TWI721477B - 經分離的轉錄增強子序列、包含該經分離的轉錄增強子序列且經修飾的啟動子序列以及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種促進基因轉錄作用之轉錄增強子序列，以及一種經修飾的啟動子序列，包含啟動子和轉錄增強子序列。本揭露亦提供一種表現載體，包含可調節經修飾的啟動子序列之調節序列。本揭露亦關於一種植物轉形細胞，包含表現載體。本揭露另關於一種生產外源蛋白之方法，包含將植物轉形細胞培養於植物培養液或將植物轉形細胞再生為植物轉殖株，以及自培養液回收外源蛋白或自植物轉殖株之組織萃取外源蛋白。

Description

經分離的轉錄增強子序列、包含該經分離的轉錄增強子序列且經修飾的啟動子序列以及其用途

本揭露係關於一種轉錄增強子序列，以及一種經修飾的啟動子序列，包含該轉錄增強子序列；本揭露亦關於一種表現載體，包含該經修飾的啟動子序列；本揭露亦關於一種植物轉形細胞，包含該表現載體；以及，本揭露亦關於一種使用該表現載體生產外源蛋白之方法。

目前，分子農場已廣泛應用於生產外源蛋白，諸如酵素、抗體以及醫藥蛋白等，而商業上常見的分子農場表現系統包含細菌表現系統、酵母菌表現系統、真菌表現系統、哺乳動物表現系統、植物表現系統以及昆蟲表現系統等，其中植物表現系統相較於其他表現系統具有許多的優勢，包括所需資本較小、生產成本和植物栽培成本較低、產量大、所生產之外源蛋白在植物體內可進行轉譯後修飾，使外源蛋白具有接近原本蛋白質之功能及活性。

在植物表現系統中，水稻(Oryza sativa，本文或簡稱Os)係容易進行基因轉殖的植物之一。參考文獻Kyozuka等人(1991)、Christensent等人(1992)和Kyozuka等人(1994)之研究顯示，水稻基因轉殖技術中常用的誘導性或持續性的啟動子包括來自水稻肌動蛋白-1(actin-1，Act1)和α-澱粉酶(α-amylase，αAmy)的啟動子，以及來自玉米泛素(ubiquitin，Ubi)的啟動子。研究亦顯示，將不同的轉錄增強子(transcription enhancer)結合至啟動子中，可增強啟動子的表現活性。例如，參考文獻Olive等人(1990)之研究證實，結合數個厭氧(anaerobic)的增強子至玉米的Adh1啟動子中，可使Adh1啟動子受缺氧和低氧誘導，並增強Adh1啟動子之活性。又如，參考文獻Weigel等人(2000)之研究證實，結合四個花椰菜嵌紋病毒35S(cauliflower mosaic virus 35S，CaMV 35S)的增強子至CaMV 35S啟動子中，可增強CaMV 35S啟動子之活性。

植物表現系統係利用分子生物技術，將啟動子(promoter)與外源蛋白之基因進行接合，以形成表現載體(expression vector)，並利用諸如農桿菌基因轉殖技術、基因槍法或花粉電穿孔法等基因轉殖技術，將表現載體導入植物細胞後，透過篩選標誌進行轉殖株之篩選，以得到植物基因轉殖株。植物基因轉殖株可透過建立懸浮細胞(suspension cell)或利用轉殖株之根、莖、葉或種子等組織來生產外源蛋白。然而，為了避免所生產之外源蛋白在產品化的過程中因繁複的純化步驟而降低外源蛋白之最終產量，因此，利用植物表現系統所生產之外源蛋白之產量至少應佔總可溶性蛋白質(total soluble protein)的1%。惟，參考文獻Daniell等人(2001)的記載，大部分的植物表現系統所生產之外源蛋白的產量佔總可溶性蛋白 質皆低於1%。以生產重組人類酸性纖維母細胞生長因子(human acidic fibroblast growth factor，haFGF)為例，參考文獻Ha等人(2017)的結果顯示，至目前為止，藉由菸草的短暫表現系統可得到最高產量的haFGF，且其產量大約佔總可溶性蛋白質之1.35%。

由此顯見，現有技術利用植物表現系統表現外源蛋白仍存在產量不高之問題。因此，發展出能夠提高外源蛋白產量之植物表現系統係本領域亟待解決之問題。

為達到上述之目的，本揭露提供一種轉錄增強子序列，包含至少一拷貝數具有與SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列90%以上相似性的核苷酸序列，且該核苷酸序列與SEQ ID NO：13同樣具有增強基因轉錄的功能。在一具體實施例中，該核苷酸序列與SEQ ID NO：13之核苷酸序列具有至少92%、95%、96%、97%、98%或99%之相似性。在另一具體實施例中，該核苷酸序列為如SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列。

在一具體實施例中，本揭露的轉錄增強子序列包含至少一拷貝數、至少二拷貝數或至少三拷貝數具有與SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列90%以上相似性的核苷酸序列。在另一具體實施例中，本揭露的轉錄增強子序列包含至少三拷貝數如SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列。

在一具體實施例中，本揭露具有與SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列90%以上相似性的核苷酸序列包含至少一段共通序列，其可為G盒(G box)序列或TA盒(TA box)序列。在本揭露的另一具體實施例中， 該G盒序列從5’端至3’端為TACGTG，以及該TA盒序列從5’端至3’端為TATCCA。

