CN103450350B - 人感染h7n9禽流感表位抗原及其在免疫检测试剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了本发明提供的人感染H7N9禽流感血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的优势表位抗原，还公开了该抗原在制备人感染H7N9禽流感抗体检测试剂中的用途。本发明采用生物信息学技术对现有H7N9HA、NA序列进行分析，筛选出4个抗原区段进行克隆表达，通过血清学试验筛选抗原的灵敏度和特异性，最终确定抗原3具有最高的诊断价值，可用于人感染H7N9禽流感抗体的检测。

Description

人感染H7N9禽流感表位抗原及其在免疫检测试剂中的用途

技术领域

本发明涉及人感染H7N9禽流感抗原，还涉及该抗原在制备检测人感染H7N9禽流感抗体检测中的用途。

背景技术

尽管2013年3月发现的人感染H7N9禽流感病毒多为散发病例，尚无人与人之间传播的确切证据，但已经波及10省市，上百人感染，数十人死亡，引起国家卫生和防疫部门的高度重视。

流感病毒根据核蛋白和基质蛋白的抗原特性和差异分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。其中H1N1、H2N2、H3N2亚型为我国人群常见甲型流感流行亚型，而H5、H7、H9亚型主要感染禽，其中H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3可感染人，2013年暴发的人感染H7N9流感病毒为新型重配病毒，是国际上首次报道H7N9能感染人的病例。

H7N9病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属，为单股负链RNA病毒，含有8个大小不等的基因节段。序列同源分析发现此次新发的人感染H7N9禽流病毒中的6个基因节段与2012年北京花鸡中分离的A/brambling/Beijing/16/2012-like viruses(H9N2)病毒高度同源；其余两个基因节段中，HA基因与浙江鸭子身上分离的A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)亚型中H7抗原高度同源，NA基因与韩国野鸟中分离的A/wild bird/Korea/A14/2011(H7N9)N9抗原高度同源，但两者的H7抗原并不相同，提示此次新发的H7N9禽流感病毒是以H9N2为内部基因的新型重配病毒(Gao R，Cao B，HuY，et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus.N Engl JMed.2013May16；368(20)：1888-97)。

HA和NA抗原是流感病毒表面的重要糖蛋白，具有很高的变异性，是流感病毒区分亚型的依据。其中HA抗原具有很强的免疫原性，并能刺激机体产生保护性抗体，是疫苗研究中的重要组份；NA抗原能水解唾液酸，是抗病毒药物研究的重要靶标。HA抗原在体内水解后形成HA1、HA2两个亚基，其中HA2相对保守，主要负责病毒与细胞之间的膜融合，实验动物显示抗HA2抗体没有很强的保护性抗体产生。不同亚型之间HA1抗原的变异较大，其抗体具有明显保护作用，如果去掉的抗HA1抗体，血清中的其他抗体不能有效抑制发生红细胞凝集和中和病毒的作用，这些研究提示HA1亚基在H7N9亚型的血清学鉴定中可能具有重要地位。NA抗原为蘑菇状的四聚体抗原，其抗C段具有和好的免疫原性，NA抗体能辅助HA抗体进行中和作用及血凝抑制功能。已有研究显示，重组HA1抗原可用于家禽流感病毒的检测和疫苗效果的评价，但重组HA1抗原用于人感染流感病毒的检测未见报道。

流感通过快速的变异逃逸机体原有的免疫反应，针对新的流感病毒株，宿主首先分泌IgM抗体，在对2009年新发的甲型H1N1流感的回顾性研究显示：发病当天就有84.7％的患者产生了抗流感病毒的IgM抗体，与2008年前流感人群血清的交叉性仅为6％；相比之下，IgG抗体在两组人群中并没有显著区别，这一发现提示对IgM抗体的检测能有效区分新发流感，具有很好地早期诊断价值。发病后4-10天，IgG抗体开始出现，患者血清表现出抑制红细胞凝集(HI)的现象，当清除掉血清中的IgM抗体，HI基本上不受影响；但清除掉IgG，HI作用显著降低，提示IgG是HI测试中主要抗体类型，在疫苗保护效果评价、临床转归中具有重要意义(Qiu C，Tian D，WanY，et al.Earlyadaptive humoral immune responses and virus clearance in humans recentlyinfected with pandemic2009H1N1influenza virus.PLoS One.2011；6(8)：e22603.)。

IgM抗体检测在疾病的早期诊断中具有重要地位。首先，IgM抗体检测简单快速，不需要专业人员和特殊设备，适合基层推广应用；其次，H7N9病毒主要存在于下呼吸道，在患者的痰和下呼吸道灌洗液中表现出长时间的高阳性率，但在鼻咽拭子的病毒检测中，阳性的检出率和持续时间都较短(ChenY，Liang W，Yang S，et al.Human infections with the emerging avian influenza AH7N9virus from wet market poultry：clinical analysis and characterisation ofviral genome.Lancet.2013；381(9881)：1916-25.)。相比之下，IgM抗体在体内存在时间长，不受药物治疗的干扰，检测结果更为稳定。另外，IgM检测在无症状携带者及隐性发病的患者检测中具有重要意义。国家CDC病毒实验室冯子建主任认为：检测出H7N9抗体，无论是否发病，均可证实其感染了H7N9病毒。

