CN102994455A - 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒，本发明获得了分泌黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所得到的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体具有灵敏度好、特异性强、效价高等优点，可用于鉴定待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒，鉴定待测样本是否感染黄瓜绿斑驳花叶病毒。所述单克隆抗体可用于制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。

Description

一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术，涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV），是芜菁花叶病毒科（Tymoviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员。该病毒主要侵染葫芦科作物，可引起黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦、笋瓜、无花果、叶瓜等葫芦科作物叶片黄化畸形、生长缓慢、结果延时、果实大部分黄化变白并产生黑绿色水疤状的坏死斑，产量损失可高达15%。世界上许多国家和地区将黄瓜绿斑驳花叶病毒列为葫芦科作物的重要检疫性病毒。2006年12月，我国将黄瓜绿斑驳花叶病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害。

黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）粒子主要分布于植物的叶片、表皮、薄壁组织、木质部、韧皮部及其他各部的细胞质和细胞液泡内。黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的检测方法有：生物学方法、电子显微镜技术、血清学技术、分子生物学技术等。生物学检测可以确定CGMMV的侵染性、传播方式和寄主范围，但所需时间长、工作量大，靠肉眼观察，稳定性和可靠性不高。电子显微镜技术需要很高的硬件要求、专业知识要求，不适用于规模化、现场检测。

随着分子生物学的发展与应用，运用分子生物学技术进行CGMMV检测的方法越来越多，尤其是基于聚合酶链式反应（PCR）的反转录（RT-）PCR，实时荧光RT-PCR。但是该方法需要昂贵且专业的仪器设备，尤其是实时荧光RT-PCR，所用耗材也价格不菲，操作也是需要经过专业培训的人员才能胜任，而且样品及操作容易出现污染而造成假阳性。而基于抗体的捕获ELISA、胶体金试纸条等方法可以快速、灵敏地检测CGMMV病毒，适于在大规模的监测系统中应用和现地检测。而捕获ELISA、胶体金试纸条等方法的应用依赖于CGMMV病毒的特异性单克隆抗体的研制。

但目前为止，尚未有见灵敏度好、特异性强、效价高的黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV的单克隆抗体的报道。

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种灵敏度好、特异性强的黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV的单克隆抗体，本发明单克隆抗体可以应用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒。

一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.6958，所述杂交瘤细胞株的获得是通过将黄瓜绿斑驳花叶病毒毒源接种在葫芦上制备黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）粒子提纯液，并纯化的，用将纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）粒子提纯液免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，后对上述细胞进行培养，进一步亚克隆，筛选出一株针对黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）粒子的单克隆抗体，及分泌这些单克隆抗体的杂交瘤细胞，纯化并保藏。

一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌而得。

上述单克隆抗体在检测黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用。

一种用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的反应载体，其特征在于，所述反应载体上直接或间接包被有上述单克隆抗体。

一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒，其特征在于，包含有上述的反应载体。所述反应载体是基于免疫反应原理的检测仪器，可以是荧光化学检测板、酶联免疫检测板等，本发明实施例优选的是酶标板。

一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的胶体金试剂盒，其特征在于，在金标纤维垫上包被有胶体金标记的抗CGMMV的单克隆抗体，即Au-McAb；检测线上包被有兔抗CGMMV多抗，即CGMMV-Pc；检测时，当样本中存在CGMMV，则与Au-McAb形成复合物，进而与检测线的CGMMV-Pc结合，显色。

本发明试剂盒可以用于鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒，辅助鉴定待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒以及辅助鉴定待测植物样本是否感染黄瓜绿斑驳花叶病毒。

本发明提供的单克隆抗体用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒，具有特异性好、敏感性强、效价高等优点。本发明研制的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体可用于研制黄瓜绿斑驳花叶病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。

本发明酶联免疫检测试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原。先在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被兔抗黄瓜绿斑驳花叶病毒粒子的多克隆抗体，当加入的样品中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒时，微孔中预包被的多克隆抗体能将其捕获，随后加入的酶标单克隆抗体与之结合，然后通过酶催化底物的显示程度来判断结果。当标本中不含黄瓜绿斑驳花叶病毒时，底物不会显色。可检测的标本包括种子、叶片等待检测物的研磨液等。

