CN109929879A

CN109929879A - 一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN109929879A
Application number: CN201910261638.3A
Authority: CN
Inventors: 陈晨; 崔清明; 罗璇; 谢菊兰; 张星; 邓缘; 刘莹莹; 朱吉; 任慧波; 胡雄贵; 左剑波; 彭英林
Original assignee: HUNAN PROV RESEARCH INST OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY
Current assignee: HUNAN PROV RESEARCH INST OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-06-25

Abstract

本发明涉及一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用，miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括与miR‑135a‑5p种子序列结合的两处野生型位点片段、第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段、第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。本发明提供了一种多位点结合、可快速直接检测miRNA和预测靶基因的结合、能够节约研究成本以及缩短实验周期的miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用。

Description

一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种荧光载体及构建方法，尤其涉及一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用。

背景技术

随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变成为一项重要的实验技术手段，在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等研究中得到广泛应用。目前，PCR介导的定点突变技术即重叠引物延伸PCR是使用最普遍的定点突变方法，可以在DNA区段的任何位置突变。

microRNA(miRNA)是一类内源性的、保守的、长度为19-23个核苷酸的非编码小分子RNA。1993年，科学家们首次在秀丽新小杆线虫中发现了具有调节其发育时序性的miRNA，即lin-4。lin-4与靶mRNA lin-14的3'UTR反向互补结合，从了抑制了lin-14基因的翻译。miRNA在生物体中主要以两种方式调控靶标基因的表达，即靶基因的剪切降解和翻译抑制。当miRNA序列与靶mRNA序列完全配对时则引起靶mRNA的剪切和降解，这种情况多见于植物中。而在动物体中，通常是miRNA的“种子序列”(第2-8个核苷酸)与靶mRNA结合，导致靶mRNA的翻译抑制，进而影响各种生命进程。

在前期研究发现，miR-135a-5p可能是调控脂肪发育的关键因子。软件预测Apc基因是miR-135a-5p的潜在靶基因，且在Apc基因的3′UTR有两个结合位点(AAGCCAT，AAAGCCA)，如图1所示。目前，针对miRNA“种子序列”和靶基因结合的验证，双荧光素酶报告载体试验是一种常见的方法，但都是基于单个结合位点的验证。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种多位点结合、可快速直接检测miRNA和预测靶基因的结合、能够节约研究成本以及缩短实验周期的miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体，所述miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括与miR-135a-5p种子序列结合的两处野生型位点片段，第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段，第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。

作为优选，两处野生型位点片段的引物序列是：

5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；

以及，5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d；

第一个突变位点片段的引物序列是：

5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'，记为引物b1；

5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'，记为引物c1；

第二个突变位点片段的引物序列是：

5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'，记为引物b2；

5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'，记为引物c2。

一种如前所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

1)构建野生型荧光载体；

2)以步骤1)构建得到的野生型荧光载体为模板，分别构建带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及从第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段；

3)将步骤2)构建得到的带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段分别进行“搭桥”，形成整体片段；

4)以步骤3)得到的整体片段为模板，分别进行PCR扩增；

5)将经过步骤4)后的产物连接pMD-18T载体，经过转化、提取质粒、双酶切，连接psiCHECK-2荧光载体，挑选阳性质粒，所述阳性质粒的第一个突变位点、第二个突变位点以及两个突变位点都成功突变。

作为优选，本发明的步骤1)的具体实现方式是：将野生型位点片段的引物序列进行PCR扩增制备双链DNA，将双链DNA与pMD-18T载体连接，转化感受态细胞、提取质粒、双酶切，将酶切片段与psiCHECK-2荧光载体连接，得到野生型荧光载体；所述野生型位点片段的引物序列是：

5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；

5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d。

作为优选，本发明的步骤2)中构建带有第一个突变位点的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物a和引物b1为引物扩增带有第一个突变位点的载体片段ab1；

所述引物a的序列是5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'；

所述引物b1的序列是5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'；

所述步骤2)中带有第二个突变位点的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物c2和引物d为引物扩增带有第二个突变位点的载体片段c2d；

所述引物c2的序列是5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'；

所述引物d的序列是5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'；

所述步骤2)中第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物c1和引物b2为引物扩增第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段c1b2；

