CN109929878A

CN109929878A - 一种利用基因组碱基编辑器系统生产fgf5基因编辑山羊的方法

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Publication number: CN109929878A
Application number: CN201910234408.8A
Authority: CN
Inventors: 王小龙; 李冠纬; 周世卫; 蔡蓓; 陈玉林
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2019-06-25

Abstract

本发明公开了一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法，该方法包括以下步骤：构建特异性靶向FGF5第一外显子的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到靶向FGF5第一外显子的sgRNA；体外转录BE3蛋白的体外转录载体，得到BE3 mRNA；将以上步骤的sgRNA及BE3 mRNA，纯化后混合，注射入山羊受精卵细胞质中，经体外培养后移植入同种雌性山羊输卵管中，用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。

Description

一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法

技术领域

本发明属于动物基因工程和遗传修饰技术领域，具体地说，涉及一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统介导的的基因编辑技术广泛应用于许多生物的基因组中，用于遗传修饰，范围涉及到了生物，医学，农业等多个领域，构建出了多种大型动物模型。

单核苷酸多态性(SNP)是人类以及动物中最常见的遗传变异类型。据文献报道，很多单碱基突变与人类疾病与生产性状相关。目前，已经有了简单的碱基编辑系统(BE)，在不产生双链断裂的情况下诱导C向T或G向A转变。最新的报告称，BE3(rAPOBEC1-nCas9-UGI)的碱基编辑效率优于BE1(rAPOBEC1-dCas9)和BE2(rAPOBEC1-dCas9-UGI)。

FGF5基因是毛发生长周期中的信号分泌蛋白，影响毛囊周期性活动及被毛生长的重要的生长因子。FGF5基因通过阻断真皮毛乳头细胞的增殖使毛囊发育进入退行期从而抑制毛发生长。敲除FGF5基因山羊的羊绒生长比野生型明显加快。同时也首次证明了基因组碱基编辑器在大型动物上的可行性，可以应用于生物医学和食品工程中构建大型动物模型。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法，包括以下步骤：

S1.构建特异性靶向FGF5第一外显子的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到靶向FGF5第一外显子的sgRNA；

S2.体外转录BE3蛋白的体外转录载体，得到BE3mRNA；

S3.将以上步骤的sgRNA及BE3mRNA，纯化后混合，注射入山羊受精卵细胞质中，经体外培养后移植入同种雌性山羊输卵管中，用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。

可选地，所述步骤S1中的sgRNA的体外转录载体为pUC57-T7-sgRNA载体。

可选地，所述sgRNA的体外转录载体pUC57-T7-sgRNA通过以下方法制备得到：

(1)设计并合成识别FGF5基因第一外显子的sgRNA；

(2)合成后的sgRNA寡核苷酸进行体外退火；

(3)将sgRNA通过BsaI位点进行酶切、连接，插入到pUC57-T7-gRNA中，命名为pUC57-T7-sgRNA。

可选地，步骤(2)中退火体系为100uM Up Oligo 4.5ul，100uM Down Oligo4.5ul，NEB bufferⅡ1ul；在PCR仪中按照以下退火程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；保持在4℃。

可选地，步骤(3)中酶切体系为：3ugpUC57-T7-sgRNA；5ul CutSmart Buffer；1.5ul BsaI三种体系混合好，补水至50ul，37℃孵育8小时，用AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化，回收至30ul灭菌水中。

可选地，所述步骤S2中的BE3蛋白的体外转录载体为pCMV-BE3。

可选地，在步骤S3中sgRNA、BE3mRNA混合后，终浓度为BE3mRNA25ng/μL，sgRNA10ng/μL。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明将sgRNA、BE3mRNA同时注射入受精卵，然后通过胚胎移植用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊；本发明将sgRNA、BE3mRNA同时转染至细胞，筛选后用阳性细胞作为供核细胞，通过核移植的方法生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊；本发明将sgRNA与BE3mRNA同时转染至细胞，敲除FGF5基因，用于研究FGF5基因的功能。本发明可以提前产生FGF5基因终止密码子，进而敲除该基因，使基因表达失效，使FGF5抑制毛发生长功能消失。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明实施例利用一种用基因组碱基编辑器(base editor3,BE3)系统生产FGF5基因敲除基因的编辑山羊中FGF5基因特异性靶位点序列图；

