CN116751283A - 一种猴痘病毒单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种猴痘病毒单克隆抗体及其制备与应用，属于生物技术领域。该猴痘病毒单克隆抗体是以具有猴痘病毒B17R蛋白和D9L蛋白的2个优势线性抗原的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原为免疫源，经过B细胞筛选，重、轻链载体构建表达和多轮筛选检测，获得的纯化的猴痘病毒单克隆抗体，可特异性识别猴痘病毒，用于猴痘病毒感染诊断。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体涉及一种猴痘病毒单克隆抗体及其制备与应用。
背景技术
传染性疾病猴痘(Monkeypox，MPX)是由猴痘病毒(Monkeypox virus，MPXV)感染导致的一种病毒性人兽共患病，跨物种传播，可以由动物传给人，并且能够人际传播。MPXV属于正痘病毒家族，与著名的天花病毒是近亲，两者的临床症状相似，但感染MPXV的病情、传播和死亡率均弱于天花。1980年，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)宣布根除天花，随即停止免疫接种天花，导致没有接种天花疫苗的人群相应的免疫力下降或缺乏，属于易感人群。而MPX是消灭天花以来人类最严重的正痘病毒感染，MPX可能会填补天花病毒所腾出的流行病学生态位。由于没有接种天花疫苗的群体对猴痘的免疫力下降，增加了人对疫情暴发的易感性，此外，流行地区的社会政治、生态变化、野生动物贸易、便利的国际旅行等多种因素，增加了人接触与感染MPXV的机会。
尽管猴痘病毒具有自限性，致死率相对天花病毒较低，但是啮齿类动物和一些哺乳动物是猴痘病毒的天然病毒库，贮存宿主较为广泛，导致存在被基因修饰为更高毒株的危险性。因此，研发一种具有高亲和力和特异性的猴痘病毒单克隆抗体是非常有必要的，可以提供对早期猴痘病毒感染的快速检测手段。
正痘病毒属在病毒形态、生命周期和结构上表现出高度的相似性，基因组序列之间的同源性高达90％以上。因此，寻找一种能有效区分痘苗病毒(Vaccinia virus，VACV)、鼠痘病毒(Ectromelia virus，ECTV)和猴痘病毒的特异性抗原显得更为重要，这是影响猴痘检测准确性的重要因素。
目前，临床和科研针对猴痘病毒的特异性快速检测主要为核酸检测试剂盒、临床诊断等方法。但是核酸检测试剂盒耗时较长，临床诊断很难与其它痘病毒感染区分，均不利于快速诊断。
发明内容
1.发明目的
本申请的发明目的之一是提供一种猴痘病毒特异性重组蛋白抗原，该猴痘病毒特异性重组蛋白抗原可有效区分猴痘病毒和其他正痘病毒。
本申请的发明目的之二是提供一种猴痘病毒单克隆抗体，该猴痘病毒单克隆抗体是以猴痘病毒特异性重组蛋白抗原为免疫原制备，仅能特异性识别猴痘病毒，提高了猴痘病毒检测的准确性。
2.技术方案
为了达到上述目的，本申请所采用的技术方案如下：
本申请提供了一种猴痘病毒特异性重组蛋白抗原，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示，该猴痘病毒特异性重组蛋白抗原，仅含有猴痘病毒D9L蛋白和B17R蛋白的特异性优势抗原表位，可有效区分猴痘病毒和其他正痘病毒，保证了以其为免疫原制备的猴痘病毒单克隆抗体仅能特异性识别猴痘病毒，提高了猴痘病毒检测的准确性。
本申请还提供了一种核酸，该核酸编码上述猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。
进一步地，上述编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，该核酸序列为在猴痘病毒特异性重组蛋白抗原氨基酸序列不变的前提下，通过稀有密码子在线软件对编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子替换大肠杆菌稀有密码子，使得编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸不含有大肠杆菌的稀有密码子，从而提高猴痘病毒特异性重组蛋白抗原在大肠杆菌中的表达量。
本申请还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有上述编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸，可以表达猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。
进一步地，上述重组表达载体包括：含有上述编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸的pET 28a(+)质粒。
本申请还提供了一种重组表达菌，该重组表达菌包括上述重组表达载体或上述编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸，可以表达猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。
进一步地，上述重组表达菌包括：有上述重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)。
本申请还提供了上述核酸、重组表达载体、重组表达菌在制备猴痘病毒特异性重组蛋白抗原中的应用。
