕａｌ Ｌａｂｅｌｅｄ ＢＨＱ（登録商標）プローブ（ｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ＰｒｏｂｅＩＴｙ／ｄｅｓｉｇｎ／ｉｎｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ａｓｐｘ）を使用して、いくつかのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイも得た。Ｃａｓ９がガイドにより結合された配列を切断する場合、これらのアッセイは対立遺伝子の喪失アッセイとして機能する。全てのアッセイをＳＮＶでスクリーニングした。ガイドを以下のとおり、ｍＧＵ及びｍＧＵ２（マウスゲノム上流用）ならびにｍＧＤ及びｍＧＤ２（マウスゲノム下流用）と命名した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを以下のとおり、ｍＴＧＵ及びｍＴＧＵ２（それぞれｍＧＵ及びｍＧＵ２を包含するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ用）ならびにｍＴＧＤ及びｍＴＧＤ２（それぞれｍＧＤ及びｍＧＤ２を包含するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ用）と命名した。ガイドｍＧＵ／ｍＧＵ２及びｍＧＤ／ｍＧＤ２からおおよそ等距離で、崩壊させる遺伝子座の中央に別のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを設計し、ｍＴＭ（マウスＴＡＱＭＡＮ（登録商標）中央用）と命名した。この対立遺伝子の喪失アッセイは、ガイドに隣接する領域の欠失（崩壊）が生じるかどうかを明らかにする。
ｍＧＵ／ｍＧＵ２（最も５´のどちらか）の２００～８００ｂｐ上流及びｍＧＤ／ｍＧＤ２（最も３´のどちらか）の２００～８００ｂｐ下流に更なるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを設計した。これらのアッセイをそれぞれ、ｒｅｔＵ（保持上流用）及びｒｅｔＤ（保持下流用）と呼んだ。これらのアッセイは最大許容欠失サイズを定め、上記のＳＮＶでスクリーニングした。
ガイドＲＮＡのクローニング：ガイドＲＮＡ二重鎖を設計して合成した。Ｕ６プロモーターはグアニンで始まることが好ましいことから、配列が既にグアニンで始まっていない場合には、５´にグアニンを付加した。凍結乾燥ｇＲＮＡ二重鎖を１００μＭとなるように滅菌水に再懸濁させ、以下のライゲーション反応液、１４．５μＬ ＰＣＲ用水；２μＬ １０Ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、１μＬ ｐＭＢ＿ｓｇＲＮＡ＿ＢｓｍＢＩベクター（約６０ｎｇ）、１μＬ ｇＲＮＡ二重鎖（１００μＭ）、及び１．５μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μＬ；ＮＥＢ）、を０．５ｍＬ微量遠心チューブ内にセットアップした。その後、ライゲーション反応液を室温で１時間インキュベートしてから、ＴＯＰ１０細胞を用いた形質転換反応にその反応液を使用した。その後、コロニーを選択してＰＣＲで確認してからシークエンシングを行った。
ＢＴＸ（登録商標）エレクトロポレーションプロトコル：ガイド混合液を、以下、１０μｇのそれぞれのｓｇＲＮＡプラスミド、及び５μｇのＣａｓ９野生型プラスミドのとおりに調製した。エレクトロポレーションの実施日、エレクトロポレーションプロセスの半時間～１時間前に細胞をＥＳ培地に供給した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを加えてから、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後にプレート（複数可）を軽くたたき、ＥＳ培地を加えてトリプシンを中和し、細胞を４回優しくピペッティングして細胞集塊を剥がしてからゼラチンプレート（複数可）に移し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。プレート（複数可）を揺らしてから培地で１回穏やかに洗浄し、その後、全ての細胞を１５ｍＬチューブに移してから１２００ｒｐｍで５分間遠心した。全てのペレットを１０ｍＬのＰＢＳ内で混ぜ合わせてから、細胞をカウントし、必要に応じて希釈した。２０μｌ容量の細胞懸濁液をＣＥＬＬＯＭＥＴＥＲ（登録商標）スライドに添加し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ ＣＥＬＬＯＭＥＴＥＲ ＡＵＴＯ Ｔ４（商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントした。その後、チューブを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。それぞれのエレクトロポレーションに７．５ｘ１０６個の細胞を使用して、エレクトロポレーション緩衝液中にペレットを再懸濁させた。それぞれのチューブの容量が１２０μｌとなるように、微量遠心チューブ内のガイド混合液へと細胞を加えた。チューブを２～３回攪拌し、大きな開口部先端を使用して９６ウェルエレクトロポレーションキュベット（２ｍｍギャップ）に移してから、キュベットを密閉した。ＢＴＸ（登録商標）ＥＣＭ（登録商標）６３０ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用して、７００Ｖ、４００Ω、２５ｕＦで電気パルスを印加した。その後、キュベットを氷上で１０分間インキュベートした。それから、エレクトロポレーションした細胞を深いウェルプレートに移した（キュベットを氷上に置いて０．８ｍＬ／ウェルで加えた）。それぞれのプレート内に２５ｍＬの培地を投入した２ｘ１５ｃｍゼラチンプレートに細胞を播種した。１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで開始して一過性の選択を３日間行い、エレクトロポレーションから１０日後まで培地を非選択培地に交換してから、その時点でコロニーを選択した。
ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（登録商標）エレクトロポレーションプロトコル：エレクトロポレーションの実施日、エレクトロポレーションプロセスの半時間～１時間前に細胞をＥＳ培地に供給した。その後、細胞を１０ｍＬ ＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＬの０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを加えてから、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後にプレート（複数可）を軽くたたき、８ｍＬのＥＳ培地を加えてトリプシンを中和し、細胞を４回優しくピペッティングして細胞集塊を剥がしてからゼラチンプレート（複数可）に移し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。プレート（複数可）を揺らしてから培地で１回穏やかに洗浄し、その後、全ての細胞を１５ｍＬチューブに移してから９０ Ｘ ｇで３分間遠心した。ペレットを１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させてから、細胞をカウントし、必要に応じて希釈した。２０μｌ容量の細胞懸濁液をＣＥＬＬＯＭＥＴＥＲ（登録商標）スライドに添加し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｖｉｓｉｏｎ ＣＢＡ Ｓｙｓｔｅｍを使用してカウントした。合計２ ｘ １０６個の細胞をアリコートし、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）チューブを用いて９０ Ｘ ｇで３分間遠心分離にかけた。その後、総容積が１００μＬとなるように５μｇのＣａｓ９野生型プラスミド及び２．５μｇのそれぞれのｓｇＲＮＡプラスミドと混合したＬＯＮＺＡ（登録商標）Ｐ４緩衝液中にペレットを再懸濁させた。それから、細胞を大きなＬＯＮＺＡ（登録商標）キュベットに移した。ＬＯＮＺＡ（登録商標）４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）及びプログラムＣＰ－１０５を使用して電気パルスを印加した。４００μＬ容量の新鮮なＥＳ培地を加えてから、細胞を新しいＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）チューブに移して混合した。その後、１０ｍＬのＥＳ培地を含む２ ｘ １０ｃｍゼラチンプレートに細胞を播種した。ＥＰから２日後にピューロマイシン（１．５μｇ／ｍＬ）で開始して一過性の選択を２日間行った。選択後、エレクトロポレーションから１０日後まで非選択培地を使用してから、その時点でコロニーを選択した。
スクリーニング：ガイドｍＧＵ、ｍＧＵ２、ｍＧＤ及びｍＧＤ２を用いたＣａｓ９による切断について、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイｍＴＧＵ、ｍＴＧＵ２、ｍＴＧＤ及びｍＴＧＤ２を使用して評価した。コピー数が２（親、未改変対照ＤＮＡ）から１へと減少した場合に、一方の対立遺伝子における切断（もう一方ではない）が確認された。アッセイがゼロのコピー数を生じた場合に、Ｃａｓ９によるホモ接合性開裂が確認された。ＡＴＧと終止コドンの近傍のＣａｓ９切断が介在配列の除去を保証しないことから、ｍＴＭアッセイ数が２（親）からそれぞれ１またはゼロになった場合に、ヘテロ接合性崩壊及びホモ接合性崩壊と評価した。最後に、ｒｅｔＵアッセイ及びｒｅｔＤアッセイを使用して欠失サイズの外側許容限度を設定した。保持アッセイでは、親と同様にコピー数２を有し、インタクト（保持された）を維持したままであった。
アッセイｍＴＧＵ、ｍＴＧＵ２、ｍＴＭ、ｍＴＧＤ及びｍＴＧＤ２またはこれらのいくつかの組み合わせを使用して、ｍＧＵ、ｍＧＵ２、ｍＧＤ及びｍＧＤ２またはこれらのいくつかの組み合わせのエレクトロポレーション後に得られたＥＳＣクローンに対して、Ｃａｓ９開裂及び／または崩壊で１回目のスクリーニングを行った。ｒｅｔＵ及びｒｅｔＤを使用して、全てのアッセイにおいてゼロのコピー数であるコロニーを更にスクリーニングし、ｒｅｔＵ及びｒｅｔＤにおいて２のコピー数のコロニーのみを更なるアッセイへと進めた。
マウス胚性幹細胞の一次スクリーニング及び再確認スクリーニング：ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＬＯＡ（対立遺伝子の喪失）マルチプレックス（４プレックス）ｑＰＣＲにより、改変ｍＥＳＣコロニーを標的遺伝子座のホモ接合性欠失でスクリーニングした。スクリーニングの初回パス（一次）で、２枚の９６ウェルプレートの１～１１列目に１７６の固有クローンのＤＮＡを単離した。１２列目には、同一ｍＥＳＣ親株からあらかじめ単離した野生型ＥＳ細胞ＤＮＡを満たし、スクリーニングするそれぞれのＤＮＡプレートが８８の改変クローン及び８つの標準物質クローンを含有するようにコピー数の標準物質として使用した。それぞれのクローンのＤＮＡを４倍の３８４ウェルプレートに分注し、標的遺伝子の相対的な上流、中央及び下流領域内におけるコピー数を同時に定量するために使用するＦＡＭ、ＶＩＣ、ＡＢＹ及びＱｕａｓａｒのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを用いて、ＤＮＡ濃度を較正するためのＱｕａｓａｒ増幅Ｗｎｔ－２ｂを用いて、単一の反応混合液内における標的遺伝子座の３つの領域にわたるホモ接合性ＬＯＡについてアッセイした。コピー数を定量した後、標的遺伝子座にわたる３つのアッセイ全てのゼロコピーを有する「最良」品質クローンのうちの最大８つを続く増殖拡大、再播種用に選択し、増殖レパートリーのコピー数アッセイ（再確認）を実施した。それぞれの増殖クローンを播種し、９６ウェルプレートの１行（Ａ～Ｈ）の最初の６列を占める６つの複製のＤＮＡを単離してから、使用する別のアッセイ用の別の遺伝物質及びデータ複製を得た。一次スクリーニングに使用したアッセイを繰り返して一次遺伝子型を確認し、保持アッセイを使用して欠失の長さを測定した。保持アッセイは欠失の標的となる領域のすぐ上流及びすぐ下流に配置され、通常は、同等の２つの複製であった。別のアッセイを使用して、マウス免疫グロブリン重（ＩｇＨ）及びカッパ（Ｉｇκ）遺伝子座における親ＥＳＣ遺伝子型（ＩｇＨマウス及びＩｇκマウスのＬＯＡ、ならびにヒト化のＧＯＡ）を確認した。
Ｃａｓ９媒介対立遺伝子を同定するための次世代シークエンシング（ＮＧＳ）：標準的な塩析法を使用して、Ｃａｓ９改変Ｆ０マウスの小さい尾部生検からゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれの標的遺伝子座用に、以下の要件、（１）アンプリコンサイズは２８０～３８０ｂｐ長である、（２）ｇＲＮＡ開裂部位は、より大きな挿入／欠失（インデル）に対応するために少なくとも３５ｂｐ離れたプライマーによるＰＣＲ産物内の中央に配置される、（３）６２～６５℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、３´末端上に２ｂｐのＣＧクランプを有するプライマーの長さは２２～２５ｂｐである、及び（４）プライマーはＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６または１２９系統の一塩基多型のゲノム配列に対して確認される、に従いＰＣＲ用プライマーを設計した。それから、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）が提供する特定のユニバーサルアダプター配列を遺伝子座特異的配列に付加した。得られたアンプリコンをアガロースゲル上で可視化し、ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ＳＥＱＵＡＬＰＲＥＰ（商標）Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｋｉｔを使用して精製／標準化した。Ｑｕｂｉｔ（登録商標）で産物を定量して、それぞれの産物の１ｎｇを、ＮＥＸＴＥＲＡ（登録商標）プライマー及びＮＥＸＴＥＲＡ（登録商標）ＰＣＲマスターミックスを用いる別のＰＣＲによるバーコード化のためのテンプレートとして使用した。サーモサイクラー内、７２℃で３分間、９５℃で３０秒間、｛９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間｝を１２サイクル、７２℃で５分間、及び１０℃の静置で、ＰＣＲを実施した。得られたバーコード化ＰＣＲ産物をＡＭＰＵＲＥ（登録商標）ＸＰビーズで精製し、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴキット内のＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）標準化ビーズを使用して標準化してからプールし、シークエンシング及び生データ収集のためにＭＩＳＥＱ（商標）にロードした。
８細胞期マウス胚のマイクロインジェクション：滅菌３５ｍｍ培養ディッシュ蓋に約２ｍＬの標準ＥＳ細胞培地（－ＬＩＦ）を加え、濾過済みミネラルオイルで覆った。マウスピペットを使用してディッシュの下半分にＥＳ細胞を播種した。ディッシュ上部に凍結保存８細胞期ＳＷ宿主胚を付着させた。インジェクション中における胚の損傷の最小化を補助するために、ホールディングピペットに対して軽く叩くことで新しいインジェクションピペットの先端を丸くした。形態及び輝度を基準としてＥＳ細胞を選択してから、インジェクションピペット内に採集した。割球間の空間が３時の位置となるように、ホールディングピペット上に胚を位置決めした。３時の位置で帯を慎重に穿刺してそのスポットに細胞を蓄積させることにより、胚の囲卵腔にＥＳ細胞を導入した。胚あたり合計７～９個のＥＳ細胞を導入した。濾過済みミネラルオイルで覆ったＫＳＯＭ胚培養液のドロップを含有する３５ｍｍディッシュに注入胚を置いてから、３７．０℃、７．５％ＣＯ２で一晩胚を培養した。翌朝、偽妊娠雌に胚を外科的に移植した。
実施例２．開始コドンの領域を標的とする複数のガイドＲＮＡを使用した、抗体産生用のＫＯ ＥＳ細胞及びマウスの作製。
目的の外来標的抗原に対する寛容の低いマウスを作製するための別の実験では、ホモ接合性欠失用にこれら目的の外来標的抗原にオルソロガスな自己抗原を標的とするための３つのガイドＲＮＡを設計してクローニングした。自己抗原をコードする内在遺伝子の開始コドンを包含するオーバーラップ領域を標的とするための３つのオーバーラップしたガイドＲＮＡを設計した（図５を参照のこと）。ユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ １－３９）マウス（（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列及び単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｉｉ）内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結した複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入をそれらの生殖細胞系内に含むマウス）に由来するＥＳ細胞内に、ガイドＲＮＡをＣａｓ９と共にエレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションした。一部の実験では、欠失させる自己抗原をコードする内在遺伝子を標的とする大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と共に、Ｃａｓ９及び３つのガイドＲＮＡをエレクトロポレーションした（例えば、図５を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＣＣ９）と組み合わせてＬＴＶＥＣを使用することにより、標的遺伝子座における二対立遺伝子変異を得る可能性が著しく高まる（表８を参照のこと）が、ＬＴＶＥＣ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による標的化には偽陽性を除外するためのはるかに多くのスクリーニングが必要となる。
Figure 2023078479000021
実施例３．マウスの免疫化及び免疫原に対する血清抗体応答の解析。
免疫化
機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子（ＶＩ－３）を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、ユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ １－３９）マウス（（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列及び単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入（再構成Ｖκ／Ｊκ配列は内在マウスκ定常領域と機能的に連結する）、及び（ｉｉ）内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結した複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入をそれらの生殖細胞系内に含むマウス）、ＫＯ（ノックアウト）／ＶＩ－３マウス（外来標的抗原にオルソロガスな自己抗原をノックアウトしたＶＩ－３マウス）、及びＫＯ／ＵＬＣ １－３９マウス（外来標的抗原にオルソロガスな自己抗原をノックアウトしたＵＬＣ １－３９マウス）を、様々な免疫原（例えば、タンパク質など）を使用して、多数の膜貫通標的で免疫化した。免疫化の開始前に、マウスから免疫前血清を採取した。標準的なアジュバントを使用して、合計３～６回のブーストで、異なる時間間隔の異なる経路でマウスをブーストした。定期的にマウスの採血を行い、対応する抗原に対する抗血清力価を評価した。標的８の例では、足蹠経路により、マウスＦｃタグを有する標的８の組換え細胞外ドメインでマウスを免疫化した。力価は、２回目の採血（一次に続き、ＵＬＣ １－３９の＋６回のブースト）または３回目の採血（一次に続き、自己抗原－８－ＫＯ／ＵＬＣ １－３９の＋３回のブースト）由来であった。