图2是本发明阳性个体与阴性个体的基因序列结果比对；

图3是本发明pUC57-T7-sgRNA构建示意图；

图4是本发明pUC57-T7-sgRNA的构建示意图；

图5是本发明获得阳性羔羊16#的皮肤组织免疫荧光示意图；其中，a代表FGF5(FGF5蛋白)，b代表DAPI(细胞核)，c代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)，d代表FGF5(FGF5蛋白)，e代表DAPI(细胞核)，f代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)；

图6是本发明得阳性羔羊18#的皮肤组织免疫荧光示意图；其中，a代表FGF5(FGF5蛋白)，b代表DAPI(细胞核)，c代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)，d代表FGF5(FGF5蛋白)，e代表DAPI(细胞核)，f代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)；

图7是本发明选取的同月龄阴性羔羊21#的皮肤组织免疫荧光示意图；其中，a代表FGF5(FGF5蛋白)，b代表DAPI(细胞核)，c代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)，d代表FGF5(FGF5蛋白)，e代表DAPI(细胞核)，f代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)；

图8是本发明选取的同月龄阴性羔羊29#的皮肤组织免疫荧光示意图(与实例中的3中的2对应)；其中，a代表FGF5(FGF5蛋白)，b代表DAPI(细胞核)，c代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)，d代表FGF5(FGF5蛋白)，e代表DAPI(细胞核)，f代表Merge(FGF5蛋白+细胞核)。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1针对FGF5基因的基因组碱基编辑器系统的构建：

步骤1，根据NCBI中山羊基因组序列，选择山羊基因组中FGF5基因第一外显子作为靶位点设计sgRNA，其靶位点序列如图1和图2所示，图1为设计的sgRNA序列以及预期的点突变示意图，通过C to T，提前产生终止密码子；由图2可知，成功生产出提前产生FGF5终止密码子基因编辑后代羊，即成功产生FGF5基因敲除后代羊；sgRNA序列如表1所示。

表1 sgRNA序列及目标位点

sgRNA	目标位点(5’-3’)	位置	Strand
				FGF5sgRNA	GAGCCCAGGCGCTGAGGATCAGG	Chr695419283-95419305	-

Strand:表明该DNA链是正义链还是反义链。+表示正义链，-表示反义链。

步骤2，含有特定sgRNA序列的pUC57-T7-gRNA载体的构建：

步骤2.1、设计并合成识别FGF5基因第一外显子的sgRNA；

步骤2.2、合成后的sgRNA寡核苷酸进行体外退火；

其中，退火体系为4.5ul Up Oligo(100uM)，4.5ul Down Oligo(100uM)，1ul NEBbufferⅡ；在PCR仪中按照以下退火程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；保持在4℃。

步骤2.3、将sgRNA通过BsaI位点进行酶切、连接，插入到pUC57-T7-gRNA中，命名为pUC57-T7-sgRNA，构建示意图如图3所示。

pUC57-T7-sgRNA酶切体系为：3ug pUC57-T7-sgRNA；5ul CutSmart Buffer(NEB公司生产，货号为#R0535V)；1.5ul BsaI(NEB公司生产，货号为#R0535V)三种体系混合好，补水至50ul，37℃孵育8小时，用AxyPrep PCR Cleanup Kit(公司AxyPrep货号为：AP-PCR-50)，纯化回收至30ul灭菌水中。连接步骤依据全式金公司的T4DNA连接酶(货号为FL101-01)使用，转化步骤依据北京擎科公司的感受态细胞(货号为TSV-A07)进行操作。

步骤3、构建pCMV-BE3载体：

步骤3.1、线性化pCMV-BE3质粒，通过位点进行酶切。

步骤3.2、将线性化质粒中加入RNAsecure(公司为thermofisher，货号为AM7005)按照说明书操作，目的为去RNA酶。

步骤3.3、依照MiniElute PCRPurificationKit(公司为QIGEN，货号为28004)说明书进行操作，纯化回收模板。

步骤3.4、依照mMESSAGE mMACHINE^TMT7ULTRA TranscriptionKit(公司为thermofisher，货号为AM1345)试剂盒说明书进行体外转录。