本申请还提供了上述一种猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)重组表达载体的构建：将上述编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸克隆到表达载体中，得到重组表达载体：
(2)重组表达菌的构建：将得到的重组表达载体转入宿主菌，得到重组表达菌：
(3)重组表达菌的培养：利用重组表达菌诱导表达猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。
进一步地，上述一种猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的制备方法，还包括：
(4)猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的分离和纯化：分离和纯化步骤(3)得到猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。
本申请还提供了上述一种猴痘病毒特异性重组蛋白抗原、核酸、重组表达载体和/或重组表达菌在制备猴痘病毒单克隆抗体中的应用。
进一步地，上述应用包括：将上述猴痘病毒特异性重组蛋白抗原和弗氏佐剂联合免疫新西兰大耳白兔的方式，制备并纯化获得猴痘病毒单克隆抗体。
本申请还提供了一种猴痘病毒单克隆抗体，该单克隆抗体能特异性的与猴痘病毒结合，包括重链可变区和轻链可变区，包括如下任意一种：
(1)单克隆抗体H15L114，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
(2)单克隆抗体H31L137，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
(3)单克隆抗体H51L152，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
(4)单克隆抗体H61L161，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
(5)单克隆抗体H71L172，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
进一步地，上述猴痘病毒单克隆抗体，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本申请还提供了一种核酸，该核酸编码上述猴痘病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区、重链恒定区或轻链恒定区。
进一步地，上述核酸编码猴痘病毒单克隆抗体H15L114，编码重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步地，上述核酸编码猴痘病毒单克隆抗体重链恒定区的核酸序列如SEQ IDNO:19所示，编码轻链恒定区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本申请还提供了上述一种核酸在制备猴痘病毒单克隆抗体中的应用。
本申请还提供了一种上述猴痘病毒单克隆抗体中一种或多种在猴痘病毒检测中的应用。
进一步地，上述应用包括以其中一种单克隆抗体为包被单抗，以另一种单克隆抗体为胶体金颗粒标记单抗，两种单克隆抗体不同。
本申请还提供了一种上述猴痘病毒单克隆抗体中一种或多种在制备猴痘病毒检测产品中的应用。
本申请还提供了一种猴痘病毒试剂盒，该试剂盒包括上述猴痘病毒单克隆抗体中一种或多种。
进一步地，上述一种猴痘病毒试剂盒，包括上述猴痘病毒单克隆抗体中任意两种，一种单克隆抗体为包被单抗，以另一种单克隆抗体为胶体金颗粒标记单抗，两种单克隆抗体不同。
进一步地，上述一种猴痘病毒试剂盒，包括单克隆抗体H15L114和单克隆抗体H61L161，以单克隆抗体H15L114为包被单抗，以单克隆抗体H61L161为胶体金颗粒标记单抗。
3.有益效果
本申请与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本申请提供的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原，仅含有猴痘病毒D9L蛋白和B17R蛋白的特异性优势抗原表位，可有效区分猴痘病毒和其他正痘病毒，保证了以其为免疫原制备的猴痘病毒单克隆抗体仅能特异性识别猴痘病毒，提高了猴痘病毒检测的准确性。
(2)本申请提供的编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸，采用大肠杆菌偏爱密码子对编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原对应的核苷酸序列进行优化，从而提高猴痘病毒特异性重组蛋白抗原在大肠杆菌中的表达水平，该方法的制备简单、成本低廉，易于短时间扩大产出，提高检测时效性。
(3)本申请提供的猴痘病毒单克隆抗体，能特异性识别猴痘病毒，可用于检测猴痘病毒。特别地，将其中任意两种组合，配对使用，提高了猴痘病毒的检测灵敏度和准确性。
附图说明
图1是猴痘病毒D9L蛋白的氨基酸序列分析结果。
图2是猴痘病毒B17R蛋白的氨基酸序列分析结果。
