CN102234317B - 甲型h1n1流感血凝素抗原及其在抗体检测试剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲型H1N1流感血凝素(HA)抗原，还公开了该抗原在制备甲型H1N1流感血凝素抗体检测试剂中的用途。本发明采用生物信息学技术对现有甲型H1N1流感HA序列进行分析，筛选出5个抗原区段进行克隆表达，并通过甲型H1N1流感疫苗者血清检测上述HA抗原的反应情况，建立间接酶联免疫法检测甲型H1N1流感血凝素抗体，并进一步对抗体类型进行鉴定，本发明不接触甲型H1N1流感病毒，安全性强，可用于人群甲型H1N1流感流行病学和疫苗保护效果的验证。

Description

甲型H1N1流感血凝素抗原及其在抗体检测试剂中的用途

技术领域

本发明涉及甲型H1N1流感血凝素抗原，还涉及该抗原在制备检测甲型H1N1流感血凝素抗体检测中的用途。 

背景技术

2009年爆发的新型甲型H1N1流感引起了全球关注(Dawood FS，Jain S，Finelli L，et al.Emergenceof a novel swine-origin infl uenza A(H1N1)virus in humans.N Engl J Med 2009；360：2605-15.)，甲型H1N1/2009流感病毒属于正黏病毒科，含有8个单股负链RNA片段，分别编码因PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，NS和MP等蛋白。其中RNA片段4(HA基因)编码病毒重要的膜蛋白血凝素(HA)，研究显示，HA含有细胞受体结合位点、介导病毒和细胞融合，是宿主特异性的主要决定因素，同时，HA抗原能诱导感染机体产生保护性中和抗体，因此，HA抗体的检测在流感病毒的研究中具有重要作用(Itoh Y，Shinya K，KisoM，et al.In vitro and in vivo characterization of new swine-origin H1N1 infl uenza viruses.Nature 2009；460：1021-25.)。 

由于HA抗体具有重要的保护作用，在疾病的转归、疫苗保护效果的评价、既往感染的流行病学调查中具有重要作用，因此HA抗体的检测具有重要的意义。由于缺少新型甲型H1N1流感特异性的HA抗原，目前，对HA抗体的检测主要采用的是血凝抑制实验、微孔中和测试等(Garten RJ，Davis CT，Russell CA，Shu B.Antigenic and Genetic Characteristics of Swine-Origin 2009 A(H1N1)Influenza VirusesCirculating in Humans Science.2009；325(5937)：197-201.) 

血凝检测主要是根据流感病毒的HA抗原能引起红细胞发生凝集作用这一原理进行的，而加入HA的抗血清后，抗原和抗体发生特异性结合，病毒则失去对红细胞的凝集作用，即血凝抑制试验。由此可见，血凝抑制检测无法区分IgG、IgM、IgA抗体，因此血凝抑制试验多用于对病毒的鉴定和疫苗保护效果的评价，在疾病的临床转归中意义不大。除此以外血凝试验和血凝抑制试验均需要病毒的培养，由于甲型H1N1流感具有很强的传染性，因此上述试验均需要在具有一定生物安全等级的试验室中才能展开，限制其在血清流行病学调查的应用。 

新型甲型H1N1流感HA共有566个氨基酸筑成，其中1-17为信号肽，18-344编码HA1亚基，346-566编码HA2亚基，第345的精氨酸在形成HA分子的过程中被水解掉。HA分子在病毒囊膜上以同源三聚体的形式存在，HA1位于组成抗原的头部，具有与宿主细胞受体结合的特性，至少含有5个抗原结构域，其抗体具有中和活性，是疫苗研究和特异型别诊断研究的靶点。HA2的N末端参与病毒和细胞融合的过程，属于高保守区，不同亚型之间具有明显的交叉性，抗体中和效果不明显。HA含有4-7个糖基化位点，其中大部分位于HA1，HA糖基化对宿主的限制性和毒力强弱有密切关系。尽管糖基化能给HA的抗原性带来一定的变化，但该变化能导致不同型别HA抗体之间的交叉性，这意味着非糖基化的抗原具有更好的特异性，特别是近年的研究显示，大肠杆菌表达得HA复性后能够保持抗原的立体构象，这些研究提示我们原核表达系统在特异性HA抗原筛选中具有一定的优势(Evaluation of hemagglutinin subtype 1 swine influenzaviruses from the United States1.Evaluation of hemagglutinin subtype 1 swine influenza virusesfrom the United States.Vet Microbiol.2006；118(3-4)：212-22)。 