所述引物c1的序列是5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'；

所述引物b2的序列是5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'。

作为优选，本发明的步骤5)中，将经过步骤4)后的产物连接pMD-18T载体时，所述pMD-18T载体通用引物序列是：

F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；

R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'。

作为优选，本发明的步骤5)中，连接psiCHECK-2荧光载体时，所述psiCHECK-2荧光载体通用引物序列是：

F：5'-GAGGACGCTCCAGATGAAAT-3'；

R：5'-GAGGTCCGAAGACTCATTTA-3'。

一种如前所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体在验证miRNA和预测靶基因的关系时的应用。

一种如前所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体在验证miR-135a-5p和预测靶基因Apc基因的关系时的应用。

本发明的优点是：

本发明提供了一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用，本发明是基于传统的重叠延伸PCR，针对某一miRNA有两个结合位点的基因，一是探索出了三个DNA片段“搭桥”的适用条件与关键参数，提供了含有两个与miRNA“种子序列”结合的野生位点或突变位点的载体及制备方法；二是将构建的野生型或突变型荧光载体用于miRNA和预测靶基因的关系验证，实现二者之间的快速检测。本发明对传统的重叠延伸PCR法进行定点突变的方法进行了改进，通过片段“搭桥”和测序使一个荧光载体上含有两个与miRNA“种子序列”结合的野生位点或突变位点，通过实验验证野生型或突变型荧光载体与预测靶基因的结合。本发明制备方法简单，在满足实验需要的同时，节约了研究成本，缩短了实验周期，是一种快捷、经济、准确的基因定点突变方法。

附图说明

图1是软件预测miR-135a-5p与Apc基因的结合；

图2是重叠引物延伸PCR法突变碱基示意图；

图3是Apc基因片段与psiCHECK-2荧光载体连接示意图；

图4是野生型psiCHECK-2荧光载体的双酶切鉴定；

图5是ab1片段、c1d片段以及两个片段“搭桥”后的扩增电泳图；

图6是ab2片段、c2d片段以及两个片段“搭桥”后扩增电泳图；

图7是c1b2片段的扩增和ab1、c1b2、c2d片段搭桥”后的PCR扩增；

图8是野生型、突变片段1、突变片段2、突变片段3载体测序结果对比(节选)；

图9是野生型载体测序结果图；

图10是突变片段1载体测序结果图；

图11是突变片段2载体测序结果图；

图12是突变片段3载体测序结果图；

图13是BHK细胞荧光活性检测miR-135a-5p对Apc基因3′UTR的调控。

具体实施方式

本发明提供了一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体，载体上有分别与miR-135a-5p“种子序列”结合的两处野生型位点片段，第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段，第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。需要说明的是：第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段不仅包括第一个突变位点到第二个野生型位点之间的序列，还包括第一个突变位点上游的部分序列以及第二个野生型位点下游的部分序列；第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段不仅包括第一个野生型位点到第二个突变位点之间的序列，还包括第一个野生型位点上游的部分序列以及第二个突变位点下游的部分序列；两处突变位点之间的片段不仅包括第一个突变位点到第二个突变位点之间的片段，还包括第一个突变位点上游的部分序列以及第二个突变位点下游的部分序列。

其中：

野生型结合位点片段的引物序列是：5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'(a)(序列表SEQ ID No.1)，5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'(d)(序列表SEQ IDNo.2)；

第一个突变位点片段的引物序列是：5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'(b1)(序列表SEQ ID No.3)，5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'(c1)(序列表SEQ IDNo.4)；

第二个突变位点片段的引物序列是：5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'(b2)(序列表SEQ ID No.5)，5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'(c2)(序列表SEQ ID No.6)；