图3是双酶切猴痘病毒特异性重组蛋白抗原表达载体1％琼脂糖凝胶电泳的电泳图，其中，泳道1为DNAmaker条带，泳道2为重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ双酶切条带。
图4是阳性重组表达菌诱导表达的SDS-PAGE结果图，其中，泳道1为蛋白分子maker，泳道2至4为阳性诱导表达菌，泳道5为未诱导对照组。
图5是Elisa检测猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的免疫效果和特异性。
图6是流式细胞仪分选猴痘病毒特异性淋巴B细胞。
图7是猴痘病毒抗体重、轻链可变区1％琼脂糖凝胶电泳的电泳图，其中，中间为DNA maker条带，泳道1～8为重链条带，9～16为轻链条带。
图8是Elisa检测单克隆抗体与猴痘病毒特异性重组蛋白抗原结合图。
图9是免疫印迹检测猴痘病毒单克隆抗体与猴痘病毒特异性重组蛋白抗原结合图。
图10为猴痘病毒单克隆抗体的SDS-PAGE结果图，泳道1-5为纯化单克隆抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请进一步进行描述。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
实施例1
本实施例提供猴痘病毒优势抗原表位选择。
为保证猴痘病毒抗原的特异性，发明人通过对正痘病毒属的多个病毒基因组进行比对、反复验证和大量实验，最终确定猴痘病毒D9L蛋白的第154氨基酸到第309氨基酸和B17R蛋白的第555氨基酸到第674氨基酸为牛痘病毒和鼠痘病毒缺失氨基酸，可以做为猴痘病毒特异性抗原的候选蛋白。
本实施例以猴痘病毒D9L蛋白和B17R蛋白为靶抗原，参考NCBI上公布的猴痘病毒D9L蛋白(AAV84851.1)和B17R蛋白(AGR37974.1)的氨基酸序列，利用DNAstar V7.10、UniProt等分析工具分析了D9L蛋白和B17R蛋白的二级结构和三级结构域，分析结果如图1和2所示，结合TMHMM-2.0、BepiPred-2.0、Discotope-2.0、Epitome等在线软件进行跨膜结构、线性位点预测、抗原-抗体相互作用残基等分析，在此基础上综合分析并筛选出D9L蛋白和B17R蛋白的特异性优势抗原表位，具体为：猴痘病毒D9L蛋白的第154个氨基酸到第309个氨基酸，序列为：NWDDEFDYLDYDYTTDYDNRMGKTVLYYYIITRSQDGYVTSLDV INYLISHENEMCHYTYRERTILYYYVDKCDIKREIFDVLFDSNYSGNELMHILSIYLRKQYRK KNHKIDNYIVDKLLSAHDTFYILELCNSLRNNVIISSILKRYTDSIQDL(SEQ ID NO：1)；和猴痘病毒B17R蛋白的第555个氨基酸到第674个氨基酸，序列为：SLCSYIPLKWTSFLI SRLPPKSVICSLTNHIIDYVLTNNRRIIWQSQMINKYVLLLDPSFYYRFRNAIENKLDQYNNR YNMFEHDRDVNEKYGKVLHDLDTYIKDVQVLKSTSITNNITL(SEQ ID NO：2)。
实施例2
本实施例提供猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。
将实施例1筛选得到的特异性优势抗原表位按照一定顺序进行串联，构建并合成多表位重组蛋白抗原，获得猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。在实施例中，为增强所选择特异性优势抗原表位对新西兰大耳兔免疫系统的激活效果，缩短单克隆抗体制备时间，将猴痘病毒D9L蛋白和B17R蛋白的两个特异性优势抗原表位序列通过柔性片段(Gly)4连接，得到猴痘病毒特异重组蛋白抗原，其氨基酸序列为：
NWDDEFDYLDYDYTTDYDNRMGKTVLYYYIITRSQDGYVTSLDVINYLISHENEMCHYTYRERTILYYYVDKCDIKREIFDVLFDSNYSGNELMHILSIYLRKQYRKKNHKIDNYIVDKLLSAHDTFYILELCNSLRNNVIISSILKRYTDSIQDLGGGGSLCSYIPLKWTSFLISRLPPKSVICSLTNHIIDYVLTNNRRIIWQSQMINKYVLLLDPSFYYRFRNAIENKLDQYNNRYNMFEHDRDVNEKYGKVLHDLDTYIKDVQVLKSTSITNNITL(SEQ ID NO：3)。
实施例3
本实施例提供一种编码实施例2中猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸，该核酸是经过大肠杆菌偏爱密码子优化的编码猴痘病毒特异性重组蛋白的核酸。具体为：
