KR20190019931A - 다중 가이드 RNAs를 이용한 면역학적 내성 파괴 방법 - Google Patents

다중 가이드 RNAs를 이용한 면역학적 내성 파괴 방법 Download PDF

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Abstract

관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 비-인간 동물 그리고 그와 같은 동물을 사용하여 관심의 그 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 제조 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 방법 및 조성물은 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 또는 관심의 외래 항원과 공유되는 자가-항원에서 에피토프의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 다중 가이드 RNAs를 사용하는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한다.

Description

다수의 가이드 RNA를 사용하여 면역학적 내성을 파괴하는 방법
EFS 웹을 통한 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참조
파일 497023SEQLIST.txt로서 기록된 서열 목록은 38.3 킬로바이트이고, 2017년 5월 18일 창작되었고, 참고로 이로써 편입된다.
"비-자가" 단백질을 가진 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 마우스 또는 랫트)의 면역화는 특정 항원-결합 단백질 예컨대 단클론성 항체를 수득하기 위해 통상적으로 사용된 방법이다. 이러한 접근법은, 하지만, 비-인간 동물내 원상태 단백질과 면역원을 비-자가 (즉, 외래)로서 인식하도록 비-인간 동물의 면역 시스템을 가능하게 하기 위해 면역화되는 단백질 사이 서열에서 발산에 의존적이다. 자가-항원을 가진 고도의 상동성을 갖는 항원에 대한 항체의 생성은 면역학적 내성으로 인해 어려운 과제일 수 있다. 단백질의 기능적으로 중요한 영역이 종을 거쳐 보존되는 경향이 있기 때문에, 자가-항원에 면역학적 내성은 이들 핵심 에피토프에 항체의 생성에 종종 도전한다.
다양한 게놈 유전자좌 표적화에서 진전되어 왔어도, 종래의 표적화 전략으로 효율적으로 달성될 수 없는 게놈 변형 또는 효율적으로 표적화될 수 없는 많은 게놈 유전자좌가 여전히 남아있다. CRISPR/Cas 시스템은 게놈 편집용 신규한 도구를 제공하고 있지만, 어려움은 여전히 남아있다. 예를 들어, 어려움은 큰 표적화된 게놈 결실 또는 다른 큰 표적화된 유전적 변형을, 특히 진핵 세포 및 유기체에서 창출을 시도하는 경우 일부 상황에서 여전히 발생할 수 있다.
게다가, 후속적인 교배 단계 없이 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 세포 또는 동물을 효율적으로 생산하는 것은 어려울 수 있고, 일부 유전자좌는 동형접합성 표적화된 변형을 생성하기 위해 다른 것보다 표적화하기 더욱 어려울 수 있다. 예를 들어, 큰 표적화된 게놈 결실에 이형접합성 F0 세대 마우스가 때때로 종래의 표적화 전략을 통해 수득될 수 있어도, 이들 이형접합성 마우스의 후속적인 교배는 결실에 동형접합성인 F1 세대 마우스를 생산하도록 요구된다. 이들 추가의 교배 단계는 고비용이고 시간-소모성이다.
관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 비-인간 동물의 제조 그리고 관심의 외래 항원을 결합시키는 항원-결합 단백질을 생성하기 위한 그와 같은 동물의 이용 방법 및 조성물은 제공된다. 일 양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 비-인간 동물의 제조 방법을 제공한다: (a) 1-세포기 배아가 아닌 비-인간 동물 만능 세포의 게놈을 하기와 접촉시키는 단계: (i) Cas9 단백질: (ii) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 상기 제1 표적 게놈 유전자좌는 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제1 자가-항원의 발현에 영향을 준다; 및 (iii) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA; 상기 제1 표적 게놈 유전자좌는 이중대립유전자 변형을 가진 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 생산하기 위해 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되고, 여기서 제1 자가-항원의 발현은 감소된다; (b) 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (c) 제1 자가-항원의 발현이 감소되도록 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 제1 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 숙주 배아를 대리모에 이식시키는 단계. 임의로, 만능 세포는 배아 줄기 (ES) 세포이다. 임의로, 접촉은 뉴클레오펙션을 통해 비-인간 동물 만능 세포에 Cas9 단백질, 제1 가이드 RNA, 및 제2 가이드 RNA 도입을 포함한다. 임의로, Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA의 형태로 비-인간 동물 만능 세포에 도입되고, 제1 가이드 RNA는 제1 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 비-인간 동물 만능 세포에 도입되고, 제2 가이드 RNA는 제2 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 비-인간 동물 만능 세포에 도입된다.
그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 게놈을 하기와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다: (iv) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제3 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA; 및/또는 (v) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제4 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제4 가이드 RNA. 그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 게놈을 하기와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다: (iv) 제2 표적 게놈 유전자좌 이내 제3 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA, 상기 제2 표적 게놈 유전자좌는 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제1 자가-항원 또는 제2 자가-항원의 발현에 영향을 준다; 및/또는 (v) 제2 표적 게놈 유전자좌 이내 제4 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제4 가이드 RNA.
그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 그리고 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트와 게놈을 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 추가로 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 핵산 삽입물은 제1 표적 게놈 유전자좌에 상동성 또는 오쏘로그성이다. 그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 1 kb이다. 그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 80개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드이다. 그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드이다. 그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 길이 적어도 10 kb인 큰 표적화 벡터 (LTVEC)이고/이거나, 외인성 수복 템플레이트는 LTVEC이고, 여기서 LTVEC의 5' 및 3' 상동성 아암의 총계는 길이 적어도 10 kb이다.
그와 같은 일부 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (d) 단계 (c)에서 생산된 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 관심의 외래 항원으로 면역화시키는 단계; (e) 관심의 외래 항원에 면역 반응을 개시하는데 충분한 조건 하에서 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 유지시키는 단계; 및 (f) 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및/또는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 수득하는 단계.
그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 항원-결합 단백질보다 더 높은 역가를 갖는다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 더욱 다양한 레퍼토리는 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 항원-결합 단백질과 비교된 관심의 외래 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 자가-항원의 발현은 제거된다.
그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원은 제1 자가-항원의 오쏘로그이다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원은 인간 단백질의 전부 또는 일부를 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 표적 게놈 유전자좌는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 대체를 포함하도록 변형된다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 표적 게놈 유전자좌는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하도록 변형된다. 그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트와 게놈을 접촉하는 것을 포함하고, 단, 상기 게놈이 1-세포기 배아내이면 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 이하이고, 상기 외인성 수복 템플레이트는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 포함하고, 상기 핵산 삽입물은 결실된 핵산 서열에 상동성 또는 오쏘로그성이고, 상기 핵산 삽입물은 결실된 핵산 서열을 대체시킨다. 그와 같은 일부 방법에서, 결실은 랜덤 삽입 및 결실 (인델)이 없는 정확한 결실이다. 그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트와 게놈을 접촉시키는 것을 포함하고, 단, 상기 게놈이 1-세포기 배아내이면 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 이하이고, 상기 결실된 핵산 서열은 5' 및 3' 표적 서열 사이 핵산 서열로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 동형접합성 결실을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 코돈의 동형접합성 파괴를 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 제2 가이드 RNA 인식 서열은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하거나 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 임의로, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 개시 코돈을 포함하고, 제2 가이드 RNA 인식 서열은 정지 코돈을 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 제1 Cas9 절단 부위를 포함하고 제2 가이드 RNA 인식 서열은 제2 Cas9 절단 부위를 포함하고, 여기서 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 및 제2 Cas9 절단 부위 사이 결실을 포함하도록 변형된다. 임의로, 결실은 정확한 결실이고, 여기서 결실된 핵산 서열은 제1 및 제2 Cas9 절단 부위 사이 핵산 서열로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 상이하고, 각각의 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 임의로, 각각의 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 개시 코돈을 포함한다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 유전적으로 변형된 비-인간 동물의 림프구로부터 또는 상기 림프구로부터 생산된 하이브리도마로부터 수득된다.
그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 그와 같은 일부 방법에서, 설치류는 마우스이다. 임의로, 마우스 균주는 BALB/c 균주를 포함한다. 임의로, 마우스 균주는 BALB/c, C57BL/6, 및 129 균주를 포함한다. 임의로, 마우스 균주는 50% BALB/c, 25% C57BL/6, 및 25% 129이다. 임의로, 마우스의 MHC 일배체형은 MHCb/d이다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에서 삽입된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함한다. 임의로, 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절은 중쇄 유전자 분절이고, 마우스 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 유전자좌이다. 임의로, 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절은 경쇄 분절이고, 마우스 면역글로불린 유전자좌는 경쇄 유전자좌이다. 임의로, 경쇄 유전자 분절은 인간 카파 또는 람다 경쇄 유전자 분절이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 마우스 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함하고, 상기 마우스는 인간 불변 영역 유전자가 부족하고, 상기 마우스 불변 영역 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (b) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 여기서 (a)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소시키고, 상기 마우스는 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 포함하는 이소성 핵산 서열을 포함하고, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 존재한다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 상동성, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌 이외의 정위에서 존재한다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 1 이하 또는 2 이하 재배열된 인간 경쇄 V/J 서열을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함한다. 임의로, 경쇄 불변 영역 유전자는 마우스 유전자이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 미재배열된 인간 V, 적어도 하나의 미재배열된 인간 D, 및 적어도 하나의 미재배열된 인간 J 분절을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 추가로 포함한다. 임의로, 중쇄 불변 영역 유전자는 마우스 유전자이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 인간화된 중쇄 면역글로불린 가변 유전자좌 및 인간화된 경쇄 면역글로불린 가변 유전자좌를 포함하고, 상기 마우스는 단일 경쇄를 발현시킨다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 인코딩하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL/JL), 상기 단일 재배열된 인간 VL/JL 영역은 인간 Vκ1-39/J 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20/J 유전자 분절로부터 선택되고; 그리고 (b) 내인성 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로의 대체, 상기 인간 VH 유전자 분절은 내인성 중쇄 불변 (CH) 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 VH 유전자 분절은 인간/마우스 키메라 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 항체의 모집단을 발현시키고, 마우스의 생식계열은 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자인 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자만을 포함하고, 상기 마우스는 단 하나의 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 이형접합성이거나, 2 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 동형접합성이고, 상기 마우스는 하기이도록 활성 친화도 성숙을 특징으로 하고 있다: (i) 모집단의 각각의 면역글로불린 카파 경쇄는 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해, 또는 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; (ii) 상기 모집단은 경쇄 가변 도메인이 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체 그리고 경쇄 가변 도메인이 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고; (iii) 상기 마우스는 모집단의 항체를 형성하기 위해 면역글로불린 카파 경쇄와 성공적으로 짝짓기하는 체세포적으로 돌연변이된 고 친화도 중쇄의 다양한 수집을 생성한다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (b) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소시키고, 상기 마우스는 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 포함하는 이소성 핵산 서열을 포함하고, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 존재한다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 상동성, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌 이외의 정위에서 존재한다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 게놈을 갖고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소 또는 제거하고, 상기 마우스는 비-인간 동물 ADAM6 단백질 또는 이의 오쏘로그 또는 동족체 또는 상응하는 ADAM6 단백질의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 마우스의 게놈은 하기를 포함한다: (a) ADAM6 유전자의 이소성 배치; 및 (b) 내인성 비-인간 동물 중쇄 유전자좌에 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어; 이로써 상기 마우스는 하기를 특징으로 한다: (i) 수정성임; 및 (ii) 항원으로 면역화되는 경우, 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 중쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 인간 VH, 하나 이상의 인간 DH, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절에 의해 인코딩된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 생성함, 상기 항체는 항원에 특이적 결합을 보여준다.
그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 상기 마우스는 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 관심의 외래 항원은 제1 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고, 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하고, 그리고 상기 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 동형접합성 결실을 포함하여, 그것에 의하여 제1-자가-항원의 발현은 제거된다. 임의로, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (c) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 상기 (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (c)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (c) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다.
그와 같은 일부 방법에서, 여기서 비-인간 동물은 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 상기 마우스는 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 관심의 외래 항원은 제1 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고, 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하고, 그리고 상기 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈의 동형접합성 파괴를 포함하여, 그것에 의하여 제1-자가-항원의 발현은 제거된다. 임의로, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (c) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 상기 (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (c)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (c) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다.
일부 방법에서, 비-인간 동물 만능 세포는 하이브리드 세포이고, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (a') 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 서열을 비교하는 단계, 그리고 제1 표적 게놈 유전자좌의 나머지의 전부 또는 일부에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는 표적 영역에 기반된 접촉 단계 (a)에 앞서 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역을 선택하는 단계. 임의로, 표적 영역은 제1 표적 게놈 유전자좌의 나머지에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는다. 임의로, 표적 영역은 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖고, 제1 표적 게놈 유전자좌의 나머지는 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 99.8% 이하 서열 동일성을 갖는다. 임의로, 표적 영역은 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체에서 동일하다. 임의로, 표적 영역은 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 연속 대립유전자 서열 동일성의 가장 긴 가능한 스트레치 이내이다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열, 그리고 제2 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는 상이한 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 상이한 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 2 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 분절은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않지만 제1 표적 게놈 유전자좌에서 각각의 상이한 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 영역 및 상기 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 영역 및 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 여기서 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 비-연속 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 비-연속 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 비-연속 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 비-연속 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 비-연속 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 비-연속 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 게놈 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 비-연속 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 비-연속 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 비-연속 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 비-연속 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 비-연속 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 비-연속 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열에 의해 측접된 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열을 포함하는 및 상기에 의해 측접된 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 표적 서열 및/또는 3' 표적 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')에서 표적 게놈 유전자좌는 5' 표적 서열 및 3' 표적 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 및 상기 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 및 상기 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 비-인간 동물의 제조 방법을 제공한다: (a) 비-인간 동물 1-세포기 배아의 게놈을 하기와 접촉시키는 단계: (i) Cas9 단백질; (ii) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 상기 제1 표적 게놈 유전자좌는 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제1 자가-항원의 발현에 영향을 준다; 및 (iii) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA; 상기 제1 표적 게놈 유전자좌는 이중대립유전자 변형을 생산하기 위해 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되고, 여기서 제1 자가-항원의 발현이 감소되는 상기 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아; 및 (b) 제1 자가-항원의 발현이 감소되도록 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 제1 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아를 대리모에 이식하는 단계. 임의로, 접촉은 뉴클레오펙션을 통해 비-인간 동물 1-세포기 배아에 Cas9 단백질, 제1 가이드 RNA, 및 제2 가이드 RNA를 도입하는 것을 포함한다. 임의로, Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA의 형태로 비-인간 동물 1-세포기 배아에 도입되고, 제1 가이드 RNA는 제1 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 비-인간 동물 1-세포기 배아에 도입되고, 제2 가이드 RNA는 제2 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 비-인간 동물 1-세포기 배아에 도입된다.
그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 게놈을 하기와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다: (iv) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제3 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA; 및/또는 (v) 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 제4 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제4 가이드 RNA. 그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 게놈을 하기와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다: (iv) 제2 표적 게놈 유전자좌 이내 제3 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA, 상기 제2 표적 게놈 유전자좌는 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제1 자가-항원 또는 제2 자가-항원의 발현에 영향을 준다; 및/또는 (v) 제2 표적 게놈 유전자좌 이내 제4 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제4 가이드 RNA.
그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트와 게놈을 접촉하는 것을 추가로 포함하고, 상기 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 5 kb이다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 추가로 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 핵산 삽입물은 제1 표적 게놈 유전자좌에 상동성 또는 오쏘로그성이다. 그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 1 kb이다. 그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 80개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드이다. 그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드이다.
그와 같은 일부 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (c) 관심의 외래 항원으로 단계 (b)에서 생산된 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 면역화시키는 단계; (d) 관심의 외래 항원에 면역 반응을 개시하는데 충분한 조건 하에서 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 유지시키는 단계; 및 (e) 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및/또는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 수득하는 단계.
그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 항원-결합 단백질보다 더 높은 역가를 갖는다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 더욱 다양한 레퍼토리는 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 항원-결합 단백질과 비교된 관심의 외래 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 자가-항원의 발현은 제거된다.
그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원은 제1 자가-항원의 오쏘로그이다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원은 인간 단백질의 전부 또는 일부를 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 표적 게놈 유전자좌는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 대체를 포함하도록 변형된다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 표적 게놈 유전자좌는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하도록 변형된다. 그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트와 게놈을 접촉하는 것을 포함하고, 단, 상기 게놈이 1-세포기 배아내이면 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 이하이고, 상기 외인성 수복 템플레이트는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 포함하고, 상기 핵산 삽입물은 결실된 핵산 서열에 상동성 또는 오쏘로그성이고, 상기 핵산 삽입물은 결실된 핵산 서열을 대체시킨다. 그와 같은 일부 방법에서, 결실은 랜덤 삽입 및 결실 (인델)이 없는 정확한 결실이다. 그와 같은 일부 방법에서, 접촉 단계 (a)는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 및 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트와 게놈을 접촉시키는 것을 포함하고, 단, 상기 게놈이 1-세포기 배아내이면 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 이하이고, 상기 결실된 핵산 서열은 5' 및 3' 표적 서열 사이 핵산 서열로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 동형접합성 결실을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 코돈의 동형접합성 파괴를 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 제2 가이드 RNA 인식 서열은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하거나 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 임의로, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 개시 코돈을 포함하고, 제2 가이드 RNA 인식 서열은 정지 코돈을 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 제1 Cas9 절단 부위를 포함하고 제2 가이드 RNA 인식 서열은 제2 Cas9 절단 부위를 포함하고, 여기서 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 및 제2 Cas9 절단 부위 사이 결실을 포함하도록 변형된다. 임의로, 결실은 정확한 결실이고, 여기서 결실된 핵산 서열은 제1 및 제2 Cas9 절단 부위 사이 핵산 서열로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 상이하고, 각각의 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 임의로, 각각의 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 개시 코돈을 포함한다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 유전적으로 변형된 비-인간 동물의 림프구로부터 또는 상기 림프구로부터 생산된 하이브리도마로부터 수득된다.
그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 그와 같은 일부 방법에서, 설치류는 마우스이다. 임의로, 마우스 균주는 BALB/c 균주를 포함한다. 임의로, 마우스 균주는 BALB/c, C57BL/6, 및 129 균주를 포함한다. 임의로, 마우스 균주는 50% BALB/c, 25% C57BL/6, 및 25% 129이다. 임의로, 마우스의 MHC 일배체형은 MHCb/d이다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에서 삽입된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함한다. 임의로, 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절은 중쇄 유전자 분절이고, 마우스 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 유전자좌이다. 임의로, 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절은 경쇄 분절이고, 마우스 면역글로불린 유전자좌는 경쇄 유전자좌이다. 임의로, 경쇄 유전자 분절은 인간 카파 또는 람다 경쇄 유전자 분절이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 마우스 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함하고, 상기 마우스는 인간 불변 영역 유전자가 부족하고, 상기 마우스 불변 영역 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (b) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 여기서 (a)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소시키고, 상기 마우스는 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 포함하는 이소성 핵산 서열을 포함하고, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 존재한다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 상동성, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌 이외의 정위에서 존재한다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 1 이하 또는 2 이하 재배열된 인간 경쇄 V/J 서열을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함한다. 임의로, 경쇄 불변 영역 유전자는 마우스 유전자이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 미재배열된 인간 V, 적어도 하나의 미재배열된 인간 D, 및 적어도 하나의 미재배열된 인간 J 분절을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 추가로 포함한다. 임의로, 중쇄 불변 영역 유전자는 마우스 유전자이다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 인간화된 중쇄 면역글로불린 가변 유전자좌 및 인간화된 경쇄 면역글로불린 가변 유전자좌를 포함하고, 상기 마우스는 단일 경쇄를 발현시킨다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 인코딩하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL/JL), 상기 단일 재배열된 인간 VL/JL 영역은 인간 Vκ1-39/J 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20/J 유전자 분절로부터 선택되고; 그리고 (b) 내인성 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로의 대체, 상기 인간 VH 유전자 분절은 내인성 중쇄 불변 (CH) 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 VH 유전자 분절은 인간/마우스 키메라 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 항체의 모집단을 발현시키고, 마우스의 생식계열은 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자인 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자만을 포함하고, 상기 마우스는 단 하나의 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 이형접합성이거나, 2 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 동형접합성이고, 상기 마우스는 하기이도록 활성 친화도 성숙을 특징으로 하고 있다: (i) 모집단의 각각의 면역글로불린 카파 경쇄는 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해, 또는 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; (ii) 상기 모집단은 경쇄 가변 도메인이 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체 그리고 경쇄 가변 도메인이 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고; (iii) 상기 마우스는 모집단의 항체를 형성하기 위해 면역글로불린 카파 경쇄와 성공적으로 짝짓기하는 체세포적으로 돌연변이된 고 친화도 중쇄의 다양한 수집을 생성한다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (b) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다. 그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소시키고, 상기 마우스는 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 포함하는 이소성 핵산 서열을 포함하고, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 존재한다. 임의로, 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 상동성, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌 이외의 정위에서 존재한다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 게놈을 갖고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소 또는 제거하고, 상기 마우스는 비-인간 동물 ADAM6 단백질 또는 이의 오쏘로그 또는 동족체 또는 상응하는 ADAM6 단백질의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 임의로, 마우스의 게놈은 하기를 포함한다: (a) ADAM6 유전자의 이소성 배치; 및 (b) 내인성 비-인간 동물 중쇄 유전자좌에 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어; 이로써 상기 마우스는 하기를 특징으로 한다: (i) 수정성임; 및 (ii) 항원으로 면역화되는 경우, 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 중쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 인간 VH, 하나 이상의 인간 DH, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절에 의해 인코딩된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 생성함, 상기 항체는 항원에 특이적 결합을 보여준다.
그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 상기 마우스는 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 관심의 외래 항원은 제1 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고, 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하고, 그리고 상기 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 동형접합성 결실을 포함하여, 그것에 의하여 제1-자가-항원의 발현은 제거된다. 임의로, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (c) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 상기 (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (c)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (c) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다.
그와 같은 일부 방법에서, 여기서 비-인간 동물은 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 상기 마우스는 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 관심의 외래 항원은 제1 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고, 제1 표적 게놈 유전자좌는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고, 상기 제1 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA 인식 부위는 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하고, 그리고 상기 변형은 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈의 동형접합성 파괴를 포함하여, 그것에 의하여 제1-자가-항원의 발현은 제거된다. 임의로, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (c) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 상기 (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (c)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (c) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다.
일부 방법에서, 비-인간 동물 1-세포기 배아는 하이브리드 1-세포기 배아이고, 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (a') 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 서열을 비교하는 단계, 그리고 제1 표적 게놈 유전자좌의 나머지의 전부 또는 일부에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는 표적 영역에 기반된 접촉 단계 (a)에 앞서 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역을 선택하는 단계. 임의로, 표적 영역은 제1 표적 게놈 유전자좌의 나머지에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는다. 임의로, 표적 영역은 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖고, 제1 표적 게놈 유전자좌의 나머지는 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 99.8% 이하 서열 동일성을 갖는다. 임의로, 표적 영역은 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체에서 동일하다. 임의로, 표적 영역은 제1 표적 게놈 유전자좌 이내 연속 대립유전자 서열 동일성의 가장 긴 가능한 스트레치 이내이다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열, 그리고 제2 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는 상이한 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 상이한 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 2 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 분절은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않지만 제1 표적 게놈 유전자좌에서 각각의 상이한 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 영역 및 상기 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 영역 및 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 여기서 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 비-연속 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 비-연속 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 비-연속 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 비-연속 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 비-연속 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 비-연속 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 게놈 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')는 제1 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 비-연속 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 비-연속 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 비-연속 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 비-연속 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 비-연속 분절은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 비-연속 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 상기 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열에 의해 측접된 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열을 포함하는 및 상기에 의해 측접된 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 표적 서열 및/또는 3' 표적 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 임의로, 단계 (a')에서 표적 게놈 유전자좌는 5' 표적 서열 및 3' 표적 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 및 상기 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 및 상기 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a')에서 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역의 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 생성 방법이 제공된다: (a) 하기를 포함하는, 관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 제조하는 단계: (i) 비-인간 동물 1-세포기 배아 또는 1-세포기 배아가 아닌 비-인간 동물 만능 세포에 하기를 도입하는 것: (I) Cas9 단백질; (II) 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 상기 표적 게놈 유전자좌는 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다; 및 (III) 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA; 상기 표적 게놈 유전자좌는 이중대립유전자 변형을 가진 변형된 비-인간 동물 만능 세포 또는 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아를 생산하기 위해 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되고, 여기서 자가-항원의 발현은 제거되고; 그리고 (ii) 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아 또는 변형된 비-인간 동물 만능 세포로부터 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하는 것, 상기 표적 게놈 유전자좌는 자가-항원의 발현이 제거되도록 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형된다; (b) 관심의 외래 항원으로 단계 (a)에서 생산된 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 면역화시키는 단계; 및 (c) 관심의 외래 항원에 면역 반응을 개시하는데 충분한 조건 하에서 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 유지시키는 단계, 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물은 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질을 생산한다.
일부 방법에서, 단계 (a) (i)에서 세포는 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, 단계 (a) (ii)에서 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 생산은 하기를 포함한다: (I) 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 것; 및 (II) 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 숙주 배아를 대리모에 이식하는 것.임의로, 만능 세포는 배아 줄기 (ES) 세포이다. 일부 방법에서, 단계 (a) (i)에서 세포는 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, 단계 (a) (ii)에서 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 생산은 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아를 대리모에 이식하는 것을 포함한다.
그와 같은 일부 방법은 면역화된, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 단리된 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 것을 추가로 포함한다. 그와 같은 일부 방법은 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질 중 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및/또는 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질 중 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 면역화된, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 수득하는 것을 추가로 포함한다. 임의로, 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 림프구 (예를 들면, B 세포)로부터 또는 림프구로부터 생산된 하이브리도마로부터 수득된다. 임의로, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물은 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 제1 핵산 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하고, 제2 핵산 서열은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩한다.
그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원에 대한 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질은 관심의 외래 항원으로 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질보다 더 높은 역가를 갖는다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 더욱 다양한 레퍼토리는 관심의 외래 항원으로 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질과 비교된 관심의 외래 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 면역화 이후 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산된다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원에 대한 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질은 관심의 외래 항원으로 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질과 비교된 중쇄 V 유전자 분절 및/또는 경쇄 V 유전자 분절의 더 큰 다양성을 사용한다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원에 대한 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질의 일부는 자가-항원과 교차-반응한다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 표적 게놈 유전자좌에서 제2 가이드 RNA 인식 서열의 5'이고, 그리고 단계 (a) (i)은 제1 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 및 영역 5'에 대하여 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 및 영역 3'에 대하여 2인 카피 수를 결정하기 위한 유지 검정을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원은 자가-항원의 오쏘로그이다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원은 인간 단백질의 전부 또는 일부로 구성된다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 게놈 유전자좌는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 대체를 포함하도록 변형된다. 임의로, 결실은 랜덤 삽입 및 결실 (인델)이 없는 정확한 결실이다.
그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 제2 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하거나 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 상이하고, 각각의 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다.
그와 같은 일부 방법에서, 표적 게놈 유전자좌는 약 0.1 kb 내지 약 200 kb의 이중대립유전자 결실을 포함하도록 변형된다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 이중대립유전자 결실을 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 코돈의 이중대립유전자 파괴를 포함한다.
그와 같은 일부 방법에서, 도입 단계 (a) (i)은 비-인간 동물 만능 세포 또는 비-인간 동물 1-세포기 배아에 하기를 도입하는 것을 추가로 포함한다: (iv) 표적 게놈 유전자좌 이내 제3 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA; 및/또는 (v) 표적 게놈 유전자좌 이내 제4 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제4 가이드 RNA.
그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a) (i)에서 세포는 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, Cas9 단백질, 제1 가이드 RNA, 및 제2 가이드 RNA는 비-인간 동물 만능 줄기 세포에 DNA의 형태로 각각 도입된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a) (i)에서 세포는 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, Cas9 단백질, 제1 가이드 RNA, 및 제2 가이드 RNA는 전기천공 또는 뉴클레오펙션에 의해 비-인간 동물 만능 줄기 세포에 각각 도입된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a) (i)에서 세포는 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, Cas9 단백질, 제1 가이드 RNA, 및 제2 가이드 RNA는 비-인간 동물 1-세포기 배아에 RNA의 형태로 각각 도입된다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a) (i)에서 세포는 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, Cas9 단백질, 제1 가이드 RNA, 및 제2 가이드 RNA는 전핵 주사 또는 세포질 주사로 비-인간 동물 1-세포기 배아에 도입된다.
그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 단계 (a) (i)에서 도입되지 않는다. 그와 같은 일부 방법에서, 도입 단계 (a) (i)은 비-인간 동물 만능 세포 또는 비-인간 동물 1-세포기 배아에 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 그리고 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트를 도입하는 것을 추가로 포함하고, 단, 단계 (a) (i)에서 세포가 비-인간 동물 1-세포기 배아이면, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 5 kb 이하이다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 추가로 포함한다. 임의로, 핵산 삽입물은 표적 게놈 유전자좌에 상동성 또는 오쏘로그성이다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 1 kb이다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 80개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드이다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드이다. 임의로, 단계 (a) (i)에서 세포는 비-인간 동물 만능 세포이고, (a) 외인성 수복 템플레이트는 길이 적어도 10 kb인 큰 표적화 벡터 (LTVEC)이거나; 또는 (b) 외인성 수복 템플레이트는 LTVEC이고, 여기서 LTVEC의 5' 및 3' 상동성 아암의 총계는 길이 적어도 10 kb이다. 임의로, 표적 게놈 유전자좌는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하도록 변형되고, 결실된 핵산 서열은 5' 및 3' 표적 서열 사이 핵산 서열로 구성된다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 포함하고, 핵산 삽입물은 결실된 핵산 서열에 상동성 또는 오쏘로그성이고, 표적 게놈 유전자좌는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하도록 변형되고, 핵산 삽입물은 결실된 핵산 서열을 대체한다.
그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 임의로, 설치류는 마우스이다. 임의로, 마우스 균주는 BALB/c 균주를 포함한다. 임의로, 마우스 균주는 BALB/c, C57BL/6, 및 129 균주를 포함한다. 임의로, 마우스 균주는 50% BALB/c, 25% C57BL/6, 및 25% 129이다. 임의로, 마우스의 MHC 일배체형은 MHCb/d이다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에서 삽입된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함한다. 임의로, 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절은 중쇄 유전자 분절이고, 마우스 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 유전자좌이고/이거나, 상기 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절은 카파 또는 람다 경쇄 분절이고, 상기 마우스 면역글로불린 유전자좌는 경쇄 유전자좌이다. 임의로, 마우스는 마우스 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함하고, 상기 마우스는 인간 불변 영역 유전자가 부족하고, 상기 마우스 불변 영역 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다. 임의로, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (b) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 여기서 (a)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 그리고 (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 마우스 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 1 이하 또는 2 이하 재배열된 인간 경쇄 V/J 서열을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함하고, 상기 마우스는 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 미재배열된 인간 V, 적어도 하나의 미재배열된 인간 D, 및 적어도 하나의 미재배열된 인간 J 분절을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 추가로 포함한다. 임의로, 마우스는 인간화된 중쇄 면역글로불린 가변 유전자좌 및 인간화된 경쇄 면역글로불린 가변 유전자좌를 포함하고, 상기 마우스는 단일 경쇄를 발현시킨다. 임의로, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 인코딩하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL/JL), 상기 단일 재배열된 인간 VL/JL 영역은 인간 Vκ1-39/Jκ5 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20/Jκ1 유전자 분절로부터 선택되고; 그리고 (b) 내인성 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로의 대체, 상기 인간 VH 유전자 분절은 내인성 중쇄 불변 (CH) 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고, 그리고 상기 인간 VH 유전자 분절은 인간/마우스 키메라 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다. 임의로, 마우스는 항체의 모집단을 발현시키고, 마우스의 생식계열은 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자인 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자만을 포함하고, 상기 마우스는 단 하나의 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 이형접합성이거나, 2 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 동형접합성이고, 마우스는 하기이도록 활성 친화도 성숙을 특징으로 한다: (i) 모집단의 각각의 면역글로불린 카파 경쇄는 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해, 또는 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; (ii) 상기 모집단은 경쇄 가변 도메인이 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체 그리고 경쇄 가변 도메인이 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고; (iii) 상기 마우스는 모집단의 항체를 형성하기 위해 면역글로불린 카파 경쇄와 성공적으로 짝짓기하는 체세포적으로 돌연변이된 고 친화도 중쇄의 다양한 수집을 생성한다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (b) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다.
그와 같은 일부 방법에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소 또는 제거하고, 상기 마우스는 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열을 포함하고, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이고, 여기서 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 상기 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 존재한다.
그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 마우스는 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 관심의 외래 항원은 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고, 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하거나 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 상기 변형은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 이중대립유전자 결실을 포함하여, 그것에 의하여 자가-항원의 발현은 제거된다. 그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 마우스는 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 여기서 관심의 외래 항원은 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고, 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 상기 변형은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈의 이중대립유전자 파괴를 포함하여, 그것에 의하여 자가-항원의 발현은 제거된다. 임의로, 마우스는 하기를 포함한다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및 (c) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 상기 (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (c)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 그리고 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없다. 임의로, 마우스는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성이다: (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다; (b) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (c) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다.
그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물 만능 세포는 하이브리드 세포이거나 비-인간 포유류 1-세포기 배아는 하이브리드 1-세포기 배아이고, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (a') 표적 게놈 유전자좌 이내 상응하는 제1 및 제2 염색체의 상의 서열을 비교하는 단계, 그리고 표적 게놈 유전자좌의 나머지의 전부 또는 일부에 비해 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는 표적 영역에 기반된 접촉 단계 (a)에 앞서 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역을 선택하는 단계, 상기 표적 영역은 하기를 포함한다: 제1 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 또는 10 kb의 측접 서열, 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 또는 10 kb의 측접 서열.임의로, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 나머지에 비해 상응하는 제1 및 제2의 쌍 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는다. 임의로, 표적 영역은 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍 사이 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖고, 표적 게놈 유전자좌의 나머지는 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍 사이 99.8% 이하 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 유전적으로 변형된 비-인간 동물의 제조 방법이 제공된다: (a) 1-세포기 배아가 아닌 비-인간 동물 만능 세포 또는 비-인간 동물 1-세포기 배아에 하기를 도입하는 단계: (i) Cas9 단백질; (ii) 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 상기 표적 게놈 유전자좌는 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다; 및 (iii) 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA; 상기 표적 게놈 유전자좌는 이중대립유전자 변형을 가진 변형된 비-인간 동물 만능 세포 또는 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아를 생산하기 위해 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되고, 여기서 자가-항원의 발현은 제거되고; 그리고 (b) 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아 또는 변형된 비-인간 동물 만능 세포로부터 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하는 단계, 상기 표적 게놈 유전자좌는 자가-항원의 발현이 제거되도록 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형된다.
그와 같은 방법은, 예를 들어, 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 생성 방법에 대하여 상기 개시된 임의의 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a)에서 세포는 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, 그리고 단계 (b)에서 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 생산은 하기를 포함한다: (I) 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 것; 및 (II) 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 숙주 배아를 대리모에 이식하는 것.임의로, 만능 세포는 배아 줄기 (ES) 세포이다. 그와 같은 일부 방법에서, 단계 (a)에서 세포는 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, 단계 (b)에서 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 생산은 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아를 대리모에 이식하는 것을 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 관심의 외래 항원은 자가-항원의 오쏘로그이다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 제2 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하거나 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 상이하고, 각각의 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 그와 같은 일부 방법에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 표적 게놈 유전자좌에서 제2 가이드 RNA 인식 서열의 5'이고, 그리고 단계 (a) (i)은 제1 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 및 영역 5'에 대하여 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 및 영역 3'에 대하여 2인 카피 수를 결정하기 위한 유지 검정을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 이중대립유전자 결실을 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 변형은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 코돈의 이중대립유전자 파괴를 포함한다. 그와 같은 일부 방법에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
도 1은 VELOCIMMUNE® 마우스 (VI-3; 양쪽 IgH 및 Igκ에서 인간화된 동형접합성)에서 면역학적 내성 파괴의 전통적 접근법을 보여준다. 전통적 접근법에서, 관심의 외래 표적 항원에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 이형접합성 녹아웃 (무효) 대립유전자는 F1H4 배아 줄기 (ES) 세포에서 창출된다. 표적화 벡터의 설계부터 녹아웃에 이형접합성인 F0 마우스의 생성까지 시간은 대략 5 개월이다. VI-3 마우스는 그 다음 관심의 외래 표적 항원에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자에서 이형접합성 녹아웃 돌연변이를 갖는 F0 마우스에 교배된다. 면역화에 적합한 (관심의 상기 표적에 대하여 동형접합성 무효 그리고 양쪽 IgH 및 Igκ에서 인간화된 동형접합성) 삼중 동형접합성 마우스를 생성하기 위해, 교배의 추가 2 세대가 요구된다. 표적화 벡터의 설계부터 삼중 동형접합성 마우스의 생성까지 전체 공정은 대략 15 내지 16 개월이 걸린다.
도 2 는 VELOCIMMUNE® (VI-3) 마우스에서 또는 보편적인 경쇄 (ULC 또는 공통 경쇄) 마우스에서 면역학적 내성의 가속화된 파괴 공정을 보여준다. 이 공정에서, VI-3 또는 ULC 마우스로부터 유래된 ES 세포는 관심의 외래 표적 항원에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자의 이형접합성 무효 대립유전자를 창출하도록 표적된다. 순차적인 표적화 단계는 동형접합성 무효 VI-3 또는 ULC ES 세포 클론을 수득하도록 요구된다.
도 3 은 VELOCIMMUNE® (VI-3) 마우스에서 또는 보편적인 경쇄 (또는 공통 경쇄) (ULC) 마우스에서 내성의 추가 가속화된 파괴 공정을 보여준다. 이 공정에서, VI-3 또는 ULC ES 세포는 CRISPR/Cas9 및 짝짓기된 가이드 RNAs로 표적되어 단일 단계에서 관심의 외래 표적 항원에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자의 동형접합성 붕괴를 생성한다. TAQMAN® 스크리닝은, 예를 들어, 양쪽 대립유전자손실 및 유지 검정을 포함할 수 있다.
도 4는 관심의 외래 표적 항원에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 마우스 유전자의 동시 결실 그리고 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 및 짝짓기된 업스트림 및 다운스트림 가이드 RNAs (gU 및 gD)를 사용하는 네오마이신 선택 마커로의 대체에 대하여 일반적인 도식을 보여준다. 2 가이드 RNAs에 의해 유도된 Cas9 절단 부위의 위치는 마우스 유전자 서열 아래 화살표로 표시된다. 유지 검정 프로브 및 업스트림, 중간, 및 다운스트림 대립유전자 손실 (LOA) 검정 프로브를 포함하는, TAQMAN® 검정 프로브는 수평선으로 표시된다. 도의 최하부 부분은 기대된 표적화된 대립유전자 유형을 표시한다.
도 5 는 관심의 외래 표적 항원에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 마우스 유전자의 동시 결실 그리고 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 및 마우스 ATG 개시 코돈을 각각 표적하는 3 중첩 가이드 RNAs를 사용하는 플록스드 네오마이신 선택 마커 및 lacZ로의 대체에 대하여 일반적인 도식을 보여준다. 가이드 RNAs는 수평 화살표로 표시되고, 그리고 TAQMAN® 검정 프로브는 둘러싸인 수평선으로 표시된다. 도의 최하부 부분은 기대된 표적화된 대립유전자 유형을 표시한다.
도 6 은, 표적 8 (자가-항원 8)에 오쏘로그성인 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자에 대하여 동형접합성 무효인, 야생형 보편적인 경쇄 (ULC 1-39) 마우스에서 그리고 ULC 1-39 마우스에서 인간 표적 항원 (표적 8)에 대하여 항체 역가 데이터를 보여준다.
도 7 은 하이브리드 VGF1 (F1H4) ES 세포 (C57BL6(XB6)/129S6(Y129))를 생산하기 위해 착수된 교배를 보여준다.
도 8은 마우스 유전자 또는 마우스 유전자의 부분의 동시 결실 그리고 어느 한쪽 1 또는 2 5' 영역, 중간 영역, 및 3' 영역 gRNAs 그리고 LTVEC를 사용하는 상응하는 인간 버전으로의 대체에 대하여 도식을 보여준다. LTVEC는 도의 최상부 부분에서 보여지고, 마우스 유전자 자리는 도의 최하부 부분에서 보여진다. 8 가이드 RNAs에 의해 유도된 Cas9 절단 부위의 위치는 마우스 유전자 서열 아래 수직 화살표로 표시된다.
도 9A는 마우스 유전자의 동시 결실 및 LTVEC 및 2 가이드 RNAs (가이드 RNAs A 및 B)를 사용하는 상응하는 인간 버전으로의 대체에 대하여 일반적인 도식을 보여준다. LTVEC는 도 9A의 최상부 부분에서 보여지고, 마우스 유전자 자리는 도 9A의 최하부 부분에서 보여진다. 2 가이드 RNAs에 의해 유도된 Cas9 절단 부위의 위치는 마우스 유전자 서열 아래 화살표로 표시된다.
도 9B-9E는 2 가이드 RNAs가 사용되는 경우 더 큰 빈도에서 발생하는 특유의 이중대립유전자 변형 (대립유전자 유형)을 보여준다. 대각 선영을 가진 두꺼운 선은 마우스 유전자를 표시하고, 점선은 마우스 유전자에서 결실을 표시하고, 두꺼운 흑색선은 인간 유전자의 삽입을 표시한다. 도 9B는 동형접합성 붕괴된 대립유전자 (큰 CRISPR-유도된 결실)을 보여준다. 도 9C는 동형접합성 표적화된 대립유전자를 보여준다. 도 9D는 반접합성 표적화된 대립유전자를 보여준다. 도 9E는 화합물 이형접합성 대립유전자를 보여준다.
도 10A 및 10B는 선택된 클론의 유전자형을 확인하는 PCR 검정을 보여준다. 도 10A는, 5' 상동성 아암에 상동성인 것 외부 서열과 인간 삽입물 사이 연결을 확립시키는, 프라이머 m-lr-f 및 m-5'-r을 사용하는 선택된 ES 세포 클론용 광범위 PCR 검정으로부터 결과를 보여주어, 그렇게 함으로써 정확한 표적화를 증명한다. 도 10B는 5' Del J, 5' Ins J, Del A + F, 및 Del A + E2 PCR 검정으로부터 결과를 보여준다. 5' Del J는, 이러한 서열의 유지 또는 손실을 확립시키기 위해 gRNA A 절단 부위를 둘러싸는 야생형 서열을 증폭시키는, m-5'-f 및 m-5-r 프라이머를 사용하는 PCR 생성물을 도시한다. 5' Ins J는, 인간 삽입물과 마우스 게놈 사이 연결을 확립시키는, m-5'-f 및 h-5'-r 프라이머를 사용하는 PCR 생성물을 도시한다. 검정은 양쪽 표적화된 및 랜덤 통합된 클론에서 양성 결과를 제공할 것이다. Del A + F는 클론 BO-F10 및 AW-A8에서 이중 gRNA A 및 F 절단에 의해 매개된 큰 결실에 대하여 기대된 앰플리콘 크기 (359 bp) 및 실제의 밴드를 도시한다. Del A + E2는 클론 BA-A7에 대하여 동일한 아이디어를 도시한다. NT는 템플레이트 없음을 표시하고, +/+는 친계 VGF1 하이브리드 ES 세포 야생형 대조군을 표시하고, H/+는 이형접합성 인간화된 유전자형을 표시하고, H/Δ는 반접합성 인간화된 유전자형을 표시하고, H/H는 동형접합성 인간화된 유전자형을 표시하고, Δ/Δ는 동형접합성 결실된 유전자형을 표시한다.
도 11A-11C 는, Cas9 및 2 gRNAs와 조합된 Lrp5 인간화 LTVEC로 표적화되었던, 마우스 ES 세포 클론 AW-D9 (도 11A) 및 BA-D5 (도 11C), 그리고 LTVEC 단독으로 표적화되었던, 클론 BS-C4 (도 11B)의 형광 원위치 하이브리드화 (FISH) 분석을 보여준다. 화살표는 염색체 19의 밴드 B에서 하이브리드화 신호의 위치를 표시한다. 적색 신호는 마우스 프로브만으로 하이브리드화를 표시한다 (대시기호로 된 화살표, 도 11B). 황색 혼합된 색상 신호는 양쪽 적색 마우스 프로브 및 녹색 인간 프로브로 하이브리드화를 표시한다. 적색 신호 (대시기호로 된 화살표)를 갖는 하나의 염색체 19 밴드 B 및 황색 신호 (고체 화살표)를 갖는 다른 염색체 19 밴드 B는 BS-C4 클론에 대하여 정확한 유전자좌 및 이형접합성 유전자형에 표적화를 확인하였다 (도 11B). 황색 신호 (고체 화살표, 도 11A 및 11C)를 갖는 양쪽 염색체 19의 B 밴드는 AW-D9 및 BS-C4 클론에 대하여 정확한 유전자좌 및 동형접합성 유전자형에 표적화를 확인하였다.
도 12는 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 이형접합성 손실 (LOH) 분석으로 2 가이드 RNAs에 의해 매개된 유전자 변환 또는 유사분열 재조합 사건을 검사하도록 설계된 검정으로 염색체 19의 도식을 보여준다. TAQMAN® qPCR 염색체 카피 수 (CCN) 프로브의 대략적 위치는 화살표로 보여진다. 구조적 변이체 (SV) 다형성 PCR 프로브의 대략적 위치는 상기 주어진 Lrp5 유전자좌로부터 그것의 거리로 (Mb로) 갈매기 무늬로 보여진다. 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV) TAQMAN® 대립유전자 식별 프로브의 대략적 위치는 아래 주어진 Lrp5 유전자좌로부터 그것의 거리로 (Mb로) 화살촉 모양으로 보여진다. F, E2, D, B2, 및 A에 대하여 gRNA 인식 서열의 위치는 Lrp5 유전자의 표현 위에서 대각 화살표로 보여진다.
도 13A 및 13B 는, Cas9 및 2 gRNAs와 조합된 Hc 인간화 LTVEC로 표적화되었던, 마우스 ES 세포 클론 Q-E9 (도 13A) 및 O-E3 (도 13B)의 형광 원위치 하이브리드화 (FISH) 분석을 보여준다. 화살표는 염색체 2의 밴드 B에서 하이브리드화 신호의 위치를 표시한다. 적색 신호는 마우스 프로브만으로 하이브리드화를 표시한다 (대시기호로 된 화살표, 도 13A). 황색 혼합된 색상 신호는 양쪽 적색 마우스 프로브 및 녹색 인간 프로브로 하이브리드화를 표시한다 (고체 화살표). 적색 신호 (대시기호로 된 화살표)를 갖는 하나의 염색체 2 밴드 B 그리고 황색 신호 (고체 화살표)를 갖는 다른 염색체 2 밴드 B는 Q-E9 클론에 대하여 정확한 유전자좌 및 이형접합성 유전자형에 표적화를 확인하였다 (도 13A). 황색 신호 (고체 화살표, 도 13B)를 갖는 양쪽 염색체 2의 B 밴드는 O-E3 클론에 대하여 정확한 유전자좌 및 동형접합성 유전자형에 표적화를 확인하였다.
도 14는 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 이형접합성 손실 (LOH) 분석으로 2 가이드 RNAs에 의해 매개된 유전자 변환 또는 유사분열 재조합 사건을 검사하도록 설계된 검정으로 마우스 C5 유전자를 함유하는 염색체의 도식을 보여준다. 구조적 변이체 (SV) 다형성 PCR 프로브의 대략적 위치는 상기 주어진 C5 유전자좌로부터 그것의 거리로 (Mb로) 수평 화살표로 보여진다. E2 및 A에 대하여 gRNA 인식 서열의 위치는 C5 유전자 자리의 표현 위에서 대각 화살표로 보여진다.
도 15A-15E는 대조군으로서 사용된 VGF1 (F1H4), 129, 및 B6 DNA로 클론 BR-B4, BP-G7, BO-G11, BO-F10, B0-A8, 및 BC-H9의 구조적 변이 (SV) 검정의 결과를 보여준다. 검정은 Lrp5 유전자좌에 텔로미어 하기 거리에서 실시되었다: 13.7 Mb (도 15A), 20.0 Mb (도 15B), 36.9 Mb (도 15C), 48.3 Mb (도 15D), 및 56.7 Mb (도 15E). B6 및 129 대립유전자에 대하여 PCR 생성물의 위치는 화살표로 보여진다.
도 16A-16C 는 Lrp5 의 0.32 Mb 동원체 (도 16A), Lrp5 의 1.2 Mb 텔로미어 (도 16B), 및 Lrp5의 57.2 Mb 텔로미어 (도 16C)에 대하여 대립유전자 식별력 플롯을 보여준다. 각각의 축에서 값은 상대 형광 강도를 나타낸다. 플롯은, 고체 도트 (B6 대립유전자), 개방 도트 (129 대립유전자), 및 대각선을 가진 도트 (양쪽 B6/129 대립유전자)로서 보여지는, 각각의 샘플에 대하여 4 복제를 묘사한다.
도 17A-17C는 이형접합성 손실에 의해 검출된 널리-확산된 유전자 변환 및 동형접합성 사건을 생산할 수 있는 세포 사이클의 G2 기 동안 유사분열 재조합에 대하여 가능한 기전을 보여주는 도식이다. 도 17A 는 129 동족체에서 표적화된 인간화에 이형접합성인 하이브리드 129/B6 ES 세포에서 2 염색분체를 보여주는 복제된 상동 염색체를 보여준다. 이중-헤드 화살표는, 도 17B에서 보여진 하이브리드 염색분체를 초래하는, 표적화된 대립유전자의 동원체 측에서 교차로서 보여진, 상동 염색체에서 염색분체 사이 상동성 재조합에 의해 상호 교환을 촉진시키는 이중 gRNA-지향된 Cas9 절단에 의해 생성된 잠재적인 이중 가닥 절단을 표시한다. 도 17C는 유사분열 및 세포 분할 후, 딸 세포에 염색체 분리의 4 유형이 가능하다는 것을 보여준다. 이형접합성의 유지를 가진 2, 친계 유형 이형접합체 (Hum/+, 좌상측) 및 동일 교환에 의한 이형접합체 (Hum/+, 우상측)은 LOH 검정에 의해 식별될 수 없다. 2 기타는 텔로미어 B6 대립유전자의 손실을 가진 이형접합성, 인간화된 동형접합체 (Hum/Hum, 예를 들면 클론 BO-A8, 좌하측) 그리고 텔로미어 129 대립유전자의 손실을 가진 야생형 동형접합체 (+/+, 우하측)의 손실을 보여준다. 이러한 후자의 유형은 인간화된 대립유전자의 약물 내성 카셋트를 유지하지 않기 때문에 손실될 것이다.
도 18A-18F는, 129S6/SvEvTac 마우스 균주로부터 유래된 하나의 반수체 염색체 보체 및 C57BL/6NTac (B6) 마우스 균주로부터 유래된 하나의 반수체 염색체 보체를 갖는 F1 하이브리드 마우스 ES 세포에서 CRISPR/Cas9-보조 인간화 실험에서, 이형접합성 손실 (LOH)를 포함하는, 관측된 결과를 설명하는 가능한 기전을 보여준다. 도 18A 는 이형접합성 변형이 게놈 복제 전 또는 게놈 복제 이어서 자매 염색분체 사이 유전자 변환 후 129 염색체에서 발생하는 유사분열 교차에 의해 상호 염색분체 교환을 보여준다. 도 18B 는 단일 129 염색분체가 게놈 복제 후 변형되는 유사분열 교차에 의한 상호 염색분체 교환을 보여준다. 도 18C 는 LTVEC 표적화가 발생하지 않았지만, Cas9 절단이 어느 한쪽 129 또는 B6 염색체 (보여진 B6 절단)에서 발생하였던 유사분열 교차에 의한 상호 염색분체 교환을 보여준다. 도 18D 는 이형접합성 변형이 게놈 복제 전 또는 게놈 복제 이어서 자매 염색분체 사이 유전자 변환 후 129 염색체에서 발생하는 파단-유도된 복제에 의한 염색분체 복사를 보여준다. 도 18E 는 단일 129 염색분체가 게놈 복제 후 변형되는 파단-유도된 복제에 의한 염색분체 복사를 보여준다. 도 18F 는 LTVEC 표적화가 발생하지 않았지만, Cas9 절단이 어느 한쪽 129 또는 B6 염색체 (보여진 B6 절단)에서 발생하였던 파단-유도된 염색분체 복사를 보여준다.
도 19 는 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 LTVEC 및 하나 이상의 gRNAs를 사용하여 상응하는 인간 LRP5 유전자좌로 대체 및 결실용으로 표적화될 마우스 Lrp5 유전자좌의 도식을 보여준다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 (도의 최하부 부분에서 3열에서 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 20 은 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 하나 이상의 gRNAs 및 LTVEC를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체 및 결실용으로 표적화될 마우스 Hc 유전자좌의 도식을 보여준다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 (도의 최하부 부분에서 3열에서 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 21 은 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 하나 이상의 gRNAs 및 LTVEC를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체 및 결실용으로 표적화될 마우스 Trpa1 유전자좌의 도식을 보여준다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 (도의 최하부 부분에서 3열에서 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 22 는 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 하나 이상의 gRNAs 및 LTVEC를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체 및 결실용으로 표적화될 마우스 Adamts5 유전자좌의 도식을 보여준다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 (도의 최하부 부분에서 3열에서 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 23 은 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 하나 이상의 gRNAs 및 LTVEC를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체 및 결실용으로 표적화될 마우스 Folh1 유전자좌의 도식을 보여준다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 (도의 최하부 부분에서 3열에서 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 24 는 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 하나 이상의 gRNAs 및 LTVEC를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체 및 결실용으로 표적화될 마우스 Dpp4 유전자좌의 도식을 보여준다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 (도의 최하부 부분에서 3열에서 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 25 는 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 하나 이상의 gRNAs 및 LTVEC를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체 및 결실용으로 표적화될 마우스 Ror1 유전자좌의 도식을 보여준다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 (도의 최하부 부분에서 3열에서 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 26 은 막관통 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 마우스 유전자좌의 도식을 보여주고; 마우스 유전자좌는 VGF1 하이브리드 ES 세포에서 하나 이상의 gRNAs 및 LTVEC를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체 및 결실용으로 표적화된다. 직사각형은 상기 표적 게놈 영역 이내 상이한 유전자를 나타낸다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주 MP 변이체, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주 RGC 변이체, 및 (도의 최하부 부분에서 3열로 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주와 비교되었다. MP 및 RGC 변이체는 동일한 균주로부터 상이한 마우스이다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
도 27A-27C 는 이형접합성의 국부 손실에 의해 검출된 동형접합성 사건 및 유전자 변환을 생산할 수 있는 세포 사이클의 G2 기 동안 유사분열 재조합에 대하여 가능한 기전을 보여주는 도식이다. 도 27A 는 129 동족체에서 표적화된 인간화에 이형접합성인 하이브리드 129/B6 ES 세포에서 2 염색분체를 보여주는 복제된 상동 염색체를 보여준다. 129 동족체에서 이형접합성 변형은 게놈 복제 전 발생하거나, 단일 129 염색분체는 게놈 복제 이어서 인터-염색분체 유전자 변환 후 변형된다. 이중-헤드 화살표는, 도 27B에서 나타낸 바와 같이, 하나의 변형된 염색분체의 작은 일부를 복사하는 유전자 변환 사건에 의해 생산된 하이브리드 염색분체를 초래하는, 대각 대시기호로 된 화살표로 보여진, 이중 가닥 침습 및 합성-유도된 수복을 촉진시키는 이중 gRNA-유도된 Cas9 절단에 의해 생성된 잠재적인 이중 가닥 절단을 표시한다. 도 27C는 유사분열 및 세포 분할 후, 딸 세포로의 염색체 분리의 2 유형이 가능하다는 것을 보여준다: 이형접합성의 손실 없이 이형접합성의 유지를 가진 것 (친계 유형 이형접합체 (Hum/+, 상부), 그리고 표적화된 변형을 둘러싸는 이형접합성의 국부 손실을 가진 것 (Hum/Hum, 최하부, 129 대립유전자 보유).
도 28 은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 및 정지 코돈 영역을, 단독으로 또는 큰 표적화 벡터와 조합으로 표적하는 짝짓기된 가이드 RNAs를 사용하여 상이한 크기의 상이한 자가-항원 표적에 대하여 VI-3 및 ULC 1-39 배아 줄기 (ES) 세포에서 CRISPR/Cas9-매개된 결실의 효율을 보여준다.
도 29는 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 및 정지 코돈 영역을 표적하는 짝짓기된 가이드 RNAs를 사용하여 결실에 대하여 상이한 크기의 상이한 자가-항원 표적을 표적하기 위해 CRISPR/Cas9로 VI-3 및 ULC 1-39 1-세포기 배아의 표적화 이후 붕괴된 대립유전자로 생산된 마우스 새끼의 백분율을 보여준다.
도 30A 및 30B는 표적 9를 발현시키기 위해 조작된 친계 VI-3T3 세포 및 VI-3T3 세포에서 표적 9 전장 DNA로 면역화 이후 표적 9 (자가-항원 9)에 오쏘로그성인 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자에 동형접합성 무효인 VI3-Adam6 마우스 (도 30A)에서 그리고 야생형 VI-3-Adam6 마우스 (도 30B)에서 인간 표적 항원 (표적 9)에 대하여 항체 역가 데이터를 보여준다.
도 31A 및 31B는 인간 표적 항원 (표적 4)에 대하여 그리고 상응하는 오쏘로그성 마우스 자가-항원 (자가-항원 4)에 대하여 항체 역가 데이터를 보여준다. 도 31A는 자가-항원 4를 인코딩하는 내인성 유전자에 동형접합성 무효인 VI3-Adam6 마우스에서 인간 표적 4 및 마우스 자가-항원 4에 대하여 항체 역가 데이터를 보여준다. 도 31B는 자가-항원 4를 인코딩하는 내인성 유전자에 동형접합성 무효인 ULC 1-39 마우스에서 인간 표적 4 및 마우스 자가-항원 4의 조합에 대하여 항체 역가 데이터를 보여준다.
도 32는, 50% BALB/cTac, 25% C57BL/6NTac, 및 25% 129S6/SvEvTac의 유전적 배경을 각각 갖는, VI3-Adam6 및 ULC 1-39 마우스에서 면역글로불린 중쇄 유전자좌 (상단부) 및 면역글로불린 경쇄 유전자좌 (최하부)에 대하여 도식을 보여준다. VI3-Adam6 마우스에서, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 재삽입된 마우스 Adam6 유전자 (사다리꼴로 표시되는, Adam6b 및 Adam6a)와 함께 상응하는 인간 DNA로 대체된다. 보편적인 경쇄 (ULC 1-39) 마우스에서, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 재삽입된 마우스 Adam6 유전자와 함께 상응하는 인간 DNA로 대체되고, 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 hVκ3-15 프로모터에 작동가능하게 연결된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 뉴클레오타이드 서열 (Vκ1-39/Jκ5)를 포함한다. 인간 분절은 흑색으로 묘사되고, 마우스 분절은 대각선으로 표시된다.
정의
본 명세서에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는, 코딩된 및 비-코딩된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도된 아미노산을 포함하여, 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 변형된 폴리머, 예컨대 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
단백질은 "N-말단" 및 "C-말단"을 갖는 것으로 언급된다. 용어 "N-말단"은, 유리 아민 기 (-NH2)를 가진 아미노산에 의해 종결된, 단백질 또는 폴리펩타이드의 개시에 관련한다. 용어 "C-말단"은, 유리 카복실 기 (-COOH)에 의해 종결된, 아미노산 쇄 (단백질 또는 폴리펩타이드)의 단말에 관련한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하여, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 포함한다. 이들은 단일-, 이중-, 및 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 포함한다.
핵산은 1개의 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 결합을 통해 1 방향으로 그것의 이웃의 3' 산소에 부착된다고 하는 방식으로 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 모노뉴클레오타이드가 반응되기 때문에 "5' 말단" 및 "3' 말단"을 갖는 것으로 언급된다. 올리고뉴클레오타이드의 말단은 그것의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않으면 "5' 말단"으로서 지칭된다. 올리고뉴클레오타이드의 말단은 그것의 3' 산소가 또 다른 모노뉴클레오타이드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않으면 "3' 말단"으로서 지칭된다. 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오타이드에 내부일지라도, 또한 5' 및 3' 말단을 갖는 것으로 언급될 수 있다. 어느 한쪽 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소는 "다운스트림" 또는 3' 요소의 "업스트림" 또는 5'인 것으로서 지칭된다.
용어 "야생형"은 (돌연변이체와 대조된, 이환된, 변경된, 또는 기타 등등 경우) 정상 상태 또는 상황에서 발견된 바와 같은 구조 및/또는 활성을 갖는 독립체를 포함한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 다중 상이한 형태 (예를 들면, 대립유전자)로 종종 실재한다.
단백질 및 핵산에 관하여 용어 "단리된"은 원위치에서, 최대 및 단백질 및 폴리뉴클레오타이드의 실질적으로 순수한 제제를 포함하여 정상적으로 존재할 수 있는 다른 박테리아, 바이러스 또는 세포 구성요소에 관하여 상대적으로 정제되는 단백질 및 핵산을 포함한다. 용어 "단리된"은 또한 자연 발생 대응물을 갖지 않는, 화학적으로 합성된 및 따라서 실질적으로 다른 단백질 또는 핵산에 의해 오염되지 않은 단백질 및 핵산을 포함하거나, 또는 이들이 자연적으로 동반되는 대부분의 다른 세포 구성요소 (예를 들면, 다른 세포 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 또는 세포 구성요소)로부터 분리 또는 정제되고 있다.
"외인성" 분자 또는 서열은 그 형태로 세포에서 정상적으로 존재하지 않는 분자 또는 서열을 포함한다. 정상 존재는 세포의 특정한 발달기 및 환경 조건에 관하여 존재를 포함한다. 외인성 분자 또는 서열은, 예를 들어, 세포 내에서 상응하는 내인성 서열의 돌연변이된 버전, 예컨대 내인성 서열의 인간화된 버전을 포함할 수 있거나, 또는 세포 내에서 내인성 서열에 상응하는 그러나 상이한 형태인 (즉, 염색체 내가 아닌) 서열을 포함할 수 있다. 그에 반해서, 내인성 분자 또는 서열은 특정 환경 조건 하에서 특정 발달기에 특정 세포에서 그 형태로 정상적으로 존재하는 분자 또는 서열을 포함한다.
"코돈 최적화"는 일반적으로 원상태 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 더 자주 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 원상태 서열의 적어도 하나의 코돈을 대체시킴으로써 특정 숙주 세포에서 향상된 발현용 핵산 서열의 변형 공정을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 자연 발생 핵산 서열에 비교된 경우, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함하는, 주어진 원핵 또는 진핵 세포에서 더 높은 빈도의 용법을 갖는 코돈을 치환시키도록 변형될 수 있다. 코돈 용법 표는, 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 쉽게 이용가능하다. 이들 표는 수많은 방식으로 적응될 수 있다. 참고 Nakamura 등 (2000) Nucleic Acids Research 28:292, 참고로 그 전체가 모든 목적을 위하여 본 명세서에서 편입됨. 특정 숙주에서 발현을 위하여 특정 서열의 코돈 최적화용 컴퓨터 알고리즘은 또한 이용가능하다 (참고, 예를 들면, Gene Forge).
용어 "유전자좌"는 유전자 (또는 유의미한 서열), DNA 서열, 폴리펩타이드-인코딩 서열, 또는 유기체의 게놈의 염색체상의 위치의 특정 정위를 지칭한다. 예를 들어, "Lrp5 유전자좌"는 Lrp5 유전자, Lrp5 DNA 서열, LRP5-인코딩 서열, 또는 그와 같은 서열이 거주하는 것에 대해 확인되고 있는 유기체의 게놈의 염색체상의 Lrp5 위치의 특정 정위를 지칭할 수 있다. "Lrp5 유전자좌"는, 예를 들어, 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' UTR, 또는 이의 조합을 포함하는, Lrp5 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 생성물 (예를 들면, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)에 대하여 코딩하는 그리고 비-코딩 인트론으로 차단된 코딩 영역을 포함하는 염색체내 DNA 서열 그리고 유전자가 (5' 및 3' 미번역된 서열을 포함하는) 전장 mRNA에 상응하도록 양쪽 5' 및 3' 말단에서 코딩 영역에 인접하여 정위된 서열을 지칭한다. 용어 "유전자"는 또한 조절 서열 (예를 들면, 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위, 사일런서, 격리 서열, 및 매트릭스 부착 영역을 포함하는 다른 비-코딩 서열을 포함한다. 이들 서열은 (예를 들면, 10 kb 이내) 유전자의 코딩 영역에 가까울 수 있거나 원위 부위에 있을 수 있고, 이들은 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다.
용어 "대립유전자"은 유전자의 변이체 형태를 지칭한다. 일부 유전자는, 염색체에서, 동일한 위치, 또는 유전적 유전자좌에 정위되는, 여러 가지의 상이한 형태를 갖는다. 2배체 유기체는 각각의 유전적 유전자좌에서 2 대립유전자를 갖는다. 각각의 쌍의 대립유전자는 특정 유전적 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 특정 유전자좌에서 2 동일한 대립유전자가 있으면 동형접합성으로서 그리고 2 대립유전자가 상이하면 이형접합성으로서 기재된다.
"프로모터"는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열용 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 II를 유도할 수 있는 TATA 박스를 일반적으로 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 미치는 다른 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 프로모터 서열은 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 세포 유형 (예를 들면, 진핵 세포, 비-인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 만능 세포, 1-세포기 배아, 분화된 세포, 또는 이의 조합)에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적으로 활성 프로모터, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터 (예를 들면, 발전적으로 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터 (예를 들면, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는, 예를 들어, 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입된, WO 2013/176772에서, 알아낼 수 있다.