HA抗原具有极高的变异性，为了逃避宿主的免疫压力，HA通过点突变形成抗原漂移(antigenicdrift)，产生新的病毒株。新毒株除了能突破原有的宿主特异性，更重要的是使宿主针对先前流行株的抗体不能再中和新出现的毒株，造成新病毒株在人群中的大量传播。2009年发生的新型甲型H1N1流感病毒是北美猪流感、禽流感和欧亚猪流感的复合毒株。显著特点是在人群中的传播迅速，表现出对人体的高度适应性。采用血凝试验对此次型甲型H1N1流感HA抗原的特异性进行鉴定，用古典猪H1病毒、曾经感染人的猪H1病毒、2009 A(H1N1)病毒、季节性H1和H3病毒免疫的雪貂抗血清该对18个墨西哥甲型H1N1流感分离株和38个美国流感分离株的抗原性进行鉴定。结果显示，不同地区发现的甲型H1N1流感病毒 具有相同的抗原性，与古典猪H1病毒、曾经感染人的猪H1病毒的抗原性相近，但与季节型流感病毒的雪貂抗血清并不交叉(Miller E，Hoschler K，Hardelid P，Stanford E，Andrews N，Zambon M.Incidenceof 2009 pandemic infl uenza A H1N1 infection in England：a cross-sectional serological study.Lancet 2010；S0140-6736(09)62126-7)。这些试验从血清学角度证明新型甲型H1N1-HA抗原具有一定的特异性，而特异性抗原区间的筛选和鉴定工作至今无人研究。 

对新型甲型H1N1流感HA的序列变异分析显示：：与2006、2007年美国俄亥俄州A/swine/H1N1病毒相差35～37个氨基酸，与我国的2008年以及2007年报道的甲型流感病毒(H1N1)的血凝素(HA)的氨基酸序列分别为70％～77％和71％～90％。而我们得研究显示，与我国的浙江猪流感病毒学序列相比，HA抗原共共发生了122处变异，并对这些变异引发的HA抗原性的改变进行了大量的预测。这些早期的对表位预测的生物信息学研究，为我们从蛋白水平验证HA抗原的免疫学特性打下了良好的基础，也为我们筛选特异性的HA抗原提供很好的技术支持。 

尽管甲型H1N1流感为新变异的病毒，但仍有少数人含有针对HA的交叉抗体，美国CDC的去年九月的血清流行病学研究显示，在1980年前出生的人群中有4％的人存在针对此次甲型H1N1流感HA交叉抗体，而英国学者采用疾病流行前的血清(2008年年底)进行的流行病学调查显示，大约有3％的15岁以下儿童和23％的成人及65岁以上老人具有交叉的HA抗体，这些流行病学的资料提示，在研制新的甲型H1N1流感抗体诊断试剂中，试剂的特异性要充分考虑选择人群中的HA抗体交叉的基础数据(Cross-reactiveantibody responses to the 2009 pandemic H1N1 infl uenza virus.N Engl J Med 2009；361：1945-52)，我国关于甲型H1N1流感的血清流行病学调查主要用于疫苗评价，国家疾控预防中心于2009年6-9月期间采用血凝试验，组织10家单位对国产疫苗的效果进行评价的结果显示：我国疫苗接种者HA抗体阳性的比率为85％。这些数据为本发明中HA抗体诊断试剂的评价提供了很好的数据支持(Liang XF，Wang HQ，Wang JZ.Safety and immunogenicity of 2009 pandemic influenza A H1N1 vaccines in China：amulticentre，double-blind，randomised，placebo-controlled trial.Lancet.2010；375(9708)：56-66)。 

发明内容

为了满足新型甲型H1N1流感HA抗体检测安全性的需求，本发明通过对HA抗原表位的生物信息学研究，对4种具有高抗原活性的HA抗原进行了克隆表达，并利用H1N1疫苗接种者血清检验4种抗原的特异性和灵敏度，建立以间接酶联免疫技术为主的新型甲型H1N1流感HA抗体检测试剂，并以此为基础进行对HA抗体的(IgG、IgM、IgA)类型进行鉴定。 