在猴痘病毒特异性重组蛋白抗原氨基酸序列不变的前提下，为了提高猴痘病毒特异性重组蛋白抗原在大肠杆菌中的表达量，通过稀有密码子在线软件对编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸中的大肠杆菌稀有密码子进行分析，并用编码相同氨基酸的大肠杆菌偏爱密码子替换大肠杆菌稀有密码子，使得编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸不含有大肠杆菌的稀有密码子，最后得到编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸，其序列为：AACTGGGA TGATGAATTTGATTATCTGGATTATGATTATACCACCGATTATGATAACCGCATGGGCAAAACCGTGCTGTATTATTATATTATTACCCGCAGCCAGGATGGCTATGTGACCAGCCTGGATGTGATTAACTATCTGATTAGCCATGAAAACGAAATGTGCCATTATACCTATCGCGAACGCACCATTCTGTATTATTATGTGGATAAATGCGATATTAAACGCGAAATTTTTGATGTGCTGTTTGATAGCAACTATAGCGGCAACGAACTGATGCATATTCTGAGCATTTATCTGCGCAAACAGTATCGCAAAAAAAACCATAAAATTGATAACTATATTGTGGATAAACTGCTGAGCGCGCATGATACCTTTTATATTCTGGAACTGTGCAACAGCCTGCGCAACAACGTGATTATTAGCAGCATTCTGAAACGCTATACCGATAGCATTCAGGATCTGGGCGGCGGCGGCAGCCTGTGCAGCTATATTCCGCTGAAATGGACCAGCTTTCTGATTAGCCGCCTGCCGCCGAAAAGCGTGATTTGCAGCCTGACCAACCATATTATTGATTATGTGCTGACCAACAACCGCCGCATTATTTGGCAGAGCCAGATGATTAACAAATATGTGCTGCTGCTGGATCCGAGCTTTTATTATCGCTTTCGCAACGCGATTGAAAACAAACTGGATCAGTATAACAACCGCTATAACATGTTTGAACATGATCGCGATGTGAACGAAAAATATGGCAAAGTGCTGCATGATCTGGATACCTATATTAAAGATGTGCAGGTGCTGAAAAGCACCAGCATTACCAACAACATTACCCTG(SEQ ID NO：4)。
实施例4
本实施例提供猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的表达载体及其构建。
在SEQ ID NO：4所示序列的核酸上、下游分别添加限制性内切酶酶切位点BamHⅠ和HindⅢ对应的核苷酸序列后，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。
使用试剂盒提取pET 28a(+)质粒(Novagen)，使用BamHI和HindⅢ(NEB)对该质粒进行双酶切，通过1％琼脂糖凝胶电泳后使用胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收单一载体片段，同时用BamHI和HindⅢ双酶切编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸片段，电泳后胶回收，-20℃保存备用。
将双酶切后的pET 28a(+)质粒(Novagen)和双酶切后的编码猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的核酸片段按1:3的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶(NEB)16℃连接2h，连接后即为猴痘病毒特异性重组蛋白抗原表达载体，将该表达载体命名为pET 28a(+)-SDT151。
连接后的产物转化到BL21(DE3)感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)，并涂布于含Kana+抗性(50μg/mL)的LB平板，37℃恒温培养12h。在平板上挑取单克隆菌株至含Kana+抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养4h后，采用质粒纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取质粒，使用BamHI和HindⅢ双酶切鉴定，得到正确的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原表达载体，如图3所示。
实施例5
本实施例提供猴痘病毒特异性重组蛋白抗原表达菌株及其构建。
将鉴定正确的pET 28a(+)-SDT151重组表达载体菌液，通过平板划线接种于含Kana+抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。挑取平板上单克隆菌株至含Kana+抗性(50μg/mL)的2×YT液体培养基中，37℃恒温摇床培养12h后。将过夜培养的菌液按照1％的比例接种到含Kana+抗性(50μg/mL)的2×YT液体培养基中37℃培养至OD600为0.5～0.8之间，加诱导剂IPTG(终浓度为0.5mmo1/L)20℃过夜诱导表达。离心收集菌体，并进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示，泳道1为Maker，泳道2为未诱导表达对照，泳道3为诱导表达菌，pET 28a(+)-SDT151表达的特异性重组蛋白抗原的大小在25kD与45kD之间、35kD附近的位置，与在线软件预测结果相符，且对照菌中无目的蛋白条带，说明成功构建了表达猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的表达菌株。