유도성 프로모터의 예는, 예를 들어, 화학적으로 조절된 프로모터 및 물리적으로-조절된 프로모터를 포함한다. 화학적으로 조절된 프로모터는, 예를 들어, 알코올-조절된 프로모터 (예를 들면, 알코올 탈수소효소 (alcA) 유전자 프로모터), 테트라사이클린-조절된 프로모터 (예를 들면, 테트라사이클린-반응성 프로모터, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 (tetO), tet-On 프로모터, 또는 tet-Off 프로모터), 스테로이드 조절된 프로모터 (예를 들면, 랫트 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체의 프로모터, 또는 엑디손 수용체의 프로모터), 또는 금속-조절된 프로모터 (예를 들면, 메탈로단백질 프로모터)를 포함한다. 물리적으로 조절된 프로모터는, 예를 들어 온도-조절된 프로모터 (예를 들면, 열충격 프로모터) 및 광-조절된 프로모터 (예를 들면, 광-유도성 프로모터 또는 광-억제성 프로모터)를 포함한다.
조직-특이적 프로모터는, 예를 들어, 뉴런-특이적 프로모터, 신경교-특이적 프로모터, 근육 세포-특이적 프로모터, 심장 세포-특이적 프로모터, 신장 세포-특이적 프로모터, 뼈 세포-특이적 프로모터, 내피 세포-특이적 프로모터, 또는 면역 세포-특이적 프로모터 (예를 들면, B 세포 프로모터 또는 T 세포 프로모터)일 수 있다.
발전적으로 조절된 프로모터는, 예를 들어, 발생의 배아기 동안만, 또는 성인 세포에서만 활성인 프로모터를 포함한다.
"작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결된" 것은 양쪽 구성요소가 정상적으로 기능하는 그리고 구성요소의 적어도 하나가 다른 구성요소의 적어도 하나에 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하는 정도로 둘 이상의 구성요소 (예를 들면, 프로모터 및 또 다른 서열 요소)의 병치를 포함한다. 예를 들어, 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사의 수준을 제어하면 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 작동가능한 연결은 서로 연속이거나 트랜스로 작용하는 그와 같은 서열을 포함할 수 있다 (예를 들면, 조절 서열은 코딩 서열의 전사를 제어하기 위해 일정 거리에서 작용할 수 있다). 또 다른 예로서, 면역글로불린 가변 영역 (또는 V(D)J 분절)의 핵산 서열은 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 서열에 서열 사이 적절한 재조합을 허용하기 위해 면역글로불린 불변 영역의 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
핵산의 "상보성"은, 그것의 핵염기 그룹의 배향으로 인해, 핵산의 1 가닥내 뉴클레오타이드 서열이 대향하는 핵산 가닥에서 또 다른 서열과 수소 결합을 형성한다는 것을 의미한다. DNA에서 상보성 염기는 전형적으로 T와 A 및 G와 C이다. RNA에서, 이들은 전형적으로 G와 C 및 A와 U이다. 상보성은 완벽 또는 실질적/충분할 수 있다. 2 핵산 사이 완벽 상보성은 듀플렉스에서 모든 염기가 왓슨-크릭 짝짓기에 의해 상보성 염기에 결합되는 듀플렉스를 2 핵산이 형성할 수 있다는 것을 의미한다. "실질적" 또는 "충분한" 상보성은 1 가닥에서 서열이 대향하는 가닥에서 서열에 완전히 및/또는 완벽히 상보성이 아니라는 것, 그러나 충분한 결합이 하이브리드화 조건 (예를 들면, 염 농도 및 온도)의 세트에서 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 2 가닥상의 염기 사이 발생한다는 것을 의미한다. 그와 같은 조건은 하이브리드화된 가닥의 Tm (용융 온도)를 예상하기 위해 서열 및 표준 수학적 계산 이용에 의해, 또는 일상적인 방법을 사용함으로써 Tm의 경험적 결정에 의해 예상될 수 있다. Tm은 2 핵산 가닥 사이 형성된 하이브리드화 복합체의 모집단이 50% 변성되는 (즉, 이중-가닥 핵산 분자의 모집단이 단일 가닥으로 절반 해리되는) 온도를 포함한다. Tm 미만 온도에서, 하이브리드화 복합체의 형성은 양호하고, 반면에 Tm 초과 온도에서, 하이브리드화 복합체에서 가닥의 용융 또는 분리는 양호하다. Tm은, 다른 공지된 Tm 계산이 핵산 구조적 특징을 고려하여도, 예를 들면, Tm=81.5+0.41(% G+C)를 이용함으로써, 수성 1 M NaCl 용액에서 공지된 G+C 함량을 갖는 핵산에 대하여 추정될 수 있다.
"하이브리드화 조건"은 1 핵산 가닥이 제2 핵산 가닥에 상보성 가닥 상호작용 및 수소 결합에 의해 결합하여 하이브리드화 복합체를 생산하는 누적 환경을 포함한다. 그와 같은 조건은 핵산을 함유하는 수성 또는 유기 용액의 화학적 구성요소 및 그것의 농도 (예를 들면, 염, 킬레이트제, 포름아미드), 그리고 혼합물의 온도를 포함한다. 다른 인자, 예컨대 인큐베이션 시간의 기간 또는 반응 챔버 치수는 환경에 기여할 수 있다. 참고, 예를 들면, Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.sup.nd ed., pp. 1.90-1.91, 9.47-9.51, 1 1.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
하이브리드화는, 염기 사이 미스매치가 가능하여도, 2 핵산이 상보성 서열을 함유하는 것을 요구한다. 2 핵산 사이 하이브리드화에 적절한 조건은, 당해 분야에서 양호하게 공지된 변수인, 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 의존한다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이 상보성의 정도가 더 클수록, 그들 서열을 갖는 핵산의 하이브리드용 용융 온도 (Tm)의 값은 더 크다. 짧은 스트레치의 상보성 (예를 들면 35 이하, 30 이하, 25 이하, 22 이하, 20 이하, 또는 18 이하 뉴클레오타이드에 걸쳐 상보성)을 가진 핵산 사이 하이브리드화를 위하여 미스매치의 위치는 중요해진다 (참고 Sambrook 등(상동), 11.7-11.8). 전형적으로, 하이브리드화가능한 핵산용 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드이다. 실례가 되는 하이브리드화가능한 핵산용 최소 길이는 적어도 약 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 22개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개의 뉴클레오타이드, 및 적어도 약 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 게다가, 온도 및 세정액 염 농도는 인자 예컨대 상보성의 영역의 길이 및 상보성의 정도에 있어서 필요에 따라 조정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 서열은 특이적으로 하이브리드화가능해지기 위해 그것의 표적 핵산의 것에 100% 상보성일 필요는 없다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 개입하는 또는 인접한 분절이 하이브리드화 사건 (예를 들면, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 관여되지 않는 정도로 하나 이상의 분절에 걸쳐 하이브리드화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 (예를 들면, gRNA)는 이들이 표적되는 표적 핵산 서열 이내 표적에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 20개의 뉴클레오타이드의 18이 표적에 상보성이고, 따라서 특이적으로 하이브리드화할 gRNA는 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이 실시예에서, 잔존 비상보성 뉴클레오타이드는 상보성 뉴클레오타이드로 클러스터링 또는 산재될 수 있고 서로에 또는 상보성 뉴클레오타이드에 연속일 필요는 없다.
핵산 이내 핵산 서열의 특정 스트레치 사이 퍼센트 상보성은 하기를 이용하여 일상적으로 결정될 수 있다: 당해 분야에서 공지된 BLAST 프로그램 (기본 국부 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램 (Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Zhang 및 Madden (1997) Genome Res. 7:649-656) 또는 갭 프로그램 이용 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), 하기의 알고리즘을 사용하는, 디폴트 설정 이용: Smith and Waterman (Adv.Appl.Math., 1981, 2, 482-489).
본 명세서에서 제공된 방법 및 조성물은 여러 가지의 상이한 구성요소를 이용한다. 일부 구성요소가 활성 변이체 및 단편을 가질 수 있다는 것이 설명 전반에 걸쳐 인식된다. 그와 같은 구성요소는, 예를 들어, Cas9 단백질, CRISPR RNAs, tracrRNAs, 및 가이드 RNAs를 포함한다. 각각의 이들 구성요소에 대하여 생물학적 활성은 본 명세서에서 다른 곳에 기재된다.
2 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대 관련성으로 정렬된 경우 동일한 2 서열에서 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질에 관련하여 사용되는 경우 동일하지 않은 잔기 위치가 보존적 아미노산 치환에 의해 종종 상이하고, 여기에서 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예를 들면, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환되고 따라서 분자의 기능적 특성이 변화하지 않는다는 것이 인식된다. 서열이 보존적 치환에서 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 그와 같은 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 언급된다. 이러한 조정을 하기 위한 수단은 당해 분야의 숙련가에 널리 공지된다. 전형적으로, 이것은 전체 미스매치보다는 부분적으로서 보존적 치환 평점, 그렇게 함으로써 백분율 서열 동일성 증가를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산이 1의 스코어가 주어지고 비-보존적 치환이 0의 스코어가 주어지는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이 스코어가 주어진다. 보존적 치환의 평점은, 예를 들면, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)에서 시행된 바와 같이, 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 2 최적으로 정렬된 서열 비교에 의해 결정된 값을 포함하고, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 2 서열의 최적의 정렬을 위하여 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열에 비교된 경우 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 매칭된 위치의 수를 산출하기 위해 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 수 결정, 비교의 윈도우에서 위치의 총 수로 매칭된 위치의 수 나눗셈, 및 그 결과에 100 곱셈에 의해 계산되어 서열 동일성의 백분율을 산출한다.
달리 언급되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 하기 파라미터를 사용하는 갭 버전 10을 사용하여 수득된 값을 포함한다: 갭 중량 50 및 길이 중량 3, 및 nwsgapdna.cmp 평점 매트릭스를 사용하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 갭 중량 8 및 길이 중량 2, 및 BLOSUM62 평점 매트릭스를 사용하는 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 또는 이의 임의의 동등한 프로그램."동등한 프로그램"은, 문제의 임의의 2 서열에 대하여, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치를 갖는 정렬 그리고 갭 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬에 비교된 경우 동일한 퍼센트 서열 동일성을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
공유된 에피토프를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "실질적인 동일성"은 상응하는 위치에서 동일한 잔기를 함유하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 2 서열은 그것의 상응하는 잔기의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 초과가 잔기의 관련된 스트레치에 걸쳐 동일하면 실질적으로 동일한 것으로 간주될 수 있다. 관련된 스트레치는, 예를 들어, 완전한 서열일 수 있거나 적어도 5, 10, 15, 또는 초과 잔기일 수 있다.
용어 "보존적 아미노산 치환" 은 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산으로 서열에서 정상적으로 존재하는 아미노산의 치환을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 비-극성 (소수성) 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 또는 류신의 또 다른 비-극성 잔기로의 치환을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는 1 극성 (친수성) 잔기의 또 다른 것 예컨대 아르기닌과 리신, 글루타민과 아스파라긴, 또는 글리신과 세린으로의 치환을 포함한다. 추가적으로, 염기성 잔기 예컨대 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘의 또 다른 것으로의 치환, 또는 1 산성 잔기 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산의 또 다른 산성 잔기로의 치환은 보존적 치환의 추가의 예이다. 비-보존적 치환의 예는 비-극성 (소수성) 아미노산 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌의 극성 (친수성) 잔기 예컨대 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신으로 및/또는 극성 잔기의 비-극성 잔기로의 치환을 포함한다. 전형적인 아미노산 범주화는 아래 요약된다.
면역글로불린 핵산 서열과 관련하여 용어 "생식계열"은 자손에 통과될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
용어 "항원-결합 단백질"은 항원에 결합하는 임의의 단백질을 포함한다. 항원-결합 단백질의 예는 하기를 포함한다: 항체, 항체의 항원-결합 단편, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중-특이적 항체), scFV, 비스-scFV, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (이중 가변 도메인 항원-결합 단백질), SVD (단일 가변 도메인 항원-결합 단백질), 이중특이적 T-세포 인게이져 (BiTE), 또는 다비스바디 (미국 특허 번호 8,586,713, 모든 목적을 위하여 그 전체가 본 명세서에서 참고로 본 명세서에서 편입됨).
용어 "항원"은, 그 서브스턴스에 결합 특이성을 가진 항체의 생산을 이끌어낼 수 있는, 전체 분자 또는 분자 이내 도메인이든, 서브스턴스를 지칭한다. 용어 항원은 또한, 야생형 숙주 유기체가 자가-인식의 덕택으로 항체 생산을 유도하지 못하지만, 면역학적 내성을 파괴시키기 위해 적절한 유전적 공학기술로 숙주 동물에서 그와 같은 반응을 유도할 수 있는, 서브스턴스를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항원-결합 단백질 (예를 들면, 항체)가 결합하는 항원에서 부위를 지칭한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. (또한 선형 에피토프로서 공지된) 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 변성 용매에 노출시 전형적으로 유지되고 반면에 (또한 형태적 에피토프로서 공지된) 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리시 전형적으로 손실된다. 에피토프는 특유의 공간적 형태에서 전형적으로 적어도 3, 및 더 일반적으로, 적어도 5 또는 8-10 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 형태의 결정 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명을 포함한다. 참고, 예를 들면, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E.Morris, Ed. (1996), 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
항원 또는 에피토프와 함께 사용된 경우 용어 "자가"는 숙주 종에 의해 정상적으로 생합성되는, 또는 숙주 종이 정상적으로 노출되는 서브스턴스 중에서 포함됨의 덕택에 숙주 종의 야생형 구성원의 B-세포 수용체에 의해 인식되지 않거나 단지 저조하게 인식될 항원 또는 에피토프를 기재한다. 그와 같은 서브스턴스는 숙주 면역 시스템의 내성을 유도한다. 항원 또는 에피토프와 함께 사용된 경우 용어 "외래"는 자가-항원 또는 자가-에피토프가 아닌 항원 또는 에피토프를 기재한다. 외래 항원은 숙주 종에 의해 정상적으로 생산되지 않는 임의의 항원이다.
용어 "항체"는 4 폴리펩타이드 쇄, 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 2 중 (H) 쇄 및 2 경 (L) 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역 (CH)를 포함한다. 중쇄 불변 영역은 하기 3 도메인을 포함한다: CH1, CH2 및 CH3. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은, 더욱 보존되는 영역, 일명 프레임워크 영역 (FR)으로 산재된, 초가변성의 영역, 일명 상보성 결정 영역 (CDR)로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은, 하기 순서로 아미노-말단부터 카복시-말단까지 배열된, 3 CDRs 및 4 FRs를 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDRs는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로서 약칭될 수 있고; 경쇄 CDRs는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로서 약칭될 수 있다). 용어 "고 친화도" 항체는 약 10-9 M 이하 (예를 들면, 약 1×10-9 M, 1×10-10 M, 1×10-11 M, 또는 약 1×10-12 M)의 그것의 표적 에피토프에 관하여 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, KD 는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면, BIACORE™에 의해 측정되고; 또 다른 구현예에서, KD 는 ELISA에 의해 측정된다.
용어 "중쇄", 또는 "면역글로불린 중쇄"는, 임의의 유기체로부터, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 달리 명시되지 않는 한, 3 중쇄 CDRs 및 4 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDRs, CDRs 및 FRs, 및 이의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는, (N-말단부터 C-말단까지) 가변 도메인 이후, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능적 단편은 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 (예를 들면, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위에서 KD로 에피토프를 인식할 수 있는), 세포로부터 발현 및 분비할 수 있는, 그리고 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 생식계열에서 존재하는 VH, DH, 및 JH 분절의 레퍼토리로부터 유래된 VH, DH, 및 JH 분절을 일반적으로 포함하는, 가변 영역 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 다양한 유기체용 V, D, 및 J 중쇄 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은, URL "imgt.org"의 월드 와이드 웹 (www)에서 인터넷을 통해 접근가능한, IMGT 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
용어 "경쇄"는 임의의 유기체로부터 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한 인간 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄 및 VpreB, 뿐만 아니라 대리 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은, 달리 명시되지 않는 한, 3개의 경쇄 CDRs 및 4개의 프레임워크 (FR) 영역을 전형적으로 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는, 아미노 말단부터 카복실 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인, 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은, 생식계열에서 존재하는 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래된, 경쇄 VL 및 경쇄 JL 유전자 분절을 일반적으로 포함하는, 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 다양한 유기체용 경쇄 V 및 J 유전자 분절에 대한 서열, 위치 및 명명법은, URL "imgt.org"의 월드 와이드 웹 (www)에서 인터넷을 통해 접근가능한, IMGT 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 경쇄는, 예를 들면, 이들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 어느 한쪽 제1 또는 제2 에피토프를 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. 경쇄는 또한, 이들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 이상의 에피토프를 결합 및 인식하는, 또는 상기의 결합 및 인식으로 중쇄를 돕는 것을 포함한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 면역글로불린 분자 (예를 들면, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 2개의 프레임워크 영역 사이 정상적으로 (즉, 야생형 동물에서) 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어, 생식계열 서열 또는 재배열된 서열에 의해, 그리고, 예를 들어, 미접촉 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 인코딩될 수 있다. CDR은 체세포적으로 돌연변이될 수 있고 (예를 들면, 동물의 생식계열에서 인코딩된 서열로부터 다양할 수 있고), 인간화될 수 있고, 그리고/또는 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실로 변형될 수 있다. (예를 들면, CDR3에 대하여) 일부 상황에서, CDRs는, 예를 들면, 서열 스플라이싱 또는 연결 (예를 들면, 중쇄 CDR3"을 형성하기 위한 V-D-J 재조합의 결과로서, (예를 들면, 미재배열된 핵산 서열에서) 연속이 아니지만 B 세포 핵산 서열에서 연속인 둘 이상의 서열 (예를 들면, 생식계열 서열)에 의해 인코딩될 수 있다.
용어 "미재배열된"은 V 유전자 분절 및 J 유전자 분절 (중쇄에 대하여, 또한 D 유전자 분절)이 별도로 유지되지만 V(D)J 레퍼토리의 단일 V, (D), J를 포함하는 재배열된 V(D)J 유전자를 형성하기 위해 연결될 수 있는 면역글로불린 유전자좌의 상태를 포함한다.
용어 중쇄 가변 영역 유전자좌는 염색체, 예를 들면, 마우스 염색체에서 정위를 포함하고, 여기에서 야생형 중쇄 가변 (VH), 중쇄 다양성 (DH), 및 중쇄 연결 (JH) 영역 DNA 서열은 발견된다.
용어 카파 경쇄 가변 영역 유전자좌는 염색체, 예를 들면, 마우스 염색체에서 정위를 포함하고, 여기에서 야생형 κ 가변 (Vκ) 및 κ 연결 (Jκ) 영역 DNA 서열은 발견된다.
용어 람다 경쇄 가변 영역 유전자좌는 염색체, 예를 들면, 마우스 염색체에서 정위를 포함하고, 여기에서 야생형 λ 가변 (Vλ) 및 λ 연결 (Jλ) 영역 DNA 서열은 찾아진다.
"상동" 서열 (예를 들면, 핵산 서열)은, 예를 들어, 공지된 참조 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 정도로, 공지된 참조 서열에 어느 한쪽 동일한 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 상동 서열은, 예를 들어, 오쏘로그성 서열 및 파라로그성 서열을 포함할 수 있다. 상동 유전자는, 예를 들어, 공통 선구 DNA 서열로부터, 어느 한쪽 종 형성 사건 (오쏘로그성 유전자) 또는 유전적 중복 사건 (파라로그성 유전자)를 통해 전형적으로 내려간다. "오쏘로그성" 유전자는 공통 선구 유전자로부터 종 형성에 의해 진화하였던 상이한 종에서 유전자를 포함한다. 오쏘로그는 진화의 과정에서 동일한 기능을 전형적으로 유지한다. "파라로그성" 유전자는 게놈 이내 중복에 의해 관련된 유전자를 포함한다. 파라로그는 진화의 과정에서 신규한 기능을 발달시킬 수 있다.
용어 "시험관내"는 인공 환경 (예를 들면, 시험 튜브) 이내 발생하는 공정 또는 반응 그리고 인공 환경을 포함한다. 용어 "생체내"는 천연 환경 이내 발생하는 공정 또는 반응 그리고 천연 환경 (예를 들면, 세포 또는 유기체 또는 바디)를 포함한다. 용어 "생체외"는 개체의 바디로부터 제거된 세포 그리고 그와 같은 세포 이내 발생하는 공정 또는 반응을 포함한다.
용어 "하이브리드"는 상동 염색체 쌍에서 제1 및 제2 염색체 사이 하나 이상의 표적 게놈 유전자좌에서 하나 이상의 서열 변이를 갖는 (예를 들면, 대립유전자 변이를 갖는) 세포 또는 균주를 포함한다. 예를 들어, 하이브리드 세포는 2 유전적으로 비유사 부모 사이 (즉, 하나 이상의 유전자에서 상이한 부모 사이를 거쳐) 짝짓기의 자손으로부터 유래될 수 있다. 예로서, 하이브리드는 2 구별되는 근교 계통 (즉, 유전적 균질성을 위하여 교배된 계통) 교차에 의해 생성될 수 있다. 모든 인간은 하이브리드로 간주된다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 또는 "포괄하는" 조성물 또는 방법은 특이적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 또는 "포괄하는" 조성물은 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 조합으로 함유할 수 있다.
값의 범위의 지정은 그 범위 이내 또는 상기를 한정하는 모든 정수, 그리고 그 범위 이내 정수에 의해 정의된 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 분명하지 않는 한, 용어 "약"은 언급된 값의 측정의 표준 오차 한계 (예를 들면, SEM) 이내 값을 포괄한다.
관사 "한", "하나", 및 "그"의 단수 형태는 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "한 Cas9 단백질" 또는 "적어도 하나의 Cas9 단백질"은, 이의 혼합물을 포함하는, 복수의 Cas9 단백질을 포함할 수 있다.
통계적으로 유의미한 것은 p ≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개요
자가-항원과 에피토프를 공유하는 또는 자가-항원에 상동성인 관심의 외래 표적 항원 (예를 들면, 관심의 인간 표적 항원)에서 에피토프를 결합시키는 항원-결합 단백질 (예를 들면, 항체)의 생산을 위한 조성물 및 개선된 방법이 본 명세서에서 제공된다. 그와 같은 방법은 단일 표적 게놈 유전자좌 이내 상이한 부위에 짝짓기된 이중-가닥 절단을 창출하기 위해 둘 이상의 가이드 RNAs (gRNAs)를 이용함으로써 (임의로 그것의 생식계열에서 인간화된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌를 포함하는) 비-인간 동물 예컨대 설치류 (예를 들면, 마우스 또는 랫트)에서 외래 항원의 내성을 감소시키는 것을 포함한다. 임의로, 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 세포는 하이브리드 세포이고, 방법은 표적 영역이 표적 게놈 유전자좌의 나머지의 전부 또는 일부에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 더 높은 정도를 갖도록 표적화된 유전적 변형을 받기 위해 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 그와 같은 짝짓기된 이중-가닥 절단은 자가-항원의 발현을 감소 또는 제거시키기 위해 또는 외래 항원과 공유되는 자가-항원으로부터 에피토프의 발현을 감소 또는 제거시키기 위해 자가-항원의 발현에 영향을 준다. 인간화된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 포함하는 및 또한 표적 게놈 유전자좌에서 그와 같은 돌연변이를 갖는 그와 같은 유전적으로 변형된 비-인간 동물은 그 다음 외래 항원으로 면역화될 수 있고, 비-인간 동물은 외래 항원에 면역 반응을 생산하는 비-인간 동물에 충분한 조건 하에서 유지될 수 있고, 외래 항원을 결합시키는 항원-결합 단백질은 비-인간 동물 또는 비-인간 동물로부터 세포로부터 수득될 수 있다.
인간 항원에 대한 항체 생산에 사용된 마우스, 예컨대 그것의 생식계열에서 인간화된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스는 다른 마우스 균주에 비교된 항체의 다양한 레퍼토리 생산용 BALB/c 균주의 증가된 수용력으로 인해 BALB/c를 포함하는 균주의 조합으로부터 전형적으로 유래된다. 하지만, 마우스에서 표적화된 유전적 변형을 생성하는데 전형적으로 사용된 배아 줄기 (ES) 세포 (예를 들면, 본 명세서에서 기재된 F1H4 (VGF1) 세포)에 비교하여, 항체-생산 마우스의 그와 같은 균주로부터 유래된 ES 세포는 배양에서 표적화됨 및/또는 표적화된 유전적 변형을 갖는 F0 세대 마우스 생산 그리고 생식계열을 통해 표적화된 변형 수송을 위하여 감소된 수용력을 전형적으로 갖는다. 결과적으로, 내성을 극복하기 위한 표적 녹아웃 마우스를 생성시키는 종래의 방법은 관심의 상기 표적에 무효 대립유전자에 동형접합성인 그리고 약 15-16 개월 걸리는 면역화를 위하여 준비된 마우스 전달의 전체 과정과, 교배 및/또는 연속 표적화의 여러 라운드를 포함한다.
본 명세서에서 기재된 방법은 유익하게는 이 시간을 대략 4 내지 5 개월로 감소시킨다 (그리고 관심의 상기 표적에서 무효 대립유전자에 동형접합성인 마우스 새끼는 ~ 3 개월 지나 전달될 수 있다). 단시간 프레임에 더하여, 본 명세서에서 기재된 방법은 동형접합성 변형을 생성하기 위해 요구된 전기천공의 라운드의 수를 감소시키고, 필요한 배양에서 통로의 수 및 시간을 감소시키고, 필요한 세포의 수를 감소시키고, 요구 및 스크리닝 따라서 간소화되지 않는 표적화 벡터로 인해 공정을 능률화시킨다. 본 명세서에서 기재된 방법은 유익하게는 자가-항원의 발현이 폐지되지 않는 마우스에 비교하여 중쇄 및 경쇄 V 유전자 분절의 증가된 용법으로 인해 관심의 외래 항원으로 면역화 이후 항체의 증가된 다양성을 초래한다. 게다가, 본 명세서에서 기재된 방법은 상응하는 자가-항원과 교차-반응하는 항체 (즉, 자가-항원과 관심의 외래 항원 사이 중첩하는 에피토프를 결합시키는 항체)의 생산으로 인해 관심의 외래 항원으로 면역화 이후 에피토프의 더 큰 다양성에 대해 생산된 항체를 초래하고, 그렇게 함으로써 관심의 외래 항원에 대한 항체의 더 큰 풀의 생산을 가능하게 한다.
II. 내성을 파괴하기 위한 표적 게놈 유전자좌의 변형 방법
그것의 생식계열에서 인간화된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 마우스 또는 랫트)의 "비-자가" 단백질로의 면역화는 특정 항원-결합 단백질 예컨대 단클론성 항체를 수득하기 위해 통상적으로 사용된 방법이다. 면역화 접근법은 생체내 성숙되고 있는 고-친화도 항원-결합 단백질을 제공하기 위한 잠재력을 갖고 양쪽 비용-효율적 및 시간-효과적일 수 있기 때문에 매력적이다. 이러한 접근법은, 하지만, 비-인간 동물내 원상태 단백질과 면역원을 비-자가 (즉, 외래)로서 인식하도록 비-인간 동물의 면역 시스템을 가능하게 하기 위해 면역화되는 단백질 사이 서열에서 발산에 의존적이다.
B 세포 수용체는 유전자 분절 (예를 들면, V, D, 및 J)의 정렬된 배열로부터 일련의 재조합 사건을 통해 조립되고, 유전자 분절의 이러한 어셈블리는 부정확한 것으로 공지되고, 자가-항원을 포함하는, 다양한 항원에 대하여 친화도를 갖는 수용체를 생성한다. 자가-분자를 결합시키는 B 세포 수용체를 생성하기 위한 이러한 수용력에도 불구하고, 면역 시스템은 그와 같은 자기-반응성 B 세포 수용체의 발달 및 팽창을 피하기 위한 그리고 비-자가로부터 자가를 식별하기 위한 그렇게 함으로써 자가면역을 예방하는 몇 개의 자가-내성 기전이 구비된다. 참고, 예를 들면, Shlomchik (2008) Immunity 28:18-28 및 Kumar 및 Mohan (2008) 40(3): 208-23, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 따라서, 비-인간 동물의 자가-항원으로 고도의 상동성 (예를 들면, 구조적 상동성 또는 서열 상동성)을 갖는 인간 항원에 대한 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 갖는 비-인간 동물에서 인간 항체의 생성은 면역학적 내성으로 인해 어려운 과제일 수 있다. 단백질의 기능적으로 중요한 영역이 종을 거쳐 보존되는 경향이 있기 때문에, 자가-항원에 면역학적 내성은 이들 핵심 에피토프에 항체의 생성에 종종 도전한다. 고도로 유사한 또는 "상동성"인 외래 (예를 들면, 인간) 항원으로 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 마우스 또는 랫트)의 면역화는 약한 또는 비-실재 항체 반응을 수득하고, 따라서, 그와 같은 인간 항원에 지향된 결합으로 항원-결합 단백질 (예를 들면, 항체)를 수득하는 것에 문제가 된다. 예로서, 내인성 단백질 (자가-항원) 및 외래 표적 항원에 의해 공유된 서열 동일성의 양은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있고, 이로써 면역 시스템은 표적 항원을 외래로서 인식하지 않는다. 예를 들어, 비-인간 동물에서 자가-항원과 외래 항원 사이 공유된 에피토프는 면역학적 내성이 외래 항원에 대한 중화 항체를 발현시키는 B 세포를 고갈 및/또는 삭제시키기 때문에 비-인간 동물에서 외래 항원에 대한 효과적인 면역 반응 실장을 문제가 되게 할 수 있다. 이러한 내성을 극복하기 위해 그리고 비-인간 동물에서 자가-항원 또는 이의 동족체 (예를 들면, 인간 동족체)를 결합시키는 단클론성 항체를 수득하기 위해, 특정 유전적으로 변형된 또는 녹아웃 비-인간 동물은 상당한 상동성을 공유하는 및/또는 면역화에 사용되는 항원을 인코딩하는 그것의 인간 대응물 유전자로 고도로 보존되는 비-인간 동물 단백질을 인코딩하는 유전자 (또는 공유된 관심의 에피토프)를 제거하기 위해 생성될 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,119,248, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물 생성은, 하지만, 양쪽 고비용이고 시간 소모성일 수 있다.
내성을 극복하기 위해 표적 녹아웃 마우스를 생성시키는 종래의 방법은 교배 및/또는 연속 표적화의 여러 라운드를 포함한다. 인간 항원에 대한 항체 생산에 사용된 마우스, 예컨대 그것의 생식계열에서 인간화된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스 (예를 들면, 양쪽 IgH 및 Igκ 유전자좌에서 동형접합성 인간화되는, VELOCIMMUNE® 마우스)는 전형적으로 다른 마우스 균주에 비교된 항체의 다양한 레퍼토리 생산용 BALB/c 균주의 증가된 수용력으로 인해 BALB/c를 포함하는 균주의 조합으로부터 유래된다. 하지만, 마우스에서 표적화된 유전적 변형을 생성하는데 전형적으로 사용된 배아 줄기 (ES) 세포 (예를 들면, 50% 129SvS6 균주 및 50% C57BL/6N 균주로 구성되는 본 명세서에서 기재된 F1H4 (VGF1) 세포)에 비교하여, 항체-생산 마우스의 그와 같은 균주로부터 유래된 ES 세포는 전형적으로 배양에서 표적화됨 및/또는 표적화된 유전적 변형을 갖는 F0 세대 마우스 생산 및 생식계열을 통한 표적화된 변형 수송에 대하여 감소된 수용력을 갖는다. 따라서, 항체-생산 마우스 예컨대 VELOCIMMUNE® 마우스에서 면역학적 내성을 파괴하기 위한 전통적 접근법은 생식계열을 통해 표적화된 변형의 표적화 및 수송에 더욱 수용적인 ES 세포주 (예를 들면, F1H4)에서 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 제1 표적화를 포함한다. 그와 같은 접근법에서, 큰 표적화 벡터 (LTVECs)는 설계되고, 녹아웃 (무효) 대립유전자는 F1H4 ES 세포에서 창출되고, 관심의 상기 표적에서 이형접합성 녹아웃 돌연변이를 갖는 F0 마우스는 생성된다 (5 개월의 전형적인 기간). VELOCIMMUNE® 마우스는 그 다음 관심의 상기 표적에서 이형접합성 녹아웃 돌연변이를 갖는 F0 마우스에 교배된다. 면역화에 적합한 (관심의 상기 표적에 대하여 동형접합성 무효 그리고 양쪽 IgH 및 Igκ에서 동형접합성 인간화된) 삼중 동형접합성 마우스를 생성하기 위해, 2 초과 세대의 교배가 요구된다. 전체 공정은 대략 15 내지 16 개월이 걸리고 (참고, 예를 들면, 도 1) 아래 기재된 연속 표적화 접근법보다 더 효과적이다 (참고, 예를 들면, 도 2).
대안적으로, 큰 표적화 벡터 (LTVEC)는 설계 및 작제될 수 있고 그 다음 표적 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자에서 이형접합성 변형을 생성하기 위해 항체-생산 마우스 (예를 들면, VELOCIMMUNE® 마우스 또는 기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스 ("VI-3 마우스"))로부터 유래된 배아 줄기 (ES) 세포에 전기천공될 수 있다. 제2 라운드의 표적화는 그 다음 동형접합성 변형을 생성하기 위해 착수된다. 상기 기재된 교배 접근법보다 시간이 덜 걸려도, 이러한 공정은, 표적 항원으로 면역화를 위하여 준비된 F0 마우스를 창출하기 위해 대략 9 내지 10 개월 걸리는, 여전히 시간-소모성일 수 있다 (참고, 예를 들면, 도 2). 게다가, 그와 같은 방법은 여러 라운드의 전기천공 및 더 많은 통로로 더 오랜 배양 시간을 요구하고, 이들 모두는 항원-결합 단백질 생성용 F0 마우스를 생성하기 위해 감소된 만능분화능 및 감소된 능력을 초래한다. 참고, 예를 들면, Buehr 등 (2008) Cell 135:1287-1298; Li 등 (2008) Cell 135(7): 1299-1310; 및 Liu 등 (1997) Dev. Dyn. 209:85-91, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
본 명세서에서 기재된 방법은 유익하게는 이러한 시간을 대략 4 내지 5 개월로 감소시킨다 (참고, 예를 들면, 도 3; 관심의 상기 표적에서 무효 대립유전자에 동형접합성인 마우스 새끼는 ~ 3 개월 지나서 전달될 수 있지만 그 다음 면역화에 앞서 4-5 주 동안 노화된다). 단시간 프레임에 더하여, 본 명세서에서 기재된 방법은 동형접합성 변형을 생성하기 위해 요구된 전기천공의 라운드의 수를 감소시키고, 통로의 수 및 필요한 배양에서 시간을 감소시키고, 필요한 세포의 수를 감소시킨다. 스크리닝은, 예를 들어, 대립유전자 프로브의 이득이 필요하고, 카피 수 보정이 필요없기 때문에 더욱 단순하고 유선형이다. 본 명세서에서 기재된 방법은 자가-항원의 발현이 폐지되지 않는 마우스에 비교된 중쇄 및 경쇄 V 유전자 분절의 증가된 용법으로 인해 관심의 외래 항원으로 면역화 이후 항체의 증가된 다양성을 또한 초래한다. 게다가, 본 명세서에서 기재된 방법은 상응하는 자가-항원과 교차-반응하는 항체 (즉, 자가-항원과 관심의 외래 항원 사이 중첩하는 에피토프를 결합시키는 항체)의 생산으로 인해 관심의 외래 항원으로 면역화 이후 에피토프의 더 큰 다양성에 대해 생산된 항체를 초래할 수 있고, 그렇게 함으로써 관심의 외래 항원에 대한 항체의 더 큰 풀의 생산을 가능하게 한다.
내성을 파괴하기 위해 표적 게놈 유전자좌의 다양한 변형 방법이 본 명세서에서 제공된다. 상기 방법은 생체외 또는 생체내 발생할 수 있고, 이들은 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원의 발현에 영향을 주는 단일 표적 게놈 유전자좌 이내 상이한 영역을 표적하고 Cas 단백질과 둘 이상의 복합체를 형성하고 표적 핵산을 절단시키는 둘 이상의 가이드 RNAs (예를 들면, 2 gRNAs, 3 가이드 RNAs, 또는 4 가이드 RNAs)를 이용할 수 있다. 둘 이상의 가이드 RNAs는 어느 한쪽 단독으로 또는 외인성 수복 템플레이트와 조합으로 사용될 수 있고, 단, 세포가 1-세포기 배아이면, 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 미만일 수 있다. 그와 같은 방법은 표적 유전자좌에서 이중대립유전자 유전적 변형의 창출을 촉진시키고 게놈 붕괴 또는 다른 표적화된 변형 예컨대 게놈 이내 핵산 서열의 동시 결실 및 외인성 핵산 서열로 대체를 포함할 수 있다. 낮은 빈도에서 이중대립유전자 변형을 생산하는, 1 gRNA로 표적화에 비교하여, 둘 이상의 gRNAs로 표적화는 상당히 증가된 속도에서 이중대립유전자 변형 (예를 들면, 동종접합성으로 표적화된 세포, 동종접합성으로 결실된 세포, 및 반접합성으로 표적화된 세포를 포함하는 화합물 이종접합성으로 표적화된 세포)의 창출을 초래한다.
이중-가닥 절단 (DSBs)에 반응하여 수복은 주로 2 보존된 DNA 수복 경로: 비-상동 말단 연결 (NHEJ) 및 상동 재조합 (HR)을 통해 발생한다. 참고 Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. NHEJ는 상동 템플레이트에 대한 필요성 없이 외인성 서열에 또는 서로에 절단 말단의 직접적인 결찰에 의해 핵산에서 이중-가닥 절단의 수복을 포함한다. NHEJ에 의한 비-연속 서열의 결찰은 이중-가닥 절단의 부위 근처 결실, 삽입, 또는 전좌를 종종 초래할 수 있다.
외인성 수복 템플레이트에 의해 매개된 상기 표적 핵산 의 수복은 2 폴리뉴클레오타이드 사이 유전적 정보의 교환의 임의의 공정을 포함할 수 있다. 예를 들어, NHEJ는 외인성 수복 템플레이트의 말단과 절단 말단의 직접적인 결찰 (즉, NHEJ-기반된 포착)을 통해 외인성 수복 템플레이트의 표적화된 통합을 또한 초래할 수 있다. 그와 같은 NHEJ-매개된 표적화된 통합은 상동성 지향된 수복 (HDR) 경로가 (예를 들면, 비-분할 세포, 1차 세포, 및 상동성-기반된 DNA 수복을 저조하게 수행하는 세포에서) 쉽게 사용가능하지 않은 경우 외인성 수복 템플레이트의 삽입에 바람직할 수 있다. 게다가, 상동성-지향된 수복에 대조적으로, (Cas-매개된 절단에 의해 창출된 돌출부를 넘어서) 절단 부위를 측접하는 서열 동일성의 큰 영역에 관한 지식은 필요없고, 이는 게놈 서열의 제한된 지식이 있는 게놈을 갖는 유기체에 표적화된 삽입을 시도하는 경우 유익할 수 있다. 통합은 외인성 수복 템플레이트와 절단된 게놈 서열 사이 평활 말단의 결찰을 통해, 또는 절단된 게놈 서열에서 Cas 단백질에 의해 생성된 것과 양립가능한 돌출부에 의해 측접되는 외인성 수복 템플레이트를 사용하는 (즉, 5' 또는 3' 돌출부를 갖는) 점성 말단의 결찰을 통해 진행할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290, 및 Maresca 등 (2013) Genome Res. 23(3): 539-546, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 평활 말단이 결찰되면, 표적 및/또는 공여체 절제는, 표적 서열에서 원치않는 변경을 창출할 수 있는, 단편 연결에 필요한 마이크로상동성의 생성 영역에 필요해질 수 있다.
수복은 상동성 지향된 수복 (HDR) 또는 상동 재조합 (HR)을 통해 또한 발생할 수 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 요구할 수 있는 핵산 수복의 형태를 포함하고, "표적" 분자 (즉, 이중-가닥 절단을 경험하였던 것)의 수복용 템플레이트로서 "공여체" 분자를 사용하고, 공여체부터 표적까지 유전적 정보의 전달을 유발시킨다. 임의의 특정 이론에 구속됨의 바램 없이, 그와 같은 전달은 파손된 표적과 공여체 사이 형성하는 이형이중나선 DNA의 미스매치 정정, 및/또는 합성-의존적 가닥 어닐링, 여기에서 공여체는 표적의 일부가 될 유전적 정보를 합성하는데 사용된다, 및/또는 관련된 공정을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 한 부분, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 한 카피, 또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 한 카피의 한 부분은 표적 DNA에 통합한다. 참고 Wang 등 (2013) Cell 153:910-918; Mandalos 등 (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang 등 (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
관심의 외래 표적 항원의 감소된 내성을 가진 비-인간 동물을 제조하기 위해, 관심의 외래 항원과 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원의 발현에 영향을 주는 하나 이상의 표적 게놈 유전자좌는 자가-항원의 발현을 감소시키기 위해 표적화될 수 있다. 바람직하게는, 자가-항원의 발현은 제거된다. 자가-항원의 발현은 자가-항원이 더 이상 발현되지 않으면 제거되는 것으로 간주된다 (예를 들면, 자가-항원이 단백질이면, 단백질이 더 이상 발현되지 않거나, 또는 자가-항원이 단백질에서 특정 에피토프이면, 그 에피토프를 포함하는 단백질이 더 이상 발현되지 않는다).
일 예에서, 1-세포기 배아 (예를 들면, 배아 줄기 (ES) 세포)가 아닌 비-인간 동물 만능 세포의 게놈은 Cas 단백질, 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 및 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA와 접촉될 수 있다. 또 다른 예에서, 비-인간 동물 1-세포기 배아의 게놈은 Cas 단백질, 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 및 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA와 접촉될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 일부 방법에서, 표적화될 세포는 본 명세서에서 다른 곳에 정의된 바와 같은 하이브리드 세포이다. 그와 같은 방법은 또한 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같은 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절 또는 표적 게놈 유전자좌의 나머지에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 높은 백분율을 갖도록 선택될 수 있다. 예로서, 표적 영역 선택은 표적 게놈 유전자좌 이내 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 서열을 비교하는 것, 그리고 표적 게놈 유전자좌의 나머지의 전부 또는 일부에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는 표적 영역을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 다른 곳에 더 상세히 기재된 바와 같은 표적 영역의 선택 방법.
임의로, 게놈은 표적 게놈 유전자좌 이내 (또는 자가-항원의 발현에 영향을 주는 또는 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제2 자가-항원의 발현에 영향을 주는 제2 표적 게놈 유전자좌 이내) 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 추가의 가이드 RNAs, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 제3 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA 또는 표적 게놈 유전자좌 이내 제4 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA 및 제4 가이드 RNA와 추가로 접촉될 수 있다. 접촉은 본 명세서에서 다른 곳에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이 임의의 수단으로 그리고 임의의 형태로 세포에 Cas 단백질 및 가이드 RNAs를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 가이드 RNAs는 Cas 단백질과 복합체를 형성하고 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열에 이것을 유도하고, 여기에서 Cas 단백질은 가이드 RNA 인식 서열 이내 Cas 단백질 절단 부위에서 표적 게놈 유전자좌를 절단시킨다. Cas 단백질에 의한 절단은 (예를 들면, Cas 단백질이 니카제이면) 이중-가닥 절단 또는 단일-가닥 절단을 창출할 수 있다. 방법에서 사용될 수 있는 Cas 단백질 및 가이드 RNAs의 예 및 변이는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된다. 표적 게놈 유전자좌에서 Cas 단백질에 의한 절단은 자가-항원의 발현을 감소시키는 이중대립유전자 변형을 생산하기 위해 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 표적 게놈 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
관심의 외래 항원은 항원-결합 단백질이 바람직한 임의의 외래 항원일 수 있다. 예를 들어, 관심의 외래 항원은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 포유류 단백질, 유인원 단백질, 갯과 단백질, 고양이 단백질, 말 단백질, 소 단백질, 설치류 단백질 (예를 들면, 랫트 또는 마우스), 또는 인간 단백질의 전부 또는 일부를 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 예를 들어, 관심의 외래 항원은 하나 이상의 돌연변이 또는 변이를 가진 인간 단백질을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 관심의 외래 항원 및 자가-항원은 상동성일 수 있다. 예를 들어, 관심의 외래 항원 및 자가-항원은 오쏘로그성 또는 파라로그성일 수 있다. 대안적으로 또는 게다가, 관심의 외래 항원 및 자가-항원은 공유된 에피토프를 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 공유된 에피토프는 상동 단백질 사이 존재할 수 있거나, 또는 상동성이 아닌 비유사 단백질 사이 존재할 수 있다. 어느 한쪽 에피토프의 형태적 맞춤화 (예를 들면, 1차 서열 상동성의 부재 하에서조차 유사한 항원성 표면) 및/또는 선형 아미노산 서열은 공유될 수 있다. 예를 들어, 공유된 에피토프는 실질적으로 동일한 에피토프를 포함한다. 에피토프가 2 항원 사이 공유되면, 제1 항원에서 에피토프에 대한 항체는 전형적으로 또한 제2 항원에서 에피토프를 결합시킬 것이다.
접촉은 외인성 수복 템플레이트의 부재 하에서 또는 표적화된 유전적 변형을 생성하기 위해 표적 게놈 유전자좌 이내 재조합하는 외인성 수복 템플레이트의 존재 하에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 세포는 1-세포기 배아일 수 있고, 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 미만일 수 있다. 외인성 수복 템플레이트의 예는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된다.
그와 같은 일부 방법에서, 외인성 수복 템플레이트에 의한 표적 핵산의 수복은 상동성-지향된 수복 (HDR)을 통해 발생한다. 상동성-지향된 수복은, Cas 단백질이 이중-가닥 절단을 창출하기 위해 표적 게놈 유전자좌에서 DNA의 양쪽 가닥을 절단하는 경우, Cas 단백질이 단일-가닥 절단을 창출하기 위해 표적 게놈 유전자좌에서 DNA의 1 가닥을 절단시키는 니카제인 경우, 또는 짝짓기된 Cas 니카제가 2 상쇄 닉에 의해 형성된 이중-가닥 절단을 창출하는데 사용되는 경우 발생할 수 있다. 그와 같은 방법에서, 외인성 수복 템플레이트는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 및 3' 표적 서열에 상응하는 5' 및 3' 상동성 아암을 포함한다. 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위는 5' 표적 서열에 인접, 3' 표적 서열에 인접, 양쪽 5' 표적 서열 및 3' 표적 서열에 인접할 수 있거나, 5' 표적 서열도 3' 표적 서열도 인접하지 않을 수 있다. 서로에 인접하는 서열은 서로의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내 서열을 포함한다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트는 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 추가로 포함할 수 있고, 상기 핵산 삽입물은 5' 및 3' 표적 서열 사이 삽입된다. 핵산 삽입물이 존재하지 않으면, 외인성 수복 템플레이트는 5' 및 3' 표적 서열 사이 게놈 서열을 삭제시키는 기능을 할 수 있다.
대안적으로, 외인성 수복 템플레이트에 의한 표적 핵산의 수복은 비-상동 말단 연결 (NHEJ)-매개된 결찰에 의해 발생할 수 있다. 그와 같은 방법에서, 외인성 수복 템플레이트의 적어도 하나의 말단은 표적 게놈 유전자좌에서 Cas-매개된 절단에 의해 창출된 적어도 하나의 돌출부에 상보성인 짧은 단일-가닥 영역을 포함한다. 외인성 수복 템플레이트에서 상보성 말단은 핵산 삽입물을 측접할 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트의 각각의 말단은 표적 게놈 유전자좌에서 Cas-매개된 절단에 의해 창출된 돌출부에 상보성인 짧은 단일-가닥 영역을 포함할 수 있고, 외인성 수복 템플레이트에서 이들 상보성 영역은 핵산 삽입물을 측접할 수 있다. 돌출부 (즉, 엇갈린 말단)은 Cas-매개된 절단에 의해 창출된 이중-가닥 절단의 평활 말단의 절제에 의해 창출될 수 있다. 그와 같은 절제는 단편 연결에 필요한 마이크로상동성의 영역을 생성시킬 수 있지만, 이것은 표적 핵산에서 원치않는 또는 통제불가능한 변경을 창출할 수 있다. 대안적으로, 그와 같은 돌출부는 짝짓기된 Cas 니카제 사용에 의해 창출될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질이 니카제이면, 표적 게놈 유전자좌는 DNA의 반대편 가닥을 표적하는 제1 및 제2 가이드 RNAs와 접촉될 수 있고, 그것에 의하여 게놈은 이중 니킹을 통해 변형된다. 이것은 표적 게놈 유전자좌 이내 상이한 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 2 가이드 RNAs와 표적 게놈 유전자좌 접촉에 의해 달성될 수 있다. 2 가이드 RNAs는 Cas 니카제와 2 복합체를 형성하고, Cas 니카제는 가이드 RNA 인식 서열의 하나 이내 표적 게놈 유전자좌의 제1 가닥을 니킹하고 다른 가이드 RNA 인식 서열 이내 표적 게놈 유전자좌의 제2 가닥을 니킹한다. 외인성 수복 템플레이트는 그 다음 표적 게놈 유전자좌와 재조합하여 표적화된 유전적 변형을 생성한다.
일부 방법에서, 핵산 삽입물은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부에 상동성 또는 오쏘로그성인 서열을 포함한다. 이것은, 예를 들어, 자가-항원의 녹아웃이 배아 치사를 초래할 수 있는 경우, 유용할 수 있다. 핵산 삽입물은 본 명세서에서 기재된 임의의 형태 (예를 들면, 표적화 벡터, LTVEC, ssODN, 및 기타 등등)으로 외인성 수복 템플레이트내일 수 있고, 핵산 삽입물은 선택 카셋트 (예를 들면, 자가-결실 선택 카셋트)를 추가로 포함할 수 있거나 선택 카셋트가 부족할 수 있다. 그와 같은 방법에서, 예를 들어, 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부는 결실될 수 있고 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열로 대체될 수 있다. 예를 들어, 자가-항원을 인코딩하는 모든 유전자는 결실될 수 있고 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열로 대체될 수 있거나, 또는 자가-항원의 특정 모티프 또는 영역을 인코딩하는 유전자의 한 부분은 결실될 수 있고 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열로 대체될 수 있다. 임의로, 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열은 또 다른 종으로부터일 수 있다. 예를 들어, 자가-항원이 마우스 항원이면, 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열은, 예를 들어, 상동성 또는 오쏘로그성 랫트, 햄스터, 고양이, 개, 거북, 여우원숭이, 또는 인간 서열일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상동성 또는 오쏘로그성 서열은 대체될 서열과 비교된 하나 이상의 점 돌연변이 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 초과)를 포함할 수 있다. 그와 같은 점 돌연변이는, 예를 들어, 자가-항원에서 하나 이상의 에피토프의 발현을 제거하는 기능을 할 수 있다. 그와 같은 에피토프는 관심의 외래 항원과 공유되는 에피토프일 수 있다. 임의로, 그와 같은 점 돌연변이는 인코딩된 폴리펩타이드에서 보존적 아미노산 치환 (예를 들면, 아스파르트산 [Asp, D]의 글루탐산 [Glu, E]로의 치환)을 초래할 수 있다. 그와 같은 아미노산 치환은 야생형 자가-항원의 기능을 유지하지만 관심의 외래 항원에서 존재하는 그리고 야생형 자가-항원과 공유되는 에피토프가 부족한 자가-항원의 발현을 초래할 수 있다. 마찬가지로, 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 결실 및 관심의 외래 항원과 자가-항원 사이 공유되는 에피토프가 부족한 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열로의 대체는 관심의 외래 항원에서 존재하고 야생형 자가-항원과 공유되는 에피토프가 부족하지만 야생형 자가-항원의 기능을 유지하는 자가-항원의 동족체 또는 오쏘로그의 발현을 초래할 수 있다. 그들 에피토프에 대한 항원-결합 단백질은 그 다음 생성될 수 있다.
변형된 비-인간 동물 만능 세포는 그 다음 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 방법을 사용하여 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 비-인간 동물 만능 세포는 숙주 배아에 도입될 수 있고, 숙주 배아는 자가-항원의 발현이 감소 또는 제거되도록 표적 게놈 유전자좌가 이중대립유전자 변형을 갖기 위해 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 대리모에 이식될 수 있다. 1-세포기 배아의 경우에서, 유전적으로 변형된 배아는 선택될 수 있고 그 다음 자가-항원의 발현이 감소 또는 제거되도록 표적 게놈 유전자좌가 이중대립유전자 변형을 갖기 위해 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되는 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 대리모에 이식될 수 있다. F0 세대 비-인간 동물은 그 다음 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 방법을 사용하여 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다.
A. 표적 영역 선택
외인성 수복 템플레이트 (예를 들면, 표적화 벡터)와 표적 게놈 유전자좌 사이 상동성 재조합에 의한 표적화된 유전자 변형은 설치류 배아 줄기 세포 이외의 세포 유형에서 특히, 매우 비효율적일 수 있다. CRISPR/Cas9-지향된 절단에 의한 하나 이상의 이중 가닥 DNA 절단의 유도는 외인성 수복 템플레이트 (예를 들면, 표적화 벡터)와 표적 게놈 유전자좌 사이 상동성 재조합 (HR)에 의해 동형접합성 유전자 표적화를 촉진시킬 수 있다. CRISPR/Cas9는 또한 비-상동 말단-연결 (NHEJ) 수복 기전에 의한 동형접합성 삽입 또는 결실 돌연변이 (즉, 동일한 이중대립유전자 변경)을 촉진시킬 수 있다. 매우 큰 인간화를 포함하는 유전자 변형을 위하여, 단일 표적 게놈 유전자좌를 표적하는 2 가이드 RNAs에 의해 유도된 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템과 표적화 벡터의 조합은 1 가이드 RNA로 달성하였던 표적화 효율을 추가로 향상시킬 수 있다. 낮은 빈도 또는 전혀 없는 이중대립유전자 변형을 생산하는, 1 가이드 RNA로 표적화에 비교하여, 2 가이드 RNAs로 표적화는 상당히 증가하는 속도에서 동종접합성으로 표적화된 세포, 동종접합성으로 결실된 세포, 및 (반접합성으로 표적화된 세포를 포함하는) 화합물 이종접합성으로 표적화된 세포의 창출을 초래한다. 일부 게놈 유전자좌에서, 하지만, 동종접합성으로 표적화된 세포 또는 동종접합성으로 결실된 세포 수득은 여전히 어려울 수 있다.
사실상 모두의 그것의 게놈 유전자좌에서 동형접합성인, 실험실 설정에서 전형적으로 사용된 근친교배한 마우스 및 랫트 균주와 달리, 하이브리드 세포에서 (예를 들면, 모든 인간에서) 표적 게놈 유전자좌에 2 대립유전자의 서열은 전형적으로 100% 동일하지 않을 것이다. 하지만, 본 명세서에서 제공된 실시예에서 실증된 바와 같이, 초기 CRISPR/Cas9-유도된 변형이 HR 또는 NHEJ에 의해 생산되었든 아니든, 동형접합성 게놈 변경의 빈도는 표적 게놈 유전자좌의 2 대립유전자 사이 서열 유사성의 정도에 좌우된다. 이러한 관찰은 CRISPR/Cas9-유도된 동형접합성 유전자 변형이 상동성-의존적 현상이라는 것을 암시한다. 이것의 뒷받침에서, CRISPR/Cas9-유도된 동형접합성 변형은, 본 명세서에서 실시예에서 실증된 바와 같이, 동일한 염색체에서 표적 게놈 유전자좌에 연결된 대립유전자 서열 및 구조적 변이체 (단일 뉴클레오타이드 변이체, SNVs, 또는 구조적 변이체, SVs)의 이형접합성의 손실 (LOH)에 의해 종종 동반된다. LOH는 어느 한쪽 표적 게놈 유전자좌의 텔로미어 측에서 모든 변이체를 포함하는 광범위 유전자 변환 (극성 유전자 변환) 또는 표적 게놈 유전자좌의 어느 한 측에서 변이체용 국부 유전자 변환 기전을 포함할 수 있다. 그와 같은 유전자 변환 사건은 상동성-유도된 유사분열 재조합 기전의 결과이어야 한다.
이러한 지식은 CRISPR/Cas9-보조된 동형접합성 표적화 실험 설계에 안내를 제공한다. 2 대립유전자가 고도의 서열 동일성을 공유하는 표적 영역 선택은 성공의 최고 기회를 제공한다. 2 대립유전자 사이 고도의 서열 변동을 가진 표적 영역에서 CRISPR/Cas9-보조된 동형접합성 표적화는 덜 성공적일 것 같다. SNVs 및 SVs의 고 밀도를 가진 유전자좌에서 조차, 성공률은 표적 게놈 유전자좌 이내 연속 대립유전자 서열 동일성의 가장 긴 가능한 스트레치 이내 또는 대립유전자 서열 동일성이 최대화되는 표적 게놈 유전자좌의 스트레치 이내 서열을 인식하는 가이드 RNAs 또는 뉴클레아제 제제의 용도에 의해 개선될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 방법은 서열 동일성이 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 표적 영역의 전부 또는 일부에 대하여 최대화될 수 있는 정도로 표적 영역의 선택을 포함할 수 있다. 하이브리드 세포에서, 상동 염색체 쌍의 1 카피에서 서열은 전형적으로 염색체 쌍 (예를 들면, 단일 뉴클레오타이드 변이)의 다른 카피에 비교된 경우 일부 차이를 가질 것이다. 따라서, 그와 같은 방법은 표적 게놈 유전자좌에서 상동 염색체 쌍 (예를 들어, 인간 세포는 23 상동 염색체 쌍을 갖는다)에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 서열을 비교하는 것 그리고 그 다음 서열 동일성이 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 표적 영역의 전부 또는 일부에 대하여 최대화되는 정도로 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 서열이 이용가능하지 않으면, 그와 같은 방법은 서열 비교에 앞서 상동 염색체 쌍 이내 각각의 단일 염색체에서 표적 게놈 유전자좌를 서열분석하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
표적 영역은, 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 방법에서 둘 이상의 가이드 RNAs 또는 하나 이상의 외인성 수복 템플레이트 중 하나에 의해 표적화된 임의의 분절 또는 영역, 또는 본 명세서에서 개시된 방법에서 둘 이상의 가이드 RNAs 또는 하나 이상의 외인성 수복 템플레이트 중 하나에 의해 표적화된 분절 또는 영역을 측접하는 임의의 분절 또는 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 표적 영역은 연속 게놈 서열 또는 비-연속 게놈 서열일 수 있다. 예를 들어, 표적 영역은 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 결실을 위하여 표적화된 게놈 분절 또는 영역, 대체를 위하여 표적화된 게놈 분절 또는 영역, 또는 삽입을 위하여 표적화된 게놈 분절 또는 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 그리고/또는 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 결실, 대체, 또는 삽입을 위하여 표적화된 게놈 분절 또는 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 표적 영역은 본 명세서에서 개시된 방법에 의한 결실, 대체, 또는 삽입을 위하여 표적화된 영역의 서열 즉시 업스트림 및/또는 서열 즉시 다운스트림 (예를 들면, 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위 사이 영역의 서열 업스트림 및/또는 다운스트림, 또는 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 서열 업스트림 및/또는 다운스트림)을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 예로서, 2 가이드 RNAs가 사용되면, 표적 영역은 가이드 RNA 인식 서열 또는 Cas 절단 부위 사이 영역을 측접하는 5' (즉, 업스트림) 및 3' (즉, 다운스트림) 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 측접 서열의 길이의 예는 본 명세서에서 다른 곳에 개시된다.
일부 방법에서, 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 먼저 설계될 수 있고, 가이드 RNAs는 그 다음 가이드 RNA 인식 서열 이내 및/또는 측접하는 (예를 들면, 둘 이상의 가이드 RNAs가 사용되면, 추가로 떨어진 2 가이드 RNA 인식 서열 사이 영역 측접하는) (5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측) 영역에서 서열 동일성을 최대화하기 위해 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열에 의해 측접된 영역 이내 설계될 수 있다. 대안적으로, 일부 방법에서, 예를 들어, 둘 이상의 가이드 RNAs는 먼저 설계될 수 있고, 외인성 수복 템플레이트는 그 다음 5' 및 3' 표적 서열이 둘 이상의 가이드 RNA 인식 서열을 측접하고 있도록 그리고 서열 동일성이 5' 및 3' 표적 서열을 측접하는 (예를 들면, 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역을 측접하는) (5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측) 및/또는 상기 이내 영역에서 최대화되도록 설계될 수 있다.
예로서, 표적 영역은 둘 이상의 가이드 RNAs 중 하나에 대하여 가이드 RNA 인식 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 게다가, 표적 영역은 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
또 다른 예로서, 표적 영역은 둘 이상의 가이드 RNA 인식 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 게다가, 표적 영역은 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 예를 들어, 표적 영역은 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위에 의해 측접된 게놈 영역 또는 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위를 포함하고 상기에 의해 측접된 게놈 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 게다가, 표적 영역은 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위 사이 영역을 측접하는 또는 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위를 포함하고 이들 사이 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 유사한 표적 영역은 2 초과 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서 선택될 수 있고, 단, 상기와 같이 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위에 의해 측접된 게놈 영역 대신에 절단 부위의 가이드 RNA 인식 서열에 의해 측접된 게놈 영역이 최대한 멀리 떨어질 것이다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
외인성 수복 템플레이트가 사용되는 방법에서, 예를 들어, 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열에 의해 측접된 영역 또는 5' 및 3' 표적 서열을 포함하고 상기에 의해 측접된 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열 또는 5' 및 3' 표적 서열 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
대립유전자 서열 동일성은 모든 표적 영역 또는 표적 영역의 일부에 대하여 최대화될 수 있다. 예로서, 대립유전자 서열 동일성은 적어도 하나의 또는 각각의 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 게놈 영역에 대하여 또는 적어도 하나의 또는 각각의 가이드 RNA 인식 서열을 포함하는 영역에 대하여 최대화될 수 있다. 예를 들어, 대립유전자 서열 동일성은 적어도 하나의 또는 각각의 가이드 RNA 인식 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 대안적으로, 대립유전자 서열 동일성은 적어도 하나의 또는 각각의 가이드 RNA 인식 서열 그리고 적어도 하나의 또는 각각의 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 대안적으로, 대립유전자 서열 동일성은 적어도 하나의 또는 각각의 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 대하여 최대화될 수 잇다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 대립유전자 서열 동일성은 외인성 수복 템플레이트용 5' 및/또는 3' 표적 서열과 상응하는 게놈 영역에 대하여 또는 적어도 하나의 또는 각각의 5' 및 3' 표적 서열을 포함하는 영역에 대하여 최대화될 수 있다. 예를 들어, 대립유전자 서열 동일성은 적어도 하나의 또는 각각의 5' 및 3' 표적 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 대안적으로, 대립유전자 서열 동일성은 적어도 하나의 또는 각각의 5' 및 3' 표적 서열 그리고 적어도 하나의 또는 각각의 5' 및 3' 표적 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 대안적으로, 대립유전자 서열 동일성은 적어도 하나의 또는 각각의 5' 및 3' 표적 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 대립유전자 서열 동일성은 결실, 대체, 또는 삽입을 위하여 표적화된 영역을 측접하는 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 예를 들어, 2 가이드 RNAs를 사용하는 방법에서, 대립유전자 서열 동일성은 2 절단 부위 또는 2 가이드 RNA 인식 서열 사이 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 셋 이상의 가이드 RNAs를 사용하는 방법에서, 대립유전자 서열 동일성은 최대한 멀리 떨어진 2 절단 부위 또는 2 가이드 RNA 인식 서열 사이 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 또 다른 예로서, 외인성 수복 템플레이트를 사용하는 방법에서, 대립유전자 서열 동일성은 외인성 수복 템플레이트용 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 (즉, 외인성 수복 템플레이트에 의해 결실을 위하여 표적화된 게놈 영역)을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 대하여 최대화될 수 있다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
서열 동일성이 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 표적 영역의 전부 또는 일부에 대하여 최대화되는 정도로 표적 영역 선택은 상동 염색체 쌍내 제1 및 제2 염색체에서 표적 게놈 유전자좌 찾기 및 표적 게놈 유전자좌의 나머지에 비해 최고 대립유전자 서열 동일성을 가진 영역 채집을 반드시 의미하지 않지만 대신 다른 인자를 고려할 수 있다. 예를 들어, 표적 영역이 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다면, 고려될 수 있는 다른 인자는, 예를 들어, 추정 가이드 RNA 인식 서열이 영역에서 정위되는 것, 추정 가이드 RNA 인식 서열이 특유인지 여부, 영역 이내 추정 가이드 RNA 인식 서열이 정위되는 곳, 영역에서 성공적인 또는 특정 추정 가이드 RNA 인식 서열이 있을 것으로 예상되는 방법, 외인성 수복 템플레이트용 적합한 5' 및 3' 표적 서열에 영역 이내 추정 가이드 RNA 인식 서열의 근접, 다른 추정 가이드 RNA 인식 서열에 영역 이내 추정 가이드 RNA 인식 서열의 근접, 정정을 위하여 표적화된 돌연변이에 영역 이내 추정 가이드 RNA 인식 서열의 근접, 및 기타 등등을 포함한다. 예를 들어, 바람직하게는 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는 특유의 표적 부위이다. 참고, 예를 들면, US 2014/0186843, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 마찬가지로, 가이드 RNA 특이성은 다양한 GC 함량 및 표적화 서열 길이에 관련할 수 있고 상기에 의해 최적화될 수 있고, 알고리즘은 가이드 RNA의 부정확한 결합 또는 상호작용을 최소화하는 가이드 RNA 표적화 서열의 설계 및 평가에 이용가능하다. 참고, 예를 들면, WO 2016/094872, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 일부 방법에서, 상이한 종으로부터 Cas9 단백질은 이용가능한 PAM 서열의 증가된 수로 인해 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열의 수를 증가시키는데 사용 또는 간주될 수 있다 (예를 들면, S. 파이오제네스 Cas9 및 S. 아우레스 Cas9).
