CN103882043A - 羊驼TGF-β1-3′UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊驼TGF-β1-3′UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用，所述报告基因载体是将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列插入到载体pmirGLODual-LuciferasemiRNATargetExpression的SacI和XbaI位点之间构建而成，用于检测miR663对TGF-β1基因的调控作用，为后续在细胞水平和动物水平上研究miR-663对候选靶基因TGF-β1生物学功能的验证和调控机制奠定基础，同时，也可以对靶基因是TGF-β1的microRNA的功能进行研究。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于羊驼TGF-β1基因的双荧光素酶报告基因载体，以及该载体的构建方法和应用。
背景技术
转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是细胞增殖和分化的重要调节蛋白之一，在细胞外基质形成、胚胎发育、创伤愈合及肿瘤发生等过程中起重要作用。在哺乳动物细胞中存在TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型，其中以TGF-β1含量最高，几乎参与了所有的病理和生理过程。TGF-β1在细胞生长和分化、促进成纤维细胞的生长和抑制上皮角朊细胞的生长等方面也起着重要的作用。
MicroRNA（即miRNA）是由18-25个核苷酸组成的一类内源性、短序列非编码单链RNA，它由DNA转录产生，不翻译蛋白质，通过和mRNA 3'UTR区结合来调控目标基因的表达。miRNA主要是通过5'端被称为种子序列（Seed Sequence）的7nt序列与位于靶mRNA 3'UTR的miRNA调控元件（miRNA Regulatory Element, MRE）相互作用以识别靶mRNA。作为一种转录后调控小分子RNA，在动物中主要通过与靶mRNA的3'UTR 区特异性互补配对，抑制靶mRNA 翻译或引起靶mRNA 的降解，从而参与调控细胞分化、组织发育、肿瘤发生发展等多种生命过程。miRNA作为转录后基因调控的一种方式，在生物体内形成一个调控网络，由于miRNA调控涉及的方便广，调控控作用明显，本身序列短，便于操作和研究，越来越受到人们对其生物学功能研究的重视。
miR-663在细胞的凋亡、免疫及肿瘤抑制中发挥着重要的作用，比如 miR-663的甲基化与胃癌和乳腺癌的发生相关。而TGF-β1是生物信息学软件预测的miR-663的靶基因之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体。
本发明的第二个目的是提供该羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建方法。
本发明的第三个目的是提供上述TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的应用。
本发明通过基因工程技术克隆并且构建了羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体，本发明所述的羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体包含有双荧光素酶报告基因载体，以及SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基因片段，所述核苷酸序列位于羊驼TGF-β1基因的3'UTR区。
其中，优选的双荧光素酶报告基因载体为pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression，由美国Promega公司提供。
具体而言，本发明的羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体是通过下述方法构建而成的。
根据生物信息学软件Targetscan (http://www.targetscan.org/)、RNAhybrid (http://bibiserv. techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)和RNA22 (http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)，在线预测miR-663与TGF-β1-3'UTR可能的相互结合的靶位点。
通过对GenBank中登录的人、小鼠、牛等哺乳动物的TGF-β1基因序列进行同源性比较，选择保守性高的编码区，以牛基因序列（登录号：NM_001166068）为模板，用primer5软件设计羊驼TGF-β1基因编码区引物，并在上游引物中加入酶切位点Sac I的序列，下游引物中加入酶切位点XbaI的序列，设计出如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特异的TGF-β1-3'UTR引物。
TGF-β1-3'UTR-Sac I-PF：5'CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3'。
TGF-β1-3'UTR-Xba I-PR：5'GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3'。
以TRizol法提取羊驼黑色素细胞总RNA，用上述特异TGF-β1-3'UTR引物扩增，得到具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的TGF-β1-3'UTR基因片段，利用PCR产物纯化试剂盒对得到的TGF-β1-3'UTR片段进行回收。