实施例6
本实施例提供猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的纯化。
接种猴痘病毒特异性重组蛋白抗原表达菌株至2×YT液体培养基，加Kana至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养至OD600为0.5～0.8之间，加诱导剂IPTG(终浓度为0.5mmo1/L)，20℃过夜诱导。离心收集菌体后，低温超声破菌30min，低温(4℃)离心后取上清，通过镍琼脂糖亲和层析柱层析，经洗涤、洗脱最终得到纯化的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原。
实施例7
本实施例提供猴痘病毒单克隆抗体及其制备，利用实施例6中纯化的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原和弗氏佐剂联合免疫新西兰大耳白兔的方式，制备并纯化获得猴痘病毒单克隆抗体。
将实施例6纯化得到的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原作为免疫原，免疫3只新西兰大耳兔，每只免疫600μg猴痘病毒特异性重组蛋白抗原，免疫方式为背部多点免疫。具体为：第一次免疫使用1mL完全弗氏佐剂与600μg猴痘病毒特异性重组蛋白抗原混合乳化；3周后第二次免疫，用1mL不完全弗氏佐剂和600μg猴痘病毒特异性重组蛋白抗原混合乳化，免疫方式为背部多点免疫；5周后第三次免疫，用300μg的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原和相同体积的0.01M PBS(pH7.4)混合，免疫方式为背部多点免疫；7周后，同样免疫程序(即用300μg的猴痘病毒特异性重组蛋白抗原和相同体积的0.01M PBS(pH7.4)混合)免疫一次。最后一次免疫后7天，兔耳缘静脉取血，4000rpm离心20min获取兔抗血清。
取猴痘病毒特异性重组蛋白抗原用碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6)稀释后，100μL/孔的蛋白量包被酶联板，4℃过夜。次日1％BSA封闭，37℃封闭1h，将兔抗血清梯度稀释作为一抗，37℃恒温孵育l h后，加1:5000二抗羊抗兔，37℃孵育1h，加显色液显色。检测结果显示抗猴痘病毒特异性重组蛋白抗原的抗体效价不低于1:50000，猴痘病毒特异性重组蛋白抗原具有较好的抗原性，如图5所示。
为获取特异性B淋巴细胞，取新西兰大耳白兔脾脏研磨获取淋巴细胞，将淋巴细胞重悬到105/mL的密度，直接取1mL重悬细胞与筛选特异性B细胞的抗体孵育，进行流式细胞筛选，结果如图6所示。
将筛选得到的特异性B淋巴细胞裂解，通过TurboCapture 96mRNA Plate(QIAGEN)试剂盒获取总RNA，使用逆转录试剂盒获取cDNA(上海同科生物科技有限公司)，将逆转录产物作为模板进行PCR，设计相应引物扩增抗体编码重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)序列，反应程序如下：VH 95℃5min，95℃30s，70℃30s，72℃1min，72℃10min进行35个循环扩增，VL 95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min进行35个循环扩增，扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图7)，然后选取单一目的条带进行凝胶回收。
将胶回收的目的条带与相应的载体通过同源重组的方法连接转化到TOP10感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)，37℃恒温培养12h，挑取单克隆送至北京擎科生物科技股份有限公司测序，通过软件分析测序结果，筛选编码单克隆抗体VH和VL的序列。
实施例8
本实施例提供猴痘病毒单克隆抗体的性能检测。
为了检测筛选的单克隆抗体是否特异性结合猴痘病毒特异性重组蛋白抗原及其功能，通过ELISA检测、免疫印迹试验进行验证。
将筛选到的编码VH和VL可变区序列的核酸通过同源重组的方式分别连接到含有重链恒定区和轻链恒定区的载体上，将完整含有编码单克隆抗体核酸序列的质粒转染于铺在六孔板中状态良好的Expi 293F细胞，小量表达猴痘病毒单克隆抗体，培养5天后吸取培养基上清，进行抗体的ELISA检测、免疫印迹检测，其中：
(1)H15L114单克隆抗体：
H15L114单克隆抗体重链可变区(H15L114VH)的氨基酸序列为：GVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFDISSYSVGWVRQAPGEGLEYIGWISVYGNIYYTTWAKGRFTISRTST TVDLKILGPTTEDTATYFCARGDGHTGFGGFWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:5)；
H15L114单克隆抗体轻链可变区(H15L114VL)的氨基酸为：GATFAQVLTQTPSPVSVAVGGTVTINCQASQSVYSNNNLAWFQQKPGQPPKRLIYFASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLT ISDVQCDDAATYYCLGEFSCSSADCSAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQ ID NO:6)；