在另一方面，本揭露提供一種經修飾的啟動子序列，包含啟動子以及轉錄增強子序列，且啟動子係可操作地連接於轉錄增強子序列。在一具體實施例中，該啟動子為肌動蛋白1啟動子、泛素啟動子、CaMV 35S啟動子或rbcS基因啟動子。

本揭露亦提供一種表現載體，包含移轉DNA之左邊界序列、調節序列、編碼多胜肽之核苷酸序列、以及移轉DNA之右邊界序列，其中，該調節序列係可操作地連接於編碼多胜肽之核苷酸序列，且位於該移轉DNA之左邊界序列以及該移轉DNA之右邊界序列之間。

在一具體實施例中，該調節序列包含前述經修飾的啟動子序列。在另一具體實施例中，該調節序列進一步包含內含子序列，且該內含子序列係可操作地連接於該經修飾的啟動子序列和該編碼多胜肽之核苷酸序列之間。在一具體實施例中，該內含子序列係肌動蛋白1內含子或乙醇脫氫酶1內含子。在另一具體實施例中，該肌動蛋白1內含子具有如SEQ ID NO：15所示之核苷酸序列。

在本揭露的一具體實施例中，該調節序列進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列，且該編碼信號肽之核苷酸序列係可操作地連接於前述經修飾的啟動子序列和編碼多胜肽之核苷酸序列之間。在另一具體實施例中，該編碼信號肽之核苷酸序列具有如SEQ ID NO：17所示之核苷酸序列。

本揭露亦提供一種植物轉形細胞，包含前述的表現載體。

本揭露進一步提供一種生產外源蛋白之方法，包含： 將植物轉形細胞培養於植物培養液或再生為植物轉殖株；以及自植物培養液分離外源蛋白或自植物轉殖株之根、莖、葉或種子萃取外源蛋白。

藉由本揭露之轉錄增強子序列、包含該轉錄增強子序列且經修飾的啟動子序列，以及包含該經修飾的啟動子序列之表現載體，可增強轉殖至植物體內之外源基因的轉錄作用，進而提高外源蛋白於植物體內之表現量。此外，本揭露之實施例證實，本揭露之轉錄增強子序列相較於αAmy3SRC更佳展現強化啟動子之能力，且本揭露之轉錄增強子序列亦能在轉殖水稻之所有組織內增強啟動子的活性。再者，藉由本揭露之植物轉形細胞以及生產外源蛋白之方法，可透過建立水稻懸浮細胞，使外源蛋白分泌至植物轉形細胞之培養液內，或者透過植物轉殖株的再生，使外源蛋白累積於植物轉殖株之根、莖、葉或種子內，並經由回收培養液或萃取植物轉殖株之根、莖、葉或種子之蛋白質，進而得到所表現之外源蛋白。本揭露之實施例證實，藉由本揭露之生產外源蛋白之方法，可得到明顯更高的外源蛋白的量。

第1A圖顯示p35mA-Luc質體之結構示意圖，其中35Smp表示花椰菜嵌紋病毒極小啟動子(CaMV 35S minimal promoter)序列，Adh1(In)表示乙醇脫氫酶1內含子(alcohol dehydrogenase 1 intron，Adh1(In))序列，Luc表示螢光酵素基因(luciferase，Luc)序列， ATG表示啟始密碼子(start codon)序列，以及Nos 3’表示NOS終止子序列。

第1B圖顯示pMT825-Luc、pMT351-Luc、pMT121-Luc和pMT36-Luc質體之結構示意圖，其中5’ UTR表示5’非轉譯區(untranslated region，UTR)，G表示G盒(G box)共通序列，以及TA表示TA盒(TA box)共通序列。

第1C圖顯示pMTSRC-Luc質體之結構示意圖，其中MTSRC表示金屬硫蛋白(metallothionein)之糖反應核酸區域(sugar response complex，SRC)。

第1D圖顯示pAct1-Luc質體之結構示意圖。

第1E圖顯示pAct1-MTSRC-Luc質體之結構示意圖。

第1F圖顯示pAAct1-MTSRC-haFGF質體之結構示意圖，其中LB表示移轉DNA之左邊界(left border)序列，RB表示移轉DNA之右邊界(right border)序列，tml 3’表示終止子(terminal，tml)序列，hpt表示潮黴素磷酸轉移酶(hygromycin phosphotransferase，hpt)之核苷酸序列，35S-P表示CaMV 35S啟動子(CaMV 35S promoter，35S-P)序列，SP表示信號肽(signal peptide，SP)之核苷酸序列，以及haFGF表示人類酸性纖維母細胞生長因子(human acidic fibroblast growth factor，haFGF)之核苷酸序列。

第2圖顯示，在轉殖水稻懸浮細胞及水稻胚內，於有糖及缺糖條件下，OsMT2b啟動子活性之柱狀圖，+S表示在有糖環境，-S表示在缺糖環境。

第3圖顯示，在轉殖水稻懸浮細胞內，於有糖及缺糖條件下，不同長度之OsMT2b啟動子(MT825、MT351、MT121及MT36)賦予螢光酵素活性之柱狀圖。

第4圖顯示，在轉殖水稻懸浮細胞內，於有糖及缺糖條件下，OsMT2b全長啟動子(MT825)和僅具有G盒(G box)及TA盒(TA box)之146個鹼基對的啟動子(即，OsMT2b啟動子轉錄起始位置-266至-121之序列)賦予螢光酵素活性之柱狀圖。