用Sac I和XbaI限制性内切酶酶切回收的TGF-β1-3'UTR片段，Sac I和XbaI限制性内切酶酶切pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression载体，将扩增获得的羊驼TGF-β1-3'UTR基因片段插入双荧光素酶报告基因载体pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression的Sac I和XbaI酶切位点，构建羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体，经酶切验证和测序鉴定后，命名为pmirGLO-TGF-β1-3'UTR。
本发明构建的羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体可用于检测miR663对TGF-β1基因的调控作用，具体的，可用于在细胞水平和动物水平上研究miR-663对候选靶基因TGF-β1的生物学功能和调控机制。
以本发明构建的pmirGLO-TGF-β1-3'UTR质粒载体进行检测验证，证明miR-663能够直接靶向TGF-β1基因的3'UTR，并对该基因起到负调控作用。
进而，本发明构建的羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体还可用于其他靶基因是TGF-β1的microRNA的功能研究。
附图说明
图1为羊驼黑色素细胞RNA的电泳图。
图2为PCR扩增羊驼TGF-β1-3'UTR基因的电泳图。
图3为PCR检测pmirGLO-TGF-β1-3'UTR质粒载体的电泳图(a)及双酶切检测pmirGLO-TGF-β1-3'UTR质粒载体的电泳图(b)。
图4为pmirGLO-TGF-β1-3'UTR质粒载体的结构图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建。
一、材料。
1、质粒。
pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression载体（简写为pmirGLO），购自美国Promega公司。
2、试剂。
Trizol Reagent（Invitogen，美国），PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒（TaKaRa，中国），DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、普通Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及纯化、回收试剂盒、质粒小提试剂盒（生工生物工程(上海)股份有限公司），DNA限制性内切酶Sac I、XbaI（NEB，英国）。PCR引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
二、试验方法。
1、引物设计。
通过对GenBank中登录的人、小鼠、牛等哺乳动物的TGF-β1基因序列进行同源性比较，选择保守性高的编码区，以牛基因序列（GenBank登录号：NM_001166068）为模板，用primer5软件设计羊驼TGF-β1基因编码区引物，再根据测序得到的羊驼TGF-β1基因序列设计特异的TGF-β1-3'UTR引物，并在上游引物中加入酶切位点Sac I的序列，下游引物中加入酶切位点XbaI的序列，设计出如下的特异的TGF-β1-3'UTR引物。
TGF-β1-3'UTR-Sac I-PF：5'CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3'。
TGF-β1-3'UTR-Xba I-PR：5'GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3'。
2、羊驼TGF-β1-3'UTR基因的克隆。
用Trizol法提取羊驼皮肤组织中的总RNA（图1），并以核酸蛋白检测仪（Nanodrop ND-1000，Thermo）和电泳鉴定其浓度和质量。
按PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis反转录试剂盒方法合成cDNA第一链，并以此为模板，用引物TGF-β1-3'UTR-Sac I-PF和TGF-β1-3'UTR-Xba I-PR扩增TGF-β1中间片段。
PCR反应体系50μL：cDNA 1μL，10×LA PCR缓冲液5μL，2.5mmol·L-1 dNTPs 5μL，10μmol·L -1的上下游引物各5μL，LA Taq酶（5U·μL-1）0.5μL，ddH2O 28.5μL。扩增条件如下：94℃ 2min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。
PCR反应结束后，取2μL反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，然后送华大基因公司测序验证，得到153bp的羊驼TGF-β1基因序列（图2）。
3、pmirGLO-TGF-β1-3'UTR载体的构建。
用Sac I和XbaI限制性内切酶酶切回收的TGF-β1-3'UTR片段，Sac I和XbaI限制性内切酶酶切pmirGLO载体。将TGF-β1-3'UTR的酶切产物进行PCR产物纯化，pmirGLO载体的酶切产物进行凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收大片段。
回收产物用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。在含有Amp的LB平板上挑选阳性单克隆，采用TGF-β1-3'UTR扩增引物进行质粒PCR，Hind III和EcoR I双酶切和测序验证后，命名为pmirGLO-TGF-β1-3'UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。图4为构建的pmirGLO-TGF-β1-3'UTR重组质粒的结构图。