本发明的目的是提供甲型H1N1流感HA抗原。 

本发明公开的甲型H1N1流感HA抗原，其氨基酸序列分别如序列表中下列序列所示： 

(1)序列表中序列1， 

(2)序列表中序列2， 

(3)序列表中序列3， 

(4)序列表中序列4， 

(5)序列表中序列5， 

本发明还公开了上述甲型H1N1流感HA抗原在制备甲型H1N1流感HA抗体检测试剂中的用途。本发明提供了一种鉴定的甲型H1N1流感HA抗体类型的酶联免疫技术。 

与现有技术相比，本发明具有以下特点： 

1.发明是建立在间接免疫酶联检测的原理上 

目前，甲型H1N1流感HA抗体的检测多以血凝试验检测为主，通过检测待测血清能否抑制由甲型H1N1流感病毒引发的红细胞的凝集作用，确定甲型H1N1流感HA抗体的存在。本发明在HA特异性抗原的克隆表达基础上，在间接免疫酶联检测的基础上建立甲型H1N1流感HA抗体检测技术，可有效的避开检测过 程中使用具有强传染能力的甲型H1N1流感病毒，降低了整个实验的危险性。使本发明具有简单易操作、重复性好等特点而得到推广和应用。 

2.发明是建立在生物信息学与基因重组技术的基础上 

甲型H1N1流感是一种新发突发传染病，目前，未见有关此次甲型H1N1流感HA抗原性分析的报道，本研究在对HA抗原表位进行生物信息学预测的基础上，分别选取可能具有较高抗原性5种HA抗原，并利用大肠杆菌表达系统，对其进行克隆表达，并利用流行前献血者血清和疫苗接种21天血清筛选其中的高特异性、高灵敏度的HA抗原，为甲型H1N1流感HA抗体检测技术提供良好的科研基础。 

3.本发明具有一定的临床意义。 

本发明在对甲型H1N1流感HA抗体检测的基础上，进一步对HA抗体的IgG、IgM、IgA类型进行鉴定。现代免疫学认为IgM的产生一般与疾病的急性感染有关，而IgG抗体的产生则意味着患者或疫苗接种者获得了对该疾病的保护。因此IgG、IgM、IgA类型的鉴定具有一定的临床检测意义，能弥补血凝抑制试验中抗体类型无法鉴定的缺憾。 

为实现上述目的，发明人利用生物信息学软件分析甲型H1N1流感HA序列的抗原性，共选择4种区段的HA抗原，其氨基酸序列分别如序列表中序列1-序列4所示。 

基因工程表达后，纯化上述HA抗原，分别包被酶联板，使用流行前献血者血清和疫苗接种21天血清对上述5种抗原的活性进行鉴定，并根据反应情况，选择其中高特异性和高灵敏度的抗原，大量纯化制备，并以此为基础实现对甲型H1N1流感HA抗体的ELISA检测。 

采用IgG、IgM、IgA特异性的辣根酶标二抗实现对甲型H1N1流感HA抗体类型的鉴定。 

本发明是通过以下技术方案得以实现的： 

利用生物信息学软件，预测甲型H1N1流感HA抗原表位，并设定不同的区间进行分别重组表达，然后使用ELISA对上述4种抗原的活性进行鉴定，并从中选择1条甲型H1N1流感HA抗原用于甲型H1N1流感HA抗体检测试剂的制备。 

本发明为了有利于甲型H1N1流感HA基因在E.coli中获得高效的表达，选择大肠杆菌的偏性密码子设计并合成HA基因；为了便于基因克隆到表达载体，在连接臂的两端引入Xho I和Xba I两个酶切位点，以适合表达载体pBVIL1(参见中国专利ZL00100695.9：表达载体pBVIL1及其构建方法和用途)。双酶切后插入载体pBVIL1中，构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。 

甲型H1N1流感HA抗原表达质粒，转化E.coli HB101后，通过热诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明各表达质粒均已获得了高效的表达，再经离子交换柱及凝胶过滤纯化，均可获得电泳纯的甲型H1N1流感HA抗原纯品。用ELISA检测上述抗原与甲型H1N1流感HA疫苗接种者血清之间的反应性，选出其中可用于对甲型H1N1流感HA抗体检测的HA抗原。 

采用上述HA抗原包被酶联板，采用间接酶联免疫法建立HCV变异检测技术，并对试剂的灵敏度和特异性进行检测。 

实验结果证明，本发明所提供的甲型H1N1流行前组中有4例HA-IgG为阳性，102例阴性，阳性率为3.77％；疫苗组中78例HA-IgG为阳性，19例阴性，阳性率为80.41％，与国家CDC的统计结果较为相近。显示甲型H1N1病毒HA-IgG抗体检测试剂具有较高的特异性和灵敏度，在甲型H1N1病毒疫苗疗效评价具有一定的应用价值。 

