CN103197054A

CN103197054A - 一种抗原共组装的传感界面

Info

Publication number: CN103197054A
Application number: CN2013101184281A
Authority: CN
Inventors: 樊春海; 宋世平; 邓王平; 冯正; 胡薇
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2013-04-07
Filing date: 2013-04-07
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明涉及一种抗原共组装的传感界面，包括作为固相载体的传感元件，传感元件的表面通过物理吸附或者共价偶联的方式修饰有天然抗原和重组抗原，传感元件的未结合有天然抗原和重组抗原的表面上覆盖有封闭剂层。本发明提供的传感界面采用天然抗原与重组抗原混合共组装的方式，很好地提高了检测抗体的灵敏度及特异性，同时，大大降低了天然抗原的用量，避免了天然抗原来源有限，制备繁琐等缺陷，降低了生产成本，同时易于标准化、商品化和规模化，而且有望应用于临床。因此本发明为特异性抗体的检测及其临床应用提供了一种新的思路及技术支撑。

Description

一种抗原共组装的传感界面

技术领域

本发明涉及特异性抗体检测领域，具体涉及一种抗原共组装的传感界面。

背景技术

免疫学检测技术已广泛应用于医学和生物学领域的研究，但迄今为止，在临床检验工作中，以特异性抗体的检测应用最广泛。特异性抗体检测首先可以协助临床诊断，在某些疾病中亦是观察疗效及预后的一个指标，其在预防接种效果的观察，以及传染病流行病学调查中，也具有特殊的、重要的意义。对于细菌、病毒、寄生虫等病原微生物引起的感染性疾病，由于病原体检测受到其生长所需条件高，生长时间长，检出阳性率低等限制给临床诊断带来一定困难，因此特异性抗体的检测尤为重要。

现在抗体检测的方法众多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定（如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等）已成为主要的免疫测定技术，目前发展起来的电化学免疫传感技术因其具有检测快速、仪器轻便、操作简单、能耗低、成本低廉、易于微型化、集成化、适用于即时检测、现场检测等优点而被视为科学研究和临床检测最具潜力的检测方法。

然而抗体检测的灵敏度及特异性除了与所选实验方法有关外，主要与界面固定的捕获抗原的特性有关。抗原在固相界面固定的方式、种类、数量及固定后其生物活性等直接影响抗体检测的稳定性、重现型、灵敏度及特异性等性能。用于诊断的捕获抗原按其来源不同包括天然抗原和重组抗原。

常用的抗体检测方法，大多采用天然抗原进行免疫检测，虽然其诊断灵敏度高，但由于天然抗原常常含有宿主抗原或不同亚型及虫株抗原的共有成分，易产生交叉反应，因而免疫检测的特异性不理想。此外由于天然抗原的来源有限，且其提取及纯化过程比较复杂，难以控制且耗资大，不易标准化和规模生产，大大限制了其在大规模筛查中的应用。

随着分子生物学技术的发展，分子克隆技术广泛地应用到诊断抗原制备中，通过基因工程方法制备重组抗原，所获抗原纯度高，可以批量生产，易于质量控制，不仅可以解决大量诊断抗原的来源，而且有利于检测方法的标准化。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。在传染病诊断中，不少重组抗原已在免疫检测中取得应用。如用于病毒病诊断的HBsAg、HBeAg和HIV抗原，用于寄生虫病诊断的曼氏血吸虫31/32kD蛋白、原肌球蛋白,23kD膜蛋白、热应急蛋白重组抗原，日本血吸虫31/32kD蛋白，谷胱甘肽转移酶蛋白，脂肪酸结合蛋白、钙结合蛋白重组抗原、多房棘球绦虫EM10重组抗原、马来丝虫BmM14重组抗原、盘尾丝虫OC3.6和OC9.3重组抗原等。然而这些重组抗原与抗体的亲和力仍有限，导致其检测灵敏度并不够高。

总之，现有技术中均仅涉及单独将天然抗原或重组抗原修饰到传感元件上用于抗体检测，还没有任何涉及将天然抗原和重组抗原一起修饰到传感元件上用于抗体检测的报道。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的天然抗原特异性不够高而重组抗原灵敏度不理想的问题，本发明旨在提供一种抗原共组装的传感界面。

本发明所述的抗原共组装的传感界面，包括作为固相载体的传感元件，所述传感元件的表面通过物理吸附或者共价偶联的方式修饰有天然抗原和重组抗原，所述传感元件的未结合有天然抗原和重组抗原的表面上覆盖有封闭剂层。