编码H15L114单克隆抗体重链可变区(H15L114VH-DNA)的核酸序列为：GGCGTGC AGTGCCAGTCCCTGGAGGAGTCCGGCGGCCGCCTGGTGACCCCCGGCACCCCCCTGACCCTGACCTGCACCGCCTCCGGCTTCGACATCTCCTCCTACTCCGTGGGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCGAGGGCCTGGAGTACATCGGCTGGATCTCCGTGTACGGCAACATCTACTACACCACCTGGGCCAAGGGCCGCTTCACCATCTCCCGCACCTCCACCACCGTGGACCTGAAGATCCTGGGCCCCACCACCGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCCCGCGGCGACGGCCACACCGGCTTCGGCGGCTTCTGGGGCCCCGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC(SEQ ID NO:7)；
编码H15L114单克隆抗体轻链可变区(H15L114VL-DNA)的核酸序列为：GGCGCCACCTTCGCCCAGGTGCTGACCCAGACCCCCTCCCCCGTGTCCGTGGCCGTGGGCGGCACCGTGACCATCAACTGCCAGGCCTCCCAGTCCGTGTACTCCAACAACAACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCGCCTGATCTACTTCGCCTCCACCCTGGCCTCCGGCGTGTCCTCCCGCTTCAAGGGCTCCGGCTCCGGCACCCAGTTCACCCTGACCATCTCCGACGTGCAGTGCGACGACGCCGCCACCTACTACTGCCTGGGCGAGTTCTCCTGCTCCTCCGCCGACTGCTCCGCCTTCGGCGGCGGCACCGAGGTGGTGGTGAAGGGCGACCCCGTGGCCCCCACCGTGCTGATCTTCCCCCCCGCCGCCGACCAGGTGGCCACCGGCACCGTGACC(SEQ ID NO:8)。
(2)H31L137单克隆抗体：
H31L137单克隆抗体重链可变区(H31L137VH)的氨基酸序列为：GVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTYTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEWIGTTGTSGATYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCVRGVGLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)；
H31L137单克隆抗体轻链可变区(H31L137VL)的氨基酸为：GATFAQVLTQTPSPVSVAVGGTVTINCQASQSVYSNNNLAWFQQKPGQPPKRLIYFASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGEFSCSSADCSAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQ ID NO:10)；
(3)H51L152单克隆抗体：
H51L152单克隆抗体重链可变区(H51L152VH)的氨基酸序列为：GVQCQEQLEESGGDLVKPEGSLTLTCTVSGFSFSSSYWMCWVRQAPGKGLEWIACIYAGNSGNTDYATWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARAPYAIYVPYGDPYYFNLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)；
H51L152单克隆抗体轻链可变区(H51L152VL)的氨基酸为：GATFAQVLTQTPSPVSAVVGGTVTISCQSSESVYSNKNLAWYQQKPGQPPKRLMYSASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGGYDCMLADCYAFGGRTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQ ID NO:12)；
(4)H61L161单克隆抗体：
H61L161单克隆抗体重链可变区(H61L161VH)的氨基酸序列为：GVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWIGDIYGSGSIYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGTDNSDYCGFDLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)；