目前，国家对H7N9的检测主要采用甲型流感病毒抗原快速检测试剂进行初筛，再进行实时荧光定量PCR鉴定，尚无血清中H7N9-IgM抗体的免疫检测的相关试剂产品。主要原因在于H7N9为新发传染病，无相关免疫检测试剂研制的技术储备，另外，大部分人都感染过季节性流感(语句不通顺，建议申请人修改)，特别是我国在2009年曾经进行广泛的甲型H1N1流感疫苗的接种，体内仍会存有大量的抗流感病毒抗体，极大的影响H7N9免疫检测的特异性。

为此，本研究在生物信息学的基础上，筛选与季节流感存在较大差异的高特异性的人感染H7N9禽流感病毒HA和NA抗原表位序列，采用优化密码子拼接技术获得上述表位基因，进行克隆表达，获得H7N9主要诊断抗原的工程菌株，大量发酵制备相应的诊断抗原，在此基础上研制人感染H7N9禽流感病毒免疫检测试剂，用于人感染H7N9禽流感病毒检测及流行病学调查。

发明内容

为了满足人感染H7N9禽流感病毒免疫检测的需求，本发明通过对HA、NA抗原表位的生物信息学研究，对4种预测的优势抗原表位进行了克隆表达，并利用正常人群和H1N1流感疫苗接种者血清评价抗原的特异性，用人感染H7N9禽流感病毒患者血清评价4种抗原的灵敏度，筛选特异、敏感的抗原建立以间接酶联免疫技术为主的新型甲型H7N9抗体检测试剂。

本发明的目的是提供人感染H7N9禽流感病毒特异性抗原。

本发明公开的人感染H7N9禽流感病毒抗原，其氨基酸序列分别如序列表中下列序列所示：

(1)序列表中序列1，

(2)序列表中序列2，

(3)序列表中序列3，

(4)序列表中序列4，

本发明还公开了上述抗原在制备人感染H7N9禽流感病毒抗体检测试剂中的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1.发明是建立在酶联免疫反应的原理上

目前，人感染H7N9禽流感的检测多以基因检测为主，未见免疫检测试剂的研制。相比基因检测，本发明以重组抗原为基础建立的免疫检测技术简单快速，不需要专业人员和特殊设备，适合基层推广应用；另外，基因检测易受临床抗病毒治疗、取样及样本处理等多方面的影响，阳性的检出率和持续时间较短，而抗体在体内存在时间长，不受药物治疗的干扰，检测结果更为稳定。因此，本发明具有简单易操作、重复性好等特点而更易在基层得到推广和应用。

2.发明是建立在生物信息学与基因重组技术的基础上

人感染H7N9禽流感是一种新发突发传染病，目前，未见有关此次人感染H7N9禽流感抗原性分析的报道，本研究在生物信息学预测的基础上，分别选取可能具有较高抗原性4种抗原，并采用优势密码子技术，通过合成法获得相关基因，对其进行克隆表达并大量制备，整个操作流程未接触人感染H7N9禽流感病毒具有很好的生物安全性。

3.本发明具有一定的临床转归意义。

本发明在对人感染H7N9禽流感免疫检测的基础上，可以通过不同的酶标二抗对抗体的类型IgG、IgM进行鉴定。现代免疫学认为IgM的产生一般与疾病的急性感染有关，而IgG抗体的产生则意味着患者获得了对该疾病的保护。因此IgG、IgM的鉴定具有一定的临床转归意义，能弥补基因检测中的不足。

为实现上述目的，发明人利用生物信息学软件预测人感染H7N9禽流感病毒HA、NA序列的抗原性，共选择2种区段的HA抗原和2种区段NA抗原，其氨基酸序列分别如序列表中序列1-序列4所示。

基因工程抗原表达后，纯化上述4种抗原，分别包被酶联板，使用人感染H7N9禽流感病毒患者血清、健康人血清和甲型H1N1疫苗免疫血清对抗原活性进行鉴定，并根据反应情况，选择其中高特异性和高灵敏度的抗原，大量纯化制备，并以此为基础实现对人感染H7N9禽流感病毒抗体的ELISA检测。

采用IgG、IgM特异性的辣根酶标二抗实现对人感染H7N9禽流感病毒抗体类型的鉴定。

本发明是通过以下技术方案得以实现的：

利用BioSun软件预测人感染H7N9禽流感抗原表位，并设定不同的区间进行分别重组表达，然后使用ELISA对上述4种抗原的活性进行鉴定，并从中选择具有最高诊断价值的H7N9禽流感抗原用于H7N9抗体检测试剂的制备。

本发明为了有利于人感染H7N9禽流感基因在E.coli中获得高效的表达，选择大肠杆菌的偏性密码子设计并合成基因；为了便于基因克隆到表达载体，在连接臂的两端引入Xho I和Xba I两个酶切位点，以适合表达载体pBVIL1(参见中国专利ZL00100695.9：表达载体pBVIL1及其构建方法和用途)。双酶切后插入载体pBVIL1中，构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。