本发明胶体金试剂盒是采用胶体金免疫层析技术研制的双抗体夹心法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒（以下简称CGMMV）的新一代诊断试剂，可检测种子、叶片等标本中是否含有CGMMV。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需要任何附加试剂，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30min。

本试剂盒分别在硝酸纤维素膜上用兔抗CGMMV多抗（即CGMMV-Pc）包被检测线，用葡萄球菌A蛋白（即SPA）包被对照线；在标记物垫上用胶体金标记抗CGMMV的单克隆抗体（即Au-McAc）。检测时，如果样本中存在CGMMV，则与Au-McAb形成复合物，在层析作用下，沿膜层析至检测线，并与CGMMV-Pc形成的肉眼可见的紫红色检测线；而未结合CGMMV的Au-McAb继续层析至对照线，与SPA结合也形成肉眼可见的紫红色对照线。如果样本中无CGMMV，则只有一条紫红色对照线。

本发明单克隆抗体具有如下优点：

1.特异性好、敏感性强、效价高；

2.可用于基于免疫反应的检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂及试剂盒；

3.能应用于各地进行黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测；

4.应用本发明单克隆抗体并且基于免疫反应的试剂盒灵敏特异，快速方便。

杂交瘤细胞保藏信息：

杂交瘤细胞株名称：黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMMV 2G5

菌株分类：小鼠杂交瘤细胞系

保藏编号为：CGMCC No.6958

保藏日期：2012年12月13日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）

保藏地址为：北京市朝阳区大屯路

附图说明：

图1为本发明胶体金试剂盒检测结果示意图

图2为本发明黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水效价测定

具体实施方式：

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。

本发明实验材料的来源：

生物材料：

黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）、辣椒轻斑驳病毒、齿瓣兰环斑病毒、烟草花叶病毒均由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所惠赠。

申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。

试剂的来源及规格：

实施例1、黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，单克隆抗体和多克隆抗体的制备

1.黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的繁殖与纯化。

将黄瓜绿斑驳花叶病毒毒源接种在葫芦上，19d采收病叶。病叶加3.5倍体积的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(含0.1%巯基乙醇，pH7.2)，匀浆，双层纱布过滤，低速离心（BECKMAN JA14转头，10000r/min,10min）。取上清，加入NaCl至浓度为0.1mol/L，加入PEG(MV6000)至浓度4%（w/v），TritonX-100至浓度2.5%(V/V)，4℃搅拌4h。离心（BECKMAN JA14转头，11000r/min，20min）。沉淀悬浮于0.1mol/L磷酸钠缓冲液中，4℃搅拌过夜。离心（BECKMANJA17转头，11000r/min，10min）。取上清离心（BECKMAN SW40Ti转头，35000r/min，70min）。沉淀悬浮于0.1mol/L磷酸钠缓冲液中，4℃搅拌过夜。离心（BECKMAN JA-21转头，10000r/min，10min）。取上清做10%～40%蔗糖梯度离心（BECKMAN SW40Ti转头，35000r/min，80min）。吸取蔗糖梯度中的病毒带用0.1mol/L磷酸钠缓冲液适当稀释后离心（BECKMAN SW40Ti转头，35000r/min，70min）。沉淀用0.1mol/L磷酸钠缓冲液悬浮后即为提纯病毒制剂。

2.多克隆抗体的制备

将纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）粒子提纯液（1000ug/只）稀释至1.5ml与1.5ml完全弗氏佐剂等体积混合乳化，乳化后采用后腿肌肉多点注射方法对家兔进行免疫。第2～4次用同样剂量病毒粒子提纯液(269mg/kg)加等体积不完全弗氏佐剂乳化，用后腿肌肉多点注射方法免疫，每次免疫间隔2-4周。第4次免疫后2周，用300ug/只病毒提纯液稀释至2ml经腹腔注射进行加强免疫。加强免疫后1周采血，使用间接ELISA法检测多克隆抗体效价，结果为1：320000。

3.小鼠免疫：

将纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）粒子提纯液(269mg/kg)按100ug/只的剂量稀释至50ul与完全弗氏佐剂等体积混合乳化，经颈背部皮下多点注射8周龄的BALB/C小鼠，每只注射100ul。首次免疫后3周、6周，分别用200ug/只的剂量稀释至50ul与不完全弗氏佐剂等体积混合乳化，进行再次免疫。融合前采血，检测小鼠血清效价，小鼠血清效价大于1:100000则进行加强免疫。加强免疫采用150ul纯化病毒粒子（50ug/只）直接注射小鼠腹腔，3d后处死小鼠取脾细胞进行融合。