抗血清力価の測定
ＥＬＩＳＡを使用して、対応する免疫原に対する血清中抗体力価を測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＩＲＶＩＮＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標））中の対応する標的抗原を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標））を２μｇ／ｍＬで一晩コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｔ、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））でプレートを洗浄してから、ＰＢＳ中の２５０μｌ ０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））を用いて、室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔでプレートを洗浄した。免疫前血清及び免疫抗血清を０．５％ＢＳＡ－ＰＢＳ中で３倍に系列希釈し、室温で１時間プレートに加えた。プレートを洗浄してから、ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄してから、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を基質として使用して２０分間インキュベートすることにより進展させた。酸で反応を停止させてから、分光光度計（ＶＩＣＴＯＲ（登録商標）、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ（登録商標））を用いて、４５０ｎｍでプレートを読んだ。ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェアを使用して抗体力価を算出した。標的８の例では、使用した力価抗原は、Ｍｙｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓタグを有するヒト標的８の組換え細胞外ドメインであった。
結果
異なる膜貫通標的で免疫化することにより、ＶＩ－３、ＵＬＣ１－３９、ＫＯ／ＶＩ－３及びＫＯ／ＵＬＣ １－３９マウスにおける体液性免疫応答を調査した。ＫＯ／ＶＩ－３及びＫＯ／ＵＬＣ １－３９系統の免疫化した全ての標的において、高い抗体力価が誘導された。力価はまた、マウスのＶＩ－３及びＵＬＣ １－３９系統で高かった。しかしながら、一般的に、ＫＯ系統はより高い力価応答を有するようであった。誘導された免疫応答については、抗原結合吸光度がバックグラウンドと比較して２倍超高い、血清希釈の最高倍率の逆数と定義される抗体力価として、表９に示している。それゆえ、数値が高いほど、免疫原に対する体液性免疫応答はより高くなる。合計で、ＫＯ系統における１６標的超が成功裏に免疫化されている。標的１及び標的９に対するＢＳＴ及びハイブリドーマプラットホームにより、また標的４及び標的５に対するＢＳＴにより、モノクローナル抗体が単離されており、これら抗体の更なるキャラクタリゼーションについては進行中である。ＵＬＣ １－３９及び自己抗原－８－ＫＯ／ＵＬＣ １－３９マウスにおける、１つの目的のヒト標的抗原（標的８；上記のマウス自己抗原８にオルソロガス）に対する抗体産生のデータについては、表９及び図６に提供している。Ｆ０ ＫＯマウスは、標的に対する中央抗体力価に示すとおり、野生型ＵＬＣ １－３９マウスと比較して、タンパク質誘発に対する約５倍超高い応答を誘導した。表９はまた、抗原に特異的に結合する抗体の数を提供している（バックグラウンド吸光度と比較して２倍の吸光度）。同様の結果を、ＶＩ－３マウスと比較した自己抗原－９－ＫＯ／ＶＩ－３マウスについて示している。図３０Ａ及び図３０Ｂを参照されたい。この実験では、皮内経路で、野生型標的９をコードするＤＮＡのいずれかを用いて、野生型ＶＩ－３－Ａｄａｍ６マウス及び自己抗原－９－ＫＯ／ＶＩ－３－Ａｄａｍ６マウスを免疫化した。標的９を発現するように遺伝子改変された細胞または親ＶＩ－３Ｔ３細胞を使用して、力価を測定した。ＶＩ－３－Ａｄａｍ６マウスの抗体力価が対照と同様に低いのに対して、自己抗原－９－ＫＯ／ＶＩ－３－Ａｄａｍ６マウスにおける抗体力価は著しく上昇した。このことは、ＫＯ／ＶＩ－３系統とＫＯ／ＵＬＣ系統の両方が強力な免疫応答を誘導していることを示している。
Figure 2023078479000022
実施例４．マウスの免疫化ならびに抗体多様性及びＶ遺伝子セグメント使用の解析。
機能性異所マウスＡｄａｍ６遺伝子（ＶＩ－３）を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス及び自己抗原－３－ＫＯ（ノックアウト）／ＶＩ－３マウスを標的３で免疫化した。免疫化の開始前に、マウスから免疫前血清を採取した。標準的なアジュバントを使用して、合計３～６回のブーストで、異なる時間間隔の異なる経路でマウスをブーストした。定期的にマウスの採血を行い、対応する抗原に対する抗血清力価を評価した。
野生型ＶＩ－３マウス及び自己抗原－３－ＫＯ ＶＩ－３マウスの脾臓からＢ細胞を単離してから、抗体をシークエンスしてＶ遺伝子使用を定量した。単一抗原に陽性なＢ細胞からＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡを直接単離してシークエンスした。例えば、ＵＳ７，５８２，２９８を参照されたい（その全体はあらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。野生型ＶＩ－３マウスのＶ遺伝子使用データを表１０に示し、自己抗原－３－ＫＯ ＶＩ－３マウスのＶ遺伝子使用データを表１１に示している。表１０及び表１１に示すとおり、野生型ＶＩ－３マウスと比較して、自己抗原－３－ＫＯ ＶＩ－３マウスに、重鎖Ｖ遺伝子セグメントと軽鎖Ｖ遺伝子セグメントの両方の使用におけるより大きな多様性が認められた。例えば、野生型ＶＩ－３マウスにおける抗体では、４つの重鎖Ｖ遺伝子セグメント及び６つの軽鎖Ｖ遺伝子セグメントのみが使用され、抗体の７９％がＩｇＨ Ｖ４－５９及びＩｇκ Ｖ１－１２ Ｖ遺伝子セグメントを使用していた。それに対し、自己抗原－３－ＫＯ ＶＩ－３マウスにおける抗体では、６つの重鎖Ｖ遺伝子セグメント及び１０の軽鎖Ｖ遺伝子セグメントが使用され、最も一般的な使用組み合わせ（ＩｇＨ Ｖ３－２３とＩｇκ Ｖ４－１）でも抗体の４２％を占めるに過ぎなかった。
Figure 2023078479000023
Figure 2023078479000024
Figure 2023078479000025
Figure 2023078479000026
Figure 2023078479000027
加えて、マウス自己抗原３に対する交差反応性を有する抗体（すなわち、ヒト標的３とマウス自己抗原３の両方に結合する抗体）を自己抗原－３－ＫＯ ＶＩ－３マウスに産生させた（例えば、表１２を参照されたい）。ＶＩ－３マウスとＵＬＣ １－３９マウスの両方における自己抗原４及びヒト標的４に、同様の結果が認められた。図３１Ａ及び図３１Ｂを参照されたい。この実験では、足蹠経路を使用して、Ｈｉｓタグを付加したヒト標的４タンパク質及び／またはＨｉｓタグを付加したマウス自己抗原４タンパク質（Ｈｉｓタグを付加した）で自己抗原－４－ＫＯ／ＶＩ－３－Ａｄａｍ６マウス及び自己抗原－４－ＫＯ／ＵＬＣ １－３９マウスを免疫化した。Ｈｉｓタグを付加したヒト標的４、Ｈｉｓタグを付加したマウス自己抗原４、またはＨｉｓタグを付加したＦｅｌ ｄ １（対照）を被覆抗原として使用し、力価を測定した。
マウス自己抗原３と標的３の間に共有されている（またはマウス自己抗原４とヒト標的４の間に共有されている）エピトープに対する抗体を産生する能力は、抗体のプールを増殖させるために有利であり、野生型ＶＩ－３マウスでは、マウス自己抗原３に対する交差反応性を有する抗体は産生されなかった。加えて、交差反応抗体の薬物動態特性は、野生型マウスにおける内在自己抗原とのそれらの交差反応ゆえに、インビボでより容易に試験することができる。したがって、このような交差反応抗体の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）を発現するように遺伝子組換えされたマウスを作製する必要はなくてもよい。
Figure 2023078479000028
実施例５．１つのガイドＲＮＡまたは２つのガイドＲＮＡを使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介標的化。
原料及び方法
ＥＳ細胞培養、スクリーニング及びエレクトロポレーション
本明細書に記載の実験は、ＶＧＦ１、本発明者らのＣ５７ＢＬ６ＮＴａｃ／１２９Ｓ６ＳｖＥｖＦ１ハイブリッドＸＹ ＥＳ細胞株を用いて実施した（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１－９９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２－６５９）。上記のとおりにＥＳ細胞を培養した（Ｍａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｎ Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．１００－１３２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交配してＣ５７ＢＬ６（ＸＢ６）／１２９Ｓ６（Ｙ１２９）マウスを作製することにより、ＶＧＦ１細胞を作製した。図７を参照されたい。
２ｍｍギャップのキュベット内、最終容量０．１２ｍｌの７．５百万個の細胞を用いてエレクトロポレーション（ＥＰ）を実施した。ＢＴＸ ＥＣＭ ６３０エレクトロポレーションシステム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用したＥＰの電気条件は、７００Ｖ、４００オームの抵抗、及び２５マイクロＦの静電容量であった。ＥＰあたりのＬＴＶＥＣの量は０．００１５ｍｇであり、Ｃａｓ９発現プラスミドは０．００５ｍｇであり、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは０．０１０ｍｇであった。ＬＴＶＥＣが発現するネオマイシン耐性を選択することなくクローンの選択を可能とするピューロマイシン耐性を付与した１００ｎｇのプラスミドを追加して、いくつかのＥＰを実施した。ＥＰ後、２枚の１５ｃｍゼラチンディッシュに細胞を播種して、培地を毎日交換した。１００ｕｇ／ｍｌのＧ－４１８硫酸塩または０．００１５ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンのいずれかを含有する選択培地をＥＰから４８時間後に開始し、ＥＰから１０日後まで継続した。ＰＢＳ内でコロニーを選択してから、０．０５％トリプシンを含有する９６ウェルディッシュに加えて１５分間解離させ、培地で中和し、スクリーニング用ＤＮＡの単離に使用した。
対立遺伝子の改変法（Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７）を使用して、正確に標的化されたＥＳ細胞クローンの同定及びマウス対立遺伝子の遺伝子型決定を行った。
ガイド配列の設計
Ｌｒｐ５の欠失部またはその他の標的遺伝子の内側５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐまたは１ｋｂ位置を囲む約２００ｂｐのＤＮＡ（上流と下流の両方）をＣＲＩＳＰＲ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に入力し、可能なｇＲＮＡ配列を取得した。それから、潜在的なｇＲＮＡ配列をフィルタリングして、それらｇＲＮＡ配列がＬＴＶＥＣ内のヒト化インサートではなく内在ＤＮＡの切断のみを可能とすることを確保した。
単一ガイドＲＮＡのクローニング
ｓｇＲＮＡについては、シームレスなＲＮＡ発現のために二重鎖オリゴ（ＩＤＴ）をＢｓｍｂＩ部位において７７ｂｐスキャフォールドに融合したｐＭＢ＿ｓｇＲＮＡ（Ｕ６プロモーター）にクローニングするか、または、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ製の承認済み発現プラスミド（ＬＲＰ５ガイドＡ、Ｂ、Ｂ２、Ｅ２、Ｅ及びＦ）として購入するかのいずれかとした。インハウスで作製したプラスミドについては、ＰＣＲ及びサンガーシークエンシングにより確認を行った。
遺伝子型確認用ＤＮＡテンプレート
ＥＳ細胞、標的化ベクターならびにＣａｓ９を発現するプラスミド及びいくつかのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のうちの１つを発現するプラスミドまたは異なるｇＲＮＡの組み合わせを発現する２つのプラスミドをエレクトロポレーションしたＥＳ細胞由来のクローン、からＤＮＡを精製した。対立遺伝子の改変（すなわち、対立遺伝子の喪失または対立遺伝子の獲得）定量的ＰＣＲアッセイにより、マウス標的遺伝子座の標的欠失及び標的化ベクターの挿入を有するまたはＣａｓ９／ｇＲＮＡ誘導欠失を有すると同定されたクローンを、通常のフォローアップＰＣＲアッセイ用に選択した。
オリゴヌクレオチドの設計
それぞれの組み合わせのｇＲＮＡ用に２つのＰＣＲアッセイを設計した。第１のＰＣＲは、異なるｇＲＮＡの組み合わせにおけるガイドＲＮＡ認識配列間の崩壊を検出するための欠失アッセイであった。第２のＰＣＲアッセイ（５´アッセイ）は２つのＰＣＲアッセイを含んでいた。第１は、ヒト化対立遺伝子用の５´ヒトアッセイであり、マウス－ヒト接合部にわたるように設計された。第２は、内在マウス対立遺伝子用の５´マウスアッセイであり、５´標的欠失接合部にわたるように設計された。
ＰＣＲ反応及びＴＯＰＯクローニング
ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃａｔ．＃ ＲＲ００２Ｍ）を使用してＥＳ細胞ＤＮＡテンプレートを増幅した。それぞれのＰＣＲアッセイ反応混合液を水陰性対照と共にランした。アッセイ混合液は、以下、０．００５ｍＬのＥＳ細胞ＤＮＡテンプレート、１Ｘ ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、０．０１ｍＭのｄＮＴＰ混合液、０．００７５ｍＭのＦｏｒｗａｒｄ Ｏｌｉｇｏ（それぞれ）、０．００７５ｍＭのＲｅｖｅｒｓｅ Ｏｌｉｇｏ（それぞれ）、５０００ユニット／ｍＬのＬＡ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び０．０２５ｍＬのｄｄＨ２Ｏ、を含有していた。
ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅプログラムは、９４℃で１分間；続いて、増幅ｋｂあたり、９４℃で３０秒間、６０℃アニーリンググラジエントで３０秒間、及び６８℃で１分間を３５サイクル；続いて、７２℃で１０分間重合、で構成されていた。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｃａｔ．＃ １０７８７－０１８）及び／またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ５０ｂｐ ＤＮＡラダー（Ｃａｔ．＃ １０４１６－０１４）を含む２％アガロースゲル上の電気泳動により、ＰＣＲ産物を分離した。シークエンシング用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ．＃ Ｋ４５７５－０２）の取扱説明書に従い、残りのＰＣＲ産物をｐＣＲ４－ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。クローニング反応物をＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０細胞へと化学的に形質転換し、０．０６ｍｇ／ｍＬのＸ－ｇａｌ及び０．０２５ｍｇ／ｍＬのカナマイシン寒天平板上に播種した。
シークエンシング
０．０２５ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢに白色コロニーを接種し、振盪させながら３７℃で一晩インキュベートした。それぞれのコロニーは、アッセイ産物の集団由来の１つのアンプリコンを示していた。ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレップキット（Ｃａｔ．＃ １２１２３）を使用して、それぞれの細菌培養物からＤＮＡを抽出した。０．００２ｍＬのＴＯＰＯクローンＰＣＲ、１ｘ ＰＣＲｘ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０ｘ ｓｔｏｃｋ）（Ｃａｔ．Ｘ１１４９５－０１７）、０．００７５ｍＭのオリゴ（Ｍ１３ＦまたはＭ１３Ｒ）、及び０．０１５ｍＬのｄｄＨ２Ｏ、を含むシークエンシング反応混合液を用いて、インサートのＤＮＡ配列を同定した。
シークエンシング解析
シークエンシング結果から不明配列及びｐＣＲ４－ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒ配列をトリミングし、ＰＣＲインサート配列を単離した。それから、シークエンスしたフラグメントを参照にアラインし、変異を解析した。
崩壊クローンのシークエンシング
製造業者の取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ．＃ Ｋ４５７５－０２）に従い、崩壊陽性クローン由来のＰＣＲ産物をｐＣＲ４－ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒにクローニングし、その後、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０細胞へと化学的に形質転換し、０．０６０ｍｇ／ｍＬのＸ－ｇａｌ及び０．０２５ｍｇ／ｍＬのカナマイシン寒天平板上に播種した。ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレップキット（Ｃａｔ．＃ １２１２３）を使用して、細菌培養物からＤＮＡを抽出した。その後、インサートシークエンシング結果を予測崩壊参照にアラインし、インデル変異を解析した。Ｃａｓ９がＰＡＭから３塩基対を開裂させてｇＲＮＡが認識する配列にすることが予測された。参照から予測開裂部内の配列を欠失させ、残りの配列を使用して結果にアラインした。
一塩基多型（ＳＮＶ）用ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイ
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別反応液は、ゲノムＤＮＡ、それぞれの多型に特異的なプローブ／プライマー、及びＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現ＰＣＲマスターミックス、を含有する０．００８ｍｌであった。プローブはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ）から取り寄せ、プライマーはＩＤＴから取り寄せた。対立遺伝子１２９用のプローブをＶＩＣ色素で標識し、対立遺伝子Ｂ６用のプローブをＦＡＭ色素で標識した。それぞれのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子アッセイを４倍の３８４ウェルプレートで実施し、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ７プラットフォームでランした。ＳＮＶ ＰＣＲサイクリングプログラムは、以下、９５℃で１０分間に続いて、９５℃で１５秒間、６０℃で６０秒間、及び６０℃で３０秒間を４０サイクル、のとおりであった。ＶｉｉＡ ７ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．１を使用して、ランの解析及び結果の評価を実施した。