H7N9抗原表达质粒，转化E.coli HB101后，通过热诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明各表达质粒均已获得了高效的表达，再经离子交换柱及凝胶过滤纯化，均可获得电泳纯的人感染H7N9禽流感抗原纯品。用ELISA检测上述抗原与人感染H7N9禽流感免疫动物血清之间的反应性，选出其中可用于对人感染H7N9禽流感抗体检测的抗原。

采用上述人感染H7N9禽流感病毒抗原包被酶联板，采用间接酶联免疫法建立人感染H7N9禽流感检测技术，并采用16份人感染H7N9禽流感病毒患者血清和30份H1N1疫苗接种者血清和22份健康人血清对人感染H7N9禽流感病毒抗体检测的灵敏度和特异性进行检测，并采用ROC曲线对抗原的诊断意义进行判断，一般认为：对于一个诊断试验，ROC曲线下面积在0.5～0.7之间时诊断价值较低，在0.7～0.9之间时诊断价值中等，在0.9以上时诊断价值较高。

实验结果证明，本发明所提供的抗原3的ROC曲线面积为0.9952，灵敏度和特异性分别为98.08％和87.5％，在人感染H7N9禽流感病毒检测中具有较高的应用价值。

附图说明

附图1人感染H7N9禽流感病毒HA序列的抗原性分析；

附图2人感染H7N9禽流感病毒NA序列的抗原性分析；

附图33种人感染H7N9禽流感病毒抗原的ROC曲线分析；其中，曲线1代表抗原1；曲线2代表抗原2；曲线3代表抗原3。

具体实施方式

实施例1候选抗原表位的选择

我们通过BioSun生物信息学软件对人感染H7N9禽流感病毒序列进行抗原性进行预测，HA、NA抗原表位结果如图1、图2所示，每种抗原选取2个主要的优势抗原区段，其氨基酸序列分别如序列表中序列1-序列4所示。

实施例24种人感染H7N9禽流感抗原的克隆与表达

1.4种人感染H7N9禽流感病毒抗原表达质粒的构建

1.14种人感染H7N9禽流感病毒抗原基因的合成

根据上述4种人感染H7N9禽流感抗原的氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子委托上海英骏生物技术服务有限公司合成上述序列的基因，其基因序列分别如序列表中序列5-8所示。

1.24种人感染H7N9禽流感抗原表达质粒的构建

1.2.1PCR产物及表达载体pBVIL1双酶切

取以上合成基因产物及pBVIL1表达载体各30μl分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(H)4μl、Xba I(10u/μl)和Xho I(12u/μl)各1μl，加灭菌蒸馏水至40μl，置37℃水浴酶切过夜。

酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：PCR产物及载体pBVIL1经双酶切后，用1.2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收：即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。

1.2.2连接：于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1μl、10×T4DNA Ligase buffer1μl、T4DNA Ligase(12u/ul)1μl，加灭菌蒸馏水至10μl，置16℃过夜。

1.2.3转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物5μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3小时，42℃水浴摇床中诱导培养4h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。

2.抗原的表达与纯化

2.1表达菌株的培养：取-70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。

2.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃，1,2000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1％β-巯基乙醇。再于20℃，1,2000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。

2.3纯化：将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.05mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。

实施例3基于重组人感染H7N9禽流感抗原的IgG抗体检测(间接法)技术的建立及其应用

3.1基于重组人感染H7N9禽流感抗原的IgG抗体检测(间接法)技术的建立

将纯化的重组人感染H7N9用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释到2.0μg/ml，每孔100μl，4℃过夜后弃液，包被ELISA测定板，蒸馏水冲洗3次，拍干，每孔加入1％BSA100μl，室温2h，弃液。每孔加入100μl样品稀液后，分别加入10μl的待测样本血清，37℃30min，弃液，用洗涤液洗板5次后弃液，拍干，加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG单抗(1∶1000)100μl，37℃温浴20min，弃液洗板5次拍干。加TMB显色液：A和B液各50μl，37℃避光显色10min，每孔加入终止液50μl，用酶标仪读取450nm吸光值OD。OD＞0.1判断为阳性。

3.2重组人感染H7N9禽流感抗原的IgG抗体检测(间接法)技术的临床检测

本发明所提供的抗原1、2、3、4在30份H1N1疫苗接种者血清和22份健康人血清共52份阴性对照血清中的特异性分别为92.31％，98.08％，98.08％和73.08％(其中抗原4与阴性血清具有很大的交叉性，特异性差，未进行后续实验)；抗原1、2、3在16份人感染H7N9禽流感患者血清中的灵敏度分别为75％、81.25％、87.5％。ROC曲线分析结果显示参见图3：其中曲线1代表抗原1、曲线2代表抗原2、曲线3代表抗原3，3条曲线下的面积分别为0.8696、0.9868和0.9952。由此可见，抗原3具有很高的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种人感染H7N9禽流感抗原，其氨基酸序列如序列表中序列3所示。

2.权利要求1所述抗原在制备人感染H7N9禽流感免疫检测试剂中的用途。