4.细胞融合：

将上述免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞相融合。先将脾脏无菌取出，研磨为脾细胞悬液，然后与对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞以10:1比例混合，1000r/min离心5min，弃上清，经PEG1500作用1min，将两种细胞融合，融合后的细胞液1000r/min离心5min，重悬于含HAT Media suplement（50×）Hybri-Max，γ-irradiated（sigma）和20%FetalBovine Serum（威正华通）的完全培养基，100ul/孔，加入有饲养细胞的96孔培养板中，置二氧化碳培养箱中培养。

5.杂交瘤细胞的筛选：

融合后，将上述细胞于96孔细胞板上培养，每天观察细胞生长情况，待培养孔中杂交瘤细胞克隆增至几百个时，吸取细胞上清原液用间接ELISA方法进行检测，对检测特异性抗体阳性孔的细胞稀释到1×10⁵个/ml，进一步亚克隆。

6.筛选结果：

获得一株针对黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）粒子的单克隆抗体，及分泌这些单克隆抗体的杂交瘤细胞。

7.杂交瘤的培养：

稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株进行扩增培养，由96孔增至24孔，再增至T25细胞瓶扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，8~9天后开始收集腹水，所得腹水离心后去除油脂和沉淀，冻存备用。

8.单克隆抗体的纯化：

上述腹水先用50%的辛酸/硫酸铵沉淀处理，然后用20mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）透析，之后用DEAE柱在HPLC下纯化，得到纯化的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定，和蛋白浓度测定，纯化的单克隆抗体浓度为0.23ug/ml。

实施例2：黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水效价的测定

1、采用间接ELISA方法测定黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水效价。

具体方法为：

1）用2μg/mL浓度的纯化黄瓜绿斑驳花叶病毒包被酶标板，4℃冰箱过夜，洗酶标板。

2）用含2.5%BSA的磷酸盐缓冲液封板，37℃，30min，洗酶标板。

3）加入按照一定比例稀释的腹水抗体溶液，37℃，2h。洗酶标板。

4）加入1：1000稀释的碱性磷酸酶标记的马抗小鼠抗体，37℃，2h。洗酶标板。

5）加入底物溶液，37℃，待颜色合适时（5-15min）用酶标仪在450nm处读取OD值。

腹水梯度稀释后的OD值见图2。当待检测样品OD值大于临界值（即：阴性对照孔OD值+0.15）时，待检样品判定为阳性，由图2可知，2G5腹水抗体效价为1.024×10⁷（见图2）。这说明黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水效价很高。

实施例3：黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水特异性测定

1、用间接ELISA方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水特异性

为测定黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的特异性，检测了其与CGMMV同属病毒——烟草花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、齿瓣兰环斑病毒是否有交叉反应。检测方法详见实例2（黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水效价的测定）。检测时将第1步中的2ug/ml黄瓜绿斑驳花叶病毒分别替换为2ug/ml的烟草花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、齿瓣兰环斑病毒，其余步骤及所使用试剂、反应条件不变，就可分别检测2G5腹水与相应病毒是否具有交叉反应。检测结果如表1所展示，黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体能特异结合CGMMV纯化病毒，而与烟草花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、齿瓣兰环斑病毒没有交叉反应，这说明我们制备的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体能特异性识别黄瓜绿斑驳花叶病毒。

表1 2G5单克隆抗体特异性测定

2、2G5单克隆抗体与其他CGMMV分离毒株的反应

为了检测本发明黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体能否识别不同来源的黄瓜绿斑驳花叶病毒，采用间接ELISA方法（详见实例2：黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水效价的测定），检测2G5单克隆抗体与其他3种不同地点来源的CGMMV有无反应。结果见表2。由表2可知，本发明黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体能良好识别纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒；此外，还能良好识别不同地区来源的黄瓜绿斑驳花叶病毒。这说明本发明中的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体能应用于各地进行黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测。