两处突变位点片段的引物序列依然是b1、c1、b2、c2。

上述荧光载体的制备方法是：将野生型结合位点引物序列进行PCR扩增制备双链DNA，将双链DNA与pMD-18T载体连接，转化感受态细胞、提取质粒、双酶切，将酶切片段与psiCHECK-2荧光载体连接，检测挑选阳性质粒。以野生型荧光载体为模板，分别扩增ab1、c1d片段，将ab1和c1d“搭桥”后PCR扩增，以“搭桥”后的体系为模板，以a和d为引物，再进行PCR扩增，连接pMD-18T载体，经过转化、提取质粒、双酶切，连接psiCHECK-2荧光载体，挑选第一个位点成功突变的阳性质粒。第二个突变位点载体构建同上。以野生型荧光载体为模板，PCR扩增c1b2片段，将ab1，c1b2和c2d片段“搭桥”，后续步骤同第一个突变位点载体构建步骤，挑选两个位点都成功突变的阳性质粒。

pMD-18T载体通用引物序列：F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'(序列表SEQ IDNo.7)，R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'(序列表SEQ ID No.8)。

psiCHECK-2荧光载体通用引物序列：F：5'-GAGGACGCTCCAGATGAAAT-3'(序列表SEQID No.9)，R：5'-GAGGTCCGAAGACTCATTTA-3'(序列表SEQ ID No.10)。

下面将结合具体实施方式，对本发明所提供的技术方案进行详细说明：

一、引物设计

根据重叠引物延伸PCR法(图2、图3)，设计上游引物a、下游引物d以及分别含有四个突变碱基的引物b1、c1、b2、c2(表1)。

表1构建载体引物信息

注：粗体部分和斜体部分分别为引物的酶切位点及保护碱基，阴影部分为突变碱基。

二、载体构建

(一)psiCHECK-2荧光载体的线性酶切

(1)在PCR反应管中加入下列反应体系：

(2)37℃恒温酶切2h。

(3)酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，采用去内毒素质粒提取试剂盒回收线性化载体片段，在-20℃中保存。

扩增目的片段与pMD-18T载体的连接及转化

(1)以小鼠cDNA为模板，以a、d为引物，PCR扩增得到ad片段，扩增条件如下：

扩增体系如下：

(2)扩增目的片段经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用DNA提取试剂盒纯化、回收，连接到pMD-18T载体，连接体系如下：

(3)16℃连接2h，将10μL体系加入到30μL的DH5α感受态细胞中进行转化。

(4)冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上，加入400μL的LB培养液，37℃摇床中200rpm振荡培养45min。

(5)3000rpm离心5min，留约100μL培养液将沉淀吹散形成悬液，均匀涂布于含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，37℃恒温培养箱中正放30min后倒置培养过夜。

(6)挑取单个菌落，加入400μL含有氨苄抗性的LB培养液，37℃摇床中200rpm振荡培养过夜。

(7)以菌液为模板，PCR扩增检测目的片段是否已连接上pMD-18T载体，扩增体系如下：

(8)选择扩增产物大小(671bp)合适同时测序结果正确的菌液，吸取100μL加入5mL含有氨苄抗性的LB培养液，37℃摇床中200rpm振荡培养过夜，利用试剂盒提取质粒。

(9)对质粒进行双酶切，反应体系如下：

(10)37℃恒温酶切2h，经1.2％琼脂糖凝胶电泳(图4)，采用DNA提取试剂盒回收酶切后的目的片段。

(二)酶切目的片段与psiCHECK-2荧光载体的连接及转化

(1)将酶切后的目的片段连接到线性化的psiCHECK-2荧光载体中，连接体系如下：

(2)16℃连接8h，将12μL体系加入到30μL的DH5α感受态细胞中进行转化。

(3)连接载体的克隆、转化同上述步骤(3)-(5)。

(4)以菌液为模板，PCR扩增检测目的片段是否已连接上psiCHECK-2荧光载体，扩增体系如下：

(5)选择扩增产物大小(713bp)合适同时测序结果正确的菌液，吸取100μL加入15mL含有氨苄抗性的LB培养液，37℃摇床中200rpm振荡培养过夜，利用去内毒素试剂盒提取质粒。

(6)对质粒进行双酶切鉴定，反应体系如下：

(7)37℃恒温酶切2h，经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后，对质粒进行测序再次确认，用核酸浓度仪测定质粒的浓度及纯度，符合要求的-20℃中保存备用，即野生型psiCHECK-2(wild)。