ＦＩＳＨ解析
Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）またはＶａｎ Ａｎｄｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｇｒａｎｄ Ｒａｐｉｄｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）のいずれかにおいて、それらの標準的な方法による蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、選択したＥＳ細胞クローンを解析した。本発明者らは、マウス及びヒトのＢＡＣを２色解析用プローブとして提供した。
高いゲノム崩壊及び／または標的遺伝子座のヒト化
げっ歯類遺伝子の全てまたは一部の単一工程欠失及び任意選択的にそのヒト相同体の全てまたは一部への同時置換を正確に達成するために、本発明者らはエレクトロポレーションにより、以下の核酸分子、（１）ＬＴＶＥＣ、（２）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡ、及び（３）１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはｇＲＮＡ自体をコードする１つまたは複数のプラスミドを、げっ歯類ＥＳ細胞に導入した。それぞれの実験では、ＬＴＶＥＣを直鎖化した。一部の実験では、ＬＴＶＥＣは、げっ歯類遺伝子を欠失させてヒト遺伝子を挿入する相同組換え事象を誘導するように設計された、げっ歯類ＤＮＡのホモロジーアームに隣接する遺伝子産物（タンパク質またはＲＮＡ）をコードするヒト遺伝子の全てまたは一部を含んでいた。その他の実験では、別々の遺伝子座、例えば、Ｃｈ２５ｈ遺伝子座などを標的とするようにＬＴＶＥＣを設計した。いずれの例においても、ＬＴＶＥＣはまた、抗生剤（例えば、Ｇ４１８）への耐性を付与する酵素（例えば、ネオマイシンリン酸基転移酵素）の発現を誘導する薬剤選択カセットを保持していた。
ＬＴＶＥＣを取り込んでそのゲノム内に組み込んだＥＳ細胞は、抗生剤を含有する増殖培地を入れた組織培養ディッシュ上で増殖してコロニーを形成することができた。本発明者らがＬＴＶＥＣ分子と比較して５００～１，０００倍超のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コード及びｇＲＮＡコード核分子を導入したため、ＬＴＶＥＣ含有薬剤耐性コロニーの大部分はまた、少なくとも一時的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を含有していた。本発明者らは、薬剤耐性コロニーを選択してから、対立遺伝子の改変法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２－６６０；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７（その全体は参照として本明細書に組み込まれる））を用いてそれらをスクリーニングし、正確に標的化されたヒト化対立遺伝子を有するクローンを同定した。加えて、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム内配列を認識するリアルタイムＰＣＲアッセイ（保持アッセイと呼ばれる）を使用して、ＬＴＶＥＣのマウスゲノムへの正確な標的化を確認した。これら保持アッセイのコピー数を定量することにより、正確に標的化されたＥＳクローン（２のコピー数を保持）と、標的マウス遺伝子座の大きなＣａｓ９誘導欠失がゲノム内の他の箇所におけるＬＴＶＥＣのランダム導入と同時に起こるクローン（その場合、保持アッセイは３（またはそれ以上）のコピー数を有する）の識別を補助するための更なる明確性がもたらされた。対のｇＲＮＡが標的マウス遺伝子座に大きなＣａｓ９媒介欠失を生成する機能は、更なる明確性をもたらして正確な標的化を確認するために上記の標準的なＬＯＡ及びＧＯＡアッセイが保持アッセイにより補完され得ることを意味した。それゆえ、保持アッセイは設計されて、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイと共に使用された。
それぞれの実験では、１つまたは２つのｇＲＮＡのいずれかを使用した。単一で使用されるｇＲＮＡは、標的遺伝子座（すなわち、標的マウス遺伝子欠失）の５´末端近傍、標的遺伝子座の中央近傍、または標的遺伝子座の３´末端近傍において、Ｃａｓ９開裂を誘導した。２つのｇＲＮＡを使用した場合、一方のｇＲＮＡは標的遺伝子座の５´末端近傍のＣａｓ９開裂を誘導し、もう一方のｇＲＮＡは標的遺伝子座の中央または標的遺伝子座の３´末端近傍のＣａｓ９開裂を誘導した。
Ｌｒｐ５遺伝子座
１つのセットの実験では、ＬＴＶＥＣは、外部ドメインをコードするマウスＬｒｐ５（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５）遺伝子の一部の６８ｋｂの欠失を生成して、ヒトＬＲＰ５遺伝子に由来する相同配列の９１ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計された（図８を参照のこと）。ＬＴＶＥＣは、欠失させることを目的としたマウスＬｒｐ５遺伝子の６８ｋｂ配列に隣接するマウスＬｒｐ５遺伝子座の一部に由来する７ｋｂ及び３３ｋｂのゲノムＤＮＡを含有するホモロジーアームに隣接する９１ｋｂフラグメントのヒトＬＲＰ５遺伝子を含んでいた。個々の実験では、Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び８つのｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、Ｅ２、Ｅ、Ｆ）のうちの１つをコードする第２のプラスミドと組み合わせた。ヒトＬＲＰ５遺伝子の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｇＲＮＡを設計した。その他の実験では、本発明者らは、ＬＴＶＥＣ及びＣａｓ９コードプラスミドを、欠失の標的となるマウスＬｒｐ５遺伝子の領域内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードするプラスミドと組み合わせた。
欠失内の配列用ならびに薬剤選択カセット及びヒト遺伝子インサート内の配列用の対立遺伝子の改変アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２－６５９；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７）により、薬剤耐性ＥＳ細胞クローンを標的ヒト化でスクリーニングした。クローンが２つの内在マウス遺伝子配列のうちの１つを喪失しヒトインサートの１つのコピーを獲得し、また保持配列の２つのコピー（ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム内に配置された）を保持していた場合、クローンを正確に標的化されたものとスコアリングした。このスクリーニングのための２つの保持アッセイは、以下のプライマー及びプローブ、７０６４ｒｅｔＵフォワードプライマーＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧ（配列番号：１００）、７０６４ｒｅｔＵリバースプライマーＣＣＴＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡ（配列番号：１０１）、７０６４ｒｅｔＵＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブＴＴＣＴＧＣＣＣＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＣ（配列番号：１０２）、７０６４ｒｅｔＤフォワードプライマーＣＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡ（配列番号：１０３）、７０６４ｒｅｔＤリバースプライマーＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＴＧＣＣＴＴＣＴＡＣ（配列番号：１０４）、７０６４ｒｅｔＤＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブＴＧＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴ（配列番号：１０５）を使用したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイであった。
Ｌｒｐ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化の結果については、表１３にまとめている。ＬＴＶＥＣ単独をＥＳ細胞に導入した際、スクリーニング済み薬剤耐性クローンの１．９％は、正確に標的化されたヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を保持していた（表１３のヘテロ標的化列（非標的対立遺伝子が全く変異されていないクローンまたはＮＨＥＪにより生じた小さな欠失などの小さなＣＲＩＳＰＲ誘導変異を有するクローンを含む）を参照のこと）。それに対し、ＬＴＶＥＣを、８つの試験ｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、Ｅ２、Ｅ及びＦ、表１を参照のこと）のうちの７つによりガイドされるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、正確に標的化された単一対立遺伝子ヘテロ接合性変異が２．１～７．８％の範囲の効率で生成された。Ｂ２及びＤによるＣａｓ９誘導開裂では、単一対立遺伝子標的化に加えて、二対立遺伝子ホモ接合性ヒト化が１．０～２．１％の頻度で検出された。本発明者らは、小さく単純な欠失対立遺伝子であっても、ＬＴＶＥＣ単独による二対立遺伝子標的化を全く観察していない。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：９１－９９（その全体は本明細書に参照として組み込まれる））を用いて、ホモ接合性Ｌｒｐ５ヒト化ＥＳ細胞を、表現型試験及び薬剤効果試験の準備が整った完全ＥＳ細胞由来マウスに直接変換することができる。
想定開裂部位またはその近傍におけるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９誘導ＮＨＥＪ変異を検出するために考案したＭＯＡアッセイは、試験した全てのｇＲＮＡの変異活性を示した（データは省略）。アッセイした全てのクローン内で検出された単一対立遺伝子ｇＲＮＡ誘導変異または二対立遺伝子ｇＲＮＡ誘導変異のいずれかの比率は、遺伝子座及び位置によって変化した。ｇＲＮＡ変異活性とＬＴＶＥＣ標的化の間に強い相関は認められなかったが、最低標的化効率は多くの場合、最低変異頻度を有するｇＲＮＡと関連していた。
欠失の標的となるＬｒｐ５遺伝子の領域における異なる末端を認識する２つのｇＲＮＡを組み合わせると、試験した５つの組み合わせのうちの３つにおけるホモ接合性標的化事象の頻度を主に上昇させることによって、総ヒト化標的化効率が上昇した（表１３）。ｇＲＮＡの組み合わせが、ｇＲＮＡによりプログラムされたＣａｓ９開裂部位間の大きな欠失を生成する潜在性を有することにより、本発明者らはまた、一方のＬｒｐ５対立遺伝子上に標的ヒト化を保持しもう一方の対立遺伝子上に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を保持するヘミ接合性ＥＳ細胞クローンを観察した（ｇＲＮＡの組み合わせＡ ＋ Ｆ、表１３）。加えて、ｇＲＮＡの組み合わせの２つ（Ａ ＋ Ｆ及びＡ ＋ Ｅ２）において、本発明者らは、固有の遺伝子型（両Ｌｒｐ５対立遺伝子上に大きなＣＲＩＳＰＲ媒介欠失）を有するＥＳ細胞クローンを同定した。
Figure 2023078479000029
Figure 2023078479000030
表１３に示すとおり、１つのｇＲＮＡではなく単一遺伝子座を標的とする２つのｇＲＮＡ（図９Ａを参照のこと）を使用した場合に、二対立遺伝子標的化を有するクローンのパーセンテージにおける有意な上昇が認められ、ｇＲＮＡの組み合わせの使用が二対立遺伝子改変を促進することを示した。図９Ａは、ＬＴＶＥＣ及び２つのガイドＲＮＡ（Ａ及びＢ）を使用した、マウス遺伝子の同時欠失及び対応するヒト型への置換の一般的な概略を示している。２つのｇＲＮＡを使用する際にはるかに高い頻度で認められる固有の変異対立遺伝子型としては、ホモ接合性に崩壊した対立遺伝子（図９Ｂ、Δ／Δ）、ホモ接合性に標的化された対立遺伝子（図９Ｃ、Ｈｕｍ／Ｈｕｍ）、ヘミ接合性に標的化された対立遺伝子（図９Ｄ、Ｈｕｍ／Δ）、及びその他の複合ヘテロ接合性に標的化された対立遺伝子（例えば、一方の対立遺伝子がＬＴＶＥＣ標的ヒト化を有し、もう一方の対立遺伝子が小さな欠失などのＣＲＩＳＰＲ誘導変異を有する）（図９Ｅ）、が挙げられる。
ＭＯＡアッセイに基づく遺伝子型を支持及び確認するために、いくつかのＰＣＲアッセイを実施した。プライマーについては表１中に見出すことができる。Ｌｒｐ５ ＬＴＶＥＣは、ヒトインサートと隣接マウスゲノム配列の間の物理的接合部をアッセイするためのＰＣＲによる標的化を証明するには十分に短い（６．９ｋｂ）５´ホモロジーアームを有していた。本発明者らは、ヘテロ接合性、ヘミ接合性またはホモ接合性とスコアリングされたクローン由来のＤＮＡを有するが、親ＥＳ細胞株由来または二対立遺伝子の大きな欠失を有するとスコアリングされたクローン由来のＤＮＡを有さない、想定された７．５ｋｂのＰＣＲ産物（図１０Ａ）を観察し、それにより、推測された二対立遺伝子の大きな欠失をスクリーニング及び支持するＭＯＡ（すなわち、ＬＯＡ及びＧＯＡ）により作製された標的化細胞を確認した。５´－Ｄｅｌ－Ｊ ＰＣＲアッセイ（欠失接合部及び挿入接合部における配列を確認した（図１０Ｂ））は、親ＥＳ細胞株由来及びほとんどのヘテロ接合性ヒト化クローン由来のＤＮＡを有する３３０ｂｐの産物を生成した（データは省略）。ヘテロ接合性クローンＡＷ－Ｃ３では、５´－Ｄｅｌ－Ｊアッセイは、想定されたよりも小さな産物（図１０Ｂ）を生成し、ｇＲＮＡ Ａ／Ｃａｓ９開裂が非標的対立遺伝子上に小さな欠失変異（ｇＲＮＡ Ａ開裂用のＭＯＡアッセイによっても検出される）を誘導したことを示唆した（データは省略）。予想どおり、５´－Ｄｅｌ－Ｊアッセイは、ヘミ接合性、ホモ接合性及び二対立遺伝子欠失の対立遺伝子を有するクローンに対して陰性であった。５´－Ｉｎｓ－Ｊ ＰＣＲ（ヒトＤＮＡインサートの５´末端と隣接したマウス隣接配列の間の接合部における配列を確認した）（図１０Ｂ）は、ヘテロ接合性、ヘミ接合性及びホモ接合性クローン（これらクローンは、少なくとも１つの標的されたヒト化対立遺伝子を有している）内の４７８ｂｐの産物を生成した。５´－Ｉｎｓ－Ｊ ＰＣＲアッセイは、二対立遺伝子の大きな欠失を有するクローンの産物を生成しなかった（図１０Ｂ）。ヘミ接合性クローン及び二対立遺伝子欠失クローン内の大きな欠失を確認するために、本発明者らは、デュアルｇＲＮＡ標的部位の外側の配列を認識するプライマーを用いたＰＣＲを実施した。Ｄｅｌ（Ａ ＋ Ｆ）ＰＣＲ（Ａ ｇＲＮＡ部位とＦ ｇＲＮＡ部位の間の欠失をアッセイする）は、クローンＡＷ－Ａ８及びＢＯ－Ｆ１０由来のＤＮＡを有する約３６０ｂｐの単一産物（図１０Ｂ）を生成し、Ｌｒｐ５対立遺伝子の少なくとも１つが大きな欠失を有していることが確認された。同様に、Ｄｅｌ（Ａ ＋ Ｅ２）ＰＣＲ（Ａ ｇＲＮＡ部位とＥ２ ｇＲＮＡ部位の間の大きな欠失をアッセイする）は、クローンＢＡ－Ａ７由来のＤＮＡを有する約２５０ｂｐの単一産物を生成した。欠失ＰＣＲは、接合部、ＬＯＡ及びＧＯＡアッセイと共に、二対立遺伝子の大きな欠失遺伝子型を支持している。図１０Ａ及び図１０Ｂに示すアッセイ結果は、表１３にまとめた二対立遺伝子の遺伝子型を確認するための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、図１１Ａ～図１１Ｃ）に加えて本発明者らが実施した類似アッセイの代表的な例である。
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、Ｌｒｐ５遺伝子のホモ接合性標的ヒト化を確認した。Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣをＣａｓ９及び２つのｇＲＮＡ（Ａ ＋ ＦまたはＡ ＋ Ｅ２）と組み合わせた標的化実験による定量的ＰＣＲアッセイ及び通常のＰＣＲアッセイによりホモ接合性標的とスコアリングされたＥＳ細胞クローンを、民間のＦＩＳＨ解析及び核型解析用細胞診断サービスに送付した。マウスＬｒｐ５遺伝子を有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）を赤色蛍光マーカーで標識して内在Ｌｒｐ５遺伝子座を同定するためのプローブとして使用し、ヒトＬＲＰ５遺伝子を有するＢＡＣを緑色蛍光マーカーで標識してヒトインサートが標的とした染色分体を同定するためのプローブとして使用した。標識ＢＡＣプローブを標的クローン由来の中期スプレッドにハイブリダイズして、蛍光顕微鏡で可視化した。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を用いた染色によりスプレッド上の染色体を可視化して、ギムザ染色によりそれぞれのクローンの個々の核型を同定した。正常な４０ＸＹ核型（図示せず）を有することが判明しているクローンＡＷ－Ｄ９の標準的な結果を図１１Ａに示している。図１１Ａの合成写真は、赤色マウスＢＡＣプローブシグナルと緑色ヒトＢＡＣプローブシグナルの両方が、両コピーのマウス１９番染色体上の細胞学的バンドＢ（Ｌｒｐ５遺伝子における既知の位置）に共局在したことを示している。図１１Ｃの合成写真は、別のクローン（ＢＡ－Ｄ５）における同様のホモ接合性標的化を示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内におけるヒトＬＲＰ５遺伝子の９１ｋｂフラグメントが、クローンＡＷ－Ｄ９及びＢＡ－Ｄ５内の両１９番染色体相同体上における目的のマウスＬｒｐ５遺伝子座に正確に挿入されたことを裏付けるものである。それに対し、図１１Ｂの合成写真は、赤色マウスＢＡＣプローブシグナルと緑色ヒトＢＡＣプローブシグナルの両方（実線矢印）が単一コピーのマウス１９番染色体上の細胞学的バンドＢに共局在した一方で、赤色マウスＢＡＣプローブシグナルのみがもう一方のコピーのマウス１９番染色体上の細胞学的バンドＢに局在したことを示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内におけるヒトＬＲＰ５遺伝子の９１ｋｂフラグメントが、一方のコピーの１９番染色体上のみにおける目的のマウスＬｒｐ５遺伝子座に正確に挿入されたこと（ヘテロ接合性標的化）を裏付けるものである。これらの結果はまた、ヒトＢＡＣプローブがマウスＬｒｐ５遺伝子座にクロスハイブリダイズしないがヒトＬＲＰ５インサートのみを認識することを示している（省略するがその他の対照と共に）。
