CN111944836A - 一种检测寨卡病毒包膜蛋白e特异性抗体的elisa试剂盒及重组zv包膜蛋白e的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测寨卡病毒（ZV）包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒。本发明试剂盒包含包被重组ZV包膜蛋白E的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。本发明试剂盒特异性高、重复性好，能够简单方便地用于寨卡病毒特异性抗体的检测，减少假阳性，能用于大规模血清学检测和流行病学调查，评估寨卡病毒的感染情况。

Description

一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒及重 组ZV包膜蛋白E的制备
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒及重组ZV包膜蛋白E的制备。
背景技术
寨卡病毒（Zika virus，ZV）属于黄病毒属，主要依赖感染病毒的伊蚊类蚊媒叮咬传播，也可通过母婴传播以及血液和性传播。各类人群对ZV普遍易感，感染后ZV在人体内经血播散并可跨越血脑屏障进入中枢神经系统。ZV感染者中只有约1/5出现临床症状且多数患者症状温和，但其中严重者有可能出现格林巴利综合症；而孕妇感染ZV则会导致婴儿小头畸形及流产、死胎等。全球已有数十个国家和地区报告发现ZV本地传播病例，分布在美洲、亚洲、非洲和欧洲，其中巴西、哥伦比亚等国疫情最为严重；我国也已出现了数个输入性ZV感染病例（包括浙江省4例及1例隐性感染病例[5]），而传播ZV蚊媒在我国分布广泛，存在因输入引发本地传播的风险。至今，尚无预防性疫苗和特异性抗病毒药物可用于有效预防和控制ZV感染。另一方面，约4/5无症状感染者在其急性期时体内包括血液、尿液、唾液和精液等所携带ZV成了难以防控的潜在感染源，尤其对献血/输血产生一种新的挑战，已有因输入献血者（症状出现前）提供的含ZV血浆而被感染的病例报道。
寨卡病毒颗粒呈球状，直径约为50 nm。其基因组为单股正链RNA，长约10.8 kb，包含5′和3′端非编码区, 中间为单一开放读码框编码一个单一的多蛋白前体，经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成熟为3个结构蛋白以及7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5），结构蛋白为衣壳蛋白（C）、膜蛋白前体/膜蛋白（prM）和包膜蛋白（E）（含504个氨基酸）。包膜蛋白E以二聚体形式位于EV毒粒表面，包含与宿主细胞受体的结合位点和诱导产生特异性抗体的线性和空间构象性B细胞抗原决定簇位点/抗原表位。包膜蛋白E可以与其特异性抗体发生结合作用，因此可利用其来捕获特异性抗体实现检测目的。
目前对寨卡病毒检测主要依赖针对患者急性期标本开展病毒特异性核酸检测如RT-PCR。由于ZV感染病毒血症期（即病毒在血液中存在时间）较短，多为发病后3～5 天，一般一周后血液中ZV病毒载量低于可检出水平，往往当病人就医时很可能RT-PCR检测结果为阴性。因此，尽管ZV病毒尿症期时间略长，RT-PCR检测ZV核酸只适用于感染早期/急性期。血清特异性IgM/IgG抗体可采用酶联免疫吸附检测（ELISA）和中和试验等方法检测。而ZV感染病人血清中在感染3天后可检出病毒特异性IgM抗体，发病7 天后检出率高，2～3周后达到峰值并可持续维持在可检出水平及以上滴度达数月之久；与IgM抗体同时或稍后产生的特异性IgG抗体则可从恢复期乃至终生存在。因此，ZV血清学/特异性抗体检测的窗口期长，最适用于恢复期（包括隐性感染病例）的检测。
综上所述，建立灵敏特异、快捷有效的ZV血清学/特异性抗体检测技术手段及试剂盒，对ZV血清学流行病学调研具有多重意义：既可作为感染早期/急性期（包括隐性感染）的核酸检测确证的前期筛选，也可作为恢复期及常规人群血清学筛查以确认特异性抗体存在与否及相应水平，并可同时为防控ZV以常规方式（包括献血/输血）传播扩散等风险提供依据和保障。
发明内容
综上所述，为克服现有技术的不足，本发明提供一种操作简单、使用方便、安全有效的检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：利用原核（大肠杆菌）表达系统，将密码子优化的包括寨卡病毒包膜蛋白E胞外表面区整段（403 aa）及其N端添加MGHHHHHHGLVPRGS标签的编码序列克隆至表达质粒pET-28a(+)，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，诱导表达并纯化获得重组寨卡病毒包膜蛋白E（分子量46 KDa）。