(三)突变片段1的psiCHECK-2荧光载体构建

(1)以稀释10倍的野生型psiCHECK-2荧光载体为模板，以a和b1为引物，PCR扩增ab1片段；以c1和d为引物，PCR扩增c1d片段，扩增体系如下：

(2)经1.5％琼脂糖凝胶电泳(图5，其中(a)是ab1片段的扩增结果电泳图；(b)是c1d片段的扩增结果电泳图；(c)是ab1片段和c1d片段“搭桥”后扩增结果电泳图)、DNA提取试剂盒回收后，将片段ab1和c1d进行“搭桥”，“搭桥”条件如下：

“搭桥”体系如下：

(3)以“搭桥”后的体系为模板，以a和d为引物，进行PCR扩增，体系如下：

(4)经1.5％琼脂糖凝胶电泳后(图5，其中(a)是ab1片段的扩增结果电泳图；(b)是c1d片段的扩增结果电泳图；(c)是ab1片段和c1d片段“搭桥”后扩增结果电泳图)，进行回收、连接pMD-18T载体、克隆、转化。

(5)经测序，选择突变位点1成功的pMD-18T载体进行扩大培养、提取质粒、双酶切、连接psiCHECK-2荧光载体等一系列操作，步骤同野生型载体的构建，即获得突变片段1的psiCHECK-2荧光载体(mutant 1)。

(四)突变片段2的psiCHECK-2荧光载体构建

以稀释10倍的野生型psiCHECK-2荧光载体为模板，以a和b2为引物，PCR扩增ab2片段；以c2和d为引物，PCR扩增c2d片段(图6，其中(a)是ab2片段的扩增结果电泳图；(b)是c2d片段的扩增结果电泳图；(c)是ab2片段和c2d片段“搭桥”后扩增结果电泳图)，后续步骤同突变片段1的psiCHECK-2荧光载体构建，即可获得突变片段2的psiCHECK-2荧光载体(mutant 2)。

(五)突变片段3的psiCHECK-2荧光载体构建

(1)以稀释10倍的野生型psiCHECK-2荧光载体为模板，以c1和b2为引物，PCR扩增c1b2片段(图7)。

(2)将ab1、c1b2和c2d片段进行“搭桥”，“搭桥”体系及条件同上。

(3)以“搭桥”后的体系为模板，以a和d为引物进行PCR扩增(图7，其中(a)是c1b2片段的扩增结果电泳图；(b)是ab1、c1b2、c2d片段“搭桥”后的扩增电泳图；)，再经胶回收、纯化、克隆、连接到载体等等，挑选两个位点都成功突变的质粒进行保存以备后续研究。

构建得到的野生型、突变片段1、突变片段2和突变片段3荧光载体的测序结果分别见图8、图9、图10、图11、图12。

三、载体应用

(一)细胞培养

(1)用含有10％胎牛血清的DMEM作为生长培养基，当BHK细胞融合度达80％时即可进行传代，先用吸管将培养液吸出，再用PBS润洗两次，最后将37℃预热的0.25％胰蛋白酶加入培养瓶(50cm²细胞培养瓶加入400μL胰蛋白酶)，将胰酶铺平细胞瓶底以覆盖所有细胞。

(2)在显微镜下观察细胞消化程度，待大部分细胞变圆、彼此分离后，立即加入一定量的新鲜培养液，终止胰酶消化。

(3)用吸管轻吹培养液，使瓶壁上的细胞完全脱离形成细胞悬液，细胞瓶中尽量避免气泡的产生。

(4)将细胞吹打均匀后，将细胞接种到24孔板中，轻轻摇匀后放入37℃，5％CO₂培养箱中进行培养。

(5)根据细胞生长状况更换培养液，一般一到两天更换一次。

(二)细胞转染

待24孔板中的细胞融合度达80％，采用lipofectamine 2000转染试剂分别将0.4μg miR-135a-5p mimics或negative control(NC)(表2)与0.4μg野生型psiCHECK-2荧光载体(wild)、突变片段1psiCHECK-2荧光载体(mutant 1)、突变片段2psiCHECK-2荧光载体(mutant 2)，突变片段3psiCHECK-2荧光载体(mutant 3)共转染BHK细胞，共8个处理组，每组3个重复。