所述天然抗原是病原微生物的裂解液或培养液。该天然抗原可以是寄生虫、细菌、病毒等病原微生物的裂解液或培养液，可以是颗粒性抗原或可溶性抗原。

所述重组抗原是通过基因工程方法将病原微生物的抗原基因克隆到原核或真核表达系统而表达和纯化的抗原。该重组抗原是通过基因工程方法将寄生虫、细菌、病毒等病原微生物的抗原基因克隆到原核或真核表达系统而表达和纯化的抗原，在本发明的传感界面中所用的重组抗原是病原微生物特有的且在疾病诊断中有一定的应用价值，其可以是一种，也可以是多种混合。

所述传感元件是电极、玻璃基片或微量滴定板。

所述电极选自由玻碳电极和金电极组成的圆盘电极，或由印刷碳电极和印刷金电极组成的薄膜印刷电极。

所述微量滴定板是聚苯乙烯微孔板、聚氯乙烯微孔板或聚四氟乙烯微孔板。

所述封闭层是含有与待检测抗体无任何特异性结合反应的蛋白溶液。该封闭层的作用是封闭传感元件表面未结合上特异诊断抗原的位点，从而减少后续检测反应中所涉及的蛋白在传感元件上的非特异结合。因此，该封闭层可以降低背景，提高信噪比，从而提高传感界面检测的灵敏度及特异性。

所述蛋白溶液含有牛血清白蛋白或酪蛋白。该蛋白溶液中的具体蛋白的浓度可以根据需要进行调节，例如1%-3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

所述天然抗原与所述重组抗原的质量比为1：4-1：64。

优选地，所述天然抗原与所述重组抗原的质量比为1：8。

优选地，所述天然抗原是血吸虫可溶性虫卵抗原SEA，所述重组抗原是血吸虫重组抗原SjE16。优选地，所述血吸虫重组抗原SjE16具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：MSDENRWIAV FNSLDKDGNK LLTRDEIEQCLKSLGVSESF AEKIIKETDL NKDGKISLDE YLKALPKIPP RDKCSSVERWKEVFQSIDKD NSGKVSAKEL DEFLKSTGND INKSCLENWMATNDKNKDGE LDYAEFLAYV RQTYE。

优选地，所述天然抗原是甲型H1N1流感病毒裂解液，所述重组抗原是甲型H1N1流感病毒重组抗原HA。

优选地，所述天然抗原是结核杆菌培养液，所述重组抗原是结核杆菌重组抗原。

应该理解，本发明提供的抗原共组装的传感界面具有普适性，其可以用于寄生虫、细菌、病毒等病原微生物感染样品的特异性抗体检测，即可以用于动物血清的检测，也可以用于人血清中的检测；即可以用于特异性抗体的定性检测（以阴性对照信号的2.1倍作为阈值，信号大于或等于阈值的被定性为阳性样本，信号小于阈值的被定性为阴性样本），也可以用于其定量检测（参见实施例3）；检测既可通过光学信号输出（参见实施例4和实施例5），也可以通过电学信号输出（参见涉及印刷电极，金电极，玻碳电极的实施例）。本发明提供的传感界面采用天然抗原与重组抗原混合共组装的方式，可以减少因共有天然抗原组分引起的种属间交叉反应，同时改善仅用重组抗原检测抗体的灵敏度。结果表明本发明提供的基于天然及重组抗原混合共组装的传感界面很好地提高了检测抗体的灵敏度及特异性，同时，大大降低了天然抗原的用量，避免了天然抗原来源有限，制备繁琐等缺陷，降低了生产成本，同时易于标准化、商品化和规模化，且有望应用于临床。因此本发明为特异性抗体的检测及其临床应用提供了一种新的思路及技术支撑。

附图说明

图1是实施例1中以玻碳电极为传感元件电化学定性检测兔血清中血吸虫抗体的结果；

图2是实施例2中以印刷碳电极为传感元件电化学定性检测人血清血吸虫抗体的结果；

图3是实施例2中以印刷碳电极为传感元件电化学半定量检测人血清血吸虫抗体的结果；

图4是实施例2中以印刷碳电极为传感元件电化学定性检测血吸虫抗体的敏感性及特异性考察结果；

图5是实施例4中以玻璃基片为传感元件荧光法定性检测血吸虫抗体的结果；

图6是实施例5中以玻碳电极为传感元件电化学定性检测人血清中甲型H1N1流感病毒抗体的结果；

图7是实施例6中以金电极为传感元件电化学定性检测人血清中结核抗体的结果。

具体实施方式

下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。

实施例1：以玻碳电极为传感元件电化学定性检测兔血清中血吸虫抗体

玻碳电极表面处理：将玻碳电极在pH7.0的磷酸缓冲液（PB）中活化：于1.5V加压120s，-1.5V加压120s，然后分别在水和酒精中超声清洗；

传感界面构建：400mM碳二亚胺（EDC）与100mM N-羟基琥珀酰胺（NHS）等体积混合滴加于电极表面，室温15min，水洗，吹干。将由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供的血吸虫重组抗原SjE16与血吸虫可溶性虫卵抗原SEA以8:1的质量比混合，滴加3ul于电极表面，室温反应2h,用含0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液（PBST）冲洗电极。将电极浸入含1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲溶液中封闭1.5h，PBST冲洗电极，氮气吹干。