表2黄瓜绿斑驳花叶病毒2G5单克隆抗体与不同分离毒株的反应

实施例4：黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法，ELISA）

1、酶标板的制备：

在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被兔抗黄瓜绿斑驳花叶病毒粒子的多克隆抗体，多克隆抗体包被使用10mM磷酸盐碳酸盐缓冲液（PB，pH7.4），在4℃下包被过夜；然后使用PBST（10mM PBS+0.05% Tween20）洗涤一两次，拍干后再加入封闭液（10mM PBS+2%牛血清白蛋白，BSA），37℃封闭2小时，再拍干，在相对湿度35%以下，室温经过18~24小时晾干后，真空抽干包装成成品试剂盒酶标板。

2、试剂盒其他成分的配置：

A）酶标试剂：应用HRP快速标记试剂盒，将5mg/ml的抗体溶液于50mM酸盐缓冲液（pH9.6，25℃）中4℃透析过夜，换液2~3次。1ml超纯水加入过碘酸钠管中充分混匀后取45ul加入到溶好的HRP溶液（0.4ml的超纯水加入HRP管中充分混匀），边加边混匀，室温暗置反应20分钟。取乙二醇40ul加入到上述溶液中充分混匀后室温暗置反应30分钟。将上述氧化好的HRP溶液加入到黄瓜绿斑驳花叶病毒粒子的单克隆抗体溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。从透析袋中取出溶液置于棕色玻璃瓶中，加NaB H₄溶液80ul，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻摇一次。还原完毕的抗体-HRP溶液置于10mM磷酸盐溶液中4℃透析过夜，换液3~4次，第一次换液时间间隔2小时。收获标记好的黄瓜绿斑驳花叶病毒粒子的单克隆抗体-HRP溶液，纯化后的将标记单克隆抗体稀释至0.2mg/ml，分装后备用。

B）阳性对照：将黄瓜绿斑驳花叶病毒株稀释至1ug/ml，经56℃水浴灭活1h后的病毒液作为阳性对照。

C）阴性对照：样品研磨缓冲液做阴性对照。

D）底物液A：四甲基联苯胺溶液

E）底物液B：过氧化脲溶液

F）终止液：1M硫酸

G）浓缩洗涤液：20×PBST

H）封板膜：2张

I）自封袋：1个

J）说明书：1份

3、检测过程：

A）配液：将50ml浓缩液（20倍）用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。

B）编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同）。

C）样品处理及加样：

取待检测种子或叶片（去主脉），加入3倍体积的磷酸盐缓冲液（pH7.2）匀浆，3000r/min离心10min，吸取上清检测，每孔加100ul进行反应。

每次检测均需要设置阴阳性对照孔，每孔加100ul对照液。

D）孵育：用封口膜封板后置微量振荡器上中等速度室温（25～28℃）振荡60min。

E）洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拍干。

F）加酶：分别在相应孔中加入酶标试剂100ul。

G）孵育：用封口膜封板后，置37℃温育30min。

H）重复步骤E。

I）显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30min。

J）测定：每孔加终止液1滴（50ul），轻轻振荡混匀，用酶标仪单波长450nm（需设空白对照孔）或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

4、结果判定：

A）阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔≤0.1（阴性对照孔OD值若大于0.1应舍弃，如果所有阴性对照孔OD值都大于0.1，应重复实验。若阴性对照孔小于0.03，则按0.03计算）。

B）阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔OD值≥0.5。

C）临界值计算：阴性对照孔OD值+0.15

D）阳性判定：样品OD值≥临界值者为黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原反应阳性。

E）阴性判定：样品OD值＜临界值者为黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原反应阴性。

本发明酶联免疫检测试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原。本发明试剂盒可检测的标本包括种子、叶片等多种待检测物的研磨液，用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测，并且具有灵敏性好，特异性强，效价高的特点，同时，该试剂盒操作简便，结果判断较客观，结果的重复性和可靠性稳定。

实施例5：快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原的胶体金试剂盒

1、本发明应用于胶体金试剂盒的制备

1）配制包被液

用20mM PBS对葡萄球菌A蛋白（即SPA）和兔抗CGMMV多抗（即CGMMV-Pc）进行稀释，将葡萄球菌A蛋白（即SPA）配制成2mg/ml，兔抗CGMMV多抗（即CGMMV-Pc）配制成0.3mg/ml，分别用于硝酸纤维素膜上C、T线的包被。