第5圖顯示，在轉殖水稻胚內，於有糖及缺糖條件下，Act1啟動子及Act1-MTSRC啟動子賦予螢光酵素活性之柱狀圖。

第6A圖顯示，在轉殖水稻懸浮細胞內，於有糖及缺糖條件下，Act1啟動子及Act1-MTSRC啟動子賦予螢光酵素活性之柱狀圖。

第6B圖顯示，在轉殖水稻幼苗內，Act1啟動子及Act1-MTSRC啟動子賦予螢光酵素活性之柱狀圖。

第7A圖顯示，在轉殖水稻株幼苗之不同組織(包括胚乳、胚、莖及根)內，Act1啟動子、Act1-αAmy3SRC啟動子及Act1-MTSRC啟動子賦予螢光酵素活性之柱狀圖。

第7B圖顯示，在轉殖水稻株幼苗之不同組織(包括胚乳、胚、莖及根)內，Act1啟動子、Act1-αAmy3SRC啟動子及Act1-MTSRC啟動子賦予螢光酵素活性之柱狀圖。

第8A圖顯示，利用蛋白質凝膠墨漬分析方法，並透過抗haFGF單株抗體(1：500)，檢測Act1-MTSRC::haFGF轉殖水稻內所表現之haFGF蛋白質，其中M表示分子量標誌，1至8分別表示泳道的編 號，即各轉殖水稻細胞所表現的haFGF蛋白質，haFGF表示市售的haFGF蛋白質，NT表示非轉殖的(non-transformed)水稻細胞。

第8B圖顯示，利用蛋白質凝膠墨漬分析方法，透過抗haFGF單株抗體(1：500)，檢測Act1-MTSRC::haFGF轉殖水稻所建立之水稻懸浮細胞，於缺糖條件下，在水稻懸浮細胞之培養液內所累績之haFGF蛋白質量。

第9圖顯示，透過NIH/3T3細胞擴增分析方法，檢測ACT-haFGF-3水稻懸浮細胞培養液內haFGF蛋白質之生物活性。

除非本文另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一」及「該」包括複數個體。

除非本文另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「或」包括「及/或」之含義。

轉錄增強子(transcription enhancer)係一段可正向調控啟動子表現之DNA片段，其可位於啟動子之上游或下游，且可與特定蛋白質(enhancer-binding protein)結合，進而協助轉錄因子(transcription factor)結合在啟動子上，以促進轉錄作用及蛋白質之表現。

本揭露提供一種轉錄增強子序列，包含如SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列，其具有兩個共通序列(consensus sequence)，即G盒(5’-TACGTG-3’)及TA盒(5’-TATCCA-3’)。

本揭露亦提供一種經修飾的啟動子序列，包含啟動子以及轉 錄增強子序列，啟動子係可操作地連接於轉錄增強子序列。在一具體實施例中，經修飾的啟動子序列包含一個、兩個或三個拷貝數之轉錄增強子序列。在另一具體實施例中，啟動子係肌動蛋白1啟動子、泛素啟動子、CaMV 35S啟動子或rbcS基因啟動子。在另一具體實施例中，經修飾的啟動子序列包含肌動蛋白1啟動子以及具有如SEQ ID NO：13所示之轉錄增強子序列。

本揭露亦提供一種表現載體，包含移轉DNA之左邊界序列、調節序列、編碼多胜肽之核苷酸序列以及移轉DNA之右邊界序列，其中，調節序列係可操作地連接於編碼多胜肽之核苷酸序列，且位於移轉DNA之左邊界序列以及移轉DNA之右邊界序列之間。在一具體實施例中，調節序列包含經修飾的啟動子序列。

在一具體實施例中，調節序列進一步包含肌動蛋白1內含子或乙醇脫氫酶1內含子(alcohol dehydrogenase 1 intron，Adh1(In))，肌動蛋白1內含子或乙醇脫氫酶1內含子係可操作地連接於經修飾的啟動子序列和編碼多胜肽之核苷酸序列之間。在另一具體實施例中，肌動蛋白1內含子具有如SEQ ID NO：15所示之核苷酸序列。

在一具體實施例中，調節序列進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列，編碼信號肽之核苷酸序列係可操作地連接於經修飾的啟動子序列和編碼多胜肽之核苷酸序列之間。在另一具體實施例中，編碼信號肽之核苷酸序列具有如SEQ ID NO：17所示之核苷酸序列。

在一具體實施例中，編碼多胜肽之核苷酸序列係編碼人類酸性纖維母細胞生長因子(human acidic fibroblast growth factor，haFGF)、 人類表皮生長因子(human epidermal growth factor，hEGF)或豬第二型環狀病毒之Orf1蛋白質。在另一具體實施例中，人類酸性纖維母細胞生長因子具有如SEQ ID NO：18所示之核苷酸序列。

本揭露亦提供一種植物轉形細胞，包含表現載體。

本揭露亦提供一種生產外源蛋白之方法，包含：將植物轉形細胞培養於植物培養液，或將植物轉形細胞再生為轉殖株；以及自培養液回收外源蛋白或自植物轉殖株之根、莖、葉或種子萃取外源蛋白。