免疫反应：将正常兔血清（阴性血清）及血吸虫感染兔血清（阳性血清）分别用PBST稀释100倍，滴加3ul于电极表面，室温反应30min，PBST冲洗，氮气吹干，辣根过氧化物酶标二抗（HRP-Ab2）用PBST稀释1000倍，滴加3ul于电极表面，室温反应30min，PBST冲洗。

电化学检测：将玻碳电极插入四甲基联苯胺（TMB）中，用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极进行循环伏安（CV）法及时间电流曲线（IT）法测试，最终记录50s的稳态电流，检测不同血清抗体的电流值结果如附图1所示，阳性兔血清的电流值约为2193nA，阴性兔血清的电流值约为137nA，扣除空白46nA后两者之间的比例为23.59，也即阳性信号大于阈值（阴性参照的2.1倍），从而说明本发明的共组装传感界面可采用玻碳电极作为传感元件对寄生虫特异性抗体进行电化学定性检测。

其中值得注意的是，本发明所选用的天然抗原与重组抗原的共组装的目的是在提高抗体检测灵敏度及特异性的前提下，尽量减少天然抗原的组装用量。因此在共组装过程中不仅要提高重组抗原及天然抗原的组装效率，同时要充分保证两种抗原的活性，因此两种抗原的共组装方式、混合组装比例是需要考察和克服的关键因素。这是在将天然抗原或重组抗原单独修饰到传感元件中所无需考虑的。

实施例2以印刷碳电极为传感元件电化学检测血吸虫抗体

印刷碳电极表面处理：印刷碳电极在PB缓冲液中进行循环伏安法扫描以活化电极，电压范围-0.3V～0.6V，扫速0.5V/s，扫描10个循环，然后超纯水冲洗，氮气吹干。

传感界面构建：在电极上滴加10ul含有200mM EDC与50mM NHS的水溶液于电极表面，室温反应15min活化羧基。将单一SEA抗原及不同比例混合的SjE16与SEA混合抗原，分别滴加10ul于电极表面，室温反应2h,用PBST冲洗电极，氮气吹干。再在电极表面滴加50ul1%BSA室温封闭1h,然后冲洗电极，吹干表面。

免疫反应：将100倍稀释的正常血清（即阴性对照血清）、不同倍比稀释的血吸虫感染血清（即阳性对照血清）分别滴加10ul至印刷碳电极上；室温下孵育30min，PBST清洗电极表面。然后将稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记二抗滴加于电极表面，室温反应30min。

电化学检测：将酶底物TMB滴加于上述反应后的电极表面，采用时间电流曲线法进行检测，读取稳态电流值作为检测信号。

采用印刷碳电极作为传感元件构建不同比例混合抗原共组装的传感界面，其检测血清抗体的结果见附图2，结果表明重组抗原SjE16与天然抗原SEA的质量比在4:1～64:1的范围内时，共组装Sj16EA检测血吸虫阳性参比血清的信号及其与阴性参比血清的P/N比值均大于单独组装SEA的，说明共组装能够提高人血清中SjAb检测的灵敏度，但与单度组装SEA组相比，共组装组阳性信号及P/N比值增加的幅度先变大，后变小，最终我们选取阳性信号及P/N比值增加幅度均为最大的点也即250ng SjE16与30ng SEA（8:1）共组装作为最佳比例。

采用8:1的比例共组装SjE16及SEA抗原对血清中SjAb的含量进行半定量检测，将血吸虫感染血清先按1:100稀释，然后倍比稀释到1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍，阴性对照血清按1:100稀释，结果见附图3，空白对照平均电流为86nA，阴性对照平均电流为179nA,因此阈值（扣除空白后的阴参电流的2.1倍）为195nA，1:1600倍稀释血清的电流信号为285.5nA，扣除空白后大于阈值，而1:3200倍稀释血清的电流值为233nA，扣除空白后小于阈值，因此可以判定该血清的效价为1：1600.由此可见本发明中的传感界面可以用于特异性抗体的半定量检测。