H61L161单克隆抗体轻链可变区(H61L161VL)的氨基酸为：GATIAQVLTQTPASVSAAVGGTVTINCQSSQSVYNNNWLAWFQQKPGQPPKRLIYFASTLASGVSSRFKGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYFCLGGYSGGIYAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQ ID NO:14)；
(5)H71L172单克隆抗体：
H71L172单克隆抗体重链可变区(H71L172VH)的氨基酸序列为：GVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSNAMIWVRQAPGKGLEWIGTIGGSGVTYCATWAKGRFTISKTSTTVYLKITGPTTEDTATYFCARGVTLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)；
H71L172单克隆抗体轻链可变区(H71L172VL)的氨基酸为：GATFAQVLTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQSVLDNKWLAWYHQKPGQPPKLLIYAASTLASGVPSRFKGSGSGTHFTLTISDLECDDAATYYCAGTYVSSNWYLDAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVT(SEQ ID NO:16)；
(6)恒定区
上述单克隆抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列为：METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPGASLTLTCKASGFSISSVYGMCWVRQAPGKGLEWIASIYAGVGASTYYANWAKGRFTISRTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGFIGDGYAAGAFDPWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTPGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:17)；
上述单克隆抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列为：MDVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQNIYSNLAWYQQKPGQRPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTWYDNTYVAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:18)；
编码单克隆抗体重链恒定区(CH-DNA)的核酸序列为：ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCAGCATCAGTAGCGTCTACGGCATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATCCATTTATGCTGGTGTTGGGGCTAGCACTTACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTTTTATTGGTGATGGTTATGCTGCGGGTGCTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCCGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG(SEQ ID NO:19)；
编码单克隆抗体轻链恒定区(CL-DNA)的核酸序列为：ATGGATGTCGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGTACTTGGTATGATAATACTTATGTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAA(SEQ ID NO:20)。
ELISA检测结果如图8所示，H15L114\H31L137\H51L152\H61L161\H71L172为ELISA检测阳性克隆，其中H15L114单克隆抗体与猴痘病毒特异性重组蛋白具有最好的结合效果。免疫印迹检测结果如图9所示，H15L114\H31L137\H51L152\H61L161\H71L172单克隆抗体能特异性的与猴痘病毒结合。
实施例9
本实施例提供猴痘病毒单克隆抗体的表达纯化。
将筛选到的编码VH和VL可变区序列的核酸通过同源重组的方式分别连接到含有重链恒定区和轻链恒定区的载体上，将完整含有编码单克隆抗体核酸序列的质粒转染到细胞密度为3×106/mL 100mL Expi 293F细胞中，培养5天后收集细胞上清，通过亲和层析纯化得抗体，最后通过SDS-PAGE验证纯化情况，结果如图10所示，泳道1-5分别为H15L114\H31L137\H51L152\H61L161\H71L172纯化抗体。
实施例10