明らかな非相同末端結合修復により両方の対立遺伝子に生成された特定のクローンにおける同一のＣＲＩＳＰＲ誘導インデル変異の存在は、Ｆ１Ｈ４ハイブリッド細胞（５０％ １２９ＳｖＳ６株及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）における遺伝子変換事象の発生を示唆していた。２つのｇＲＮＡを使用する際の高い二対立遺伝子標的化の基礎をなす機構についての洞察を得るために、ＬＴＶＥＣ及びＡ ＋ ＦまたはＡ ＋ Ｅ２ ｇＲＮＡの組み合わせのいずれかを用いた標的化に続いて、標的ホモ接合性ヒト化またはＣＲＩＳＰＲが誘導したホモ接合性の大きな欠失のいずれかを有する７つのクローンをスクリーニングした。
図１２は、２つのガイドＲＮＡが関与する遺伝子変換事象を確認するように設計されたアッセイの例を示している。具体的には、Ｆ１Ｈ４ハイブリッドＥＳ細胞（５０％ １２９ ＳｖＳ６株及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）内におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を解析することにより、遺伝子変換の可能性を確認した。１２９ＳｖＳ６（１２９）とＣ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６）の間の既知の多型におけるヘテロ接合性の喪失により遺伝子変換が示され得るため、これら２つの対立遺伝子型を識別するようにＰＣＲアッセイを設計した。１２９対立遺伝子とＢ６対立遺伝子の間の差異を検出するように設計された通常のＰＣＲを用いて、構造多型（ＳＶ）多型をアッセイした。以下で使用したＳＶアッセイの１つのみを図１２に示しているが、それぞれにおいてコンセプトは同様である。Ｂ６マウス系統と１２９マウス系統の間の構造多型（ＳＶ）に基づいてプライマーを設計したが、それらプライマーについては表１に記載している。プライマー設計の条件は、約２５ｂｐのＳＶを同定して約３００ｂｐのＰＣＲ産物を生成させるような条件とし、任意の変化がゲル電気泳動により可視化され得るようにこれらの条件を選択した。
クローンに対してＰＣＲを行う前に、アッセイを検証して、Ｂ６系統、１２９系統由来及びＦ１Ｈ４ ＥＳ細胞株由来の野生型ＥＳ細胞ＤＮＡに対して最適化した。Ｂ６対立遺伝子または１２９対立遺伝子のいずれかに特異的な識別可能なＰＣＲバンドを生成し、Ｆ１Ｈ４ ＤＮＡを使用してこれら同様の２つの識別可能なバンドを安定生成するプライマーセットを、クローン試験用に選択した。１９番染色体（Ｌｒｐ５遺伝子の位置）については、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイ及び通常のＰＣＲにより「ホモ接合性標的」または「ホモ接合性崩壊」のいずれかとして遺伝子型決定されたＬｒｐ５ヒト化クローンに使用するための６組のプライマーセット（ＩＤ １９００４５、１９００６１、１９００６８、１９００３０、１９００３３、１９００１３）を選択した。Ｌｒｐ５遺伝子座から染色体のテロメア末端までの１９番染色体に沿ってＬｒｐ５遺伝子座から約１３．７～約５６．２Ｍｂの範囲で、ＳＶ ＰＣＲアッセイを間隔を空けて配置した。１９番染色体上におけるＬｒｐ５遺伝子座からのＳＶアッセイのおおよその距離（Ｍｂ）は、以下、１９００４５アッセイで１３．７、１９００６１アッセイで１９．０、１９００６８アッセイで３５．０、１９００３０アッセイで３７．４、１９００３３アッセイで４８．３、及び１９００１３アッセイで５６．２、のとおりである。アッセイ１９００３３（ＳＶ４８．３として示す）のみを図１２に示しているが、アッセイ１９００４５、１９００６１、１９００６８、１９００３０、１９００３３及び１９００１３用のプライマーについて表１に示している。
これらクローン由来のＤＮＡに加え、Ｆ１Ｈ４対照ＤＮＡ、１２９対照ＤＮＡ及びＢ６対照ＤＮＡに対してＰＣＲを実施した。電気泳動によりＰＣＲ産物を６％ポリアクリルアミドゲル上で分離させてからＧｅｌＲｅｄで染色した。Ｆ１Ｈ４対照と一致する２つのバンドを生成したクローンにおいては、以前の最適化により、上部のバンドが１２９対立遺伝子に特異的であり下部のバンドがＢ６対立遺伝子に特異的であることが示された。１つのバンドのみを生成したクローンは、Ｂ６バンドのみまたは１２９バンドのみのいずれかを示した。クローンＡＷ－Ａ７、ＡＷ－Ｆ１０、ＢＡ－Ｄ５、ＢＡ－Ｆ２、ＢＣ－Ｈ９及びＢＲ－Ｂ４が６つ全てのアッセイでＢ６バンドのみを示した一方で、クローンＢＯ－Ａ８は６つ全てのアッセイで１２９バンドのみを示した。上で述べたように、これらクローンは、ＭＯＡ及び／またはＰＣＲによりホモ接合性標的またはホモ接合性崩壊のいずれかとして遺伝子型決定され、様々なｇＲＮＡの組み合わせ（Ａ ＋ Ｆ、Ａ ＋ Ｅ２、Ｂ２及びＤ）が関与していた。単一対立遺伝子バンドのみの存在は遺伝子変換事象が起こっていることを示唆した（変換がない場合、両方のバンドはなおもＦ１Ｈ４対照に存在するであろう）。
加えて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイを用いて、１２９対立遺伝子とＢ６対立遺伝子の間の一塩基多型（ＳＮＶ）をアッセイした。図１２の１９番染色体地図上におけるＳＮＶアッセイのおおよその位置は、Ｌｒｐ５遺伝子座からのそれらの距離（Ｍｂ）を示す矢じり（下側に記載）で示している。Ｌｒｐ５遺伝子座からの距離（Ｍｂ）は、以下、Ｌｒｐ５の０．３２セントロメア側（Ｃ２）、Ｌｒｐ５の１．２テロメア側（Ｔ３）、Ｌｒｐ５の１１．１テロメア側（Ｔ６）、Ｌｒｐ５の１３．２テロメア側（Ｔ７）、Ｌｒｐ５の１７．５テロメア側（Ｔ８）、Ｌｒｐ５の２５．８テロメア側（Ｔ９）、Ｌｒｐ５の３３．０テロメア側（Ｔ１０）、Ｌｒｐ５の３８．３テロメア側（Ｔ１１）、Ｌｒｐ５の４９．６テロメア側（Ｔ１３）、及びＬｒｐ５の５７．２テロメア側（Ｔ１４）、のとおりである。１２９特異的プローブ及びＢ６特異的プローブならびにプライマーペアについては、表１に示している。
表１４は、ＳＶ対立遺伝子とＳＮＶ対立遺伝子の両方のＬＯＨによる、Ｌｒｐ５標的遺伝子座からテロメア方向へと１９番染色体の長腕にわたる明らかな遺伝子変換事象を示した、ＥＳ細胞クローンの７つの例を示している。示したとおり、Ｌｒｐ５ヒト化ＬＴＶＥＣを１つまたは２つのｇＲＮＡと組み合わせた独立した標的化実験でＥＳ細胞クローンを誘導した。ｇＲＮＡ認識配列の位置は、図１２のＬｒｐ５遺伝子表記の上側に示している（左向き太矢印）。遺伝子型決定アッセイは、７つのクローンのうちの６つがＬｒｐ５遺伝子のホモ接合性に標的化されたヒト化を有する一方で、１つがホモ接合性崩壊（ｇＲＮＡ部位間の大きな欠失）を有することを示した。７つのクローンのうちの６つでは、１２９対立遺伝子が喪失してＢ６対立遺伝子のみが残った。その他のクローンでは、Ｂ６対立遺伝子が喪失して１２９対立遺伝子のみが残った。Ｌｒｐ５遺伝子座のセントロメア側をアッセイした対立遺伝子では、全てのクローンはヘテロ接合性を維持していた（すなわち、全てのクローンはＣ２ ＳＮＶアッセイでヘテロ接合性Ｂ６／１２９であった）。７つのクローンで認められたＬＯＨは、ＬＴＶＥＣを１つのｇＲＮＡまたはより頻繁に２つのｇＲＮＡと組み合わせた場合にホモ接合性の遺伝子組換え対立遺伝子が得られ、一方の対立遺伝子上における最初の標的遺伝子改変に続き、一方の染色体からその相同体へと標的遺伝子改変を複製する相同組換え遺伝子変換事象である、１つの機構を示している。
Figure 2023078479000031
Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座
別のセットの実験では、ＬＴＶＥＣは、補対成分５（Ｃ５またはＨｃ（溶血性補体））のマウス遺伝子の７６ｋｂの欠失を生成して、相同ヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計された。標的遺伝子座は、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子の終止コドンに対応するエキソン２を含んでいた。ＬＴＶＥＣは、欠失させることを目的としたマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の７６ｋｂ配列に隣接するマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座の一部に由来する３５ｋｂ及び３１ｋｂのゲノムＤＮＡを含有するホモロジーアームに隣接する９７ｋｂフラグメントのヒトＣ５遺伝子を含んでいた。個々の実験では、Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び６つのｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＥ２、表１を参照のこと）のうちの１つをコードする第２のプラスミドと組み合わせた。ヒトＣ５遺伝子の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｇＲＮＡを設計した。その他の実験では、本発明者らは、ＬＴＶＥＣ及びＣａｓ９コードプラスミドを、欠失の標的となるマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子の領域内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードするプラスミドと組み合わせた。一部の実験では、Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化ＬＴＶＥＣの代わりに、Ｃｈ２５ｈ遺伝子座を標的とする対照ＬＴＶＥＣを使用した。Ｃｈ２５ｈの全コード配列（約１ｋｂ）を欠失させてピューロマイシン及びネオマイシン選択カセットをＣｈ２５ｈ遺伝子座に挿入するように設計された対照ＬＴＶＥＣを、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子座における相同組換えの標的とはならない薬剤耐性クローンを選択するための手段として使用した。
Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化の結果については表１５に示しており、Ｌｒｐ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化で得られた結果に類似している。ＬＴＶＥＣ単独による標的化効率はＬｒｐ５と比較してＣ５（Ｈｃ）ヒト化でより高かった（６．１％）が、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを加えることにより、試験した６つのｇＲＮＡのうちの４つで標的化効率が向上した。Ｌｒｐ５と同様に、Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化のためにｇＲＮＡを組み合わせると（すなわち、２つのｇＲＮＡを使用する）、ヘミ接合性及びホモ接合性標的化事象の頻度を主に上昇させることによって、総標的化効率が更に上昇した。本発明者らはまた、両方の対立遺伝子上に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞クローンを発見した（１．８％～３．６％の頻度で観察された）。加えて、Ｃｈ２５ｈ遺伝子座を標的とするＬＴＶＥＣを２つのＣ５（Ｈｃ）ｇＲＮＡと組み合わせて使用した場合に、２つのガイドＲＮＡ認識配列間で崩壊したホモ接合性対立遺伝子を有するクローンが１．２％～６％の頻度で観察され、標的遺伝子座における崩壊事象が相同組換え事象とは独立して生じることを示した。Ｌｒｐ５と同様に、保持アッセイを使用して正確に標的化されたクローンを確認した。このスクリーニングのための２つの保持アッセイは、以下のプライマー及びプローブ、７１４０ｒｅｔＵフォワードプライマーＣＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＣ（配列番号：１０６）、７１４０ｒｅｔＵリバースプライマーＧＡＣＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧ（配列番号：１０７）、７１４０ｒｅｔＵＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブＣＣＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＴＡＧＣＡＴＣＡ（配列番号：１０８）、７１４０ｒｅｔＤフォワードプライマーＣＣＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧ（配列番号：１０９）、７１４０ｒｅｔＤリバースプライマーＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧ（配列番号：１１０）、７１４０ｒｅｔＤＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブＴＡＧＴＣＡＣＧＴＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡ（配列番号：１１１）を使用したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイであった。
Figure 2023078479000032
Figure 2023078479000033
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子のホモ接合性標的ヒト化を確認した。Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化ＬＴＶＥＣをＣａｓ９及び２つのｇＲＮＡと組み合わせた標的化実験による定量的ＰＣＲアッセイ及び通常のＰＣＲアッセイによりホモ接合性標的とスコアリングされたＥＳ細胞クローンを、民間のＦＩＳＨ解析及び核型解析用細胞診断サービスに送付した。マウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子を有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）を赤色蛍光マーカーで標識して内在遺伝子座を同定するためのプローブとして使用し、ヒトＣ５遺伝子を有するＢＡＣを緑色蛍光マーカーで標識してヒトインサートが標的とした染色分体を同定するためのプローブとして使用した。標識ＢＡＣプローブを標的クローン由来の中期スプレッドにハイブリダイズして、蛍光顕微鏡で可視化した。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を用いた染色によりスプレッド上の染色体を可視化して、ギムザ染色によりそれぞれのクローンの個々の核型を同定した。クローンＯ－Ｅの標準的な結果を図１３Ｂに示している。図１３Ｂの合成写真は、赤色マウスＢＡＣプローブシグナルと緑色ヒトＢＡＣプローブシグナルの両方が、両コピーのマウス２番染色体上のＣ５（Ｈｃ）遺伝子座（Ｃ５（Ｈｃ）遺伝子における既知の位置）に共局在したことを示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内におけるヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂフラグメントが、クローンＯ－Ｅ３内の両２番染色体相同体上における目的のマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座に正確に挿入されたことを裏付けるものである。それに対し、図１３Ａの合成写真は、赤色マウスＢＡＣプローブシグナルと緑色ヒトＢＡＣプローブシグナルの両方（実線矢印）が単一コピーのマウス２番染色体上に共局在した一方で、赤色マウスＢＡＣプローブシグナルのみがもう一方のコピーのマウス２番染色体上のＣ５（Ｈｃ）遺伝子座に局在したことを示している。これらの結果は、ヒト化ＬＴＶＥＣ内におけるヒトＣ５遺伝子の９７ｋｂフラグメントが、クローンＱ－Ｅ９内の一方のコピーの２番染色体上のみにおける目的のマウスＣ５（Ｈｃ）遺伝子座に正確に挿入されたこと（ヘテロ接合性標的化）を裏付けるものである。
それから、クローンに対してアッセイを行い、２つのガイドＲＮＡが関与する遺伝子変換事象を確認した。具体的には、Ｆ１Ｈ４ハイブリッドＥＳ細胞（５０％ １２９ ＳｖＳ６株及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）内におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を解析することにより、遺伝子変換の可能性を確認した。１２９ＳｖＳ６（１２９）とＣ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６）の間の既知の多型におけるヘテロ接合性の喪失により遺伝子変換が示され得るため、これら２つの対立遺伝子型を識別するようにＰＣＲアッセイを設計した。１２９対立遺伝子とＢ６対立遺伝子の間の差異を検出するように設計された通常のＰＣＲを用いて、構造多型（ＳＶ）多型をアッセイした。Ｂ６マウス系統と１２９マウス系統の間の構造多型（ＳＶ）に基づいてプライマーを設計したが、それらプライマーについては表１に記載している。プライマー設計の条件は、約２５ｂｐのＳＶを同定して約３００ｂｐのＰＣＲ産物を生成させるような条件とし、任意の変化がゲル電気泳動により可視化され得るようにこれらの条件を選択した。
クローンに対してＰＣＲを行う前に、アッセイを検証して、Ｂ６系統、１２９系統由来及びＦ１Ｈ４ ＥＳ細胞株由来の野生型ＥＳ細胞ＤＮＡに対して最適化した。Ｂ６対立遺伝子または１２９対立遺伝子のいずれかに特異的な識別可能なＰＣＲバンドを生成し、Ｆ１Ｈ４ ＤＮＡを使用してこれら同様の２つの識別可能なバンドを安定生成するプライマーセットを、クローン試験用に選択した。標的化実験のクローンに使用するために、５つのプライマーセット（ＩＤ ＳＶ ６．１、ＳＶ ６．３、ＳＶ ７．８、ＳＶ １６及びＳＶ ２５．５）を選択した。Ｃ５遺伝子座から染色体のテロメア末端までの染色体に沿ってＣ５遺伝子座から約６．３～約２５．５Ｍｂの範囲で、ＳＶ ＰＣＲアッセイのうちの４つを間隔を空けて配置した。最後のＳＶ ＰＣＲアッセイは、Ｃ５遺伝子座へと約６．１Ｍｂセントロメア側であった。Ｃ５遺伝子座からのＳＶアッセイのおおよその距離（Ｍｂ）は、以下、アッセイＳＶ ６．１で６．１（セントロメア側）、アッセイＳＶ ６．３で６．３（テロメア側）、アッセイＳＶ ７．８で７．８（テロメア側）、アッセイＳＶ １６．０で１６．０、及びアッセイＳＶ２５．５で２５．５（図１４を参照のこと）、のとおりである。
Ｃ４遺伝子座のセントロメア側をアッセイした対立遺伝子では、２１全てのクローンはヘテロ接合性を維持していた（すなわち、全てのクローンはヘテロ接合性Ｂ６／１２９であった）。試験した２１のクローンのうちの２つは、ＬＯＨによるＣ５標的遺伝子座からテロメア方向への明らかな遺伝子変換事象を示した（表１６を参照のこと）。遺伝子型決定アッセイでは、クローンのうちの一方がＣ５遺伝子のホモ接合性に標的化されたヒト化を有し、もう一方のクローンがホモ接合性崩壊を有することを示した。２つのクローンで認められたＬＯＨは、ＬＴＶＥＣを１つのｇＲＮＡまたはより頻繁に２つのｇＲＮＡと組み合わせた場合にホモ接合性の遺伝子組換え対立遺伝子が得られ、一方の対立遺伝子上における最初の標的遺伝子改変に続き、一方の染色体からその相同体へと標的遺伝子改変を複製する相同組換え遺伝子変換事象である、１つの機構を示している。
Figure 2023078479000034
Ｒｏｒ１遺伝子座