附图说明

附图1纯化后的5种甲型H1N1流感HA抗原的SDS-PAGE 

具体实施方式

实施例1 候选抗原表位的选择 

我们通过生物信息学软件对甲型H1N1流感HA序列进行抗原性进行预测，结果如图1所示，含有5个主要的抗原区段，其序列分别如序列表中序列1-序列5所示。 

实施例2 5种甲型H1N1流感HA抗原的克隆与表达 

1.5种甲型H1N1流感HA抗原表达质粒的构建 

1.1 5种甲型H1N1流感HA抗原基因的合成 

根据上述5种甲型H1N1流感HA抗原的氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子委托上海英骏生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。 

1.2 5种甲型H1N1流感HA抗原表达质粒的构建 

1.2.1 PCR产物及表达载体pBVIL1双酶切 

取以上合成基因产物及pBVIL1表达载体各30μl分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(H)4μl、Xba I(10u/μl)和Xho I(12u/μl)各1μl，加灭菌蒸馏水至40μl，置37℃水浴酶切过夜。 

酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：PCR产物及载体pBVIL1经双酶切后，用1.2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收：即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。 

1.2.2 连接： 

于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1μl、10×T4 DNA Ligase buffer1μl、T4 DNA Ligase(12u/ul)1μl，加灭菌蒸馏水至10μl，置16℃过夜。 

1.2.3 转化： 

在超净工作台中，用无菌吸头取100μl感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物5μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3小时，42℃水浴摇床中诱导培养4h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。 

2.抗原的表达与纯化 

2.1 表达菌株的培养： 

取-70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。 

2.2 提取包涵体： 

将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃，1,2000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0 TE配制)溶解，加1％ β-巯基乙醇。再于20℃，1,2000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。 

2.3 纯化： 

将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％ β-巯基乙醇)清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.05mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。 

3.5种甲型H1N1流感HA抗原活性鉴定 

将纯化的候选抗原用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释到2.0μg/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对本室保存的内质控血清(含国内10份甲型H1N1流感疫苗接种者血清和10份流行前健康献血者血清)进行了测定。结果如表1所示。抗原2具有很高的特异性和灵敏度 

表1 不同甲型H1N1流感HA抗原活性检测 

实施例3 甲型H1N1流感HA抗体检测及临床意义 

采用HA抗原2包被酶联板，利用间接ELISA法对甲型H1N1流感HA抗体进行检测，结果如表2所示：106例甲型H1N1病毒流行前标本组中有4例HA-IgG检测结果为阳性，102例阴性，阳性率为3.77％。97例疫苗组中78例HA-IgG检测为阳性，19例阴性，阳性率为80.41％。疫苗组阳性率显著高于疾病流行前组(P＜0.01)。 

表2 甲型H1N1流感病毒HA抗体检测 

序列表

<110>军事医学科学院基础医学研究所

<120>甲型H1N1流感血凝素抗原及其在制备甲型H1N1流感血凝素抗体检测试剂中的

     用途

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>43

<212>PRT

<213>甲型H1N1流感病毒(Influenza A(H1N1)virus)

<400>1

Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val

1               5                   10                  15

Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu

            20                  25                  30

Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys

        35                  40

<210>2

<211>93

<212>PRT

<213>甲型H1N1流感病毒

<400>2

Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val Glu Thr Ser Ser

            20                  25                  30

Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile Asp Tyr Glu Glu

        35                  40                  45

Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile

    50                  55                  60

Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp Ser Asn Lys Gly Val

65                  70                  75                  80

Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe Tyr

                85                  90

<210>3

<211>81

<212>PRT

<213>甲型H1N1流感病毒

<400>3

Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu

1               5                   10                  15

Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp

            20                  25                  30

Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr Gln

        35                  40                  45

Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser Lys Lys

    50                  55                  60

Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu Gly

65                  70                  75                  80

Arg

<210>4

<211>81

<212>PRT

<213>甲型H1N1流感病毒

<400>4

Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala

1               5                   10                  15

Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys

            20                  25                  30

Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly

        35                  40                  45

Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys

    50                  55                  60

Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu

65                  70                  75                  80

Val

<210>5

<211>82

<212>PRT

<213>甲型H1N1流感病毒

<400>5

Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys

1               5                   10                  15

Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu

            20                  25                  30

Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys

        35                  40                  45

Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu

    50                  55                  60

Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser

65                  70                  75                  80

Thr Arg

Claims (3)

1.一种甲型H1N1流感HA抗原，其特征在于氨基酸序列为序列2所示。

2.权利要求1中所述的抗原在制备检测甲型H1N1流感血凝素抗体的检测试剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的检测试剂中还含有检测IgG、IgM或IgA的抗体类型的试剂。

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