CN113073084A - 提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法 - Google Patents

提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种兽用生物制品领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎病毒的增殖方法。一种提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，包括：将鸡传染性支气管炎病毒的种毒用生理盐水稀释至10～1000倍；鸡胚尿囊腔接种10～13日龄鸡胚，0.1～0.2ml/胚，使种毒接种计量为105 . 0～106 . 0EID50/胚；继续孵育30～36h，孵育温度为35.0～37.0℃、孵育湿度为60～70％；置于2～8℃的环境中冷却4～24h后，收获鸡胚病毒液。采用本发明生产工艺，不但生产的鸡胚病毒液病毒含量指标超过国家标准10倍以上，而且鸡胚病毒液收获量比现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标法生产提高20％以上，产生的经济效益显著。

Description

提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法
技术领域
本发明涉及一种兽用生物制品领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎病毒的增殖方法。
背景技术
鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性的呼吸道疾病，各个鸡龄均易感。主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化系统等，以呼吸困难、拉白色或水样稀便、患病雏鸡有较高死亡率，成鸡产蛋下降、产畸形蛋、软壳蛋等为主要临床特征，是目前危害我国养鸡业发展的主要疫病之一。
疫苗免疫是预防该病的重要方法，我国的活疫苗常采用Massachusetts型的H120株、H52株和肾型的W93株等，灭活疫苗常用H52株或强毒M41株或强毒F株。H120株及W93株毒力弱，用于雏鸡的首次免疫，H52株毒力较强，用于雏鸡的二次免疫及成鸡免疫，灭活疫苗则用于成鸡加强免疫。免疫效果受疫苗质量的影响较大，而制苗所用的鸡胚病毒液的病毒含量决定着疫苗质量，如果接种弱毒疫苗没有含有足够量的有活力的病毒，就会影响免疫效果，灭活疫苗接种后没有繁殖过程，更要有足够量的病毒量，才能刺激机体产生坚实的免疫力。
制造鸡传染性支气管炎活疫苗的病毒液是用SPF鸡胚，接种IBV-H120株或H52株或W93株种毒，经孵育培养，无菌收取鸡胚的尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液；制造鸡传染性支气管炎灭活疫苗的病毒液是用健康敏感鸡胚，接种IBV-M41株或H52株或F株种毒，经孵育培养，无菌收取鸡胚的尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液。鸡胚病毒液的病毒含量是影响疫苗质量的关键因素；单胚的病毒液产量是影响疫苗生产成本的主要因素，因此，获得大收量、高病毒含量的鸡胚病毒液，是保证产品质量，提升产品市场竞争力、增加经济效益的重要突破口。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种获得大收量、高病毒含量鸡胚病毒液的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，包括以下步骤：
1)种毒稀释步骤：将鸡传染性支气管炎病毒的种毒用生理盐水稀释至10～1000倍，得到种毒稀释液；
2)鸡胚接种步骤：将步骤1)得到的种毒稀释液，尿囊腔接种10～13日龄鸡胚，0.1～0.2ml/胚，使种毒接种计量为105.0～106.0EID50/胚，接种后密封针孔；
3)孵育步骤：将接种后的鸡胚，继续孵育30～36h，孵育温度为35～37℃、孵育湿度为60～70％，孵育期间不必翻蛋，且每隔1～3小时照蛋一次，弃去死胚；
4)冷却步骤：将步骤3)孵育完成的活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h；
5)病毒液的收获步骤：将冷却后的鸡胚取出，消毒鸡胚，然后剪掉气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内一侧，于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即得到鸡传染性支气管炎病毒的鸡胚病毒液；收获的同时，逐个检查鸡胚，弃去污染鸡胚。
进一步的，所述的鸡传染性支气管炎病毒的种毒为H120株，用生理盐水稀释至50～500倍，尿囊腔接种12～13日龄鸡胚，0.1～0.15ml/胚，种毒接种计量为105.0EID50/胚；将接种后的鸡胚，继续孵育33～36h，孵育温度为35.5～36.5℃、孵育湿度为65～70％；在鸡胚接种后的33～36h照蛋，弃去死胚，剩余活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h，之后，无菌收取鸡胚病毒液。