일 예에서, 표적 영역은 표적 영역의 전부 또는 일부가 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 높은 백분율을 갖도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적 영역은 표적 영역의 전부 또는 일부가 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 서열 동일성의 최소 백분율, 예컨대 적어도 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.55%, 99.6%, 99.65%, 99.7%, 99.75%, 99.8%, 99.85%, 99.9%, 99.95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖도록 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, 표적 영역은 표적 영역의 전부 또는 일부가 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 수 또는 또는 낮은 밀도를 갖도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적 영역은 표적 영역의 전부 또는 일부가 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 단일 뉴클레오타이드 변이의 최대 밀도, 예컨대 서열의 kb당 5, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 3, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 또는 제로 이하 단일 뉴클레오타이드 변이를 갖도록 선택될 수 있다.
임의로, 표적 영역은 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체에서 동일할 수 있다. 임의로, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌 이내 연속 서열 동일성의 가장 긴 가능한 스트레치 이내일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역은 표적 영역의 전부 또는 일부가 표적 게놈 유전자좌 이내 다른 영역에 비해 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 수 또는 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 갖도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 나머지의 전부 또는 일부에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 더 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 더 높은 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 영역은 상응하는 제1 및 제2 상동 염색체 사이 적어도 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있고, 표적 게놈 유전자좌의 나머지는 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 99.8% 이하 서열 동일성을 갖는다.
예를 들어, 표적 영역은 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 하나 이상의 표적 게놈 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 게놈 영역에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 일 예로서, 표적 영역은 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열의 적어도 하나 또는 각각을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 표적 영역은 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열의 적어도 하나 또는 각각 그리고 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열의 적어도 하나 또는 각각을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열 및 그것의 5' 및/또는 3' 측접 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 더욱 또 다른 예로서, 표적 영역은 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열의 적어도 하나 또는 각각을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열의 5' 및/또는 3' 측접 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 표적 영역은 제1 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 제1 표적 게놈 영역 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 제2 표적 게놈 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 게놈 영역에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 영역은 제1 가이드 RNA 인식 서열 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 표적 영역은 제1 가이드 RNA 인식 서열 및 제1 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열 및 제2 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열의 높은 백분율을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열 및 그것의 5' 및/또는 3' 측접 서열과 상응하는 게놈 영역에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 더욱 또 다른 예로서, 표적 영역은 제1 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 하나 이상의 다른 잠재적 가이드 RNA 인식 서열을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
따라서, 1 가이드 RNA가 표적 영역 선택에서 고려되는 방법에서, 예를 들어, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는 상이한 가이드 RNA 인식 서열 및 상이한 가이드 RNA 인식 서열의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함할 수 있다. 둘 이상의 가이드 RNAs가 사용되면, 방법은 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 둘 이상의 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 하나 이상의 분절은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않지만 표적 게놈 유전자좌에서 각각의 가이드 RNA 인식 서열과 상응하는 분절을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 절단 부위를 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위의 하나 이상의 다른 쌍 사이 영역에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 셋 이상의 가이드 RNAs가 사용되면, 관련된 영역은 최대한 멀리 떨어져 있는 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 2 절단 부위 사이 영역일 것이다.
따라서, 2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 예를 들어, 표적 영역 선택은 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 영역을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 여기서 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 하나 이상의 분절은 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 여기서 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
대안적으로 또는 추가적으로, 2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 절단 부위 사이 영역 그리고 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 절단 부위 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위의 하나 이상의 다른 쌍 사이 영역 및 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위의 하나 이상의 다른 쌍 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 바람직하게는, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 절단 부위 사이 게놈 영역 그리고 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 절단 부위 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위의 하나 이상의 다른 쌍 사이 영역 및 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위의 하나 이상의 다른 쌍 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및 3' 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 셋 이상의 가이드 RNAs가 사용되면, 관련된 영역은 최대한 멀리 떨어져 있는 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 2 절단 부위 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열일 것이다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
따라서, 2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 예를 들어, 표적 영역 선택은 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 영역 및 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 여기서 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 하나 이상의 분절은 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 여기서 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
대안적으로 또는 추가적으로, 2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 절단 부위 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위의 하나 이상의 다른 쌍 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 바람직하게는, 표적 영역은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 절단 부위 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절, 예컨대 표적 게놈 유전자좌 이내 잠재적인 가이드 RNA 인식 서열 또는 절단 부위의 하나 이상의 다른 쌍 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 셋 이상의 가이드 RNAs가 사용되면, 관련된 영역은 최대한 멀리 떨어져 있는 2 가이드 RNA 인식 서열 또는 2 절단 부위 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열일 것이다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
따라서, 2 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 예를 들어, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 둘 이상의 비-연속 분절을 비교하는 것, 여기서 각각의 비-연속 분절은 가이드 RNA 인식 서열의 상이한 쌍 사이 게놈 영역의5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 또는 150 kb의 측접 서열을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 여기서 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다, 그리고 다른 비-연속 분절에 비해 서열 동일성의 최고 백분율을 갖는 비-연속 분절을 표적 영역으로서 선택하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 하나 이상의 비-연속 분절은 표적 게놈 유전자좌에서 가이드 RNA 인식 서열의 각각의 상이한 쌍과 상응하는 비-연속 분절을 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성되고, 여기서 가이드 RNA 인식 서열은 게놈에서 다른 곳에 존재하지 않는다.
외인성 수복 템플레이트가 사용되는 방법에서, 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표적 영역은 5' 및/또는 3' 표적 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 바람직하게는, 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 영역은 5' 및 3' 표적 서열을 포함하고 상기에 의해 측접된 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다.
마찬가지로, 외인성 수복 템플레이트가 사용되는 방법에서, 표적 영역은 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열 또는 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열을 포함하고 그 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 바람직하게는, 표적 영역은 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열을 포함하고 그 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및 3' 서열 이내 또는 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 대안적으로, 표적 영역은 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 그리고 5' 및 3' 표적 서열 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및/또는 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 바람직하게는, 표적 영역은 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 표적 서열 사이 영역 그리고 5' 및 3' 표적 서열 사이 게놈 영역을 측접하는 5' 및 3' 서열을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있고, 표적 영역은 표적 게놈 유전자좌의 다른 분절에 비해 단일 뉴클레오타이드 변이의 낮은 밀도 또는 서열 동일성의 높은 백분율을 가질 수 있다. 5' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다. 마찬가지로, 3' 측접 서열은, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1,000 bp의 측접 서열 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 kb의 측접 서열일 수 있다.
본 명세서에서 개시된 방법에 의해 변형된 표적 영역은 세포 내에서 DNA의 임의의 분절 또는 (연속 또는 비-연속) 영역을 포함할 수 있다. 표적 영역은 세포에 원상태일 수 있거나, 세포의 게놈에 통합되었던 DNA의 이종성 또는 외인성 분절일 수 있거나, 또는 이의 조합일 수 있다. DNA의 그와 같은 이종성 또는 외인성 분절은 이식유전자, 발현 카셋트, 폴리뉴클레오타이드 인코딩 선택 마커, 또는 게놈 DNA의 이종성 또는 외인성 영역을 포함할 수 있다.
B. CRISPR/Cas 시스템
본 명세서에서 개시된 방법은 세포 내에서 게놈을 변형시키기 위해 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문성 반복부 (CRISPR)/CRISPR-관련된 (Cas) 시스템 또는 그와 같은 시스템의 구성요소를 이용한다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현에서 관여된, 또는 상기의 활성을 유도하는 전사체 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III 시스템일 수 있다. 대안적으로 CRISPR/Cas 시스템은, 예를 들어, 유형 V 시스템 (예를 들면, 하위유형 V-A 또는 하위유형 V-B)일 수 있다. 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물은 핵산의 부위-지향된 절단을 위하여 (Cas 단백질로 복합체화된 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는) CRISPR 복합체 이용에 의해 CRISPR/Cas 시스템을 사용한다.
본 명세서에서 개시된 방법에서 사용된 CRISPR/Cas 시스템은 비-자연 발생이다. "비-자연 발생" 시스템은 사람의 손의 관여를 표시하는 것, 예컨대 그것의 자연 발생 상태로부터 변경 또는 돌연변이되는, 이들이 사실상 자연적으로 관련되는 적어도 하나의 다른 구성요소가 적어도 실질적으로 없는, 또는 이들이 자연적으로 관련되지 않는 적어도 하나의 다른 구성요소와 관련되는 시스템의 하나 이상의 구성요소를 포함한다. 예를 들어, 일부 CRISPR/Cas 시스템은 함께 자연적으로 발생하지 않는 Cas 단백질 및 gRNA를 포함하는 비-자연 발생 CRISPR 복합체를 사용한다. 다른 CRISPR/Cas 시스템은 자연적으로 발생하지 않는 Cas 단백질을 사용하고, 다른 CRISPR/Cas 시스템은 자연적으로 발생하지 않는 gRNA를 사용한다.
(1) Cas 단백질
Cas 단백질은 일반적으로 가이드 RNAs (gRNAs, 아래에 더 상세히 기재됨)과 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 뉴클레아제 도메인 (예를 들면, DNase 또는 RNase 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 및 다른 도메인을 또한 포함할 수 있다. 뉴클레아제 도메인은, 핵산 분자의 공유결합의 파손을 포함하는, 핵산 절단용 촉매적 활성을 보유한다. 절단은 평활 말단 또는 엇갈린 말단을 생산할 수 있고, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 전형적으로 평활 절단 생성물을 창출할 것이다. 대안적으로, 야생형 Cpf1 단백질 (예를 들면, FnCpf1)은 비-표적화된 가닥에서 PAM 서열로부터 18번째 염기 쌍 후 그리고 표적화된 가닥에서 23번째 염기 후 발생하는 절단으로, 5-뉴클레오타이드 5' 돌출부를 가진 절단 생성물을 초래할 수 있다. Cas 단백질은 상기 표적 핵산에서 이중-가닥 절단 (예를 들면, 평활 말단을 가진 이중-가닥 절단)을 창출하기 위해 전체 절단 활성을 가질 수 있거나, 또는 표적 핵산에서 단일-가닥 절단을 창출하는 니카제일 수 있다.
Cas 단백질의 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 또는 Csx12), Cas10, Casl0d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cu1966, 및 이의 동족체 또는 변형된 버전을 포함한다.
예시적 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 Cas9 단백질로부터 유래된 단백질이다. Cas9 단백질은 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터이고 전형적으로 보존된 구조를 가진 4 핵심 모티프를 공유한다. 모티프 1, 2, 및 4는 RuvC-유사 모티프이고, 모티프 3은 HNH 모티프이다. 예시적 Cas9 단백질은 하기로부터이다: 연쇄상구균 파이오제네스, 연쇄상구균 써모필루스, 연쇄상구균 sp., 스타필로코쿠스 아우레스, 노르카르디옵시스 닷손빌레이, 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토마이세스 비리크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움, 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실러스 악시도칼다리우스, 바실러스 슈도마이코이데스, 바실러스 셀레니티레두센스, 엑시구오박테리움 시비리쿰, 락토바실러스 델브루엑키이, 락토바실러스 살리바리우스, 마이크로스실라 마리나, 버크홀데리아에스 박테리움, 폴라로모나스 나프탈레니보란스, 폴라로모나스 sp., 크로코스파에라 왓소니이, 시아노테세 sp., 마이크로사이스티스 에어루기노사, 사이네초코쿠스 sp., 아세토할로비움 아라바티쿰, 암모니펙스 데겐시, 칼디셀룰로시룹토르 벡스시이, 칸디다투스 데설포루디스, 클로스트리듐 보툴리눔, 클로스트리듐 디피실레, 피네골디아 마그나, 나트라나에로비우스 써모필루스, 펠로토마컬럼 써모프로피오니쿰, 악시디티오바실러스 칼두스, 악시디티오바실러스 페로옥시단스, 알로크로마티움 비노섬, 마리노박터 sp., 니트로소콕쿠스 할로필루스, 니트로소콕쿠스 왓소니, 가성알테로모나스 할로플랑크티스, 크테도노박터 라세미페르, 메타노할로비움 에베스티가툼, 아나바에나 바리아빌리스, 노둘라리아 스푸미게나, 노스톡 sp., 아트로스피라 맥시마, 아트로스피라 플라텐시스, 아트로스피라 sp., 링그비아 sp., 마이크로콜레우스 츠토노플라스테스, 오실라토리아 sp., 페트로토가 모빌리스, 테르모시포 아프리카누스, 아카리오클로리스 마리나, 나이세리아 메닌기티디스, 또는 캄필로박터 제주니.Cas9 패밀리 일원의 추가의 예는, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입된, WO 2014/131833에서 기재된다. (SwissProt 수탁 번호 Q99ZW2로 배정된) S. 파이오제네스 (SpCas9)로부터 Cas9는 예시적 Cas9 단백질이다. (UniProt 수탁 번호 J7RUA5로 배정된) S. 아우레스 (Sa Cas9)로부터 Cas9는 또 다른 예시적 Cas9 단백질이다. (UniProt 수탁 번호 Q0P897로 배정된) 캄필로박터 제주니 (CjCas9)로부터 Cas9는 또 다른 예시적 Cas9 단백질이다. 참고, 예를 들면, Kim 등 (2017) Nat. Comm.8:14500, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. SaCas9는 SpCas9보다 더 작고, CjCas9는 양쪽 SaCas9 및 SpCas9보다 더 작다.
Cas 단백질의 또 다른 예는 Cpf1 (프레보텔라 및 프란시셀라 1로부터의 CRISPR) 단백질이다. Cpf1은 Cas9의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터에 대응물과 함께 Cas9의 상응하는 도메인에 상동성인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 큰 단백질 (약 1300 아미노산)이다. 하지만, Cpf1은 Cas9 단백질에서 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 부족하고, RuvC-유사 도메인은, HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9에 대조적으로, Cpf1 서열에서 연속성이다. 참고, 예를 들면, Zetsche 등 (2015) Cell 163(3): 759-771, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 예시적 Cpf1 단백질은 하기로부터이다: 프란시셀라 툴라렌시스 1, 프란시셀라 툴라렌시스 subsp. 노비시다, 프레보텔라 알벤시스, 라크노스피라세아에 박테리움 MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스, 페레그리니박테리아 박테리움 GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 GW2011_GWC2_44_17, 스미셀라 sp.SCADC, 악시다미노코쿠스 sp.BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼, 유박테륨 엘리겐, 모락셀라 보보쿨리 237, 렙토스피라 이나다이, 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006, 포르파이로모나스 크레비오리카니스 3, 프레보텔라 디시엔스, 및 포르파이로모나스 마카카에.프란시셀라 노비시다 U112로부터 Cpf1 (FnCpf1; UniProt 수탁 번호 A0Q7Q2로 배정됨)은 예시적 Cpf1 단백질이다.
Cas 단백질은 야생형 단백질 (즉, 자연에서 발생하는 것), 변형된 Cas 단백질 (즉, Cas 단백질 변이체), 또는 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 단편일 수 있다. Cas 단백질은 또한 야생형 또는 변형된 Cas 단백질의 촉매적 활성 에 관하여 활성 변이체 또는 단편일 수 있다. 촉매적 활성에 관하여 활성 변이체 또는 단편은 야생형 또는 변형된 Cas 단백질 또는 이의 부분에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 초과 서열 동일성을 포함할 수 있고, 상기 활성 변이체는 원하는 절단 부위에서 컷팅하는 능력을 유지하고 따라서 닉-유도 또는 이중-가닥-파단-유도 활성을 유지한다. 닉-유도 또는 이중-가닥-파단-유도 활성용 검정은 공지되고 일반적으로 절단 부위를 함유하는 DNA 기질에서 Cas 단백질의 전체적인 활성 및 특이성을 측정한다.
변형된 Cas 단백질의 일 예는, 비-특이적 DNA 접촉을 감소시키도록 설계된 변경을 갖는 연쇄상구균 파이오제네스 Cas9의 고-충실도 변이체 (N497A/R661A/Q695A/Q926A)인, 변형된 SpCas9-HF1 단백질이다. 참고, 예를 들면, Kleinstiver 등 (2016) Nature 529(7587): 490-495, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 변형된 Cas 단백질의 또 다른 예는 부정확한 효과를 감소시키도록 설계된 변형된 eSpCas9 변이체 (K848A/K1003A/R1060A)이다. 참고, 예를 들면, Slaymaker 등 (2016) Science 351(6268): 84-88, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 다른 SpCas9 변이체는 K855A 및 K810A/K1003A/R1060A를 포함한다.
Cas 단백질은 핵산 결합 친화도, 핵산 결합 특이성, 및 효소적 활성의 하나 이상을 증가 또는 감소시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질은 또한 단백질의 임의의 다른 활성 또는 특성, 예컨대 안정성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 하나 이상의 뉴클레아제 도메인은 변형, 결실, 또는 불활성화될 수 있거나, Cas 단백질은 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 또는 Cas 단백질의 활성을 최적화 (예를 들면, 향상 또는 감소)시키기 위해 절단될 수 있다.
Cas 단백질은 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 Cpf1 단백질은 일반적으로, 아마 이량체성 배치형태에서, 표적 DNA의 양쪽 가닥을 절단시키는 RuvC-유사 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 적어도 2 뉴클레아제 도메인, 예컨대 DNase 도메인을 또한 포함한다. 예를 들어, 야생형 Cas9 단백질은 일반적으로 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. RuvC 및 HNH 도메인은 DNA에서 이중-가닥 절단을 만들기 위해 이중-가닥 DNA의 상이한 가닥을 각각 컷팅할 수 있다. 참고, 예를 들면, Jinek 등 (2012) Science 337:816-821, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
뉴클레아제 도메인의 한쪽 또는 양쪽은 이들이 더 이상 기능적이지 않거나 또는 감소된 뉴클레아제 활성을 갖도록 결실 또는 돌연변이될 수 있다. 뉴클레아제 도메인 중 하나가 결실 또는 돌연변이되면, 수득한 Cas 단백질 (예를 들면, Cas9)는 니카제로서 지칭될 수 있고 이중-가닥 절단이 아닌 이중-가닥 DNA 이내 가이드 RNA 인식 서열에서 단일-가닥 절단을 생성할 수 있다 (즉, 양쪽이 아닌, 상보성 가닥 또는 비-상보성 가닥을 절단할 수 있다). 뉴클레아제 도메인의 양쪽이 결실 또는 돌연변이되면, 수득한 Cas 단백질 (예를 들면, Cas9)는 이중-가닥 DNA (예를 들면, 뉴클레아제-무효 Cas 단백질)의 양쪽 가닥을 절단시키기 위한 감소된 능력을 가질 것이다. Cas9를 니카제로 전환시키는 돌연변이의 예는 S. 파이오제네스로부터 Cas9의 RuvC 도메인에서 D10A (Cas9의 위치 10에서 아스파르테이트부터 알라닌) 돌연변이이다. 마찬가지로, S. 파이오제네스로부터 Cas9의 HNH 도메인에서 H939A (아미노산 위치 839에서 히스티딘부터 알라닌) 또는 H840A (아미노산 위치 840에서 히스티딘부터 알라닌), 또는 N863A (아미노산 위치 N863에서 아스파라긴부터 알라닌)은 Cas9를 니카제로 전환시킬 수 있다. Cas9를 니카제로 전환시키는 돌연변이의 다른 예는 S. 써모필루스로부터 Cas9에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 참고, 예를 들면, Sapranauskas 등 (2011) Nucleic Acids Research 39:9275-9282 및 WO 2013/141680, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 돌연변이는 방법 예컨대 부위-지향된 돌연변이유발, PCR-매개된 돌연변이유발, 또는 총 유전자 합성을 사용하여 생성될 수 있다. 니카제를 창출하는 다른 돌연변이의 예는, 예를 들어, 이들의 각각이 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입되는, WO 2013/176772 및 WO 2013/142578에서 발견될 수 있다. 모든 뉴클레아제 도메인이 Cas 단백질에서 결실 또는 돌연변이되면 (예를 들면, 뉴클레아제 도메인의 양쪽이 Cas9 단백질에서 결실 또는 돌연변이되면), 수득한 Cas 단백질 (예를 들면, Cas9)는 이중-가닥 DNA (예를 들면, 뉴클레아제-무효 또는 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질)의 양쪽 가닥을 절단시키기 위한 감소된 능력을 가질 것이다. 하나의 특정 예는 D10A/H840A S. 파이오제네스 Cas9 이중 돌연변이체 또는 S. 파이오제네스 Cas9로 최적으로 정렬된 경우 또 다른 종으로부터 Cas9에서 상응하는 이중 돌연변이체이다. 또 다른 특정 예는 D10A/N863A S. 파이오제네스 Cas9 이중 돌연변이체 또는 S. 파이오제네스 Cas9로 최적으로 정렬된 경우 또 다른 종으로부터 Cas9에서 상응하는 이중 돌연변이체이다.
스타필로코쿠스 아우레스 Cas9 단백질의 촉매적 도메인에서 불활성화 돌연변이의 예는 또한 공지된다. 예를 들어, 스타필로콕쿠스 아우레스 Cas9 효소 (SaCas9)는 뉴클레아제-불활성 Cas 단백질을 생성하기 위해 위치 N580에서 치환 (예를 들면, N580A 치환) 및 위치 D10에서 치환 (예를 들면, D10A 치환)을 포함할 수 있다. 참고, 예를 들면, WO 2016/106236, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
Cpf1 단백질의 촉매적 도메인에서 불활성화 돌연변이의 예는 또한 공지된다. 하기로부터 Cpf1 단백질과 관련하여: 프란시셀라 노비시다 U112 (FnCpf1), 악시다미노코쿠스 sp.BV3L6 (AsCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 (LbCpf1), 및 모락셀라 보보쿨리 237 (MbCpf1 Cpf1), 그와 같은 돌연변이는 AsCpf1의 위치 908, 993, 또는 1263 또는 Cpf1 오쏘로그내 상응하는 위치, 또는 LbCpf1의 위치 832, 925, 947, 또는 1180 또는 Cpf1 오쏘로그내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 그와 같은 돌연변이는, 예를 들어 AsCpf1의 돌연변이 D908A, E993A, 및 D1263A 또는 Cpf1 오쏘로그내 상응하는 돌연변이, 또는 LbCpf1의 D832A, E925A, D947A, 및 D1180A 또는 Cpf1 오쏘로그내 상응하는 돌연변이의 하나 이상을 포함할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2016/0208243, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
Cas 단백질은 또한 융합 단백질로서 이종성 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인, 후성유전적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인에 융합될 수 있다. 참고 WO 2014/089290, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. Cas 단백질은 또한 증가된 또는 감소된 안정성을 제공하는 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 융합된 도메인 또는 이종성 폴리펩타이드는 N-말단에서, C-말단에서, 또는 Cas 단백질 이내 내부적으로 정위될 수 있다.
Cas 융합 단백질의 예는 세포하 국재화를 제공하는 이종성 폴리펩타이드에 융합된 Cas 단백질이다. 그와 같은 이종성 폴리펩타이드는, 예를 들어, 하나 이상의 핵 국재화 신호 (NLS) 예컨대 핵에 표적화용 SV40 NLS, 미토콘드리아에 표적화용 미토콘드리아 국재화 신호, ER 유지 신호, 및 기타 동종을 포함할 수 있다. 참고, 예를 들면, Lange 등 (2007) J. Biol. Chem. 282:5101-5105, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 다른 적합한 NLSs는 알파-임포르틴 NLS를 포함한다. 그와 같은 세포하 국재화 신호는 N-말단에서, C-말단에서, 또는 Cas 단백질 이내 어디든지 정위될 수 있다. NLS는 염기성 아미노산의 스트레치를 포함할 수 있고, 단일분절 서열 또는 이중분절 서열을 포함할 수 있다. 임의로, Cas 단백질은, N-말단에서 NLS (예를 들면, 알파-임포르틴 NLS) 및/또는 C-말단에서 NLS (예를 들면, SV40 NLS)를 포함하는, 둘 이상의 NLSs를 포함한다.
Cas 단백질은 또한 세포-투과 도메인에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 세포-투과 도메인은 HIV-1 TAT 단백질, 인간 B형 간염 바이러스로부터 TLM 세포-투과 모티프, MPG, Pep-1, VP22, 단순 포진 바이러스로부터 세포 투과 펩타이드, 또는 폴리아르기닌 펩타이드 서열로부터 유래될 수 있다. 참고, 예를 들면, WO 2014/089290, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 세포-투과 도메인은 N-말단에서, C-말단에서, 또는 Cas 단백질 이내 어디든지 정위될 수 있다.
Cas 단백질은 또한 추적 또는 정제의 편이성을 위하여 이종성 폴리펩타이드, 예컨대 형광 단백질, 정제 태그, 또는 에피토프 태그에 작동가능하게 연결될 수 있다. 형광 단백질의 예는 하기를 포함한다: 녹색 형광 단백질 (예를 들면, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, 에메랄드, 아자미 그린, 모노머성 아자미 그린, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), 황색 형광 단백질 (예를 들면, YFP, eYFP, 시트린, 베누스, YPet, PhiYFP, ZsYellowl), 청색 형광 단백질 (예를 들면 eBFP, eBFP2, 아주라이트, mKalamal, GFPuv, 사파이어, T-사파이어), 청록색 형광 단백질 (예를 들면 eCFP, 세룰리안, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed 모노머, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), 오렌지 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, 모노머성 Kusabira-오렌지, mTangerine, tdTomato), 및 임의의 다른 적합한 형광 단백질.태그의 예는 하기를 포함한다: 글루타티온-S-전달효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화도 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, 혈구응집소 (HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 히스티딘 (His), 바이오틴 카복실 캐리어 단백질 (BCCP), 및 칼모듈린.
Cas9 단백질은 또한 외인성 수복 템플레이트 또는 표지된 핵산에 결박될 수 있다. 그와 같은 결박 (즉, 물리적 연결)은 공유 상호작용 또는 비공유 상호작용을 통해 달성될 수 있고, 결박은 (예를 들면, 단백질에서 시스테인 또는 리신 잔기의 변형 또는 인테인 변형에 의해 달성될 수 있는, 직접적인 융합 또는 화학적 콘주게이션을 통해) 직접적일 수 있거나, 또는 하나 이상의 개입 링커 또는 어댑터 분자 예컨대 스트렙타비딘 또는 압타머를 통해 달성될 수 있다. 참고, 예를 들면, Pierce 등 (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1): 41-55; Duckworth 등 (2007) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46(46): 8819-8822; Schaeffer 및 Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10): 1328-1332; Goodman 등 (2009) ChembioChem. 10(9): 1551-1557; 및 Khatwani 등 (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14): 4532-4539, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 단백질-핵산 콘주게이트 합성을 위한 비공유 전략은 바이오틴-스트렙타비딘 및 니켈-히스티딘 방법을 포함한다. 공유 단백질-핵산 콘주게이트는 다양한 화학을 사용하여 적절하게 작용화된 핵산 및 단백질을 연결시킴으로써 합성될 수 있다. 이들 화학의 일부는 단백질 표면에서 아미노산 잔기 (예를 들면, 리신 아민 또는 시스테인 티올)에 올리고뉴클레오타이드의 직접적인 부착을 포함하고, 반면 다른 더욱 복잡한 반응식은 단백질의 번역후 변형 또는 촉매적 또는 반응성 단백질 도메인의 관여를 요구한다. 핵산에 단백질의 공유결합 방법은, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 단백질 리신 또는 시스테인 잔기로의 화학적 가교결합, 발현된 단백질-결찰, 화학효소적 방법, 및 광압타머의 사용을 포함할 수 있다. 외인성 수복 템플레이트 또는 표지된 핵산은 C-말단에, N-말단에, 또는 Cas9 단백질 이내 내부 영역에 결박될 수 있다. 바람직하게는, 외인성 수복 템플레이트 또는 표지된 핵산은 Cas9 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 결박된다. 마찬가지로, Cas9 단백질은 외인성 수복 템플레이트 또는 표지된 핵산 이내 5' 말단, 3' 말단, 또는 내부 영역에 결박될 수 있다. 즉, 외인성 수복 템플레이트 또는 표지된 핵산은 임의의 배향 및 극성으로 결박될 수 있다. 바람직하게는, Cas9 단백질은 외인성 수복 템플레이트 또는 표지된 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 결박된다.
Cas 단백질 은 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA로 복합체화된 Cas 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산, 예컨대 RNA (예를 들면, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. 임의로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 특정 세포 또는 유기체에서 단백질에 효율적인 번역을 위하여 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 은, 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 서열에 비교된 경우, 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 또는 관심의 임의의 다른 숙주 세포에서 더 높은 빈도의 용법을 갖는 코돈을 치환시키도록 변형될 수 있다. Cas 단백질을 인코딩하는 핵산이 세포에 도입되는 경우, Cas 단백질은 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
Cas 단백질을 인코딩하는 핵 산은 세포의 게놈에서 안정적으로 통합될 수 있고 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 작제물에서 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 작제물은 관심의 유전자 또는 다른 핵산 서열 (예를 들면, Cas 유전자)의 발현을 유도할 수 있는 그리고 표적 세포에 관심의 그와 같은 핵산 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터 및/또는 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터내일 수 있다. 대안적으로, 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터로부터 분리되는 및/또는 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는 벡터로부터 분리되는 벡터 또는 플라스미드내일 수 있다. 발현 작제물에서 사용될 수 있는 프로모터는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 또는 접합자의 하나 이상에서 활성인 프로모터를 포함한다. 그와 같은 프로모터는, 예를 들어, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 임의로, 프로모터는 일 방향으로 Cas 단백질 및 다른 방향으로 가이드 RNA 양쪽의 발현을 구동시키는 양방향성 프로모터일 수 있다. 그와 같은 양방향성 프로모터는 (1) 3 외부 제어 요소: 원위 서열 요소 (DSE), 근위 서열 요소 (PSE), 및 TATA 박스를 함유하는 완전한, 종래의, 단방향 Pol III 프로모터; 및 (2) 역방향 배향으로 DSE의 5′ 말단에 융합된 PSE 및 TATA 박스를 포함하는 제2 염기성 Pol III 프로모터로 구성될 수 있다. 예를 들어, H1 프로모터에서, DSE는 PSE 및 TATA 박스에 인접하고, 프로모터는 역방향으로 전사가 U6 프로모터로부터 유래된 PSE 및 TATA 박스를 첨부시킴으로써 제어되는 하이브리드 프로모터 창출에 의해 양방향성으로 만들어질 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2016/0074535, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. Cas 단백질 및 가이드 RNA를 동시에 인코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 양방향성 프로모터의 사용은 전달을 용이하게 하기 위해 압축 발현 카셋트의 생성을 허용한다.
(2) 가이드 RNAs
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질 (예를 들면, Cas9 단백질)에 결합하는 그리고 표적 DNA 이내 특정 정위에 Cas 단백질을 표적하는 RNA 분자이다. 가이드 RNAs는 2 분절: "DNA-표적화 분절" 및 "단백질-결합 분절"을 포함할 수 있다. "분절"은 분자의 부문 또는 영역, 예컨대 RNA에서 뉴클레오타이드의 연속 스트레치를 포함한다. 일부 gRNAs, 예컨대 Cas9용의 것은 2개의 별개의 RNA 분자: "활성제-RNA" (예를 들면, tracrRNA) 및 "타겟터-RNA" (예를 들면, CRISPR RNA 또는 crRNA)를 포함할 수 있다. 다른 gRNAs는, 또한 "단일-분자 gRNA", "단일-가이드 RNA", 또는 "sgRNA"로 불릴 수 있는, 단일 RNA 분자 (단일 RNA 폴리뉴클레오타이드)이다. 참고, 예를 들면, WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2014/089290, WO 2014/093622, WO 2014/099750, WO 2013/142578, 및 WO 2014/131833, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입된다. Cas9에 대하여, 예를 들어, 단일-가이드 RNA는 (예를 들면, 링커를 통해) tracrRNA에 융합된 crRNA를 포함할 수 있다. Cpf1에 대하여, 예를 들어, 단지 crRNA는 표적 서열 또는 절단에 결합을 달성하는데 필요하다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 양쪽 이중-분자 gRNAs (즉, 모듈러 gRNAs) 및 단일-분자 gRNAs를 포함한다.
예시적 2-분자 gRNA는 crRNA-유사 ("CRISPR RNA" 또는 "타겟터-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부") 분자 및 상응하는 tracrRNA-유사 ("트랜스-작용 CRISPR RNA" 또는 "활성제-RNA" 또는 "tracrRNA") 분자를 포함한다. crRNA는 gRNA의 DNA-표적화 분절 (단일-가닥) 그리고 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 이분의 일을 형성하는 뉴클레오타이드의 스트레치 양쪽을 포함한다.
상응하는 tracrRNA (활성제-RNA)는 gRNA의 단백질-결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 다른 절반을 형성하는 뉴클레오타이드의 스트레치를 포함한다. crRNA의 뉴클레오타이드의 스트레치는 gRNA의 단백질-결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성하기 위해 tracrRNA의 뉴클레오타이드의 스트레치에 상보성이고 상기로 하이브리드화한다. 이와 같이, 각각의 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 갖는다고 언급될 수 있다.
양쪽 crRNA 및 tracrRNA가 필요한 시스템에서, crRNA 및 상응하는 tracrRNA는 하이브리드화하여 gRNA를 형성한다. 단지 crRNA가 필요한 시스템에서, crRNA는 gRNA일 수 있다. crRNA는 추가적으로 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 단일-가닥 DNA-표적화 분절을 제공한다. 세포 이내 변형을 위하여 사용되면, 주어진 crRNA 또는 tracrRNA 분자의 정확한 서열은 RNA 분자가 사용될 종에 특이적이도록 설계될 수 있다. 참고, 예를 들면, Mali 등 (2013) Science 339:823-826; Jinek 등 (2012) Science 337:816-821; Hwang 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31:227-229; Jiang 등 (2013) Nat. Biotechnol. 31:233-239; 및 Cong 등 (2013) Science 339:819-823, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
주어진 gRNA의 DNA-표적화 분절 (crRNA)는 표적 DNA에서 서열 (즉, 가이드 RNA 인식 서열)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA의 DNA-표적화 분절은 하이브리드화 (즉, 염기 짝짓기)를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 DNA와 상호작용한다. 이와 같이, DNA-표적화 분절의 뉴클레오타이드 서열은 다양할 수 있고 gRNA 및 표적 DNA가 상호작용할 표적 DNA 이내 정위를 결정할 수 있다. 대상체 gRNA의 DNA-표적화 분절은 표적 DNA 이내 임의의 원하는 서열에 하이브리드화하도록 변형될 수 있다. 자연 발생 crRNAs는, 21 내지 46개의 뉴클레오타이드 사이의 길이의 2 직접 반복부 (DR)에 의해 측접된, 21 내지 72개의 뉴클레오타이드 길이의 표적화 분절을 종종 함유하지만 CRISPR/Cas 시스템 및 유기체에 의존하여 상이하다 (참고, 예를 들면, WO 2014/131833, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). S. 파이오제네스의 경우에서, DRs는 36개의 뉴클레오타이드 길이고 표적화 분절은 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 3' 정위된 DR은, Cas 단백질에 차례로 결합하는, 상응하는 tracrRNA에 상보성이고 상기로 하이브리드화한다.
DNA-표적화 분절은 적어도 약 12개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 17개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 19개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 35개의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 40개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 그와 같은 DNA-표적화 분절은 길이 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 80개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 또는 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, DNA 표적화 분절은 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드 (예를 들면, 약 17개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 또는 약 17개의 뉴클레오타이드, 약 18개의 뉴클레오타이드, 약 19개의 뉴클레오타이드, 또는 약 20개의 뉴클레오타이드)일 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2016/0024523, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. S. 파이오제네스로부터 Cas9에 대하여, 전형적인 DNA-표적화 분절은 길이 16 내지 20개의 뉴클레오타이드 또는 길이 17 내지 20개의 뉴클레오타이드이다. S. 아우레스로부터 Cas9에 대하여, 전형적인 DNA-표적화 분절은 길이 21 내지 23개의 뉴클레오타이드이다. Cpf1에 대하여, 전형적인 DNA-표적화 분절은 길이 적어도 16개의 뉴클레오타이드 또는 길이 적어도 18개의 뉴클레오타이드이다.
TracrRNAs는 임의의 형태 (예를 들면, 전장 tracrRNAs 또는 활성 부분적인 tracrRNAs) 및 가변 길이일 수 있다. 이들은 일차 전사체 또는 가공된 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-가이드 RNA의 일부로서 또는2-분자 gRNA의 일부로서 별개의 분자로서) tracrRNAs는 야생형 tracrRNA 서열의 전부 또는 한 부분 (예를 들면, 야생형 tracrRNA 서열의 약 또는 초과 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, 또는 초과 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있거나 상기로 구성될 수 있다. S. 파이오제네스로부터 야생형 tracrRNA 서열의 예는 171-뉴클레오타이드, 89-뉴클레오타이드, 75-뉴클레오타이드, 및 65-뉴클레오타이드 버전을 포함한다. 참고, 예를 들면, Deltcheva 등 (2011) Nature 471:602-607; WO 2014/093661, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 단일-가이드 RNAs (sgRNAs) 이내 tracrRNAs의 예는 sgRNAs의 +48, +54, +67, 및 +85 버전 이내 발견된 tracrRNA 분절을 포함하고, 여기에서 "+n"는 야생형 tracrRNA의 최대 +n 뉴클레오타이드가 sgRNA에서 포함되는 것을 표시한다. 참고 US 8,697,359, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
표적 DNA 이내 가이드 RNA 인식 서열과 DNA-표적화 서열 사이 퍼센트 상보성은 적어도 60% (예를 들면, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)일 수 있다. 표적 DNA 이내 가이드 RNA 인식 서열과 DNA-표적화 서열 사이 퍼센트 상보성은 약 20 연속 뉴클레오타이드에 대해 적어도 60%일 수 있다. 예로서, 표적 DNA 이내 가이드 RNA 인식 서열과 DNA-표적화 서열 사이 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보성 가닥 이내 가이드 RNA 인식 서열의 5' 말단에서 14 연속 뉴클레오타이드에 대해 100% 그리고 나머지에 대해 0%만큼 낮다. 그와 같은 경우에, DNA-표적화 서열은 길이 14개의 뉴클레오타이드인 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 예로서, 표적 DNA 이내 가이드 RNA 인식 서열과 DNA-표적화 서열 사이 퍼센트 상보성은 표적 DNA의 상보성 가닥 이내 가이드 RNA 인식 서열의 5' 말단에서 7 연속 뉴클레오타이드에 대해 100% 그리고 나머지에 대해 0%만큼 낮다. 그와 같은 경우에, DNA-표적화 서열은 길이 7개의 뉴클레오타이드인 것으로 간주될 수 있다. 일부 가이드 RNAs에서, DNA-표적 서열 이내 적어도 17개의 뉴클레오타이드는 표적 DNA에 상보성이다. 예를 들어, DNA-표적화 서열은 길이 20개의 뉴클레오타이드일 수 있고 표적 DNA (가이드 RNA 인식 서열)과 1, 2, 또는 3 미스매치를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 미스매치는 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM) 서열에 인접하지 않는다 (예를 들면, 미스매치는 DNA-표적화 서열의 5' 말단내이거나, 또는 미스매치는 PAM 서열로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19 염기 쌍 떨어져 있다).
gRNA의 단백질-결합 분절은 서로 상보성인 뉴클레오타이드의 2 스트레치를 포함할 수 있다. 단백질-결합 분절의 상보성 뉴클레오타이드는 하이브리드화하여 이중-가닥 RNA 듀플렉스 (dsRNA)를 형성한다. 대상체 gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 단백질과 상호작용하고, gRNA는 DNA-표적화 분절을 통해 표적 DNA 이내 특정 뉴클레오타이드 서열에 결합된 Cas 단백질을 유도한다.
단일-가이드 RNAs는 DNA-표적화 분절 및 스캐폴드 서열 (즉, 가이드 RNA의 단백질-결합 또는 Cas-결합 서열)을 갖는다. 예시적 스캐폴드 서열은 하기를 포함한다: GTTGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열번호:150); GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열번호:151); 및 GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열번호:152).
가이드 RNAs는 추가의 바람직한 피쳐 (예를 들면, 변형된 또는 조절된 안정성; 아세포 표적화; 형광 표지로 추적; 단백질 또는 단백질 복합체용 결합 부위; 및 기타 동종)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 그와 같은 변형의 예는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 5' 캡 (예를 들면, 7-메틸구아닐레이트 캡 (m7G)); 3' 폴리아데닐화된 꼬리 (즉, 3' 폴리(A) 꼬리); (예를 들면, 단백질 및/또는 단백질 복합체에 의한 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 허용하기 위한) 리보스위치 서열; 안정성 제어 서열; dsRNA 듀플렉스 (즉, 헤어핀)을 형성하는 서열; 세포하 정위에 RNA를 표적하는 변형 또는 서열 (예를 들면, 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 및 기타 동종); 추적을 제공하는 변형 또는 서열 (예를 들면, 형광 분자에 직접 콘주게이션, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에 콘주게이션, 형광 검출을 허용하는 서열, 및 기타 등등); 단백질 (예를 들면, 전사 활성제, 전사 억제인자, DNA 메틸전달효소, DNA 탈메틸효소, 히스톤 아세틸전달효소, 히스톤 탈아세틸화효소, 및 기타 동종을 포함하는, DNA에서 작용하는 단백질)을 결합 부위에 제공하는 변형 또는 서열; 및 이의 조합. 변형의 다른 예는 조작된 줄기 루프 듀플렉스 구조, 조작된 팽출 영역, 줄기 루프 듀플렉스 구조의 조작된 헤어핀 3', 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2015/0376586, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 팽출은 crRNA-유사 영역 및 최소 tracrRNA-유사 영역으로 구성된 듀플렉스 이내 뉴클레오타이드의 짝짓기되지 않은 영역일 수 있다. 팽출은, 듀플렉스의 한쪽에, X가 임의의 퓨린이고 Y가 반대편 가닥에서 뉴클레오타이드와 워블 쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드일 수 있는 짝짓기되지 않은 5′-XXXY-3′, 그리고 듀플렉스의 다른 쪽에 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드 영역을 포함할 수 있다.
가이드 RNAs는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNA는, 어느 한쪽 2 분자 (별개의 crRNA 및 tracrRNA)로서 또는 하나의 분자 (sgRNA)로서, RNA의 형태로, 그리고 임의로 Cas 단백질로 복합체의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, gRNAs는, 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다 (참고, 예를 들면, WO 2014/089290 및 WO 2014/065596, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). 가이드 RNAs는 또한 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
gRNA는 또한 gRNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 제공될 수 있다. gRNA를 인코딩하는 DNA는 단일 RNA 분자 (sgRNA) 또는 별개의 RNA 분자 (예를 들면, 별개의 crRNA 및 tracrRNA)를 인코딩할 수 있다. 후자의 경우에, gRNA를 인코딩하는 DNA는 crRNA 및 tracrRNA, 각각을 인코딩하는 하나의 DNA 분자로서 또는 별개의 DNA 분자로서 제공될 수 있다.
gRNA가 DNA의 형태로 제공되는 경우, gRNA는 세포에서 일시적으로, 조건적으로, 또는 구성적으로 발현될 수 있다. gRNAs를 인코딩하는 DNAs는 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있고 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, gRNAs를 인코딩하는 DNAs는 발현 작제물에서 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, gRNA를 인코딩하는 DNA는 외인성 수복 템플레이트를 포함하는 벡터 및/또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터내일 수 있다. 대안적으로, 외인성 수복 템플레이트를 포함하는 벡터 및/또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로부터 분리된 플라스미드 또는 벡터내일 수 있다. 그와 같은 발현 작제물에서 사용될 수 있는 프로모터는, 예를 들어, 진핵 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 만능 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, 또는 접합자의 하나 이상에서, 활성인 프로모터를 포함한다. 그와 같은 프로모터는, 예를 들어, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 그와 같은 프로모터는 또한, 예를 들어, 양방향성 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터의 특정 예는 RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예컨대 인간 U6 프로모터, 랫트 U6 폴리머라제 III 프로모터, 또는 마우스 U6 폴리머라제 III 프로모터를 포함한다.
(3) 가이드 RNA 인식 서열
용어 "가이드 RNA 인식 서열"은, 충분한 결합 조건이 실재하면, gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합할 표적 DNA에서 존재하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 가이드 RNA 인식 서열은 가이드 RNA가 상보성을 갖도록 설계되는 서열을 포함하고, 여기에서 가이드 RNA 인식 서열과 DNA 표적화 서열 사이 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 전체 상보성은, CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는데 그리고 하이브리드화를 야기시키는데 충분한 상보성이 있다면, 반드시 요구되지 않는다. 가이드 RNA 인식 서열은 또한, 아래에 더 상세히 기재된, Cas 단백질용 절단 부위를 포함한다. 가이드 RNA 인식 서열은, 예를 들어, 세포의 핵 또는 세포질에서 혹은 세포의 소기관, 예컨대 미토콘드리아 또는 엽록체 이내 정위될 수 있는, 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
표적 DNA 이내 가이드 RNA 인식 서열은 Cas 단백질 또는 gRNA에 의해 표적화될 수 있다 (즉, 상기에 의해 결합될 수 있거나, 또는 상기와 하이브리드화할 수 있거나, 또는 상기에 상보성일 수 있다). 적합한 DNA/RNA 결합 조건은 세포에서 정상적으로 존재하는 생리적 병태를 포함한다. 다른 적합한 DNA/RNA 결합 조건 (예를 들면, 무세포 시스템에서 조건)은 당해 분야에서 공지된다 (참고, 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, Harbor Laboratory Press 2001), 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). Cas 단백질 또는 gRNA에 상보성이고 상기와 하이브리드화하는 표적 DNA의 가닥은 "상보성 가닥"으로 불릴 수 있고, "상보성 가닥"에 상보성인 (그리고 따라서 Cas 단백질 또는 gRNA에 상보성이 아닌) 표적 DNA의 가닥은 "비상보성 가닥" 또는 "템플레이트 가닥"으로 불릴 수 있다.
Cas 단백질은 gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합할 표적 DNA에서 존재하는 핵산 서열의 내부 또는 외부 부위에서 핵산을 절단시킬 수 있다. "절단 부위"는 Cas 단백질이 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단을 생산하는 핵산의 위치를 포함한다. 예를 들어, (가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화된 그리고 Cas 단백질로 복합체화된 gRNA를 포함하는) CRISPR 복합체의 형성은 gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합할 표적 DNA에서 존재하는 핵산 서열 내 또는 근처 (예를 들면, 상기로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 또는 초과 염기 쌍 이내) 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 초래할 수 있다. 절단 부위가 gRNA의 DNA-표적화 분절이 결합할 핵산 서열의 외부이면, 절단 부위는 "가이드 RNA 인식 서열" 이내인 것으로 여전히 간주된다. 절단 부위는 핵산의 단 한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥에서일 수 있다. 절단 부위는 (평활 말단을 생산하는) 핵산의 양쪽 가닥에서 동일한 위치일 수 있거나 또는 (엇갈린 말단 (즉, 돌출부)를 생산하는) 각각의 가닥에서 상이한 부위일 수 있다. 엇갈린 말단은, 예를 들어, 2 Cas 단백질 사용에 의해 생산될 수 있고, 이들의 각각은 상이한 가닥에서 상이한 절단 부위에 단일-가닥 절단을 생산하고, 그렇게 함으로써 이중-가닥 절단을 생산한다. 예를 들어, 제1 니카제는 이중-가닥 DNA (dsDNA)의 제1 가닥에서 단일-가닥 절단을 창출할 수 있고, 제2 니카제는 돌출하는 서열이 창출되도록 dsDNA의 제2 가닥에서 단일-가닥 절단을 창출할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 가닥에서 니카제의 가이드 RNA 인식 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 또는 1,000 염기 쌍만큼 제2 가닥에서 니카제의 가이드 RNA 인식 서열로부터 분리된다.
Cas 단백질에 의한 표적 DNA의 부위-특이적 결합 및 절단은 (i) gRNA와 표적 DNA 사이 염기-짝짓기 상보성 및 (ii) 표적 DNA에서, 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)으로 불리는, 짧은 모티프 양쪽에 의해 결정된 위치에서 발생할 수 있다. PAM은 가이드 RNA 인식 서열을 측접할 수 있다. 임의로, 가이드 RNA 인식 서열은 PAM에 의해 3' 말단에서 측접될 수 있다. 대안적으로, 가이드 RNA 인식 서열은 PAM에 의해 5' 말단에서 측접될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 절단 부위는 PAM 서열의 약 1 내지 약 10 또는 약 2 내지 약 5 염기 쌍 (예를 들면, 3 염기 쌍) 업스트림 또는 다운스트림일 수 있다. 일부 경우에서 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9 또는 밀접하게 관련된 Cas9가 사용되는 경우), 비-상보성 가닥의 PAM 서열은 5'-N1GG-3'일 수 있고, 여기에서 N1은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이고 표적 DNA의 비-상보성 가닥의 가이드 RNA 인식 서열의 즉시 3'이다. 이와 같이, 상보성 가닥의 PAM 서열은 5'-CCN2-3'일 것이고, 여기에서 N2는 임의의 DNA 뉴클레오타이드이고 표적 DNA의 상보성 가닥의 가이드 RNA 인식 서열의 즉시 5'이다. 그와 같은 일부 사례에서, N1 및 N2는 상보성일 수 있고 N1- N2 염기 쌍은 임의의 염기 쌍 (예를 들면, N1=C 및 N2=G; N1=G 및 N2=C; N1=A 및 N2=T; 또는 N1=T, 및 N2=A)일 수 있다. S. 아우레스로부터 Cas9의 경우에서, PAM은 하기일 수 있고: NNGRRT (서열번호:146) 또는 NNGRR (서열번호:147), 여기에서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. C. 제주니로부터 Cas9의 경우에서, PAM은, 예를 들어, NNNNACAC 또는 NNNNRYAC일 수 있고, 여기에서 N은 A, G, C, 또는 T일 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다. 일부 경우에서 (예를 들면, FnCpf1에 대하여), PAM 서열은 5' 말단의 업스트림일 수 있고 서열 5'-TTN-3'를 갖는다.
가이드 RNA 인식 서열의 예는 gRNA의 DNA-표적화 분절에 상보성인 DNA 서열, 또는 PAM 서열에 첨가로 그와 같은 DNA 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 표적 모티프는 Cas9 단백질, 예컨대 하기에 의해 인식된 NGG 모티프를 즉시 선행하는 20-뉴클레오타이드 DNA 서열일 수 있다: GN19NGG (서열번호:1) 또는 N20NGG (서열번호:2) (참고, 예를 들면, WO 2014/165825, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). 5' 말단에서 구아닌은 세포에서 RNA 폴리머라제에 의해 전사를 용이하게 할 수 있다. 가이드 RNA 인식 서열의 다른 예는 하기에서 2 구아닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다: 시험관내 T7 폴리머라제의 의해 효율적인 전사를 용이하게 하기 위해 5' 말단 (예를 들면, GGN20NGG; 서열번호:3). 참고, 예를 들면, WO 2014/065596, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 다른 가이드 RNA 인식 서열은 하기의 길이 4-22개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다: 서열번호:1-3, 5' G 또는 GG 및 3' GG 또는 NGG 포함.더욱 다른 가이드 RNA 인식 서열은 길이 하기의 14 내지 20개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다: 서열번호:1-3.
가이드 RNA 인식 서열은 세포에 내인성 또는 외인성인 임의의 핵산 서열일 수 있다. 가이드 RNA 인식 서열은 유전자 생성물 (예를 들면, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열 (예를 들면, 조절 서열)일 수 있거나 양쪽을 포함할 수 있다.
C. 외인성 수복 템플레이트
본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물은 Cas 단백질로 표적 게놈 유전자좌의 절단 이후 표적 게놈 유전자좌를 변형시키기 위해 외인성 수복 템플레이트를 이용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 1-세포기 배아일 수 있고, 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 미만일 수 있다. 1-세포기 배아 이외의 세포 유형에서, 외인성 수복 템플레이트 (예를 들면, 표적화 벡터)는 더 길 수 있다. 예를 들어, 1-세포기 배아 이외의 세포 유형에서, 외인성 수복 템플레이트는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 큰 표적화 벡터 (LTVEC) (예를 들면, 적어도 10 kb의 길이를 갖는 또는 적어도 10 kb의 총계를 갖는 5' 및 3' 상동성 아암을 갖는 표적화 벡터)일 수 있다. Cas 단백질과 조합으로 외인성 수복 템플레이트 사용은 상동성-지향된 수복을 촉진시킴으로써 표적 게놈 유전자좌에서 더욱 정확한 변형을 초래할 수 있다.
그와 같은 방법에서, Cas 단백질은 단일-가닥 절단 (닉) 또는 이중-가닥 절단을 창출하기 위해 표적 게놈 유전자좌를 절단시키고, 외인성 수복 템플레이트는 비-상동 말단 연결 (NHEJ)-매개된 결찰을 통해 또는 상동성-지향된 수복 사건을 통해 표적 핵산을 재조합시킨다. 임의로, 외인성 수복 템플레이트로 수복은 가이드 RNA 인식 서열 또는 Cas 절단 부위를 제거 또는 파괴시켜 이로써 표적화된 대립유전자는 Cas 단백질에 의해 재-표적화될 수 없다.
외인성 수복 템플레이트는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)를 포함할 수 있고, 이들은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 이들은 선형 또는 원형 형태일 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODN)일 수 있다. 참고, 예를 들면, Yoshimi 등 (2016) Nat. Commun. 7:10431, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 예시적 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 5 kb이거나, 길이 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 3 kb이거나, 또는 길이 약 50 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드이다. 다른 예시적 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 40 내지 약 200개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 대안적으로, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 약 200, 약 200 내지 약 300, 약 300 내지 약 400, 약 400 내지 약 500, 약 500 내지 약 600, 약 600 내지 약 700, 약 700 내지 약 800, 약 800 내지 약 900, 또는 약 900 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 대안적으로, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 약 2 kb 내지 약 2.5 kb, 약 2.5 kb 내지 약 3 kb, 약 3 kb 내지 약 3.5 kb, 약 3.5 kb 내지 약 4 kb, 약 4 kb 내지 약 4.5 kb, 또는 약 4.5 kb 내지 약 5 kb일 수 있다. 대안적으로, 외인성 수복 템플레이트는, 예를 들어, 길이 5 kb, 4.5 kb, 4 kb, 3.5 kb, 3 kb, 2.5 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb, 900개의 뉴클레오타이드, 800개의 뉴클레오타이드, 700개의 뉴클레오타이드, 600개의 뉴클레오타이드, 500개의 뉴클레오타이드, 400개의 뉴클레오타이드, 300개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드, 또는 50개의 뉴클레오타이드 이하일 수 있다. 1-세포기 배아 이외의 세포 유형에서, 외인성 수복 템플레이트 (예를 들면, 표적화 벡터)는 더 길 수 있다. 예를 들어, 1-세포기 배아 이외의 세포 유형에서, 외인성 수복 템플레이트는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 큰 표적화 벡터 (LTVEC)일 수 있다.
일 예에서, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 80개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드인 ssODN이다. 또 다른 예에서, 외인성 수복 템플레이트는 길이 약 80개의 뉴클레오타이드 내지 약 3 kb인 ssODN이다. 그와 같은 ssODN은, 예를 들어, 길이 각각 약 40개의 뉴클레오타이드 내지 약 60개의 뉴클레오타이드인 상동성 아암을 가질 수 있다. 그와 같은 ssODN은 또한, 예를 들어, 길이 각각 약 30개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드인 상동성 아암을 가질 수 있다. 상동성 아암은 대칭 (예를 들면, 길이 각각 40개의 뉴클레오타이드 또는 각각 60개의 뉴클레오타이드)일 수 있거나, 이들은 비대칭 (예를 들면, 길이 36개의 뉴클레오타이드인 하나의 상동성 아암, 및 길이 91개의 뉴클레오타이드인 하나의 상동성 아암)일 수 있다.
외인성 수복 템플레이트는 추가의 바람직한 피쳐 (예를 들면, 변형된 또는 조절된 안정성; 형광 표지로 추적 또는 검출; 단백질 또는 단백질 복합체용 결합 부위; 및 기타 등등)을 제공하는 변형 또는 서열을 포함할 수 있다. 외인성 수복 템플레이트는 하나 이상의 형광 표지, 정제 태그, 에피토프 태그, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 하나 이상의 형광 표지 (예를 들면, 형광 단백질 또는 다른 형광단 또는 염료), 예컨대 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5 형광 표지를 포함할 수 있다. 예시적 형광 표지는 형광단 예컨대 플루오레신 (예를 들면, 6-카복시플루오레신 (6-FAM)), 텍사스 레드, HEX, Cy3, Cy5, Cy5.5, 퍼시픽 블루, 5-(및-6)-카복시테트라메틸로다민 (TAMRA), 및 Cy7을 포함한다. 광범위한 형광 염료는 (예를 들면, Integrated DNA Technologies제) 올리고뉴클레오타이드 표지화를 위하여 상업적으로 이용가능하다. 그와 같은 형광 표지 (예를 들면, 내부 형광 표지)는, 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트의 말단과 양립가능한 돌출되는 말단을 갖는 절단된 표적 핵산에 직접적으로 통합된 외인성 수복 템플레이트를 검출하는데 사용될 수 있다. 표지 또는 태그는 외인성 수복 템플레이트 이내 5' 말단, 3' 말단, 또는 내부적일 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 Integrated DNA Technologies제 IR700 형광단 (5'IRDYE®700)으로 5' 말단에 콘주게이션될 수 있다.
외인성 수복 템플레이트는 또한 표적 게놈 유전자좌에 통합되도록 DNA의 분절을 포함하는 핵산 삽입물을 포함할 수 있다. 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물의 통합은 표적 게놈 유전자좌에 관심의 핵산 서열의 부가, 표적 게놈 유전자좌에서 관심의 핵산 서열의 결실, 또는 표적 게놈 유전자좌에서 관심의 핵산 서열의 대체 (즉, 결실 및 삽입)을 초래할 수 있다. 일부 외인성 수복 템플레이트는 표적 게놈 유전자좌에서 임의의 상응하는 결실 없이 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물의 삽입용으로 설계된다. 다른 외인성 수복 템플레이트는 핵산 삽입물의 임의의 상응하는 삽입 없이 표적 게놈 유전자좌에서 관심의 핵산 서열을 결실시키도록 설계된다. 더욱 다른 외인성 수복 템플레이트는 표적 게놈 유전자좌에서 관심의 핵산 서열을 결실시키도록 그리고 그것을 핵산 삽입물로 대체시키도록 설계된다.
결실될 및/또는 대체될 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 다양한 길이일 수 있다. 결실될 및/또는 대체될 표적 게놈 유전자좌에서 예시적 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 길이 약 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 5 kb이거나 길이 약 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 결실될 및/또는 대체될 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 길이 약 1 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 마찬가지로, 결실될 및/또는 대체될 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 길이 약 1 내지 약 100, 약 100 내지 약 200, 약 200 내지 약 300, 약 300 내지 약 400, 약 400 내지 약 500, 약 500 내지 약 600, 약 600 내지 약 700, 약 700 내지 약 800, 약 800 내지 약 900, 또는 약 900 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 마찬가지로, 결실될 및/또는 대체될 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 길이 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 약 2 kb 내지 약 2.5 kb, 약 2.5 kb 내지 약 3 kb, 약 3 kb 내지 약 3.5 kb, 약 3.5 kb 내지 약 4 kb, 약 4 kb 내지 약 4.5 kb, 또는 약 4.5 kb 내지 약 5 kb일 수 있다. 표적 게놈 유전자좌로부터 결실될 핵산은 또한 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 70 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 600 kb, 약 600 kb 내지 약 700 kb, 약 700 kb 내지 약 800 kb, 약 800 kb 내지 약 900 kb, 약 900 kb 내지 약 1 Mb 또는 더 길 수 있다. 대안적으로, 표적 게놈 유전자좌로부터 결실될 핵산은 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb, 약 3 Mb 내지 약 4 Mb, 약 4 Mb 내지 약 5 Mb, 약 5 Mb 내지 약 10 Mb, 약 10 Mb 내지 약 20 Mb, 약 20 Mb 내지 약 30 Mb, 약 30 Mb 내지 약 40 Mb, 약 40 Mb 내지 약 50 Mb, 약 50 Mb 내지 약 60 Mb, 약 60 Mb 내지 약 70 Mb, 약 70 Mb 내지 약 80 Mb, 약 80 Mb 내지 약 90 Mb, 또는 약 90 Mb 내지 약 100 Mb일 수 있다.
핵산 삽입물은 게놈 DNA 또는 임의의 다른 유형의 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 삽입물은 원핵생물, 진핵생물, 효모, 새 (예를 들면, 닭), 비-인간 포유동물, 설치류, 인간, 랫트, 마우스, 햄스터, 토끼, 돼지, 소, 사슴, 양, 염소, 고양이, 개, 흰담비, 영장류 (예를 들면, 마모셋, 붉은털원숭이), 사육된 포유동물, 농업 포유동물, 거북, 또는 관심의 임의의 다른 유기체로부터일 수 있다.
핵산 삽입물은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부 (예를 들면, 자가-항원의 특정 모티프 또는 영역을 인코딩하는 유전자의 한 부분)에 상동성 또는 오쏘로그성인 서열을 포함할 수 있다. 상동성 서열은 상이한 종 또는 동일한 종으로부터일 수 있다. 예를 들어, 핵산 삽입물은 표적 게놈 유전자좌에서 대체를 위하여 표적화된 서열과 비교하여 하나 이상의 점 돌연변이 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 초과)를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 임의로, 그와 같은 점 돌연변이는 인코딩된 폴리펩타이드에서 보존적 아미노산 치환 (예를 들면, 아스파르트산 [Asp, D]의 글루탐산 [Glu, E]로의 치환)을 초래할 수 있다.
결실될 및/또는 대체될 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물 또는 상응하는 핵산은 코딩 영역 예컨대 엑손; 비-코딩 영역 예컨대 인트론, 미번역된 영역, 또는 조절 영역 (예를 들면, 프로모터, 인핸서, 또는 전사 억제인자-결합 요소); 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
핵산 삽입물은 또한 조건적 대립유전자를 포함할 수 있다. 조건적 대립유전자는, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입된, US 2011/0104799에서 기재된 바와 같이, 다작용성 대립유전자일 수 있다. 예를 들어, 조건적 대립유전자는 하기를 포함할 수 있다: (a) 표적 유전자의 전사에 관하여 센스 방향에서 구동 서열; (b) 센스 또는 안티센스 방향에서 약물 선택 카셋트 (DSC); (c) 안티센스 방향에서 관심의 뉴클레오타이드 서열 (NSI); 및 (d) 역방향 배향에서 조건적 역전 모듈 (엑손-할피 인트론 및 가역 유전자-트랩-유사 모듈을 이용하는, COIN). 참고, 예를 들면, US 2011/0104799.조건적 대립유전자는 (i) 구동 서열 및 DSC가 부족한; 그리고 (ii) 센스 방향에서 NSI 및 안티센스 방향에서 COIN을 함유하는 조건적 대립유전자를 형성하기 위해 제1 재조합효소에 노출시 재조합하는 재조합가능 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2011/0104799.
핵산 삽입물은 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 또한 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산 삽입물은 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 부족할 수 있다. 선택 마커는 선택 카셋트에서 함유될 수 있다. 임의로, 선택 카셋트는 자가-결실 카셋트일 수 있다. 참고, 예를 들면, US 8,697,851 및 US 2013/0312129, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 예로서, 자가-결실 카셋트는 마우스 Prm1 프로모터에 작동가능하게 연결된 (인트론에 의해 분리되는, Cre 재조합효소를 인코딩하는 2 엑손을 포함하는) Crei 유전자 및 인간 유비퀴틴 프로모터에 작동가능하게 연결된 네오마이신 저항 유전자를 포함할 수 있다. Prm1 프로모터를 이용함으로써, 자가-결실 카셋트는 F0 동물의 숫컷 세균 세포에서 특이적으로 결실될 수 있다. 예시적 선택 마커는 네오마이신 인산전달효소 (neor), 하이그로마이신 B 인산전달효소 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸전달효소 (puror), 블라스티사이딘 S 데아미나제 (bsrr), 잔틴/구아닌 포스포리보실 전달효소 (gpt), 또는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-k), 또는 이의 조합을 포함한다. 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화될 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된다.
핵산 삽입물은 또한 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 예시적 리포터 유전자는 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 향상된 황색 형광 단백질 (eYFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 향상된 청색 형광 단백질 (eBFP), DsRed, ZsGreen, MmGFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 에메랄드, CyPet, 세룰리안, T-사파이어, 및 알칼리성 포스파타제를 인코딩하는 것을 포함한다. 그와 같은 리포터 유전자는 표적화될 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터의 예는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된다.
핵산 삽입물은 하나 이상의 발현 카셋트 또는 결실 카셋트를 또한 포함할 수 있다. 주어진 카셋트는 발현에 영향을 미치는 다양한 조절 구성요소와 함께, 관심의 뉴클레오타이드 서열, 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 리포터 유전자의 하나 이상을 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 선택가능한 마커 및 리포터 유전자의 예는 본 명세서에서 다른 곳에 상세히 논의된다.