实施例2：pmirGLO-TGF-β1-3'UTR转染细胞和双荧光素酶活性检测。
1、材料。
健康293T细胞，置于液氮内，-80℃冰箱冻存。Trizol Reagent、Lipfectamine2000（Invitogen，美国），Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，美国），反转录试剂盒、LA Taq DNA聚合酶、T4连接酶及纯化、胶回收试剂盒（TaKaRa，中国），Tip100质粒中提试剂盒（QIAGEN，德国）。PCR引物及其它药品、试剂由生工生物工程(上海)有限公司合成或购自该公司的BBI系列产品。
2、方法。
将冻存的293T细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中并轻轻摇动，使其内容物尽快融化，吸出细胞悬液，离心后弃上清，再用培养基重复洗一遍。用培养基重悬细胞至适当的浓度，接种，放入5% CO2培养箱，37℃静置培养细胞至融合率为70%左右。
用试剂盒得到去内毒素的pmirGLO-TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体。
瞬时转染按Lipfectamine 2000说明书进行。设置三个实验组合：1）转入pmirGLO载体、2）转入pmirGLO-TGF-β1-3'UTR载体、3）转入pmirGLO-TGF-β1-3'UTR载体和Pre-miR663。置于5% CO2培养箱，37℃静置24h。
转染24h后，吸出培养基，加入PBS洗涤细胞，尽可能的弃净各孔内的残留液体。按Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒说明书向每孔中加入100μL PLB，室温摇床摇动20min充分裂解细胞。每孔加入20μL LAR-II试剂，放入仪器上，读取荧光素酶荧光值，然后加入20μL Stop & Glo试剂，放入仪器上，读取海肾荧光素酶荧光值。通过Dual-Luciferase报告基因检测系统测定各实验组中萤火虫荧光素酶的荧光值（FLuc）和海肾荧光素酶的荧光值（RLuc），取F/R为相对活性值进行数据的统计。
以转入pmirGLO载体为实验对照组NC，结果显示，转入pmirGLO-TGF-β1-3'UTR载体与NC相比变化下降2.67%，不具有显著性差异；pmirGLO-TGF-β1-3'UTR载体和Pre-miR663共转入组与NC相比变化下降26.91%，具有显著性差异（P<0.05）。实验结果表明，TGF-β1是miR-663的靶基因，miR-663靶向并抑制TGF-β1的表达，对TGF-β1基因起到负调控作用。
Claims (6)
1.羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体，所述羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体含有双荧光素酶报告基因载体和SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基因片段，所述核苷酸序列位于羊驼TGF-β1基因的3'UTR区。
2.根据权利要求1所述的羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体，其特征是所述的双荧光素酶报告基因载体为pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression。
3.一种羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：
1) 设计如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特异的TGF-β1-3'UTR引物：
TGF-β1-3'UTR-Sac I-PF：5'CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3'；
TGF-β1-3'UTR-Xba I-PR：5'GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3'；
2) TRizol法提取羊驼黑色素细胞总RNA，以上述特异TGF-β1-3'UTR引物扩增，得到SEQ ID No.3所示核苷酸序列的TGF-β1-3'UTR片段；
3) 以Sac I和XbaI限制性内切酶分别酶切回收的TGF-β1-3'UTR片段和pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression双荧光素酶报告基因载体，将TGF-β1-3'UTR片段插入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression的Sac I和XbaI酶切位点，构建羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体pmirGLO-TGF-β1-3'UTR。
4.权利要求1羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体在检测miR663对TGF-β1基因调控作用上的应用。
5.权利要求1羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体在研究miR-663对候选靶基因TGF-β1生物学功能和调控机制上的应用。
6.权利要求1羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体在靶基因为TGF-β1的microRNA功能研究上的应用。
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