表2 miR-135a-5p mimics和NC序列

(三)细胞荧光活性检测

转染24h后，采用Promega双荧光素酶试剂盒裂解收集细胞，检测荧光活性。与NC相比，miR-135a-5p mimics显著降低野生型psiCHECK-2荧光载体的荧光活性(下降约40.3％)，降低突变片段1psiCHECK-2荧光载体的荧光活性(下降23.7％)，降低突变片段2突变片段1psiCHECK-2荧光载体的荧光活性(下降9.6％)(图13)。这说明，突变片段2均极大程度减少了miR-135a-5p对突变psiCHECK-2荧光载体荧光活性的抑制，而突变片段3则完全解除了miR-135a-5p对突变psiCHECK-2荧光载体荧光的抑制作用。表明在miR-135a-5p与Apc基因的结合过程中，这两个位点发挥协同增效的作用，其中第二个位点可能是主要的结合位置。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 湖南省畜牧兽医研究所

<120> 一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体及其构建方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgctcgagg gacaaacgta gaaaagc 27

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataagaatgc ggccgcagta aagcaaagca ggc 33

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tatcaaatta cctttccaga acaaaacccc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttctggaaa ggtaatttga tagtacactt 30

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatacttcc gattaccatt ttttcc 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatggtaatc ggaagtatat ttgtac 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggacgctc cagatgaaat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaggtccgaa gactcattta 20

Claims

1.一种miRNA靶基因双结合位点荧光载体，其特征在于：所述miRNA靶基因双结合位点荧光载体上包括分别与miR-135a-5p种子序列结合的两处野生型位点片段，第一个突变位点和第二个野生型位点之间的片段，第一个野生型位点和第二个突变位点之间的片段以及两处突变位点之间的片段。

2.根据权利要求1所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体，其特征在于：所述两处野生型位点片段的引物序列分别是：5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；以及，5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d；

第一个突变位点片段的引物序列是：

5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'，记为引物b1；

5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'，记为引物c1；

第二个突变位点片段的引物序列是：

5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'，记为引物b2；

5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'，记为引物c2。

3.一种如权利要求2所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：

1)构建野生型荧光载体；

2)以步骤1)构建得到的野生型荧光载体为模板，分别构建带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段；

3)将步骤2)构建得到的带有第一个突变位点的载体片段、带有第二个突变位点的载体片段以及第一个突变位点和第二个突变位点之间的载体片段分别进行搭桥，形成整体片段；

4)以步骤3)得到的整体片段为模板，分别进行PCR扩增；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：将野生型位点片段的引物序列进行PCR扩增制备双链DNA，将双链DNA与pMD-18T载体连接，转化感受态细胞、提取质粒、双酶切，将酶切片段与psiCHECK-2荧光载体连接，得到野生型荧光载体；所述野生型位点片段的引物序列是5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'，记为引物a；5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'，记为引物d。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中构建带有第一个突变位点的载体片段的具体实现方式是：以野生型荧光载体为模板，以引物a和引物b1为引物扩增带有第一个突变位点的载体片段ab1；

所述引物a的序列是5'-CCGCTCGAGGGACAAACGTAGAAAAGC-3'；

所述引物b1的序列是5'-TATCAAATTACCTTTCCAGAACAAAACCCC-3'；

所述引物c2的序列是5'-AATGGTAATCGGAAGTATATTTGTAC-3'；

所述引物d的序列是5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGTAAAGCAAAGCAGGC-3'；

所述引物c1的序列是5'-GTTCTGGAAAGGTAATTTGATAGTACACTT-3'；

所述引物b2的序列是5'-ATATACTTCCGATTACCATTTTTTCC-3'。

6.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，将经过步骤4)后的产物连接pMD-18T载体时，所述pMD-18T载体通用引物序列是：

F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；

R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，连接psiCHECK-2荧光载体时，所述psiCHECK-2荧光载体通用引物序列是：

F：5'-GAGGACGCTCCAGATGAAAT-3'；

R：5'-GAGGTCCGAAGACTCATTTA-3'。

8.一种如权利要求1或2所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体在验证miRNA和预测靶基因的关系时的应用。

9.一种如权利要求1或2所述的miRNA靶基因双结合位点荧光载体在验证miR-135a-5p和预测靶基因Apc基因的关系时的应用。