핵산 삽입물은 부위-특이적 재조합 표적 서열로 측접된 핵산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산 삽입물은 하나 이상의 부위-특이적 재조합 표적 서열을 포함할 수 있다. 전체 핵산 삽입물이 그와 같은 부위-특이적 재조합 표적 서열에 의해 측접될 수 있어도, 핵산 삽입물 이내 관심의 임의의 영역 또는 개별 폴리뉴클레오타이드는 그와 같은 부위에 의해 또한 측접될 수 있다. 핵산 삽입물에서 관심의 핵산 삽입물 또는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 측접할 수 있는, 부위-특이적 재조합 표적 서열은, 예를 들어, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일 예에서, 부위-특이적 재조합 부위는 핵산 삽입물 이내 함유된 리포터 유전자 및/또는 선택 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 측접한다. 표적화된 유전자좌에서 핵산 삽입물의 통합 이후, 부위-특이적 재조합 부위 사이 서열은 제거될 수 있다. 임의로, 부위-특이적 재조합 부위를 포함하는 핵산 삽입물을 각각 가진, 2 외인성 수복 템플레이트는 사용될 수 있다. 외인성 수복 템플레이트는 관심의 핵산을 측접하는 5' 및 3' 영역에 표적화될 수 있다. 표적 게놈 유전자좌에 2 핵산 삽입물의 통합 이후, 2 삽입된 부위-특이적 재조합 부위 사이 관심의 핵산은 제거될 수 있다.
핵산 삽입물은, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 및 유형 IV 엔도뉴클레아제를 포함하는, 제한 엔도뉴클레아제 (즉, 제한 효소)에 대하여 하나 이상의 제한 부위를 또한 포함할 수 있다. 유형 I 및 유형 III 제한 엔도뉴클레아제는 특정 인식 부위를 인식하지만, 절단 부위 (인식 부위)로부터 떨어져 있는 수백 염기 쌍일 수 있는, 뉴클레아제 결합 부위로부터 가변 위치에서 전형적으로 절단시킨다. 유형 II 시스템에서 제한 활성은 임의의 메틸화효소 활성에 독립적이고, 절단은 전형적으로 결합 부위 이내 또는 근처 특정 부위에서 발생한다. 대부분의 유형 II 효소는 회문성 서열을 컷팅하지만, 그러나 유형 IIa 효소는 비-회문성 인식 부위를 인식하고 인식 부위의 외부를 절단시키고, 유형 IIb 효소는 인식 부위의 외부 양쪽 부위로 2회 서열을 컷팅하고, 유형 IIs 효소는 비대칭 인식 부위를 인식하고 한쪽에서 그리고 인식 부위로부터 약 1-20개의 뉴클레오타이드의 한정된 거리에서 절단한다. 유형 IV 제한 효소는 메틸화된 DNA를 표적한다. 제한 효소는, 예를 들어 하기에서 추가로 기재 및 분류된다: REBASE 데이터베이스 (webpage at rebase.neb.com; Roberts 등, (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420; Roberts 등, (2003) Nucleic Acids Res. 31:1805-1812; 및 Belfort 등 (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie 등, (ASM Press, Washington, DC)).
(1) 비-상동-말단-연결-매개된 삽입용 수복 템플레이트
일부 외인성 수복 템플레이트는 표적 게놈 유전자좌에서 Cas-단백질-매개된 절단에 의해 창출된 하나 이상의 돌출부에 상보성인 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 짧은 단일-가닥 영역을 갖는다. 이들 돌출부는 또한 5' 및 3' 상동성 아암으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 일부 외인성 수복 템플레이트는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 및/또는 3' 표적 서열에 Cas-단백질-매개된 절단에 의해 창출된 하나 이상의 돌출부에 상보성인 5' 말단 및/또는 3' 말단에 짧은 단일-가닥 영역을 갖는다. 그와 같은 일부 외인성 수복 템플레이트는 5' 말단에서만 또는 3' 말단에서만 상보성 영역을 갖는다. 예를 들어, 그와 같은 일부 외인성 수복 템플레이트는 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 창출된 돌출부에 상보성인 5' 말단에서만 또는 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 창출된 돌출부에 상보성인 3' 말단에서만 상보성 영역을 갖는다. 다른 그와 같은 외인성 수복 템플레이트는 양쪽 5' 및 3' 말단에서 상보성 영역을 갖는다. 예를 들어, 다른 그와 같은 외인성 수복 템플레이트는, 각각, 표적 게놈 유전자좌에서 Cas-매개된 절단에 의해 생성된, 예를 들면, 제1 및 제2 돌출부에 상보성인 양쪽 5' 및 3' 말단에서 상보성 영역을 갖는다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트가 이중-가닥이면, 단일-가닥 상보성 영역은, 각각의 말단에서 5' 돌출부를 창출하는, 수복 템플레이트의 최상부 가닥의 5' 말단 그리고 수복 템플레이트의 최하부 가닥의 5' 말단으로부터 확장할 수 있다. 대안적으로, 단일-가닥 상보성 영역은, 3' 돌출부를 창출하는, 수복 템플레이트의 최상부 가닥의 3' 말단으로부터 그리고 템플레이트의 최하부 가닥의 3' 말단으로부터 확장할 수 있다.
상보성 영역은 외인성 수복 템플레이트와 상기 표적 핵산 사이 결찰을 촉진시키기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예시적 상보성 영역은 길이 약 1 내지 약 5개의 뉴클레오타이드, 길이 약 1 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 또는 길이 약 5 내지 약 150개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 상보성 영역은 길이 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 대안적으로, 상보성 영역은 길이 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150개의 뉴클레오타이드, 또는 더 길 수 있다.
그와 같은 상보성 영역은 니카제의 2 쌍에 의해 창출된 돌출부에 상보성일 수 있다. 엇갈린 말단을 가진 2 이중-가닥 절단은 제1 이중-가닥 절단을 창출하기 위해 DNA의 반대편 가닥을 절단시키는 제1 및 제2 니카제, 그리고 제2 이중-가닥 절단을 창출하기 위해 DNA의 반대편 가닥을 절단시키는 제3 및 제4 니카제 사용에 의해 창출될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 제1, 제2, 제3, 및 제4 가이드 RNAs와 상응하는 제1, 제2, 제3, 및 제4 가이드 RNA 인식 서열을 닉킹하는데 사용될 수 있다. 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 DNA의 제1 및 제2 가닥에서 제1 및 제2 니카제에 의해 창출된 닉이 이중-가닥 절단을 창출하도록 제1 절단 부위를 창출하기 위해 배치될 수 있다 (즉, 제1 절단 부위는 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 이내 닉을 포함한다). 마찬가지로, 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열은 DNA의 제1 및 제2 가닥에서 제3 및 제4 니카제에 의해 창출된 닉이 이중-가닥 절단을 창출하도록 제2 절단 부위를 창출하기 위해 배치될 수 있다 (즉, 제2 절단 부위는 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열 이내 닉을 포함한다). 바람직하게는, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 및/또는 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열 이내 닉은 돌출부를 창출하는 오프-세트 닉일 수 있다. 오프세트 윈도우는, 예를 들어, 적어도 약 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp 또는 초과일 수 있다. 참고 Ran 등 (2013) Cell 154:1380-1389; Mali 등 (2013) Nat. Biotech. 31:833-838; 및 Shen 등 (2014) Nat. Methods 11:399-404, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 경우에, 이중-가닥 외인성 수복 템플레이트는 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 이내 닉에 의해 그리고 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열 이내 닉에 의해 창출된 돌출부에 상보성인 단일-가닥 상보성 영역으로 설계될 수 있다. 그와 같은 외인성 수복 템플레이트는 그 다음 비-상동-말단-연결-매개된 결찰에 의해 삽입될 수 있다.
(2) 상동성-지향된 수복에 의한 삽입용 수복 템플레이트
일부 외인성 수복 템플레이트는 상동성 아암을 포함한다. 외인성 수복 템플레이트가 또한 핵산 삽입물을 포함하면, 상동성 아암은 핵산 삽입물을 측접시킬 수 있다. 참조의 편의를 위하여, 상동성 아암은 본 명세서에서 5' 및 3' (즉, 업스트림 및 다운스트림) 상동성 아암으로서 지칭된다. 이러한 용어는 외인성 수복 템플레이트 이내 핵산 삽입물에 대한 상동성 아암의 상대 위치에 관련한다. 5' 및 3' 상동성 아암은, 본 명세서에서 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열", 각각으로서 지칭되는, 표적 게놈 유전자좌 이내 영역에 상응한다.
상동성 아암 및 표적 서열은 2 영역이 상동 재조합 반응용 기질로서 작용하기 위해 서로에 서열 동일성의 충분한 수준을 공유하는 경우 서로에 "상응한다" 또는 "상응하는" 것이다. 용어 "상동성"은 어느 한쪽 동일하거나 또는 상응하는 서열에 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 외인성 수복 템플레이트에서 발견된 상응하는 상동성 아암과 주어진 표적 서열 사이 서열 동일성은 상동 재조합이 발생하도록 하는 서열 동일성의 임의의 정도일 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트 (또는 이의 단편) 및 표적 서열 (또는 이의 단편)의 상동성 아암에 의해 공유된 서열 동일성의 양은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성일 수 있어서, 이로써 서열은 상동 재조합을 겪는다. 또한, 상동성 아암과 상응하는 표적 서열 사이 상동성의 상응하는 영역은 상동 재조합을 촉진시키는데 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예시적 상동성 아암은 길이 약 25개의 뉴클레오타이드 내지 약 2.5 kb이거나, 길이 약 25개의 뉴클레오타이드 내지 약 1.5 kb이거나, 또는 길이 약 25 내지 약 500개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 주어진 상동성 아암 (또는 각각의 상동성 아암) 및/또는 상응하는 표적 서열은 길이 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 200 내지 약 250, 약 250 내지 약 300, 약 300 내지 약 350, 약 350 내지 약 400, 약 400 내지 약 450, 또는 약 450 내지 약 500개의 뉴클레오타이드인 상동성의 상응하는 영역을 포함할 수 있어서, 이로써 상동성 아암은 표적 핵산 이내 상응하는 표적 서열과 상동 재조합을 겪기 위해 충분한 상동성을 갖는다. 대안적으로, 주어진 상동성 아암 (또는 각각의 상동성 아암) 및/또는 상응하는 표적 서열은 길이 약 0.5 kb 내지 약 1 kb, 약 1 kb 내지 약 1.5 kb, 약 1.5 kb 내지 약 2 kb, 또는 약 2 kb 내지 약 2.5 kb인 상동성의 상응하는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상동성 아암은 각각 길이 약 750개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 상동성 아암은 대칭 (각각 길이가 약 동일한 크기)일 수 있거나, 또는 이들은 비대칭일 (다른 것보다 더 길) 수 있다.
상동성 아암은 세포에 원상태인 유전자좌 (예를 들면, 표적화된 유전자좌)에 상응할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 이들은, 예를 들어, 이식유전자, 발현 카셋트, 또는 DNA의 이종성 또는 외인성 영역을 포함하여, 세포의 게놈에 통합되었던 DNA의 이종성 또는 외인성 분절의 영역에 상응할 수 있다. 대안적으로, 표적화 벡터의 상동성 아암은 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체의 영역, 또는 적절한 숙주 세포에서 함유된 임의의 다른 조작된 영역에 상응할 수 있다. 한층 더, 표적화 벡터의 상동성 아암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리, 또는 P1 파아지 라이브러리의 영역에 상응할 수 있거나 상기로부터 유래될 수 있거나, 또는 합성 DNA로부터 유래될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템이 외인성 수복 템플레이트와 조합으로 사용되는 경우, 5' 및 3' 표적 서열은 바람직하게는 Cas 절단 부위에서 단일-가닥 절단 (닉) 또는 이중-가닥 절단상의 상동성 아암과 표적 서열 사이 상동성 재조합 사건의 발생을 촉진시키기 위해 Cas 절단 부위에 충분히 근접하여 (예를 들면, 가이드 RNA 인식 서열에 충분한 근접 이내) 정위된다. 용어 "Cas 절단 부위"는 닉 또는 이중-가닥 절단이 Cas 효소 (예를 들면, 가이드 RNA로 복합체화된 Cas9 단백질)에 의해 창출되는 DNA 서열을 포함한다. 외인성 수복 템플레이트의 5' 및 3' 상동성 아암에 상응하는 표적화된 유전자좌 이내 표적 서열은 거리가 예컨대 Cas 절단 부위에서 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단 상의 상동성 아암과 5' 및 3' 표적 서열 사이 상동성 재조합 사건의 발생을 촉진시키는 것이면 Cas 절단 부위에 "충분히 근접하여 정위된"다. 따라서, 외인성 수복 템플레이트의 5' 및/또는 3' 상동성 아암에 상응하는 표적 서열은, 예를 들어, 주어진 Cas 절단 부위의 적어도 1개의 뉴클레오타이드 이내 또는 주어진 Cas 절단 부위의 적어도 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 1,000개의 뉴클레오타이드 이내일 수 있다. 예로서, Cas 절단 부위는 표적 서열의 적어도 한쪽 또는 양쪽에 바로 인접할 수 있다.
대안적으로, 주어진 절단 부위는 5' 표적 서열, 3' 표적 서열, 또는 양쪽 표적 서열로부터 가변 길이일 수 있다. 예를 들어, 2 가이드 RNAs가 사용되면, 제1 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및/또는 제2 절단 부위는 5' 및 3' 표적 서열 사이 정위될 수 있거나 또는 5' 표적 서열 및/또는 3' 표적 서열에 인접 또는 근접될 수 있고, 예컨대 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 150 kb, 160 kb, 170 kb, 180 kb, 190 kb, 200 kb, 250 kb, 300 kb, 350 kb, 400 kb, 450 kb, 또는 500 kb의 5' 및/또는 3' 표적 서열 이내일 수 있다. 대안적으로, 제1 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및/또는 제2 절단 부위는 5' 및/또는 3' 표적 서열로부터 적어도 50 bp, 적어도 100 bp, 적어도 200 bp, 적어도 300 bp, 적어도 400 bp, 적어도 500 bp, 적어도 600 bp, 적어도 700 bp, 적어도 800 bp, 적어도 900 bp, 적어도 1 kb, 적어도 2 kb, 적어도 3 kb, 적어도 4 kb, 적어도 5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 7 kb, 적어도 8 kb, 적어도 9 kb, 적어도 10 kb, 적어도 20 kb, 적어도 30 kb, 적어도 40 kb, 적어도 50 kb, 적어도 60 kb, 적어도 70 kb, 적어도 80 kb, 적어도 90 kb, 적어도 100 kb, 적어도 110 kb, 적어도 120 kb, 적어도 130 kb, 적어도 140 kb, 적어도 150 kb, 적어도 160 kb, 적어도 170 kb, 적어도 180 kb, 적어도 190 kb, 적어도 200 kb, 적어도 250 kb, 적어도 300 kb, 적어도 350 kb, 적어도 400 kb, 적어도 450 kb, 또는 적어도 500 kb 정위될 수 있다. 예를 들어, 제1 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및/또는 제2 절단 부위는 5' 및/또는 3' 표적 서열로부터 약 50 bp 내지 약 100 bp, 약 200 bp 내지 약 300 bp, 약 300 bp 내지 약 400 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 약 900 bp 내지 약 1 kb, 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 2 kb 내지 약 3 kb, 약 3 kb 내지 약 4 kb, 약 4 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 또는 약 400 kb 내지 약 500 kb 정위될 수 있다. 대안적으로, 제1 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및/또는 제2 절단 부위는 5' 및/또는 3' 표적 서열로부터 50 bp 초과, 100 bp 초과, 200 bp 초과, 300 bp 초과, 400 bp 초과, 500 bp 초과, 600 bp 초과, 700 bp 초과, 800 bp 초과, 900 bp 초과, 1 kb 초과, 2 kb 초과, 3 kb 초과, 4 kb 초과, 5 kb 초과, 6 kb 초과, 7 kb 초과, 8 kb 초과, 9 kb 초과, 10 kb 초과, 20 kb 초과, 30 kb 초과, 40 kb 초과, 50 kb 초과, 60 kb 초과, 70 kb 초과, 80 kb 초과, 90 kb 초과, 또는 100 kb 초과 정위될 수 있다. 예를 들어, 제1 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 절단 부위는 5' 표적 서열로부터 또는 양쪽 5' 및 3' 표적 서열로부터 50 bp 초과, 100 bp 초과, 200 bp 초과, 300 bp 초과, 400 bp 초과, 500 bp 초과, 600 bp 초과, 700 bp 초과, 800 bp 초과, 900 bp 초과, 1 kb 초과, 2 kb 초과, 3 kb 초과, 4 kb 초과, 5 kb 초과, 6 kb 초과, 7 kb 초과, 8 kb 초과, 9 kb 초과, 10 kb 초과, 20 kb 초과, 30 kb 초과, 40 kb 초과, 50 kb 초과, 60 kb 초과, 70 kb 초과, 80 kb 초과, 90 kb 초과, 또는 100 kb 초과 정위될 수 있다. 마찬가지로, 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제2 절단 부위는 3' 표적 서열로부터 또는 양쪽 5' 및 3' 표적 서열로부터 50 bp 초과, 100 bp 초과, 200 bp 초과, 300 bp 초과, 400 bp 초과, 500 bp 초과, 600 bp 초과, 700 bp 초과, 800 bp 초과, 900 bp 초과, 1 kb 초과, 2 kb 초과, 3 kb 초과, 4 kb 초과, 5 kb 초과, 6 kb 초과, 7 kb 초과, 8 kb 초과, 9 kb 초과, 10 kb 초과, 20 kb 초과, 30 kb 초과, 40 kb 초과, 50 kb 초과, 60 kb 초과, 70 kb 초과, 80 kb 초과, 90 kb 초과, 또는 100 kb 초과 정위될 수 있다.
외인성 수복 템플레이트의 상동성 아암에 상응하는 표적 서열 및 Cas 절단 부위의 공간적 관계는 변할 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 Cas 절단 부위에 5' 정위될 수 있거나, 표적 서열은 Cas 절단 부위에 3' 정위될 수 있거나, 또는 표적 서열은 Cas 절단 부위를 측접시킬 수 있다.
1-세포기 배아 이외의 세포에서, 외인성 수복 템플레이트는, 세포에서 상동성 재조합을 수행하기 위해 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용된 것보다 더 큰 핵산 서열로부터 유래되는 그리고 상기에 상응하는 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터를 포함하는, "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"일 수 있다. LTVECs는 또한 세포에서 상동성 재조합을 수행하기 위해 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용된 것보다 더 큰 핵산 서열을 갖는 핵산 삽입물을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들어, LTVECs는 그것의 크기 제한 때문에 전통적 플라스미드-기반된 표적화 벡터에 의해 수용될 수 없는 큰 유전자좌의 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 표적화된 유전자좌는 종래의 방법을 사용하여 표적화가능하지 않은 또는 뉴클레아제 제제 (예를 들면, Cas 단백질)에 의해 유도된 닉 또는 이중-가닥 절단의 부재 하에서 단지 상당히 낮은 효율로 또는 단지 부정확하게 표적화될 수 있는 세포의 유전자좌일 수 있다 (즉, 5' 및 3' 상동성 아암은 상기에 상응할 수 있다).
LTVECs의 예는 박테리아 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체, 또는 효모 인공 염색체 (YAC)로부터 유래된 벡터를 포함한다. LTVECs 및 이들의 제조 방법의 비-제한 예는, 예를 들면, 이들의 각각이 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입되는, 미국 특허 번호 6,586,251; 6,596,541; 및 7,105,348; 및 WO 2002/036789에서 기재된다. LTVECs는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있다.
LTVECs는 임의의 길이일 수 있고 전형적으로 길이 적어도 10 kb이다. 예를 들어, LTVEC는 약 50 kb 내지 약 300 kb, 약 50 kb 내지 약 75 kb, 약 75 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 125 kb, 약 125 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 175 kb, 약 175 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 225 kb, 약 225 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 275 kb 또는 약 275 kb 내지 약 300 kb일 수 있다. LTVEC는 또한 약 50 kb 내지 약 500 kb, 약 100 kb 내지 약 125 kb, 약 300 kb 내지 약 325 kb, 약 325 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 375 kb, 약 375 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 425 kb, 약 425 kb 내지 약 450 kb, 약 450 kb 내지 약 475 kb, 또는 약 475 kb 내지 약 500 kb일 수 있다. 대안적으로, LTVEC는 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 30 kb, 적어도 40 kb, 적어도 50 kb, 적어도 60 kb, 적어도 70 kb, 적어도 80 kb, 적어도 90 kb, 적어도 100 kb, 적어도 150 kb, 적어도 200 kb, 적어도 250 kb, 적어도 300 kb, 적어도 350 kb, 적어도 400 kb, 적어도 450 kb, 또는 적어도 500 kb 또는 초과일 수 있다. LTVEC의 크기는 종래의 검정, 예를 들면, 서던 블랏팅 및 광범위 (예를 들면, 1 kb 내지 5 kb) PCR에 의한 표적화 사건의 스크리닝을 가능하게 하기에 너무 클 수 있다.
LTVEC에서 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암의 총계는 전형적으로 적어도 10 kb이다. 예로서, 5' 상동성 아암은 약 5 kb 내지 약 100 kb 범위일 수 있고/있거나 3' 상동성 아암은 약 5 kb 내지 약 100 kb 범위일 수 있다. 또 다른 예로서, 5' 상동성 아암은 약 5 kb 내지 약 150 kb 범위일 수 있고/있거나 3' 상동성 아암은 약 5 kb 내지 약 150 kb 범위일 수 있다. 각각의 상동성 아암은, 예를 들어, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 70 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb일 수 있다. 5' 및 3' 상동성 아암의 총계는, 예를 들어, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 30 kb, 약 30 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 70 kb, 약 70 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 90 kb, 약 90 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 110 kb, 약 110 kb 내지 약 120 kb, 약 120 kb 내지 약 130 kb, 약 130 kb 내지 약 140 kb, 약 140 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 160 kb, 약 160 kb 내지 약 170 kb, 약 170 kb 내지 약 180 kb, 약 180 kb 내지 약 190 kb, 또는 약 190 kb 내지 약 200 kb일 수 있다. 5' 및 3' 상동성 아암의 총계는 또한, 예를 들어, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 또는 약 350 kb 내지 약 400 kb일 수 있다. 대안적으로, 각각의 상동성 아암은 적어도 5 kb, 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 30 kb, 적어도 40 kb, 적어도 50 kb, 적어도 60 kb, 적어도 70 kb, 적어도 80 kb, 적어도 90 kb, 적어도 100 kb, 적어도 110 kb, 적어도 120 kb, 적어도 130 kb, 적어도 140 kb, 적어도 150 kb, 적어도 160 kb, 적어도 170 kb, 적어도 180 kb, 적어도 190 kb, 또는 적어도 200 kb일 수 있다. 마찬가지로, 5' 및 3' 상동성 아암의 총계는 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 30 kb, 적어도 40 kb, 적어도 50 kb, 적어도 60 kb, 적어도 70 kb, 적어도 80 kb, 적어도 90 kb, 적어도 100 kb, 적어도 110 kb, 적어도 120 kb, 적어도 130 kb, 적어도 140 kb, 적어도 150 kb, 적어도 160 kb, 적어도 170 kb, 적어도 180 kb, 적어도 190 kb, 또는 적어도 200 kb일 수 있다. 각각의 상동성 아암은 또한 적어도 250 kb, 적어도 300 kb, 적어도 350 kb, 또는 적어도 400 kb일 수 있다.
LTVECs는 세포에서 상동성 재조합을 수행하기 위해 의도된 다른 접근법에 의해 전형적으로 사용된 것보다 더 큰 핵산 서열을 갖는 핵산 삽입물을 포함할 수 있다. 예를 들어, LTVEC는 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 또는 초과 범위의 핵산 삽입물을 포함할 수 있다. LTVEC는 또한, 예를 들어, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 400 kb 내지 약 450 kb, 약 450 kb 내지 약 500 kb, 또는 초과 범위의 핵산 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 핵산 삽입물은 적어도 1 kb, 적어도 5 kb, 적어도 10 kb, 적어도 20 kb, 적어도 30 kb, 적어도 40 kb, 적어도 60 kb, 적어도 80 kb, 적어도 100 kb, 적어도 150 kb, 적어도 200 kb, 적어도 250 kb, 적어도 300 kb, 적어도 350 kb, 적어도 400 kb, 적어도 450 kb, 또는 적어도 500 kb일 수 있다.
D. 세포의 게놈 접촉 및 세포에 핵산 또는 단백질 도입
세포의 게놈 접촉은 하나 이상의 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 이상의 가이드 RNAs 또는 가이드 RNAs (즉, 하나 이상의 CRISPR RNAs 및 하나 이상의 tracrRNAs)를 인코딩하는 핵산, 및 하나 이상의 외인성 수복 템플레이트를 세포에 도입하는 것을 포함할 수 있고, 단, 세포가 1-세포기 배아이면, 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 길이 5 kb 미만일 수 있다. 세포의 게놈 접촉 (예를 들면, 세포 접촉)은 상기 구성요소의 단 하나, 구성요소의 하나 이상, 또는 모든 구성요소를 세포에 도입하는 것을 포함할 수 있다. "도입"은 서열이 세포의 내측에 접근하는 그와 같은 방식으로 핵산 또는 단백질을 세포에 제시하는 것을 포함한다. 도입은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있고, 구성요소의 하나 이상 (예를 들면, 구성요소의 둘, 또는 모든 구성요소)가 세포에 동시에 또는 임의의 조합으로 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트는 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입에 앞서 도입될 수 있거나, Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입 이후 도입될 수 있다 (예를 들면, 외인성 수복 템플레이트는 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 도입 약 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 또는 72 시간 전 또는 후 투여될 수 있다). 참고, 예를 들면, US 2015/0240263 및 US 2015/0110762, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
Cas 단백질은 단백질, 예컨대 gRNA로 복합체화된 Cas 단백질의 형태로, 또는 Cas 단백질을 인코딩하는 핵산, 예컨대 RNA (예를 들면, 메신저 RNA (mRNA)) 또는 DNA의 형태로 세포에 도입될 수 있다. DNA의 형태로 도입된 경우, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그와 같은 DNAs는 하나 이상의 발현 작제물일 수 있다.
가이드 RNA는 RNA의 형태로 또는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 세포에 도입될 수 있다. DNA의 형태로 도입된 경우, 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA는 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그와 같은 DNAs는 하나 이상의 발현 작제물일 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 발현 작제물은 단일 핵산 분자의 구성요소일 수 있다. 대안적으로, 이들은 둘 이상의 핵산 분자 중에서 임의의 조합으로 분리될 수 있다 (즉, 하나 이상의 CRISPR RNAs를 인코딩하는 DNAs 및 하나 이상의 tracrRNAs를 인코딩하는 DNAs는 별개의 핵산 분자의 구성요소일 수 있다).
일부 방법에서, 뉴클레아제 제제 (예를 들면, Cas 단백질 및 가이드 RNA)를 인코딩하는 DNA 및/또는 외인성 수복 템플레이트를 인코딩하는 DNA는 DNA 미니서클을 통해 세포에 도입될 수 있다. 참고, 예를 들면, WO 2014/182700, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. DNA 미니서클은 복제의 기원도 항생제 선택 마커도 갖지 않는 비-바이러스 유전자 전달에 사용될 수 있는 초나선 DNA 분자이다. 따라서, DNA 미니서클은 플라스미드 벡터보다 크기가 전형적으로 더 작다. 이들 DNAs는 박테리아 DNA가 결여되고 따라서 박테리아 DNA에서 발견된 메틸화되지 않은 CpG 모티프가 부족하다.
본 명세서에서 제공된 방법은 세포에 핵산 또는 단백질을 도입하기 위한 특정 방법에 의존하지 않고, 핵산 또는 단백질이 최소 하나의 세포의 내측에 접근한다는 점에만 의존한다. 핵산 및 단백질을 다양한 세포 유형에 도입하는 방법은 당해 분야에서 공지되고, 예를 들어, 안정한 형질감염 방법, 일시적 형질감염 방법, 및 바이러스-매개된 방법을 포함한다.
형질감염 프로토콜 뿐만 아니라 핵산 또는 단백질을 세포에 도입하기 위한 프로토콜은 다양할 수 있다. 비-제한 형질감염 방법은 하기를 사용하는 화학-기반된 형질감염 방법을 포함한다: 리포좀; 나노입자; 인산칼슘 (Graham 등 (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti 등 (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4, 및 Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual.New York:W.H.Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 양이온성 폴리머 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민.비-화학적 방법은 전기천공, 소노-포레이션, 및 광학 형질감염을 포함한다. 입자-기반된 형질감염은 유전자 건, 또는 자석-보조된 형질감염의 용도를 포함한다 (Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). 바이러스 방법은 또한 형질감염에 사용될 수 있다.
세포에 핵산 또는 단백질의 도입은 또한 전기천공으로, 세포내질 주사로, 바이러스 감염으로, 아데노바이러스로, 렌티바이러스로, 레트로바이러스로, 형질감염으로, 지질-매개된 형질감염으로, 또는 뉴클레오펙션으로 매개될 수 있다. 세포에 핵산 또는 단백질의 도입은 또한 아데노-관련된 바이러스로 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은 세포질에 뿐만 아니라 핵 막을 통해 핵에 전달되도록 핵산 기질을 가능하게 하는 개선된 전기천공 기술이다. 게다가, 본 명세서에서 개시된 방법에서 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로 규칙적 전기천공보다 훨씬 더 적은 세포 (예를 들면, 규칙적 전기천공으로 7 백만과 비교된 단지 약 2 백만)을 요구한다. 일 예에서, 뉴클레오펙션은 LONZA® NUCLEOFECTOR™ 시스템을 사용하여 수행된다.
세포 (예를 들면, 1-세포기 배아)에 핵산 또는 단백질의 도입은 또한 미세주입으로 달성될 수 있다. 1-세포기 배아에서, 미세주입은 모계 및/또는 부계 전핵에 또는 세포질에 될 수 있다. 미세주입이 단 하나의 전핵에 되면, 부계 전핵은 그것의 더 큰 크기로 인해 바람직하다. mRNA의 미세주입은 바람직하게는 (예를 들면, 번역 기계장치에 직접적으로 mRNA를 전달하기 위해) 세포질에 되고, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 인코딩하거나 RNA를 인코딩하는 핵산의 미세주입은 핵/전핵에 바람직하다. 대안적으로, 미세주입은 양쪽 핵/전핵 및 세포질에 주사로 수행될 수 있다: 바늘은 핵/전핵에 먼저 도입될 수 있고 제1 양은 주사될 수 있고, 1-세포기 배아로부터 바늘을 제거하면서 제2 양이 세포질에 주사될 수 있다. Cas 단백질이 세포질에 주사되면, Cas 단백질은 바람직하게는 핵 국재화 신호를 포함하여 핵/전핵에 전달을 보장한다. 미세주입 실행 방법은 널리 공지된다. 참고, 예를 들면, Nagy 등 (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press); Meyer 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026 및 Meyer 등 (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359.1-세포기 배아에 도입은 또한 전기천공으로 달성될 수 있다.
세포에 핵산 또는 단백질을 도입하는 다른 방법은, 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개된 전달, 엑소좀-매개된 전달, 지질-나노입자-매개된 전달, 세포-투과-펩타이드-매개된 전달, 또는 이식가능-디바이스-매개된 전달을 포함할 수 있다.
세포에 핵산 또는 단백질의 도입은 일정 기간 동안 1회 또는 다회 수행될 수 있다. 예를 들어, 도입은 일정 기간 동안 적어도 2 회 일정 기간 동안, 적어도 3 회 일정 기간 동안, 적어도 4 회 일정 기간 동안, 적어도 5 회 일정 기간 동안, 적어도 6 회 일정 기간 동안, 적어도 7 회 일정 기간 동안, 적어도 8 회 일정 기간 동안, 적어도 9 회 일정 기간 동안, 적어도 10 회 일정 기간 동안, 적어도 11 회, 적어도 12 회 일정 기간 동안, 적어도 13 회 일정 기간 동안, 적어도 14 회 일정 기간 동안, 적어도 15 회 일정 기간 동안, 적어도 16 회 일정 기간 동안, 적어도 17 회 일정 기간 동안, 적어도 18 회 일정 기간 동안, 적어도 19 회 일정 기간 동안, 또는 적어도 20 회 수행될 수 있다.
일부 경우에서, 방법 및 조성물에서 이용된 세포는 그것의 게놈에 안정적으로 편입된 DNA 작제물을 갖는다. 그와 같은 경우에, 접촉은 그것의 게놈에 이미 안정적으로 편입된 작제물을 가진 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 방법에서 이용된 세포는 그것의 게놈 (즉, Cas-준비 세포)에 안정적으로 편입된 기존의 Cas-인코딩 유전자를 가질 수 있다. "안정적으로 편입된" 또는 "안정적으로 도입된" 또는 "안정적으로 통합된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈에 통합하고 이의 자손에 의해 선천적일 수 있는 방식으로 세포에 폴리뉴클레오타이드의 도입을 포함한다. 임의의 프로토콜은 표적화된 게놈 통합 시스템의 DNA 작제물 또는 다양한 구성요소의 안정한 편입에 사용될 수 있다.
E. 표적 게놈 유전자좌 및 가이드 RNA 인식 서열의 위치
표적 게놈 유전자좌는 관심의 외래 표적 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원의 발현에 영향을 주는 임의의 게놈 유전자좌일 수 있다. 바람직하게는, 표적 게놈 유전자좌는 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하거나, 상기로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기로 구성된다. 예로서, 표적 게놈 유전자좌는 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 코돈을 포함하는 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있거나, 유전자의 전체 코딩 영역을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 대안적으로, 표적 게놈 유전자좌는 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 발현에 영향을 주는 또 다른 게놈 유전자좌를 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있다. 그와 같은 게놈 유전자좌의 예는 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 발현에 요구된 전사 조절자를 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부이다. 일부 방법에서, 다중 표적 게놈 유전자좌는 표적화될 수 있다. 예로서, 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성 다중 자가-항원을 인코딩하는 다중 유전자가 있다면, 각각의 다중 유전자는, 어느 한쪽 순차적으로 또는 동시에, 표적화될 수 있다.
제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 표적 게놈 유전자좌 이내 어디든지 있을 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 관심의 외래 표적 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 측접시킬 수 있다. 일 예에서, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 제2 가이드 RNA 인식 서열은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함하거나 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 예를 들어, 제1 가이드 RNA 인식 서열은 개시 코돈을 포함할 수 있고, 제2 가이드 RNA 인식은 정지 코돈을 포함할 수 있다. 제3 및 제4 가이드 RNAs가 또한 사용되면, 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열은 또한 표적 게놈 유전자좌 이내 어디든지 있을 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 인식 서열 중 둘 (예를 들면, 제1 및 제3, 여기서 제1 및 제3 가이드 RNA 인식 서열은 상이하고 임의로 중첩이다)은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함할 수 있거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내일 수 있고, 다른 2 가이드 RNA 인식 서열 (예를 들면 제2 및 제4, 여기서 제2 및 제4 가이드 RNA 인식 서열은 상이하고 임의로 중첩이다)은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 정지 코돈을 포함할 수 있거나 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내일 수 있다. 양쪽 개시 및 정지 코돈 표적화는 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 코딩 서열의 결실을 초래할 수 있고 그렇게 함으로써 자가-항원의 발현을 제거시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 상이하고 각각은 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함하거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이다. 예를 들어, 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열은 중첩일 수 있고 각각 개시 코돈을 포함할 수 있다. 제3 및/또는 제4 가이드 RNAs가 또한 사용되면, 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열은 표적 게놈 유전자좌 이내 어디든지 있을 수 있다. 예를 들어, 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열은 서로 상이할 수 있고 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열로부터 상이할 수 있고, 각각의 제3 및 제4 가이드 RNA 인식 서열은 또한 자가-항원을 인코딩하는 유전자용 개시 코돈을 포함할 수 있거나 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내일 수 있다. 개시 코돈 표적화는 개시 코돈을 파괴시킬 수 있고 그렇게 함으로써 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 발현을 제거시킬 수 있다.
제3 및 제4 가이드 RNAs (또는 추가의 가이드 RNAs)가 사용되면, 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제1 자가-항원의 발현에 영향을 주는 또는 다른 자가-항원 (예를 들면, 제2 자가-항원)의 발현에 영향을 주는 추가의 표적 게놈 유전자좌는 또한 제1 자가-항원 및/또는 다른 자가-항원의 발현을 감소시키기 위해 표적화될 수 있다. 예로서, 일부 방법에서 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제1 자가-항원을 인코딩하는 유전자는 표적화될 수 있고, 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 제2 자가-항원을 인코딩하는 제2 유전자는 표적화될 수 있다.
F. 재조합의 기전 그리고 비-상동 말단 연결, 유전자 변환, 또는 상동성 재조합의 유병률의 변경 방법
재조합은 2 폴리뉴클레오타이드 사이 유전적 정보의 임의의 교환 공정을 포함하고 임의의 기전에 의해 발생할 수 있다. 이중-가닥 절단 (DSBs)에 반응하여 재조합은 2 보존된 DNA 수복 경로: 비-상동 말단 연결 (NHEJ) 및 상동 재조합 (HR)을 통해 주로 발생한다. 참고 Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 마찬가지로, 외인성 수복 템플레이트에 의해 매개된 표적 핵산 의 수복은 2 폴리뉴클레오타이드 사이 유전적 정보의 임의의 교환 공정을 포함할 수 있다.
NHEJ는 상동 템플레이트에 대한 필요성 없이 외인성 서열에 또는 서로에 절단 말단의 직접적인 결찰에 의해 핵산에서 이중-가닥 절단의 수복을 포함한다. NHEJ에 의한 비-연속 서열의 결찰은 이중-가닥 절단의 부위 근처 결실, 삽입, 또는 전좌를 종종 초래할 수 있다. 예를 들어, NHEJ는 외인성 수복 템플레이트의 말단과 절단 말단의 직접적인 결찰 (즉, NHEJ-기반된 포착)을 통해 외인성 수복 템플레이트의 표적화된 통합을 또한 초래할 수 있다. 그와 같은 NHEJ-매개된 표적화된 통합은 상동성 지향된 수복 (HDR) 경로가 (예를 들면, 비-분할 세포, 1차 세포, 및 상동성-기반된 DNA 수복을 저조하게 수행하는 세포에서) 쉽게 사용가능하지 않은 경우 외인성 수복 템플레이트의 삽입에 바람직할 수 있다. 게다가, 상동성-지향된 수복에 대조적으로, (Cas-매개된 절단에 의해 창출된 돌출부를 넘어서) 절단 부위를 측접하는 서열 동일성의 큰 영역에 관한 지식은 필요없고, 이는 게놈 서열의 제한된 지식이 있는 게놈을 갖는 유기체에 표적화된 삽입을 시도하는 경우 유익할 수 있다. 통합은 외인성 수복 템플레이트와 절단된 게놈 서열 사이 평활 말단의 결찰을 통해, 또는 절단된 게놈 서열에서 Cas 단백질에 의해 생성된 것과 양립가능한 돌출부에 의해 측접되는 외인성 수복 템플레이트를 사용하는 (즉, 5' 또는 3' 돌출부를 갖는) 점성 말단의 결찰을 통해 진행할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290, 및 Maresca 등 (2013) Genome Res. 23(3): 539-546, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 평활 말단이 결찰되면, 표적 및/또는 공여체 절제는, 표적 서열에서 원치않는 변경을 창출할 수 있는, 단편 연결에 필요한 마이크로상동성의 생성 영역에 필요해질 수 있다.
재조합은 또한 상동성 지향된 수복 (HDR) 또는 상동 재조합 (HR)을 통해 발생할 수 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 요구할 수 있는 핵산 수복의 형태를 포함하고, "표적" 분자 (즉, 이중-가닥 절단을 경험하였던 것)의 수복용 템플레이트로서 "공여체" 분자를 사용하고, 공여체부터 표적까지 유전적 정보의 전달을 유발시킨다. 임의의 특정 이론에 구속됨의 바램 없이, 그와 같은 전달은 파손된 표적과 공여체 사이 형성하는 이형이중나선 DNA의 미스매치 정정, 및/또는 합성-의존적 가닥 어닐링, 여기에서 공여체는 표적의 일부가 될 유전적 정보를 합성하는데 사용된다, 및/또는 관련된 공정을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 한 부분, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 한 카피, 또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 한 카피의 한 부분은 표적 DNA에 통합한다. 참고 Wang 등 (2013) Cell 153:910-918; Mandalos 등 (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang 등 (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
재조합은 상동 염색체 쌍에서 제1 및 제2 염색체 사이일 수 있다. 그와 같은 수단은, 예를 들어, 이형접합성의 손실 (LOH), 유전자 변환, 또는 임의의 공지된 재조합 기전에 의해 발생하는 교차 사건을 포함할 수 있다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, LOH는, 예를 들어, 유사분열 재조합을 통해, 유전자 변환 있거나 없이, 또는 염색체 손실 및 중복을 통해 발생할 수 있다. 참고, 예를 들면, Lefebvre 등 (2001) Nat. Genet. 27:257-258, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 이러한 문맥에서 유전자 변환은 공여체 서열부터 고도로 상동 수용체까지 유전적 물질의 단방향 전달 (즉, 하나의 분자로부터 그것의 동족체까지 유전적 정보의 비-상호 교환)을 포함할 수 있다. 유전자 변환은 임의의 공지된 재조합 기전에 의한 대립유전자의 복사용 임의의 수단을 포함한다. 예를 들어, 유전자 변환은 온전한 서열부터 이중-가닥 절단을 함유하는 상동 영역까지 유전적 정보의 비-상호 전달을 포함할 수 있고, 자매 염색분체, 상동 염색체, 또는 어느 한쪽 동일한 염색분체에서 또는 상이한 염색체에서 상동 서열 사이 발생할 수 있다. 참고, 예를 들면, Chen 등 (2007) Nat. Rev. Genet. 8:762-775, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 특정 사례에서, 유전자 변환은 상동 염색체로부터 유전적 정보 복사의 결과로서 상동 재조합에서 직접적으로 비롯한다. 이것은 상동 서열이 비-동일한 경우 국소화된 이형접합성의 손실 (LOH)로 이어질 수 있다.
예로서, LOH는 유사분열 교차에 의한 상호 염색분체 교환을 통해, 또는 파단-유도된 복제에 의한 염색분체 복사에 의해 발생할 수 있다. 어느 경우에나, 이형접합성 변형은 하나의 염색체가 게놈 복제 전 표적되는 것에서 발생할 수 있다. 대안적으로, 단일 염색분체는 게놈 복제 후 표적화될 수 있고, 이어서 염색분체간 유전자 변환될 수 있다.
본 명세서에서 개시된 임의의 방법에서, 세포는 NHEJ 활성을 증가 또는 감소시키도록 변형된 세포일 수 있다. 마찬가지로, 세포는 유전자 변환 또는 HDR 활성을 증가시키도록 변형된 세포일 수 있다. 그와 같은 변형은 NHEJ, 유전자 변환, 및/또는 HDR 조절에서 관여된 유전자의 발현 또는 활성에서 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, NHEJ의 활성 감소 및/또는 HDR의 활성 증가는 2 뉴클레아제 제제 (예를 들면, Cas 단백질 및 2 가이드 RNAs)에 상응하는 뉴클레아제 인식 서열 (예를 들면, 가이드 RNA 인식 서열) 사이 게놈 영역의 이중대립유전자 붕괴를 촉진시킬 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속됨의 바램 없이, 이중대립유전자 게놈 붕괴가 발생할 수 있는 하나의 기전은 제1 대립유전자 이내 NHEJ-매개된 수복 또는 HDR-매개된 수복 그리고 HDR 기전, 예컨대 유전자 변환을 통한 동일한 제2 대립유전자의 창출에 의한 것이다 (참고 실시예 1). 따라서, (예를 들면, NHEJ 활성 감소에 의한 또는 HDR 활성 증가에 의한 HDR-매개된 경로 촉진은 또한 게놈 영역의 이중대립유전자 붕괴를 촉진시킬 수 있다. 유사하게, 임의의 특정 이론에 구속됨의 바램 없이, 단일 유전자좌를 표적하는 짝짓기된 뉴클레아제 제제 (예를 들면, Cas 단백질 및 짝짓기된 가이드 RNAs)를 사용함으로써 이형접합성 세포의 동형접합성 세포로의 변환은 NHEJ 활성이 감소되고 HDR 활성 (예를 들면, 유전자 변환 활성)이 상응하여 증가되면 촉진될 수 있다.
억제제는 NHEJ 활성을 증가 또는 감소시키는데 혹은 HDR 활성을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 그와 같은 억제제는, 예를 들어, 작은 분자 또는 억제성 핵산 예컨대 짧은 간섭 핵산 (예를 들면, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 유전자 전사체에 특이적인 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 억제제는, 예를 들어, 인산화, 유비퀴틸화, 및 수모화를 통해 번역후 변형에 의한 NHEJ 또는 HDR 또는 그것의 업스트림 조절에 관여된 효소에 지향될 수 있다.
포유류 세포에서, NHEJ는 우세한 DSB 수복 기전이고 세포 사이클 전반에 걸쳐 활성이다. 척추동물에서, "표준적" 또는 "고전적" NHEJ 경로 (C-NHEJ)는 DSB를 수복하기 위해 DNA-PK, Ku70-80, 아르테미스, 리가제 IV (Lig4), XRCC4, CLF, 및 Pol μ를 포함하는, 몇 개의 코어 인자를 요구한다. 참고 Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. NHEJ 동안, DNA 말단은, 다른 NHEJ 구성요소의 장입용 도킹 스테이션으로서 기능하는, 고도로 풍부한 말단-보호 Ku 단백질에 의해 결합된다.
따라서, 본 명세서에서 개시된 방법의 일부에서, 세포는 C-NHEJ에서 관여된 인자의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거 또는 증가시키도록 변형되어 왔다. 예를 들어, 일부 방법에서, 세포는 DNA-PK, Ku70-80, 아르테미스, 리가제 IV (Lig4), XRCC4, CLF, 및/또는 Pol μ 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 변형되어 왔다. 특정 방법에서, 세포는 DNA-PK 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 혹은 DNA-PK 발현 또는 활성 (예를 들면, DNA-PKcs의 발현 또는 활성; 예시적 UniProt 서열 지정된 P97313)을 증가시키도록 변형되어 왔다. DNA-PKcs 억제제의 예는, 예를 들어, NU7026, 및 NU7441을 포함한다. 참고, 예를 들면, 미국특허 번호 6,974,867, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 특정 방법에서, 세포는 리가제 IV 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 혹은 리가제 IV 발현 또는 활성을 증가시키도록 변형되어 왔다. 리가제 IV 억제제의 예는 SCR7이다.
ATM (예를 들면, KU55933), CHK1/CHK2 (예를 들면, KLD1162 또는 CHIR-124) 및 ATR (예를 들면, VE 821) 같은 억제제 표적화 세포 사이클 체크포인트 단백질은 또한 어느 한쪽 특정 DNA 수복 억제제의 효과를 상승작용으로 향상시키는데 또는 세포 사이클 정지 및/또는 세포자멸사 같은 의도되지 않은 부작용을 예방하는데 사용될 수 있다 (참고 Ciccia 등 (2010) Mol Cell 40:179, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨).
C-NHEJ의 파괴는 "대안적인" NHEJ (A-NHEJ) 경로에 의해 매개된 비정상 연결의 수준을 증가시킬 수 있고 HR 수복을 또한 증가시킬 수 있다. A-NHEJ 경로는 마이크로상동성-매개된 연결을 향한 바이어스를 표시하고 C-NHEJ보다 더 느린 동력학을 따른다. MRN 복합체 (MRE11, RAD50, NBS1), CtIP, XRCC1, PARP, Lig1, 및 Lig3을 포함하는, 몇 개의 인자는 참여하기 위해 제안되어 왔다. 참고 Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897 및 Claybon 등 (2010) Nucleic Acids Res. 38(21): 7538-7545, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
따라서, 본 명세서에서 개시된 방법의 일부에서, 세포는 A-NHEJ에서 관여된 인자의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거하도록 혹은 증가시키도록 변형되어 왔다. 예를 들어, 일부 방법에서, 세포는 MRE11, RAD50, NBS1, CtIP, XRCC1, PARP (예를 들면, PARP1), Lig1, 및/또는 Lig3 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 변형되어 왔다. 다른 방법에서, 세포는 MRE11, RAD50, NBS1, CtIP, XRCC1, PARP (예를 들면, PARP1), Lig1, 및/또는 Lig3 발현 또는 활성을 증가시키도록 변형되어 왔다. 특정 방법에서, 세포는 PARP1 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 혹은 PARP1 발현 또는 활성 (예시적 UniProt 서열 지정된 P11103)을 증가시키도록 변형되어 왔다. PARP 억제제 (예를 들면, NU1025, 이니파립, 올라파립)의 예는 하기를 포함한다: 니코틴아미드; 이소퀴놀리논 및 디하이드로이소퀴놀리논; 벤즈이미다졸 및 인돌; 프탈라진-l(2H)-온 및 퀴나졸리논; 이소인돌리논 및 이의 유사체 및 유도체; 페난트리딘 및 페난트리디논; 벤조피론 및 이의 유사체 및 유도체; 불포화된 히드록심 산 유도체 및 이의 유사체 및 유도체; 융합된 피리다진을 포함하는, 피리다진, 및 이의 유사체 및 유도체; 및/또는 다른 화합물 예컨대 카페인, 테오필린, 및 티미딘, 및 이의 유사체 및 유도체.참고, 예를 들면, 미국특허 번호 8,071,579, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
C-NHEJ는 또한 파괴 C-NHEJ가 또한 증가된 HR 수복으로 이어질 수 있는 정도로 HR과 경쟁적 관계를 나타낸다. NHEJ와 HR 사이 그와 같은 경쟁은 파괴 NHEJ가 감소된 랜덤 통합 및 가능하게는 상동 재조합에 의한 증가된 표적 통합을 통해 향상된 유전자 표적화로 이어질 수 있음에 따라 개척될 수 있다.
단일-가닥 어닐링, 유전자 변환, 교차, 및 파단-유도된 복제를 포함하는, 여러 형태의 상동 재조합 수복이 있다. 단일-가닥 어닐링은 절제된 DSB의 어느 한쪽에서 상동 단일-가닥 서열이 어닐링하여, 염색체 재구성을 초래하는, HR 수복의 거울 형태이다. 단일-가닥 어닐링은, 서열 상동성의 2 영역을 분리시키는 거리에 의존하여, 다양한 크기의 결실을 생성한다. 유전자 변환은, 상동 염색체로부터 유전적 정보 복사의 결과로서 HR에서 직접적으로 비롯하는, 하나의 분자부터 그것의 동족체까지 유전적 정보의 비-상호 교환을 포함한다. 이것은 상동 서열이 비-동일한 경우 국소화된 LOH로 이어질 수 있다. 정상적으로, 유전자 변환의 정도는 몇 백 염기 쌍으로 제한된다. 하지만, 긴 영역 유전자 변환은, RAD51C 결핍을 포함하는, 일부 유전적 배경에서 보고되어 왔다. 참고 Nagaraju 등 (2006) Mol. Cell.Biol. 26:8075-8086, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 교차는, 예를 들어, 상동 염색체 사이 발생할 수 있고, G1에서 발생하면 상호 전좌 또는 G2에서 발생하면 파단 부위부터 원위 말단소체까지 확장하는 비-상호 전좌 및 LOH로 이어지기 위한 잠재력을 갖는다. 파단-유도된 복제는 가닥 침습 이후, DNA 복제가 염색체의 말단까지 계속하는 HR의 변이체이다. 따라서, HR이 LOH를 촉진시킬 수 있는 많은 기전이 있다.
따라서, 본 명세서에서 개시된 방법의 일부에서, 세포는 HR에서 관여된 인자의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 혹은 증가시키도록 변형되어 왔다. 예를 들어, 일부 방법에서, 세포는 RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD51C, BRCA1, 및/또는 BRCA2 발현 또는 활성을 증가시키도록 변형되어 왔다. 다른 방법에서, 세포는 RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD51C, BRCA1, 및/또는 BRCA2 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 변형되어 왔다.
일부 방법에서, NHEJ 및/또는 HR 조절에서 관여된 더욱 다른 단백질의 발현 또는 활성은 변경될 수 있다. 예를 들어, 일부 방법에서, 세포는 Chk2 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록, Clspn 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록, Setd2 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록, Kat2a 발현 또는 활성을 증가시키도록, 및/또는Rad51 발현 또는 활성을 증가시키도록 변형되어 왔다. 다른 방법에서, 세포는 Chk2 발현 또는 활성을 증가시키도록, Clspn 발현 또는 활성을 증가시키도록, Setd2 발현 또는 활성을 증가시키도록, Kat2a 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록, 및/또는 Rad51 발현 또는 활성을 감소 또는 제거시키도록 변형되어 왔다.
Chk2 (또한 Chek2 및 Rad53으로서 공지됨; S. 폼베 동족체는 Cds1임)는 DNA 이중-가닥 절단의 존재에 반응하여 체크포인트-매개된 세포 사이클 정지, DNA 수복의 활성화, 및 세포자멸사에 요구된 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 참고 Blaikley 등 (2014) Nucleic Acids Research 42:5644-5656, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. Clspn (또한 클라스핀으로서 공지됨; S. 폼베 동족체는 Mrc1임)은 DNA 손상에 반응하여 체크포인트 매개된 세포 사이클 정지에 요구된 단백질이다. S. 폼베에서 Chk2 또는 Clspn의 동족체의 결실은 야생형에 비교된 파단-유도된 유전자 변환의 상당히 상승된 수준을 나타내는 초-재조합 표현형을 초래한다고 보고되어 왔다. 특이적으로, 유전자 변환의 수준은 상당히 증가된 것으로 보고되었지만, 반면에 비-상동 말단 연결 (NHEJ), 자매 염색분체 변환 (SCC), 및 이형접합성의 손실 (LOH)의 수준은 감소된 것으로 보고되었다. 참고 Blaikley 등 (2014) Nucleic Acids Research 42:5644-5656.
(또한 Gcn5 및 Gcn5l2로서 공지된) Kat2a는 전사 활성화를 촉진시키고 이중-가닥 절단 수복과 관련된다고 보고된 도처에 존재하는 히스톤 아세틸전달효소이다. Kat2a-의존적 히스톤 H3 리신 36 (H3K36) 아세틸화는 염색질 접근성을 증가시키고, 절제를 증가시키고, 그리고 상동 재조합을 촉진시키면서 비-상동 말단 연결을 억압시킨다. 참고 Pai 등 (2014) Nat. Commun. 5:4091, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. (또한 Kiaa1732, Kmt3a, 및 Set2로서 공지된) Setd2는 기질로서 데메틸화된 리신 36 (H3K36me2)를 사용하는 히스톤 H3 (H3K36me3)의 리신 36을 특이적으로 트리메틸화하는 히스톤 메틸전달효소이다. Setd2-의존적 H3K36 메틸화는 염색질 접근성을 감소시키고, 절제를 감소시키고, NHEJ를 촉진시킨다. 참고 Pai 등 (2014) Nat. Commun. 5:4091.
(또한 Reca, Rad51A, 및 DNA 수복 단백질 Rad51 동족체 1로서 공지된) Rad 51은, 유전자 변환 영역을 산출하기 위해 미스매치 수복에 의해 분해되는 이형이중나선 DNA를 형성하는, 상동 재조합 동안 가닥 교환을 유효화하기 위해 Rad52 및 다른 단백질과 기능하는 단백질이다. 포유류 세포에서, Rad51 및 Rad52 과발현은 상동 재조합 및 유전자 변환의 빈도를 증가시킨다고 보고되어 왔다. 참고 Yanez & Porter (1999) Gene Ther. 6:1282-1290 및 Lambert & Lopez (2000) EMBO J. 19:3090-3099, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
NHEJ, 유전자 변환, 및/또는 상동성-지향된 수복 조절에서 관여된 유전자의 발현 또는 활성에서 변형은 공간적으로 또는 일시적으로 특이적일 수 있고 또한 유도성 또는 일시적 및 가역적일 수 있다. 예를 들어, 다양한 형태의 카셋트는 특정 세포 또는 조직 유형으로, 특정 발달기에, 또는 유도시 결실을 허용하도록 작제될 수 있다. 그와 같은 카셋트는 카셋트가 재조합효소 인식 부위에 의해 양면에서 측접되는 재조합효소 시스템을 이용할 수 있고 원하는 세포 유형으로 발현된, 원하는 발달기에서 발현된, 또는 유도시 발현된 또는 활성화된 재조합효소를 사용하여 제거될 수 있다. 그와 같은 카셋트는 무효, 조건적, 또는 조합 조건적/무효 대립유전자가, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입된, US 2011/0104799에서 기재된 바와 같이, 생성될 수 있는 정도로 배치되는 상이한 재조합효소 인식 부위의 다수의 쌍을 포함하도록 추가로 작제될 수 있다. 재조합효소 유전자의 조절은 다양한 방식으로, 예컨대 세포-특이적, 조직-특이적, 또는 발전적으로 조절된 프로모터 (또는 다른 조절 요소)에 재조합효소 유전자의 작동가능하게 연결함으로써, 또는 단지 특히 세포 유형, 조직 유형, 또는 발달기에서 활성인 miRNA용 인식 부위를 포함하는 3'-UTR에 재조합효소 유전자를 작동가능하게 연결함으로써 제어될 수 있다. 재조합효소는 또한, 예를 들어, 효과기 또는 대사물 (예를 들면, 활성이 타목시펜에 의해 양성으로 제어되는, CreERT2)의 제어 하에서 재조합효소를 배치하는 융합 단백질을 이용함으로써, 또는 유도성 프로모터 (예를 들면, 활성이 독시사이클린 및 TetR 또는 TetR 변이체에 의해 제어되는 것)의 제어 하에서 재조합효소 유전자를 배치함으로써 조절될 수 있다. 다양한 형태의 카셋트 및 재조합효소 유전자의 조절 수단의 예는, 예를 들어, US 8,518,392; US 8,354,389; 및 US 8,697,851에서 제공되고, 이들의 각각은 그 전체가 참고로 편입된다.
본 명세서에서 개시된 다른 방법에서, 세포는 NHEJ 활성을 증가 또는 감소시키도록 혹은 세포 사이클의 시기, 예컨대 세포 사이클의 M-기 또는 S-기에서 세포 차단에 의해 유전자 변환 또는 HDR 활성을 증가시키도록 변형되어 왔다. 참고, 예를 들면, WO 2016/036754, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 이것은 세포 사이클 차단 조성물로 달성될 수 있다. 그와 같은 조성물의 예는 노코다졸, 하이드록시우레아; 콜히친; 데메콜신 (콜세미드); 로바스타틴; 미모신; 티미딘; 아파이디콜린; 라트룬쿨린 A; 및 라트룬쿨린 B를 포함한다. 그와 같은 변형은 NHEJ, 유전자 변환, 및/또는 HDR 조절에서 관여된 유전자의 발현 또는 활성에서 변형을 포함할 수 있다.
G. 표적화된 유전적 변형의 유형
표적화된 유전적 변형의 다양한 유형은 본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 그와 같은 표적화된 유전적 변형은 관심의 외래 표적 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원의 발현을 감소 또는 제거시키는 임의의 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 그와 같은 변형은 표적 게놈 유전자좌를 파괴시킨다. 파괴의 예는 조절 요소 (예를 들면, 프로모터 또는 인핸서)의 변경, 미스센스 돌연변이, 논센스 돌연변이, 프레임-시프트 돌연변이, 절단 돌연변이, 무효 돌연변이, 또는 작은 수의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실 (예를 들면, 프레임시프트 돌연변이 야기)를 포함한다. 파괴는 불활성화 (즉, 기능의 손실) 또는 대립유전자의 손실을 초래할 수 있다. 그와 같은 표적화된 유전적 변형은, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환 (대체)를 포함할 수 있다. 그와 같은 삽입, 결실, 또는 대체는, 예를 들어, 점 돌연변이, 관심의 핵산 서열 또는 이의 한 부분의 녹아웃, 관심의 핵산 서열 또는 이의 한 부분의 녹-인, 내인성 핵산 서열의 이종성 또는 외인성 핵산 서열로의 대체, 조절 요소 (예를 들면, 프로모터 또는 인핸서)의 변경, 미스센스 돌연변이, 논센스 돌연변이, 프레임-시프트 돌연변이, 절단 돌연변이, 무효 돌연변이, 또는 이의 조합을 초래할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 또는 초과 뉴클레오타이드는 표적화된 유전적 변형을 형성하기 위해 변화 (예를 들면, 결실, 삽입, 또는 치환)될 수 있다. 결실, 삽입, 또는 대체는, 본 명세서에서 다른 곳에 개시된 바와 같이, 임의의 크기일 수 있다. 참고, 예를 들면, Wang 등 (2013) Cell 153:910-918; Mandalos 등 (2012) PLOS One 7:e45768; 및 Wang 등 (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532, 이들의 각각은 그것이 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 돌연변이는 자가-항원의 발현 (예를 들면, mRNA 및/또는 단백질 발현)의 제거 또는 발현의 감소 (예를 들면, 대립유전자의 결실)을 초래할 수 있다.
표적화된 유전적 변형 (예를 들면, 삽입, 결실, 또는 치환)은 표적 게놈 유전자좌에서 하나 이상의 위치에 발생할 수 있다. 예를 들어, 표적화된 유전적 변형은 2 외인성 수복 템플레이트가 사용되면 표적 게놈 유전자좌 이내 2 위치에서 2개의 별개의 변형을 포함할 수 있다.
외인성 수복 템플레이트가 사용되는 방법에서, 예를 들어, 결실은 5' 및 3' 표적 서열 사이일 수 있다. 둘 이상의 가이드 RNAs가 사용되는 방법에서, 결실은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 제1 및 제2 Cas 절단 부위 사이일 수 있다. 그와 같은 결실은 임의의 길이일 수 있다. 결실된 핵산은, 예를 들어, 약 1 bp 내지 약 5 bp, 약 5 bp 내지 약 10 bp, 약 10 bp 내지 약 50 bp, 약 50 bp 내지 약 100 bp, 약 100 bp 내지 약 200 bp, 약 200 bp 내지 약 300 bp, 약 300 bp 내지 약 400 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 1 kb, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 또는 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 500 kb, 약 500 kb 내지 약 1 Mb, 약 1 Mb 내지 약 1.5 Mb, 약 1.5 Mb 내지 약 2 Mb, 약 2 Mb 내지 약 2.5 Mb, 또는 약 2.5 Mb 내지 약 3 Mb일 수 있다.
대안적으로, 결실된 핵산은, 예를 들어, 적어도 1 bp, 적어도 5 bp, 적어도 10 bp, 적어도 50 bp, 적어도 100 bp, 적어도 200 bp, 적어도 300 bp, 적어도 400 bp, 적어도 500 bp, 적어도 1 kb, 적어도 5 kb, 적어도 10 kb, 적어도 20 kb, 적어도 30 kb, 적어도 40 kb, 적어도 50 kb, 적어도 60 kb, 적어도 70 kb, 적어도 80 kb, 적어도 90 kb, 적어도 100 kb, 적어도 110 kb, 적어도 120 kb, 적어도 130 kb, 적어도 140 kb, 적어도 150 kb, 적어도 160 kb, 적어도 170 kb, 적어도 180 kb, 적어도 190 kb, 적어도 200 kb, 적어도 250 kb, 적어도 300 kb, 적어도 350 kb, 적어도 400 kb, 적어도 450 kb, 또는 적어도 500 kb 또는 초과일 수 있다. 일부 경우에서, 결실된 핵산은 적어도 550 kb, 적어도 600 kb, 적어도 650 kb, 적어도 700 kb, 적어도 750 kb, 적어도 800 kb, 적어도 850 kb, 적어도 900 kb, 적어도 950 kb, 적어도 1 Mb, 적어도 1.5 Mb, 적어도 2 Mb, 적어도 2.5 Mb, 적어도 3 Mb, 적어도 4 Mb, 적어도 5 Mb, 적어도 10 Mb, 적어도 20 Mb, 적어도 30 Mb, 적어도 40 Mb, 적어도 50 Mb, 적어도 60 Mb, 적어도 70 Mb, 적어도 80 Mb, 적어도 90 Mb, 또는 적어도 100 Mb (예를 들면, 대부분의 염색체)일 수 있다.
특정 예에서, 결실 크기는 약 0.1 kb 내지 약 1 Mb, 약 0.1 kb 내지 약 900 kb, 약 0.1 kb 내지 약 400 kb, 약 0.1 kb 내지 약 200 kb, 약 0.1 kb 내지 약 100 kb, 또는 최대 약 1 Mb, 최대 약 900 kb, 최대 약 400 kb, 최대 약 200 kb, 또는 최대 약 100 kb일 수 있다. 특정 예에서, 결실 크기는 약 0.1-200, 0.1-190, 0.1-180, 0.1-170, 0.1-160, 0.1-150, 0.1-140, 0.1-130, 0.1-120, 0.1-110, 0.1-100, 0.1-90, 0.1-80, 0.1-70, 0.1-60, 0.1-50, 0.1-40, 0.1-30, 0.1-20 0.1-10, 0.1-9, 0.1-8, 0.1-7, 0.1-6, 0.1-5, 0.1-4, 0.1-3, 0.1-2, 또는 0.1-1 kb일 수 있다. 표적화된 세포 클론 예컨대 표적화된 배아 줄기 세포 클론에서 이중대립유전자 결실 (붕괴) 효율 (즉, 이중대립유전자 결실을 가진 스크리닝된 클론의 백분율)은 약 1-100%, 1-90%, 1-80%, 1-70%, 1-60%, 1-50%, 1-40%, 1-30%, 또는 1-27%일 수 있거나, 또는 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 또는 25%일 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 결실 크기는 약 50 kb 이하이고 이중대립유전자 결실 효율은 약 1-30% 또는 1-27%이거나, 또는 결실 크기는 약 50 kb 이상 (예를 들면, 약 50 kb 내지 약 200 kb)이고 이중대립유전자 결실 효율은 약 1-5% 또는 1-3%이다. 1-세포기 배아가 표적되는 실험에서, 1-세포기 배아내 CRISPR/Cas 주사 이후 살아있는 새끼에서 이중대립유전자 결실 (붕괴) 효율 (즉, 이중대립유전자 결실을 가진 살아있는 새끼의 백분율)은 약 1-100%, 1-90%, 또는 1-85%, 또는 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 85%일 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 결실 크기는 약 50 kb 이하이고 이중대립유전자 결실 효율은 약 1-85% 또는 20-85%이거나, 또는 결실 크기는 약 50 kb 이상 (예를 들면, 약 50 kb 내지 약 100 kb)이고 이중대립유전자 결실 효율은 약 1-20% 또는 1-15%이다.