一种重组寨卡病毒包膜蛋白E的制备方法，工艺流程图（见附图1），具体步骤如下：
根据寨卡病毒包膜蛋白E胞外表面区的氨基酸序列（403 aa），在N端添加MGHHHHHHGLVPRGS序列使重组蛋白带有His标签以利于纯化，利用生物信息学软件程序反推出编码基因的核苷酸序列并进行密码子优化，人工合成DNA片段并克隆到表达质粒pET-28a，转化大肠杆菌BL21（DE3）后用IPTG诱导重组蛋白的表达，收集大肠杆菌菌体超声碎菌，用His•Bind蛋白纯化试剂盒纯化（见附图2）。
本发明提供了一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒，包括包被了权利要求1所述的重组寨卡病毒包膜蛋白E的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的酶联免疫吸附试剂盒的制备方法，工艺流程图（见附图1），具体步骤如下：
（1）将重组寨卡病毒包膜蛋白E作为抗原，用包被缓冲液稀释到1微克/毫升，以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4 ℃过夜后洗板3次。每孔加入200微升含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37 ℃孵育1小时后洗板3次，晾干，用密封袋封装酶标板，4℃保存，即为预先包被好抗原的酶标板。
（2）本试剂盒中所含阴性对照血清为正常血清样本，阳性对照血清为明确感染该病毒的患者血清样本，并已通过实验验证。
（3）本试剂盒涉及的其他试剂配制方法如下：
包被缓冲液（0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH 9.6）：1000毫升蒸馏水中加入1.59克碳酸钠（Na2CO3）和2.93克碳酸氢钠（NaHCO3），溶解混匀。
磷酸盐缓冲液（0.01摩尔/升PBS，pH 7.4)：1000毫升蒸馏水中加入8.0克氯化钠（NaCl ），0.2克磷酸二氢钾（KH2PO4），2.9克磷酸氢二钠（Na2HPO4 .12H2O）和0.2克氯化钾（KCl），溶解混匀。
封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
样品稀释液：PBS中加入1%牛血清白蛋白及0.1% 吐温-20，pH7.4。
酶标抗体：HRP标记的抗体，市售，用样品稀释液稀释5000倍使用。
浓缩洗涤液：含有1%吐温-20，pH7.4的100毫摩尔/升PBS，洗涤时稀释10倍使用。
酶底物A溶液：5.1克柠檬酸（C6H8O7 .H2O），18.4克磷酸氢二钠（Na2HPO4 .12H2O），加水定容到1000毫升后混匀。
酶底物B溶液：30%双氧水（H2O2）1毫升。
酶底物C：邻苯二胺（OPD）粉末1克。
终止液：2摩尔/升的硫酸溶液，取108.7毫升98%浓硫酸加入891.3毫升中，混匀冷却。
使用本发明试剂盒检测样本的具体方法如下：
取出试剂盒中已经包被了重组寨卡病毒包膜蛋白E的酶标板。用样品稀释液将各血清样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37 ℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37 ℃孵育30分钟后洗板3次。配置OPD显色液，称取酶底物C 20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零，用酶标仪测定492纳米处的吸光度值。使用P/N比值法判定结果，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，否则为阴性。鉴定结果举例如下：样品1、3为阴性，样品2、4为阳性（见附图3）。
本发明提供的检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒，可用于检测寨卡病毒特异性抗体。
本发明提供的检测寨卡病毒包膜糖蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒，可用于评估寨卡病毒感染情况，应用于血清学和流行病学研究等。
本发明具有以下优点和效果：
（1）本发明试剂盒使用重组表达的寨卡病毒包膜蛋白E，纯度高，特异性好，直接瞄准相应抗体，避免其他物质引起的非特异性反应，减少假阳性，提高检测准确性；
（2）本发明试剂盒能够检测寨卡病毒包膜糖蛋白E特异性抗体，快速诊断寨卡病毒感染；
（3）本发明试剂盒具有成本低、操作简便、速度快、特异性强等优点，能够被基层单位广泛使用。
实施例描述本发明具体实施方式。