在一具體實施例中，植物培養液係缺糖條件之植物培養液。

以下係藉由特定的具體實施例說明本揭露之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容瞭解本揭露之其他優點與功效。然而，本揭露中所揭示之例示性實施例僅出於說明之目的，不應被視為限制本揭露之範圍。換言之，本揭露也可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點與應用，在不悖離本揭露之精神下進行各種修飾與變更。

本揭露之實施例所使用引子對之序列如下表1所示：

製備例1：建構pMT825-Luc、pMT351-Luc、pMT121-Luc、pMT36-Luc及pMTSRC-Luc質體

分別依據參考文獻Christensen和Quail(1996)以及Lu等人(1998 I)之內容，利用含有結合於玉米泛素(Ubi)啟動子和NOS終止子之間之β-葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase，GUS)cDNA的pUG質體，以及含有花椰菜嵌紋病毒極小啟動子(CaMV 35S minimal promoter)、乙醇脫氫酶1內含子(alcohol dehydrogenase 1 intron，Adh1(In))及螢光酵素基因(luciferase，Luc)之p35mA-Luc質體，透過聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增欲併入質體之插入物，以建構pMT825-Luc、pMT351-Luc、pMT121-Luc、pMT36-Luc及pMTSRC-Luc質體。

自美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)之GenBank資料庫下載取得水稻金屬硫蛋白(metallothionein(MT)gene of Oryza sativa，OsMT2b)之基因序列(基因庫登錄號：AF048750)，設計包含如SEQ ID NO：1所示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：2所示序列之反向引子的第一引子對，並以水稻基因體DNA作為PCR之模板DNA進行PCR，以擴增如SEQ ID NO：3所示含有825bp之5’-側翼區和100bp之5’非轉譯區的OsMT2b啟動子全長片段序列。利用HindIII及BamHI限制酶切割OsMT2b啟動子片段，並次選殖至pUG質體，以得到pMT-GUS質體。

設計包含如SEQ ID NO：1所示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：4所示序列之反向引子的第二引子對、如SEQ ID NO：5所示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：4所示序列之反向引子的第三引子對、如SEQ ID NO：6所示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：4所示序列之反向引子的第四引子對、如SEQ ID NO：7所示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：4所示序列之反向引子的第五引子對，並以pMT-GUS質體作為PCR之模板DNA進行PCR，以分別擴增如SEQ ID NO：3所示含有825bp之5’-側翼區和100bp之5’非轉譯區的OsMT2b啟動子全長片段序列、如SEQ ID NO：8所示含有351bp之5’-側翼區和100bp之5’非轉譯區的OsMT2b啟動子部分缺失片段序列、如SEQ ID NO：9所示含有121bp之5’-側翼區和100bp之5’非轉譯區的OsMT2b啟動子部分缺失片段序列，以及如SEQ ID NO：10所示含有36bp之5’-側翼區和100bp之5’非轉譯區的OsMT2b啟動子部分缺失片段序列。利用HindIII及NcoI限制酶切割OsMT2b啟動子全長片段序列和該等OsMT2b啟動子部分缺失片段序列，並分別次選殖至如第1A圖所示之p35mA-Luc質體，以得到如第1B圖所示之pMT825-Luc、pMT351-Luc、pMT121-Luc和pMT36-Luc質體。

設計包含如SEQ ID NO：11所示序列之正向引子以及如SEQ ID NO：12所示序列之反向引子的第六引子對，並以pMT825-Luc質體作為PCR之模板DNA進行PCR，以擴增如SEQ ID NO：13所示位於OsMT2b啟動子之轉錄起始位置-266至-121的DNA序列片段(或簡稱為MTSRC)。利用XhoI及PstI限制酶切割OsMT2b啟動子之轉錄起始位置-266至-121的DNA序列片段後，次選殖至p35mA-Luc質體，以得到如第1C圖所示之pMTSRC-Luc質體。

製備例2：建構pAct1-MTSRC-Luc質體

依據參考文獻Chen等人(2002)之內容，利用pAct質體來建構pAct1-MTSRC-Luc質體。首先，利用化學合成方法(生工有限公司)合成含有三個拷貝數之MTSRC的DNA片段，且該DNA片段之兩端各具有EcoRI限制酶切割位置，將該DNA片段插入pBluescript II SK載體(Stratagene)，以得到pBS-3xMTSRC質體。之後，利用EcoRI限制酶將三個拷貝數之MTSRC的DNA片段從pBS-3xMTSRC質體切除，並次選殖至具有如SEQ ID NO：14所示序列之Act1啟動子的pAct質體，以得到pAct1-MTSRC質體。最後，利用HindIII限制酶將含有三個拷貝數之OsMT2b SRC(MTSRC)的Act1啟動子從pAct1-MTSRC質體切除，並次選殖至具有如第1D圖所示含有如SEQ ID NO：15所示之肌動蛋白1內含子(Actin-1 intron，Act1 In)序列的pAct1-Luc質體，以得到如第1E圖所示在Act1啟動子中帶有三個MTSRC重複片段和肌動蛋白內含子之pAct1-MTSRC-Luc質體，且該帶有三個MTSRC重複片段和肌動蛋白內含子之Act1啟動子具有如SEQ ID NO：16所示之序列。