采用此传感界面对随机挑选的10份正常人血清及10份血吸虫感染人血清进行检测，设定阴性对照电流值的2.1倍为阈值，当样本信号值与阈值的比值大于或等于1时，样本被判定为阳性，反之，当信号与阈值之比小于1时，样本被判定为阴性。结果如附图4，基于混合抗原共组装的传感界面（Sj16EA）检测10份正常人血清的信号与阈值之比均小于1，因此全部被检出为阴性，说明其阴性检出率也即检测特异性为100%，而检测10份血吸虫病人血清的信号与阈值之比均大于1，因此全部被检出为阳性，说明其阳性检出率也即检测灵敏度为100%，而单一天然抗原（SEA）传感界面检测10份正常人血清的信号与阈值之比均小于1，因此全部被检出为阴性，说明其阴性检出率也即检测特异性为100%，而检测10份血吸虫病人血清时，只有9份血清的信号与阈值之比大于1，被检出为阳性，其中一份血清为假阴性，说明单一SEA传感界面的阳性检出率也即检测灵敏度为90%。单一重组抗原（SjE16）传感界面检测10份正常人血清时，只有9份血清的信号与阈值之比小于1，被检出为阴性，其中一份血清为假阳性，说明单一重组抗原SjE16传感界面阴性检出率也即检测特异性为90%，而检测10份血吸虫病人血清时，只有9份血清的信号与阈值之比大于1，被检出为阳性，其中一份血清为假阴性，说明其阳性检出率也即检测灵敏度为90%。以上结果表明，本发明中基于混合共组装的传感界面在检测血清特异性抗体的敏感性及特异性方面均表现出更好的检测性能。

实施例3以聚苯乙烯微孔板为传感元件比色法检测血吸虫抗体

传感界面构建：用包被缓冲液稀释血吸虫可溶性虫卵抗原及血吸虫SjE16重组抗原，将1.2ug/ml的SEA与5ug/ml的SjE16等体积混合滴加于96通道微孔板中，100ul/孔，4度包被过夜，PBST洗涤，然后用含3%BSA的PBST封闭，37度2h，PBST洗涤。

免疫反应：将稀释后的血吸虫阴性对照血清、血吸虫阳性对照血清或血吸虫感染血清，分别滴加至微孔板内，100ul/孔，37℃孵育60min，PBST洗涤。滴加10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育60min，PBST洗涤，拍干。

比色法检测：向微孔板内加入100ul TMB，37℃反应10min，加入50ul2MH2SO4终止反应，于酶标仪上测OD_450nm。采用此传感界面对6份阳性血清进行比色法检测，阈值设为阴性对照血清OD值的2.1倍。大于或等于阈值的血清样本被判定为阳性，小于阈值的血清样本为阴性，检测结果如表1所示。其中5份血吸虫感染阳性血清被检出为阳性，一份血吸虫感染阳性血清被检出为假阴性，其检测6份血清的敏感性为83.3%，说明本发明中的共组装传感界面以微孔板为基底通过光学定性检测特异性抗体。

表1以聚苯乙烯微孔板为传感元件比色法检测血吸虫感染血清样本的敏感性

Figure 2013101184281100002DEST_PATH_IMAGE001

阈值：0.916

实施例4.以玻璃基片为传感元件荧光法定性检测血吸虫抗体

传感界面构建：用点样液稀释SEA至6ug/ml，SjE16抗原至50ug/ml，在醛基化玻片上点样，于4度固定16h.清洗玻片，然后用封闭液封闭玻片表面37℃1h，清洗玻片。

免疫反应：将稀释好的血吸虫阴性对照血清及血吸虫阳性对照血清分别滴加20ul到点样区域，于37度反应30min,清洗基片，再滴加1000倍稀释的Cy3标记二抗，37℃孵育30min，清洗基片。

荧光检测：利用荧光扫描仪进行荧光信号检测。

检测不同血清抗体的荧光值结果如附图5所示，空白对照为PBST，阴性血清为10份正常人的混合血清，阳性血清是10份血吸虫感染人的混合血清，空白对照的荧光强度约为58au,阴性血清的荧光强度约为133au，阳性血清的荧光强度约为723au，扣除空白后阳性血清与阴性血清荧光强度之比为8.87，大于2.1倍，很好地区分了正常人血清与血吸虫感染人血清，说明本发明中的共组装传感界面可采用玻璃基片作为传感元件对特异性抗体进行光学定性检测。