別のセットの実験では、ｌＴＶＥＣは、マウスＲｏｒ１（チロシン－タンパク質キナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１）遺伝子の１１０ｋｂの欠失を生成して、相同ヒトＲＯＲ１遺伝子の１３４ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計された。ＬＴＶＥＣは、欠失させることを目的としたマウスＲｏｒ１遺伝子の１１０ｋｂ配列に隣接するマウスＲｏｒ１遺伝子座の一部に由来する４１．８ｋｂ及び９６．４ｋｂのゲノムＤＮＡを含有するホモロジーアームに隣接する１３４ｋｂフラグメントのヒトＲＯＲ１遺伝子を含んでいた。個々の実験では、Ｒｏｒ１ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウスＲｏｒ１遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び６つのｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ、表１を参照のこと）のうちの１つをコードする第２のプラスミドと組み合わせた。ヒトＲＯＲ１遺伝子の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｇＲＮＡを設計した。その他の実験では、本発明者らは、ＬＴＶＥＣ及びＣａｓ９コードプラスミドを、欠失の標的となるＲｏｒ１遺伝子内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードするプラスミドと組み合わせた。
Ｒｏｒ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化の結果については表１７に示しており、Ｌｒｐ５遺伝子及びＣ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化で得られた結果に類似している。ＬＴＶＥＣ単独による標的化効率は０．３％であったが、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを加えることにより、試験した６つのｇＲＮＡのうちの２つで標的化効率がわずかに上昇した。Ａ ｇＲＮＡとＦ ｇＲＮＡを組み合わせると、ヘテロ接合性標的化事象とヘミ接合性標的化事象の両方の頻度を上昇させることによって、総Ｒｏｒ１標的化効率が６．３％に上昇した。本発明者らはまた、両方の対立遺伝子上に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞クローンを発見した（１．６％の頻度で観察された）。ホモ接合性標的クローンは観察されなかった。別の実験では、ｇＲＮＡ ＡとｇＲＮＡ Ｄも組み合わせたが、ホモ接合性標的化は依然として観察されなかった。
Figure 2023078479000035
Ｔｒｐａ１遺伝子座
別のセットの実験では、ＬＴＶＥＣは、マウスＴｒｐａ１（一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＡ、メンバー１）遺伝子の４５．３ｋｂの欠失を生成して、相同ヒトＴＲＰＡ１遺伝子の５４．５ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計された。ＬＴＶＥＣは、欠失させることを目的としたマウスＴｒｐａ１遺伝子の４５．３ｋｂ配列に隣接するマウスＴｒｐａ１遺伝子座の一部に由来する４１．０ｋｂ及び５８．０ｋｂのゲノムＤＮＡを含有するホモロジーアームに隣接する５４．５ｋｂフラグメントのヒトＴＲＰＡ１遺伝子を含んでいた。個々の実験では、Ｔｒｐａ１ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウスＴｒｐａ１遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び８つのｇＲＮＡ（Ａ、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ２、Ｅ及びＦ、表１を参照のこと）のうちの１つをコードする第２のプラスミドと組み合わせた。ヒトＴＲＰＡ１遺伝子の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｇＲＮＡを設計した。その他の実験では、本発明者らは、ＬＴＶＥＣ及びＣａｓ９コードプラスミドを、欠失の標的となるＴｒｐａ１遺伝子内の異なる部位を標的とする２つの異なるｇＲＮＡをコードするプラスミドと組み合わせた。
Ｔｒｐａ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化の結果については表１８に示しており、Ｌｒｐ５遺伝子及びＣ５（Ｈｃ）遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化で得られた結果に類似している。ＬＴＶＥＣ単独による標的化効率は０．３％であったが、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを加えることにより、試験した８つのｇＲＮＡのうちの６つで標的化効率が上昇した。Ｂ ｇＲＮＡとＦ ｇＲＮＡを組み合わせると、ヘテロ接合性、ヘミ接合性及びホモ接合性の標的化事象の頻度を上昇させることによって、総Ｔｒｐａ１標的化効率が３．４％に上昇した。本発明者らはまた、両方の対立遺伝子上に大きなＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞クローンを発見した（０．３％の頻度で観察された）。
Figure 2023078479000036
Figure 2023078479000037
これらの例が示すように、大きく離れた部位においてデュアルガイドＲＮＡを使用することによって、単一ｇＲＮＡと比較してヘテロ接合性ヒト化の向上が改善された。加えて、デュアルガイドＲＮＡを使用することによって、単一ｇＲＮＡと比較して二対立遺伝子事象が促進された。１つのｇＲＮＡを用いた標的化とは対照的に、２つのｇＲＮＡを用いた標的化により、両方の対立遺伝子が標的ヒト化を有したホモ接合性標的細胞（Ｈｕｍ／Ｈｕｍ）、どちらの対立遺伝子もヒト化ＬＴＶＥＣに標的とされなかったが両方共大きな欠失を有したホモ接合性欠失細胞（Δ／Δ）、及び、一方の対立遺伝子が標的ヒト化を有しもう一方が大きなデュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９誘導欠失を有したヘミ接合性標的細胞（Ｈｕｍ／Δ）、が生成される。第１に、本発明者らは、両方の標的対立遺伝子に正確で同一な非常に大きなヒト化を有する正確に標的化されたクローン（例えば、標的遺伝子改変にホモ接合性な細胞）を発見した。Ｌｒｐ５ヒト化を達成するために本発明者らが１つのｇＲＮＡを使用した際にホモ接合性に標的化されたクローンも観察されたが、それらクローンは、本発明者らが２つのｇＲＮＡを用いた際と比較してはるかに低い頻度で生じた（表１３を参照のこと）。同様に、本発明者らは、Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化またはＴｒｐａ１ヒト化を達成するために１つのｇＲＮＡを使用した際にホモ接合性標的化を観察しなかったが、本発明者らは、標的化ベクターと共に２つのｇＲＮＡを使用した際にホモ接合性標的化を観察した（表１５及び表１８を参照のこと）。同様に、本発明者らは、Ｌｒｐ５標的化、Ｃ５（Ｈｃ）標的化、Ｒｏｒ１標的化及びＴｒｐａ１標的化の遺伝子改変にヘミ接合性である正確に標的化されたクローン（すなわち、それらクローンは、一方の対立遺伝子上に正確に標的化されたヒト化を有し、もう一方の対立遺伝子上に非常に大きな（時に遺伝子破壊）欠失を有する）を発見した。Ｌｒｐ５ヒト化、Ｃ５（Ｈｃ）ヒト化、Ｒｏｒ１ヒト化またはＴｒｐａ１ヒト化を達成するために１つのｇＲＮＡを使用した際には、このような改変は全く生じなかった（それぞれ表１３、表１５、表１７及び表１８を参照のこと）。
第２に、本発明者らは、両方の標的対立遺伝子上における両方のｇＲＮＡがガイドするＣａｓ９開裂事象により誘導された同一の非常に大きな欠失（＞４５ｋｂ）を有するクローン（すなわち、細胞は、標的遺伝子座において大きな（時に遺伝子破壊）欠失にホモ接合性であった）を発見した。これらのタイプの変異は、同一遺伝子に向かう標的化ベクターを必要としない。例えば、表１５に示すとおり、本発明者らは、Ｃａｓ９及び２つのｇＲＮＡを、ｇＲＮＡが標的とする遺伝子とは無関係の異なる遺伝子に向かう標的化ベクターと組み合わせることにより、ホモ接合性ＣＲＩＳＰＲ誘導欠失を有するＥＳ細胞を得た。それゆえ、２つのｇＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９ヌクレアーゼは、標的化ベクターを加えることなく細胞内における大きな欠失を誘導することができる。このような例においては、薬剤耐性遺伝子を発現するベクターによりもたらされる一過性または安定な薬剤選択は、ＤＮＡを取り込んだＥＳ細胞の濃縮による希少なホモ接合性欠失クローンの単離促進を可能とする。
実施例６．組み合わせたｇＲＮＡにより誘導された大きな欠失の解析。
組み合わせたｇＲＮＡにより誘導された大きな欠失の対立遺伝子構造
２つのｇＲＮＡがガイドするＣａｓ９開裂事象により誘導された大きな欠失を含むクローンについて、別の配列解析を実施した（表１９を参照のこと）。本発明者らがｇＲＮＡをＬｒｐ５ ＬＴＶＥＣまたはほぼ３０Ｍｂ離れたＣｈ２５ｈ遺伝子を標的とするＬＴＶＥＣのいずれかと組み合わせた際におおよそ同等の頻度でＬｒｐ５遺伝子座に大きな欠失を得たため、これらの大きな欠失は同一遺伝子座におけるＬＴＶＥＣ誘導相同組換え事象とは無関係であると思われた（データは省略）。大きな欠失の特性を決定するために、本発明者らは、６つのヒト化に由来する４０のクローン（１５のヘミ接合性及び二対立遺伝子の大きな欠失を有する２５）について欠失スパニングＰＣＲ（ｄｅｌｅｔｉｏｎ－ｓｐａｎｎｉｎｇ ＰＣＲ）を実施し、個々のクローンのＰＣＲ産物をシークエンスした。シークエンスにより、３８ｋｂ～１０９ｋｂの範囲の大きな欠失を確認した。ＥＳ細胞クローンのうちの３つ（Ｌｒｐ５クローンＡＷ－Ａ８及びＢＰ－Ｄ３ならびにＡｄａｍｔｓ５クローンＸ－Ｂ１１）は想定Ｃａｓ９開裂部位間に完全に修復された正確な欠失（６８．２ｋｂ）を有していた一方で、１つのクローン（ＨｃクローンＰ－Ｂ１２）は単一塩基対挿入に加え３８．１ｋｂの欠失を有していた。ＥＳ細胞クローンのうちの２７は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による不正確な修復と一致する、Ｃａｓ９開裂部位を越えてわたる欠失を有していた。残りの９つのＥＳ細胞クローンは明らかなＮＨＥＪ誘導欠失と挿入を組み合わせた変異（例えば、Ｌｒｐ５クローンＢＰ－Ｆ６及びＨｃクローンＯ－Ｅ４）を有しており、そのうちの５つは、本発明者らがそのソースゲノム遺伝子座にマッピング可能な２００ｂｐ超の挿入を有していた（データは省略）。Ｌｒｐ５クローンＢＯ－Ｅ９内における２１０ｂｐの挿入（１９番染色体 ＋、３５８９１３８～３５８９３４７）は、ｇＲＮＡ Ｆ標的部位の外側セントロメア方向約２，６００ｂｐに位置する同一配列に対して逆方向であった。この配列は、Ｌｒｐ５ ＬＴＶＥＣの長い３´ホモロジーアーム内に存在していた。Ｌｒｐ５クローンＢＰ－Ｆ６及びＢＰ－Ｇ７は、本発明者らがＬｒｐ５ ｇＲＮＡ Ａ及びＦをＣａｓ９及びＬｒｐ５からテロメア方向に３０Ｍｂ離れたＣｈ２５ｈ遺伝子を標的とするＬＴＶＥＣと組み合わせた実験に由来していた。クローンＢＰ－Ｆ６は、Ｃｈ２５ｈ近傍の配列と同一な１６３ｂｐのフラグメントに結合したベクター骨格の一部と同一な１０３ｂｐのフラグメントで構成されまたＬＴＶＥＣの長腕内に存在することからＣｈ２５ｈ ＬＴＶＥＣの一端に由来すると思われる２６６ｂｐの挿入（１９番染色体＋、３４４７８１３６～３４４７８２９８）を有しており、このフラグメントは、内在染色体配列に対して逆方向で欠失に挿入された。ＨｃクローンＯ－Ｅ４は、ｇＲＮＡ Ａ認識配列から約３．１ｋｂ離れた欠失配列内に見つかった同一配列に対して逆である２５４ｂｐの挿入を有していた。ＨｃクローンＳ－Ｄ５内における１，３０４ｂｐの挿入は、２つのフラグメント、想定ｇＲＮＡ Ｅ２誘導Ｃａｓ９開裂部位から約１．４ｋｂ離れた欠失配列内に見つかった同一配列と同一方向である１，２３８ｂｐの部分、及びｇＲＮＡ Ｅ２切断部位の外側２５ｂｐの同一配列の逆方向の複製である第２の６６ｂｐの部分、で構成されていた。
Figure 2023078479000038
Figure 2023078479000039
Figure 2023078479000040
ホモ接合性対立遺伝子における遺伝子変換のエビデンス
二対立遺伝子の大きな欠失を有する２５のＥＳ細胞クローンのうちの２４は、単一の固有配列のみを有しており（表１９）、それらクローンがホモ接合性対立遺伝子であることを示した。ＨｃクローンＳ－Ａ１１において、本発明者らは、１２のＰＣＲクローンのうちの１１内に同一配列を発見した。異なる配列を有する単一クローンは２つの異なる欠失対立遺伝子を示唆し得るが、本発明者らはまた、Ｈｃヘミ接合性クローンのうちの２つ、Ｎ－Ｄ１１及びＯ－Ｆ１２において同一結果を発見した。複数のクローン内の異なるホモ接合性欠失対立遺伝子は、それら対立遺伝子が、一方の染色体上の欠失が相同染色体上のＣａｓ９開裂の相同組換え修復用のテンプレートとして機能する遺伝子変換機構により生じ得たことを示唆した。本発明者らは、１９番染色体上のＬｒｐ５遺伝子座（以下で使用する５つのＳＶアッセイ及び１０のＳＮＶアッセイについては図１２を参照のこと）及び２番染色体上のＨｃ遺伝子座（図示せず）の周囲の変種間の構造多型（ＳＶ）及び一塩基多型（ＳＮＶ）によるヘテロ接合性の喪失としての遺伝子変換（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２５７－２５８）をアッセイするために、１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃ（１２９）とＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Ｂ６）のＦ１ハイブリッド組成物のＶＧＦ１ ＥＳ細胞株（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１－９９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２－６５９）を利用した。任意のヘテロ接合性の喪失が全染色体喪失の結果ではないことを確認するために、本発明者らは、１２９系統とＢ６系統の間で同一な部位で染色体コピー数（ＣＣＮ）アッセイを実施した。Ｌｒｐ５ヒト化または欠失対立遺伝子について、本発明者らは、Ｌｒｐ５からテロメア方向に１．２Ｍｂ離れた位置から１９番染色体の長腕末端までの位置に配置された複数のＳＶ及びＳＮＶをアッセイした（図１２）。Ｌｒｐ５の位置がセントロメアに近いために、本発明者らは遺伝子のセントロメア側にＳＶを発見せずＳＮＶを１つだけ発見した。Ｈｃでは、本発明者らは２番染色体上の遺伝子の両側に複数のＳＶ及びＳＮＶをアッセイすることができた（図示せず）。Ｌｒｐ５クローンのうちの６つの結果については、図１５Ａ～図１５Ｅ及び図１６Ａ～図１６Ｃに示している。
図１５Ａ～図１５Ｅは、５つのＳＶアッセイ（その位置範囲は、Ｌｒｐ５から１３．７Ｍｂ離れた位置から長腕のテロメア末端近傍の５６．７Ｍｂ離れた位置まで）の結果を示している。５つのＳＶアッセイは、１２９、Ｂ６及びＶＧＦ１対照内に２種類の異なるサイズの産物（１２９対立遺伝子（大きい方）及びＢ６対立遺伝子（小さい方））を生成した。１９番染色体地図上におけるＳＶアッセイのおおよその位置については、図１２に示している（アッセイＳＶ １３．７、アッセイＳＶ ２０．０、アッセイＳＶ ３６．９、アッセイＳＶ ４８．３、及びアッセイＳＶ ５６．７を参照のこと）。アッセイの数字は、Ｌｒｐ５に対してテロメア側のＭｂの数字を表している。これらアッセイ用のプライマーについては表１に示しており、それらの結果については図１５Ａ～図１５Ｅに示している。クローンのうちの２つ、ＢＣ－Ｈ９（Ｌｒｐ５Ｈｕｍ／Ｈｕｍ、ｇＲＮＡ Ｂ２）及びＢＲ－Ｂ４（Ｌｒｐ５Ｈｕｍ／Ｈｕｍ、ｇＲＮＡ Ｄ）がＢ６ ＳＶ対立遺伝子の全てを保持するヘテロ接合性の喪失を示す一方で、３番目のクローン、Ｂ０－Ａ８（Ｌｒｐ５Ｈｕｍ／Ｈｕｍ、ｇＲＮＡ Ａ ＋ Ｆ）は１２９対立遺伝子の全てを保持していた。その他の３つのクローン、ＢＯ－Ｆ１０（Ｌｒｐ５Ｈｕｍ／Ｈｕｍ、ｇＲＮＡ Ａ ＋ Ｆ）、ＢＯ－Ｇ１１（Ｌｒｐ５Ｈｕｍ／Ｈｕｍ、ｇＲＮＡ Ａ ＋ Ｆ）及びＢＰ－Ｇ７（Ｌｒｐ５Δ／Δ、ｇＲＮＡ Ａ ＋ Ｆ）は、ヘテロ接合性を維持していた。
加えて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイを用いて、１２９対立遺伝子とＢ６対立遺伝子の間の一塩基多型（ＳＮＶ）をアッセイした。図１２の１９番染色体地図上におけるＳＮＶアッセイのおおよその位置は、アッセイの数字を下部に有する矢じりで示しており、Ｌｒｐ５遺伝子座からのそれらの距離（Ｍｂ）については以下に示す。Ｌｒｐ５遺伝子座からの距離（Ｍｂ）は、以下、Ｌｒｐ５の０．３２セントロメア側（Ｃ２）、Ｌｒｐ５の１．２テロメア側（Ｔ３）、Ｌｒｐ５の１１．１テロメア側（Ｔ６）、Ｌｒｐ５の１３．２テロメア側（Ｔ７）、Ｌｒｐ５の１７．５テロメア側（Ｔ８）、Ｌｒｐ５の２５．８テロメア側（Ｔ９）、Ｌｒｐ５の３３．０テロメア側（Ｔ１０）、Ｌｒｐ５の３８．３テロメア側（Ｔ１１）、Ｌｒｐ５の４９．６テロメア側（Ｔ１３）、及びＬｒｐ５の５７．２テロメア側（Ｔ１４）、のとおりである。１２９特異的プローブ及びＢ６特異的プローブならびにプライマーペアについては、表１に示している。ＳＶアッセイによりテロメアのヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を示した３つのクローン（ＢＣ－Ｈ９、ＢＯ－Ａ８及びＢＲ－Ｂ４）の結果については、図１６Ａ～図１６Ｃに示している。ＳＮＶアッセイ（図１６Ａ～図１６Ｃ、データは省略）では、Ｌｒｐ５のテロメア側に１９番染色体の長腕にわたる遺伝子変換事象（ＳＮＶ １．２及びＳＮＶ ５７．２；それぞれ図１６Ｂ及び図１６Ｃを参照のこと）を確認したが、ＳＮＶ ０．３２アッセイ（図１６Ａを参照のこと）は、全てのクローンがセントロメア側にＬｒｐ５から３２０ｋｂ離れた対立遺伝子におけるヘテロ接合性を維持していたことを示した。アッセイした２４のＬｒｐ５Ｈｕｍ／ＨｕｍまたはＬｒｐ５Δ／Δクローンのうち、本発明者らは、Ｌｒｐ５のテロメア側に１９番染色体の全長腕にわたるヘテロ接合性の喪失のエビデンスを有していた６つを発見した。クローンのうちの５つ（４つのＬｒｐ５Ｈｕｍ／Ｈｕｍ及び１つのＬｒｐ５Δ／Δ）がヘテロ接合性からホモ接合性Ｂ６に変換された一方で、６番目のクローン（Ｌｒｐ５Ｈｕｍ／Ｈｕｍ）はホモ接合性１２９に変換された。ＣＣＮアッセイは、１９番染色体の２つのコピーの保持を示した。２１のＨｃホモ接合性クローンに対する同様のヘテロ接合性の喪失アッセイにより、２つ、Ｒ－Ｅ２（ＨｃＨｕｍ／Ｈｕｍ、ｇＲＮＡ Ａ ＋ Ｆ）及びＲ－Ｅ８（ＨｃΔ／Δ、ｇＲＮＡ Ａ ＋ Ｆ）が、セントロメア側に全ての対立遺伝子のヘテロ接合性を維持しつつ、Ｈｃ遺伝子のテロメア側に全てのＳＶ及びＳＮＶのホモ接合性１２９に対するヘテロ接合性の喪失を示すことが明らかとなった。ＣＣＮアッセイは、２番染色体の喪失がないことを示した。
本発明者らの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が１００ｋｂ超の大きな単一工程ヒト化の相同組換え修復を改善可能であることを初めて示しており、それにより、大規模なゲノム改変の可能性が広がる。ＬＴＶＥＣとｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を組み合わせることによる最も注目に値し予想外な効果は、ホモ接合性標的ヒト化を促進させるそれらの機能であった。二対立遺伝子変異及びホモ接合性標的化事象がその他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実験で報告されているが、これらの遺伝子改変及び挿入のほとんどは、本発明者らのヒト化対立遺伝子と比較して数桁小さい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用前において、本発明者らは、ＬＴＶＥＣによるホモ接合性標的化を発見していなかったし、別々の遺伝子を標的とする複数のＬＴＶＥＣを組み合わせた際の２つ以上の遺伝子の同時標的化も確認していなかった。この知見を考慮すると、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９誘導ホモ接合性標的化は、両方の対立遺伝子を別々に標的とする２つのＬＴＶＥＣではなく、一方の対立遺伝子上における最初の標的化事象が１つまたは複数のＣａｓ９切断が促進するもう一方の対立遺伝子の相同変換のためのテンプレートとして機能し得るということを示唆した。デュアルｇＲＮＡ／Ｃａｓ９が誘導する大きな二対立遺伝子欠失もホモ接合性であるという意外な新事実（表１９）は、遺伝子変換機構の更なる裏付けを提供した。