製備例3：建構pAct1-MTSRC-haFGF質體

利用化學合成方法(生工有限公司)合成在5’端含有αAmy3基因之信號肽(signal peptide，SP)的全長haFGF基因，並插入pBluescript II SK載體(Stratagene)，其中，信號肽和haFGF基因之核苷酸序列係依水稻之密碼子使用最佳化(codon usage optimization)而修飾，且αAmy3基因之信號肽具有如SEQ ID NO：17所示之核苷酸序列，而haFGF基因則具有如SEQ ID NO：18所示之核苷酸序列，以得到pBS-haFGF質體。之後，利用SalI限制酶將合成的SP-haFGF融合基因從pBS-haFGF質體切除，並次選殖至pAct1-MTSRC-Luc，以得到pAct1-MTSRC-haFGF質體。

製備例4：建構pA35mA-Luc、pAMT825-Luc、pAMT351-Luc、pAMT121-Luc、pAMT36-Luc、pAMTSRC-Luc、pAAct1-MTSRC-Luc及pAAct1-MTSRC-haFGF質體

依據參考文獻Ho等人(2000)之內容，利用二元載體(binary vector)pSMY1H質體來建構pA35mA-Luc、pAMT825-Luc、pAMT351-Luc、pAMT121-Luc、pAMT36-Luc、pAMTSRC-Luc、pAAct1-MTSRC-Luc及pAAct1-MTSRC-haFGF質體，以進行農桿菌轉殖。

利用HindIII限制酶切割各p35mA-Luc、pMT825-Luc、pMT351-Luc、pMT121-Luc和pMT36-Luc質體後，次選殖至兩端皆為HindIII限制酶切位之線性pSMY1H質體，以得到pA35mA-Luc、pAMT825-Luc、pAMT351-Luc、pAMT121-Luc及pAMT36-Luc質體。

利用SacII和KpnI限制酶分別切割pMTSRC-Luc和pAct1-MTSRC-haFGF質體後，分別以克列諾酵素(Klenow enzyme)處理，以形成兩端皆為鈍端之線性pMTSRC-Luc和pAct1-MTSRC-haFGF質體，並將線性pMTSRC-Luc和pAct1-MTSRC-haFGF質體透過接合酶與兩端皆為鈍端之線性pSMY1H質體進行接合，以分別得到pAMTSRC-Luc和如第1F圖所示之pAAct1-MTSRC-haFGF質體。利用PstI限制酶切割pAct1-MTSRC-Luc質體後，次選殖至兩端皆為PstI限制酶切位之線性pSMY1H質體，以得到pAAct1-MTSRC-Luc質體。

實施例1：檢測在有糖及缺糖的條件下，OsMT2b啟動子於水稻細胞及水稻胚內之活性

依據參考文獻Chen等人(2002)之內容，利用農桿菌轉殖方法，透過pAMT825-Luc質體，將OsMT2b啟動子與Luc嵌合基因導入水稻基因體內，以得到獨立的轉殖水稻株。

隨機挑選轉殖水稻株，並依據參考文獻Yu等人(1991)之內容，建立各轉殖水稻株之水稻懸浮細胞，使水稻懸浮細胞在28℃黑暗中且在含有3%蔗糖或缺乏3%蔗糖之培養環境下進行培養兩天。水稻胚則在28℃黑暗中且在含有3%蔗糖或缺乏3%蔗糖之培養環境下進行培養兩天。利用包含100mM KH₂PO₄、pH 7.8、1mM EDTA、10%甘油、1%三硝基甲苯X-100及7mM β-巰乙醇之細胞溶解試劑(cell culture lysis reagent，CCLR)緩衝溶液，萃取水稻懸浮細胞及水稻胚之總蛋白質，並利用Commassie Brilliant Blue R250蛋白質分析試劑(Pierce)測定蛋白質濃度，以及依據參考文獻Lu等人(1998)之內容，分析水稻懸浮細胞及水稻胚內之螢光酵素活性。

結果如第2圖所示，在轉殖水稻懸浮細胞內，缺糖環境(-S)會誘導OsMT2b啟動子之活性。此外，相較於在有糖環境(+S)下，轉殖水稻胚在缺糖環境(-S)下之螢光酵素活性顯著增加9.1倍至14.2倍。此結果證實，在水稻懸浮細胞以及水稻胚內，OsMT2b啟動子之活性可受缺糖環境所誘導。

實施例2：確認水稻細胞內賦予OsMT2b啟動子之糖反應的糖反應核酸區域(sugar response complex，SRC)

利用農桿菌轉殖方法，透過pAMT825-Luc、pAMT351-Luc、pAMT121-Luc和pAMT36-Luc質體，分別將OsMT2b全長啟動子與Luc之嵌合基因以及OsMT2b部分缺失啟動子與Luc之嵌合基因導入水稻基因體內，以得到獨立的轉殖水稻株。建立各轉殖水稻株之水稻懸浮細胞，使水稻懸浮細胞在28℃黑暗中且在含有3%蔗糖或缺乏3%蔗糖之環境下進行培養兩天，並分析螢光酵素之活性。