实施例5：以玻碳电极为传感元件电化学定性检测人血清中甲型H1N1病毒抗体

传感界面构建：400mM碳二亚胺（EDC）与100mM N-羟基琥珀酰胺（NHS）等体积混合滴加于电极表面，室温15min，水洗，吹干。将由中国军事医学科学院提供的甲型H1N1流感病毒重组抗原HA与甲型H1N1流感病毒裂解液以8:1的质量比混合，滴加3ul于电极表面，室温反应2h,用含0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液（PBST）冲洗电极。将电极浸入含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中封闭1.5h，PBST冲洗电极，氮气吹干。

免疫反应：将正常人血清及甲型H1N1流感病毒感染人血清分别用PBST稀释100倍，滴加3ul于电极表面，室温反应30min，PBST冲洗，氮气吹干，辣根过氧化物酶标二抗（HRP-Ab2）用PBST稀释1000倍，滴加3ul于电极表面，室温反应30min，PBST冲洗。

电化学检测：具体步骤同实施例1.检测不同血清抗体的电流值结果如附图6所示，甲型H1N1流感病毒感染病人血清的电流值约为1739nA,正常人血清的电流值约为169nA,扣除空白信号46nA后两者之间的比值为13.76，也即阳性信号均大于阈值（阴性参照的2.1倍），从而说明本发明的共组装传感界面可以对病毒特异性抗体进行电化学定性检测。

实施例6以金电极为传感元件电化学定性检测人血清结核抗体

金电极表面处理：金电极用磨粉打磨，然后依次在无水乙醇和水中超声清洗，再在0.5M硫酸中进行电化学清洗。将清洗好的金电极放入等体积比的巯基四乙酸和巯基四乙醇中室温组装过夜。已羧基化的金电极用水洗后，氮气吹干。

传感界面构建：400mM碳二亚胺（EDC）与100mM N-羟基琥珀酰胺（NHS）等体积混合滴加于电极表面，室温15min，水洗，吹干。将由中国军事医学科学院提供的结核杆菌重组抗原与结核杆菌培养液以8:1的质量比混合，滴加3ul于电极表面，室温反应2h,用含0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液（PBST）冲洗电极。将电极浸入含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中封闭1.5h，PBST冲洗电极，氮气吹干。

免疫反应：将正常人血清及肺结核病人血清分别用PBST稀释100倍，滴加3ul于电极表面，室温反应30min，PBST冲洗，氮气吹干，辣根过氧化物酶标二抗（HRP-Ab2）用PBST稀释1000倍，滴加3ul于电极表面，室温反应30min，PBST冲洗。

电化学检测：具体步骤及条件同实施例1

检测不同血清抗体的电流值如附图7所示，空白对照电流值为53nA,正常人血清的电流值为219nA,肺结核病人血清的电流值为3063nA，扣除空白信号后两者之间的比值为18.02.也即阳性参照人血清的电流值远大于阈值（阴性参照血清的2.1倍），说明本发明中的传感界面可对细菌特异性抗体进行电化学定性检测。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims

1.一种抗原共组装的传感界面，包括作为固相载体的传感元件，其特征在于，所述传感元件的表面通过物理吸附或者共价偶联的方式修饰有天然抗原和重组抗原，所述传感元件的未结合有天然抗原和重组抗原的表面上覆盖有封闭剂层。

2.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述天然抗原是病原微生物的裂解液或培养液。

3.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述重组抗原是通过基因工程方法将病原微生物的抗原基因克隆到原核或真核表达系统而表达和纯化的抗原。

4.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述传感元件是电极、玻璃基片或微量滴定板。

5.根据权利要求4所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述电极选自由玻碳电极和金电极组成的圆盘电极，或由印刷碳电极和印刷金电极组成的薄膜印刷电极。

6.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述微量滴定板是聚苯乙烯微孔板、聚氯乙烯微孔板或聚四氟乙烯微孔板。

7.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述封闭层是含有与待检测抗体无任何特异性结合反应的蛋白溶液。

8.根据权利要求7所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述蛋白溶液含有牛血清白蛋白或酪蛋白。

9.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述天然抗原与所述重组抗原的质量比为1：4-1：64。

10.根据权利要求9所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述天然抗原与所述重组抗原的质量比为1：8。

11.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述天然抗原是血吸虫可溶性虫卵抗原SEA，所述重组抗原是血吸虫重组抗原SjE16。

12.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述天然抗原是甲型H1N1流感病毒裂解液，所述重组抗原是甲型H1N1流感病毒重组抗原HA。

13.根据权利要求1所述的抗原共组装的传感界面，其特征在于，所述天然抗原是结核杆菌培养液，所述重组抗原是结核杆菌重组抗原。