외인성 수복 템플레이트가 사용되는 방법에서, 예를 들어, 삽입은 5' 및 3' 표적 서열 사이일 수 있다. 그와 같은 삽입은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 삽입된 핵산은, 예를 들어, 약 1 bp 내지 약 5 bp, 약 5 bp 내지 약 10 bp, 약 10 bp 내지 약 50 bp, 약 50 bp 내지 약 100 bp, 약 100 bp 내지 약 200 bp, 약 200 bp 내지 약 300 bp, 약 300 bp 내지 약 400 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 1 kb, 약 1 kb 내지 약 5 kb, 약 5 kb 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 20 kb, 약 20 kb 내지 약 40 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb, 약 60 kb 내지 약 80 kb, 약 80 kb 내지 약 100 kb, 약 100 kb 내지 약 150 kb, 약 150 kb 내지 약 200 kb, 약 200 kb 내지 약 250 kb, 약 250 kb 내지 약 300 kb, 약 300 kb 내지 약 350 kb, 약 350 kb 내지 약 400 kb, 약 400 kb 내지 약 450 kb, 약 450 kb 내지 약 500 kb, 또는 초과일 수 있다. 대안적으로, 삽입은 적어도 1 bp, 적어도 5 bp, 적어도 10 bp, 적어도 50 bp, 적어도 100 bp, 적어도 200 bp, 적어도 300 bp, 적어도 400 bp, 적어도 500 bp, 적어도 1 kb, 적어도 5 kb, 적어도 10 kb, 적어도 20 kb, 적어도 30 kb, 적어도 40 kb, 적어도 60 kb, 적어도 80 kb, 적어도 100 kb, 적어도 150 kb, 적어도 200 kb, 적어도 250 kb, 적어도 300 kb, 적어도 350 kb, 적어도 400 kb, 적어도 450 kb, 또는 적어도 500 kb일 수 있다.
표적화된 유전적 변형은 정확한 변형 또는 부정확한 변형일 수 있다. 예를 들어, 외인성 수복 템플레이트를 사용하는 방법에서, 결실은 변형된 표적 게놈 유전자좌에서 추가의 삽입 또는 결실 (인델)이 없는 정도로 결실된 핵산이 5' 및 3' 상동성 아암 사이 핵산 서열만으로 구성되는 정확한 결실일 수 있다. 유사하게, 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전체 코딩 영역을 측접하는 짝짓기된 gRNAs가 사용되면, 제1 및 제2 Cas 단백질 절단 부위 사이 결실은 변형된 표적 게놈 유전자좌에서 추가의 삽입 또는 결실 (인델)이 없는 정도로 결실된 핵산이 제1 및 제2 Cas 단백질 절단 부위 사이 핵산 서열만으로 구성되는 정확한 결실일 수 있다. 외인성 수복 템플레이트 및 관심의 영역을 측접하는 짝짓기된 gRNAs 양쪽이 사용되는 방법에서, 결실은 상기 언급된 정확한 결실의 어느 한쪽일 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 Cas 단백질 절단 부위 사이 결실은, 변형된 게놈 유전자좌에서 추가의 결실 및/또는 삽입을 초래하는, 비-상동 말단 연결 (NHEJ)에 의한 부정확한 수복과 일치하는, 제1 및 제2 Cas 단백질 절단 부위를 넘어서 확장하는 부정확한 결실일 수 있다. 예를 들어, 결실은 제1 및 제2 Cas 단백질 절단 부위를 넘어서 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 bp 또는 초과 확장할 수 있다. 마찬가지로, 변형된 게놈 유전자좌는 NHEJ에 의한 부정확한 수복과 일치하는 추가의 삽입, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 bp 또는 초과의 삽입을 포함할 수 있다. CRISPR/Cas9와 함께 외인성 수복 템플레이트 (예를 들면, 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ssODNs)의 사용은 NHEJ보다는 상동성-지향된 수복 촉진에 의해 정확한 변형에 대한 기회를 증가시킬 수 있다.
표적화된 변형은 표적 게놈 유전자좌에서 서열 (예를 들면, 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부, 예컨대 자가-항원의 특정 영역 또는 모티프를 인코딩하는 유전자의 한 부분)의 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열로의 대체를 포함할 수 있다. 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부의 결실 그리고 관심의 외래 항원과 자가-항원 사이 공유되는 에피토프가 부족한 상응하는 상동성 또는 오쏘로그성 서열로의 대체는 야생형 자가-항원의 기능을 유지하지만 관심의 외래 항원에서 존재하고 야생형 자가-항원과 공유되는 에피토프가 부족한 자가-항원의 동족체 또는 오쏘로그의 발현을 초래할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표적화된 변형은 표적 게놈 유전자좌 (예를 들면, 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부)에서 하나 이상의 점 돌연변이 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 초과)를 포함할 수 있다. 그와 같은 점 돌연변이는, 예를 들어, 관심의 외래 항원과 공유되는 자가-항원에서 하나 이상의 에피토프의 발현을 제거시키기 위해 작용할 수 있다. 임의로, 그와 같은 점 돌연변이는 인코딩된 폴리펩타이드에서 보존적 아미노산 치환 (예를 들면, 아스파르트산 [Asp, D]의 글루탐산 [Glu, E]로의 치환)을 초래할 수 있다. 그와 같은 아미노산 치환은 야생형 자가-항원의 기능을 유지하지만 관심의 외래 항원에서 존재하는 그리고 야생형 자가-항원과 공유되는 에피토프가 부족한 자가-항원의 발현을 초래할 수 있다.
본 명세서에서 기재된 방법은 이중대립유전자 및 특히 동형접합성 변형의 빈도를 촉진 및 증가시킨다. 특히, 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열을 표적하는 제1 및 제2 제1 및 제2 가이드 RNAs와 세포 접촉에 의해, 이중대립유전자 변형의 생산 효율은 어느 한쪽 가이드 RNA 단독과 세포 접촉에 비교하여 증가될 수 있다. 이중대립유전자 변형의 생산 효율은 또한 표적 게놈 유전자좌 이내 가이드 RNA 인식 서열을 표적하는 제1, 제2, 및 제3 가이드 RNAs, 또는 표적 게놈 유전자좌 이내 가이드 RNA 인식 서열을 표적하는 제1, 제2, 제3, 및 제4 가이드 RNAs와 세포 접촉에 의해 증가될 수 있다. 게다가 또는 대안적으로, 이중대립유전자 변형 및 특히 동형접합성 변형의 생산 효율은 서열 동일성이 표적 게놈 유전자좌의 전부 또는 일부내 상동 염색체 쌍에서 상응하는 제1 및 제2 염색체 사이 최대화되도록 표적 게놈 유전자좌 선택에 의해 증가될 수 있다. 그와 같은 표적 게놈 유전자좌의 선택 방법은 본 명세서에서 다른 곳에 더욱 상세하게 기재된다.
바람직하게는, 표적화된 유전적 변형은 이중대립유전자 변형이다. 이중대립유전자 변형은 동일한 변형이 상응하는 상동 염색체에서 (예를 들면, 2배체 세포에서) 동일한 유전자좌에 실시되는, 또는 상이한 변형이 상응하는 상동 염색체에서 동일한 유전자좌에 실시되는 사건을 포함한다. 상동 염색체 (즉, 상동 염색체 쌍)은 동일한 유전자좌에서 동일한 유전자 그러나 가능하게는 상이한 대립유전자를 갖는 염색체 (예를 들면, 감수분열 동안 짝짓기되는 염색체)를 포함한다. 용어 대립유전자는 유전적 서열의 임의의 하나 이상의 대안적인 형태를 포함한다. 2배체 세포 또는 유기체에서, 주어진 서열의 2 대립유전자는 전형적으로 한 쌍의 상동 염색체에서 상응하는 유전자좌를 차지한다.
이중대립유전자 변형은 표적화된 유전적 변형에 대하여 동형접합성을 초래할 수 있다. 동형접합성은 표적 게놈 유전자좌의 양쪽 대립유전자 (즉, 양쪽 상동 염색체에서 상응하는 대립유전자)이 표적화된 유전적 변형을 갖는 상황을 포함한다. 예를 들어, 이중대립유전자 변형은 자가-항원을 인코딩하는 전부 또는 일부 유전자의 동형접합성 결실을 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있거나, 또는 이중대립유전자 변형은 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 개시 코돈의 동형접합성 파괴를 포함할 수 있거나, 상기로 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 상기로 구성될 수 있어서, 이로써 개시 코돈은 더 이상 기능적이지 않다.
대안적으로, 이중대립유전자 변형은 표적화된 변형에 대하여 화합물 이형접합성 (예를 들면, 반접합성)을 초래할 수 있다. 화합물 이형접합성은 상기 표적 유전자좌의 양쪽 대립유전자 (즉, 양쪽 상동 염색체에서 대립유전자)이 변형되었지만, 이들이 상이한 방식으로 변형된 (예를 들면, 하나의 대립유전자에서 표적화된 변형 및 다른 대립유전자의 불활성화 또는 파괴) 상황을 포함한다. 예를 들어, 표적화된 변형 없이 대립유전자에서, Cas 단백질에 의해 창출된 이중-가닥 절단은, 비-상동 말단 연결 (NHEJ)-매개된 DNA 수복에 의해 수복되어질 수 있고, 이는 핵산 서열의 삽입 또는 결실을 포함하는 돌연변이체 대립유전자를 생성하고 그렇게 함으로써 게놈 유전자좌의 파괴를 야기시킨다. 예를 들어, 이중대립유전자 변형은 세포가 표적화된 변형을 가진 하나의 대립유전자 및 발현될 수 없는 또 다른 대립유전자를 갖는다면 화합물 이형접합성을 초래할 수 있다. 화합물 이형접합성은 반접합성을 포함한다. 반접합성은 표적 유전자좌의 단 하나의 대립유전자 (즉, 2 상동 염색체 중 하나에서 대립유전자)이 존재하는 상황을 포함한다. 예를 들어, 이중대립유전자 변형은 표적화된 변형이 다른 대립유전자의 상응하는 손실 또는 결실을 가진 하나의 대립유전자에서 발생하면 표적화된 변형에 대하여 반접합성을 초래할 수 있다.
특정 예에서, 이중대립유전자 변형은 제1 및 제2 상동 염색체의 쌍으로 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 Cas 절단 부위 사이 동형접합성 결실을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이중대립유전자 변형은 제1 및 제2 상동 염색체의 쌍으로 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 Cas 절단 부위 사이 이중대립유전자 결실 (즉, 양쪽 염색체에서 결실, 반드시 그렇지는 않지만 각각에서 동일한 결실)을 포함할 수 있다. 결실은 동시에 발생할 수 있거나, 결실은 제1 상동 염색체에서 초기에 발생할 수 있어서, 동형접합성은 그 다음 상동 재조합을 통해, 예컨대 유전자 변환에 의해 제2 상동 염색체에서 하나 이상의 이중-가닥 절단을 수복하기 위한 공여체 서열로서 제1 상동 염색체를 사용하는 세포에 의해 달성된다.
또 다른 특정 예에서, 이중대립유전자 변형은 제1 및 제2 상동 염색체의 쌍으로 표적 유전자의 개시 코돈의 영역의 동형접합성 파괴를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 상동 염색체의 쌍으로 상기 표적 유전자의 개시 코돈의 영역의 이중대립유전자 파괴 (즉, 양쪽 염색체에서 파괴, 반드시 그렇지는 않지만 각각에서 동일한 변형). 변형은 동시에 발생할 수 있거나, 변형은 제1 상동 염색체에서 초기에 발생할 수 있어서, 동형접합성은 그 다음 상동 재조합을 통해, 예컨대 유전자 변환에 의해 제2 상동 염색체에서 하나 이상의 이중-가닥 절단을 수복하기 위한 공여체 서열로서 제1 상동 염색체를 사용하는 세포에 의해 달성된다.
공여체 서열 (예를 들면, 외인성 수복 템플레이트)가 사용되면, 이중대립유전자 변형은 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 또는 Cas 절단 부위 사이 결실 뿐만 아니라 제1 및 제2 상동 염색체의 쌍으로 5' 및 3' 표적 서열 사이 핵산 삽입물의 삽입을 포함할 수 있어서, 그렇게 함으로써 동형접합성 변형된 게놈을 초래한다. 대안적으로, 이중대립유전자 변형은 5' 및 3' 표적 서열 사이 결실 뿐만 아니라 제1 및 제2 상동 염색체의 쌍으로 5' 및 3' 표적 서열 사이 핵산 삽입물의 삽입을 포함할 수 있어서, 그렇게 함으로써 동형접합성 변형된 게놈을 초래한다. 결실 및 삽입은 양쪽 염색체에서 동시에 발생할 수 있거나, 결실 및 삽입은 제1 상동 염색체에서 초기에 발생할 수 있어서, 동형접합성은 그 다음 상동 재조합을 통해, 예컨대 유전자 변환에 의해 제2 상동 염색체에서 이중-가닥 절단(들)을 수복하기 위한 공여체 서열로서 제1 상동 염색체를 사용하는 세포에 의해 달성된다. 예를 들어, 임의의 특정 이론에 의해 구속됨의 바램 없이, 핵산 삽입물의 삽입은 (Cas 단백질에 의한 절단 있거나 없이) 제1 상동 염색체에서 발생할 수 있고, 제2 상동 염색체는 그 다음 제2 상동 염색체에서 Cas 단백질에 의한 절단으로 자극되는 유전자 변환 사건에 의해 변형될 수 있다.
대안적으로, 외인성 수복 템플레이트가 핵산 삽입물 없이 5' 및 3' 상동성 아암을 포함하면, 이중대립유전자 변형은 제1 및 제2 상동 염색체의 쌍으로 5' 및 3' 표적 서열 사이 결실을 포함할 수 있어서, 그렇게 함으로써 동형접합성 변형된 게놈을 초래한다. 결실은 양쪽 염색체에서 동시에 발생할 수 있거나, 결실은 제1 상동 염색체에서 초기에 발생할 수 있어서, 동형접합성은 그 다음 상동 재조합을 통해, 예컨대 유전자 변환에 의해 제2 상동 염색체에서 이중-가닥 절단(들)을 수복하기 위한 공여체 서열로서 제1 상동 염색체를 사용하는 세포에 의해 달성된다. 예를 들어, 임의의 특정 이론에 의해 구속됨의 바램 없이, 결실은 (Cas 단백질에 의한 절단 있거나 없이) 제1 상동 염색체에서 발생할 수 있고, 제2 상동 염색체는 그 다음 제2 상동 염색체에서 Cas 단백질에 의한 절단으로 자극되는 유전자 변환 사건에 의해 변형될 수 있다.
제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 결실 또는 5' 및 3' 표적 서열 사이 결실은 정확한 결실일 수 있고 여기서 결실된 핵산은 변형된 게놈 표적 유전자좌에서 추가의 결실 또는 삽입이 없는 정도로 5' 및 3' 표적 서열 사이 핵산 서열로만 또는 제1 및 제2 뉴클레아제 절단 부위 사이 핵산 서열로만 구성된다. 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열 사이 결실은 또한, 변형된 게놈 유전자좌에서 추가의 결실 및/또는 삽입을 초래하는, 비-상동 말단 연결 (NHEJ)에 의한 부정확한 수복과 일치하는, 제1 및 제2 뉴클레아제 절단 부위를 넘어서 확장하는 부정확한 결실일 수 있다. 예를 들어, 결실은 제1 및 제2 Cas 단백질 절단 부위를 넘어서 약 1 bp, 약 2 bp, 약 3bp, 약 4 bp, 약 5 bp, 약 10 bp, 약 20 bp, 약 30 bp, 약 40 bp, 약 50 bp, 약 100 bp, 약 200 bp, 약 300 bp, 약 400 bp, 약 500 bp, 또는 초과 확장할 수 있다. 마찬가지로, 변형된 게놈 유전자좌는 NHEJ에 의한 부정확한 수복과 일치하는 추가의 삽입, 예컨대 약 1 bp, 약 2 bp, 약 3bp, 약 4 bp, 약 5 bp, 약 10 bp, 약 20 bp, 약 30 bp, 약 40 bp, 약 50 bp, 약 100 bp, 약 200 bp, 약 300 bp, 약 400 bp, 약 500 bp, 또는 초과의 삽입을 포함할 수 있다.
외인성 수복 템플레이트의 사용을 통해 창출된 표적화된 삽입은 임의의 크기일 수 있다. 외인성 수복 템플레이트에서 핵산 삽입물의 예 그리고 핵산 삽입물의 크기의 예는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된다.
동형접합성 표적화된 유전적 변형은 (아래에 더 상세히 기재된) 이들 변형으로 유전적으로 변형된 동물을 제조하는 공정이 더욱 효율적일 수 있고 덜 시간-솜성일 수 있기 때문에 유리하다. 많은 상황, 예컨대 그것의 부재의 효과를 연구하기 위한 유전자의 제거 또는 파괴에서, 표적화된 유전적 변형 (즉, 하나의 대립유전자에서 변형 및 다른 대립유전자에 변화 없음)에 대하여 겨우 이형접합성은 충분하지 않다. 종래의 표적화 전략으로, 큰 표적화된 게놈 결실에 이형접합성인 F0 세대 동물은 수득가능할 수 있지만, 이들 이형접합성 동물의 후속적인 이종교배는 결실에 동형접합성인 F1 세대 동물을 생산하기 위해 요구된다. 이들 추가의 교배 단계는 고비용이고 시간-소모성이다. 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 F0 세대 유전적으로 변형된 동물의 창출 능력은 더 적은 교배 단계가 요구되기 때문에 상당한 효율 이득 및 시간 절감을 초래한다.
H. 표적화된 유전적 변형으로 세포 확인
본 명세서에서 개시된 방법은 변형된 표적 핵산 (예를 들면, 변형된 게놈)을 갖는 세포 확인을 추가로 포함할 수 있다. 다양한 방법은 표적화된 유전적 변형, 예컨대 결실 또는 삽입을 갖는 세포를 확인하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은 표적 게놈 유전자좌에서 표적화된 유전적 변형을 갖는 하나의 세포 확인을 포함할 수 있다. 스크리닝은 변형된 게놈 유전자좌로 그와 같은 세포를 확인하는데 실시될 수 있다.
스크리닝 단계는 친계 염색체의 대립유전자 (MOA)의 변형 평가용 정량적 검정 (예를 들면, 대립유전자손실 (LOA) 및/또는 대립유전자이득 (GOA) 검정)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정량적 검정은 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR (qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은 표적 게놈 유전자좌를 인식하는 제1 프라이머 세트 그리고 비-표적화된 참조 유전자좌를 인식하는 제2 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광 프로브를 포함할 수 있다.
동형접합성 붕괴된 ES 세포 클론을 확인하기 위해, TAQMAN® 프로브 qPCR 전략은 전통적 방법과 비교된 더 큰 효율 및 정확도로 사용될 수 있다. 동형접합성 붕괴된 대립유전자는 "중간" LOA 검정 (참고, 예를 들면, 도 4에서 mTM 프로브)의 포함 및 GOA 검정의 부재로 인해 하나의 qPCR 플레이트로 확인될 수 있다. ES 세포 클론을 스크리닝하는데 사용된 모든 검정이 LOA 검정이기 때문에, 카피 수는, 임의의 비-마우스 DNA 캘리브레이터 사용 없이, 시험된 모든 영역에 정확하게 계산될 수 있다.
스크리닝 단계는 또한, 표적 게놈 유전자좌의 외부 게놈 위치에 핵산 삽입물의 랜덤 유전자도입 삽입으로부터 표적 게놈 유전자좌에 핵산 삽입물의 정확한 표적화된 삽입을 식별하는데 사용된 검정인, 유지 검정을 포함할 수 있다. 유지 검정은 또한 결실에 표적화된 영역을 넘어서 확장하는 결실과 정확한 결실 사이 식별하는데 사용될 수 있다. 표적화된 변형에 대하여 스크리닝을 위한 종래의 검정, 예컨대 광범위 PCR 또는 서던 블랏팅은 삽입된 표적화 벡터를 표적화된 유전자좌에 연결한다. 그것의 큰 상동성 아암 크기 때문에, 하지만, LTVECs는 그와 같은 종래의 검정에 의한 스크리닝을 허용하지 않는다. LTVEC 표적화를 스크리닝하기 위해, 대립유전자 손실 (LOA) 및 대립유전자 이득 (GOA) 검정을 포함하는 대립유전자 변형 (MOA) 검정은 사용될 수 있다 (참고, 예를 들면, US 2014/0178879 및 Frendewey 등 (2010) Methods Enzymol. 476:295-307, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). 대립유전자손실 (LOA) 검정은 종래의 스크리닝 논리를 반전시키고 돌연변이가 지향되었던 원상태 유전자좌의 카피의 수를 정량화시킨다. 정확하게 표적화된 세포 클론에서, LOA 검정은 (X 또는 Y 염색체에 없는 유전자에 대하여) 2 원상태 대립유전자 중 하나를 검출하고, 다른 대립유전자는 표적화된 변형에 의해 파괴된다. 동일한 원리는 삽입된 표적화 벡터의 카피 수를 정량화하기 위한 대립유전자 이득 (GOA) 검정으로서 역방향으로 적용될 수 있다. 예를 들어, GOA 및 LOA 검정의 조합된 사용은 원상태 표적 유전자의 손실된 하나의 카피 그리고 약물 내성 유전자 또는 다른 삽입된 마커의 이득된 하나의 카피를 갖는 것으로서 정확하게 표적화된 이형접합성 클론을 드러낼 것이다.
예로서, 정량적 폴리머라제 쇄 반응 (qPCR)은 대립유전자 정량화의 방법으로서 사용될 수 있지만, 상기 표적 유전자의 0, 1, 및 2 카피 또는 핵산 삽입물의 0, 1, 및 2 카피 사이 차이를 확실하게 식별할 수 있는 임의의 방법은 MOA 검정을 개발하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, TAQMAN®은, 특히 참조 유전자에 비교로, 게놈 DNA 샘플에서 DNA 템플레이트의 카피의 수를 정량화하는데 사용될 수 있다 (참고, 예를 들면, US 6,596,541, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). 참조 유전자는 상기 표적 유전자(들) 또는 유전자좌(유전자좌)로서 동일한 게놈 DNA에서 정량화된다. 따라서, 2 TAQMAN® 증폭 (각각 그것의 각각의 프로브를 가짐)은 수행된다. 하나의 TAQMAN® 프로브는 참조 유전자의 "Ct" (역치 사이클)을 결정하고, 한편 다른 프로브는 성공적인 표적화 (즉, LOA 검정)에 의해 대체되는 표적화된 유전자(들) 또는 유전자좌(유전자좌들)의 영역의 Ct를 결정한다. Ct는 각각의 TAQMAN® 프로브에 대하여 개시 DNA의 양을 반영하는 양이다, 즉 덜 풍부한 서열은 역치 사이클을 달성하기 위해 PCR의 더 많은 사이클을 요구한다. TAQMAN® 반응용 템플레이트 서열의 카피의 수 절반만큼 감소는 약 1 Ct 유닛의 증가를 초래할 것이다. 상기 표적 유전자(들) 또는 유전자좌(유전자좌들)의 하나의 대립유전자가 상동 재조합에 의해 대체된 세포에서 TAQMAN® 반응은 비-표적화된 세포로부터 DNA에 비교된 경우 참조 유전자용 Ct에서 증가 없이 표적 TAQMAN® 반응용 1 Ct의 증가를 초래할 것이다. GOA 검정을 위하여, 또 다른 TAQMAN® 프로브는 성공적인 표적화에 의해 표적화된 유전자(들) 또는 유전자좌(유전자좌들)을 대체하고 있는 핵산 삽입물의 Ct를 결정하는데 사용될 수 있다.
짝짓기된 gRNAs가 큰 Cas-매개된 결실을 표적 게놈 유전자좌에서 창출할 수 있기 때문에, (즉, 1-세포기 배아 이외의 세포에서) LTVECs에 의한 정확한 표적화를 입증하기 위해 유용한 확대 표준 LOA 및 GOA 검정일 수 있다. 예를 들어, LOA 및 GOA 검정은 단독으로, 특히 GOA 검정이 LTVEC 삽입물 이내 선택 카셋트에 대한 프로브를 이용하면, 표적 게놈 유전자좌의 큰 Cas-유도된 결실이 게놈에서 다른 곳에 LTVEC의 랜덤 통합과 일치하는 클론으로부터 정확하게 표적화된 세포 클론을 식별할 수 없다. 표적화된 세포에서 선택 압력이 선택 카셋트에 기반되기 때문에, 게놈에서 다른 곳에 LTVEC의 랜덤 유전자도입 통합은 일반적으로 선택 카셋트를 포함할 것이지만 LTVEC의 인접한 영역은 LTVEC의 더 많은 원위 영역을 배제할 것이다. 예를 들어, LTVEC의 한 부분이 게놈에 무작위로 통합되면, LTVEC은 3' 상동성 아암에 인접한 선택 카셋트와 길이 약 5 kb 이상의 핵산 삽입물을 포함하고, 일반적으로 5' 상동성 아암이 아닌 3' 상동성 아암은 선택 카셋트와 유전자도입적으로 통합될 것이다. 대안적으로, 선택 카셋트가 5' 상동성 아암에 인접하면, 일반적으로 3' 상동성 아암이 아닌 5' 상동성 아암은 선택 카셋트와 유전자도입적으로 통합될 것이다. 예로서, LOA 및 GOA 검정이 LTVEC의 표적화된 통합을 평가하는데 사용되면, GOA 검정은 선택 카셋트에 대한 프로브를 이용하고, LTVEC의 랜덤 유전자도입 통합과 조합된 표적 게놈 유전자좌에서 이형접합성 결실은 표적 게놈 유전자좌에서 LTVEC의 이형접합성 표적화된 통합과 동일한 판독을 제공할 것이다. LTVEC에 의한 정확한 표적화를 입증하기 위해, 유지 검정은, 단독으로 또는 LOA 및/또는 GOA 검정과 함께, 사용될 수 있다.
유지 검정은 (LTVEC의 5' 상동성 아암에 상응하는) 5' 표적 서열 및/또는 (LTVEC의 3' 상동성 아암에 상응하는) 3' 표적 서열에서 DNA 템플레이트의 카피 수를 결정한다. 특히, 선택 카셋트에 인접한 상동성 아암에 상응하는 표적 서열에서 DNA 템플레이트의 카피 수 결정은 유용하다. 2배체 세포에서, 2 초과 카피 수는 일반적으로, 바람직하지 않은, 표적 게놈 유전자좌에서 보다는 표적 게놈 유전자좌의 외부에서 무작위로 LTVEC의 유전자도입 통합을 나타낸다. 정확하게 표적화된 클론은 2의 카피 수를 유지할 것이다. 게다가, 그와 같은 유지 검정에서 2 미만의 카피 수는 일반적으로, 또한 바람직하지 않은, 결실에 표적화된 영역을 넘어서 확장하는 큰 Cas-매개된 결실을 나타낸다.
2배체 세포에서 표적 게놈 유전자좌에 핵산 삽입물의 표적화된 삽입 확인을 위한 예시적 유지 검정에서, DNA는 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 상동성 아암 및 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 포함하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)로 접촉된 게놈을 갖는 세포로부터 먼저 수득되고, 상기 핵산 삽입물은 제1 상동성 아암에 인접한 선택 카셋트를 포함한다. 임의로, 선택 카셋트는 약물 내성 유전자를 포함할 수 있다. DNA는 그 다음 제1 표적 서열 이내 결합하는 프로브, 핵산 삽입물 이내 결합하는 프로브, 및 공지된 카피 수를 갖는 참조 유전자 이내 결합하는 프로브에 노출되고, 여기서 각각의 프로브는 결합시 검출가능한 신호를 생성한다. 각각의 프로브의 결합으로부터 신호는 그 다음 검출된다. 참조 유전자 프로브로부터 신호는 제1 표적 서열용 카피 수를 결정하기 위해 제1 표적 서열 프로브로부터 신호에 비교되고, 참조 유전자 프로브로부터 신호는 핵산 삽입물용 카피 수를 결정하기 위해 핵산 삽입물 프로브로부터 신호에 비교된다. 하나 또는 둘의 핵산 삽입물 카피 수 그리고 둘의 제1 표적 서열 카피 수는 일반적으로 표적 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물의 표적화된 삽입을 나타내고, 하나 이상의 핵산 삽입물 카피 수 그리고 셋 이상의 제1 표적 서열 카피 수는 일반적으로 표적 게놈 유전자좌 이외의 게놈 유전자좌에서 핵산 삽입물의 랜덤 삽입을 나타낸다.
제1 표적 서열 프로브의 결합으로부터 신호는 제1 표적 서열용 역치 사이클 (Ct) 값을 결정하는데 사용될 수 있고, 참조 유전자 프로브의 결합으로부터 신호는 참조 유전자용 역치 사이클 (Ct) 값을 결정하는데 사용될 수 있고, 제1 표적 서열의 카피 수는 제1 표적 서열 Ct 값 및 참조 유전자 Ct 값 비교에 의해 결정될 수 있다. 마찬가지로, 핵산 삽입물 프로브의 결합으로부터 신호는 핵산 삽입물용 역치 사이클 (Ct) 값을 결정하는데 사용될 수 있고, 핵산 삽입물의 카피 수는 제1 표적 서열 Ct 값 및 참조 유전자 Ct 값 비교에 의해 결정될 수 있다.
LTVEC에서 핵산 삽입물은, 예를 들어, 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 kb일 수 있다. 프로브가 제1 표적 서열 및 선택 카셋트에서 결합하는 서열 사이 거리는, 예를 들어, 이하 100개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드, 300개의 뉴클레오타이드, 400개의 뉴클레오타이드, 500개의 뉴클레오타이드, 600개의 뉴클레오타이드, 700개의 뉴클레오타이드, 800개의 뉴클레오타이드, 900개의 뉴클레오타이드, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 또는 5 kb일 수 있다.
그와 같은 방법은 제2 표적 서열의 카피 수를 결정하기 위해 추가의 유지 검정을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 방법은 제2 표적 서열용 카피 수를 결정하기 위해 제2 표적 서열을 결합시키는 프로브에 세포의 DNA 노출, 제2 표적 서열 프로브의 결합으로부터 신호 검출, 및 제2 표적 서열 프로브로부터 신호에 참조 유전자 프로브로부터 신호 비교를 추가로 포함할 수 있다.
마찬가지로, 그와 같은 방법은 핵산 삽입물 이내 하나 이상의 추가의 서열의 카피 수를 결정하기 위해 추가의 GOA 검정을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 방법은 핵산 삽입물 이내 하나 이상의 추가의 서열용 카피 수를 결정하기 위해 핵산 삽입물을 결합시키는 하나 이상의 추가의 프로브에 세포의 DNA 노출, 하나 이상의 추가의 프로브의 결합으로부터 신호 검출, 및 하나 이상의 추가의 핵산 삽입물 프로브로부터 신호에 참조 유전자 프로브로부터 신호 비교를 추가로 포함할 수 있다.
마찬가지로, LTVEC이 표적 게놈 유전자좌로부터 내인성 서열을 결실시키도록 설계되는 경우 또는 짝짓기된 gRNAs가 (예를 들면, 단일 게놈 표적 유전자좌 이내 상이한 부위에서 짝짓기된 이중-가닥 절단을 창출하는데 그리고 개입 내인성 서열을 결실시키는데) 사용되는 경우, 그와 같은 방법은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 서열의 카피 수를 결정하기 위해 LOA 검정을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 방법은 내인성 서열용 카피 수를 결정하기 위해 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 서열을 결합시키는 프로브에 세포의 DNA 노출, 내인성 서열 프로브의 결합으로부터 신호 검출, 및 내인성 서열 프로브로부터 신호에 참조 유전자 프로브로부터 신호 비교를 추가로 포함할 수 있다.
유지 검정은 또한 짝짓기된 gRNAs가 사용되지만 외인성 수복 템플레이트는 반드시 사용되지 않는 실험에서 사용될 수 있다. 짝짓기된 gRNAs가 표적 게놈 유전자좌에서 큰 Cas-매개된 결실을 창출할 수 있기 때문에, NHEJ 수복 이후 인델로 인한 결실에 표적화된 영역을 넘어서 확장하는 결실과 대조적으로 짝짓기된 gRNAs에 의한 정확한 표적화 결실을 입증하기 위한 유용한 확대 표준 LOA 검정일 수 있다.
유지 검정은 제1 가이드 RNA 인식 서열 (즉, 5' 가이드 RNA 인식 서열)을 포함하는 및/또는 상기의 업스트림 영역 및/또는 제2 가이드 RNA 인식 서열 (즉, 3' 가이드 RNA 인식 서열)을 포함하는 및/또는 상기의 다운스트림 및 상기에 인접한 영역에서 DNA 템플레이트의 카피 수를 결정한다. 2배체 세포에서, 1 미만 카피 수는, 바람직하지 않은, 결실에 표적화된 영역을 넘어서 확장하는 큰 NHEJ-매개된 결실을 나타낼 것이다. 정확하게 표적화된 클론은 2의 카피 수를 유지할 것이다. 카피 수를 결정하기 위한 프로브는, 예를 들어, 가이드 RNA 인식 서열의 약 100개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드, 300개의 뉴클레오타이드, 400개의 뉴클레오타이드, 500개의 뉴클레오타이드, 600개의 뉴클레오타이드, 700개의 뉴클레오타이드, 800개의 뉴클레오타이드, 900개의 뉴클레오타이드, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 또는 5 kb 이내일 수 있다.
적합한 정량적 검정의 다른 예는 하기를 포함한다: 형광-매개된 원위치 하이브리드화 (FISH), 비교 게놈 하이브리드화, 등온성 DNA 증폭, 고정된 프로브(들)에 정량적 하이브리드화, INVADER® 프로브, TAQMAN® 분자 항로표지 프로브, 또는 ECLIPSE™ 프로브 기술 (참고, 예를 들면, US 2005/0144655, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). 표적화된 변형에 대하여 스크리닝을 위한 종래의 검정, 예컨대 광범위 PCR, 서던 블랏팅, 또는 생거 서열분석은 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 검정은 전형적으로 삽입된 표적화 벡터와 표적화된 게놈 유전자좌 사이 연결에 대하여 증거를 수득하기 위해 사용된다. 예를 들어, 광범위 PCR 검정을 위하여, 1 프라이머는 삽입된 DNA 이내 서열을 인식할 수 있고 한편 다른 것은 표적화 벡터의 상동성 아암의 말단을 넘어서 표적 게놈 유전자좌 서열을 인식한다.
차세대 서열분석 (NGS)는 또한, 특히 변형된1-세포기 배아에서 스크리닝에 사용될 수 있다. 차세대 서열분석은 또한 "NGS" 또는 "대량 병렬 서열분석" 또는 "고처리량 서열분석"으로서 지칭될 수 있다. 그와 같은 NGS는 표적화된 유전적 변형의 정확한 성질을 정의하기 위해 그리고 모자이크현상을 검출하기 위해 MOA 검정 및 유지 검정에 더하여 스크리닝 도구로서 사용될 수 있다. 모자이크현상은 단일 수정란 (즉, 접합자)로부터 개발된 하나의 개체에서 상이한 유전자형을 가진 세포의 둘 이상의 모집단의 존재를 지칭한다. 본 명세서에서 개시된 방법에서, 선택 마커를 사용하여 표적화된 클론에 대하여 스크리닝하는 것이 필요 없다. 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 MOA 및 NGS 검정은 선택 카셋트 사용 없이 의존될 수 있다.
표적화된 세포는 또한 관심의 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원의 발현의 감소 또는 제거를 위하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 자가-항원이 단백질이면, 발현은, 예를 들어, 웨스턴 블랏 분석 또는 단백질 면역염색을 포함하여, 단백질 발현 검정용 임의의 공지된 기술에 의해 평가될 수 있다.
III. 유전적으로 변형된 비-인간 동물의 제조 방법
유전적으로 변형된 비-인간 동물은 본 명세서에서 개시된 다양한 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법을 포함하여, 유전적으로 변형된 유기체 생산을 위한 임의의 편리한 방법 또는 프로토콜은 그와 같은 유전적으로 변형된 비-인간 동물의 생산에 적합하다. 유전적으로 변형시키는 만능 세포 예컨대 배아 줄기 (ES) 세포로 개시하는 그와 같은 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함한다: (1) 본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여 1-세포기 배아가 아닌 만능 세포의 게놈을 변형시키는 단계; (2) 유전적으로 변형된 만능 세포를 확인 및 선택하는 단계; (3) 유전적으로 변형된 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (4) 대리모에서 유전적으로 변형된 만능 세포를포함하는 숙주 배아를 이식 및 잉태하는 단계. 대리모는 그 다음 표적화된 유전적 변형을 포함하는 그리고 생식계열을 통해 표적화된 유전적 변형을 전염시킬 수 있는 F0 세대 비-인간 동물을 생산할 수 있다. 유전적으로 변형된 게놈 유전자좌를 보유하는 동물은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 대립유전자 (MOA) 검정의 변형을 통해 확인될 수 있다. 공여체 세포는 임의의 단계, 예컨대 배반포기 또는 전-상실배기 (즉, 4 세포기 또는 8 세포기)에서 숙주 배아에 도입될 수 있다. 생식계열을 통해 유전적 변형을 전염시킬 수 있는 자손은 생성된다. 만능 세포는, 예를 들어, 본 명세서에서 다른 곳에 논의된 바와 같이 ES 세포 (예를 들면, 설치류 ES 세포, 마우스 ES 세포, 또는 랫트 ES 세포)일 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,294,754, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
대안적으로, 유전적으로 변형시키는 1-세포기 배아로 개시하는 그와 같은 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함한다: (1) 본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여1-세포기 배아의 게놈을 변형시키는 단계; (2) 유전적으로 변형된 배아를 확인 또는 선택하는 단계; 및 (3) 대리모에서 유전적으로 변형된 배아를 이식 및 잉태하는 단계. 대리모는 그 다음 표적화된 유전적 변형을 포함하는 그리고 생식계열을 통해 표적화된 유전적 변형을 전염시킬 수 있는 F0 세대 비-인간 동물을 생산할 수 있다. 유전적으로 변형된 게놈 유전자좌를 보유하는 동물은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 대립유전자 (MOA) 검정의 변형을 통해 확인될 수 있다.
핵전이 기술은 또한 비-인간 포유류 동물을 생성하는데 사용될 수 있다. 간단히, 핵전이 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다: (1) 난모세포를 제핵하는 또는 제핵된 난모세포를 제공하는 단계; (2) 제핵된 난모세포와 조합되도록 공여체 세포 또는 핵을 단리 또는 제공하는 단계; (3) 재구성된 세포를 형성하기 위해 제핵된 난모세포에 세포 또는 핵을 삽입하는 단계; (4) 배아를 형성하기 위해 비-인간 동물의 자궁에 재구성된 세포를 이식하는 단계; 및 (5) 배아를 발달시키는 단계. 그와 같은 방법에서, 난모세포는, 이들이 살아있는 동물의 어느 한쪽 난관 및/또는 난소로부터 또한 단리될 수 있어도, 사망한 동물로부터 일반적으로 회수된다. 난모세포는 제핵에 앞서 당해 분야의 숙련가에 공지된 여러 가지의 배지에서 성숙될 수 있다. 난모세포의 제핵은 당해 분야의 숙련가에 널리 공지된 수많은 방식으로 수행될 수 있다. 재구성된 세포를 형성하기 위해 제핵된 난모세포에 공여체 세포 또는 핵의 삽입은 융합에 앞서 조나 펠루시다 하에서 공여체 세포의 미세주입으로 될 수 있다. 융합은 접촉/융합 면을 거쳐 DC 전기 펄스의 인가 (전기융합)에 의해, 융합-촉진 화학물질, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에 세포의 노출에 의해, 또는 불활성화된 바이러스, 예컨대 센다이 바이러스에 의해 유도될 수 있다. 재구성된 세포는 핵 공여체 및 수령체 난모세포의 융합 전, 동안, 및/또는 후 전기 및/또는 비-전기 수단에 의해 활성화될 수 있다. 활성화 방법은 전기 펄스, 화학적으로 유도된 쇼크, 정자에 의한 침투, 난모세포에서 2가 양이온의 수준 증가, 및 난모세포에서 (키나제 억제제의 식으로서) 세포 단백질의 인산화 감소를 포함한다. 활성화된 재구성된 세포, 또는 배아는 당해 분야의 숙련가에 널리 공지된 배지에서 배양될 수 있고 그 다음 동물의 자궁에 전달될 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2008/0092249, WO 1999/005266, US 2004/0177390, WO 2008/017234, 및 미국 특허 번호 7,612,250, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
본 명세서에서 제공된 다양한 방법은 표적화된 유전적 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 F0 동물의 세포인 유전적으로 변형된 비-인간 F0 동물의 생성을 허용한다. F0 동물을 생성하는데 사용된 방법에 의존하여, 표적화된 유전적 변형을 갖는 F0 동물 이내 세포의 수는 다양할 것임이 인식된다. 예를 들어, VELOCIMOUSE® 방법을 통해 상응하는 유기체로부터 전-상실배기 배아 (예를 들면, 8-세포기 마우스 배아)에 공여체 ES 세포의 도입은 표적화된 유전적 변형을 갖는 세포를 포함하기 위해 F0 동물의 세포 모집단의 더 큰 백분율을 허용한다. 예를 들어, 비-인간 F0 동물의 세포 기여의 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 표적화된 유전적 변형을 갖는 세포 모집단을 포함할 수 있다. 게다가, F0 동물의 적어도 하나 이상의 세균 세포는 표적화된 유전적 변형을 가질 수 있다.
A. 비-인간 동물 및 세포의 유형
본 명세서에서 제공된 방법은 비-인간 동물 그리고 비-인간 동물로부터 세포 및 배아를 이용한다. 그와 같은 비-인간 동물은 바람직하게는 포유동물, 예컨대 설치류 (예를 들면, 랫트, 마우스, 및 햄스터)이다. 다른 비-인간 포유동물은, 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 토끼, 말, 황소, 사슴, 들소, 가축 (예를 들면, 소 종 예컨대 소, 거세소, 및 기타 동종; 양 종 예컨대 양, 염소, 및 기타 동종; 및 돼지 종 예컨대 돼지 및 야생돼지)를 포함한다. 용어 "비-인간"은 인간을 배제한다. 본 명세서에서 제공된 일부 방법에서, 비-인간 동물 그리고 비-인간 동물로부터 세포 및 배아는 하이브리드이다.
본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 비-인간 동물 세포는, 예를 들어, 분화전능성 세포 또는 만능 세포 (예를 들면, 배아 줄기 (ES) 세포 예컨대 설치류 ES 세포, 마우스 ES 세포, 또는 랫트 ES 세포)). 분화전능성 세포는 임의의 세포 유형을 생기게 할 수 있는 미분화된 세포를 포함하고, 만능 세포는 1 초과 분화된 세포 유형으로 발생하는 능력을 갖는 미분화된 세포를 포함한다. 그와 같은 만능 및/또는 분화전능성 세포는, 예를 들어, ES 세포 또는 ES-유사 세포, 예컨대 유도 만능 줄기 (iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는 배아에 도입시 발생 배아의 임의의 조직에 기여할 수 있는 배아-유래된 분화전능성 또는 만능 세포를 포함한다. ES 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래될 수 있고 3 척추동물 배엽층 (내배엽, 외배엽, 및 중배엽)의 어느 하나의 세포로 분화할 수 있다.
본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 비-인간 동물 세포는 또한 1-세포기 배아 (즉, 수정된 난모세포 또는 접합자)를 포함할 수 있다. 1-세포기 배아는 2 배우자 사이 수정 사건에 의해 형성된 진핵 세포이다. 그와 같은 1-세포기 배아는 임의의 유전적 배경 (예를 들면, BALB/c, C57BL/6, 129, 또는 이의 조합)일 수 있고, 신선하거나 냉동일 수 있고, 천연 교배 또는 시험관내 수정으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 마우스 및 마우스 세포는, 예를 들어, 129 균주, C57BL/6 균주, BALB/c 균주, 스위스 웹스터 균주, 129 및 C57BL/6의 믹스, 균주, BALB/c 및 C57BL/6 균주의 믹스, 129 및 BALB/c 균주의 믹스, 및 BALB/c, C57BL/6, 및 129 균주의 믹스로부터일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 마우스 또는 마우스 세포는 적어도 부분적으로 BALB/c 균주 (예를 들면, BALB/c 균주로부터 유래된 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 BALB/c 균주로부터 유래된 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 100%)로부터일 수 있다. 일 예에서, 마우스 또는 마우스 세포는 50% BALB/c, 25% C57BL/6, 및 25% 129를 포함하는 균주를 가질 수 있다. 대안적으로, 마우스 또는 마우스 세포는 BALB/c를 배제하는 균주 또는 균주 조합을 포함할 수 있다. 그와 같은 마우스에서, BALB/c 배경은 관심의 외래 항원에 대핸 항원-결합 단백질의 충분한 레퍼토리를 생산하도록 요구되지 않는다.
129 균주의 예는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들면, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 포함한다. 참고, 예를 들면, Festing 등 (1999) Mammalian Genome 10(8): 836, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. C57BL 균주의 예는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 마우스 및 마우스 세포는 또한 상기 언급된 129 균주 및 상기 언급된 C57BL/6 균주 (예를 들면, 50% 129 및 50% C57BL/6)의 믹스로부터일 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 마우스 및 마우스 세포는 상기 언급된 129 균주의 믹스 또는 상기 언급된 BL/6 균주 (예를 들면, 129S6 (129/SvEvTac) 균주)의 믹스로부터일 수 있다. 마우스 ES 세포의 특정 예는 VGF1 마우스 ES 세포이다. (또한 F1H4로서 공지된) VGF1 마우스 ES 세포는 숫컷 129S6/SvEvTac 마우스에 암컷 C57BL/6NTac 마우스를 이종교배시킴으로써 생산된 하이브리드 배아로부터 유래되었다. 참고, 예를 들면, Auerbach 등 (2000) Biotechniques 29, 1024-1028, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 마우스 및 마우스 세포는 또한 MHC 일배체형의 임의의 조합을 가질 수 있다. MHC 분자의 기능은 외래 펩타이드 단편을 결합시키는 것이고 적절한 T 세포에 의한 인식을 위하여 세포 표면에서 이들을 표시하는 것이다. 예를 들어, 마우스 및 마우스 세포는 MHCb 일배체형 (예를 들면, C57BL/6), MHCd 일배체형 (예를 들면, BALB/c)를 포함할 수 있거나, 양쪽 MHCb 및 MHCd (예를 들면, C57BL/6 및 BALB/c의 조합)을 포함할 수 있다. 그와 같은 MHC 조합은 증가된 항체 역가를 초래할 수 있다.
본 명세서에서 제공된 방법에서 이용된 랫트 또는 랫트 세포는, 예를 들어, ACI 랫트 균주, Dark Agouti (DA) 랫트 균주, Wistar 랫트 균주, LEA 랫트 균주, Sprague Dawley (SD) 랫트 균주, 또는 Fischer 랫트 균주 예컨대 Fisher F344 또는 Fisher F6을 포함하는, 임의의 랫트 균주로부터일 수 있다. 랫트 또는 랫트 세포는 또한 상기 인용된 둘 이상의 균주의 믹스로부터 유래된 균주로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 랫트 또는 랫트 세포는 DA 균주 또는 ACI 균주로부터일 수 있다. ACI 랫트 균주는, 백색 배 및 발 그리고 RT1 av1 일배체형과, 흑색 아구티를 갖는 것으로서 특성규명된다. 그와 같은 균주는 Harlan Laboratories를 포함하는 여러 가지의 공급원으로부터 이용가능하다. ACI 랫트로부터 랫트 ES 세포주의 예는 ACI.G1 랫트 ES 세포이다. Dark Agouti (DA) 랫트 균주는 아구티 코트 및 RT1 av1 일배체형을 갖는 것으로서 특성규명된다. 그와 같은 랫트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함하는 여러 가지의 공급원으로부터 이용가능하다. DA 랫트로부터 랫트 ES 세포주의 예는 DA.2B 랫트 ES 세포주 및 DA.2C 랫트 ES 세포주이다. 일부 경우에서, 랫트 또는 랫트 세포는 근친교배한 랫트 균주로부터이다. 참고, 예를 들면, US 2014/0235933 A1, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 다른 사례에서, 랫트 또는 랫트 세포는 하이브리드 랫트 균주로부터이다.
숙주 배아에 이식된 세포는 "공여체 세포"로서 지칭될 수 있다. 공여체 세포는 숙주 배아로서 동일한 균주로부터 또는 상이한 균주로부터일 수 있다. 마찬가지로, 대리모는 공여체 세포 및/또는 숙주 배아로서 동일한 균주로부터일 수 있거나, 대리모는 공여체 세포 및/또는 숙주 배아로서 상이한 균주로부터일 수 있다.
여러 가지의 숙주 배아는 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 공여체 세포 (예를 들면, 공여체 ES 세포)는 상응하는 유기체로부터 전-상실배기 배아 (예를 들면, 8-세포기 배아)에 도입될 수 있다. 참고, 예를 들면, US 7,576,259; US 7,659,442; US 7,294,754; 및 US 2008/0078000, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 다른 방법에서, 공여체 세포는 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기, 16-세포기, 32-세포기, 또는 64-세포기에서 숙주 배아에 이식될 수 있다. 숙주 배아는 또한 배반포일 수 있거나 전-배반포 배아, 전-상실배기 배아, 상실배기 배아, 미결속된 상실배기 배아, 또는 결속된 상실배기 배아일 수 있다. 마우스 배아를 이용하는 경우, 숙주 배아기는 하기에서 기재된 Theiler기와 관련하여, Theiler Stage 1 (TS1), TS2, TS3, TS4, TS5, 및 TS6일 수 있다: Theiler (1989) "The House Mouse:Atlas of Mouse Development," Springer-Verlag, New York, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 예를 들어, Theiler Stage는 TS1, TS2, TS3, 및 TS4로부터 선택될 수 있다. 일부 방법에서, 숙주 배아는 조나 펠루시다를 포함하고, 공여체 세포는 조나 펠루시다에서 홀을 통해 숙주 배아에 도입되는 ES 세포이다. 다른 방법에서, 숙주 배아는 조나-없는 배아이다. 더욱 다른 방법에서, 상실배기 숙주 배아는 응집된다.
B. 항원-결합 단백질 생성용 비-인간 동물
본 명세서에서 제공된 방법에서 사용된 비-인간 동물은 항원-결합 단백질을 생산할 수 있는 임의의 비-인간 동물, 예컨대 포유동물, 설치류, 랫트, 또는 마우스일 수 있다. 예를 들어, 항체 생산을 최적화하기 위해 유전적으로 변형된 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 사용될 수 있다. 그와 같은 비-인간 동물은, 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물을 포함하는, 인간 치료제로서 사용될 수 있는 항체의 대규모 생산을 용이하게 하기 위해 조작된 비-인간 동물일 수 있다. 예를 들어, 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열에서 하나 이상의 하기 변형을 포함할 수 있다: 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 중쇄 가변 영역 유전자좌는, 전체적으로 또는 부분적으로, 인간 중쇄 가변 유전자 유전자좌로 대체되고; 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 카파 경쇄 가변 영역 유전자좌는, 전체적으로 또는 부분적으로, 인간 카파 경쇄 가변 영역 유전자좌로 대체되고; 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 람다 경쇄 가변 영역 유전자좌는, 전체적으로 또는 부분적으로, 인간 람다 경쇄 가변 영역 유전자좌로 대체되고; 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 유전자좌는, 전체적으로, 그것의 인간 동족체 또는 오쏘로그로 대체된다. 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 또한 그것의 생식계열에서 하나 이상의 하기 변형을 포함할 수 있다: 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)가 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 불변 도메인에 융합된 인간 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 B 세포를 생산하도록 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 전적으로 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자좌; 또는 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)가 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 불변 영역에 융합된 인간 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 B 세포를 생산하도록 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역.예로서, VELOCIMMUNE® 마우스는 사용될 수 있다. 참고, 예를 들면, US 6,596,541, US 8,791,323, US 8,895,802, US 8,895,801, US 7,105,348, US 2002/0106629, US 2007/0061900, US 2011/0258710, US 2011/0283376, US 2013/0210137, US 2014/0017781, US 2014/0020124, US 2014/0020125, US 2014/0017782, US 2014/0018522, US 2014/0033337, US 2014/0033336, US 2014/0041068, US 2014/0073010, US 2014/0023637, US 2014/0017238, US 2014/0013457, US 2014/0017229, US 2002/0183275, US 8,502,018, US 2012/0322108, US 2013/0254911, US 2014/0213773, US 2015/0201589, US 2015/0210776, US 2014/0017228, US 8,642,835, US 8,697,940, 및 Murphy 등 (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14): 5153-5158, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. VELOCIMMUNE® 마우스는, 내인성 유전자좌에서, 상응하는 인간 면역글로불린 가변 영역으로 마우스 면역글로불린 중쇄 (IgH) 및 면역글로불린 경쇄 (예를 들면, κ 경쇄, Igκ)를 인코딩하는 생식계열 가변 영역의 정확한, 대규모 대체를 함유한다. 이러한 정확한 대체는 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 중쇄 및 경쇄를 만드는 하이브리드 면역글로불린 유전자좌를 가진 마우스를 초래한다. 마우스 VH-DH-JH 및 Vκ-Jκ 분절의 정확한 대체는 하이브리드 면역글로불린 유전자좌에서 온전한 및 기능적인 측접하는 마우스 서열을 남겨둔다. 마우스의 체액성 면역 시스템은 야생형 마우스의 것처럼 기능한다. B 세포 발생은 임의의 상당한 면에서 방해되지 않고 인간 가변 영역의 풍부한 다양성은 항원 공격시 마우스에서 생성된다.
상기 기재된 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) (예를 들면, VELOCIMMUNE® 마우스)는 또한 그것의 생식계열에서 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) ADAM6 유전자 또는 이의 동족체 또는 오쏘로그 또는 기능적 단편을 인코딩하는 기능적 이소성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 부족할 수 있고 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) ADAM6 기능의 손실을 보완하기 위해 기능적 이소성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기능적 이소성 서열은 하나 이상의 Adam6 유전자, 예컨대 마우스 Adam6a 유전자, 마우스 Adam6b 유전자, 또는 양쪽 Adam6a 및 Adam6b 유전자를 포함할 수 있다. 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에 또는 다른 곳에 존재할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2012/0322108; US 2013/0254911; US 2014/0213773; US 2015/0201589; US 2015/0210776; US 2014/0017228; 및 US 2013/0198879, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는, 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 제한된 레퍼토리로부터, 인간 경쇄 가변 도메인의 제한된 레퍼토리, 또는 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현시키기 위해 유전적으로 변형된 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)를 포함한다. 그와 같은 비-인간 동물은 "보편적인 경쇄" 또는 "공통 경쇄"를 생성하고 이중특이적 항체 제조에 유용할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2011/0195454; US 2012/0021409; US 2012/0192300; US 2015/0059009; US 2013/0045492; US 2013/0198880; US 2013/0185821; US 2013/0302836; US 2013/0247234; US 2014/0329711; 및 US 2013/0198879, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 예를 들어, 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 단일 경쇄를 발현시키는 (또는 2 경쇄의 어느 한쪽 또는 양쪽을 발현시키는) 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 (또는 2 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자)를 형성하기 위해 재배열하는 단일 미재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절 (또는 2 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절)을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 재배열된 인간 경쇄 가변 도메인은 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)에 의해 선택된 복수의 친화도-성숙된 인간 중쇄와 짝짓기할 수 있고, 여기서 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프를 특이적으로 결합시킨다.
경쇄 옵션의 제한된 레퍼토리를 달성하기 위해, 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 원상태 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 경쇄 가변 도메인을 제조, 또는 재배열시키기 위해 그것의 능력을 비기능성 또는 실질적으로 비기능성으로 만들도록 조작될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 비-인간 동물의 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 경쇄 가변 영역 유전자 분절 결실에 의해, 달성될 수 있다. 내인성 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 유전자좌는 그 다음, 외인성 인간 가변 영역 유전자 분절이 내인성 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 경쇄 불변 영역 유전자를 재배열 및 재조합할 수 있고 재배열된 역방향 키메라 경쇄 유전자 (인간 가변, 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 불변)을 형성하는는 그와 같은 방식으로, 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된, 선택의 외인성 적합한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 변형될 수 있다.