本实施例提供胶体金颗粒标记的猴痘病毒单克隆抗体及其制备方法。
取胶体金溶液加入碳酸钾溶液，充分混匀后加入猴痘病毒单克隆抗体，室温反应2h后添加BSA，封闭处理2h后，离心弃去上清后沉淀用1mL复溶液充分溶解，采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将复溶液均匀喷涂于玻璃纤维，再置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
以上述方法分别对H15L114\H31L137\H51L152\H61L161\H71L172单克隆抗体进行胶体金标记，分别获得胶体金颗粒标记的单克隆抗体。
实施例11
本实施例提供猴痘病毒单克隆抗体在检测猴痘病毒中的应用。
猴痘病毒单克隆抗体(H15L114\H31L137\H51L152\H61L161\H71L172)分别经包被液稀释后，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将其均匀包被于硝酸纤维素膜，此为T线。通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将羊抗兔溶液均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
按照常规工艺将样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、滤纸在PVC垫板上依次组装后切成宽4mm长条，装上试剂卡条壳并压紧。
猴痘病毒患者临床血清样本及正常人血清样本，100μL/孔上样，室温放置15min后，通过层析读数仪(上海捷浩科学仪器有限公司)分别读值并计算P/N值，(阳性样本检测值与阴性样本检测值的比值)，详见表1。
表1不同配对猴痘病毒单克隆抗体P/N值统计
通过表1可知，同一种单克隆抗体的P/N＜2.1，无法检测出阳性；而任意两种不同的单克隆抗体配对使用，其P/N≥2.1，可以检测出阳性样本。其中H15L114包被单抗与H61L161胶体金颗粒标记单抗配对与抗原亲和力最高，为检测猴痘病毒最佳组合。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种猴痘病毒单克隆抗体，其特征在于，所述猴痘病毒单克隆抗体能与猴痘病毒特异性结合，包括如下任意一种：
(1)单克隆抗体H15L114，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
(2)单克隆抗体H31L137，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
(3)单克隆抗体H51L152，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
(4)单克隆抗体H61L161，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
(5)单克隆抗体H71L172，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
2.根据权利要求1所述的一种猴痘病毒单克隆抗体，其特征在于，所述猴痘病毒单克隆抗体，还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的猴痘病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区，或权利要求2所述的重链恒定区、轻链恒定区中一种。
4.根据权利要求3所述的一种核酸，其特征在于，编码猴痘病毒单克隆抗体H15L114的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:7所示；
编码猴痘病毒单克隆抗体H15L114的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:8所示；
编码猴痘病毒单克隆抗体的重链恒定区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示；
编码猴痘病毒单克隆抗体的轻链恒定区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示。
5.权利要求3或4所述的一种核酸在制备猴痘病毒单克隆抗体中的应用。
6.权利要求1或2所述的一种猴痘病毒单克隆抗体的一种或多种在猴痘病毒检测中的应用。
7.权利要求1或2所述的一种猴痘病毒单克隆抗体的一种或多种在制备猴痘病毒检测产品中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：以其中一种单克隆抗体为包被单抗，以另一种单克隆抗体为胶体金颗粒标记单抗，两种单克隆抗体不同。
9.一种猴痘病毒试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述猴痘病毒单克隆抗体中一种或多种。
10.根据权利要求9所述的一种猴痘病毒试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括任意两种猴痘病毒单克隆抗体，以一种单克隆抗体为包被单抗，以另一种单克隆抗体为胶体金颗粒标记单抗。
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