进一步的，所述的鸡传染性支气管炎病毒的种毒为H52株，用生理盐水稀释至50～500倍，尿囊腔接种12～13日龄鸡胚，0.1～0.15ml/胚，种毒接种计量为105.0EID50/胚；将接种后的鸡胚，继续孵育33～36h，孵育温度为35.5～36.5℃、孵育湿度为65～70％；在鸡胚接种后的33～36h照蛋，弃去死胚，剩余活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h，之后，无菌收取鸡胚病毒液。
进一步的，鸡传染性支气管炎病毒的种毒为M41株或W93株或F株。
进一步的，在所述的鸡胚病毒液收获步骤中，先用浓度为1～1.5‰新洁尔灭消毒液擦拭整个鸡胚，再用浓度为4～5％碘酊消毒气室部位，然后再剪掉气室部位卵壳，无菌收取鸡胚病毒液。
进一步的，所述的污染鸡胚为胚胎腐败和鸡胚液混浊的鸡胚。
进一步的，所述的鸡胚接种步骤中，还包括先用浓度为4～5％碘酊消毒鸡胚的气室及尿囊腔接种点部位，1～2min后再用浓度为70～75％酒精脱碘；在尿囊腔接种点和气室顶部各钻一小孔；用灭菌的注射器吸取种毒稀释液，注射器针头朝向鸡胚小头端，与鸡胚大头夹角成30～45°，从尿囊腔接种点进针5～8mm，注射种毒0.1～0.2ml；接种后，用石蜡先封接种孔，再封气室孔。
进一步的，所述的鸡胚为SPF鸡胚或健康敏感鸡胚，所述健康敏感鸡胚是鸡传染性支气管炎病毒血清HI抗体几何平均滴度不大于1:4的鸡群所产出的鸡胚。
本发明的有益效果是：采用本发明生产工艺，不但生产的鸡胚病毒液病毒含量指标超过现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国家标准10倍以上，而且鸡胚病毒液收获量比现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标法生产增加20％以上。为了减少死胚、提高单胚胚液收获量及鸡胚液病毒含量，发明者对能引起变化的所有因素，逐一通过反复实验，确定单一因素的理想参数范围，然后把各因素组合成不同方案，再进行反复实验，经过近5年的不断实验研究与总结，探索出了通过降低该病毒的培养温度及调整种毒接种鸡胚计量，延缓了病毒的增殖速度和鸡胚死亡率；通过增大鸡胚接种日龄及调整收获鸡胚病毒液的时间，不但解决了病毒增殖缓慢带来的不足，提高了鸡胚液的病毒含量，而且增加了鸡胚病毒液的收获量。
因此，本发明提供的鸡传染性支气管炎鸡胚病毒液生产工艺参数是可行的、可靠的，并在实际产业化生产中取得了理想的效果，将在今后鸡传染性支气管炎鸡胚病毒液的生产、乃至鸡传染性支气管炎相关疫苗制苗用病毒液生产中发挥重大作用。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：本发明提供一种提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，包括以下步骤：
1)种毒稀释步骤：将鸡传染性支气管炎病毒的种毒用生理盐水稀释至10～1000倍，得到种毒稀释液；鸡传染性支气管炎病毒的种毒为H120株、H52株、M41株或W93株或F株；
2)鸡胚接种步骤：先用浓度为4～5％碘酊消毒鸡胚的气室及尿囊腔接种点部位，1～2min后再用浓度为70～75％酒精脱碘；在尿囊腔接种点和气室顶部各钻一小孔；用灭菌的注射器吸取步骤1)得到的种毒稀释液，注射器针头朝向鸡胚小头端，与鸡胚大头夹角成30～45°，尿囊腔接种10～13日龄鸡胚，从尿囊腔接种点进针5～8mm，注射种毒0.1～0.2ml，使种毒接种计量为105.0～106.0EID50/胚，接种后用石蜡先封接种孔，再封气室孔。
3)孵育步骤：将接种后的鸡胚，继续孵育30～36h，孵育温度为35～37℃、孵育湿度为60～70％，孵育期间不必翻蛋，且每隔1～3小时照蛋一次，弃去死胚；
4)冷却步骤：将步骤3)孵育完成的活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h；
5)病毒液的收获步骤：将冷却后的鸡胚取出，先用浓度为1～1.5‰新洁尔灭消毒液擦拭整个鸡胚，再用浓度为4～5％碘酊消毒气室部位，然后剪掉气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内一侧，于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即得到鸡传染性支气管炎病毒的鸡胚病毒液。收获的同时，逐个检查鸡胚，弃去污染鸡胚，所述的污染鸡胚为胚胎腐败和鸡胚液混浊的鸡胚，所述的鸡胚为SPF鸡胚或健康敏感鸡胚，所述健康敏感鸡胚是鸡传染性支气管炎病毒血清HI抗体几何平均滴度不大于1:4的鸡群所产出的鸡胚。
实施例2：与实施例1相同，不同的是：所述的鸡传染性支气管炎病毒的种毒为H120株，用生理盐水稀释至50～500倍，尿囊腔接种12～13日龄鸡胚，0.1～0.15ml/胚，种毒接种计量为105.0EID50/胚；将接种后的鸡胚，继续孵育33～36h，孵育温度为35.5～36.5℃、孵育湿度为65～70％；在鸡胚接种后的33～36h照蛋，弃去死胚，剩余活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h，之后，无菌收取鸡胚病毒液。
实施例3：与实施例1相同，不同的是：所述的鸡传染性支气管炎病毒的种毒为H52株，用生理盐水稀释至50～500倍，尿囊腔接种12～13日龄鸡胚，0.1～0.15ml/胚，种毒接种计量为105.0EID50/胚；将接种后的鸡胚，继续孵育33～36h，孵育温度为35.5～36.5℃、孵育湿度为65～70％；在鸡胚接种后的33～36h照蛋，弃去死胚，剩余活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h，之后，无菌收取鸡胚病毒液。