상기 (예를 들면, "보편적인 경쇄" 또는 "공통 경쇄") 기재된 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 또한 그것의 생식계열에서 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) ADAM6 유전자 또는 이의 동족체 또는 오쏘로그 또는 기능적 단편을 인코딩하는 기능적 이소성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 명세서에서 기재된 임의의 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 또한 그것의 생식계열에서 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) ADAM6 유전자 또는 이의 동족체 또는 오쏘로그 또는 기능적 단편을 인코딩하는 기능적 이소성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 부족할 수 있고 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) ADAM6 기능의 손실을 보완하기 위해 기능적 이소성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이소성 핵산 서열은 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에 또는 다른 곳에 존재할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2012/0322108; US 2013/0254911; US 2014/0213773; US 2015/0201589; US 2015/0210776; US 2014/0017228; 및 US 2013/0198879, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열에서 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 미재배열된 J 분절 및 미재배열된 경쇄 V 분절을 포함하는 비-인간 동물을 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2012/0096572, US 2014/0130194, 및 US 2014/0130193, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 일 예는 생식계열 게놈이 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절, 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 다양성 (DH) 유전자 분절, 및 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 연결 (JH) 유전자 분절의, 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (Vκ) 유전자 분절 및 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 연결 (Jκ) 유전자 분절을 포함하고 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 (CH) 영역에 작동가능하게 연결되는 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 포함하는 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물이고, 상기 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 V 유전자 분절 및 상기 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 J 유전자 분절은 변형된 내인성 중쇄 유전자좌에서 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 CH 영역에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 Vκ/Jκ 유전자 서열을 형성하기 위해 B 세포 발생 동안 B 세포에서 재배열에 참가한다. 그와 같은 비-인간 동물의 또 다른 예는 그것의 생식계열에서 내인성 비-인간 동물 중쇄 유전자좌에서 내인성 비-인간 동물 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 미재배열된 인간 카파 경쇄 연결 (Jκ) 유전자 분절 및 제1 미재배열된 인간 카파 경쇄 가변 (Vκ) 유전자 분절을 포함하는 비-인간 동물이고, 상기 제1 미재배열된 인간 Vκ 유전자 분절 및 상기 미재배열된 인간 Jκ 유전자 분절은 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절, 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 다양성 (DH) 유전자 분절 및 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 중쇄 연결 (JH) 유전자 분절을 대체하고, 상기 제1 미재배열된 인간 Vκ 유전자 분절 및 미재배열된 인간 Jκ 유전자 분절은 비-인간 동물에서 내인성 비-인간 동물 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 재배열된 Vκ/Jκ 서열을 형성하기 위해 재배열에 참가하고, 상기 비-인간 동물은 추가로 그것의 생식계열에서 비-인간 동물 경쇄 불변 유전자에 작동가능하게 연결된 제2 인간 경쇄 가변 (VL) 유전자 분절 및 인간 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절을 포함한다. 예컨대 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 게놈이 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절, 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 다양성 (DH) 유전자 분절, 및 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 연결 (JH) 유전자 분절의, 제1 복수의 미재배열된 인간 경쇄 가변 (Vκ) 유전자 분절 및 제1 복수의 미재배열된 인간 경쇄 연결 (Jκ) 유전자 분절로의 대체를 포함하도록 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 상기 제1 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 내인성 중쇄 불변 (CH) 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고 내인성 비-인간 동물 CH 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제1 재배열된 인간 경쇄 Vκ/Jκ 유전자 서열을 형성하기 위해 B 세포 발생 동안 B 세포에서 재배열에 참가한다; 및 (b) 내인성 비-인간 동물 경쇄 유전자좌에서 내인성 비-인간 동물 경쇄 불변 (Cκ) 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제2 복수의 미재배열된 인간 경쇄 가변 (Vκ) 유전자 분절 및 제2 복수의 미재배열된 인간 경쇄 연결 (Jκ) 유전자 분절을 포함하는 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌, 상기 제2 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 내인성 쇄 유전자좌에서 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 경쇄 가변 (Vκ) 유전자 분절 및 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 경쇄 연결 (Jκ) 유전자 분절을 대체하고 내인성 비-인간 동물 Cκ 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제2 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 Vκ/Jκ 영역 유전자 서열을 형성하기 위해 B 세포 발생 동안 B 세포에서 재배열에 참가한다.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열 게놈에서 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2015/0020224, US 2014/0245468, US 2016/0100561, US 9,204,624, 및 US 14/961,642, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 일 예는 그것의 생식계열 게놈에서 내인성 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 포함하는 비-인간 동물이고, 상기 재배열된 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열은 VH3-23/X1X2/JH의 서열을 인코딩하고, 여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산이다. 그와 같은 비-인간 동물의 또 다른 예는 그것의 생식계열 게놈에서 내인성 비-인간 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물이고, 상기 비-인간 동물은 B 세포 모집단에 관하여 야생형 비-인간 동물에 실질적으로 유사한 체액성 면역 시스템을 나타낸다. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는, 스페이서를 통해, 중쇄 J 분절 (JH) 서열에 작동가능하게 연결되는 중쇄 V 분절 (VH) 서열을 포함하는 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물이고, 상기 스페이서는 적어도 2 아미노산 잔기를 인코딩하고, 상기 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 이다. 일 예에서, VH 분절은 VH3-23이다.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 생식계열 게놈이 하기를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다: 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 단일 인간 미재배열된 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 미재배열된 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 미재배열된 JH 유전자 분절의 존재를 특징으로 하는 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 상기 비-인간 동물은 추가로 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 유래된 재배열된 인간 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2013/0323791 및 US 2013/0096287, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 일부 비-인간 동물에서, 단일 미재배열된 인간 VH 유전자 분절은 VH1-69이다. 그와 같은 일부 비-인간 동물에서, 단일 미재배열된 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2이다. 사용될 수 있는 다른 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 단일 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함한다는 점에서 제한되는 그리고 기능적 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌를 포함하지 않는 비-인간 동물; 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 인간 면역글로불린 VL 유전자 분절을 추가로 포함하는 비-인간 동물을 포함하고, 상기 단일 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 JH 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 단일 인간 VH 유전자 분절은 VH1-69 또는 이의 다형성 변이체이다.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열 게놈에서 미재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물을 포함하고, 상기 미재배열된 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 부가 또는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 상기 히스티딘 코돈은 상응하는 인간 생식계열 중쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 인코딩되지 않고; 상기 부가된 또는 치환된 히스티딘 코돈은 서열을 인코딩하는 상보성 결정 영역 3 (CDR3)에서 존재한다. 참고, 예를 들면, US 2013/0247235, US 9,301,510, 및 US 14/046,501, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 내인성 IgG 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부의 결실을 포함하는 생식계열 유전적 변형을 포함하는 비-인간 동물을 포함하고; 상기 비-인간 동물은 기능적 CH1 도메인을 포함하는 IgM 불변 영역 유전자를 발현시키고 상기 비-인간 동물은 그것의 혈청에서, 전체적으로 또는 부분적으로, CH1 도메인이 부족한, 그리고 동족 경쇄가 부족한 IgG 항체를 발현시킨다. 참고, 예를 들면, US 2011/0145937, US 2014/0289876, US 2015/0197553, US 2015/0197554, US 2015/0197555, US 2015/0196015, US 2015/0197556, US 2015/0197557, 및 US 8,754,287, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는, 변형이 하기를 포함하는, 생식계열 변형을 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 IgG 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 결실; 및 (b) 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 포함, 상기 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 (a)의 내인성 IgG 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 온전한 IgM 불변 영역 유전자를 포함하고 상기 비-인간 동물은 인간 가변 도메인을 포함하는, 전체적으로 또는 부분적으로, CH1 도메인이 부족한 그리고 동족 경쇄가 부족한 IgG 중쇄 항체를 발현시키고 상기 IgG 중쇄 항체를 그것의 혈청에 분비시킨다. 참고, 예를 들면, US 2011/0145937. 그와 같은 비-인간 동물의 또 다른 예는, 변형이 하기를 포함하는, 생식계열 변형을 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 IgG 불변 영역 유전자의 힌지 영역 및 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 결실; 및 (b) 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 포함, 상기 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 (a)의 내인성 IgG 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 온전한 IgM 불변 영역 유전자를 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2015/0197553. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는, 변형이 하기를 포함하는, 생식계열 변형을 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 IgG 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 결실; (b) 내인성 IgG2a 불변 영역 유전자의 결실; (c) 내인성 IgG2b 불변 영역 유전자의 결실; 및 (d) 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 포함, 상기 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 (a)의 내인성 IgG 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 온전한 IgM 불변 영역 유전자를 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2015/0197554. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는, 변형이 하기를 포함하는, 생식계열 변형을 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 IgG 불변 영역 유전자의 CH1 도메인 및 힌지 영역을 인코딩하는 핵산 서열의 결실; (b) 내인성 IgG2a 불변 영역 유전자의 결실; (c) 내인성 IgG2b 불변 영역 유전자의 결실; 및 (d) 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 포함, 상기 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 (a)의 내인성 IgG 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 온전한 IgM 불변 영역 유전자를 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2015/0197555. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는, 변형이 하기를 포함하는, 생식계열 변형을 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 IgG1 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 결실; (b) 내인성 IgD 불변 영역 유전자의 결실; (c) 내인성 IgG3 불변 영역 유전자의 결실; (d) 내인성 IgG2a 불변 영역 유전자의 결실; (e) 내인성 IgG2b 불변 영역 유전자의 결실; (f) 내인성 IgE 불변 영역 유전자의 결실; (g) 내인성 IgA 불변 영역 유전자의 결실; 및 (h) 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 포함, 상기 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 (a)의 내인성 IgG1 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 온전한 IgM 불변 영역 유전자를 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2015/0196015. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는, 변형이 하기를 포함하는, 생식계열 변형을 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 IgG1 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 결실; (b) 내인성 IgG2a 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 결실; (c) 내인성 IgD 불변 영역 유전자의 결실; (d) 내인성 IgG3 불변 영역 유전자의 결실; (e) 내인성 IgG2b 불변 영역 유전자의 결실; (f) 내인성 IgE 불변 영역 유전자의 결실; (g) 내인성 IgA 불변 영역 유전자의 결실; 및 (h) 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 포함, 상기 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 (a)의 내인성 IgG1 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 온전한 IgM 불변 영역 유전자를 포함한다. 참고, 예를 들면 US 2015/0197556. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는, 변형이 하기를 포함하는, 생식계열 변형을 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 IgG1 불변 영역 유전자의 힌지 영역 및 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 결실; (b) 내인성 IgD 불변 영역 유전자의 결실; (c) 내인성 IgG3 불변 영역 유전자의 결실; (d) 내인성 IgG2a 불변 영역 유전자의 결실; (e) 내인성 IgG2b 불변 영역 유전자의 결실; (f) 내인성 IgE 불변 영역 유전자의 결실; (g) 내인성 IgA 불변 영역 유전자의 결실; 및 (h) 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 포함, 상기 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 (a)의 내인성 IgG1 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 온전한 IgM 불변 영역 유전자를 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2015/0197557.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는, 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 서열과 인접한, λ 경쇄 가변 영역 서열 (Vλ) 및 적어도 하나의 J 서열 (J)를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2012/0073004, US 2014/0137275, US 2015/0246976, US 2015/0246977, US 2015/0351371, US 9,035,128, US 9,066,502, US 9,163,092, 및 US 9,150,662, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 일 예는 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 내인성 비-인간 동물 경쇄 유전자좌에서 적어도 12 내지 적어도 40 미재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역 유전자 분절 및 적어도 하나의 인간 Jλ 유전자 분절; (b) 적어도 12 내지 적어도 40 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절과 적어도 하나의 인간 Jλ 서열 사이 정위된 인간 Vκ-Jκ 유전자간 서열; 상기 비-인간 동물은 인간 Vλ 도메인 및 비-인간 동물 Cκ 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현시킨다. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 그것의 생식계열에서 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 복수의 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 V (hVλ) 유전자 분절 및 복수의 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 J (hJλ) 유전자 분절을 포함하는 미재배열된 경쇄 가변 영역, 상기 복수의 hVλ 유전자 분절 및 상기 복수의 hJλ 유전자 분절은 미재배열된 경쇄 가변 영역에서 단지 기능적 가변 영역 유전자 분절이다; 및 (b) 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자, 상기 복수의 연속 미재배열된 인간 λ 경쇄 V (hVλ) 유전자 분절 및 상기 복수의 연속 미재배열된 인간 λ 경쇄 J (hJλ) 유전자 분절은 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어 이로써 상기 미재배열된 경쇄 가변 영역은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 형성하기 위해 재배열할 수 있고 상기 비-인간 동물은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역에 의해 인코딩된 가변 영역 및 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현시킨다. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 그것의 생식계열에서 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 하기를 포함하는 미재배열된 경쇄 가변 영역: (i) 적어도 12 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 가변 영역 (hVλ) 유전자 분절 및 복수의 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 J (hJλ) 유전자 분절, 상기 적어도 12 기능적 hVλ 유전자 분절 및 상기 복수의 기능적 hJλ 유전자 분절은 미재배열된 경쇄 가변 영역에서 단지 기능적 가변 영역 유전자 분절이다; 및 (ii) 연속 hVλ 유전자 분절과 상기 복수의 연속 hJλ 유전자 분절 사이 정위된 인간 Vκ-Jκ 유전자간 서열; 및 (b) 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자; 상기 적어도 12 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 V (hVλ) 유전자 분절 및 상기 복수의 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 J (hJλ) 유전자 분절은 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어 이로써 미재배열된 경쇄 가변 영역은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 형성하기 위해 재배열할 수 있고 상기 비-인간 동물은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역에 의해 인코딩된 가변 영역 및 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현시킨다. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 그것의 생식계열에서 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 복수의 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 V (hVλ) 유전자 분절 및 복수의 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 J (hJλ) 유전자 분절을 포함하는 미재배열된 경쇄 가변 영역, 상기 복수의 hVλ 유전자 분절 및 상기 복수의 hJλ 유전자 분절은 미재배열된 경쇄 가변 영역에서 단지 기능적 가변 영역 유전자 분절이다; 및 (b) 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자, 상기 복수의 연속 미재배열된 기능적 hVλ 유전자 분절 및 상기 복수의 연속 미재배열된 기능적 hJλ 유전자 분절은 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어 이로써 상기 미재배열된 경쇄 가변 영역은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 형성하기 위해 재배열할 수 있고 상기 비-인간 동물은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역에 의해 인코딩된 가변 도메인 및 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현시킨다. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 그것의 생식계열에서 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 하기를 포함하는 미재배열된 경쇄 가변 영역: (i) 적어도 12 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 V (hVλ) 유전자 분절 및 복수의 연속 미재배열된 기능적 인간 λ 경쇄 J (hJλ) 유전자 분절, 상기 적어도 12 기능적 hVλ 유전자 분절 및 상기 복수의 기능적 hJλ 유전자 분절은 미재배열된 경쇄 가변 영역에서 단지 기능적 가변 영역 유전자 분절이다; 및 (ii) 연속 hVλ 유전자 분절과 상기 복수의 연속 hJλ 유전자 분절 사이 정위된 인간 Vκ-Jκ 유전자간 서열; 및 (b) 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자; 상기 적어도 12 연속 미재배열된 기능적 hVλ 유전자 분절 및 상기 복수의 연속 미재배열된 기능적 hJλ 유전자 분절은 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어 이로써 상기 미재배열된 경쇄 가변 영역은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역을 형성하기 위해 재배열할 수 있고 상기 비-인간 동물은 재배열된 인간 λ 경쇄 가변 영역에 의해 인코딩된 가변 도메인 및 비-인간 동물 κ 경쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 불변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 발현시킨다. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 게놈이 비-인간 동물 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물이어서 이로써 상기 비-인간 동물은 비-인간 동물 κ 불변 도메인과 융합된 인간 λ 가변 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현시킨다. 참고, 예를 들면, US 9,226,484.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열에서, 내인성 비-인간 동물 경쇄 유전자좌에, 인간 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 비-인간 동물을 포함하고, 상기 인간 람다 가변 영역 서열은 비-인간 동물 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열을 포함하는 경쇄에서 발현된다. 참고, 예를 들면, US 2013/0323790, US 2013/0326647, US 2015/0089680, US 2015/0173331, US 2015/0176002, US 2015/0173332, US 2012/0070861, US 2015/0320023, US 2016/0060359, US 2016/0057979, US 9,029,628, US 9,006,511, US 9,012,717, US 9,206,261, US 9,206,262, US 9,206,263, 및 US 9,226,484, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 비-인간 동물 불변 영역과 융합된 인간 람다 가변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현시키는 비-인간 동물이고, 상기 비-인간 동물은 약 1:1의 κ 용법 대 λ 용법 비를 나타낸다. 참고, 예를 들면, US 9,029,628. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 게놈이 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 분절의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로의 대체를 포함하는 내인성 미재배열된 κ 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물이고, 상기 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 동물 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결되어 이로써 상기 비-인간 동물은 비-인간 동물 κ 불변 영역과 융합된 인간 λ 가변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현시킨다. 참고, 예를 들면, US 9,006,511. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 게놈이 하기를 포함하는 내인성 λ 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물이다: (i) 제1 내인성 Vλ-Jλ-Cλ 유전자 클러스터의 결실; 및 (ii) 제2 내인성 Vλ-Jλ-Cλ 유전자 클러스터내 내인성 Vλ 및 Jλ 유전자 분절의 단편의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로의 대체, 상기 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 적어도 하나의 인간 Vλ 유전자 분절 및 적어도 하나의 인간 Jλ 유전자 분절을 포함하고, 상기 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절은 비-인간 동물 Cλ 유전자에 작동가능하게 연결된다. 참고, 예를 들면, US 9,012,717.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하는 게놈을 갖는 비-인간 동물을 포함하고, 상기 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소 또는 제거하고, 상기 비-인간 동물은 추가로 비-인간 동물 ADAM6 단백질 또는 이의 오쏘로그 또는 동족체 또는 상응하는 ADAM6 단백질의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2012/0322108, US 2013/0254911, US 2014/0213773, US 2015/0201589, US 2015/0210776, US 2014/0017228, US 8,642,835, 및 US 8,697,940, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 게놈이 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) ADAM6 유전자의 이소성 배치; 및 (b) 내인성 비-인간 동물 중쇄 유전자좌에 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절의 삽입을 포함하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌, 상기 인간 VH, DH 및 JH 유전자 분절은 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고; 이로써 상기 비-인간 동물은 하기를 특징으로 한다: (i) 수정성임; 및 (ii) 항원으로 면역화되는 경우, 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 중쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 인간 VH, 하나 이상의 인간 DH, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절에 의해 인코딩된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 생성함, 상기 항체는 항원에 특이적 결합을 보여준다. 참고, 예를 들면, US 8,642,835.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 하기를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다: (a) 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 하나 이상의 인간 Vλ 및 Jλ 유전자 분절 업스트림의 삽입, (b) 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 인간 VH, 하나 이상의 인간 DH 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절 업스트림의 삽입, 및 (c) ADAM6 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 ADAM6 단백질은 이소성 ADAM6 핵산 서열로부터 발현된다. 참고, 예를 들면, US 2013/0160153 및 US 2014/0017228, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 게놈이 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 비-인간 동물 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자의 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절 업스트림의 삽입, (b) 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절 업스트림의 삽입, 및 (c) 비-인간 동물 ADAM6 단백질을 인코딩하는 이소성 뉴클레오타이드 서열, 상기 비-인간 동물 ADAM6 단백질은 이소성 뉴클레오타이드 서열로부터 발현된다. 참고, 예를 들면, US 2013/0160153.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환 또는 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입을 CDR3 인코딩 서열에서 포함하는 미재배열된 면역글로불린 가변 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함하는 비-인간 동물을 포함하고, 상기 비-인간 동물은 추가로 다양한 레퍼토리의 항체를 생체내 포함하고, 이들의 각각은 관심의 항원에 특이적이고 미재배열된 면역글로불린 가변 유전자 서열에서 적어도 하나의 히스티딘 코돈 치환 또는 삽입에 의해 인코딩된 적어도 하나의 히스티딘 아미노산을 가변 도메인의 CDR3에서 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2013/0247236 및 US 2014/0082760, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 일 예에서, 제1 면역글로불린 가변 영역 유전자 유전자좌는 미재배열된 VH, DH, 및 JH 유전자 분절을 포함하는 미재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열의 기능적 부분을 포함하고, 여기서 하나 이상의 미재배열된 VH, DH, 및 JH 유전자 분절은 상응하는 야생형 생식계열 유전자 분절에 의해 인코딩되지 않는 삽입된 또는 치환된 히스티딘 코돈을 포함한다. 또 다른 예에서, 미재배열된 VH, DH, 및 JH 유전자 분절은 미재배열된 인간 VH, 미재배열된 인간 DH, 및 미재배열된 인간 JH 유전자 분절이다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입 또는 적어도 하나의 비 히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 가변 영역 유전자 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함하고, 상기 삽입된 또는 치환된 히스티딘 코돈은 상응하는 야생형 생식계열 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 인코딩되지 않고, 상기 비-인간 동물은 비-인간 동물의 생식계열에서 히스티딘 치환 또는 삽입으로부터 유래된 히스티딘을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 발현시킨다. 참고, 예를 들면, US 2013/0247236.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 하기를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다: (a) 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 하나 이상의 인간 VL 및 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절 업스트림의 삽입; (b) 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 인간 VL 및 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절 업스트림의 삽입; 및 (c) ADAM6 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 ADAM6 단백질은 이소성 ADAM6 핵산 서열로부터 발현된다. 참고, 예를 들면, US 2013/0212719, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 게놈이 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자의 하나 이상의 인간 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절 업스트림의 삽입, 상기 하나 이상의 인간 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다; (b) 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 하나 이상의 인간 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절 업스트림의 삽입, 상기 하나 이상의 인간 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (c) 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) ADAM6 단백질을 인코딩하는 삽입된 핵산 서열, 상기 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스) ADAM6 단백질은 삽입된 핵산 서열로부터 발현되어서, 이로써 비-인간 동물의 B 세포는 2 면역글로불린 중쇄와 짝짓기된 2 면역글로불린 경쇄를 각각 포함하는 항체를 발현시키고, 여기서 각각의 경쇄는 인간 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 경쇄 불변 도메인을 포함하고 각각의 중쇄는 인간 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2013/0212719.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열에서 하기를 갖는 비-인간 동물을 포함한다: (a) 단일 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 JH 유전자 분절을 포함하는 인간 게놈 서열; 및 (b) 숫컷 비-인간 동물에서 기능적인 ADAM6 단백질을 인코딩하는 서열, 여기서 ADAM6을 인코딩하는 상기 서열은 야생형 비-인간 동물의 ADAM6 유전자좌와 상이한 위치에서 정위된다. 참고, 예를 들면, US 2013/0333057, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 그것의 생식계열에서 하기를 갖는 비-인간 동물이다: (a) 단일 인간 VH 유전자 분절, 하나 이상의 인간 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 미재배열된 인간 게놈 서열, 상기 단일 인간 VH 유전자 분절은 VH1-2, VH1-69, VH2-26, VH2-70, 또는 이의 다형성 변이체이다; 및 (b) 숫컷 비-인간 동물에서 기능적인 ADAM6 단백질을 인코딩하는 서열, 여기서 ADAM6 단백질을 인코딩하는 상기 서열은 야생형 비-인간 동물의 ADAM6 유전자좌와 상이한 위치에서 정위된다. 참고, 예를 들면, US 2013/0333057.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 하기를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다: (a) 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 인코딩하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL/JL), 상기 단일 재배열된 인간 VL/JL 영역은 인간 Vκ1-39/J 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20/J 유전자 분절 (예를 들면, Vκ1-39/Jκ5 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20/Jκ1 유전자 분절)로부터 선택되고; 그리고 (b) 내인성 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로의 대체, 상기 인간 VH 유전자 분절은 내인성 중쇄 불변 (CH) 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 VH 유전자 분절은 인간/비-인간 동물 키메라 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다. 그와 같은 비-인간 동물은 "보편적인 경쇄" (ULC) 또는 "공통 경쇄" 비-인간 동물로서 지칭될 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2011/0195454, US 2012/0021409, US 2012/0192300, US 2015/0059009, US 2013/0045492, US 2013/0198880, US 2013/0185821, US 2013/0302836, US 2015/0313193, 및 US 15/056,713, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 마찬가지로, 사용될 수 있는 또 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 항체의 모집단을 발현시키는 비-인간 동물을 포함하고, 상기 비-인간 동물의 생식계열은, 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자인, 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자만을 포함하고, 상기 비-인간 동물은 단 하나의 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 이형접합성이거나, 2 카피를 함유한다는 점에서 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 동형접합성이고; 상기 비-인간 동물은 하기이도록 활성 친화도 성숙을 특징으로 한다: (i) 모집단의 각각의 면역글로불린 카파 경쇄는 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해, 또는 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; (ii) 상기 모집단은 경쇄 가변 도메인이 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체 그리고 경쇄 가변 도메인이 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고; (iii) 상기 비-인간 동물은 모집단의 항체를 형성하기 위해 면역글로불린 카파 경쇄와 성공적으로 짝짓기하는 체세포적으로 돌연변이된 고 친화도 중쇄의 다양한 수집을 생성한다. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성인 비-인간 동물이다: (a) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 비-인간 동물 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서 존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 비-인간 동물 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (b) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/비-인간 동물 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있다. 서열번호:148은 조작된 인간 Vκ1-39Jκ5 유전자좌의 서열이고, 서열번호:149는 조작된 인간 Vκ3-20Jκ1 유전자좌의 서열이다. 참고, 예를 들면, US 2011/0195454, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열 게놈에서 하기를 포함하는 인간 VL/CH x ULC 도메인 생성에 유용한 비-인간 동물을 포함한다: (i) 면역글로불린 하이브리드 쇄를 인코딩하는 하이브리드 면역글로불린 유전자좌, 상기 하이브리드 면역글로불린 유전자좌는 하나 이상의 중쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 분절 (VL 및 JL)을 포함하고, 각각의 이들은 적어도 기능적 CH1 도메인을 인코딩하고, 상기 VL 및 JL 유전자 분절은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 VL/JL 유전자 서열을 포함하는 하이브리드 서열을 형성하도록 재배열할 수 있다; (ii) 인간 보편적인 경쇄를 인코딩하고 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인간 보편적인 재배열된 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 유전자좌; 상기 비-인간 동물은 하이브리드 유전자좌로부터 유래된 인간 면역글로불린 하이브리드 쇄 및 경쇄 유전자좌로부터 유래된 동족 인간 보편적인 경쇄를 포함하는 항원-결합 단백질을 생산할 수 있고, 상기 인간 면역글로불린 하이브리드 쇄는 기능적 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 불변 IgD, IgG, IgE 또는 IgA 영역에 융합된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (hVL/CH x ULC) 도메인을 포함하고, 상기 인간 보편적인 경쇄는 경쇄 불변 도메인에 융합된 인간 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 참고, 예를 들면, PCT/US2016/023289, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 그것의 생식계열 게놈에서 하기를 포함하는 인간 VL/CH x ULC 도메인 생성에 유용한비-인간 동물이다: (i) 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 가변 VH 유전자 분절, 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 다양성 DH 유전자 분절 및 모든 기능적 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 연결 JH 유전자 분절의, 하나 이상의 중쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산에 작동가능하게 연결된 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 Vκ 유전자 분절 및 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 연결 Jκ 유전자 분절로의 대체를 포함하는 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 각각의 이들은 적어도 기능적 CH1 도메인을 인코딩하고, 상기 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 Vκ 유전자 분절 및 상기 복수의 미재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 Jκ 유전자 분절은 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열 에 작동가능하게 연결된 제1 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 Vκ/Jκ 뉴클레오타이드 서열을 형성하기 위해 B 세포 발생 동안 B 세포에서 재배열에 참가한다; 및 (ii) 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유래된 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 변형된 내인성 경쇄 유전자좌, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 내인성 비-인간 동물 면역글로불린 경쇄 불변 영역 k 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고; 상기 비-인간 동물은 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터 유래된 인간 면역글로불린 하이브리드 쇄 및 변형된 내인성 경쇄 유전자좌로부터 유래된 동족 인간 보편적인 경쇄를 포함하는 항원-결합 단백질을 생산할 수 있고, 상기 인간 면역글로불린 하이브리드 쇄는 기능적 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 불변 IgD, IgG, IgE 또는 IgA 영역에 융합된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (hVL/CH x ULC) 도메인을 포함하고, 상기 인간 보편적인 경쇄는 경쇄 불변 도메인에 융합된 인간 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는, 예를 들면, 내인성 비-인간 경쇄 유전자좌에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 그것의 생식계열 게놈에서 포함하는 비-인간 동물을 포함하고, 여기서 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 상기 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열은 보편적인 경쇄를 인코딩하고, 상기 비-인간 동물은 면역글로불린 하이브리드 쇄 및 보편적인 경쇄를 포함하는 항원-결합 단백질을 발현시키는 세포, 예를 들면, 림프구, 예를 들면, B 세포를 생산할 수 있거나 생산한다. 참고, 예를 들면, US 2013/0247234, US 2014/0329711, US 2014/0013456, US 2015/0119556, US 2015/0250151, US 9,334,334, 및 US 9,332,742, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 일부 비-인간 동물은 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열에 대하여 동형접합성이다. 그와 같은 일부 비-인간 동물은 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열에 대하여 이형접합성이다. 그와 같은 일부 비-인간 동물에서, 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 카파 서열이다. 그와 같은 일부 비-인간 동물에서, 경쇄 불변 영역 핵산 서열은 람다 서열이다. 그와 같은 일부 비-인간 동물에서, 제2 면역글로불린 유전자좌는 경쇄 카파 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 제2 면역글로불린 유전자좌는 경쇄 람다 유전자좌이다. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 인간 Vκ 및 Jκ 분절 서열을 포함하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함하는 비-인간 동물이고, 상기 Vκ 분절 서열은 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 분절로부터 유래되고, 상기 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 Vκ 분절 서열의 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 (IMGT 넘버링에 따른) 105, 106, 107, 108, 109, 111 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 위치에서 발현되는 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 게놈이 하기를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다: (a) 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 미재배열된 인간 VH, 적어도 하나의 미재배열된 인간 DH, 및 적어도 하나의 미재배열된 인간 JH 분절을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌; (b) 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 1 이하, 또는 2 이하, 재배열된 인간 경쇄 V/J 서열을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌; 및 (c) 기능적 비-인간 동물 ADAM6 단백질 또는 이의 기능적 오쏘로그 또는 기능적 동족체 또는 기능적 단편을 발현시키는 이소성 핵산 서열.참고, 예를 들면, US 2013/0198879, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 그것의 생식계열에서 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 적어도 하나의 미재배열된 인간 VH 유전자 분절, 적어도 하나의 미재배열된 인간 DH 유전자 분절, 및 적어도 하나의 미재배열된 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌, 상기 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된다; (b) 하기를 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌: (i) 단일 재배열된 인간 경쇄 V/J 서열, 상기 단일 재배열된 인간 경쇄 V/J 서열은 재배열된 인간 Vκ1-39/Jκ 서열 또는 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ 서열이다, 또는 (ii) 1 이하 인간 경쇄 V 유전자 분절 및 1 이하 인간 경쇄 J 유전자 분절, 상기 1 이하 인간 경쇄 V 유전자 분절은 Vκ1-39 또는 Vκ3-20이고, 상기 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌는 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (c) 숫컷 비-인간 동물에서 기능적인, 비-인간 동물 ADAM6 단백질 또는 이의 오쏘로그 또는 동족체 또는 기능적 단편을 발현시키는 이소성 핵산 서열.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 그것의 생식계열에서 하기를 포함하는 비-인간 동물을 포함한다: (a) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 결실 또는 불활성화, 상기 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 이의 조합이다; 및 (b) 어느 한쪽 또는 양쪽 (i) 적어도 하나의 미재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 유전자 분절 및 적어도 하나의 미재배열된 면역글로불린 경쇄 연결 (JL) 유전자 분절을 포함하는 핵산 서열, 상기 미재배열된 VL 및 JL 유전자 분절은 CH1 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL/JL) 뉴클레오타이드 서열을 형성하기 위해 재조합할 수 있다; 및/또는 (ii) VL 및 JL 유전자 분절 서열을 포함하는 단일 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 VL/JL 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌, 상기 단일 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 참고, 예를 들면, US 2015/0289489, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 하기를 포함하는 비-인간 동물이다: (a) 비-인간 동물 중쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 하기 어느 한쪽으로의 대체: (i) 하나 이상의 미재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 VH 유전자 분절, 하나 이상의 미재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절, 및 하나 이상의 미재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절, 상기 하나 이상의 인간 미재배열된 면역글로불린 중쇄 VH, DH, 및 JH 유전자 분절은 비-인간 동물 중쇄 불변 영역 유전자 서열 에 작동가능하게 연결된다; 또는 (ii) 하나 이상의 미재배열된 인간 경쇄 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 미재배열된 경쇄 JL 유전자 분절, 상기 하나 이상의 미재배열된 인간 경쇄 VL, 및 JL 유전자 분절은 비-인간 동물 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되고, 상기 비-인간 동물 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 전장 IgM 유전자 그리고 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 IgG 유전자에서 CH1 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다; 및 (b) 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 단일 재배열된 인간 가변 Vκ/Jκ 유전자 서열로의 대체, 및 상기 비-인간 동물은 동족 경쇄와 관련된 IgM 중쇄를 포함하는 B 세포 수용체를 발현시킨다.
사용될 수 있는 다른 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스)는 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결된 2 이하 인간 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함하는 비-인간 동물을 포함하고, 여기서 각각의 2 이하 인간 VL 유전자 분절은 상응하는 인간 생식계열 VL 유전자 분절에 의해 인코딩되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하고, 상기 인간 VL 유전자 분절 및 JL 유전자 분절은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열 및 인코딩할 수 있다. 참고, 예를 들면, US 2014/0013456, US 2015/0119556, US 2015/0250151, US 2013/0247234, 및 US 9,332,742, 이들의 각각은 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 그와 같은 비-인간 동물의 예는 2 이하 인간 VL 유전자 분절을 포함하는 비-인간 동물이고, 이들의 각각은 (하나의 또는 복수의 JL 분절로부터 선택된) 인간 JL 유전자 분절을 재배열시킬 수 있고 면역글로불린 경쇄의 인간 가변 도메인을 인코딩시킬 수 있고, 여기서 각각의 2 이하 VL 유전자 분절 및/또는 JL 유전자 분절은 적어도 하나의 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환을 포함한다. 참고, 예를 들면, US 2014/0013456. 그와 같은 비-인간 동물의 더욱 또 다른 예는 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결된 2 미재배열된 인간 Vκ 유전자 분절 및 하나 이상의 미재배열된 인간 Jκ 유전자 분절(들)을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함하는 비-인간 동물이고, 여기서 2 미재배열된 인간 Vκ 유전자 분절은 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 하나 이상의 치환을 각각 포함하는 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절이고, 상기 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 재배열할 수 있고 상기 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 (IMGT 넘버링에 따라) 105, 106, 107, 108, 109, 111, 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 히스티딘을 포함하는 인간 경쇄 가변 도메인을 인코딩하고, 상기 하나 이상의 히스티딘은 하나 이상의 치환으로부터 유래된다. 참고, 예를 들면, US 2015/0250151.
IV. 항원-결합 단백질의 생성 방법
본 명세서에서 개시된 방법에 의해 생성된 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물은 관심의 외래 표적 항원에 대한 항원-결합 단백질을 만드는데 사용될 수 있다. 항원-결합 단백질 (예를 들면, 항체)의 몇 개의 생산 기술은 기재되어 있다. 항원-결합 단백질은 면역화된 마우스의 B 세포로부터 직접적으로 단리될 수 있고 (참고, 예를 들면, US 2007/0280945, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨) 및/또는 면역화된 마우스의 B 세포는 하이브리도마를 만드는데 사용될 수 있다 (참고, 예를 들면, Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495-497, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨). 본 명세서에서 기재된 바와 같이 비-인간 동물로부터 항원-결합 단백질 (중쇄 및/또는 경쇄)를 인코딩하는 DNA는 종래의 기술을 사용하여 쉽게 단리 및 서열분석될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이 비-인간 동물로부터 유래된 하이브리도마 및/또는 B 세포는 그와 같은 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있고, 이는 그 다음 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 숙주 세포에 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 수득한다.
예를 들어, 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 생성된 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물은 표적 항원에 노출될 수 있고 관심의 외래 표적 항원에 면역 반응을 개시하는데 충분한 조건 하에서 유지될 수 있다. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및/또는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제2 핵산 서열은 그 다음 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 항원-결합 단백질은 그 다음 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 단리될 수 있다. 예로서, 관심의 외래 항원을 특이적으로 결합시키는 항체를 발현시키는 클론적으로 선택된 림프구는 확인될 수 있다.
일 예에서, 항원-결합 단백질은 관심의 외래 표적 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 면역화시킴으로써, 비-인간 동물에 면역 반응을 탑재함으로써, 면역화된 동물로부터 림프구 (예를 들면, B 세포)를 수확함으로써, 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성함으로써, 표적 항원을 특이적으로 결합시키는 VH 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 표적 항원을 특이적으로 결합시키는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 하이브리도마 세포로부터 수득함으로써, 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 단편 서열과 프레임내 (즉, 작동가능한 연결로) 핵산 서열을 클로닝시켜 면역글로불린 중쇄 및/또는 면역글로불린 경쇄를 창출함으로써, 그리고 항원-결합 단백질을 발현시킬 수 있는 세포 (예를 들면, CHO 세포)에서 중쇄 및 경쇄를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
또 다른 예에서, 항원-결합 단백질은 관심의 외래 표적 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 면역화시킴으로써, 비-인간 동물에 면역 반응을 탑재함으로써, 면역화된 동물로부터 림프구 (예를 들면, B 세포)를 수확함으로써, 표적 항원을 특이적으로 결합시키는 VH 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 표적 항원을 특이적으로 결합시키는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 림프구로부터 수득함으로써, 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 단편 서열과 프레임내 (즉, 작동가능한 연결로) 핵산 서열을 클로닝시켜 면역글로불린 중쇄 및/또는 면역글로불린 경쇄를 창출함으로써, 그리고 항원-결합 단백질을 발현시킬 수 있는 세포 (예를 들면, CHO 세포)에서 중쇄 및 경쇄를 발현시킴으로써 생성될 수 있다.
관심의 외래 항원으로 면역화는 단백질, DNA, DNA 및 단백질의 조합, 또는 관심의 외래 항원을 발현시키는 세포로 수행될 수 있다. 수득되는 림프구는, 예를 들어, 면역화된 동물로부터 비장, 림프절, 또는 골수를 포함하는, 임의의 공급원으로부터일 수 있다.
그와 같은 일부 방법에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 인간이고 (예를 들면, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물이 양쪽 IgH 및 Igκ에서 동형접합성 인간화되는 경우), VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 인간 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열로 프레임내 클로닝되고, 생산되는 항원-결합 단백질은 완전하게 인간 항체이다.
본 명세서에서 기재된 (즉, 제1 표적 게놈 유전자좌에서 유전적으로 변형된) 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에서 생산된 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 생산은 (즉, 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물과 비교된 경우 전형적으로 증가된다. 즉, 본 명세서에서 기재된 (즉, 제1 표적 게놈 유전자좌에서 유전적으로 변형된) 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에서 생산된 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질은 전형적으로 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 항원-결합 단백질보다 더 높은 역가를 갖는다. 예를 들어, 역가는 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 또는 10-배 더 높을 수 있다. 용어 항체 역가는 혈청에서 존재하는 특정 항체의 농도의 측정을 포함한다. 예를 들어, 항체 역가는, 양성 결과를 여전히 제공하는 가장 큰 희석의 역함수로서 표현된, 특정 에피토프를 인식하는 유기체가 생산하였던 얼마나 많은 항체의 측정일 수 있다. 마찬가지로, 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 더욱 다양한 레퍼토리는 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 수득된 항원-결합 단백질과 비교된 관심의 외래 항원으로 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 면역화 이후 전형적으로 수득된다. 대조군 비-인간 동물은 제1 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 비-인간 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물과 대조군 동물 사이 단지 실질적인 차이는 제1 표적 게놈 유전자좌의 상태이다. 예를 들어, 바람직하게는 대조군 동물은 다른 실질적인 유전적 변형이 없고 비-인간 동물의 동일한 종이고, 비-인간 동물의 동일한 균주이고, (제1 표적 게놈 유전자좌 이외의) 동일한 유전적 배경을 갖고, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물과 동일한 수명을 갖는다.
상기 및 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 공보, 수탁 번호 및 기타 동종은 각각의 개별 항목이 참고로 그렇게 편입되도록 특이적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 그 전문이 참고로 편입된다. 서열의 상이한 버전이 상이한 시간에서 수탁 번호와 관련되면, 본원의 유효 출원일에서 수탁 번호와 관련된 버전은 의미된다. 유효 출원일은 적용가능하면 수탁 번호를 참조하는 우선권 출원의 출원일 또는 실제 출원일의 더 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로, 공보, 웹사이트 또는 기타 동종의 상이한 버전이 상이한 시간에 공개되면, 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전은 달리 나타내지 않는 한 의미된다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 구현예, 또는 양태는 달리 특이적으로 나타내지 않는 한 임의의 다른 것과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명이 명료성 및 이해의 목적을 위하여 예시 및 예로서 일부 상세히 기재되어 있어도, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구항들의 범위 내에서 실시될 수 있다는 것이 분명할 것이다.
서열의 간단한 설명
첨부하는 서열 목록에서 열거된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대하여 표준 문자 약어, 그리고 아미노산에 대하여 3-문자 코드를 사용하여 보여진다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 말단에서 개시하고 3' 말단까지 정방향 (즉, 각각의 라인내 좌부터 우까지) 진행하는 표준 협약을 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열의 단 하나의 가닥은 보여지지만, 상보성 가닥은 표시된 가닥의 임의의 참조에 의해 포함되도록 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 개시하고 카복시 말단까지 정방향 (즉, 각각의 라인내 좌부터 우까지) 진행하는 표준 협약을 따른다.
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Figure pct00004
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실시예
실시예 1. 짝짓기된 가이드 RNAs 표적화 개시 및 정지 코돈을 사용하여 항체 생산을 위한 KO 배아 줄기 (ES) 세포, 1-세포기 배아, 및 마우스 생성.
VELOCIGENE® 및 VELOCIMOUSE® 기술은, 완전하게 인간 항체의 생산을 가능하게 하는, VELOCIMMUNE® 마우스의 생성을 허용하였다. VELOCIMMUNE® 마우스는 완전하게 인간화된 가변 영역이 마우스 불변 영역에 연결되는 면역글로불린 카파 (Igκ) 및 중 (IgH) 쇄를 발현시킨다. 단백질의 기능적으로 중요한 영역이 종을 거쳐 보존되는 경향이 있기 때문에, 자가-항원에 면역학적 내성은 이들 핵심 에피토프에 항체의 생성에 종종 도전한다. 종래에, VELOCIMMUNE® 마우스는 면역학적 내성을 극복하기 위해 관심의 자가-항원 표적에 이형접합성 녹아웃 돌연변이를 갖는 F0 마우스에 교배되었다. 면역화에 적합한 (관심의 상기 표적에 동형접합성 무효 및 양쪽 IgH 및 Igκ에 동형접합성 인간화된) 삼중 동형접합성 마우스를 생성하기 위해, 교배의 2 초과 세대, 및 15 내지 16 개월의 총 시간이 요구되었다. 이러한 공정을 가속화시키기 위해, VELOCIMMUNE® 배아 줄기 (ES) 세포는 유래되었고, 이는 관심의 상기 표적에 무효 대립유전자를 창출하기 위해 표적화될 수 있다. 불행하게도, 하지만, 순차적인 표적화 단계는, 시간-소모성인, 동형접합성 무효 VELOCIMMUNE® ES 세포 클론을 수득하도록 요구된다. 더욱 중요하게는, VELOCIMMUNE® ES 세포 클론 종래에 면역화 프로젝트용 KO에서 완전하게 ES-세포-유래된 F0 VELOCIMICE® (즉, 8-세포기 배아에 ES 세포의 주사로부터 수득된 완전하게 ES-세포-유래된 F0 세대 마우스)를 생산하기 위해 낮은 수용력을 나타내고 (참고, 예를 들면, 표 2), 뿐만 아니라 순차적으로 표적화된 VELOCIMMUNE® ES 세포 클론은 완전하게 ES-세포-유래된 F0 VELOCIMICE® (즉, 8-세포기 배아에 ES 세포의 주사로부터 수득된 완전하게 ES-세포-유래된 F0 세대 마우스)를 생산하기 위해 더욱 추가로 감소된 수용력을 나타낸다. 참고, 예를 들면, 표 3 (표적화된 유전적 변형 및 VELOCIMICE® 생성에 사용된 전형적인 ES 세포주 (F1H4 ES 세포주) 및 2 보편적인 경쇄 (ULC) ES 세포주 및 VELOCIMMUNE® ES 세포주 (VI-3Adam6)을 사용하여 VELOCIMOUSE® 생산 효율 비교).
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관심의 외래 인간 표적 항원에 감소된 내성을 가진 마우스를 생성하기 위해, 우리는, 단일 변형 단계에서 관심의 표적에 무효 대립유전자용 동형접합성인, 기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® ES 세포를 빠르게 생성하는 방법을 개발하였다. 우리는 기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자를 포함하는 VELOCIMMUNE® ES 세포에서 관심의 표적의 양쪽 대립유전자에서 큰 결실을 효율적으로 창출하기 위해 한 쌍의 가이드 RNAs를 이용하는 절차를 최적화시켰고, 그렇게 함으로써 큰 표적화 벡터 (LTVECs)를 설계 및 생산하기 위한 필요성을 방지하였다. 이러한 접근법을 사용하여, 관심의 상기 표적에 무효 대립유전자용 동형접합성이고 면역화를 위하여 준비된 F0 VELOCIMICE®은 15 내지 16 개월 대신에4 내지 5 개월 지나서 전달될 수 있다 관심의 상기 표적에 무효 대립유전자용 동형접합성 마우스 새끼는 ~ 3 개월 지나서 전달될 수 있지만 그 다음 면역화를 위하여 4-5 주 동안 노화된다). 이 실험에서, 짝짓기된 가이드 RNAs는 동형접합성 결실에 대하여 관심의 외래 표적 항원에 오쏘로그성 자가-항원을 표적화하도록 설계 및 클로닝되었다. 가이드 RNAs는 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자의 개시 및 정지 코돈 영역을 표적화하도록 설계되었다. 일부 표적에 대하여, gRNAs의 2 쌍은 설계되었다 (v1 및 v2). 가이드 RNA 설계 과정은 아래 물질 및 방법에서 기재된다. 가이드 RNAs는 기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자 (VI-3 Adam6) 마우스 (재삽입된 마우스 Adam6 유전자와 함께 상응하는 인간 DNA를 가진 대체된 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역) 또는 보편적인 경쇄 (ULC 1-39) 마우스 (인간 Vκ1-39/J 유전자 분절인 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 가진 마우스)를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 유래된 ES 세포에 Cas9와 함께 전기천공 또는 뉴클레오펙션되었다. 참고 도 32.전기천공 및 뉴클레오펙션용 프로토콜은 아래 물질 및 방법에서 기재된다. 일부 실험에서, Cas9 및 짝짓기된 가이드 RNAs는 결실용 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자를 표적하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)와 함께 전기천공되었다 (참고, 예를 들면, 도 4). 비교할만한 결실 효율성은 LTVECs 있거나 없이 CRISPR/Cas9 (CC9)를 사용하여 관측되었다 (참고 표 4).
Figure pct00008
실험의 시작 (gRNA 설계)부터 끝 (자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자용 동형접합성 무효 대립유전자를 가진 유전자형화된 F0 마우스)까지 연대표는 대략 3 개월이었다. 예로서, 표적 1 (자가-항원 1)에 상응하는 자가-항원용 동형접합성 무효 F0 마우스 생산용 연대표는 표 5에서 보여진다.
Figure pct00009
몇 개의 실험은, 단독으로 또는 결실용 자가-항원을 표적하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)와 함께, 각각의 자가-항원의 개시 및 정지 코돈 영역을 표적하는 짝짓기된 가이드 RNAs를 사용하여, VI-3-Adam6 및 ULC 1-39 마우스로부터 배아 줄기 (ES) 세포에서 결실용 다양한 자가-항원을 표적화하도록 수행되었다. Cas9 및 가이드 RNAs는 DNA의 형태로 ES 세포에 도입되었다. 표 6 및 도 28에서 나타낸 바와 같이, 결실 (즉, 붕괴)는, 0.1 kb 내지 165 kb 범위의 결실 크기로, 시험된 모든 자가-항원에 대하여 달성되었고, 결실 (즉, 붕괴)의 크기와 결실 (즉, 붕괴) 생산의 효율 사이 음성 상관관계가 있었다. 이중대립유전자 붕괴는 또한 훨씬 더 큰 크기에 대하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 우리는 ~400 kb의 결실 크기에 대하여 이중대립유전자 붕괴를 달성하였다. 마찬가지로, 마우스 IgH 유전자좌에서 ~ 900 kb - 1 Mb 이중대립유전자 붕괴는 2개의 5' gRNAs 및 2개의 3' gRNAs 그리고 ~1.2%의 효율을 가진 수복 벡터의 사용을 통해 달성되었다 (데이터 도시되지 않음).
Figure pct00010
ES 세포를 사용하는 절차에 유사하게, 관심의 외래 인간 표적 항원에 감소된 내성을 가진 마우스를 생성하기 위해, 우리는 단일 변형 단계에서 관심의 표적에 무효 대립유전자에 대하여 동형접합성인 1-세포기 배아를 빠르게 생성하기 위한 방법을 또한 개발하였다. 우리는 1-세포기 배아에서 관심의 표적의 양쪽 대립유전자에서 큰 결실을 효율적으로 창출하기 위해 한 쌍의 가이드 RNAs 사용을 위한 절차를 최적화시켰고, 그렇게 함으로써 큰 표적화 벡터 (LTVECs)를 설계 및 생산하기 위한 필요성을 방지하였다. 게다가, 1-세포기 배아의 사용은 ES 세포주 (예를 들면, ULC 1-39 ES 세포주) 사용에 비교된 표적화된 마우스의 생산 효율을 개선할 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 면역화에 대하여 준비되는 관심의 표적에서 무효 대립유전자에 대하여 동형접합성 F0 마우스는 15 내지 16 개월 대신에 4 내지 5 개월 지나서 전달될 수 있다 (관심의 표적에서 무효 대립유전자에 대하여 동형접합성 F0 마우스 새끼는 ~3 개월 지나서 전달될 수 있다). 이 실험에서, 짝짓기된 가이드 RNAs는 동형접합성 결실에 대하여 관심의 외래 표적 항원에 오쏘로그성 자가-항원을 표적화하도록 설계 및 클로닝되었다. 가이드 RNAs는 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자의 개시 및 정지 코돈 영역을 표적화하도록 설계되었다. 가이드 RNA 설계 과정은 아래 물질 및 방법에서 기재된다. 간단히, 과배란된 암컷은 스터드 숫컷과 교미되어 배아를 생성하였다. 단지 몇몇의 숫컷이 이용가능하였다면, 시험관내 수정은 사용되었다. 암컷 연령 범위는 3-16 주이었고, 공여체당 난모세포는 15-46 (중앙 = 32 난모세포) 범위이었고, 공여체당 접합자는 5-32 (중앙 = 15 접합자) 범위이었다. 가이드 RNAs는 기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자 (VI-3 Adam6) 마우스 (재삽입된 마우스 Adam6 유전자와 함께 상응하는 인간 DNA를 가진 대체된 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역) 또는 보편적인 경쇄 (ULC 1-39) 마우스 (인간 Vκ1-39/Jκ5 유전자 분절인 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 가진 마우스)를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 1-세포기 배아에 Cas9 mRNAs와 마이크로주사 (세포질 주사)되었다. 주사된 배아의 수는 99-784 (중앙 = 334) 범위이었고, 생존하였던 배아의 백분율은 56%-73% (중앙 = 63%) 범위이었고, 전달된 배아의 수는 59-442 (중앙 = 226) 범위이었고, 각각의 프로젝트에 대하여 새끼의 수는 10-46 (중앙 = 32) 범위이었고, 출생률은 2%-59% (중앙 = 13%) 범위이었다. 표 7 및 도 29에서 나타낸 바와 같이, 표적화된 결실 (즉, 붕괴)를 갖는 살아있는 새끼는, 0.1 kb 내지 94 kb 범위의 결실 크기를 가진, 시험된 모든 자가-항원에 대하여 생산되었고, 결실 (즉, 붕괴)의 크기와 결실 (즉, 붕괴)를 갖는 마우스 새끼 생산의 효율 사이 음성 상관관계가 있었다.
Figure pct00011
물질 및 방법
가이드 RNA 및 TAQMAN ® 검정 설계: 23 염기 쌍의 길이를 가진 가이드 RNAs (gRNA)는 하기에서 각각의 유전자좌에 대하여 공통 코딩 서열 (CCDS)에 기반하여 설계되었다: 포멧 5' NNNNNNNNNNNNNNNNnnNNNGG 3' (서열번호:2), 여기에서 N은 임의의 뉴클레오타이드이다. 마지막 3개의 뉴클레오타이드 (NGG)는 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)이고, Cas9 효소에 의한 이중-가닥 평활-말단 DNA 절단은 (상기 소문자 잔기 사이) NGG에 3개의 뉴클레오타이드 5'를 발생시킨다. gRNAs는, crispr.mit.edu, crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorer/, 및 broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design을 포함하는, 다양한 gRNA 검색 엔진으로부터 수득된 스코어에 기반하여 선택되었다. 간단히, 개시 ATG의 서열 직접적으로 5' 및 3'의 100-150 bp 및 정지 코돈의 직접적으로 5' 및 3' 100-150 bp, 각각은 양쪽 DNA 가닥에서 gRNAs에 대하여 분석되었다. 사용된 모든 검색 엔진으로부터 높은 스코어를 가진 정지 코돈 근처 2 gRNAs 및 ATG 근처 (25% 이하만큼 서로 중첩하는) 2 gRNAs는 마우스 게놈에서 특유성에 대하여 추가로 추궁되었고 기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자 (VI-3-Adam6), 및 VGB6 VELOCIGENE® 마우스 배아 줄기 세포 (ESC) 주를 포함하는 보편적인 경쇄 (ULC, 또는 공통 경쇄), VELOCIMMUNE® 마우스에서 단일 뉴클레오타이드 변이 (SNV)는 없었다. 높은 평점 가이드가 상기 검색 사양을 사용하여 발견되었다면, ATG 및 정지 코돈 주변 추가의 서열은 2개의 고 품질 가이드가 발견되었던 때까지 검색되었다.
TAQMAN® 검정은 프로브 서열이 항상 각각의 가이드에 대하여 cas9 커트 부위를 중첩하도록 APPLIED BIOSYSTEMS® Custom TAQMAN® MGB Probes를 가진 PRIMER EXPRESS®를 사용하여 설계되었다. 일부 TAQMAN® 검정은 Biosearch Technologies Dual Labeled BHQ® Probes (biosearchtech.com/ProbeITy/design/inputsequences.aspx)를 사용하여 또한 수득되었다. 이들 검정은 Cas9가 가이드에 의해 결합된 서열을 커트하면 대립유전자 손실 검정으로서 기능한다. 모든 검정은 SNVs에 대하여 스크리닝되었다. 가이드는 아래와 같이 명명되었다: mGU 및 mGU2 (마우스 게놈 업스트림용); 및 mGD 및 mGD2 (마우스 게놈 다운스트림용). TAQMAN® 검정은 아래와 같이 명명되었다: mTGU 및 mTGU2 (mGU 및 mGU2, 각각을 포괄하는 TAQMAN® 검정용), 및 mTGD 및 mTGD2 (mGD 및 mGD2, 각각을 포괄하는 TAQMAN® 검정용). 추가의 TAQMAN® 검정은, mTM (마우스 TAQMAN® 중간용)으로 불리는, 붕괴되는 유전자좌의 중간에서 가이드 mGU/mGU2 및 mGD/mGD2로부터 거의 등거리로 설계되었다. 이러한 대립유전자 손실 검정은 가이드에 의해 측접된 영역의 결실 (붕괴)가 발생하는지 여부를 결정한다.
추가 TAQMAN® 검정은 (어느 쪽이든 주로 5'인) mGU/mGU2의 200-800 bp 업스트림 및 (어느 쪽이든 주로 3'인) mGD/mGD2의 다운스트림 설계되었다. 이들 검정은 retU (업스트림 유지용) 및 retD (다운스트림 유지용), 각각으로 불리웠다. 이들 검정은 최대 허용가능한 결실 크기를 기술하고 상기와 같이 SNVs에 대하여 스크리닝되었다.
가이드 RNA 클로닝: 가이드 RNA 듀플렉스는 설계 및 합성되었다. U6 프로모터가 구아닌으로 개시하는 것을 선호하기 때문에, 구아닌은 서열이 구아닌으로 이미 개시하지 않았다면 5'에 부가되었다. 동결건조된 gRNA 듀플렉스는 멸균수로 100 μM까지 재현탁되었고, 하기 결찰 반응은 0.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에서 설정되었다: 14.5 μL PCR 보증된 물; 2 μL 10X T4 DNA 리가제 완충액 (NEB), 1 μL pMB_sgRNA_BsmBI 벡터 (~60 ng), 1 μL gRNA 듀플렉스 (100 μM), 및 1.5 μL T4 DNA 리가제 (40 U/μL; NEB). 결찰 반응은 그 다음 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션되었고 TOP10 세포에서 전환 반응에 후속적으로 사용되었다. 콜로니는 그 다음 구해졌고 PCR 및 서열분석을 통해 체크되었다.
BTX ® 전기천공 프로토콜: 가이드 혼합물은 아래와 같이 제조되었다: 10 μg의 각각의 sgRNA 플라스미드, 및 5 μg의 Cas9 야생형 플라스미드. 전기천공 일에, 세포는 전기천공 공정 전 30 분 내지 1 시간 ES 배지로 공급되었다. 세포는 그 다음 PBS로 2회 세정되었고, 0.25% 트립신-EDTA가 첨가되었고 세포는 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션되었다. 플레이트(들)은 인큐베이션 이후 탭핑되었고, ES 배지는 첨가되어 트립신을 중화시켰고, 세포는 4회 부드럽게 피펫팅되어 세포 덩어리를 파괴시키고 젤라틴화된 플레이트(들)로 이동시켰고, 세포는 20 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션되었다. 플레이트(들)은 진탕되었고 배지로 1회 부드럽게 세정되었고, 모든 세포는 그 다음 15-mL 튜브로 전달되었고, 그 다음 5 분 동안 1200 rpm으로 회전되었다. 펠릿의 모두가 10 mL의 PBS에서 조합되었고, 세포는 카운트되었고 필요하면 희석되었다. 20 μl의 세포 현탁액의 용적은 CELLOMETER® 슬라이드에 첨가되었고 Nexcelom CELLOMETER AUTO T4™ 세포 생존력 계수기를 사용하여 카운트되었다. 튜브는 그 다음 5 분 동안 1200 rpm에서 원심분리되었다. 펠릿은, 각각의 전기천공용 7.5x106 세포를 사용하여, 전기천공 완충액에 재-현탁되었다. 세포는, 120 μl의 각각의 튜브내 용적으로, 마이크로 원심분리기 튜브에서 가이드 혼합물에 첨가되었다. 튜브는 2-3회 혼합되었고 와이드 오리피스 팁을 사용하여 96-웰 전기천공 큐벳 (2 mm 갭)에 전달되었고, 큐벳은 밀봉되었다. 전기 펄스는 BTX® ECM® 630 전기천공기를 사용하여 700V, 400Ω, 25uF에서 전달되었다. 큐벳은 그 다음 얼음에서 10 분 동안 인큐베이션되었다. 전기천공된 세포는 그 다음 딥웰 플레이트에 전달되었다 (큐벳이 얼음에 있는 동안 0.8 mL/웰 첨가). 세포는 각각의 플레이트에서 2x15 cm 젤라틴화된 플레이트/25 mL 배지를 가진 프로젝트에 플레이팅되었다. 일시적 선택은 1 μg/mL 퓨로마이신으로 3 일 동안 개시되었고, 배지는 10 일 전기천공후까지 비-선택 배지로 변화되었고, 이 시점에서 콜로니는 구해졌다.
NUCLEOFECTOR ® 전기천공 프로토콜:전기천공 일에, 세포는 전기천공 공정 전 30 분 내지 1 시간 ES 배지로 공급되었다. 세포는 그 다음 10 mL PBS로 2회 세정되었고, 2 mL의 0.25% 트립신-EDTA는 첨가되었고 세포는 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션되었다. 플레이트(들)은 인큐베이션 이후 탭핑되었고, 8 mL의 ES 배지는 첨가되어 트립신을 중화시켰고, 세포는 4회 부드럽게 피펫팅되어 세포 덩어리를 파괴시켰고 젤라틴화된 플레이트(들)로 이동시켰고, 세포는 20 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션되었다. 플레이트(들)은 진탕되었고 배지로 1회 부드럽게 세정되었고, 모든 세포는 그 다음 15-mL 튜브에 전달되었고, 그 다음 3 분 동안 90 X g로 회전되었다. 펠릿은 10 mL의 PBS에 재-현탁되었고, 세포는 카운트되었고 필요하면 희석되었다. 20 μl의 세포 현탁액의 용적은 CELLOMETER® 슬라이드에 첨가되었고 Nexcelom Vision CBA System을 사용하여 카운트되었다. 총 2 x 106 세포는 분취되었고 EPPENDORF® 튜브에서 3 분 동안 90 X g로 원심분리되었다. 펠릿은 그 다음 100 μL의 총 용적에서 5 μg Cas9 야생형 플라스미드 및 2.5 μg의 각각의 sgRNA 플라스미드와 혼합된 LONZA® P4 완충액에 재-현탁되었다. 세포는 그 다음 큰 LONZA® 큐벳에 전달되었다. 전기 펄스는 LONZA® 4D-NUCLEOFECTOR™ 및 프로그램 CP-105를 사용하여 전달되었다. 400 μL의 신선한 ES 배지의 용적은 첨가되었고, 세포는 신규한 EPPENDORF® 튜브에 전달되어 혼합하였다. 세포는 그 다음 10 mL의 ES 배지가 있는 2 x 10cm 젤라틴화된 플레이트상에 플레이팅되었다. 일시적 선택은 2 일 동안 퓨로마이신 (1.5 μg/mL)로 2 일 EP후 개시되었다. 선택 후, 비-선택 배지는 10 일 전기천공후까지 사용되었고, 이 시점에서 콜로니는 구해졌다.
스크리닝: 가이드 mGU, mGU2, mGD, 및 mGD2를 가진 Cas9에 의한 커팅은 TAQMAN® 검정 mTGU, mTGU2, mTGD, 및 mTGD2를 사용하여 평가되었다. 다른 것이 아닌 하나의 대립유전자에서 커팅은 카피 수가 2 (친계, 비변형된 대조군 DNA)부터 1까지 감소하였던 경우 결정되었다. Cas9에 의한 동형접합성 절단은 검정이 제로의 카피 수를 산출하였던 경우 결정되었다. ATG 및 정지 코돈 근처 Cas9 커팅이 개입 서열의 제거를 보증하지 않음에 따라, 이형접합성 및 동형접합성 붕괴는 mTM 검정 수가 2 (친계)부터 1 또는 제로, 각각으로 되었던 경우 평가되었다. 마지막으로, 결실 크기에서 외부 한계는 retU 및 retD 검정을 사용하여 설정되었다. 유지 검정은, 친계처럼, 카피 수 2로 온전한 (유지된) 채 남아있는 것이었다.
mGU, mGU2, mGD, 및 mGD2, 또는 이의 일부 조합으로 전기천공 후 수득된 ESC 클론은 검정 mTGU, mTGU2, mTM, mTGD, 및 mTGD2, 또는 이의 일부 조합을 사용하여 Cas9 절단 및/또는 붕괴에 대하여 먼저 스크리닝되었다. 모든 검정에 대하여 제로 카피 수를 가진 콜로니는 그 다음 retU 및 retD를 사용하여 추가로 스크리닝되었고, 2의 retU 및 retD 카피 수를 가진 콜로니만이 추가 분석에 통과되었다.
마우스 배아 줄기 세포의 1차 및 재확인 스크리닝: 변형된 mESC 콜로니는 TAQMAN® LOA (대립유전자 손실) 다중 (4-플렉스) qPCT을 통해 표적 유전자좌의 동형접합성 결실에 대하여 스크리닝되었다. 스크리닝의 제1 통과 (1차)에 대하여, 176 특유의 클론의 DNA는 2개의 96-웰 플레이트의 칼럼 1-11에서 단리되었다. 칼럼 12는 동일한 mESC 친계 균주로부터 이전에 단리되었던 야생형 ES 세포 DNA로 채워졌고 카피 수에 대하여 캘리브레이터로서 사용되었고; 이로써 스크리닝되는 각각의 DNA 플레이트는 88 변형된 클론 및 8 캘리브레이터 클론을 함유한다. 각각의 클론의 DNA는 384-웰 플레이트에 4배로 분배되었고, DNA 농도에 대하여 측정하기 위해 증폭 Wnt-2b로, 상기 표적 유전자의 업스트림, 중간, 및 다운스트림 영역에 비해 카피 수를 동시에 결정하는데 사용된 FAM, VIC, ABY 및 Quasar에서 TAQMAN® 프로브로, 단일 반응 믹스에서 상기 표적 유전자좌의 3 영역을 거쳐 동형접합성 LOA에 대하여 분석되었다. 카피 수가 결정된 후, 상기 표적 유전자좌에 미치는 모두 3 검정의 제로 카피를 가진 최대 8의 "최상의" 품질 클론은 후속적인 성장 팽창, 재-플레이팅을 위하여 선택되었고, 카피 수 검정 (재확인)의 팽창된 레퍼토리를 거치게 되었다. 각각의 팽창된 클론은 플레이팅되었고, 96-웰 플레이트의 1 행 (A-H)의 첫번째 6 칼럼을 차지하는, 6개의 복제물로 DNA 단리되었고, 그렇게 함으로써 사용된 추가의 검정에 추가의 유전적 물질 및 데이터 복제물을 제공하였다. 1차 스크리닝에서 사용된 검정은 1차 유전자형을 확인하기 위해 반복되었고, 유지 검정은 결실의 정도를 결정하는데 사용되었다. 유지 검정은 결실을 위하여 표적화된 영역의 바로 업스트림 및 다운스트림 배치되었고, 전형적으로 2 카피와 같았다. 추가의 검정은 마우스 면역글로불린 중 (IgH) 및 카파 (Igκ) 유전자좌 (IgH 및 Igκ 마우스에 대하여 LOA, 및 인간화에 대하여 GOA)에서 친계 ESC 유전자형을 확인하는데 사용되었다.
Cas9-매개된 대립유전자를 확인하기 위한 차세대 서열분석 (NGS): Cas9-변형된 F0 마우스로부터 작은 꼬리 생검은 표준 염 침전 방법을 사용하여 게놈 DNA에 대하여 추출되었다. 각각의 표적 유전자좌에 대하여, PCR 프라이머는 하기 고려사항들로 설계되었다: (1) 앰플리콘 크기는 길이 280-380 bp임; (2) gRNA 절단 부위는 더 큰 삽입/결실 (인델)을 수용하기 위해 프라이머 적어도 35 bp 떨어져 있는 PCR 생성물 이내 중심에 있음, (3) 프라이머의 길이는, 3' 말단에서 2 bp CG 클램프를 가진, 62-65 ℃ 사이의 용융 온도 (Tm)이 있는 22-25 bp임; 그리고 (4) 프라이머는 BALB/c, C57BL/6, 또는 129 균주 단일-뉴클레오타이드 변이용 게놈 서열에 대해 체크됨. ILLUMINA®에 의해 제공된 특정 보편적인 어댑터 서열은 그 다음 유전자좌-특이적 서열에 첨가되었다. 수득한 앰플리콘은 아가로스 겔에서 시각화되었고 Thermo Fisher Scientific® SEQUALPREP™ 정규화 플레이트 키트를 사용하여 정제/정규화되었다. 생성물은 QUBIT®을 통해 정량화되었고 1 ng의 각각의 생성물은 NEXTERA® 프라이머를 가진 추가의 PCR 및 NEXTERA® PCR 마스터 믹스를 통해 바코딩용 템플레이트로서 사용되었다. PCR은 써모사이클러에서 3 분 동안 72 ℃, 30 초 동안 95 ℃, {10 초 동안 95 ℃, 30 초 동안 55 ℃, 30 초 동안 72 ℃}의 12 사이클, 5 분 동안 72 ℃에서, 및 10 ℃ 유지로 수행되었다. 수득한 바코딩된 PCR 생성물은 AMPURE® XP 비드를 통해 정제되었고, NEXTERA® XT 키트에서 ILLUMINA® 정규화 비드를 사용하여 정규화되었고, 풀링되었고, 서열분석 및 미가공 데이터 수집을 위하여 MISEQ™에 장입되었다.
8-세포기 마우스 배아의 미세주입: 대략 2 mL의 표준 ES 세포 배지 (- LIF)는 뚜껑있는 멸균된 35 mm 배양 접시에 첨가되었고 여과된 광유로 피복되었다. ES 세포는 마우스 피펫을 사용하여 접시의 하부 절반에 플레이팅되었다. 동결보존된 8-세포기 SW 숙주 배아는 접시의 최상부를 향해 침착되었다. 주사 동안 배아 손상 최소화를 돕기 위해, 신규한 주사 피펫의 끝은 유지 피펫을 부드럽게 타격함으로써 둔탁해졌다. ES 세포는 형태 및 휘도에 기반하여 선택되었고 주사 피펫에 모집되었다. 배아는 할구 사이 공간이 3시 위치에서 존재하도록 유지 피펫에서 배치되었다. ES 세포는 3시 위치에서 구역을 통해 주의하여 펀칭 및 그 지점에서 세포 침착에 의해 배아의 난황주위 공간에 도입되었다. 총 7-9 ES 세포는 배아마다 도입되었다. 주사된 배아는 여과된 광유로 피복된 한 방울의 KSOM 배아 배양 배지를 함유하는 35 mm 접시에 배치되었고, 배아는 7.5% CO2로 37.0˚C에서 밤새 배양되었다. 배아는 다음날 아침 상상임신한 암컷에 수술로 전달되었다.
실시예 2.개시 코돈의 다중 가이드 RNAs 표적화 영역을 사용하는 항체 생산용 KO ES 세포 및 마우스 생성.
관심의 외래 표적 항원에 감소된 내성을 가진 마우스를 생성하기 위한 또 다른 실험에서, 3 가이드 RNAs는 동형접합성 결실용 외래 표적 항원에 오쏘로그성 자가-항원을 표적화하도록 설계 및 클로닝되었다. 3 중첩 가이드 RNAs는 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자의 개시 코돈을 포괄하는 중첩 영역을 표적화하도록 설계되었다 (참고 도 5). 가이드 RNAs는 하기로부터 유래된 ES 세포에 Cas9와 함께 전기천공 또는 뉴클레오펙션되었다: 보편적인 경쇄 (ULC 1-39) 마우스 (그것의 생식계열에서 하기를 포함하는 마우스: (i) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: 단일 인간 생식계열 Vκ 서열; 및 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (ii) 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입). 일부 실험에서, Cas9 및 3 가이드 RNAs는 결실용 자가-항원을 인코딩하는 내인성 유전자를 표적하는 큰 표적화 벡터 (LTVEC)와 함께 전기천공되었다 (참고, 예를 들면, 도 5). CRISPR/Cas9 (CC9)와 조합으로 LTVEC의 사용은 표적 유전자좌에서 이중대립유전자 돌연변이를 얻을 기회를 상당히 증가시켰지만 (참고 표 8), LTVEC 및 CRISPR/Cas9로 표적화는 거짓 양성을 배제시키기 위해 훨씬 더 스크리닝을 요구한다.
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실시예 3.마우스의 면역화 및 면역원에 혈청 항체 반응의 분석.
면역화
하기를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스: 기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자 (VI-3), 보편적인 경쇄 (ULC 1-39) 마우스 (그것의 생식계열에서 하기를 포함하는 마우스: (i) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입: 단일 인간 생식계열 Vκ 서열; 및 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고 (ii) 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입), KO (녹아웃)/VI-3 마우스 (외래 표적 항원에 오쏘로그성 자가-항원이 녹아웃되는 VI-3 마우스), 및 KO/ULC 1-39 마우스 (외래 표적 항원에 오쏘로그성 자가-항원이 녹아웃되는 ULC 1-39 마우스)는 여러 가지의 면역원 예컨대 단백질을 사용하여 수많은 막관통 표적으로 면역화되었다. 사전-면역 혈청은 면역화의 개시에 앞서 마우스로부터 수집되었다. 마우스는 표준 아쥬반트를 사용하여 총 3-6 부스트 동안 다양한 시간 간격으로 상이한 경로를 통해 부스팅되었다. 마우스는 주기적으로 채혈되었고 항-혈청 역가는 각각의 항원에서 분석되었다. 표적 8의 예에서, 마우스는 족척 경로를 통해 마우스 Fc 태그와 표적 8의 재조합 세포외 도메인으로 면역화되었다. 역가는 (ULC 1-39에 대하여 프라임 + 6 부스트 이후) 2번째 채혈 또는 (자가-항원-8-KO/ULC 1-39에 대하여 프라임 + 3 부스트 이후) 3번째 채혈로부터이었다.
항-혈청 역가 결정
각각의 면역원에 대한 혈청내 항체 역가는 ELISA를 사용하여 결정되었다. 96-웰 미세적정 플레이트 (THERMO SCIENTIFIC®)은 2 μg/mL에서 밤새 포스페이트-완충 식염수 (PBS, IRVINE SCIENTIFIC®)내 각각의 표적 항원으로 코팅되었다. 플레이트는 0.05% Tween 20 (PBS-T, SIGMA-ALDRICH®)을 함유하는 포스페이트-완충 식염수로 세정되었고 실온에서 1 시간 동안 PBS내 250 μl의 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA, SIGMA-ALDRICH®) 로 차단되었다. 플레이트는 PBS-T로 세정되었다. 사전-면역 및 면역 항-혈청은 0.5% BSA-PBS에서 3-배 연속으로 희석되었고 실온에서 1 시간 동안 플레이트에 첨가되었다. 플레이트는 세정되었고 염소 항-마우스 IgG-Fc-호스 래디시 페록시다아제 (HRP) 접합된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch)는 플레이트에 첨가되었고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 세정되었고 20 분 동안 인큐베이팅에 의해 기질로서 TMB/H2O2를 사용하여 현상되었다. 반응은 산으로 중단되었고 플레이트는 450 nm에서 분광측정기 (Victor®, PerkinElmer®)로 판독되었다. 항체 역가는 GRAPHPAD PRISM® 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 표적 8의 예에서, 사용된 역가 항원은 Myc-Myc-His 태그를 가진 인간 표적 8의 재조합 세포외 도메인이었다.