結果如第3圖所示，相較於OsMT2b全長啟動子(pAMT825-Luc)，OsMT2b啟動子之351個鹼基對的上游片段(pAMT351-Luc)不管在 有糖(+S)或缺糖(-S)的環境下，賦予螢光酵素之活性皆為最高。此外，OsMT2b全長啟動子與OsMT2b部分缺失啟動子(pAMT351-Luc)在缺糖環境下，所誘導螢光酵素活性之倍數相似(pAMT825-Luc係2.8倍，而pAMT351-Luc係3.1倍)。再者，刪除OsMT2b啟動子之5’端至-121位置(pAMT121-Luc)則會顯著降低啟動子之活性以及對糖之反應性，且當進一步刪除OsMT2b啟動子至-36位置時，會更加地降低螢光酵素之活性以及對糖之反應性。因此，結果顯示在缺糖環境下，OsMT2b啟動子位於-351至-121之間的5’-側翼區對於提供高量級之啟動子活性係重要的。進一步將OsMT2b啟動子之序列進行分析，結果顯示位於OsMT2b啟動子之-173至-160位置之間具有兩個共通序列(consensus sequence)，即G盒(5’-TACGTG-3’)及TA盒(5’-TATCCA-3’)。

為了確認OsMT2b啟動子之G盒及TA盒是否負責誘導OsMT2b啟動子在缺糖環境下之活性，利用農桿菌轉殖方法，透過pA35mA-Luc和pAMTSRC-Luc質體，分別將35mA-Luc和MTSRC-Luc嵌合基因導入水稻基因體內，以得到獨立的轉殖水稻株。建立各轉殖水稻株之水稻懸浮細胞，使水稻懸浮細胞在28℃黑暗中且在含有3%蔗糖或缺乏3%蔗糖之環境下進行培養兩天，並分析螢光酵素之活性。結果如第4圖所示，在水稻細胞內，包含G盒及TA盒之146個鹼基對的啟動子(即，如SEQ ID NO：13所示OsMT2b啟動子轉錄起始位置-266至-121之序列)顯著地受到缺糖環境之誘導，因此將該受缺糖環境誘導之區域命名為MTSRC。

實施例3：確認MTSRC對於Act1啟動子之活性

為了確認MTSRC是否能夠增強Act1啟動子之活性，依據參考文獻Umemura等人(1998)之內容，利用水稻胚粒子轟擊的短暫表現分析方法，透過如第1D和1E圖所示之pAct1-Luc質體和包含三個MTSRC重複 片段之pAct1-MTSRC-Luc質體，檢測水稻胚內之螢光酵素活性。於28℃下，將經轉染之水稻胚培養於含有100mM葡萄糖或甘露醇之MS培養基(Murashige and Skoog medium)24小時。各自獨立的實驗係由8個水稻胚所組成且進行3重複，依據參考文獻Chen等人(2006)之內容，進行螢光酵素活性及GUS活性之測試，而pUG質體係作為內部定量對照(internal control)，以進行數據標準化。結果如第5圖所示，不論在有糖或缺糖環境下，MTSRC確實皆能夠增強Act1啟動子之活性。此外，在缺糖環境下，MTSRC更顯著增強Act1啟動子之活性約15.5倍。由此顯見，MTSRC確實具有將受糖誘導之Act1啟動子轉換成缺糖誘導之啟動子之能力。

為了進一步確認在穩定轉殖的水稻細胞及幼苗內是否能得到相似的結果，利用農桿菌轉殖方法，透過pAAct1-MTSRC-Luc質體，將Act1-MTSRC-Luc之嵌合基因導入水稻基因體內，以得到獨立的Act1-MTSRC-Luc轉殖水稻株，並以Act1-Luc轉殖水稻株作為對照組。隨機挑選轉殖水稻株，並建立各轉殖水稻株之水稻懸浮細胞，或待各T2轉殖水稻株之種子發芽8天後，分析螢光酵素之活性。結果如第6A圖所示，相較於Act1啟動子，在有糖及缺糖環境下，由Act1-MTSRC啟動子所賦予之平均螢光酵素活性最多分別增加8倍及44倍。此外，4株帶有Act1-Luc之T3轉殖水稻株種子及6株帶有Act1-MTSRC-Luc之T2轉殖水稻株種子在發芽8天後，每個轉殖株各挑選5株幼苗分別分析螢光酵素之活性。結果如第6B圖所示，在轉殖水稻幼苗中，MTSRC平均可增加Act1啟動子的活性約11倍。

實施例4：比較MTSRC與αAmy3SRC對於Act1啟動子之活性影響

為比較在發芽轉殖水稻種子之不同組織內Act1啟動子、Act1-αAmy3SRC啟動子與Act1-MTSRC啟動子之活性，使分別帶有Act1-Luc和Act1-αAmy3SRC-Luc基因之Act1-6-19-1-1和Act1-αAmy3SRC-5-10-4-3轉殖水稻株之T4種子，以及帶有Act1-MTSRC-Luc基因之Act1-MTSRC-3-12轉殖水稻株之T2種子進行發芽，生長至14天後，收集各轉殖水稻株幼苗之不同組織並分析螢光酵素之活性。結果如第7A圖所示，αAmy3SRC能顯著增強Act1啟動子在水稻之胚、莖和根內的活性，而MTSRC則能普遍增強Act1啟動子在轉殖水稻之所有組織內的活性。進一步如第7B圖所示，在水稻幼苗內，MTSRC相較於αAmy3SRC更佳展現強化Act1啟動子之能力。