实验例：采用12日龄SPF鸡胚，固定鸡传染性支气管炎病毒种毒的接种计量为105.0EID50/胚，将鸡传染性支气管炎病毒H120株种毒50倍稀释、H52株种毒300倍稀释，每胚均尿囊腔接种0.1ml，含105.0EID50病毒，每种毒株接种1200枚SPF鸡胚，置孵育湿度为65～70％环境中，在接种后28h、30h、33h、36h、40h，孵育温度34.5℃、35.0℃、35.5℃、36.0℃、36.5℃、37.0℃、37.5℃的不同结点，取30枚活胚，气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h；取出冷却的鸡胚，用浓度为4～5％碘酊消毒鸡胚气室部位，然后剪掉气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内一侧，于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液。收获的同时，逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；按EID50测定法对收获的鸡胚病毒液进行检验；并比较单胚平均收获量，结果见表1、表2。
表1 采用本发明方法生产IBV-H120株鸡胚病毒液情况
Figure BDA0003009365040000061
Figure BDA0003009365040000071
注：“/”左侧表示0.1ml鸡胚液中病毒含量EID50，“/”右侧表示平均单胚收获量ml。下同
表2 采用本发明方法生产IBV-H52株鸡胚病毒液情况
Figure BDA0003009365040000072
从表1、表2看出，以105.0EID50/0.1ml稀释种毒，尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1ml/胚，接种后的鸡胚在35～37℃孵育，收取接种后孵育30～36h的活胚病毒液，其鸡胚液病毒含量EID50均达到现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标，鸡胚病毒液收获量是现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标法生产所不能比拟的，尤其接种鸡胚在35.5℃孵育，收取接种后孵育33h的活胚病毒液的病毒含量及单胚平均收获量综合效果最佳。
2.3产业化生产中，将鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株种毒按每0.1ml含病毒量105.0EID50进行稀释，尿囊腔接种12日龄SPF鸡胚，0.1ml/胚，接种后置35.5℃、65～70％湿度下增殖培养病毒，接种后33h，照蛋弃去死胚，将活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷冻4～24h，取出冷却的鸡胚，用浓度为4～5％碘酊消毒鸡胚气室部位，然后剪掉气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内一侧，于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液。收获的同时，逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；按无菌检验法、EID50测定法对收获的鸡胚病毒液进行检验，结果见表3。
表3 产业化生产验证发明情况
Figure BDA0003009365040000081
注:“-”表示无菌生长或HA阴性；“/”左侧为按收获胚计算的平均值，“/”右侧为按接种胚计算的平均值。
从表3看出，产业化生产所收获的鸡胚病毒液病毒含量EID50是现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标法生产的10倍以上，鸡胚病毒液收获量比现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标法生产增加20％以上，证明本发明同样适用于产业化，产业化生产实际中取得的效果依旧显著。
按照现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标方法，将鸡传染性支气管炎病毒H120、H52株种毒用生理盐水均稀释至100倍，分别尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚2批，0.1ml/胚，接种后密封针孔，置37℃、65～70％湿度中继续孵育，不必翻蛋；鸡胚接种后，30h照蛋1次，弃去死胚，将活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h；取出冷却的鸡胚，用浓度为4～5％碘酊消毒鸡胚气室部位，然后剪掉气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内一侧，于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液。收获的同时，逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；按无菌检验法、EID50测定法对收获的鸡胚病毒液进行检验。结果见表4。