ヘテロ接合性の喪失アッセイ（図１２）は、標的遺伝子のテロメア側の染色体の大きなフラグメントを変換する複数の対立遺伝子の大規模な遺伝子変換がホモ接合性ヒト化及び大きな欠失の一部に影響を及ぼすことを示した。このタイプの広範囲指向性遺伝子変換は、細胞周期のＧ２期における相同染色体の複製染色分体間の有糸分裂組換えと一致する（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２５７－２５８）（図１７Ａ～図１７Ｃ）。ホモ接合性事象のごく少数を説明するに過ぎないが、この機構は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９開裂を使用して染色体の大きな部分にわたる複数の対立遺伝子をヘテロ接合性からホモ接合性へと大規模に変換させることを促進可能とするための手段を提供することができた。しかしながら、ホモ接合性事象のほとんどは、その機構が更なる研究に値する局所的な遺伝子変換の結果であるものと思われる。
広範囲指向性遺伝子変換の更なるエビデンスは、Ｆ１Ｈ４ハイブリッドＥＳ細胞（５０％ １２９ＳｖＳ６株及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）に、Ｌｒｐ５ ｇＲＮＡ Ａ及びＦをコードするプラスミド、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、及びＬｒｐ５からテロメア方向に３０Ｍｂ離れたＣｈ２５ｈ遺伝子を標的とするＬＴＶＥＣをエレクトロポレーションした後に得られた３つのクローンを解析することによりもたらされた。２つのｇＲＮＡ（５´末端に５００ｂｐ離れたｇＲＮＡ、及び３´末端に２ｋｂ離れたｇＲＮＡ）の間の想定欠失内におけるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを使用した一次スクリーニング後に、３つのクローンは最初に野生型とスコアリングされたが、１２９対立遺伝子とＢ６対立遺伝子の間の一塩基多型（ＳＮＶ）をアッセイする続くＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイでは驚くべきことに、ヘテロ接合性の喪失が明らかとなった。使用したＳＮＶアッセイは、１つのセントロメアアッセイ（ＳＮＶ ０．３２）及び２つのテロメアアッセイ（ＳＮＶ １．２及びＳＮＶ ５７．２）であった（図１２を参照のこと）。表２０に示すとおり、セントロメアＳＮＶアッセイ（０．３２Ｍｂ）により、３つのクローン全てにおけるヘテロ接合性の維持が確認された。しかしながら、両方のテロメアＳＮＶアッセイはＢＰ－Ｅ７及びＢＰ－Ｈ４が１２９対立遺伝子にホモ接合性であることを示し、両方のテロメアＳＮＶアッセイはＢＰ－Ｅ６がＢ６対立遺伝子にホモ接合性であることを示した。３つのクローン全ては１９番染色体の２つのコピーの保持を示し、３つのクローン全てはＬＴＶＥＣ標的化にトランスジェニックであった（すなわち、Ｃｈ２５ｈ遺伝子座が標的となった）。これらの結果は、標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９開裂を使用した人工ホモ接合性（ｆｏｒｃｅｄ ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）への可能性を開くものである。
Figure 2023078479000041
マウスＦ１Ｈ４ハイブリッドＥＳ細胞（５０％ １２９ＳｖＳ６株及び５０％ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ株からなる）を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ＬＴＶＥＣヒト化実験（図１８Ａ～図１８Ｆを参照のこと）で観察された結果について、いくつかの起こり得る機構で説明可能である。このような機構は、有糸分裂交差による（図１８Ａ～図１８Ｃを参照のこと）、または切断誘導複製による染色分体複製による（図１８Ｄ～図１８Ｅを参照のこと）、相互染色分体交換を介して生じ得る。いずれの例においても、ゲノム複製前に１２９染色体またはＢ６染色体のいずれか一方がＬＴＶＥＣの標的となるヘテロ接合性改変は生じ得る（図１８Ａ及び図１８Ｄを参照のこと）。代替的に、単一の１２９染色分体または単一のＢ６染色分体はゲノム複製後にＬＴＶＥＣの標的となり、続いて、染色分体間の遺伝子変換が生じ得る（図１８Ｂ及び図１８Ｅを参照のこと）。代替的に、標的ゲノム遺伝子座におけるＬＴＶＥＣ標的化はなくてもよいが、１２９染色体またはＢ６染色体のいずれかでＣａｓ９開裂が生じ得る（図１８Ｃ及び図１８Ｆを参照のこと）。ＢＰ－Ｅ７、ＢＰ－Ｈ４、及びＢＰ－Ｅ６クローンで観察された結果について、この後者の可能性で説明可能である。潜在的な結果については、図１８Ａ～図１８Ｆに示している。図１８Ｆでは、Ｃａｓ９が１２９染色分体を開裂させる場合、Ｂ６対立遺伝子を保持するヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を観察することも可能である。上記の実験では、両方の対立遺伝子が標的となること（Ｈｕｍ／Ｈｕｍ）または両方の対立遺伝子が野生型対立遺伝子となること（＋／＋）をもたらすヘテロ接合性の喪失事象が観察された。
実施例７．Ｂ６対立遺伝子と１２９対立遺伝子の間に最も少ない変異を有する遺伝子のホモ接合性標的化。
いくつかのその他の遺伝子座についてもホモ接合性標的化の試験を行った。別の実験では、ＬＴＶＥＣは、マウスＡｄａｍｔｓ５（ディスインテグリン、及びトロンボスポンジンモチーフ５を有するメタロプロテアーゼ）遺伝子の３８ｋｂの欠失を生成して、ヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の４３ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計された。ＬＴＶＥＣは、欠失させることを目的としたマウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子の３８ｋｂ配列に隣接するマウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子座の一部に由来する２２ｋｂ及び４６ｋｂのゲノムＤＮＡを含有するホモロジーアームに隣接する４３ｋｂフラグメントのヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子を含んでいた。個々の実験では、本発明者らは、Ａｄａｍｔｓ５ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウスＡｄａｍｔｓ５遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び第２のプラスミドまたは８つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２及びｇＦ）のうちの１つまたは２つをコードするプラスミドと組み合わせた。ヒトＡＤＡＭＴＳ５の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｓｇＲＮＡを設計した。
Ａｄａｍｔｓ５遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化の結果については、表２１に示している。ＬＴＶＥＣ単独をＥＳ細胞に導入した際、本発明者らは、９６のスクリーニング済み薬剤耐性クローンのどれも、正確に標的化された単一対立遺伝子ヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を保持していないことを発見した。それに対し、ＬＴＶＥＣを、８つの試験ｓｇＲＮＡのうちの２つ（Ｂ及びＦ、表１を参照のこと）によりガイドされるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、正確に標的化された単一対立遺伝子ヘテロ接合性変異または二対立遺伝子複合ヘテロ接合性変異が１．０％の効率で生成された。ホモ接合性標的改変は観察されなかった。別の実験では、ｇＲＮＡ Ａ２とｇＲＮＡ Ｅ２も組み合わせたが、ホモ接合性標的化は依然として観察されなかった。
Figure 2023078479000042
別の実験では、ＬＴＶＥＣは、マウスＤｐｐ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）遺伝子の７９ｋｂの欠失を生成して、相同ヒトＤＰＰ４遺伝子の８２ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計された。ＬＴＶＥＣは、欠失させることを目的としたマウスＤｐｐ４遺伝子の７９ｋｂ配列に隣接するマウスＤｐｐ４遺伝子座の一部に由来する４６ｋｂのゲノムＤＮＡをそれぞれ含有する５´及び３´ホモロジーアームに隣接する８２ｋｂフラグメントのヒトＤＰＰ４遺伝子を含んでいた。個々の実験では、本発明者らは、Ｄｐｐ４ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウスＤｐｐ４遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び第２のプラスミドまたは８つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＢ、ｇＢ２、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＥ２及びｇＦ）のうちの１つまたは２つをコードするプラスミドと組み合わせた。ヒトＤＰＰ４遺伝子の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｓｇＲＮＡを設計した。
Ｄｐｐ４遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化の結果については、表２２に示している。ＬＴＶＥＣ単独をＥＳ細胞に導入した際、本発明者らは、スクリーニング済み薬剤耐性クローンの２．１％が、正確に標的化された単一対立遺伝子ヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を保持していることを発見した。それに対し、ＬＴＶＥＣを、８つの試験ｓｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｅ２及びＦ、表１を参照のこと）のうちの任意の１つによりガイドされるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、正確に標的化された単一対立遺伝子ヘテロ接合性変異が２．１～７．３％の範囲の効率で生成された。ホモ接合性標的改変は観察されなかった。別の実験では、ｇＲＮＡ ＡとｇＲＮＡ Ｆ、またはｇＲＮＡ ＡとｇＲＮＡ Ｄを組み合わせたが、ホモ接合性標的化は依然として観察されなかった。
Figure 2023078479000043
Figure 2023078479000044
別の実験では、ＬＴＶＥＣは、マウスＦｏｌｈ１（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２）遺伝子の５５ｋｂの欠失を生成して、相同ヒトＦＯＬＨ１遺伝子の６１ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計された。ＬＴＶＥＣは、欠失させることを目的としたマウスＦｏｌｈ１遺伝子の５５ｋｂ配列に隣接するマウスＦｏｌｈ１遺伝子座の一部に由来する２２ｋｂ及び４６ｋｂのゲノムＤＮＡを含有するホモロジーアームに隣接する６１ｋｂフラグメントのヒトＦＯＬＨ１遺伝子を含んでいた。個々の実験では、本発明者らは、Ｆｏｌｈ１ヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウスＦｏｌｈ１遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び第２のプラスミドまたは８つのｓｇＲＮＡ（ｇＡ、ｇＡ２、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＦ、ｇＥ及びｇＥ２）のうちの１つまたは２つをコードするプラスミドと組み合わせた。ヒトＦＯＬＨ１遺伝子の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｓｇＲＮＡを設計した。
Ｆｏｌｈ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９補助型ヒト化の結果については、表２３に示している。ＬＴＶＥＣ単独をＥＳ細胞に導入した際、本発明者らは、９６のスクリーニング済み薬剤耐性クローンのどれも、正確に標的化された単一対立遺伝子ヘテロ接合性ヒト化対立遺伝子を保持していないことを発見した。それに対し、ＬＴＶＥＣを、６つの試験ｓｇＲＮＡのうちの３つ（Ａ、Ｄ及びＥ２、表１を参照のこと）によりガイドされるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、正確に標的化された単一対立遺伝子ヘテロ接合性変異が１．０～３．１％の範囲の効率で生成された。ホモ接合性標的改変は観察されなかった。別の実験では、ｇＲＮＡ ＡとｇＲＮＡ Ｅ２、またはｇＲＮＡ ＡとｇＲＮＡ Ｄを組み合わせたが、ホモ接合性標的化は依然として観察されなかった。
Figure 2023078479000045
Figure 2023078479000046
異なる遺伝子座を標的とする際に観察されたホモ接合性標的クローンの要約については、表２４に提供している。
Figure 2023078479000047
Figure 2023078479000048
これらの実験では、ホモ接合性標的化は、Ｂ６対立遺伝子と１２９対立遺伝子の間に最も少ない配列変異を有する遺伝子で最も多かった。このことは図１９～図２５に示されている。それぞれの図における縦点線の内側の領域は、標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）を示している。例えば、Ｌｒｐ５（図１９を参照のこと）では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアームは、１２９ゲノムに基づいて設計された。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株と、この参照配列を比較した。縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。図２０～図２５はそれぞれ、Ｈｃ、Ｔｒｐａ１、Ａｄａｍｔｓ５、Ｆｏｌｈ１、Ｄｐｐ４、Ｒｏｒ１及びＣＤ３についての同様の解析を提供している。
表２４及び図１９～図２５に示すとおり、最も多い数のホモ接合性標的クローンは、Ｌｒｐ５遺伝子座（１２のホモ接合性クローン）及びＨｃ／Ｃ５遺伝子座（４つのホモ接合性クローン）において生成された。特に、ｇＲＮＡ認識配列もしくはその近傍または欠失及び置換させることを目的とした領域の前後において、これら標的ゲノム遺伝子座のそれぞれが有する一塩基多型は極めて少なかった（図１９（Ｌｒｐ５）及び図２０（Ｃ５）を参照のこと）。
それに対し、ホモ接合性標的化は、特に、ｇＲＮＡ認識配列もしくはその近傍または欠失及び置換させることを目的とした領域の前後において、Ｂ６対立遺伝子と１２９対立遺伝子の間に高密度の対立遺伝子配列変異を有する遺伝子で少ないまたは不在であった。例えば、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、Ｆｏｌｈ１遺伝子座、Ｄｐｐ４遺伝子座またはＲｏｒ１遺伝子座を標的とする際に、ホモ接合性クローンは生成されなかった（それぞれ図２２～図２５を参照のこと）。しかしながら、欠失及び置換させることを目的とした領域の高密度の対立遺伝子配列変異３´を有するが欠失及び置換させることを目的とした領域の低密度の対立遺伝子配列変異５´を有するＴｒｐａ１遺伝子座を標的とする際に、ホモ接合性クローンは生成された（すなわち、５´ｇＲＮＡ認識配列またはその近傍に）（図２１）。
実施例８．相同染色体対がホモ接合性標的化を増加させないそれぞれの染色体に対して設計された標的化ベクターの使用。
相同染色体対内のそれぞれの染色体上における独立した標的化事象により、または、相同染色体対内の一方の染色体上における標的化事象に続く相同染色体対間で同等の遺伝子変換またはヘテロ接合性の喪失により、ホモ接合性標的改変が生成されたかどうかを更に試験するために、ｇＲＮＡ認識配列もしくはその近傍または欠失及び置換させることを目的とした領域の前後において相同染色体対間に大量の対立遺伝子配列変異を有する別のゲノム遺伝子座を標的とした。例えば、図２６を参照されたい。このことは、ホモ接合性崩壊またはホモ接合性標的化に対する対立遺伝子変異の影響を本発明者らが確認することを可能とした。縦点線の内側の領域は標的領域（ＬＴＶＥＣの５´標的配列及び３´標的配列の内側の領域）である。一塩基多型を同定するための参照配列を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統のゲノム配列とした。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統ＭＰ変異体、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統ＲＧＣ変異体、ならびに、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖ系統及びＣ５７ＢＬ／６Ｎ系統から作製したＶＧＦ１ハイブリッド細胞株（図下部の３行に記載）と、この参照配列を比較した。３行のそれぞれにおける縦線は、参照配列と比較した一塩基多型を示している。
この実験では、２つのＬＴＶＥＣを、マウス遺伝子座の３３ｋｂの欠失を生成して、ヒトセグメント間にマウス遺伝子座の介在セグメントを有するオルソロガスヒト遺伝子の３つのセグメント（６．８ｋｂ、０．１ｋｂ及び１．７ｋｂ）を含む３４．５ｋｂのフラグメントへと同時に置換するように設計した。実験は、ＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４）、本発明者らのＣ５７ＢＬ６ＮＴａｃ／１２９Ｓ６ＳｖＥｖＦ１ハイブリッドＸＹ ＥＳ細胞株を用いて実施した（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１－９９；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２－６５９）。上記のとおりにＥＳ細胞を培養した（Ｍａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｎ Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．１００－１３２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交配してＣ５７ＢＬ６（ＸＢ６）／１２９Ｓ６（Ｙ１２９）マウスを作製することにより、ＶＧＦ１細胞を作製した。図７を参照されたい。
一方のＬＴＶＥＣはＶＧＦ１細胞内の１２９染色体に対して設計されＮｅｏ選択カセット（ＭＡＩＤ ＃ ７１７０）を含むホモロジーアームを有し、もう一方のＬＴＶＥＣはＣ５７ＢＬ６染色体に対して設計されＨｙｇ選択カセット（ＭＡＩＤ ＃ ７３１４）を含むホモロジーアームを有していた。２つのＬＴＶＥＣは別の場合同一であった。