附图说明
图1为本发明试剂盒制备工艺流程图。
图2为寨卡病毒重组包膜蛋白E在大肠杆菌中的高效表达和纯化（箭头所指处为重组包膜蛋白E位置）。
图3为本发明试剂盒检测血清中特异性抗体的ELISA结果。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1：重组表达质粒的构建和转化
根据寨卡病毒包膜蛋白E胞外表面区的氨基酸序列（403 aa），在N端添加MGHHHHHHGLVPRGS序列使重组蛋白带有His标签以利于纯化，利用生物信息学软件程序反推出编码基因的核苷酸序列并进行密码子优化，人工合成DNA片段，两端分别导入相应的限制性内切酶酶切位点NcoI和XhoI并克隆至大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)，获得相应的重组质粒经鉴定正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选获得转化子即重组表达菌。
实施例2：重组寨卡病毒包膜蛋白E的表达及纯化
挑选单菌落转化子接种于LB液体培养基中，用IPTG诱导重组蛋白的表达，收集大肠杆菌菌体重悬于缓冲液后超声碎菌，离心收集上清和沉淀，用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达形式。将破菌沉淀溶于含8mol/L脲液，离心后收集上清液，在变性条件下过His GravitrapTM柱，按照说明书操作，利用咪唑浓度梯度洗脱并收集目的蛋白，然后在透析复性并逐步去除脲。（图2）
实施例3：使用该试剂盒检测样品中寨卡病毒包膜蛋白E的特异性抗体
样品孵育：取出试剂盒中已经包被了重组寨卡病毒包膜蛋白E的酶标板。用样品稀释液将各样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37 ℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。
二抗孵育：将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37 ℃孵育30分钟后洗板3次。
显色读数：配置OPD显色液，称取酶底物C 20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零，用酶标仪测定492纳米处的吸光度值。
结果判定：P/N比值法，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，否则为阴性。例如附图3中ELISA结果：样品1、3为阴性，样品2、4为阳性。

Claims (5)

1.一种重组寨卡病毒包膜蛋白E的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，根据寨卡病毒包膜蛋白E胞外表面区的氨基酸序列，在寨卡病毒包膜蛋白E胞外表面区整段及其N端添加MGHHHHHHGLVPRGS标签的编码序列克隆至表达质粒pET-28a；步骤二，进行密码子优化；步骤三，利用原核表达系统诱导表达并纯化获得重组寨卡病毒包膜蛋白E。
2.一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：包括包被了权利要求1所述的重组寨卡病毒包膜蛋白E的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
3.根据权利要求2所述的一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标板通过如下方法制备：通过大肠杆菌-质粒原核系统重组表达ZV包膜蛋白E并纯化，用包被缓冲液将蛋白稀释至1微克/毫升；以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干后备用。
4.根据权利要求2所述的一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒在检测寨卡病毒特异性抗体中的应用。
5.根据权利要求2所述的一种检测寨卡病毒包膜蛋白E特异性抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒在对于寨卡病毒感染情况以及相应血清学和流行病学研究中的应用。
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CN106518990A (zh) * 2016-07-04 2017-03-22 德诺杰亿（北京）生物科技有限公司 一种寨卡病毒抗原及其应用
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