表4 现行《规程》法生产IBV-H120、H52鸡胚病毒液情况
Figure BDA0003009365040000082
Figure BDA0003009365040000091
注:“-”表示无菌生长或HA阴性；“/”左侧为按收获胚计算的平均值，“/”右侧为按接种胚计算的平均值。
从表4看出，采取现行《鸡传染性支气管炎活疫苗制造及检验规程》国标法生产，收获的鸡胚病毒液的病毒含量虽达到106.0EID50/0.1ml的国标，但鸡胚病毒液收获量一般，造成鸡胚病毒液生产成本偏高，这与接种鸡胚日龄及收获时间有关；接种H52株种毒的鸡胚早死较多，超过10％，是与单胚接毒量较大有关，导致鸡胚病毒液平均单胚收获量下降，成本进一步增高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)种毒稀释步骤：将鸡传染性支气管炎病毒的种毒用生理盐水稀释至10～1000倍，得到种毒稀释液；
2)鸡胚接种步骤：将步骤1)得到的种毒稀释液，尿囊腔接种10～13日龄鸡胚，0.1～0.2ml/胚，使种毒接种计量为105.0～106.0EID50/胚，接种后密封针孔；
3)孵育步骤：将接种后的鸡胚，继续孵育30～36h，孵育温度为35～37℃、孵育湿度为60～70％，孵育期间不必翻蛋，且每隔1～3小时照蛋一次，弃去死胚；
4)冷却步骤：将步骤3)孵育完成的活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h；
5)病毒液的收获步骤：将冷却后的鸡胚取出，消毒鸡胚，然后剪掉气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内一侧，于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即得到鸡传染性支气管炎病毒的鸡胚病毒液；收获的同时，逐个检查鸡胚，弃去污染鸡胚。
2.如权利要求1所述的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，所述的鸡传染性支气管炎病毒的种毒为H120株，用生理盐水稀释至50～500倍，尿囊腔接种12～13日龄鸡胚，0.1～0.15ml/胚，种毒接种计量为105.0EID50/胚；将接种后的鸡胚，继续孵育33～36h，孵育温度为35.5～36.5℃、孵育湿度为65～70％；在鸡胚接种后的33～36h照蛋，弃去死胚，剩余活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h，之后，无菌收取鸡胚病毒液。
3.如权利要求1所述的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，所述的鸡传染性支气管炎病毒的种毒为H52株，用生理盐水稀释至50～500倍，尿囊腔接种12～13日龄鸡胚，0.1～0.15ml/胚，种毒接种计量为105.0EID50/胚；将接种后的鸡胚，继续孵育33～36h，孵育温度为35.5～36.5℃、孵育湿度为65～70％；在鸡胚接种后的33～36h照蛋，弃去死胚，剩余活胚气室向上直立，置于2～8℃环境中冷却4～24h，之后，无菌收取鸡胚病毒液。
4.如权利要求1所述的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，鸡传染性支气管炎病毒的种毒为M41株或W93株或F株。
5.如权利要求1所述的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，在所述的鸡胚病毒液收获步骤中，先用浓度为1～1.5‰新洁尔灭消毒液擦拭整个鸡胚，再用浓度为4～5％碘酊消毒鸡胚气室部位，然后再剪掉气室部位卵壳，无菌收取鸡胚病毒液。
6.如权利要求1所述的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，所述的污染鸡胚为胚胎腐败和鸡胚液混浊的鸡胚。
7.如权利要求1所述的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，所述的鸡胚接种步骤中，还包括先用浓度为4～5％碘酊消毒鸡胚的气室及尿囊腔接种点部位，1～2min后再用浓度为70～75％酒精脱碘；在尿囊腔接种点和气室顶部各钻一小孔；用灭菌的注射器吸取种毒稀释液，注射器针头朝向鸡胚小头端，与鸡胚大头夹角成30～45°，从尿囊腔接种点进针5～8mm，注射种毒0.1～0.2ml；接种后，用石蜡先封接种孔，再封气室孔。
8.如权利要求1-7任一所述的提高鸡传染性支气管炎病毒增殖的方法，其特征在于，所述的鸡胚为SPF鸡胚或健康敏感鸡胚，所述健康敏感鸡胚是鸡传染性支气管炎病毒血清HI抗体几何平均滴度不大于1:4的鸡群所产出的鸡胚。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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崔卓宇等: "鸡传染性支气管炎H120 、W93 株活疫苗生产工艺的改进", 动物医学进展, vol. 26, no. 8, pages 92 - 94 *

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