個々の実験では、本発明者らは、２つのヒト化ＬＴＶＥＣを、欠失の標的となるマウス遺伝子の領域内の二本鎖切断を生成するように設計された、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及び第２のプラスミドまたは４つのｓｇＲＮＡ（ｍＧＵ、ｍＧＵ２、ｍＧＤ、ｍＧＤ２）をコードするプラスミドと組み合わせた。ヒト遺伝子の挿入部位内の任意の配列の認識を回避するようにｓｇＲＮＡを設計した。
合計、１９２のＮｅｏ＋クローン、１２８のＨｙｇ＋クローン、及び１６のＮｅｏ＋／Ｈｙｇ＋クローンをスクリーニングした。ＬＴＶＥＣと、４つのｓｇＲＮＡによりガイドされるＣａｓ９エンドヌクレアーゼと組み合わせることにより、一部ヘテロ接合性標的クローン、ヘミ接合性標的クローン、二対立遺伝子崩壊クローン、ＮＨＥＪ欠失を有するヘテロ接合性標的クローン、二対立遺伝子ＮＨＥＪ欠失を有するクローン、及びをＮＨＥＪ欠失有するヘテロ接合性崩壊クローン、を生成した。しかしながら、ホモ接合性標的クローンは観察されなかった。このことは、相同染色体対内のそれぞれの染色体上における独立した標的化事象ではなく、局所的な遺伝子変換事象が、その他の実験で観察されたホモ接合性標的クローンに影響を及ぼすことを示唆している。相同染色体対内のそれぞれの染色体上における独立した標的化事象が、その他の実験で観察されたホモ接合性標的クローンに影響を及ぼす場合、相同染色体対内の２つの染色体のそれぞれのために特に調整された２つの標的化ベクターを使用すると、染色体のそれぞれのために調整された標的化ベクターが５´及び３´標的配列内の対立遺伝子配列変異に向かうために、５´及び３´ホモロジーアームの５´及び３´標的配列内の高いパーセンテージの対立遺伝子配列変異にもかかわらずホモ接合性標的クローンを生成することが予想された。しかしながら、２つのＬＴＶＥＣを使用しても、ホモ接合性標的クローンは一切生成されなかった。このことは、図２７に示すようなホモ接合性標的改変の考えまたは局所的な遺伝子変換事象により生成された考えを更に裏付けるものである。本発明者らは、極性遺伝子変換よりも高い比率で標的欠失及び挿入の両側に局所的なヘテロ接合性の喪失を観察した。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製することであって、
（ｉ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（Ｉ）Ｃａｓ９タンパク質と、
（ＩＩ）標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記目的の外来抗原と相同であるまたは前記目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む、前記第１のガイドＲＮＡと、
（ＩＩＩ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと、
を導入することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を産生し、前記自己抗原の発現は排除される、前記導入することと、
（ｉｉ）前記改変非ヒト動物１細胞期胚または前記改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変される、前記作製することと、
を含む、前記作製することと、
（ｂ）工程（ａ）で作製した前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化することと、
（ｃ）前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を、前記目的の外来抗原に対する免疫応答を開始するのに十分な条件下に維持することと、
を含み、
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物は、前記目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質を産生する、
前記方法。
(項目２)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、工程（ａ）（ｉｉ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、
（Ｉ）前記改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入することと、
（ＩＩ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することと、
を含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目２に記載の方法。
(項目４)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ａ）（ｉｉ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、前記改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含む、項目１に記載の方法。
(項目５)
前記免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から単離したＢ細胞からハイブリドーマを作製することを更に含む、項目１から項目４のいずれか１項に記載の方法。
(項目６)
前記免疫化した遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物から、前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする第１の核酸配列、及び／または、前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質のうちの１つにおける免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２の核酸配列を得ることを更に含む、項目１から項目５のいずれか１項に記載の方法。
(項目７)
前記第１の核酸配列及び／または前記第２の核酸配列は、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物のリンパ球から、または、前記リンパ球から作製したハイブリドーマから得られる、項目６に記載の方法。
(項目８)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、前記第１の核酸配列はヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードし、前記第２の核酸配列はヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする、項目６または項目７に記載の方法。
(項目９)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質は、前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より高い力価を有する、項目１から項目８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０)
前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、前記目的の外来抗原に対する抗原結合タンパク質のより多様なレパートリーは、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物により産生される、項目１から項目９のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質は、前記標的ゲノム遺伝子座において野生型である対照非ヒト動物を前記目的の外来抗原で免疫化した後の前記対照非ヒト動物が産生した抗原結合タンパク質と比較して、より多様性が大きい重鎖Ｖ遺伝子セグメント及び／または軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを使用する、項目１から項目１０のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２)
前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物が産生した前記目的の外来抗原に対する前記抗原結合タンパク質の一部は、前記自己抗原と交差反応する、項目１から項目１１のいずれか１項に記載の方法。
(項目１３)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記標的ゲノム遺伝子座内における前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´であり、
工程（ａ）（ｉ）は、保持アッセイを実施して、５´領域及び前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内における及び／または３´領域及び前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内におけるコピー数が、２であることを確認することを更に含む、
項目１から項目１２のいずれか１項に記載の方法。
(項目１４)
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原のオルソログである、項目１から項目１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１５)
前記目的の外来抗原は、ヒトタンパク質の全てまたは一部を含む、項目１から項目１４のいずれか１項に記載の方法。
(項目１６)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、または、１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む、項目１から項目１５のいずれか１項に記載の方法。
(項目１７)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含む、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記欠失は、ランダムな挿入及び欠失（インデル）を伴わない正確な欠失である、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目１から項目１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目２０)
前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目１から項目１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目２１)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、約０．１ｋｂ～約２００ｋｂの二対立遺伝子欠失を含む、項目１から項目２０のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含む、項目１から項目２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含む、項目１から項目２２のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４)
前記導入工程（ａ）（ｉ）は、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト動物１細胞期胚に、
（ｉｖ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第３のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第３のガイドＲＮＡ、及び／または、
（ｖ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第４のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第４のガイドＲＮＡ、
を導入することを更に含む、項目１から項目２３のいずれか１項に記載の方法。
(項目２５)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、ＤＮＡの形態で前記非ヒト動物の多能性幹細胞に導入される、項目１から項目２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２６)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションにより前記非ヒト動物の多能性幹細胞に導入される、項目１から項目２５のいずれか１項に記載の方法。
(項目２７)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡはそれぞれ、ＲＮＡの形態で前記非ヒト動物１細胞期胚に導入される、項目１から項目２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２８)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、前記Ｃａｓ９タンパク質、前記第１のガイドＲＮＡ及び前記第２のガイドＲＮＡは、前核注入または細胞質注入により前記非ヒト動物１細胞期胚に導入される、項目１から項目２４及び項目２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２９)
外来修復テンプレートは、工程（ａ）（ｉ）で導入されない、項目１から項目２８のいずれか１項に記載の方法。
(項目３０)
前記導入工程（ａ）（ｉ）は、工程（ａ）（ｉ）の前記細胞が前記非ヒト動物１細胞期胚であり、前記外来修復テンプレートの長さが約５ｋｂ以下である場合、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト動物１細胞期胚に、前記標的ゲノム遺伝子座における５´標的配列にハイブリダイズする５´ホモロジーアーム、及び前記標的ゲノム遺伝子座における３´標的配列にハイブリダイズする３´ホモロジーアームを含む外来修復テンプレートを導入することを更に含む、項目１から項目２８のいずれか１項に記載の方法。
(項目３１)
前記外来修復テンプレートは、前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを更に含む、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記核酸インサートは、前記標的ゲノム遺伝子座に対して相同またはオルソロガスである、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
前記外来修復テンプレートは、約５０ヌクレオチド長～約１ｋｂ長である、項目３０から項目３２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３４)
前記外来修復テンプレートは、約８０ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長である、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記外来修復テンプレートは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、項目３０から項目３４のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６)
工程（ａ）（ｉ）の前記細胞は前記非ヒト動物多能性細胞であり、
（ａ）前記外来修復テンプレートは、少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である、または、
（ｂ）前記外来修復テンプレートはＬＴＶＥＣであり、前記ＬＴＶＥＣの前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームの総合計は少なくとも１０ｋｂ長である、
項目３０から項目３２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７)
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、
前記欠失核酸配列は、前記５´標的配列と前記３´標的配列の間の前記核酸配列からなる、
項目３０から項目３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目３８)
前記外来修復テンプレートは、前記５´ホモロジーアームと前記３´ホモロジーアームに隣接する核酸インサートを含み、
前記核酸インサートは、前記欠失核酸配列に対して相同またはオルソロガスであり、
前記標的ゲノム遺伝子座は、改変されて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含み、
前記核酸インサートは前記欠失核酸配列を置換する、
項目３０から項目３７のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９)
前記非ヒト動物はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む、項目１から項目３８のいずれか１項に記載の方法。
(項目４０)
前記非ヒト動物はげっ歯類である、項目１から項目３９のいずれか１項に記載の方法。
(項目４１)
前記げっ歯類はマウスである、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
前記マウス系統はＢＡＬＢ／ｃ系統を含む、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
前記マウス系統は、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含む、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記マウス系統は、５０％ ＢＡＬＢ／ｃ、２５％ Ｃ５７ＢＬ／６、及び２５％ １２９である、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記マウスのＭＨＣハプロタイプはＭＨＣｂ／ｄである、項目４１から項目４４のいずれか１項に記載の方法。
(項目４６)
前記マウスは、内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に挿入されたヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含む、項目４１から項目４５のいずれか１項に記載の方法。
(項目４７)
前記ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントは重鎖遺伝子セグメントであり、前記マウス免疫グロブリン遺伝子座は重鎖遺伝子座であり、及び／または、前記ヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントはカッパまたはラムダ軽鎖セグメントであり、前記マウス免疫グロブリン遺伝子座は軽鎖遺伝子座である、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記マウスはマウス定常領域遺伝子と機能的に連結したヒト非再構成可変領域遺伝子セグメントをその生殖細胞系内に含み、前記マウスはヒト定常領域遺伝子を欠き、前記マウス定常領域遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、項目４６または項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記マウスは、