實施例5：確認在轉殖水稻植株內Act1-MTSRC啟動子所介導重組haFGF之表現

為檢測在水稻內Act1-MTSRC啟動子是否確實能夠生產高量級之外源蛋白，利用農桿菌轉殖方法，透過pAAct1-MTSRC-haFGF質體，將Act1-MTSRC::haFGF嵌合基因導入水稻基因體內，以得到獨立的轉殖水稻株。分別建立數個獨立轉殖水稻株之癒傷組織，並將各癒傷組織置於缺糖的N6培養基內培養2天，利用CCLR緩衝溶液萃取細胞內的總蛋白質後，以Commassie Brilliant Blue蛋白質分析試劑(Pierce)測定蛋白質濃度。隨機挑選8株轉殖水稻株，依據參考文獻Lu等人(2007)之內容，利用蛋白質凝膠墨漬分析方法，透過抗haFGF單株抗體(1：500，Abcam)，檢測轉殖水稻內所表現之haFGF蛋白質。此外，利用市售的haFGF(Sigma)作為標準品，透過抗haFGF單株抗體進行重組haFGF蛋白質之定量，以及利用Quantity One軟體(Bio-Rad)計算重組haFGF蛋白質在水稻細胞內之累績量。

結果如第8A圖所示，轉殖水稻植株內會表現兩種形式的重組haFGF蛋白質，較高的條帶為全長的haFGF，具有17.4kDa分子量(如三角形標誌所示)，而較低的條帶則與市售的haFGF相同，具有15.8kDa分子量(如箭頭標誌所示)，其顯示在轉殖水稻細胞內存在有N-端截斷形式的haFGF，且這些蛋白質條帶並未出現在非轉殖的水稻細胞內。

為檢測在水稻內所表現的重組haFGF蛋白質是否會分泌至培養液中，挑選haFGF蛋白表現量最高之ACT-haFGF-3水稻轉殖株，經再生為T0植株後自交產生T1種子。將各自獨立之T1種子的胚誘導癒傷組織，並培養成懸浮細胞。自水稻懸浮細胞之培養液內收集培養液的總蛋白質，並進一步檢測重組haFGF。結果如第8B圖所示，在ACT-haFGF-3水稻轉殖株之水稻懸浮細胞培養液內，亦會累績兩種形式的重組haFGF蛋白質，且重組haFGF蛋白質之濃度約佔培養液總蛋白質量之2%。

為檢測在水稻內所表現並分泌至培養液內之重組haFGF蛋白質是否具有生物活性，依據參考文獻Gospodarowicz(1974)之內容，透過NIH/3T3細胞擴增分析方法，檢測收集自經缺糖處理16小時後之野生型水稻品系TNG67和水稻轉殖細胞株ACT-haFGF-3的培養液蛋白質或市售的haFGF蛋白質之生物活性。結果如第9圖所示，相較於野生型水稻品系TNG67之培養液蛋白質和未經刺激的對照組，NIH/3T3細胞顯著受到由水稻所表現之重組haFGF蛋白質和市售的haFGF蛋白質所刺激。此等結果顯示，由轉殖水稻細胞培養系統所表現之重組haFGF蛋白質確實仍具有促分裂原的刺激活性，且能促進NIH/3T3細胞的增生。

以上為描述本揭露之例示性實施例，應理解的，本揭露之範圍不限於所揭露的實施例；反之，其應涵蓋各種修改及類似的重新組 合。因此，申請專利範圍應賦予最廣泛的解釋，以涵蓋所有此種修改及類似的組合。

以下所列的參考文獻皆以引用的方式併入本文：Chen PW, Lu CA, Yu TS, Tseng TH, Wang CS, and Yu SM (2002) Rice alpha-amylase transcriptional enhancers direct multiple mode regulation of promoters in transgenic rice. J. Biol. Chem. 277 (16): 13641-13649.

Chen PW, Chiang CM, Tseng TH, and Yu SM (2006) Interaction between rice MYBGA and the gibberellin response element controls tissue-specific sugar sensitivity of alpha-amylase genes. Plant Cell 18 (9): 2326-2340.

Christensen, AH, Sharrock, RA, and Quail, PH (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18: 675-689.

Christensen AH and Quail PH (1996) Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res. 5(3): 213-218.

Daniell H, Streatfield SJ, and Wycoff K (2001) Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends Plant Sci. 6: 219-226.

Gospodarowicz D (1974) Localisation of a fibroblast growth factor and its effect alone and with hydrocortisone on 3T3 cell growth. Nature 249 (5453): 123.

Ho SL, Tong WF, and Yu SM (2000) Multiple mode regulation of a cysteine proteinase gene expression in rice. Plant Physiol. 122 (1): 57-66.

Kyozuka J, Fujimoto H, Izawa T, and Shimamoto K (1991) Anaerobic induction and tissue-specific expression of maize Adh1 promoter in transgenic rice plants and their progeny. Mol. Gen. Genet. 228: 40-48.

Kyozuka J, Olive M, Peacock WJ, Dennis, E.S., and Shimamoto K (1994) Promoter element required for developmental expression of the maize Adh1 gene in transgenic rice. Plant Cell 6: 799-810.

Lu CA, Lim EK, and Yu SM (1998) Sugar response sequence in the promoter of a rice alpha-amylase gene serves as a transcriptional enhancer. J. Biol. Chem. 273 (17): 10120-10131.