결과
VI-3, ULC1-39, KO/VI-3 및 KO/ULC 1-39 마우스에서 체액성 면역 반응은 상이한 막관통 표적 면역화에 의해 조사되었다. 고 항체 역가는 면역화된 모든 표적에 대하여 KO/VI-3 및 KO/ULC 1-39 균주에서 유발되었다. 역가는 또한 마우스의 VI-3 및 ULC 1-39 균주에서 높았다. 일반적으로, 하지만, KO 균주는 더 큰 역가 반응을 갖는 것처럼 보였다. 유발된 면역 반응은, 항원 결합 흡광도가 배경보다 2-배 더 높은 최고 혈청 희석의 역수로서 정의된, 항체 역가로서 표 9 에서 표시된다. 따라서, 수가 더 높을수록, 면역원에 체액성 면역 반응은 더 크다. 전체로, 16 초과 표적은 KO 균주에서 성공적으로 면역화되어 왔다. 단클론성 항체은 표적 1 및 9에 BST 및 하이브리도마 플랫폼에 의해 그리고 표적 4 및 5에 BST에 의해 단리되어 왔고, 이들 항체의 추가 특성규명은 진행 중이다. ULC 1-39 및 자가-항원-8-KO/ULC 1-39 마우스에서 관심의 1 인간 표적 항원 (표적 8; 마우스 자가-항원 8에 오쏘로그성, 상기)에 대한 항체 생산용 데이터는 표 9에서 그리고 도 6에서 제공된다. F0 KO 마우스는, 표적에 중앙 항체 역가에 의해 나타낸 바와 같이, 야생형 ULC 1-39 마우스보다 단백질 공격에 대략 5-배 더 높은 반응을 유발시켰다. (배경 흡광도보다 2배 흡광도에서) 특이적으로 항원에 결합하는 항체의 수는 표 9에서 또한 제공된다. 유사한 결과는 VI-3 마우스에 비교된 자가-항원-9-KO/VI-3 마우스에서 보여진다. 참고 도 30A 및 30B.이 실험에서, 야생형 VI-3-Adam6 마우스 및 자가-항원-9-KO/VI-3-Adam6 마우스는 진피내 경로로 야생형 표적 9를 인코딩하는 어느 한쪽 DNA로 면역화되었다. 역가는 표적 9 또는 친계 VI-3T3 세포를 발현시키도록 조작된 세포를 사용하여 결정되었다. 반면에 VI-3-Adam6 마우스로부터 항체 역가는 대조군과 다름 없었고, 항체 역가는 자가-항원-9-KO/VI-3-Adam6 마우스에서 크게 증가되었다. 이것은 양쪽 KO/VI-3 및 KO/ULC 균주가 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 보여준다.
Figure pct00013
실시예 4. 마우스의 면역화 V 유전자 분절의 항체 다양성 및 용법의 분석.
기능적 이소성 마우스 Adam6 유전자 (VI-3) 및 자가-항원-3-KO (녹아웃)/VI-3 마우스를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스는 표적 3으로 면역화되었다. 사전-면역 혈청은 면역화의 개시에 앞서 마우스로부터 수집되었다. 마우스는 표준 아쥬반트를 사용하여 총 3-6 부스트 동안 다양한 시간 간격으로 상이한 경로를 통해 부스팅되었다. 마우스는 주기적으로 채혈되었고 항-혈청 역가는 각각의 항원에서 분석되었다.
B 세포는 야생형 VI-3 및 자가-항원-3-KO VI-3 마우스의 비장으로부터 단리되었고, 항체는 V 유전자 용법을 결정하기 위해 서열분석되었다. VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 DNA는 단일 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 단리되었고 서열분석되었다. 참고, 예를 들면, US 7,582,298, 모든 목적을 위하여 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨. 야생형 VI-3 마우스용 V 유전자 용법 데이터는 표 10에서 나타나고, 자가-항원-3-KO VI-3 마우스용 V 유전자 용법 데이터는 표 11에서 나타난다. 표 10 및 11에서 나타낸 바와 같이, 양쪽 중쇄 V 유전자 분절 및 경쇄 V 유전자 분절의 용법에서 더 큰 다양성은 야생형 VI-3 마우스에 비교된 자가-항원-3-KO VI-3 마우스에서 관측되었다. 예를 들어, 단지 4 중쇄 V 유전자 분절 및 6 경쇄 V 유전자 분절은 야생형 VI-3 마우스에서 항체로 사용되었고, 항체의 79%는 IgH V4-59 및 Igκ V1-12 V 유전자 분절을 사용하였다. 그에 반해서, 6 중쇄 V 유전자 분절 및 10 경쇄 V 유전자 분절은 자가-항원-3-KO VI-3 마우스에서 항체로 사용되어ㅆ고, 가장 보편적인 용법 조합 (IgH V3-23 및 Igκ V4-1)은 항체의 단지 42%를 차지하였다.
표 10.야생형 VI-3 마우스에서 표적 3에 대한 항체에 대하여 V 유전자 용법.
Figure pct00014
표 11.자가-항원-3-KO VI-3 마우스에서 표적 3에 대한 항체에 대하여 V 유전자 용법.
Figure pct00015
게다가, 마우스 자가-항원 3에 교차-반응성을 가진 항체 (즉, 양쪽 인간 표적 3 및 마우스 자가-항원 3에 결합하는 항체)는 자가-항원-3-KO VI-3 마우스에서 생산되었다 (참고, 예를 들면, 표 12). 유사한 결과는 양쪽 VI-3 및 ULC 1-39 마우스에서 자가-항원 4 및 인간 표적 4로 보여졌다. 참고 도 31A 및 31B.이 실험에서, 자가-항원-4-KO/VI-3-Adam6 및 자가-항원-4-KO/ULC 1-39 마우스는 족척 경로를 사용하여 His-태깅된 인간 표적 4 단백질 및/또는 His-태깅된 마우스 자가-항원 4 단백질 (His-태깅된)로 면역화되었다. 역가는 코팅 항원으로서 His-태깅된 인간 표적 4, His-태깅된 마우스 자가-항원 4, 또는 His-태깅된 Fel d 1 (대조군)을 사용하여 결정되었다.
마우스 자가-항원 3과 표적 3 사이 공유되는 (또는 마우스 자가-항원 4와 인간 표적 4 사이 공유되는) 에피토프에 대한 항체를 생성하는 능력은 항체의 풀을 팽창시키기 때문에 유리하다: 마우스 자가-항원 3에 교차-반응성을 가진 무 항체는 야생형 VI-3 마우스에서 생성되었다. 게다가, 교차-반응 항체의 약동학적 특성은 야생형 마우스에서 내인성 자가-항원과 그것의 교차-반응성 때문에 생체내 더욱 쉽게 시험될 수 있다. 결과적으로, 그와 같은 교차-반응 항체의 표적 항원 (예를 들면, 인간 표적 항원)을 발현시키도록 유전적으로 조작된 마우스는 생성될 필요가 없을 수 있다.
Figure pct00016
실시예 5.1 가이드 RNA 또는 2 가이드 RNAs를 사용하는 CRISPR/Cas9-매개된 표적화.
물질 및 방법
ES 세포 배양, 스크리닝, 및 전기천공
본 명세서에서 기재된 실험은 하기로 수행되었다: VGF1, 우리의 C57BL6NTac/129S6SvEvF1 하이브리드 XY ES 세포주 (Poueymirou 등 (2007) Nat. Biotechnol. 25:91-99; Valenzuela 등 (2003) Nat. Biotechnol. 21:652-659). ES 세포는 이전에 기재된 바와 같이 배양되었다 (Matise 등 (2000) in Joyner, A.L. ed. Gene Targeting: a practical approach, pp. 100-132, Oxford University Press, New York). VGF1 세포는 C57BL6(XB6)/129S6(Y129) 마우스를 생산하기 위해 숫컷 129S6/SvEvTac 마우스와 암컷 C57BL/6NTac 마우서 교배에 의해 창출되었다. 참고 도 7.
전기천공 (EPs)는 0.12 ml의 최종 용적으로 2 mm 갭 큐벳에서 7.5 백만 세포로 수행되었다. EP용 전기 조건은 BTX ECM 630 전기천공 시스템 (Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 사용하여 700V, 400 오옴 저항, 및 25 microF 커패시턴스이었다. EP당 LTVEC의 양은 0.0015 mg이었고, Cas9 발현 플라스미드는 0.005 mg이었고 sgRNA 발현 플라스미드는 0.010 mg이었다. 일부 EPs는 LTVECs에 의해 발현된 네오마이신 저항을 위하여 선택 없이 클론의 선택을 허용하기 위해 퓨로마이신 저항을 부여하는 100 ng의 플라스미드의 첨가로 수행되었다. EP 이후, 세포는 2개의 15 cm 젤라틴화된 접시에서 플레이팅되었고 배지는 매일 변화되었다. 어느 한쪽 100 ug/ml G-418 설페이트 또는 0.0015 mg/ml 퓨로마이신을 함유하는 배지 선택은 EP 48 시간 후 개시하였고 EP후 10 일까지 계속되었다. 콜로니는 PBS에서 구해졌고 0.05% 트립신을 함유하는 96-웰 접시에 첨가되었고 15 분 동안 해리하게 되었고, 배지로 중화되었고 스크리닝용 DNA의 단리에 사용되었다.
대립유전자 변형 방법 (Frendewey 등 (2010) Methods Enzymol. 476:295-307)은 정확하게 표적화된 ES 세포 클론을 확인하는데 그리고 마우스 대립유전자 유전자형을 결정하는데 사용되었다.
가이드 서열의 설계
양쪽 업스트림 및 다운스트림, Lrp5 또는 다른 표적화된 유전자의 결실된 부분 내부 50 bp, 100 bp, 500 bp, 또는 1 kb 위치를 둘러싸는 DNA의 대략 200 bp는 가능한 gRNA 서열을 회수하기 위해 CRISPR 설계 도구 (crispr.mit.edu)에 입력되었다. 잠재적인 gRNA 서열은 그 다음 이들이 LTVEC에서 인간화 삽입물이 아니고 내인성 DNA의 커팅을 허용할 뿐인 것을 확보하기 위해 여과되었다.
단일 가이드 RNA 클로닝
sgRNAs는 매끄거운 RNA 발현을 위하여 77 bp 스캐폴드에 융합된 BsmbI 부위에서 pMB_sgRNA (U6 프로모터)에 듀플렉스 올리고 (IDT)로서 클로닝되었거나, 또는 GeneCopoeia로부터 입증된 발현 플라스미드 (LRP5 가이드 A, B, B2, E2, E, 및 F)로서 구매되었다. 인하우스-생산된 플라스미드는 PCR 및 생거 서열분석에 의해 확인되었다.
유전자형 확인용 DNA 템플레이트
DNA는 ES 세포로부터 정제되었고, 클론은 표적화 벡터 그리고 Cas9를 발현시키는 플라스미드 및 몇 개의 가이드 RNAs (gRNAs) 중 하나를 발현시키는 플라스미드 또는 상이한 gRNA 조합을 발현시키는 2 플라스미드로 전기천공된 ES 세포로부터 유래하였다. 마우스 표적 유전자좌의 표적화된 결실 및 표적화 벡터의 삽입을 갖는 것 또는 Cas9/gRNA-유도된 결실을 갖는 것으로서 대립유전자 변형 (즉, 대립유전자 손실 또는 대립유전자 이득) 정량적 PCR 검정에 의해 확인된 클론은 후속조치 종래의 PCR 검정을 위하여 선택되었다.
올리고뉴클레오타이드 설계
2 PCR 검정은 gRNAs의 각각의 조합을 위하여 설계되었다. 제1 PCR은 상이한 gRNA 조합의 가이드 RNA 인식 서열 사이 붕괴를 검출하기 위한 결실 검정이었다. 5' 검정인, 제2 PCR 검정은 2 PCR 검정을 포함하였다. 첫번째는 인간화된 대립유전자용 5' 인간 검정이었고 마우스-인간 접합을 거쳐 설계되었다. 두번째는 내인성 마우스 대립유전자용 5' 마우스 검정이었고 5' 표적화된 결실 접합을 거쳐 설계되었다.
PCR 반응 및 TOPO 클로닝
TaKaRa LA Taq DNA 폴리머라제 (Cat. # RR002M)은 ES 세포 DNA 템플레이트를 증폭시키는데 사용되었다. 각각의 PCR 검정 반응 믹스는 물 음성 대조군으로 실행되었다. 검정 혼합물은 하기를 함유하였다: 0.005 mL ES 세포 DNA 템플레이트; 1X LA PCR 완충액 II (Mg2+플러스); 0.01 mM dNTP 혼합물; 0.0075 mM 정방향 올리고 (각각); 0.0075 mM 역방향 올리고 (각각); 5000 단위/mL LA Taq 폴리머라제; 및 0.025 mL로 ddH2O.
PCR Thermocycle 프로그램은 1 분 동안 94°C; 이어서 30 초 동안 94°C, 30 초 동안 60 ℃ 어닐링 구배, 및 증폭된 kb당 1 분 동안 68°C의 35 사이클; 이어서 10 분 동안 72 ℃에서 중합으로 구성되었다.
PCR 생성물은 하기를 가진 2% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분획화되었다: Invitrogen 1 kb 플러스 DNA ladder (Cat. # 10787-018) 및/또는 Invitrogen 50 bp DNA Ladder (Cat. # 10416-014). 잔존하는 PCR 생성물은 하기로부터 지침에 따라 pCR4-TOPO 벡터에 클로닝되었다: Invitrogen의 TOPO TA 클로닝 키트 (Cat. # K4575-02) 서열분석용.클로닝 반응은 One Shot Top10 세포로 화학적으로 형질전환되었고 0.06 mg/mL X-gal 및 0.025 mg/mL 카나마이신 한천 플레이트에서 플레이팅되었다.
서열분석
백색 콜로니는 0.025 mg/mL 카나마이신을 함유하는 LB에 접종되었고 37oC에서 진탕하면서 밤새 인큐베이션되었다. 각각의 콜로니는 분석된 생성물의 모집단으로부터 하나의 앰플리콘을 나타냈다. DNA는 하기를 이용하여 각각의 박테리아 배양물로부터 추출되었다: QIAGEN 플라스미드 미니프렙 키트 (Cat. # 12123). 삽입물의 DNA 서열은 하기를 포함하였던 서열분석 반응 믹스에서 결정되었다: 0.002 mL TOPO 클로닝된 PCR, 1x PCRx 인핸서 용액 (10x 스톡) (Cat. X11495-017), 0.0075 mM 올리고 (M13F 또는 M13R), 및 0.015 mL로 ddH2O.
서열분석 분석
서열분석 결과는, PCR 삽입물 서열을 단리시키는, 불확정 서열 및 pCR4-TOPO 벡터 서열로 트리밍되었다. 서열분석된 단편은 그 다음 참조로 정렬되었고 변이는 분석되었다.
서열분석 붕괴된 클론
붕괴된 양성 클론으로부터 PCR 생성물은 제조자의 지침에 따라 pCR4-TOPO 벡터 (Invitrogen Cat. # K4575-02)로 클로닝되었고, 그 다음 One Shot Top10 세포로 화학적으로 형질전환되었고 0.060 mg/mL X-gal 및 0.025 mg/mL 카나마이신 한천 플레이트에서 플레이팅되었다. DNA는 하기를 사용하는 박테리아 배양물로부터 추출되었다: QIAGEN 플라스미드 미니프렙 키트 (Cat. # 12123). 삽입물 서열분석 결과는 그 다음 예상된 붕괴 참조로 정렬되었고 인델 변이는 분석되었다. Cas9는 PAM으로부터 gRNA에 의해 인식된 서열로 3 염기 쌍을 절단시킨다고 예상되었다. 예상된 절단 이내 서열은 참조로부터 결실되었고 나머지는 결과를 정렬하는데 사용되었다.
단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNVs)용 TAQMAN ® 대립유전자 식별 검정
TAQMAN® 대립유전자 식별 반응은 0.008 ml 함유 게놈 DNA, 각각의 다형성용 특이적 프로브/프라이머, 및 TAQMAN® 유전자 발현 PCR Master 믹스이었다. 프로브는 Life Technologies (Thermo)로부터 정렬되었고 프라이머는 IDT로부터 정렬되었다. 대립유전자 129용 프로브는 VIC 염료로 표지되었고; 대립유전자 B6용 프로브는 FAM 염료로 표지되었다. 각각의 TAQMAN® 대립유전자 검정은 384-웰 플레이트에서 4배로 수행되었고 Applied BioSystems ViiA 7 플랫폼에서 실행되었다. SNV PCR 사이클링 프로그램은 아래와 같았다: 10 분 동안 95 oC 이어서 하기의 40 사이클:15 초 동안 95 oC, 60 초 동안 60 oC, 및 30 초 동안 60 oC.실행의 분석 및 결과의 평가는 ViiA 7 소프트웨어 v1.1을 사용하여 실시되었다.
FISH 분석
선택된 ES 세포 클론은 그것의 표준 절차에 의한 형광 원위치 하이브리드화 (FISH)를 사용하여 어느 한쪽 Cell Line Genetics (Madison, Wisconsin) 또는 Van Andel Institute (Grand Rapids, Michigan)에 의해 분석되었다. 우리는 2-색상 분석용 프로브로서 마우스 및 인간 BACs를 제공하였다.
표적 유전자좌의 향상된 게놈 붕괴 및/또는 인간화
설치류 유전자의 전부 또는 일부의 정확한, 단일-단계 결실 및 임의로 그것의 인간 동족체의 전부 또는 일부로 동시 대체를 유효화하기 위해, 우리는 설치류 ES 세포에 전기천공에 의해 하기 핵산 분자를 도입하였다: (1) LTVEC; (2) 플라스미드 또는 Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA; 및 (3) 하나 이상의 CRISPR 단일 가이드 RNAs (gRNAs)를 인코딩하는 하나 이상의 플라스미드 또는 gRNAs 자체. 각각의 실험에서, LTVEC는 선형화되었다. 일부 실험에서, LTVEC는 설치류 유전자를 결실시키고 인간 유전자를 삽입하는 상동 재조합 사건을 유도하도록 설계된 설치류 DNA의 상동성 아암에 의해 측접된 유전자 생성물 (단백질 또는 RNA)를 인코딩하는 인간 유전자의 전부 또는 일부를 포함하였다. 다른 실험에서, LTVEC는 별개의 유전자좌 예컨대 Ch25h 유전자좌를 표적화하도록 설계되었다. 어느 경우에나, LTVEC는 또한 항생제 약물 (예를 들어, G418)에 저항을 부여하는 효소 (예를 들면, 네오마이신 인산전달효소)의 발현을 유도하는 약물 선택 카셋트를 운반하였다.
LTVEC를 차지하였고 그것의 게놈에 편입하였던 ES 세포는 항생제 약물을 함유하는 성장 배지에서 조직 배양 접시상에 콜로니를 성장 및 형성시킬 수 있었다. 우리가 LTVEC 분자보다 500 내지 1,000 배 더 많은 CRISPR/Cas9-인코딩 및 gRNA-인코딩 핵 분자를 도입하였기 때문에, 대부분의 LTVEC-함유 약물 내성 콜로니는, 적어도 일시적으로, CRISPR/Cas9 성분을 또한 함유하였다. 우리는 약물 내성 콜로니를 구하였고 하기에 의해 이들을 스크리닝하여: 대립유전자 변형 방법 (Valenzuela 등 (2003) Nat. Biotech. 21:652-660; Frendewey 등 (2010) Methods Enzymol. 476:295-307; 그 전체가 본 명세서에서 참고로 편입됨) 정확하게 표적화된 인간화된 대립유전자를 갖는 클론을 확인하였다. 게다가, 유지 검정으로서 지칭되는, LTVEC의 상동성 아암에서 서열을 인식하는 실시간 PCR 검정은 마우스 게놈에 LTVEC의 정확한 표적화를 검증하는데 사용되었다. 이들 유지 검정의 카피 수 결정은, 상기 표적 마우스 유전자좌의 큰 Cas9-유도된 결실이 게놈에서 다른 곳에 LTVEC의 랜덤 통합과 일치하는 클론으로부터, 2개의 카피 수를 유지하였던, 정확하게 표적화된 ES 클론 식별을 돕기 위해 추가 정화를 제공하였고, 이 경우에 유지 검정은 3 (또는 초과)의 카피 수를 가졌다. 상기 표적 마우스 유전자좌에서 큰 Cas9-매개된 결실을 창출하기 위한 짝짓기된 gRNAs의 능력은 이전에 기재된 바와 같은 표준 LOA 및 GOA 검정이 추가 정화를 제공하기 위해 그리고 정확한 표적화를 검증하기 위해 유지 검정에 의해 증강될 수 있다는 것을 의미하였다. 따라서, 유지 검정은 LOA 및 GOA 검정과 함께 설계 및 사용되었다.
각각의 실험에서, 어느 한쪽 1개 또는 2개의 gRNAs는 사용되었다. 단독으로 사용된 gRNAs는 표적 유전자좌의 5' 말단, 상기 표적 유전자좌의 중간, 또는 상기 표적 유전자좌의 3' 말단 근처에서 Cas9 절단 (즉, 표적화된 마우스 유전자 결실)을 유도하였다. 2개의 gRNAs가 사용되었던 경우, 하나의 gRNA는 표적 유전자좌의 5' 말단 근처에서 Cas9 절단을 유도하였고 다른 gRNA는 상기 표적 유전자좌의 중간에서 또는 상기 표적 유전자좌의 3' 말단 근처에서 Cas9 절단을 유도하였다.
Lrp5 유전자좌
한 세트의 실험에서, LTVEC는 도메인외부를 인코딩하는 마우스 Lrp5 (저-밀도 지질단백질 수용체-관련된 단백질 5) 유전자의 부분의 68 kb 결실 그리고 인간 LRP5 유전자로부터 상동 서열의 91 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다 (참고 도 8). LTVEC는 결실로 의도된 마우스 Lrp5 유전자의 68 kb 서열을 측접하는 마우스 Lrp5 유전자좌의 부분으로부터 유래된 게놈 DNA의 7 kb 및 33 kb를 함유하는 상동성 아암에 의해 측접된 인간 LRP5 유전자의 91 kb 단편을 포함하였다. 별개의 실험에서, Lrp5 인간화 LTVEC는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 Lrp5 유전자의 영역 이내 이중-가닥 절단을 창출하도록 설계된 8개의 gRNAs (A, B, B2, C, D, E2, E, F) 중 하나를 인코딩하는 제2 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 조합되었다. gRNAs는 인간 LRP5 유전자의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다. 다른 실험에서, 우리는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 Lrp5 유전자의 영역 이내 상이한 부위를 표적하는 2개의 상이한 gRNAs를 인코딩하는 플라스미드와 Cas9-인코딩 플라스미드 및 LTVEC를 조합하였다.
약물 내성 ES 세포 클론은 하기에 의해 표적화된 인간화로 스크리닝되었다: 대립유전자 변형 검정 (Valenzuela 등 (2003) Nat. Biotechnol. 21:652-659; Frendewey 등 (2010) Methods Enzymol. 476:295-307) 결실 이내 서열에 대하여 그리고 약물 선택 카셋트 및 인간 유전자 삽입물 이내 서열에 대하여.클론은 이들이 2 내인성 마우스 유전자 서열 중 하나를 잃었고 인간 삽입물의 1 카피를 얻었는지, 그리고 또한 (LTVEC의 상동성 아암에서 정위된) 유지 서열의 2 카피를 유지하였는지 정확하게 표적화된 경우 채점되었다. 이러한 스크리닝용 2 유지 검정은 하기 프라이머 및 프로브를 사용하는 TAQMAN® 검정이었다: 7064retU 정방향 프라이머 CCTCCTGAGCTTTCCTTTGCAG (서열번호:100); 7064retU 역방향 프라이머 CCTAGACAACACAGACACTGTATCA (서열번호:101); 7064retU TAQMAN® 프로브 TTCTGCCCTTGAAAAGGAGAGGC (서열번호:102); 7064retD 정방향 프라이머 CCTCTGAGGCCACCTGAA (서열번호:103); 7064retD 역방향 프라이머 CCCTGACAAGTTCTGCCTTCTAC (서열번호:104); 7064retD TAQMAN® 프로브 TGCCCAAGCCTCTGCAGCTTT (서열번호:105).
Lrp5 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화의 결과는 표 13에서 요약된다. LTVEC 단독이 ES 세포에 도입되었던 경우, 1.9%의 스크리닝된 약물 내성 클론은 하기를 운반하였다: 정확하게 표적화된 이형접합성 인간화된 대립유전자 (참고 Het.Targ. 칼럼 표 13내, 비-표적화된 대립유전자가 전혀 돌연변이되지 않았던 또는 NHEJ에 의해 야기된 작은 CRISPR-유도된 돌연변이 예컨대 작은 결실을 가졌던 클론을 포함함). 그에 반해서, 시험된 8개 gRNAs (A, B, B2, C, D, E2, E 및 F; 참고 표 1) 중 7개에 의해 유도된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC 조합은 2.1 내지 7.8% 범위이었던 효율성에서 정확하게 표적화된 단일대립유전자 이형접합성 돌연변이를 생산하였다. B2 및 D에 의한 Cas9-유도된 절단에 대하여, 단일대립유전자 표적화에 더하여, 이중대립유전자 동형접합성 인간화는 1.0-2.1%의 빈도에서 검출되었다. 우리는, 심지어 작은, 단순한 결실 대립유전자에 대하여, 그 자체로 LTVEC를 가진 이중대립유전자 표적화를 전혀 관측하지 못했다. 동형접합성 Lrp5 인간화된 ES 세포는 하기에 의해 전환될 수 있다: VELOCIMOUSE® 방법 (Poueymirou 등 (2007) Nat. Biotech. 25:91-99, 그 전체가 본 명세서에서 참고로 편입됨) 표현형 및 약물 효능 연구에 대하여 준비된 완전히 ES 세포-유래된 마우스에 직접적으로.
예상된 절단 부위에서 또는 근처에서 gRNA/Cas9-유도된 NHEJ 돌연변이를 검출하도록 고안된 MOA 검정은 시험된 모든 gRNAs에 대하여 돌연변이 활성을 실증하였다 (데이터 도시되지 않음). 어느 한쪽 단일대립유전자 또는 이중대립유전자 gRNA-유도된 돌연변이의 분율은 유전자좌 및 위치에 의해 가변된 분석된 모든 클론 중에서 감출하였다. gRNA 돌연변이 활성과 LTVEC 표적화 사이 강한 상관관계는 없었지만, 최저 표적화 효율성은 최저 돌연변이 빈도를 가졌던 gRNAs와 종종 관련되었다.
결실에 대하여 표적화되었던 Lrp5 유전자의 영역의 상이한 말단을 인식하는 2개의 gRNAs 조합은, 주로 시험된 5 조합 중 3개에 대하여 동형접합성 표적화 사건의 빈도 증가에 의해, 총 인간화 표적화 효율을 증가시켰다 (표 13). gRNAs의 조합이 gRNAs에 의해 프로그래밍된 Cas9 절단 부위 사이 큰 결실을 창출하기 위한 잠재력을 갖기 때문에, 우리는 하나의 Lrp5 대립유전자에서 표적화된 인간화 그리고 다른 대립유전자에서 큰 CRISPR-유도된 결실을 운반하였던 반접합성 ES 세포 클론을 또한 관측하였다 (gRNA 조합 A + F, 표 13). 게다가, gRNA 조합 중 2개 (A + F 및 A + E2)에 대하여, 우리는 특유의 유전자형으로 ES 세포 클론을 확인하였다: 양쪽 Lrp5 대립유전자에서 큰 CRISPR-매개된 결실.
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표 13에서 실증된 바와 같이, 이중대립유전자 표적화를 가졌던 클론의 백분율에서 유의미한 증가는, gRNA 조합의 사용이 이중대립유전자 변형을 촉진시킨다는 것을 나타내는, 1개의 gRNA보다 단일 유전자좌를 표적하는 2개의 gRNAs를 사용하는 경우 관측되었다 (참고 도 9A). 도 9A는 마우스 유전자의 동시 결실 그리고 LTVEC 및 2개의 가이드 RNAs (A 및 B)를 사용하여 상응하는 인간 버전으로 대체에 대하여 일반적인 도식을 보여준다. 2개의 gRNAs를 사용하는 경우 훨씬 높은 빈도에서 관측되는 특유의 돌연변이체 대립유전자 유형은 하기를 포함한다: 동종접합성으로 붕괴된 대립유전자 (도 9B; Δ/Δ), 동종접합성으로 표적화된 대립유전자 (도 9C; Hum/Hum), 반접합성으로 표적화된 대립유전자 (도 9D; (Hum/Δ)), 및 다른 화합물 이종접합성으로 표적화된 대립유전자 (예를 들면, 하나의 대립유전자는 LTVEC-표적화된 인간화를 갖고 및 다른 대립유전자는 CRISPR-유도된 돌연변이 예컨대 작은 결실을 갖는다) (도 9E).
몇 개의 PCR 검정은 MOA 검정에 기반된 유전자형을 지지 및 확인하기 위해 수행되었다. 프라이머는 표 1에서 발견될 수 있다. Lrp5 LTVEC는 인간 삽입물과 인접한 마우스 게놈 서열 사이 물리적 연결에 대하여 분석하였던 PCR에 의한 표적화를 증명하기에 충분한 짧은 (6.9 kb) 5' 상동성 아암을 가졌다. 우리는 이중대립유전자 큰 결실을 갖는 것으로서 채점된 클론으로부터 또는 친계 ES 세포주로부터 DNA를 갖지 않지만 이형접합성, 반접합성, 또는 동형접합성으로서 채점된 클론으로부터 DNA를 가진 기대된 7.5 kb PCR 생성물을 관측하였고 (도 10A), 따라서 추론된 이중대립유전자 큰 결실을 스크리닝 및 지지하는 MOA (즉, LOA 및 GOA)에 의해 만들어진 표적화 요구를 확인하였다. 결실 및 삽입 접합부에서 서열을 검사하였던 (도 10B), 5'-Del-J PCR 검정은 친계 ES 세포주로부터 그리고 대부분의 이형접합성 인간화된 클론으로부터 DNA를 가진 330 bp 생성물을 생산하였다 (데이터 도시되지 않음). 이형접합성 클론 AW-C3에 대하여, 5'-Del-J 검정은 기대된 생성물보다 더 작은 것을 생산하여 (도 10B), gRNA A/Cas9 절단이 비-표적화된 대립유전자에서 작은 결실 돌연변이를 유도하였고, 이는 또한 gRNA A 절단용 MOA 검정에 의해 검출되었다는 것을 시사하였다 (데이터 도시되지 않음). 기대된 대로, 5'-Del-J 검정은 반접합성, 동형접합성, 및 이중대립유전자 결실 대립유전자를 가진 클론에 대하여 음성이었다. 인간 DNA 삽입물의 5' 말단과 인접한 마우스 측접 서열 사이 접합부에서 서열을 검사하였던, 5'-Ins-J PCR (도 10B)는, 이들이 적어도 하나의 표적화된 인간화된 대립유전자를 가짐에 따라, 이형접합성, 반접합성, 및 동형접합성 클론에서 478 bp 생성물을 생산하였다. 5'-Ins-J PCR 검정은 이중대립유전자 큰 결실을 가진 클론에 대하여 생성물을 생산하지 못했다 (도 10B). 반접합성 및 이중대립유전자 결실 클론에서 큰 결실을 확인하기 위해, 우리는 이중 gRNA 표적 부위 외부에서 서열을 인식하였던 프라이머로 PCRs를 수행하였다. A 및 F gRNA 부위 사이 결실에 대하여 분석하였던, Del(A + F) PCR은 클론 AW-A8 및 BO-F10으로부터 DNA를 가진 대략 360 bp의 단일 생성물을 생산하여 (도 10B), Lrp5 대립유전자의 적어도 하나가 큰 결실을 갖는다는 것을 확인하였다. 마찬가지로, A 및 E2 gRNA 부위 사이 큰 결실에 대하여 분석하였던, Del(A + E2) PCR은 클론 BA-A7로부터 DNA를 가진 대략 250 bp의 단일 생성물을 생산하였다. 접합, LOA, 및 GOA 검정과 함께, 결실 PCRs는 이중대립유전자 큰 결실 유전자형을 지지한다. 도 10A 및 10B에서 보여진 검정 결과는 우리가 표 13에서 요약된 이중대립유전자 유전자형을 확인하기 위해 형광 원위치 하이브리드화 (FISH; 도 11A-C) 에 더하여 수행하였던 유사한 검정의 대표적인 예이다.
형광 원위치 하이브리드화 (FISH)는 Lrp5 유전자의 동형접합성 표적화된 인간화를 확인하는데 사용되었다. Lrp5 인간화 LTVEC가 Cas9 및 2 gRNAs (A 플러스 F 또는 A 플러스 E2)와 조합되었던 표적화 실험으로부터 표적화된 동형접합성인 경우 정량적 및 종래의 PCR 검정에 의해 채점된 ES 세포 클론은 FISH 및 핵형 분석을 위하여 상업적 세포학 서비스에 보내졌다. 마우스 Lrp5 유전자를 운반하는 박테리아 인공 염색체 (BAC)는 적색 형광 마커로 표지되었고 내인성 Lrp5 유전자좌를 확인하기 위한 프로브로서 사용되었고, 인간 LRP5 유전자를 운반하는 BAC는 녹색 형광 마커로 표지되었고 인간 삽입물로 표적화된 염색분체를 확인하기 위한 프로브로서 사용되었다. 표지된 BAC 프로브는 표적화된 클론으로부터 중기 확대로 하이브리드화되었고 형광 현미경검사에 의해 시각화되었다. 확대에서 염색체는 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 염색에 의해 시각화되었고, 각각의 클론에 대하여 별개의 핵형은 김자 염색에 의해 결정되었다. 전형적인 결과는 클론 AW-D9에 대하여 도 11A에서 보여지고, 이는 정상 40XY 핵형을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도시되지 않음). 도 11A에서 합성 사진은 양쪽 적색 마우스 BAC 프로브 신호 및 녹색 인간 BAC 프로브 신호가, Lrp5 유전자의 공지된 정위인, 마우스 염색체 19의 양쪽 카피에서 세포학적 밴드 B에 공동-국소화하였다는 것을 보여준다. 도 11C에서 합성 사진은 또 다른 클론 (BA-D5)에 대하여 동일한 동형접합성 표적화를 보여준다. 이들 결과는 인간화 LTVEC에서 인간 LRP5 유전자의 91 kb 단편이 클론 AW-D9 및 BA-D5내 양쪽 염색체 19 동족체에서 의도된 마우스 Lrp5 유전자좌에 정확하게 삽입되었다는 것을 확인한다. 그에 반해서, 도 11B에서 합성 사진은 양쪽 적색 마우스 BAC 프로브 신호 및 녹색 인간 BAC 프로브 신호가 마우스 염색체 19의 단일 카피에서 세포학적 밴드 B에 공동-국소화하였고 (고체 화살표), 반면에 단지 적색 마우스 BAC 프로브 신호가 마우스 염색체 19의 다른 카피에서 세포학적 밴드 B에 국소화하였다는 것을 보여준다. 이들 결과는 인간화 LTVEC에서 인간 LRP5 유전자의 91 kb 단편이 염색체 19의 단 하나의 카피에서 의도된 마우스 Lrp5 유전자좌에 정확하게 삽입되었다는 것을 확인한다 (이형접합성 표적화). 이들은 또한 인간 BAC 프로브가 마우스 Lrp5 유전자좌에 교차-하이브리드화하지 않지만 인간 LRP5 삽입물을 단지 인식한다는 것을 (도시되지 않은 다른 대조군과 함께) 나타낸다.
분명한 비-상동 말단-연결 수복에 의해 양쪽 대립유전자에서 형성된 동일한 CRISPR-유도된 인델 돌연변이의 특정 클론에서 존재는 (50% 129SvS6 균주 및 50% C57BL/6N 균주로 구성되는) F1H4 하이브리드 세포에서 유전자 변환 사건의 발생을 제안하였다. 2개의 gRNAs가 사용되는 경우 향상된 이중대립유전자 표적화에 기저하는 기전에 통찰력을 얻기 위해, LTVEC 그리고 어느 한쪽 A 플러스 F 또는 A 플러스 E2 gRNA 조합으로 표적화 이후 어느 한쪽 표적화된 동형접합성 인간화 또는 동형접합성 CRISPR-유도된 큰 결실을 가졌던 7개의 클론은 스크리닝되었다.
도 12는 2개의 가이드 RNAs에 의해 매개된 유전자 변환 사건을 검사하도록 설계된 검정의 예를 보여준다. 특이적으로, 유전자 변환의 가능성은 (50% 129 SvS6 균주 및 50% C57BL/6N 균주로 구성되는) F1H4 하이브리드 ES 세포에서 이형접합성 손실 (LOH) 분석에 의해 검사되었다. 유전자 변환은 129SvS6 (129)와 C57BL/6N (B6) 사이 공지된 다형성에서 이형접합성 손실에 의해 실증될 수 있고, 따라서 PCR 검정은 이들 2 대립유전자 유형 사이 분화하도록 설계되었다. 구조적 변이체 (SV) 다형성은 129와 B6 대립유전자 사이 차이를 검출하도록 설계된 종래의 PCRs에 의해 분석되었다. 아래 사용된 SV 검정 중 단 하나가 도 12에서 보여져도, 개념은 각각에 대하여 동일하다. 프라이머는 B6과 129 마우스 균주 사이 구조적 변이 (SVs)에 기반하여 설계되었고 표 1에서 보여진다. 프라이머 설계 조건은 ~25 bp SVs를 확인하도록 그리고 ~300 bp PCR 생성물을 생산하도록 제한되었고; 이들 조건은 임의의 변화가 겔 전기영동에 의해 가시적일 정도로 선택되었다.
클론에서 PCRs 실행에 앞서, 검정은 B6, 129 균주 및 F1H4 ES 세포주로부터 야생형 ES-세포 DNA에 대해 입증 및 최적화되었다. 어느 한쪽 B6 또는 129 대립유전자에 특이적인 구별할 수 있는 PCR 밴드를 생산하였던 그리고 F1H4 DNA를 사용하여 이들 동일한 2개의 구별할 수 있는 밴드 생산에서 일관되었던 프라이머 세트는 클론에서 시험을 위하여 선택되었다. 염색체 19 (Lrp5 유전자의 정위)에 대하여, 6 프라이머 세트―IDs 190045, 190061, 190068, 190030, 190033, 190013―는 대립유전자 변형 (MOA) 검정 및 종래의 PCR에 의해 어느 한쪽 "동형접합성 표적화된" 또는 "동형접합성 붕괴된" 것으로서 유전자형화된 Lrp5 인간화된 클론에서 사용을 위하여 선택되었다. SV PCR 검정은, Lrp5 유전자좌로부터 ~13.7 내지 ~56.2 Mb 범위의, 염색체의 Lrp5 유전자좌부터 텔로미어 말단까지 염색체 19를 따라 이격 제거되었다. Lrp5 유전자좌로부터 염색체 19에서 SV 검정의 (Mb로) 대략적 거리는 아래와 같다: 검정 190045에 대하여 13.7, 검정 190061에 대하여 19.0, 검정 190068에 대하여 35.0, 검정 190030에 대하여 37.4, 검정 190033에 대하여 48.3, 및 검정 190013에 대하여 56.2. 유일한 검정 190033은 (SV 48.3으로서 보여진) 도 12에서 보여지지만, 검정 190045, 190061, 190068, 190030, 190033, 및 190013에 대하여 프라이머는 표 1에서 보여진다.
PCRs는 이들 클론으로부터 DNA에서 뿐만 아니라 F1H4 대조군 DNA, 129 대조군 DNA, 및 B6 대조군 DNA에서 실행되었다. PCR 생성물은, GelRed로 후속적으로 염색되었던, 6% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동에 의해 분획화되었다. 2개의 밴드를 생산하는 클론은 최대 F1H4 대조군을 매칭시켰고, 이는 이전의 최적화로부터 최상부 밴드가 129 대립유전자에 특이적이었고 최하부 밴드가 B6 대립유전자에 특이적이었다는 것을 보여주었다. 단 하나의 밴드를 생산하였던 클론은 어느 한쪽 단지 B6 또는 단지 129 밴드를 표시하였다. 클론 AW-A7, AW-F10, BA-D5, BA-F2, BC-H9, 및 BR-B4는 모두 6개의 검정에 대하여 단지 B6을 보여주었고, 반면에 클론 BO-A8은 모두 6개의 검정에 대하여 단지 129를 보여주었다. 이전에 언급한 바와 같이, 이들 클론은 MOA 및/또는 PCR에 의해 어느 한쪽 표적화된 동형접합성 또는 붕괴된 동형접합성으로서 유전자형화되었고, 다양한 gRNA 조합 (A 플러스 F, A 플러스 E2, B2, 및 D)에 관여되었다. 단지 단일 대립유전자 밴드의 존재는 유전자 변환 사건이 발생 중이고―변환이 없었다면, 양쪽 밴드가 F1H4 대조군에서처럼 여전히 존재할 것을 제안하였다.
게다가, 129와 B6 대립유전자 사이 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNVs)는 TAQMAN® 대립유전자 식별 검정에 의해 분석되었다. 도 12에서 염색체 19 지도상의 SNV 검정의 대략적 위치는 아래 주어진Lrp5 유전자좌로부터 (Mb로) 그것의 거리를 따라 화살촉으로 보여진다. Lrp5 유전자좌로부터 (Mb로) 거리는 아래와 같다: Lrp5 (C2)의 0.32 동원체, Lrp5 (T3)의 1.2 텔로미어, Lrp5 (T6)의 11.1 텔로미어, Lrp5 (T7)의 13.2 텔로미어, Lrp5 (T8)의 17.5 텔로미어, Lrp5 (T9)의 25.8 텔로미어, Lrp5 (T10)의 33.0 텔로미어, Lrp5 (T11)의 38.3 텔로미어, Lrp5 (T13)의 49.6 텔로미어, 및 Lrp5 (T14)의 57.2 텔로미어. 129-특이적 및 B6-특이적 프로브 및 프라이머 쌍은 표 1에서 보여진다.
표 14는 양쪽 SV 및 SNV 대립유전자에 대하여 LOH에 의해 Lrp5 표적 유전자좌로부터 텔로미어 방향에서 염색체 19의 긴 아암에 대해 분명한 유전자 변환 사건을 나타냈던 ES 세포 클론의 7 예를 보여준다. ES 세포 클론은, 나타난 바와 같이, 1개 또는 2개의 gRNAs와 Lrp5 인간화 LTVEC를 조합하였던 독립 표적화 실험으로부터 유래되었다. gRNA 인식 서열의 위치는 도 12에서 Lrp5 유전자의 표현 위에 보여진다 (두꺼운 왼쪽으로 지적하는 화살표). 유전형분석 검정은 7 클론 중 6개가 Lrp5 유전자의 동종접합성으로 표적화된 인간화를 가졌고, 한편 1개가 동형접합성 붕괴 (gRNA 부위 사이 큰 결실)을 가졌다는 것을 나타냈다. 7 클론 중 6개에서, 129 대립유전자는 손실되어, 단지 B6 대립유전자를 남겨두었다. 다른 클론에서, B6 대립유전자는 손실되어, 단지 129 대립유전자를 남겨두었다. 모든 클론은 Lrp5 유전자좌의 센트로메트릭 측에서 분석된 대립유전자에 대하여 이형접합성으로 남아있었다 (즉, 모든 클론은 C2 SNV 검정으로 이형접합성 B6/129이었다). 7 클론에서 관측된 LOH는 LTVEC이 1개, 또는 더 자주, 2개의 gRNAs와 조합되는 경우 동형접합성 유전적으로 변형된 대립유전자가 수득되는 하나의 기전이 하나의 대립유전자에서 제1 표적화된 유전적 변형이고 이어서 하나의 염색체부터 그것의 동족체까지 표적화된 유전적 변형을 카피하는 상동성 지향된 재조합 유전자 변환인 것을 나타낸다.
Figure pct00018
C5 (Hc) 유전자좌
실험의 또 다른 세트에서, LTVEC는 보체 구성요소 5 (C5 또는 Hc (용혈성 보체))에 대하여 마우스 유전자의 76 kb 결실 그리고 상동 인간 C5 유전자의 97 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다. 상기 표적 유전자좌는 C5 (Hc) 유전자의 정지 코돈에 엑손 2를 포함하였다. LTVEC는 결실로 의도된 마우스 C5 (Hc) 유전자의 76 kb 서열을 측접하는 마우스 C5 (Hc) 유전자좌의 부분으로부터 유래된 게놈 DNA의 35 kb 및 31 kb를 함유하는 상동성 아암에 의해 측접된 인간 C5 유전자의 97 kb 단편을 포함하였다. 별개의 실험에서, C5 (Hc) 인간화 LTVEC는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 C5 (Hc) 유전자의 영역 이내 이중-가닥 절단을 창출하도록 설계된 6개의 gRNAs (A, B, C, D, E, 및 E2; 참고 표 1) 중 하나를 인코딩하는 제2 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 조합되었다. gRNAs는 인간 C5 유전자의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다. 다른 실험에서, 우리는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 C5 (Hc) 유전자의 영역 이내 상이한 부위를 표적하는 2개의 상이한 gRNAs를 인코딩하는 플라스미드와 Cas9-인코딩 플라스미드 및 LTVEC를 조합하였다. 일부 실험에서, Ch25h 유전자좌를 표적하는 대조군 LTVEC는 C5 (Hc) 인간화 LTVEC 대신에 사용되었다. Ch25h (~1 kb)의 전체 코딩 서열을 결실하도록 그리고 Ch25h 유전자좌에 퓨로마이신 및 네오마이신 선택 카셋트를 삽입하도록 설계되는, 대조군 LTVEC는 C5 (Hc) 유전자좌에서 상동 재조합에 대하여 표적되지 않았던 약물 내성 클론을 선택하기 위한 수단으로서 사용되었다.
C5 (Hc) 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화의 결과는 표 15에서 보여지고 Lrp5 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화에 대하여 수득된 결과와 유사하다. LTVEC 단독으로 표적화 효율은 Lrp5보다 C5 (Hc) 인간화에 대하여 더 높았지만 (6.1%), Cas9 및 gRNAs의 첨가는 시험된 6개의 gRNAs 중 4개에 대하여 표적화 효율을 향상시켰다. Lrp5와 마찬가지로, C5 (Hc) 인간화에 대하여 gRNAs 조합 (즉, 2개의 gRNAs의 사용)은, 주로 반접합성 및 동형접합성 표적화 사건의 빈도 증가에 의해, 총 표적화 효율을 추가로 증가시켰다. 우리는 (1.8% 내지 3.6%의 빈도에서 관측된) 양쪽 대립유전자에서 큰 CRISPR-유도된 결실을 가진 ES 세포 클론을 또한 알아내었다. 게다가, Ch25h 유전자좌를 표적하는 LTVEC가 2개의 C5 (Hc) gRNAs와 조합으로 사용되었던 경우, 2개의 가이드 RNA 인식 서열 사이 붕괴되었던 동형접합성 대립유전자를 가진 클론은 1.2% 내지 6%의 빈도에서 관측되었고, 붕괴 사건이 상기 표적 유전자좌에서 상동 재조합 사건과 독립적으로 발생한다는 것을 나타낸다. Lrp5와 마찬가지로, 유지 검정은 정확하게 표적화된 클론을 확인하는데 사용되었다. 이러한 스크리닝용 2 유지 검정은 하기 프라이머 및 프로브를 사용하는 TAQMAN® 검정이었다: 7140retU 정방향 프라이머 CCCAGCATCTGACGACACC (서열번호:106); 7140retU 역방향 프라이머 GACCACTGTGGGCATCTGTAG (서열번호:107); 7140retU TAQMAN® 프로브 CCGAGTCTGCTGTTACTGTTAGCATCA (서열번호:108); 7140retD 정방향 프라이머 CCCGACACCTTCTGAGCATG (서열번호:109); 7140retD 역방향 프라이머 TGCAGGCTGAGTCAGGATTTG (서열번호:110); 7140retD TAQMAN® 프로브 TAGTCACGTTTTGTGACACCCCAGA (서열번호:111).
Figure pct00019
형광 원위치 하이브리드화 (FISH)는 C5 (Hc) 유전자의 동형접합성 표적화된 인간화를 확인하는데 사용되었다. C5 (Hc) 인간화 LTVEC이 Cas9 및 2개의 gRNAs와 조합되었던 표적화 실험으로부터 표적화된 동형접합성으로서 정량적 및 종래의 PCR 검정에 의해 채점된 ES 세포 클론은 FISH 및 핵형 분석을 위하여 상업적 세포학 서비스에 보내졌다. 마우스 C5 (Hc) 유전자를 운반하는 박테리아 인공 염색체 (BAC)는 적색 형광 마커로 표지되었고 내인성 유전자좌를 확인하기 위한 프로브로서 사용되었고, 인간 C5 유전자를 운반하는 BAC는 녹색 형광 마커로 표지되었고 인간 삽입물로 표적화된 염색분체를 확인하기 위한 프로브로서 사용되었다. 표지된 BAC 프로브는 표적화된 클론으로부터 중기 확대로 하이브리드화되었고 형광 현미경검사에 의해 시각화되었다. 확대에서 염색체는 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 염색에 의해 시각화되었고, 각각의 클론에 대하여 별개의 핵형은 김자 염색에 의해 결정되었다. 전형적인 결과는 클론 O-E에 대하여 도 13B에서 보여진다. 도 13B에서 합성 사진은 양쪽 적색 마우스 BAC 프로브 신호 및 녹색 인간 BAC 프로브 신호가, C5 (Hc) 유전자의 공지된 정위인, 마우스 염색체 2의 양쪽 카피에서 C5 (Hc) 유전자좌에 공동-국소화하였다는 것을 보여준다. 이들 결과는 인간화 LTVEC에서 인간 C5 유전자의 97 kb 단편이 클론 O-E3내 양쪽 염색체 2 동족체에서 의도된 마우스 C5 (Hc) 유전자좌에 정확하게 삽입되었다는 것을 확인한다. 그에 반해서, 도 13A에서 합성 사진은 양쪽 적색 마우스 BAC 프로브 신호 및 녹색 인간 BAC 프로브 신호가 마우스 염색체 2의 단일 카피 (고체 화살표)에서 공동-국소화하였고, 반면에 단지 적색 마우스 BAC 프로브 신호는 마우스 염색체 2의 다른 카피에서 C5 (Hc) 유전자좌에 국소화한다는 것을 보여준다. 이들 결과는 인간화 LTVEC에서 인간 C5 유전자의 97 kb 단편이 클론 Q-E9내 염색체 2의 단 하나의 카피에서 의도된 마우스 C5 (Hc) 유전자좌에 정확하게 삽입되었다는 것 (이형접합성 표적화)를 확인한다.
클론은 그 다음 2개의 가이드 RNAs에 의해 매개된 유전자 변환 사건을 검사하기 위해 분석되었다. 특이적으로, 유전자 변환의 가능성은 (50% 129 SvS6 균주 및 50% C57BL/6N 균주로 구성되는) F1H4 하이브리드 ES 세포에서 이형접합성 손실 (LOH) 분석에 의해 검사되었다. 유전자 변환은 129SvS6 (129)와 C57BL/6N (B6) 사이 공지된 다형성에서 이형접합성 손실에 의해 실증될 수 있고, 따라서 PCR 검정은 이들 2 대립유전자 유형 사이 분화하도록 설계되었다. 구조적 변이체 (SV) 다형성은 129와 B6 대립유전자 사이 차이를 검출하도록 설계된 종래의 PCRs에 의해 분석되었다. 프라이머는 B6과 129 마우스 균주 사이 구조적 변이 (SVs)에 기반하여 설계되었고 표 1에서 보여진다. 프라이머 설계 조건은 ~25 bp SVs를 확인하도록 그리고 ~300 bp PCR 생성물을 생산하도록 제한되었고; 이들 조건은 임의의 변화가 겔 전기영동에 의해 가시적일 정도로 선택되었다.
클론에서 PCRs 실행에 앞서, 검정은 B6, 129 균주 및 F1H4 ES 세포주로부터 야생형 ES-세포 DNA에 대해 입증 및 최적화되었다. 어느 한쪽 B6 또는 129 대립유전자에 특이적인 구별할 수 있는 PCR 밴드를 생산하였던 그리고 F1H4 DNA를 사용하여 이들 동일한 2개의 구별할 수 있는 밴드 생산에서 일관되었던 프라이머 세트는 클론에서 시험을 위하여 선택되었다. 5 프라이머 세트―IDs SV 6.1, SV 6.3, SV 7.8, SV 16, 및 SV 25.5―는 표적화 실험으로부터 클론에서 사용을 위하여 선택되었다. SV PCR 검정 중 4개는, C5 유전자좌로부터 ~6.3 내지 ~25.5 Mb 범위의, C5 유전자좌부터 염색체의 텔로미어 말단까지 염색체를 따라 이격 제거되었다. 최종 SV PCR 검정은 C5 유전자좌에 ~6.1 Mb 동원체이었다. C5 유전자좌로부터 SV 검정의 (Mb로) 대략적 거리는 아래와 같다: 검정 SV 6.1에 대하여 6.1 (동원체), 검정 SV 6.3에 대하여 6.3 (텔로미어), 검정 SV 7.8에 대하여 7.8 (텔로미어), 검정 SV 16.0에 대하여 16.0, 및 검정 SV25.5에 대하여 25.5 (참고 도 14).
모든 21 클론은 C4 유전자좌의 동원체 측에서 분석된 대립유전자에 대하여 이형접합성으로 남겨졌다 (즉, 모든 클론은 이형접합성 B6/129이었다). 시험된 21 클론 중에서 2개는 LOH에 의해 C5 표적 유전자좌로부터 텔로미어 방향에서 분명한 유전자 변환 사건을 나타냈다 (참고 표 16). 유전형분석 검정은 클론 중 하나가 C5 유전자의 동종접합성으로 표적화된 인간화를 가졌고, 다른 클론이 동형접합성 붕괴를 가졌다는 것을 나타냈다. 2 클론에서 관측된 LOH는 LTVEC가 1개, 또는 더 자주, 2개의 gRNAs와 조합되는 경우 동형접합성 유전적으로 변형된 대립유전자가 수득되는 하나이 기전이 하나의 대립유전자에서 제1 표적화된 유전적 변형 이어서 하나의 염색체부터 그것의 동족체까지 표적화된 유전적 변형을 카피하는 상동성 지향된 재조합 유전자 변환인 것을 나타낸다.
Figure pct00020
Ror1 유전자좌
실험의 또 다른 세트에서, LTVEC는 마우스 Ror1 (티로신-단백질 키나제 막관통 수용체 ROR1) 유전자의 110 kb 결실 및 상동 인간 ROR1 유전자의 134 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다. LTVEC는 결실로 의도된 마우스 Ror1 유전자의 110 kb 서열을 측접하는 마우스 Ror1 유전자좌의 부분으로부터 유래된 게놈 DNA의 41.8 kb 및 96.4 kb를 함유하는 상동성 아암에 의해 측접된 인간 ROR1 유전자의 134 kb 단편을 포함하였다. 별개의 실험에서, Ror1 인간화 LTVEC는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 Ror1 유전자의 영역 이내 이중-가닥 절단을 창출하도록 설계된 6개의 gRNAs (A, B, C, D, E, 및 F; 참고 표 1) 중 하나를 인코딩하는 제2 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 조합되었다. gRNAs는 인간 ROR1 유전자의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다. 다른 실험에서, 우리는 결실에 대하여 표적화되었던 Ror1 유전자 이내 상이한 부위를 표적하는 2개의 상이한 gRNAs를 인코딩하는 플라스미드와 Cas9-인코딩 플라스미드 및 LTVEC를 조합시켰다.
Ror1 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화의 결과는 표 17에서 보여지고 Lrp5 및 C5 (Hc) 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화에 대하여 수득된 결과와 유사하다. LTVEC 단독으로 표적화 효율은 0.3%이었고, Cas9 및 gRNAs의 첨가는 시험된 6개의 gRNAs 중 2개에 대하여 표적화 효율을 약간 증가시켰다. A 및 F gRNAs 조합은 양쪽 이형접합성 및 반접합성 표적화 사건의 빈도 증가에 의해 6.3%로 총 Ror1 표적화 효율을 증가시켰다. 우리는 (1.6%의 빈도에서 관측된) 양쪽 대립유전자에서 큰 CRISPR-유도된 결실을 가진 ES 세포 클론을 또한 알아내었다. 동형접합성 표적화된 클론은 관측되지 않았다. 추가의 실험에서, gRNAs A 및 D는 또한 조합되었지만, 여전히 동형접합성 표적화는 관측되지 않았다.
Figure pct00021
Trpa1 유전자좌
실험의 또 다른 세트에서, LTVEC는 마우스 Trpa1 (일과성 수용체 전위 양이온 통로, 서브패밀리 A, 구성원 1) 유전자의 45.3 kb 결실 및 상동 인간 TRPA1 유전자의 54.5 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다. LTVEC는 결실로 의도된 마우스 Trpa1 유전자의 45.3 kb 서열을 측접하는 마우스 Trpa1 유전자좌의 부분으로부터 유래된 게놈 DNA의 41.0 kb 및 58.0 kb를 함유하는 상동성 아암에 의해 측접된 인간 TRPA1 유전자의 54.5 kb 단편을 포함하였다. 별개의 실험에서, Trpa1 인간화 LTVEC는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 Trpa1 유전자의 영역 이내 이중-가닥 절단을 창출하도록 설계된 8개의 gRNAs (A, A2, B, C, D, E2, E, 및 F; 참고 표 1) 중 하나를 인코딩하는 제2 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 조합되었다. gRNAs는 인간 TRPA1 유전자의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다. 다른 실험에서, 우리는 결실에 대하여 표적화되었던 Trpa1 유전자 이내 상이한 부위를 표적하는 2개의 상이한 gRNAs를 인코딩하는 플라스미드와 Cas9-인코딩 플라스미드 및 LTVEC를 조합시켰다.
Trpa1 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화의 결과는 표 18 에서 보여지고 Lrp5 및 C5 (Hc) 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화에 대하여 수득된 결과와 유사하다. LTVEC 단독으로 표적화 효율은 0.3%이었고, Cas9 및 gRNAs의 첨가는 시험된 8개의 gRNAs 중 6개에 대하여 표적화 효율을 증가시켰다. B 및 F gRNAs 조합은 이형접합성, 반접합성, 및 동형접합성 표적화 사건의 빈도 증가에 의해 3.4%로 총 Trpa1 표적화 효율을 증가시켰다. 우리는 (0.3%의 빈도에서 관측된) 양쪽 대립유전자에서 큰 CRISPR-유도된 결실을 가진 ES 세포 클론을 또한 알아내었다.
Figure pct00022
이들 예가 설명하는 바와 같이, 널리 분리된 부위에서 이중 가이드 RNAs의 사용은 단일 gRNAs와 비교된 이형접합성 인간화의 향상을 개선하였다. 게다가, 이중 가이드 RNAs의 사용은 단일 gRNAs에 비교하여 이중대립유전자 사건을 촉진시켰다. 1개의 gRNA로 표적화와 대조적으로, 2개의 gRNAs로 표적화는 양쪽 대립유전자가 표적화된 인간화를 가졌던 동종접합성으로 표적화된 세포 (Hum/Hum), 어느 한쪽의 대립유전자도 인간화 LTVEC로 표적화되지 않았지만, 양쪽이 큰 결실을 가졌던 동종접합성으로 결실된 세포 (Δ/Δ), 그리고 하나의 대립유전자가 표적화된 인간화를 가졌고 다른 것이 큰 이중 gRNA/Cas9-유도된 결실을 가졌던 반접합성으로 표적화된 세포 (Hum/Δ)의 창출을 초래한다. 첫째, 우리는 양쪽 표적 대립유전자 (예를 들면, 표적화된 유전자 변형에 대하여 동형접합성이었던 세포)에서 정확한 및 동일한 초대 인간화를 가졌던 정확하게 표적화된 클론을 알아내었다. 우리가 Lrp5 인간화를 달성하기 위해 1개의 gRNA를 사용하였던 경우 동종접합성으로 표적화된 클론이 또한 관측되었어도, 이들은 우리가 2개의 gRNAs를 사용하였던 경우보다 훨씬 더 낮은 빈도에서 발생하였다 (참고 표 13). 마찬가지로, 우리는 C5 (Hc) 인간화 또는 Trpa1 인간화를 달성하기 위해 1개의 gRNA를 사용하는 경우 동형접합성 표적화를 관측하지 못했지만, 우리는 표적화 벡터로 2개의 gRNAs를 사용하는 경우 동형접합성 표적화를 관측하였다 (참고 표 15 및 18). 유사하게, 우리는 Lrp5 표적화, C5 (Hc) 표적화, Ror1 표적화, 및 Trpa1 표적화에 대하여 유전자 변형에 반접합성이었던 정확하게 표적화된 클론을 알아내었다 (즉, 이들은 1개의 대립유전자에서 정확하게 표적화된 인간화 그리고 다른 대립유전자에서 초대, 때때로 유전자 제거하는, 결실을 가졌다). 그와 같은 변형은 Lrp5, C5 (Hc), Ror1, 또는 Trpa1 인간화를 달성하기 위해 1개의 gRNA를 사용하는 경우 전혀 발생하지 않았다 (참고 표 13, 15, 17, 및 18, 각각).
둘째, 우리는 양쪽 표적화된 대립유전자에서 양쪽 gRNAs에 의해 유도된 Cas9 절단 사건에 의해 유도된 동일한 초대 결실 (>45 kb)를 가졌던 클론을 알아내었다 (즉, 세포는 표적 유전자좌에서 큰, 때때로 유전자-제거하는, 결실에 대하여 동형접합성이었다). 이들 유형의 돌연변이는 동일한 유전자에 관하여 표적화 벡터를 요구하지 않는다. 예를 들어, 표 15에서 나타낸 바와 같이, 우리는 gRNAs에 의해 표적화된 것과 관련없는 상이한 유전자에 관한 표적화 벡터와 Cas9 및 2개의 gRNAs 조합에 의해 동형접합성 CRISPR-유도된 결실을 가진 ES 세포를 수득하였다. 따라서, 2개의 gRNAs에 의해 유도된 Cas9 뉴클레아제는 표적화 벡터의 첨가 없이 세포에서 큰 결실을 유도할 수 있다. 그와 같은 경우에, 약물 내성 유전자를 발현시키는 벡터에 의해 제공된 일시적 또는 안정한 약물 선택은 DNA를 흡수하였던 ES 세포에 대하여 농축에 의한 희귀 동형접합성 결실 클론의 단리를 용이하게 할 수 있다.
실시예 6. 조합된 gRNAs에 의해 유도된 큰 결실의 분석.
조합된 gRNAs에 의해 유도된 큰 결실용 대립유전자 구조
추가의 서열 분석은 2개의 gRNAs에 의해 유도된 Cas9 절단 사건에 의해 유도된 큰 결실을 포함하는 클론에서 수행되었다 (참고 표 19). 이들 큰 결실은 우리가 gRNAs를 어느 한쪽 Lrp5 LTVEC 또는 거의 30 Mb 떨어져서 Ch25h 유전자를 표적하는 것과 조합시켰던 경우 대략 동일한 빈도에서 Lrp5 유전자좌에 큰 결실을 수득하였다는 점에서 동일한 유전자좌에서 LTVEC-지향된 상동 재조합 사건과 독립적인 것처럼 보였다 (데이터 도시되지 않음). 큰 결실을 특성규명하기 위해, 우리는 6 인간화로부터 40 클론, 15 반접합성 및 이중대립유전자 큰 결실을 가진 25에서 결실-스패닝 PCRs을 수행하였고, PCR 생성물의 개별 클론을 서열분석하였다. 서열은, 38 kb 내지 109 kb 범위이었던, 큰 결실을 확인하였다. 3개의 ES 세포 클론 (Lrp5 클론 AW-A8 및 BP-D3 및 Adamts5 클론 X-B11)은 예상된 Cas9 절단 부위 사이 완벽하게 수복된 정확한 결실 (68.2 kb)를 가졌고, 한편 하나의 클론 (Hc 클론 P-B12)는 38.1 kb 결실에 더하여 단일 염기 쌍 삽입을 가졌다. 27개의 ES 세포 클론은, 비-상동 말단 연결 (NHEJ)에 의한 부정확한 수복과 일치하는, Cas9 절단 부위를 넘어서 연장하였던 결실을 가졌다. 잔존 9개의 ES 세포 클론은 분명한 NHEJ-유도된 결실 및 삽입 (예를 들면, Lrp5 클론 BP-F6 및 Hc 클론 O-E4)를 조합시켰던 돌연변이를 가졌고, 이들 중 5개는 우리가 그것의 공급원 게놈 유전자좌에 맵핑할 수 있었던 200 bp 초과의 삽입을 가졌다 (데이터 도시되지 않음). Lrp5 클론 BO-E9에서 210 bp 삽입은 동원체 방향에서 gRNA F 표적 부위 외부에서 대략 2,600 bp 놓이는 동일한 서열에 관하여 역전된 배향이었다 (염색체 19 +, 3589138-3589347). 이러한 서열은 Lrp5 LTVEC의 긴 3' 상동성 아암에서 존재하였다. Lrp5 클론 BP-F6 및 BP-G7은 우리가 텔로미어 방향에서 Lrp5 로부터 30 Mb 떨어져서 Ch25h 유전자를 표적하였던 LTVEC 및 Cas9와 Lrp5 gRNAs A 및 F를 조합하였던 실험으로부터 유래되었다. 클론 BP-F6은 Ch25h 근처에서 서열에 동일하였던 그리고 또한 LTVEC (염색체 19+, 34478136-34478298)의 긴 아암에서 존재하였던 163 bp 단편에 연결된 벡터 백본의 부분에 동일한 103 bp 단편으로 구성되었다는 점에서 Ch25h LTVEC의 한쪽 말단으로부터 유래된 것처럼 보였던 266 bp 삽입을 가졌고; 이러한 단편은 내인성 염색체 서열에 관하여 역전된 배향으로 결실에 삽입되었다. Hc 클론 O-E4는 gRNA A 인식 서열로부터 대략 3.1 kb 떨어져서 결실된 서열 이내 발견된 동일한 서열에 관하여 역전되었던 254 bp 삽입을 가졌다. Hc 클론 S-D5에서 1,304 bp 삽입은 2 단편으로 구성되었다: 예상된 gRNA E2-지향된 Cas9 절단 부위로부터 대략 1.4 kb 떨어져서 결실된 서열 이내 발견된 동일한 서열로서 동일한 배향이었던 1,238 bp 피스 그리고 gRNA E2 커트 부위의 25 bp 외부에서 동일한 서열의 역전된 배향으로 중복이었던 제2 66 bp 피스.