步骤3.5、依照RNeasyMini Kit(50)(公司为QIAGEN，货号为74104)试剂盒说明书进行纯化，构建示意图如图4所示。

针对FGF5基因的基因组碱基编辑器系统包括体外转录载体pUC57-T7-sgRNA和pCMV-BE3。

实施例2体外转录：

利用构建好的载体pUC57-T7-sgRNA和BE3mRNA的体外转录载体pCMV-linker-BE3进行以T7启动子介导的体外转录。(1)将pUC57-T7-sgRNA用BsaI线性化，pCMV-linker-BE3用Age1线性化；(2)用MEGAshortscript kit(Ambion)试剂盒按照说明书进行pUC57-T7-sgRNA、pCMV-linker-BE3的体外转录；(3)用MEGAClearkit(Ambion)试剂盒按照说明书进行sgRNA、BE3mRNA的纯化。

实施例3利用针对FGF5基因的基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊：

1、原核注射及胚胎移植：

从经过同期发情后自然交配的供体母山羊体内通过手术收集处于单细胞阶段的胚胎(大约在受精后14h)，利用显微注射仪将预混好的sgRNA、BE3mRNA混合物(混合后终浓度为BE3mRNA 25ng/μL，sgRNA 10ng/μL)注射入山羊受精卵的细胞质中。注射后的受精卵转移至Quinn’s Advantage Cleavage Medium(Sage Biopharma，NJ，USA)体外37℃培养24h，然后移植至受体母羊的输卵管壶腹部与峡部连接处，生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。

2、FGF5基因敲除的基因编辑山羊的鉴定

受体母羊生产后，待羔羊长至1周龄后采羔羊的血样，提取羔羊血液基因组DNA。以羔羊血液基因组为模版，设计针对FGF5基因第一外显子的引物。序列如表2，进行扩增，对获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并进行产物体系回收，回收后的PCR产物送测序并进行序列分析，测序结果分析确定阳性个体；对阳性个体的PCR产物克隆至T载体，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，根据测序结果更深一步确定基因敲除成功的阳性个体及阳性个体中碱基的变化方式，证明成功产生了敲除FGF5基因的绵羊。

如图5所示，性16#羔羊免疫荧光结果与阴性羔羊(21#，29#)的免疫荧光结果比较，FGF蛋白的含量相比明显减少。如图6所示，性18#羔羊免疫荧光结果与阴性羔羊(21#，29#)的免疫荧光结果比较，FGF蛋白的含量相比明显减少。如图7所示，阴性21#羔羊免疫荧光结果与阳性羔羊(16#，18#)的免疫荧光结果比较，FGF蛋白的含量相比明显更多。如图8所示，阴性29#羔羊免疫荧光结果与阳性羔羊(16#，18#)的免疫荧光结果比较，FGF蛋白的含量相比明显更多。

表2用于基因分型和扩增Cas9/sgRNA靶向FGF5基因片段的引物

表3阳性山羊及阴性山羊绒毛相关数据测量结果

由表3可知，山羊毛纤维长，山羊绒长以及山羊绒毛直径都具有显著性差异。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法

<130> 2019

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gagcccaggc gctgaggatc agg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

tctctctccc cctctctccc t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cagacgcacc tccaacccaa c 21

Claims

1.一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2.体外转录BE3蛋白的体外转录载体，得到BE3 mRNA；

S3.将以上步骤的sgRNA及BE3 mRNA，纯化后混合，注射入山羊受精卵细胞质中，经体外培养后移植入同种雌性山羊输卵管中，用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中的sgRNA的体外转录载体为pUC57-T7-sgRNA载体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的体外转录载体pUC57-T7-sgRNA通过以下方法制备得到：

(1)设计并合成识别FGF5基因第一外显子的sgRNA；

(2)合成后的sgRNA寡核苷酸进行体外退火；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中退火体系为100uM Up Oligo4.5ul，100uM Down Oligo4.5ul，NEB buffer Ⅱ 1ul；在PCR仪中按照以下退火程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；保持在4℃。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中酶切体系为：3ug pUC57-T7-sgRNA；5ul CutSmart Buffer；1.5ul BsaI三种体系混合好，补水至50ul，37℃孵育8小时，用AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化，回收至30ul灭菌水中。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中的BE3蛋白的体外转录载体为pCMV-BE3。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中sgRNA、BE3 mRNA混合后，终浓度为BE3 mRNA 25ng/μL，sgRNA 10ng/μL。