2）试剂的包被

硝酸纤维膜上包被葡萄球菌A蛋白（即SPA）和兔抗CGMMV多抗（即CGMMV-Pc）：将葡萄球菌A蛋白（即SPA）和兔抗CGMMV多抗（即CGMMV-Pc）用包被机分别包被于T线和C线，C、T线之间的间距为4.0mm，C、T线宽度为0.8mm，包被速度为40mm/s。干燥时间为6小时，温度为30℃，湿度≤35%。

3）胶体金标记的CGMMV的单克隆抗体（即Au-McAc）的制备

取40nm的胶体金溶液，按终浓度8-12μl/ml加入0.2M K2CO3，加入CGMMV的单克隆抗体（即Au-McAc）制备成特定浓度，放置室温反应15-30分钟，然后按终浓度20μl/ml加入20%BSA的溶液，用于饱和游离的胶体金。

10000rpm离心30分钟，除去上清液中未结合的蛋白质。用1/10体积的0.5M硼酸溶液（含1%Tween、5%蔗糖、1%水解BSA、1%水解酪蛋白、0.1%PVA）复溶沉淀的胶体金标记原液。工作溶液采用上述0.5M硼酸溶液稀释，浓度为原液的10-20%。

4）金标纤维层的标记：

将胶体金标记的CGMMV的单克隆抗体（即Au-McAc）溶液，铺于30*30cm玻璃纤维垫上，加液量为35ml/张，干燥时间为6小时，温度为30℃，湿度≤35%。

5）试纸条的组装：

将塑料板平放在操作台上，贴上双面胶带；

撕掉双面胶带衬纸，在距塑料板上端30mm处贴上已包被有葡萄球菌A蛋白和兔抗CGMMV多抗的硝酸纤维素膜；

将粗纤维吸水纸压硝酸纤维素膜上端2mm贴上，上端与塑料板上端取齐；

将小无纺布压硝酸纤维素膜下端0.5mm处贴上；

将金标垫取齐压于小无纺布上面；

将玻璃纤维垫压于金标垫上约一半，下端距塑料板下端2mm处贴上；。

将大无纺布与金标垫上端取齐，下端与塑料板下端取齐贴上；

将箭头胶带压硝酸纤维素膜1.5-2mm贴上；

将手持端胶带压粗纤维吸水纸贴上。

2、试剂盒组成：

本试剂盒是将试纸条、塑料滴管、干燥剂用铝箔袋密闭包装而成，另附说明书1份。试剂盒是用CGMMV-Pc、SPA包被的硝酸纤维素反应膜、胶体金标记的Au-McAc、样品垫、吸收垫等组装制成。

3、检测操作过程：

A）样品处理及加样：

取待检测种子或叶片（去主脉），加入3倍体积的磷酸盐缓冲液（pH7.2）匀浆，3000r/min离心10min，吸取上清检测，每孔加2~3滴进行反应。

B）将试纸条平置于桌面，在加样孔用塑料滴管垂直滴入2~3滴，室温条件下避免潮湿。

4、结果判定：20-30min内观察结果。

出现两条红色线，判定为阳性：只出现对照线，判定为阴性；不出现或只出现一条检测线，都判定为无效，结果参见图1

5、本发明胶体金试剂盒的优点

本发明试剂盒采用胶体金免疫层析技术研制的双抗体夹心法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的新一代诊断试剂，可检测种子、叶片等标本中是否含有CGMMV。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需要任何附加试剂、仪器，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30min，具有灵敏度高，特异性好，检测时间短的特点，尤其适合于现场检测，推广应用范围广，可用于农业质检、工商质检、出入境质检，食品加工生产企业、出口企业及其他领域。

本发明实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。

Claims (6)

1.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.6958。

2.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌而得。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用。

4.一种用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的反应载体，其特征在于，所述反应载体直接或间接包被有权利要求2所述单克隆抗体。

5.一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒，其特征在于，包含有权利要求4所述的反应载体。

6.一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的胶体金试剂盒，其特征在于，在金标纤维垫上包被有胶体金标记的抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的单克隆抗体，即Au-McAb；检测线上包被有兔抗黄瓜绿斑驳花叶病毒多抗，即CGMMV-Pc；检测时，当样本中存在黄瓜绿斑驳花叶病毒，则与Au-McAb形成复合物，进而与检测线的CGMMV-Pc结合，显色。

Images