Lu CA, Lin CC, Lee KW, Chen JL, Huang LF, Ho SL, Liu HJ, Hsing YI, and Yu SM (2007) The SnRK1A protein kinase plays a key role in sugar signaling during germination and seedling growth of rice. Plant Cell 19 (8): 2484-2499.

Olive MR, Walker JC, Singh K, Dennis ES, and Peacock WJ (1990) Functional properties of the anaerobic responsive element of the maize Adh1 gene. Plant Mol. Biol. 15: 593-604.

Umemura T, Perata P, Futsuhara Y, and Yamaguchi J (1998) Sugar sensing and alpha-amylase gene repression in rice embryos. Planta 204(4): 420-428.

Weigel D, Ahn JH, Blazquez MA, Borevitz JO, Christensen SK, Fankhauser C, Ferrandiz C, Kardailsky I, Malancharuvil EJ, Neff MM, Nguyen JT, Sato S, Wang ZY, Xia Y, Dixon RA, Harrison MJ, Lamb CJ, Yanofsky MF, and Chory J (2000). Activation tagging in Arabidopsis. Plant Physiol. 122: 1003-1013.

Yu SM, Kuo YH, Sheu G, Sheu YJ, and Liu LF (1991) Metabolic derepression of alpha-amylase gene expression in suspension-cultured cells of rice. J. Biol. Chem. 266 (31): 21131-21137.

<110> 國立嘉義大學

<120> 經分離的轉錄增強子序列、包含該經分離的轉錄增強子序列且經修飾的啟動子序列以及其用途

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 925

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 4

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 451

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 8

<210> 9

<211> 221

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 9

<210> 10

<211> 136

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 11

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 12

<210> 13

<211> 146

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 13

<210> 14

<211> 932

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 14

<210> 15

<211> 461

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 15

<210> 16

<211> 1867

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 16

<210> 17

<211> 90

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 17

<210> 18

<211> 468

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

Claims (19)

1. 一種經分離的轉錄增強子序列，包含至少一拷貝數具有SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述經分離的轉錄增強子序列，其中，該SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列包含G盒序列或TA盒序列。
3. 如申請專利範圍第2項所述經分離的轉錄增強子序列，其中，該G盒序列從5’端至3’端為TACGTG，以及該TA盒序列從5’端至3’端為TATCCA。
4. 如申請專利範圍第1項所述經分離的轉錄增強子序列，包含至少一拷貝數如SEQ ID NO：13所示之核苷酸序列。
5. 如申請專利範圍第4項所述經分離的轉錄增強子序列，包含至少三拷貝數如SEQ ID NO：13所示之該核苷酸序列。
6. 一種經修飾的啟動子序列，包含啟動子及如申請專利範圍第1至5項中任一項所述經分離的轉錄增強子序列，其中，該啟動子係可操作地連接於該經分離的轉錄增強子序列。
7. 如申請專利範圍第6項所述經修飾的啟動子序列，其中，該啟動子係肌動蛋白1啟動子、泛素啟動子、CaMV 35S啟動子或rbcS基因啟動子。
8. 一種表現載體，包含移轉DNA之左邊界序列、調節序列、編碼多胜肽之核苷酸序列、以及移轉DNA之右邊界序列，其中，該調節序列係可操作地連接於該編碼多胜肽之核苷酸序列，且位於該移轉DNA之左邊 界序列及該移轉DNA之右邊界序列之間，以及其中，該調節序列包含如申請專利範圍第6或7項所述經修飾的啟動子序列。
9. 如申請專利範圍第8項所述之表現載體，其中，該調節序列進一步包含內含子序列，且該內含子序列係可操作地連接於該經修飾的啟動子序列和該編碼多胜肽之核苷酸序列之間。
10. 如申請專利範圍第9項所述之表現載體，其中，該內含子序列係肌動蛋白1內含子或乙醇脫氫酶1內含子。
11. 如申請專利範圍第10項所述之表現載體，其中，該肌動蛋白1內含子具有如SEQ ID NO：15所示之核苷酸序列。
12. 如申請專利範圍第8項所述之表現載體，其中，該調節序列進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列，且該編碼信號肽之核苷酸序列係可操作地連接於該經修飾的啟動子序列和該編碼多胜肽之核苷酸序列之間。
13. 如申請專利範圍第12項所述之表現載體，其中，該編碼信號肽之核苷酸序列具有如SEQ ID NO：17所示之核苷酸序列。
14. 如申請專利範圍第8項所述之表現載體，其中，該編碼多胜肽之核苷酸序列係編碼人類酸性纖維母細胞生長因子、人類表皮生長因子或豬第二型環狀病毒之Orf1蛋白質。
15. 如申請專利範圍第14項所述之表現載體，其中，該人類酸性纖維母細胞生長因子具有如SEQ ID NO：18所示之核苷酸序列。
16. 一種植物轉形細胞，包含如申請專利範圍第8至15項中任一項所述之表現載體。
17. 一種生產外源蛋白之方法，包含：將如申請專利範圍第16項所述之植物轉形細胞培養於植物培養液；以及自該植物培養液分離該外源蛋白。
18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該植物培養液係缺糖條件之植物培養液。
19. 一種生產外源蛋白之方法，包含：將如申請專利範圍第16項所述之植物轉形細胞再生為植物轉殖株；以及自該植物轉殖株之根、莖、葉或種子萃取該外源蛋白。

Images