Figure pct00023
Figure pct00024
동형접합성 대립유전자에서 유전자 변환용 증거
이중대립유전자 큰 결실을 가진 25 ES 세포 클론 중 24개는, 이들이 동형접합성 대립유전자인 것을 나타내는, 단지 단일, 특유의 서열을 가졌다 (표 19). Hc 클론 S-A11에 대하여, 우리는 12 PCR 클론 중 11에서 동일한 서열을 알아내었다. 상이한 서열을 가진 단일 클론은 2개의 상이한 결실 대립유전자를 시사할 수 있지만, 우리는 2개의 Hc 반접합성 클론, N-D11 및 O-F12에 대하여 동일한 결과를 또한 알아내었다. 다중 클론에서 구별되는 동형접합성 결실 대립유전자는 하나의 염색체에서 결실이 상동 염색체에서 Cas9 절단의 상동 재조합 수복용 템플레이트로서 기능하였다는 유전자 변환 기전에 의해 이들이 발생하였다는 것을 제안하였다. 우리는 VGF1 ES 세포주의 129S6SvEvTac (129) 및 C57BL/6NTac (B6) F1 하이브리드 조성물을 활용하였다 (Poueymirou 등 (2007) Nat. Biotechnol. 25:91-99; Valenzuela 등 (2003) Nat. Biotechnol. 21:652-659) 이형접합성의 손실로서 유전자 변환을 검정하기 위해 (Lefebvre 등 (2001) Nat. Genet. 27:257-258) 염색체 19에서 Lrp5 유전자좌 (아래 사용된 5 SV 검정 및 10 SNV 검정에 대하여 도 12 참고) 주위 균주와 염색체 2에서 Hc 유전자좌 (도시되지 않음) 사이 구조적 (SV) 및 단일 뉴클레오타이드 (SNV) 변이체에 대하여.임의의 이형접합성의 손실이 전체의 염색체 손실의 결과가 아니었음을 확인하기 위해, 우리는 129와 B6 균주 사이 동일하였던 부위에서 염색체 카피 수 (CCN) 검정을 수행하였다. Lrp5 인간화된 또는 결실된 대립유전자에 대하여 우리는 텔로미어 방향에서 Lrp5부터 염색체 19의 긴 아암의 말단까지 1.2 Mb 떨어져서 배치된 다중 SVs 및 SNVs를 분석하였다 (도 12). 동원체에 가까운 Lrp5의 정위 때문에, 우리는 유전자의 동원체 부위에서 SVs 없음 및 단 하나의 SNV를 알아내었다. Hc에 대하여, 우리는 염색체 2에서 유전자의 어느 한쪽에서 다중 SVs 및 SNVs에 대하여 검정할 수 있었다 (도시되지 않음). Lrp5 클론 중 6개에 대한 결과는 도 15A-E 및 16A-C에서 보여진다.
도 15A-E는, 위치가 Lrp5 부터 13.7 Mb 떨어져서 내지 긴 아암의 텔로미어 말단 근처에서 56.7 Mb 떨어져서 범위인, 5 SV 검정에 대하여 결과를 보여준다. 5 SV 검정은 129, B6, 및 VGF1 대조군에서 129 (더 큰) 및 B6 (더 작은) 대립유전자에 대하여 2개의 상이한 크기의 생성물을 생산하였다. 염색체 19 지도에서 SV 검정의 대략적 위치는 도 12에서 보여진다 (참고 검정 SV 13.7, 검정 SV 20.0, 검정 SV 36.9, 검정 SV 48.3, 및 검정 SV 56.7). 검정 수는 Lrp5에 텔로미어 Mb의 수를 나타낸다. 이들 검정용 프라이머는 표 1에서 보여지고, 그 결과는 도 15A-E에서 보여진다. 2개의 클론, BC-H9 (Lrp5 Hum/Hum, gRNA B2) 및 BR-B4 (Lrp5 Hum/Hum, gRNA D)는 모든 B6 SV 대립유전자를 유지하였던 이형접합성의 손실을 표시하였고, 한편 제3 클론, B0-A8 (Lrp5 Hum/Hum, gRNAs A + F)는 모든 129 대립유전자를 유지시켰다. 다른 3개의 클론, BO-F10 (Lrp5 Hum /Hum, gRNAs A + F), BO-G11 (Lrp5 Hum/Hum, gRNAs A + F), 및 BP-G7 (Lrp5 Δ /Δ, gRNAs A + F)는 이형접합성으로 남아있었다.
게다가, 129와 B6 대립유전자 사이 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNVs)는 TAQMAN® 대립유전자 식별 검정에 의해 분석되었다. 도 12내 염색체 19 지도에서 SNV 검정의 대략적 위치는 아래의 검정 수를 가진 화살촉에 의해 보여지고, Lrp5 유전자좌로부터 (Mb로) 그것의 거리는 아래 주어진다. Lrp5 유전자좌로부터 (Mb로) 거리는 아래와 같다: Lrp5 (C2)의 0.32 동원체, Lrp5 (T3)의 1.2 텔로미어, Lrp5 (T6)의 11.1 텔로미어, Lrp5 (T7)의 13.2 텔로미어, Lrp5 (T8)의 17.5 텔로미어, Lrp5 (T9)의 25.8 텔로미어, Lrp5 (T10)의 33.0 텔로미어, Lrp5 (T11)의 38.3 텔로미어, Lrp5 (T13)의 49.6 텔로미어, 및 Lrp5 (T14)의 57.2 텔로미어. 129-특이적 및 B6-특이적 프로브 및 프라이머 쌍은 표 1에서 보여진다. SV 검정에 의해 텔로미어 이형접합성 손실 (LOH)를 보여주었던 3개의 클론 (BC-H9, BO-A8, 및 BR-B4)에 대한 결과는 도 16A-C에서 보여진다. SNV 검정 (도 16A-C 및 데이터 도시되지 않음)은 Lrp5 의 텔로미어 측에서 염색체 19의 긴 아암에 대해 유전자 변환 사건을 확인하였지만 (SNV 1.2 및 SNV 57.2; 참고 도 16B 및 도 16C, 각각), SNV 0.32 검정 (참고 도 16A)는 모든 클론이 동원체 측에서 Lrp5 로부터 320 kb 떨어져서 대립유전자에 대하여 이형접합성으로 남아있었다는 것을 보여주었다. 분석된 24 Lrp5 Hum/Hum 또는 Lrp5 Δ /Δ 클론 중에서, 우리는 Lrp5의 텔로미어 측에서 염색체 19의 전체 긴 아암에 대해 이형접합성의 손실의 증거를 가졌던 6개를 알아내었다. 5개의 클론 (4 Lrp5 Hum/Hum 및 1 Lrp5 Δ /Δ)는 이형접합성부터 동형접합성 B6까지 전환하였고, 한편 6번째 클론 (Lrp5 Hum/Hum)은 동형접합성 129로 전환하였다. CCN 검정은 염색체 19의 2 카피의 유지를 실증하였다. 21개의 Hc 동형접합성 클론에 대하여 유사한 이형접합성의 손실 검정은 2개, R-E2 (Hc Hum/Hum, gRNAs A + F) 및 R-E8 (Hc Δ /Δ, gRNAs A + F)가 동원체 측에서 모든 대립유전자에 대하여 이형접합성을 남겨두는 동안 Hc 유전자의 텔로미어 측에서 모든 SVs 및 SNVs에 대하여 동형접합성 129에 대해 이형접합성의 손실을 보여주었다는 것을 드러냈다. CCN 검정은 염색체 2의 손실 없음을 나타냈다.
우리의 결과는 CRISPR/Cas9이, 대규모 게놈 조작에 대하여 가능성을 팽창시키는, 100 kb 초과의 큰 단일-단계 인간화에 대하여 상동성-지향된 수복을 향상시킬 수 있다는 것을 최초로 실증한다. LTVECs 및 gRNA/Cas9 조합의 가장 현저한 및 예기치 못한 이점은 동형접합성 표적화된 인간화를 촉진시키기 위한 그것의 능력이었다. 이중대립유전자 돌연변이 및 동형접합성 표적화 사건이 다른 CRISPR/Cas9 실험에서 보고되었어도, 대부분의 이들 유전자 변형 및 삽입은 우리의 인간화된 대립유전자보다 더 작은 자릿수이었다. CRISPR/Cas9의 사용에 앞서, 우리는 LTVEC에 의한 동형접합성 표적화를 결코 발견하지 못했고, 우리가 다중 LTVECs 표적화 별개의 유전자를 조합하였던 경우 1 초과 유전자의 동시 표적화를 볼수 없었다. 이러한 경험을 가정하면, gRNA/Cas9-유도된 동형접합성 표적화는 양쪽 대립유전자를 별도로 표적하는 2개의 LTVECs 보다는, 1개의 대립유전자에서 초기 표적화 사건이 하나 이상의 Cas9 커트에 의해 촉진된 다른 대립유전자의 상동 변환용 템플레이트로서 기능할 수 있다는 것을 제안하였다. 이중 gRNA/Cas9-유도된 큰 이중대립유전자 결실이 또한 동형접합성 (표 19)이었다는 공개는 유전자 변환 기전을 위하여 추가 뒷받침을 제공하였다.
이형접합성의 손실 검정 (도 12)는 표적 유전자의 텔로미어 측에서 염색체의 큰 단편을 피복시키는 다중 대립유전자의 대규모 유전자 변환이 동형접합성 인간화 및 큰 결실의 일부를 책임진다는 것을 실증하였다. 이러한 유형의 광범위 지향성 유전자 변환은 세포 사이클의 G2기에서 상동 염색체의 복제된 염색분체 사이 유사분열 재조합과 일치한다 (Lefebvre 등 (2001) Nat. Genet. 27:257-258) (도 17A-C). 소수의 동형접합성 사건만을 설명하였어도, 이러한 기전은 gRNA/Cas9 절단이 큰 부분의 염색체에 비해 다중 대립유전자에 대하여 이형접합성부터 동형접합성까지 대규모 변환을 촉진시키는데 사용될 수 있는 수단을 제공할 수 있다. 대부분의 동형접합성 사건은, 하지만, 기전이 추가 조사를 받을만한 국부 유전자 변환의 결과이었던 것처럼 보인다.
광범위 지향성 유전자 변환을 위한 추가 증거는 Lrp5 gRNAs A 및 F를 인코딩하는 플라스미드, Cas9를 인코딩하는 플라스미드, 및 텔로미어 방향에서 Lrp5 로부터 30 Mb 떨어져서 Ch25h 유전자를 표적하였던 LTVEC로 (50% 129SvS6 균주 및 50% C57BL/6N 균주로 구성되는) F1H4 하이브리드 ES 세포 전기천공 후 수득된 3개의 클론의 분석에 의해 제공되었다. 3개의 클론은 (5' 말단에서 500 bp 그리고 3' 말단에서 2 kb 떨어져서) 2 gRNAs 사이 예상된 결실 내부에서 TAQMAN® 검정을 사용하여 1차 스크리닝 이후 야생형으로 초기에 채점하였지만, 129와 B6 대립유전자 사이 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNVs)를 검정하는 후속적인 TAQMAN® 대립유전자 식별 검정은 이형접합성의 손실을 놀랍게도 드러냈다. 사용된 SNV 검정은 1 동원체 검정 (SNV 0.32) 및 2 텔로미어 검정 (SNV 1.2 및 SNV 57.2)이었다 (참고 도 12). 표 20에서 나타낸 바와 같이, 동원체 SNV 검정 (0.32 Mb)는 모두 3개의 클론에서 이형접합성의 유지를 확인하였다. 하지만, 양쪽 텔로미어 SNV 검정은 BP-E7 및 BP-H4가 129 대립유전자에 대하여 동형접합성이었다는 것을 보여주었고, 양쪽 텔로미어 SNV 검정은 BP-E6이 B6 대립유전자에에 대하여 동형접합성이었다는 것을 보여주었다. 모두 3개의 클론은 염색체 19의 2 카피의 유지를 보여주었고, 모두 3개의 클론은 LTVEC 표적화에 대하여 유전자도입성이었다 (즉, Ch25h 유전자좌는 표적화되었이다). 이들 결과는 표적된 CRISPR/Cas9 절단을 사용하여 강제된 동형접합성으로 가능성을 개방한다.
Figure pct00025
몇 개의 가능한 기전은 (50% 129SvS6 균주 및 50% C57BL/6N 균주로 구성되는) 마우스 F1H4 하이브리드 ES 세포내 CRISPR/Cas9-보조된 LTVEC 인간화 실험에서 관측된 결과를 설명할 수 있다 (참고 도 18A-F). 그와 같은 기전은 유사분열 교차에 의한 상호 염색분체 교환 (참고 도 18A-C), 또는 파단-유도된 복제에 의한 염색분체 카핑 (참고 도 18D-E)를 통해 발생할 수 있다. 어느 경우에나, 어느 한쪽 129 염색체 또는 B6 염색체가 게놈 복제 전 LTVEC에 의해 표적되는 이형접합성 변형은 발생할 수 있다 (참고 도 18A 및 18D). 대안적으로, 단일 129 염색분체 또는 단일 B6 염색분체는 게놈 복제 후 LTVEC에 의해 표적될 수 있고, 이어서 염색분체간 유전자 변환될 수 있다 (참고 도 18B 및 18E). 대안적으로, 표적 게놈 유전자좌에서 LTVEC 표적화의 부족이 있을 수 있지만, Cas9 절단은 어느 한쪽 129 또는 B6 염색체에서 발생할 수 있다 (참고 도 18C 및 18F). 이러한 후자의 가능성은 BP-E7, BP-H4, 및 BP-E6 클론에서 보여진 결과를 설명할 수 있다. 잠재적인 결과는 도 18A-F에서 보여진다. 도 18F에 대하여, Cas9가 129 염색분체를 절단시키면 B6 대립유전자를 유지하는 이형접합성의 손실 (LOH)를 관찰하는 것이 또한 가능하다. 상기 기재된 실험에서, 표적되는 양쪽 대립유전자 (Hum/Hum) 또는 야생형 대립유전자 (+/+)인 양쪽 대립유전자를 초래하는 이형접합성의 손실 사건은 관측되었다.
실시예 7. B6과 129 대립유전자 사이 최소 변이를 가진 유전자용 동형접합성 표적화.
몇 개의 다른 유전자좌는 동형접합성 표적화에 대하여 또한 시험되었다. 또 다른 실험에서, LTVEC는 마우스 Adamts5 (트롬보스폰딘 모티프 5를 가진 디신테그린 및 메탈로프로테이나제) 유전자의 38 kb 결실 및 인간 ADAMTS5 유전자의 43 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다. LTVEC는 결실로 의도된 마우스 Adamts5 유전자의 38 kb 서열을 측접하는 마우스 Adamts5 유전자좌의 부분으로부터 유래된 게놈 DNA의 22 kb 및 46 kb를 함유하는 상동성 아암에 의해 측접된 인간 ADAMTS5 유전자의 43 kb 단편을 포함하였다. 별개의 실험에서, 우리는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 Adamts5 유전자의 영역 이내 이중 가닥 절단을 창출하도록 설계된 8개의 sgRNAs (gA, gA2, gB, gC, gD, gE, gE2, 및 gF) 중 1개 또는 2개를 인코딩하는 제2 플라스미드 또는 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 Adamts5 인간화 LTVEC를 조합시켰다. sgRNAs는 인간 ADAMTS5의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다.
Adamts5 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화의 결과는 표 21에서 보여진다. LTVEC 단독이 ES 세포에 도입되었던 경우, 우리는 96 스크리닝된 약물 내성 클론의 어느 것도 정확하게 표적화된 단일대립유전자 이형접합성 인간화된 대립유전자를 운반하지 못했다는 것을 알아내었다. 그에 반해서, 8개의 시험된 sgRNAs 중 2개 (B 및 F; 참고 표 1)에 의해 유도된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC 조합은 1.0%의 효율에서 정확하게 표적화된 단일대립유전자 이형접합성 돌연변이 또는 이중대립유전자 화합물 이형접합성 돌연변이를 생산하였다. 동형접합성 표적된 변형은 관측되지 않았다. 추가의 실험에서, gRNAs A2 및 E2는 또한 조합되었지만, 여전히 동형접합성 표적화는 관측되지 않았다.
Figure pct00026
또 다른 실험에서, LTVEC는 마우스 Dpp4 (디펩티딜 펩티다아제 4) 유전자의 79 kb 결실 및 상동 인간 DPP4 유전자의 82 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다. LTVEC는, 결실로 의도된 마우스 Dpp4 유전자의 79 kb 서열을 측접하는 마우스 Dpp4 유전자좌의 부분으로부터 유래된 게놈 DNA의 46 kb를 각각 함유하는, 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 인간 DPP4 유전자의 82 kb 단편을 포함하였다. 별개의 실험에서, 우리는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 Dpp4 유전자의 영역 이내 이중 가닥 절단을 창출하도록 설계된 8개의 sgRNAs (gA, gB, gB2, gC, gD, gE, gE2, 및 gF) 중 1개 또는 2개를 인코딩하는 제2 플라스미드 또는 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 Dpp4 인간화 LTVEC를 조합시켰다. sgRNAs는 인간 DPP4 유전자의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다.
Dpp4 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화의 결과는 표 22에서 보여진다. LTVEC 단독이 ES 세포에 도입되었던 경우, 우리는 스크리닝된 약물 내성 클론의 2.1%가 정확하게 표적화된 단일대립유전자 이형접합성 인간화된 대립유전자를 운반하였다는 것을 알아내었다. 그에 반해서, 8개의 시험된 sgRNAs (A, B, B2, C, D, E, E2, 및 F; 참고 표 1) 중 어느 하나에 의해 유도된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC 조합은 2.1 내지 7.3% 범위이었던 효율성에서 정확하게 표적화된 단일대립유전자 이형접합성 돌연변이를 생산하였다. 동형접합성 표적된 변형은 관측되지 않았다. 추가의 실험에서, gRNAs A 및 F 또는 gRNAs A 및 D는 조합되었지만, 여전히 동형접합성 표적화는 관측되지 않았다.
Figure pct00027
또 다른 실험에서, LTVEC는 마우스 Folh1 (글루타메이트 카복시펩티다아제 2) 유전자의 55 kb 결실 및 상동 인간 FOLH1 유전자의 61 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다. LTVEC는 결실로 의도된 마우스 Folh1 유전자의 55 kb 서열을 측접하는 마우스 Folh1 유전자좌의 부분으로부터 유래된 게놈 DNA의 22 kb 및 46 kb를 함유하는 상동성 아암에 의해 측접된 인간 FOLH1 유전자의 61 kb 단편을 포함하였다. 별개의 실험에서, 우리는 결실에 대하여 표적화되었던 마우스 Folh1 유전자의 영역 이내 이중 가닥 절단을 창출하도록 설계된 8개의 sgRNAs (gA, gA2, gB, gC, gD, gF, gE, 및 gE2) 중 1개 또는 2개를 인코딩하는 제2 플라스미드 또는 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 Folh1 인간화 LTVEC를 조합시켰다. sgRNAs는 인간 FOLH1 유전자의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다.
Folh1 유전자의 CRISPR/Cas9-보조된 인간화의 결과는 표 23에서 보여진다. LTVEC 단독이 ES 세포에 도입되었던 경우, 우리는 96 스크리닝된 약물 내성 클론의 어느 것도 정확하게 표적화된 단일대립유전자 이형접합성 인간화된 대립유전자를 운반하지 못했다는 것을 알아내었다. 그에 반해서, 6개의 시험된 sgRNAs 중 3개 (A, D, 및 E2; 참고 표 1)에 의해 유도된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC 조합은 1.0 내지 3.1% 범위이었던 효율성에서 정확하게 표적화된 단일대립유전자 이형접합성 돌연변이를 생산하였다. 동형접합성 표적된 변형은 관측되지 않았다. 추가의 실험에서, gRNAs A 및 E2 또는 gRNAs A 및 D는 조합되었지만, 여전히 동형접합성 표적화는 관측되지 않았다.
Figure pct00028
상이한 유전자좌를 표적하는 경우 관측된 동형접합성 표적된 클론의 요약은 표 24에서 제공된다.
Figure pct00029
이들 실험에서, 동형접합성 표적화는 B6과 129 대립유전자 사이 최소 서열 변이를 가진 유전자에 대하여 최고이었다. 이것은 도 19-25에서 실증된다. 각각의 도에 있는 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)을 나타낸다. 예를 들어, Lrp5 (참고 도 19)에 대하여, LTVEC의 상동성 아암은 129 게놈에 기반하여 설계되었다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주, 그리고 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주에 비교되었다. 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다. 도 20-25는 Hc, Trpa1, Adamts5, Folh1, Dpp4, Ror1, 및 CD3, 각각에 유사한 분석을 제공한다.
표 24 및 도 19-25에서 나타낸 바와 같이, 동형접합성 표적화된 클론의 최고 수는 Lrp5 유전자좌 (12개의 동형접합성 클론) 및 Hc/C5 유전자좌 (4개의 동형접합성 클론)에서 생산되었다. 각각의 이들 표적 게놈 유전자좌는, 특히 결실 및 대체로 의도된 영역을 측접하는 또는 gRNA 인식 서열에서 또는 근처에서 아주 적은 단일 뉴클레오타이드 변이를 가졌다 (참고 도 19 (Lrp5) 및 20 (C5)).
그에 반해서, 동형접합성 표적화는 B6과 129 대립유전자 사이, 특히 결실 및 대체로 의도된 영역을 측접하는 또는 gRNA 인식 서열에서 또는 근처에서, 대립유전자 서열 변이의 고 밀도를 가진 유전자에 대하여 낮거나 부재이었다. 예를 들어, 동형접합성 클론은 Adamts5, Folh1, Dpp4, 또는 Ror1 유전자좌를 표적하는 경우 생산되지 않았다 (도 22-25, 각각). 하지만, 동형접합성 클론은 Trpa1 유전자좌를 표적하는 경우 생산되었고, 이는 결실 및 대체로 의도된 영역의 대립유전자 서열 변이 3'의 고 밀도 그러나 (즉, 5' gRNA 인식 서열에서 또는 근처에서) 결실 및 대체로 의도된 영역의 대립유전자 서열 변이 5'의 낮은 밀도를 갖는다 (도 21).
실시예 8. 상동 염색체 쌍에서 각각의 염색체에 대해 설계된 표적화 벡터의 사용은 동형접합성 표적화를 증가시키지 않는다.
동형접합성 표적된 변형이 상동 염색체 쌍내 각각의 염색체에서 독립적인 표적화 사건을 통해 또는 상동 염색체 쌍내 하나의 염색체에서 표적화 사건 및 그 다음 상동 염색체 쌍 사이조차 이형접합성의 유전자 변환 또는 손실을 통해 생성되고 있었는지를 추가로 시험하기 위해, 결실 및 대체로 의도된 영역을 측접하는 또는 gRNA 인식 서열에서 또는 근처에서 상동 염색체 쌍 사이 다량의 대립유전자 서열 변이를 갖는 또 다른 게놈 유전자좌는 표적화되었이다. 참고, 예를 들면, 도 26. 이것은 우리가 동형접합성 붕괴 또는 동형접합성 표적화에서 대립유전자 변이의 효과를 검사하게 만들었다. 점으로 된 수직선 내부 영역은 표적화된 영역 (LTVEC의 5' 및 3' 표적 서열 내부 영역)이다. 단일 뉴클레오타이드 변이 결정용 참조 서열은 Jackson Laboratory로부터 C57BL/6J 마우스 균주의 게놈 서열이었다. 이러한 참조 서열은 Taconic Biosciences로부터 129S6/SvEv 균주 MP 변이체, Taconic Biosciences로부터 C57BL/6N 균주 RGC 변이체, 및 (도의 최하부 부분에서 3열로 표시되는) 129S6/SvEv 균주 및 C57BL/6N 균주로부터 생산된 VGF1 하이브리드 세포주와 비교되었다. 각각의 3 열에서 수직선은 참조 서열에 비교된 단일 뉴클레오타이드 변이를 나타낸다.
이 실험에서, 2개의 LTVECs는 마우스 유전자좌의 33 kb 결실 및 인간 분절 사이 마우스 유전자좌의 개입 분절을 가진 오쏘로그성 인간 유전자의 3개의 분절 (6.8 kb, 0.1 kb, 및 1.7 kb)를 포함하는 34.5 kb 단편으로 동시 대체를 창출하도록 설계되었다. 실험은 하기로 수행되었다: VGF1 (F1H4), 우리의 C57BL6NTac/129S6SvEvF1 하이브리드 XY ES 세포주 (Poueymirou 등 (2007) Nat. Biotechnol. 25:91-99; Valenzuela 등 (2003) Nat. Biotechnol. 21:652-659). ES 세포는 이전에 기재된 바와 같이 배양되었다 (Matise 등 (2000) in Joyner, A.L. ed. Gene Targeting: a practical approach, pp. 100-132, Oxford University Press, New York). VGF1 세포는 C57BL6(XB6)/129S6(Y129) 마우스를 생산하기 위해 숫컷 129S6/SvEvTac 마우스와 암컷 C57BL/6NTac 마우서 교배에 의해 창출되었다. 참고 도 7.
하나의 LTVEC는 VGF1 세포에서 129 염색체에 대해 설계된 상동성 아암을 가졌고 Neo 선택 카셋트 (MAID # 7170)을 포함하였고, 다른 LTVEC는 C57BL6 염색체에 대해 설계된 상동성 아암을 가졌고 Hyg 선택 카셋트 (MAID # 7314)를 포함하였다. 2개의 LTVECs는 달리 동일한 것이었다.
별개의 실험에서, 우리는 결실로 표적화되었던 마우스 유전자의 영역 이내 이중 가닥 절단을 창출하도록 설계된 4개의 sgRNAs (mGU, mGU2, mGD, mGD2)를 인코딩하는 제2 플라스미드 또는 플라스미드 및 Cas9를 인코딩하는 플라스미드와 2개의 인간화 LTVECs를 조합시켰다. sgRNAs는 인간 유전자의 삽입된 부분에서 임의의 서열의 인식을 회피하도록 설계되었다.
총 192 Neo+ 클론, 128 Hyg+ 클론, 및 16 Neo+/Hyg+ 클론은 스크리닝되었다. 4개의 sgRNAs에 의해 유도된 Cas9 엔도뉴클레아제와 LTVEC 조합은 일부 이형접합성 표적화된 클론, 반접합성 표적화된 클론, 이중대립유전자 붕괴된 클론, NHEJ 결실을 가진 이형접합성 표적화된 클론, 이중대립유전자 NHEJ 결실을 가진 클론, 및 NHEJ 결실을 가진 이형접합성 붕괴된 클론을 생산하였다. 하지만, 동형접합성 표적된 클론은 관측되지 않았다. 이것은 국부 유전자 변환 사건이 상동 염색체 쌍 이내 각각의 염색체에서 별개의 표적화 사건보다는 다른 실험에서 관측된 동형접합성 표적화된 클론을 책임진다는 것을 시사한다. 상동 염색체 쌍 이내 각각의 염색체에서 독립적인 표적화 사건이 다른 실험에서 관측된 동형접합성 표적된 클론을 책임졌다면, 상동 염색체 쌍 이내 2 염색체의 각각에 대하여 특이적으로 맞추어진 2 표적화 벡터의 사용은, 각각의 염색체에 대하여 맞추어진 표적화 벡터가 5' 및 3' 표적 서열 이내 대립유전자 서열 변이를 다루기 때문에, 5' 및 3' 상동성 아암용 5' 및 3' 표적 서열 이내 대립유전자 서열 변이의 높은 백분율에도 불구하고 동형접합성 표적된 클론을 생산하는 것이 기대될 것이다. 하지만, 2개의 LTVECs의 사용은 임의의 동형접합성 표적된 클론을 생산하지 못했다. 이것은 변형을 동형접합성 표적하였던 또는 도 27에서 묘사된 바와 같이 국부 유전자 변환 사건을 통해 생산하였던 아이디어를 추가로 지지한다. 우리는 극성 유전자 변환보다 더 높은 비율로 표적된 결실 및 삽입의 양쪽에서 이형접합성의 국부 손실을 관측하였다.
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> METHODS FOR BREAKING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE USING MULTIPLE GUIDE RNAS <130> 057766/497023 <150> 62/339,472 <151> 2016-05-20 <150> 62/368,604 <151> 2016-07-29 <160> 152 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(21) <223> n = A, T, C, or G <400> 1 gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> n = A, T, C, or G <400> 2 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA recognition sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(23) <223> n = A, T, C, or G <400> 3 ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngg 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 (Hc) gRNA A DNA-targeting segment (100 bp from target locus endpoint) <400> 4 atcacaaacc agttaaccgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 (Hc) gRNA B DNA-targeting segment (500 bp from target locus endpoint) <400> 5 tttcagacga gccgacccgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 (Hc) gRNA C DNA-targeting segment (38200 and 37500 bp from target locus endpoints) <400> 6 tgtgtgtcat agcgatgtcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 (Hc) gRNA D DNA-targeting segment (43500 and 32200 bp from target locus endpoints) <400> 7 aacaggtacc ctatcctcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 (Hc) gRNA E DNA-targeting segment (500 bp from target locus endpoint) <400> 8 ggcccggacc tagtctctct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 (Hc) gRNA E2 DNA-targeting segment (100 bp from target locus endpoint) <400> 9 tcgtggttgc atgcgcactg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA A DNA-targeting segment (50 bp from target locus end point) <400> 10 gggaacccac agcatactcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA B DNA-targeting segment (500 bp from target locus end point) <400> 11 gaatcatgca cggctacccc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA B2 DNA-targeting segment (1000 bp from target locus end point) <400> 12 tgctcctatg gggaggcgcg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA C DNA-targeting segment (29900 and 38430 bp from target locus end points) <400> 13 actgagatca atgaccccga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA D DNA-targeting segment (29950 and 38380 bp from target locus end points) <400> 14 gggtcgcccg gaacctctac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA E2 DNA-targeting segment (1000 bp from target locus end point) <400> 15 cttggataac attgataccc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA E DNA-targeting segment (500 bp from target locus end point) <400> 16 ggggcagagc ccttatatca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lrp5 gRNA F DNA-targeting segment (50 bp from target locus end point) <400> 17 tcgctcacat taatccctag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ror1 gRNA A DNA-targeting segment (200 bp from target locus end point) <400> 18 tgtgggcctt tgctgatcac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ror1 gRNA B DNA-targeting segment (1000 bp from target locus end point) <400> 19 aatctatgat cctatggcct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ror1 gRNA D DNA-targeting segment (54300 and 55500 bp from target locus end points) <400> 20 tgccaatagc agtgacttga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ror1 gRNA C DNA-targeting segment (54500 and 55300 bp from target locus end points) <400> 21 gggaagaatg ggctattgtc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ror1 gRNA E DNA-targeting segment (1000 bp from target locus end point) <400> 22 ggttgtttgt gctgatgacg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ror1 gRNA F DNA-targeting segment (200 bp from target locus end point) <400> 23 ccgtcctagg ccttctacgt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA A DNA-targeting segment (100 bp from target locus end point) <400> 24 gtactgggga atcggtggtc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA A2 DNA-targeting segment (500 bp from target locus end point) <400> 25 cacgcactcc aaatttatcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA B DNA-targeting segment (1000 bp from target locus end point) <400> 26 ctaagtgtgt atcagtacat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA C DNA-targeting segment (25600 and 19740 bp from target locus end points) <400> 27 tgccctgcac aataagcgca 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA D DNA-targeting segment (26970 and 18370 bp from target locus end points) <400> 28 actcattgaa acgttatggc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA E2 DNA-targeting segment (1000 bp from target locus end point) <400> 29 agtaagggtg gattaaattc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA E DNA-targeting segment (500 bp from target locus end point) <400> 30 gccatctaga ttcatgtaac 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trpa1 gRNA F DNA-targeting segment (100 bp from target locus end point) <400> 31 gactagaaat gttctgcacc 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190045 forward primer <400> 32 gagctcatag ccaacagctt g 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190061 forward primer <400> 33 atgcatcaga tcacgctcag 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190068 forward primer <400> 34 gtccttgtgg catttccaac 20 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190030 forward primer <400> 35 ccagtatggt gtcagttaat agcg 24 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190033 forward primer (same as forward primer for SV 48.3 in Fig. 6) <400> 36 ctgtgcagaa agcagcctc 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190013 forward primer <400> 37 cctctccctc taggcacctg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190045 reverse primer <400> 38 tctttaaggg ctccgttgtc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190061 reverse primer <400> 39 aagaccaacc attcacccag 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190068 reverse primer <400> 40 ttcccagtcc aagtcaaagg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190030 reverse primer <400> 41 ctgttatctg caaggcaccc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190033 reverse primer (same as reverse primer for SV 48.3 in Fig. 6) <400> 42 acaactggat cctgattcgc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 190013 reverse primer <400> 43 taagagggca tgggtgagac 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 probe (B6) - SNV 0.32 in Fig. 6 <400> 44 aattcagaag acctatcgta 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 probe (B6) - SNV 1.2 in Fig. 6 <400> 45 tatgtgtata ggtgtttgga t 21 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T6 probe (B6) - SNV 11.1 in Fig. 6 <400> 46 tacattgcta aatgaaacc 19 <210> 47 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 probe (B6) - SNV 13.2 in Fig. 6 <400> 47 cgcagtcatg cacata 16 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 probe (B6) - SNV 17.5 in Fig. 6 <400> 48 ttataaagcc cagtatgtac 20 <210> 49 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T9 probe (B6) - SNV 25.8 in Fig. 6 <400> 49 tgctgcataa tcag 14 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 probe (B6) - SNV 33.0 in Fig. 6 <400> 50 tcaggagtga attggata 18 <210> 51 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T11 probe (B6) - SNV 38.3 in Fig. 6 <400> 51 ctgctactta cctttg 16 <210> 52 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T13 probe (B6) - SNV 49.6 in Fig. 6 <400> 52 aggaggaaaa cgc 13 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T14 probe (B6) - SNV 57.2 in Fig. 6 <400> 53 cctttgttcc tcataag 17 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 probe (129) - SNV 0.32 in Fig. 6 <400> 54 aattcagaag acctattgta 20 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 probe (129) - SNV 1.2 in Fig. 6 <400> 55 tatgtgtata ggtgtttgca t 21 <210> 56 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T6 probe (129) - SNV 11.1 in Fig. 6 <400> 56 cattgctaca tgaaac 16 <210> 57 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 probe (129) - SNV 13.2 in Fig. 6 <400> 57 cgcagtcatg cacgta 16 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 probe (129) - SNV 17.5 in Fig. 6 <400> 58 tgagaattta taaagcccaa tat 23 <210> 59 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T9 probe (129) - SNV 25.8 in Fig. 6 <400> 59 tgctgcatga tcag 14 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 probe (129) - SNV 33.0 in Fig. 6 <400> 60 tcaggagtga atcgg 15 <210> 61 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T11 probe (129) - SNV 38.3 in Fig. 6 <400> 61 ctgctagtta cctttg 16 <210> 62 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T13 probe (129) - SNV 49.6 in Fig. 6 <400> 62 aggaggaaga cgcag 15 <210> 63 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T14 probe (129) - SNV 57.2 in Fig. 6 <400> 63 ctttgttctt cataagc 17 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 forward primer - SNV 0.32 in Fig. 6 <400> 64 atgagggatt tccttaatca gacaa 25 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 forward primer - SNV 1.2 in Fig. 6 <400> 65 tggtatgttt attcttactc aaggttttg 29 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T6 forward primer - SNV 11.1 in Fig. 6 <400> 66 gggcaactga tggaaagaac tc 22 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 forward primer - SNV 13.2 in Fig. 6 <400> 67 gactgacgca caaacttgtc ctt 23 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 forward primer - SNV 17.5 in Fig. 6 <400> 68 cccaaagcat ataacaagaa caaatg 26 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T9 forward primer - SNV 25.8 in Fig. 6 <400> 69 gcaggacgca ggcgttta 18 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 forward primer - SNV 33.0 in Fig. 6 <400> 70 gcatcctcat ggcagtctac atc 23 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T11 forward primer - SNV 38.3 in Fig. 6 <400> 71 cctgcccctt gatgagtgtt 20 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T13 forward primer - SNV 49.6 in Fig. 6 <400> 72 ccctctttga tatgctcgtg tgt 23 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T14 forward primer - SNV 57.2 in Fig. 6 <400> 73 tcccacaggt ccatgtcttt aa 22 <210> 74 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 reverse primer - SNV 0.32 in Fig. 6 <400> 74 agactacaat gagctaccat cataaggt 28 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 reverse primer - SNV 1.2 in Fig. 6 <400> 75 caaccatcta aaactccagt tcca 24 <210> 76 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T6 reverse primer - SNV 11.1 in Fig. 6 <400> 76 tgtgtaacag gacagttgaa tgtagaga 28 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 reverse primer - SNV 13.2 in Fig. 6 <400> 77 cttaaaaccc gccctgcat 19 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T8 reverse primer - SNV 17.5 in Fig. 6 <400> 78 ctacaggaga tgtggctgtt ctatgt 26 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T9 reverse primer - SNV 25.8 in Fig. 6 <400> 79 tcagcgtgat tcgcttgtag tc 22 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T10 reverse primer - SNV 33.0 in Fig. 6 <400> 80 tgcatagctg tttgaataat gacaag 26 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T11 reverse primer - SNV 38.3 in Fig. 6 <400> 81 tgcagcatct ctgtcaagca a 21 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T13 reverse primer - SNV 49.6 in Fig. 6 <400> 82 gcaacaacat aacccacagc ataa 24 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T14 reverse primer - SNV 57.2 in Fig. 6 <400> 83 gctaagcgtt tggaagaaat tcc 23 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 13.7 in Fig. 6 <400> 84 taggctctaa ggatgctggc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 13.7 in Fig. 6 <400> 85 aagcagcttc aaaccctctg 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 20.0 in Fig. 6 <400> 86 ttacttggcc ttggaactgc 20 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 20.0 in Fig. 6 <400> 87 tgattcgtaa tcgtcactgc c 21 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 36.9 in Fig. 6 <400> 88 tcctgtcccg agaaactgtc 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 36.9 in Fig. 6 <400> 89 agctggcttt cagagagctg 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 56.7 in Fig. 6 <400> 90 ttagaaagtg ccaaccaggc 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 56.7 in Fig. 6 <400> 91 ctctggctag gaacaatggc 20 <210> 92 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m-lr-f primer for Lrp5 locus <400> 92 gttaggtgca gggtctactc agctg 25 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m-5'-f primer for Lrp5 locus <400> 93 ggaggagagg agaagcagcc 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m-A primer for Lrp5 locus <400> 94 ggaggagagg agaagcagcc 20 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h-lr-r primer for Lrp5 locus <400> 95 gcaaacagcc ttcttcccac attcgg 26 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m-5'-r primer for Lrp5 locus <400> 96 ttgctttcag tagttcaggt gtgc 24 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h-5'-r primer for Lrp5 locus <400> 97 ggcgttgtca ggaagttgcc 20 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m-F primer for Lrp5 locus <400> 98 tgaagttgag aggcacatga gg 22 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m-E2 primer for Lrp5 locus <400> 99 tagagtagcc acaggcagca aagc 24 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7064retU forward primer <400> 100 cctcctgagc tttcctttgc ag 22 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7064retU reverse primer <400> 101 cctagacaac acagacactg tatca 25 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7064retU TAQMAN probe <400> 102 ttctgccctt gaaaaggaga ggc 23 <210> 103 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7064retD forward primer <400> 103 cctctgaggc cacctgaa 18 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7064retD reverse primer <400> 104 ccctgacaag ttctgccttc tac 23 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7064retD TAQMAN probe <400> 105 tgcccaagcc tctgcagctt t 21 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7140retU forward primer <400> 106 cccagcatct gacgacacc 19 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7140retU reverse primer <400> 107 gaccactgtg ggcatctgta g 21 <210> 108 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7140retU TAQMAN probe <400> 108 ccgagtctgc tgttactgtt agcatca 27 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7140retD forward primer <400> 109 cccgacacct tctgagcatg 20 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7140retD reverse primer <400> 110 tgcaggctga gtcaggattt g 21 <210> 111 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7140retD TAQMAN probe <400> 111 tagtcacgtt ttgtgacacc ccaga 25 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA A DNA-targeting segment <400> 112 tgaaccaatt gtgtagcctt 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA A2 DNA-targeting segment <400> 113 aatagtggta aagcaccatg 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA B DNA-targeting segment <400> 114 gtgtgctaag gatcgaagtc 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA C DNA-targeting segment <400> 115 caccgagatg cttgggtatt 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA D DNA-targeting segment <400> 116 tgtaaccgcc ctgaatgacc 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA E DNA-targeting segment <400> 117 aaaagggcat cataaatccc 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA E2 DNA-targeting segment <400> 118 tcaaaaatag tcatacacct 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Folh1 gRNA F DNA-targeting segment <400> 119 ggtctctagt acattgtaga 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA A DNA-targeting segment <400> 120 ggtggtggtg ctgacggaca 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA A2 DNA-targeting segment <400> 121 tatgagatca acactcgcta 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA B DNA-targeting segment <400> 122 ccaaggactt ccccacgtta 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA C DNA-targeting segment <400> 123 tgcttccctt atgcaagatt 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA D DNA-targeting segment <400> 124 ttaggtaccc tatttgaata 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA E2 DNA-targeting segment <400> 125 tgcagtgggt gacaggtcca 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA E DNA-targeting segment <400> 126 agggttatac tgacgttgtg 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adamts5 gRNA F DNA-targeting segment <400> 127 tgtctttcaa ggagggctac 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA A DNA-targeting segment <400> 128 actagtagac ctgaggggtt 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA B DNA-targeting segment <400> 129 gctccagtgt ttaggccttg 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA B2 DNA-targeting segment <400> 130 ggcaagctga aaacgcatgc 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA C DNA-targeting segment <400> 131 gtagatcgct ttccactacc 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA D DNA-targeting segment <400> 132 gaactccact gctcgtgagc 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA E2 DNA-targeting segment <400> 133 ataggtgggc actattgaag 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA E DNA-targeting segment <400> 134 atgggaaggt ttataccagc 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpp4 gRNA F DNA-targeting segment <400> 135 cggtgtaaaa acaacgggaa 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 6.1 in Fig. 8 <400> 136 ggaatgccaa ggctactgtc 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 6.1 in Fig. 8 <400> 137 aaaagtctgc tttgggtggt 20 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 6.3 in Fig. 8 <400> 138 cttcatgaac ctcactcagg a 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 6.3 in Fig. 8 <400> 139 tctcggagtc aggatttacc t 21 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 7.8 in Fig. 8 <400> 140 tgtctctttg cctgttgctg 20 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 7.8 in Fig. 8 <400> 141 tctgctctac aaggcttacg tg 22 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 16 in Fig. 8 <400> 142 caaccaggca gacttacagc 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 16 in Fig. 8 <400> 143 ggcctaggaa ccagtcaaaa 20 <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SV 25.5 in Fig. 8 <400> 144 gcttactgga aagctacata ggg 23 <210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SV 25.5 in Fig. 8 <400> 145 caacaacata gaaacccctg tc 22 <210> 146 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S. aureus Cas9 PAM sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n = A, T, C, or G <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> r = A or G <400> 146 nngrrt 6 <210> 147 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S. aureus Cas9 PAM sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n = A, T, C, or G <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> r = A or G <400> 147 nngrr 5 <210> 148 <211> 3155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Human Vk1-39Jk5 Locus <400> 148 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tgacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 2400 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 2460 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 2520 ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 2580 accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 2640 acccctccga tcaccttcgg ccaagggaca cgactggaga ttaaacgtaa gtaatttttc 2700 actattgtct tctgaaattt gggtctgatg gccagtattg acttttagag gcttaaatag 2760 gagtttggta aagattggta aatgagggca tttaagattt gccatgggtt gcaaaagtta 2820 aactcagctt caaaaatgga tttggagaaa aaaagattaa attgctctaa actgaatgac 2880 acaaagtaaa aaaaaaaagt gtaactaaaa aggaaccctt gtatttctaa ggagcaaaag 2940 taaatttatt tttgttcact cttgccaaat attgtattgg ttgttgctga ttatgcatga 3000 tacagaaaag tggaaaaata cattttttag tctttctccc ttttgtttga taaattattt 3060 tgtcagacaa caataaaaat caatagcacg ccctaagatc tagatgcatg ctcgagtgcc 3120 atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagat 3155 <210> 149 <211> 3166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Human Vk3-20Jk1 Locus <400> 149 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt 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gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca 2400 ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta 2460 gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct 2520 atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga 2580 cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc 2640 agcagtatgg tagctcacct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta 2700 agtaattttt cactattgtc ttctgaaatt tgggtctgat ggccagtatt gacttttaga 2760 ggcttaaata ggagtttggt aaagattggt aaatgagggc atttaagatt tgccatgggt 2820 tgcaaaagtt aaactcagct tcaaaaatgg atttggagaa aaaaagatta aattgctcta 2880 aactgaatga cacaaagtaa aaaaaaaaag tgtaactaaa aaggaaccct tgtatttcta 2940 aggagcaaaa gtaaatttat ttttgttcac tcttgccaaa tattgtattg gttgttgctg 3000 attatgcatg atacagaaaa gtggaaaaat acatttttta gtctttctcc cttttgtttg 3060 ataaattatt ttgtcagaca acaataaaaa tcaatagcac gccctaagat ctagatgcat 3120 gctcgagtgc catttcatta cctctttctc cgcacccgac atagat 3166 <210> 150 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA Scaffold v1 <400> 150 gttggaacca ttcaaaacag catagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 60 aaaagtggca ccgagtcggt gc 82 <210> 151 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA Scaffold v2 <400> 151 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60 ggcaccgagt cggtgc 76 <210> 152 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Guide RNA Scaffold v3 <400> 152 gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60 ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 86

Claims (73)

  1. 하기 단계를 포함하는, 관심의 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 생성 방법:
    (a) 하기를 포함하는, 관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 제조하는 단계:
    (i) 1-세포기 배아가 아닌 비-인간 동물 만능 세포 또는 비-인간 동물 1-세포기 배아에 하기를 도입하는 것:
    (I) Cas9 단백질;
    (II) 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 상기 표적 게놈 유전자좌는 관심의 상기 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다; 및
    (III) 상기 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA;
    상기 표적 게놈 유전자좌는 2대립유전자 변형을 가진 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아 또는 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 생산하기 위해 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되고, 상기 자가-항원의 발현은 제거되고; 그리고
    (ii) 상기 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아 또는 상기 변형된 비-인간 동물 만능 세포로부터 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하는 것, 상기 표적 게놈 유전자좌는 상기 자가-항원의 발현이 제거되도록 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형된다;
    (b) 관심의 상기 외래 항원으로 단계 (a)에서 생산된 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 면역화시키는 단계; 및
    (c) 관심의 상기 외래 항원에 면역 반응을 개시하는데 충분한 조건 하에서 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 유지시키는 단계, 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물은 관심의 상기 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질을 생산함.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, 단계 (a)(ii)에서 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 생산이 하기를 포함하는, 방법:
    (I) 상기 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 것; 및
    (II) 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 상기 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 대리모에 상기 숙주 배아를 이식하는 것.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 만능 세포가 배아 줄기 (ES) 세포인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, 단계 (a)(ii)에서 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 생산이 상기 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 상기 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 상기 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아를 대리모에 이식하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역화된, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 단리된 B 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역화된, 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물로부터 관심의 상기 외래 항원에 대한 상기 항원-결합 단백질 중 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및/또는 관심의 상기 외래 항원에 대한 상기 항원-결합 단백질 중 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 수득하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 제1 핵산 서열 및/또는 상기 제2 핵산 서열이 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 림프구로부터 또는 림프구로부터 생산된 하이브리도마로부터 수득되는, 방법.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물이 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고, 상기 제1 핵산 서열이 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하고, 상기 제2 핵산 서열이 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 상기 외래 항원에 대한 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산된 상기 항원-결합 단백질이 관심의 상기 외래 항원으로 상기 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 상기 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질보다 더 높은 역가를 갖는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 상기 외래 항원에 대한 항원-결합 단백질의 더욱 다양한 레퍼토리가 관심의 상기 외래 항원으로 상기 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 상기 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질과 비교하여 관심의 상기 외래 항원으로 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물의 면역화 이후 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산되는, 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 상기 외래 항원에 대한 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산된 상기 항원-결합 단백질이 관심의 상기 외래 항원으로 상기 대조군 비-인간 동물의 면역화 이후 상기 표적 게놈 유전자좌에서 야생형인 대조군 비-인간 동물에 의해 생산된 항원-결합 단백질과 비교하여 중쇄 V 유전자 분절 및/또는 경쇄 V 유전자 분절의 더 큰 다양성을 사용하는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 상기 외래 항원에 대한 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에 의해 생산된 상기 항원-결합 단백질의 일부가 자가-항원과 교차-반응하는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열이 상기 표적 게놈 유전자좌에서 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 5'이고,
    단계 (a)(i)이 영역 5'에 대하여 및 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 및/또는 영역 3'에 대하여 및 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 2인 상기 카피 수를 결정하기 위해 유지 검정 수행을 추가로 포함함.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 상기 외래 항원이 상기 자가-항원의 오쏘로그인, 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 상기 외래 항원이 인간 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는, 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 게놈 유전자좌가 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 대체를 포함하도록 변형되는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 표적 게놈 유전자좌가 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하도록 변형되는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 결실이 랜덤 삽입 및 결실 (인델) 없이 정확한 결실인, 방법.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 개시 코돈을 포함하거나 상기 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 정지 코돈을 포함하거나 상기 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내인, 방법.
  20. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상이하고, 각각의 상기 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 개시 코돈을 포함하거나 상기 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내인, 방법.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 게놈 유전자좌가 약 0.1 kb 내지 약 200 kb의 2대립유전자 결실을 포함하도록 변형되는, 방법.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자의 전부 또는 일부의 2대립유전자 결실을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자의 상기 개시 코돈의 2대립유전자 파괴를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입 단계 (a)(i)이 상기 비-인간 동물 만능 세포 또는 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아에 하기를 도입하는 것을 추가로 포함하는, 방법:
    (iv) 표적 게놈 유전자좌 이내 제3 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제3 가이드 RNA; 및/또는
    (v) 표적 게놈 유전자좌 이내 제4 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제4 가이드 RNA.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, 상기 Cas9 단백질, 상기 제1 가이드 RNA, 및 상기 제2 가이드 RNA가 DNA의 형태로 상기 비-인간 동물 만능 줄기 세포에 각각 도입되는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, 상기 Cas9 단백질, 상기 제1 가이드 RNA, 및 상기 제2 가이드 RNA가 상기 비-인간 동물 만능 줄기 세포에 전기천공 또는 뉴클레오펙션에 의해 각각 도입되는, 방법.
  27. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, 상기 Cas9 단백질, 상기 제1 가이드 RNA, 및 상기 제2 가이드 RNA가 RNA의 형태로 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아에 각각 도입되는, 방법.
  28. 청구항 1 내지 24 및 27 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, 상기 Cas9 단백질, 상기 제1 가이드 RNA, 및 상기 제2 가이드 RNA가 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아에 전핵 주사 또는 세포질 주사에 의해 도입되는, 방법.
  29. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 수복 템플레이트가 단계 (a)(i)에서 도입되지 않는, 방법.
  30. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입 단계 (a)(i)이 상기 표적 게놈 유전자좌에서 5' 표적 서열에 하이브리드화하는 5' 상동성 아암 그리고 상기 표적 게놈 유전자좌에서 3' 표적 서열에 하이브리드화하는 3' 상동성 아암을 포함하는 외인성 수복 템플레이트를 상기 비-인간 동물 만능 세포 또는 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아에 도입하는 것을 추가로 포함하고, 단 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아이면, 상기 외인성 수복 템플레이트가 길이 약 5 kb 이하인, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 외인성 수복 템플레이트가 상기 5' 상동성 아암 및 상기 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 추가로 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 핵산 삽입물이 상기 표적 게놈 유전자좌에 상동성 또는 오쏘로그성인, 방법.
  33. 청구항 30 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 수복 템플레이트가 길이 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 1 kb인, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 외인성 수복 템플레이트가 길이 약 80개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드인, 방법.
  35. 청구항 30 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 수복 템플레이트가 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드인, 방법.
  36. 청구항 30 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 단계 (a)(i)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 만능 세포이고, 그리고
    (a) 상기 외인성 수복 템플레이트가 길이 적어도 10 kb인 큰 표적화 벡터 (LTVEC)이거나; 또는
    (b) 상기 외인성 수복 템플레이트가 LTVEC이고, 상기 LTVEC의 상기 5' 및 3' 상동성 아암의 상기 총계가 길이 적어도 10 kb임.
  37. 청구항 30 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 상기 표적 게놈 유전자좌가 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하도록 변형되고,
    상기 결실된 핵산 서열이 상기 5' 및 3' 표적 서열 사이 상기 핵산 서열로 구성됨.
  38. 청구항 30 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 상기 외인성 수복 템플레이트가 상기 5' 상동성 아암 및 상기 3' 상동성 아암에 의해 측접된 핵산 삽입물을 포함하고,
    상기 핵산 삽입물이 상기 결실된 핵산 서열에 상동성 또는 오쏘로그성이고,
    상기 표적 게놈 유전자좌가 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함하도록 변형되고,
    상기 핵산 삽입물이 상기 결실된 핵산 서열을 대체함.
  39. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는, 방법.
  40. 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 설치류인, 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 설치류가 마우스인, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 마우스 균주가 BALB/c 균주를 포함하는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 마우스 균주 BALB/c, C57BL/6, 및 129 균주를 포함하는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 마우스 균주가 50% BALB/c, 25% C57BL/6, 및 25% 129인, 방법.
  45. 청구항 41 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마우스의 상기 MHC 일배체형이 MHCb/d인, 방법.
  46. 청구항 41 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마우스가 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에서 삽입된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절이 중쇄 유전자 분절이고, 상기 마우스 면역글로불린 유전자좌가 중쇄 유전자좌이고, 그리고/또는 상기 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절이 카파 또는 람다 경쇄 분절이고, 상기 마우스 면역글로불린 유전자좌가 경쇄 유전자좌인, 방법.
  48. 청구항 46 또는 47에 있어서, 상기 마우스가 마우스 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 미재배열된 가변 영역 유전자 분절을 그것의 생식계열에서 포함하고, 상기 마우스가 인간 불변 영역 유전자가 부족하고, 상기 마우스 불변 영역 유전자가 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있는, 방법.
  49. 청구항 46 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마우스가 하기를 포함하는, 방법:
    (a) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및
    (b) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다;
    여기서 (a)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없음.
  50. 청구항 41 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마우스가 마우스 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 1 이하 또는 2 이하 재배열된 인간 경쇄 V/J 서열을 포함하는 인간화된 면역글로불린 경쇄 가변 유전자좌를 그것의 생식계열에서 포함하고, 상기 마우스가 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 미재배열된 인간 V, 적어도 하나의 미재배열된 인간 D, 및 적어도 하나의 미재배열된 인간 J 분절을 포함하는 인간화된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 마우스가 인간화된 중쇄 면역글로불린 가변 유전자좌 및 인간화된 경쇄 면역글로불린 가변 유전자좌를 포함하고, 상기 마우스가 단일 경쇄를 발현시키는, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 상기 마우스가 하기를 포함하는, 방법:
    (a) 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 인코딩하는 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (VL/JL), 상기 단일 재배열된 인간 VL/JL 영역은 인간 Vκ1-39/Jκ5 유전자 분절 또는 인간 Vκ3-20/Jκ1 유전자 분절로부터 선택되고; 그리고
    (b) 내인성 중쇄 가변 (VH) 유전자 분절의 하나 이상의 인간 VH 유전자 분절로의 대체, 상기 인간 VH 유전자 분절은 내인성 중쇄 불변 (CH) 영역 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 VH 유전자 분절은 인간/마우스 키메라 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있음.
  53. 청구항 51에 있어서, 하기인 방법: 상기 마우스가 항체의 모집단을 발현시키고, 상기 마우스의 생식계열이 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자인 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자만을 포함하고,
    상기 마우스가 단 하나의 카피를 함유한다는 점에서 상기 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 이형접합성이거나, 2 카피를 함유한다는 점에서 상기 단일 면역글로불린 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 동형접합성이어서, 상기 마우스는 하기이도록 활성 친화도 성숙을 특징으로 함:
    (i) 상기 모집단의 각각의 면역글로불린 카파 경쇄가 상기 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해, 또는 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고;
    (ii) 상기 모집단이 경쇄 가변 도메인이 상기 재배열된 인간 생식계열 카파 경쇄 가변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 상기 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체 그리고 경쇄 가변 도메인이 상기 체세포적으로 돌연변이된 이의 변이체에 의해 인코딩되는 상기 면역글로불린 카파 경쇄를 포함하는 항체를 포함하고;
    (iii) 상기 마우스가 상기 모집단의 상기 항체를 형성하기 위해 상기 면역글로불린 카파 경쇄와 성공적으로 짝짓기하는 체세포적으로 돌연변이된 고 친화도 중쇄의 다양한 수집을 생성함.
  54. 청구항 51에 있어서, 상기 마우스가 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성인, 방법:
    (a) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입:
    (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및
    (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고
    (b) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있음.
  55. 청구항 46 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 상기 마우스가 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 변형을 포함하고, 상기 변형이 내인성 ADAM6 기능을 감소 또는 제거하고,
    상기 마우스가 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열을 포함하고, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이고,
    상기 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 상기 이소성 핵산 서열은 상기 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 존재함.
  56. 청구항 1 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 상기 비-인간 동물이 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 상기 마우스가 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고,
    관심의 상기 외래 항원이 상기 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고,
    상기 제1 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 개시 코돈을 포함하거나 상기 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 정지 코돈을 포함하거나 상기 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고,
    상기 변형이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자의 전부 또는 일부의 2대립유전자 결실을 포함하여, 그것에 의하여 자가-항원의 발현이 제거됨.
  57. 청구항 1 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 상기 비-인간 동물이 BALB/c 균주로부터 적어도 부분적으로 유래되는 마우스이고, 상기 마우스가 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 포함하고,
    관심의 상기 외래 항원이 상기 자가-항원에 오쏘로그성인 인간 단백질의 전부 또는 일부이고,
    상기 제1 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 개시 코돈을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 정지 코돈을 포함하거나 상기 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고,
    상기 변형이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 개시 코돈의 2대립유전자 파괴를 포함하여, 그것에 의하여 자가-항원의 발현이 제거됨.
  58. 청구항 56 또는 57에 있어서, 상기 마우스가 하기를 포함하는, 방법:
    (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다;
    (b) 인간 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 중쇄 유전자좌, 상기 인간 중쇄 면역글로불린 V, D, 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌에 있다; 및
    (c) 인간 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 삽입을 포함하는 하이브리드 경쇄 유전자좌, 상기 인간 V 및 J 유전자 분절은 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다;
    상기 (b)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 중쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, (c)는 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 가변 영역을 포함하는 하이브리드 경쇄 서열을 형성하도록 재배열시키고, 상기 마우스는 인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체를 형성할 수 없음.
  59. 청구항 56 또는 57에 있어서, 마우스가 하기에 대하여 그것의 생식계열에서 이형접합성 또는 동형접합성인, 방법:
    (a) 마우스 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 이소성 핵산 서열, 상기 ADAM6 단백질, 이의 오쏘로그, 이의 동족체, 또는 이의 단편은 숫컷 마우스에서 기능적이다;
    (b) 하기를 포함하는 재배열된 Vκ/Jκ 서열의 내인성 마우스 κ 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입:
    (i) 단일 인간 생식계열 Vκ 서열이 하기에서존재하는, 단일 인간 생식계열 Vκ 서열: 서열번호:148 또는 서열번호:149; 및
    (ii) 단일 인간 생식계열 Jκ 서열, 상기 재배열된 Vκ/Jκ 서열은 내인성 마우스 κ 불변 영역에 작동가능하게 연결되고; 그리고
    (c) 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자좌에서 삽입, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되고, 상기 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 재배열된 인간/마우스 키메라 면역글로불린 중쇄 유전자를 재배열 및 형성할 수 있음.
  60. 청구항 1 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 만능 세포가 하이브리드 세포이거나 상기 비-인간 포유류 1-세포기 배아가 하이브리드 1-세포기 배아이고, 상기 방법이 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    (a') 상기 표적 게놈 유전자좌 이내 상응하는 제1 및 제2 염색체의 상기 쌍의 상기 서열을 비교하는 단계, 그리고 상기 표적 게놈 유전자좌의 상기 나머지의 전부 또는 일부에 비해 상응하는 제1 및 제2 염색체의 상기 쌍 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는 상기 표적 영역에 기반된 접촉 단계 (a)에 앞서 상기 표적 게놈 유전자좌 이내 표적 영역을 선택하는 단계, 상기 표적 영역은 하기를 포함한다:
    상기 제1 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열의 상기 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 또는 10 kb의 측접 서열, 및/또는
    상기 제2 가이드 RNA 인식 서열 및 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 상기 5' 측, 3' 측, 또는 각각의 측에서 적어도 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6, kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 또는 10 kb의 측접 서열.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 표적 영역이 상기 표적 게놈 유전자좌의 상기 나머지에 비해 상응하는 제1 및 제2의 상기 쌍 사이 서열 동일성의 더 높은 백분율을 갖는, 방법.
  62. 청구항 61에 있어서, 상기 표적 영역이 상응하는 제1 및 제2 염색체의 상기 쌍 사이 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖고, 상기 표적 게놈 유전자좌의 상기 나머지가 상응하는 제1 및 제2 염색체의 상기 쌍 사이 99.8% 이하 서열 동일성을 갖는, 방법.
  63. 하기 단계를 포함하는, 관심의 외래 항원의 감소된 내성을 가진 유전적으로 변형된 비-인간 동물의 제조 방법:
    (a) 1-세포기 배아가 아닌 비-인간 동물 만능 세포 또는 비-인간 동물 1-세포기 배아에 하기를 도입하는 단계:
    (i) Cas9 단백질;
    (ii) 표적 게놈 유전자좌 이내 제1 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드 RNA, 상기 표적 게놈 유전자좌는 관심의 상기 외래 항원과 관심의 에피토프를 공유하는 또는 상기에 상동성인 자가-항원을 인코딩하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다; 및
    (iii) 상기 표적 게놈 유전자좌 이내 제2 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드 RNA;
    상기 표적 게놈 유전자좌는 2대립유전자 변형을 가진 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아 또는 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 생산하기 위해 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형되고, 상기 자가-항원의 발현은 제거되고; 그리고
    (b) 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 상기 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아 또는 상기 변형된 비-인간 동물 만능 세포로부터 생산하는 단계, 상기 표적 게놈 유전자좌는 상기 자가-항원의 발현이 제거되도록 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물에서 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 변형됨.
  64. 청구항 63에 있어서, 단계 (a)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 만능 줄기 세포이고, 단계 (b)에서 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 상기 생산이 하기를 포함하는, 방법:
    (I) 상기 변형된 비-인간 동물 만능 세포를 숙주 배아에 도입하는 것; 및
    (II) 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 상기 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 대리모에 상기 숙주 배아를 이식하는 것.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 만능 세포가 배아 줄기 (ES) 세포인, 방법.
  66. 청구항 63에 있어서, 단계 (a)에서 상기 세포가 상기 비-인간 동물 1-세포기 배아이고, 단계 (b)에서 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물 상기 생산이 자가-항원의 발현이 제거되도록 상응하는 제1 및 제2 염색체의 쌍으로 상기 표적 게놈 유전자좌가 변형되는 상기 유전적으로 변형된 F0 세대 비-인간 동물을 생산하기 위해 대리모에 상기 변형된 비-인간 동물 1-세포기 배아를 이식하는 것을 포함하는, 방법.
  67. 청구항 63 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 상기외래 항원이 상기 자가-항원의 오쏘로그인, 방법.
  68. 청구항 63 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 개시 코돈을 포함하거나 상기 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내이고, 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 정지 코돈을 포함하거나 상기 정지 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내인, 방법.
  69. 청구항 63 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상이하고, 각각의 상기 제1 및 제2 가이드 RNA 인식 서열이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자용 상기 개시 코돈을 포함하거나 상기 개시 코돈의 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1,000개의 뉴클레오타이드 이내인, 방법.
  70. 청구항 63 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 하기인 방법: 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열이 상기 표적 게놈 유전자좌에서 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 5'이고,
    단계 (a)(i)이 영역 5'에 대하여 및 상기 제1 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 및/또는 영역 3'에 대하여 및 상기 제2 가이드 RNA 인식 서열의 약 1 kb 이내 2인 상기 카피 수를 결정하기 위해 유지 검정 수행을 추가로 포함함.
  71. 청구항 63 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자의 전부 또는 일부의 2대립유전자 결실을 포함하는, 방법.
  72. 청구항 63 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 상기 자가-항원을 인코딩하는 상기 유전자의 상기 개시 코돈의 2대립유전자 파괴를 포함하는, 방법.
  73. 청구항 63 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 마우스인, 방법.
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