（ａ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座であって、
前記ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、前記ハイブリッド重鎖遺伝子座と、
（ｂ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座であって、
前記ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する、前記ハイブリッド軽鎖遺伝子座と、
を含み、
（ａ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、前記マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない、
項目４６から項目４８のいずれか１項に記載の方法。
(項目５０)
前記マウスは、マウス軽鎖定常領域と機能的に連結した１つ以下または２つ以下の再構成ヒト軽鎖Ｖ／Ｊ配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座をその生殖細胞系内に含み、前記マウスは、マウス重鎖定常領域遺伝子と機能的に連結した少なくとも１つの非再構成ヒトＶセグメント、少なくとも１つの非再構成ヒトＤセグメント、及び少なくとも１つの非再構成ヒトＪセグメントを含むヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を更に含む、項目４１から項目４８のいずれか１項に記載の方法。
(項目５１)
前記マウスは、ヒト化重鎖免疫グロブリン可変遺伝子座及びヒト化軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を含み、前記マウスは単一軽鎖を発現する、項目５０に記載の方法。
(項目５２)
前記マウスは、
（ａ）免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードする単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）であって、
前記単一再構成ヒトＶＬ／ＪＬ領域は、ヒトＶκ１－３９／Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３－２０／Ｊκ１遺伝子セグメントから選択される、前記単一再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）と、
（ｂ）内在重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントへの置換であって、
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは内在重鎖定常（ＣＨ）領域遺伝子と機能的に連結し、前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記置換と、
を含む、項目５１に記載の方法。
(項目５３)
前記マウスは抗体の集団を発現し、前記マウスの生殖細胞系は、再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子である単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子のみを含み、
前記マウスは、１つのコピーのみを含有するという点で前記単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にヘテロ接合性であるか、または、２つのコピーを含有するという点で前記単一免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域遺伝子にホモ接合性であるかのいずれかであり、前記マウスは、
（ｉ）前記集団のそれぞれの免疫グロブリンカッパ軽鎖は、前記再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子またはその体細胞変異体によりコードされる軽鎖可変ドメインを含み、
（ｉｉ）前記集団は、その軽鎖可変ドメインが前記再構成ヒト生殖細胞系カッパ軽鎖可変領域遺伝子によりコードされる前記免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体、及び、その軽鎖可変ドメインが前記その体細胞変異体によりコードされる前記免疫グロブリンカッパ軽鎖を含む抗体を含み、
（ｉｉｉ）前記マウスは、前記免疫グロブリンカッパ軽鎖と成功裏にペアとなり前記集団の前記抗体を形成する体細胞変異高親和性重鎖の多様な集団を産生する、
ために、
活性な親和性成熟を特徴とする、項目５１に記載の方法。
(項目５４)
前記マウスは、その生殖細胞系内において、
（ａ）
（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列であって、
前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列と、
（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列であって、
前記再構成Ｖκ／Ｊκ配列は前記内在マウスκ定常領域と機能的に連結する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列と、
を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に、
（ｂ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入であって、
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記挿入に、
ヘテロ接合性またはホモ接合性である、項目５１に記載の方法。
(項目５５)
前記マウスは免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含み、前記改変は内在ＡＤＡＭ６機能を抑制または排除し、
前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列を含み、前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能しており、
前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする前記異所性核酸配列は、前記ヒト重鎖可変領域遺伝子座に存在する、
項目４６から項目５４のいずれか１項に記載の方法。
(項目５６)
前記非ヒト動物は少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、前記マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含み、それにより前記自己抗原の発現は排除される、
項目１から項目５５のいずれか１項に記載の方法。
(項目５７)
前記非ヒト動物は少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するマウスであり、前記マウスはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含み、
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原に対してオルソロガスなヒトタンパク質の全てまたは一部であり、
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含み、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含み、それにより前記自己抗原の発現は排除される、
項目１から項目５５のいずれか１項に記載の方法。
(項目５８)
前記マウスは、
（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列であって、
前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能している、前記異所性核酸配列と、
（ｂ）ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド重鎖遺伝子座であって、
前記ヒト重鎖免疫グロブリンＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子と機能的に連結し、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子は内在マウス免疫グロブリン遺伝子座に存在する、前記ハイブリッド重鎖遺伝子座と、
（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの挿入を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座であって、
前記ヒトＶ及びＪ遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列と機能的に連結する、前記ハイブリッド軽鎖遺伝子座と、
を含み、
（ｂ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド重鎖配列を形成し、（ｃ）は再構成されて、マウス定常領域と機能的に連結したヒト可変領域を含むハイブリッド軽鎖配列を形成し、前記マウスは、ヒト可変領域及びヒト定常領域を含む抗体を形成することができない、
項目５６または項目５７に記載の方法。
(項目５９)
前記マウスは、その生殖細胞系内において、
（ａ）マウスＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントをコードする異所性核酸配列であって、
前記ＡＤＡＭ６タンパク質、そのオルソログ、その相同体、またはそのフラグメントは、雄マウスにおいて機能している、前記異所性核酸配列に、
（ｂ）
（ｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列であって、
前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列は配列番号：１４８または配列番号：１４９内に存在する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｖκ配列と、
（ｉｉ）単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列であって、
前記再構成Ｖκ／Ｊκ配列は前記内在マウスκ定常領域と機能的に連結する、前記単一ヒト生殖細胞系Ｊκ配列と、
を含む再構成Ｖκ／Ｊκ配列の内在マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における挿入に、
（ｃ）複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの内在マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座における挿入であって、
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは内在マウス免疫グロブリン重鎖定常領域と機能的に連結し、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成ヒト／マウスキメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を再構成及び形成することができる、前記挿入に、
ヘテロ接合性またはホモ接合性である、項目５６または項目５７に記載の方法。
(項目６０)
項目１から項目５９のいずれか１項に記載の方法であって、前記非ヒト動物多能性細胞はハイブリッド細胞であり、または、前記非ヒト哺乳動物１細胞期胚はハイブリッド１細胞期胚であり、前記方法は、
（ａ’）前記標的ゲノム遺伝子座内の対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペアの前記配列を比較して、前記標的ゲノム遺伝子座内の標的領域を選択した後に、前記標的ゲノム遺伝子座の残部の全てまたは一部と比較して、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する前記標的領域に基づいて前記接触工程（ａ）を実施すること、を更に含み、前記標的領域は、
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列、及び、前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、及び／または、
前記第２のガイドＲＮＡ認識配列、及び、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´側、３´側または両側上にある少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂの隣接配列、
を含む、前記方法。
(項目６１)
前記標的領域は、前記標的ゲノム遺伝子座の残部と比較して、対応する第１と第２の前記ペア間のより高いパーセンテージの配列同一性を有する、項目６０に記載の方法。
(項目６２)
前記標的領域は、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間の少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、前記標的ゲノム遺伝子座の残部は、対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア間の９９．８％以下の配列同一性を有する、項目６１に記載の方法。
(項目６３)
目的の外来抗原に対する寛容が抑制された遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚にまたは１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質と、
（ｉｉ）標的ゲノム遺伝子座内の第１のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第１のガイドＲＮＡであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記目的の外来抗原と相同であるまたは前記目的の外来抗原と目的のエピトープを共有する自己抗原をコードする遺伝子の全てまたは一部を含む、前記第１のガイドＲＮＡと、
（ｉｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと、
を導入することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、対応する第１の染色体と第２の染色体のペア内で改変されて、改変非ヒト動物１細胞期胚、または二対立遺伝子改変を有する改変非ヒト動物多能性細胞を産生し、前記自己抗原の発現は排除される、前記導入することと、
（ｂ）前記改変非ヒト動物１細胞期胚または前記改変非ヒト動物多能性細胞から遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することであって、
前記標的ゲノム遺伝子座は、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物内における対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変される、前記作製することと、
を含む、前記方法。
(項目６４)
工程（ａ）の前記細胞は前記非ヒト動物の多能性幹細胞であり、工程（ｂ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、
（Ｉ）前記改変非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入することと、
（ＩＩ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することと、
を含む、項目６３に記載の方法。
(項目６５)
前記多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目６４に記載の方法。
(項目６６)
工程（ａ）の前記細胞は前記非ヒト動物１細胞期胚であり、工程（ｂ）における前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物の前記作製は、前記改変非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記自己抗原の発現が排除されるように、前記標的ゲノム遺伝子座が対応する第１の染色体と第２の染色体の前記ペア内で改変された前記遺伝子組換えＦ０世代非ヒト動物を作製することを含む、項目６３に記載の方法。
(項目６７)
前記目的の外来抗原は、前記自己抗原のオルソログである、項目６３から項目６６のいずれか１項に記載の方法。
(項目６８)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内であり、前記第２のガイドＲＮＡ認識配列は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の終止コドンを含むか、または、前記終止コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目６３から項目６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目６９)
前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列は異なり、前記第１と第２のガイドＲＮＡ認識配列のそれぞれは、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンを含むか、または、前記開始コドンの約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１，０００ヌクレオチド以内である、項目６３から項目６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目７０)
前記第１のガイドＲＮＡ認識配列は、前記標的ゲノム遺伝子座内における前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の５´であり、
工程（ａ）（ｉ）は、保持アッセイを実施して、５´領域及び前記第１のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内における及び／または３´領域及び前記第２のガイドＲＮＡ認識配列の約１ｋｂ内におけるコピー数が、２であることを確認することを更に含む、
項目６３から項目６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目７１)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の全てまたは一部の二対立遺伝子欠失を含む、項目６３から項目７０のいずれか１項に記載の方法。
(項目７２)
前記改変は、前記自己抗原をコードする前記遺伝子の開始コドンの二対立遺伝子破壊を含む、項目６３から項目７１のいずれか１項に記載の方法。
(項目７３)
前記非ヒト動物はマウスである、項目６３から項目７２のいずれか１項に記載の方法。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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