CN104212771A - 一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗。本发明主要利用鸡胚无限稀释法对流感病毒进行纯化，提高了病毒的增殖能力和毒液滴度，制备的病毒含量可以高达10^-9.1EID₅₀/0.1mL～10^-9.5EID₅₀/0.1mL；培养流感病毒时稀释倍数有所提高，提高了病毒的增殖活力，并且节约了病毒培养时间；以本发明方法培养的流感病毒无需浓缩，无需浓缩或稀释后制备成品疫苗，简化了后续疫苗生产工艺、降低生产成本；利用本发明制备的流感病毒灭活疫苗，免疫鸡群后能够较快的产生抗体，并且抗体持续期长，疫苗的保护率有所提高。

Description

一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗

技术领域

本发明涉及兽用疫苗技术领域，具体涉及一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗。

背景技术

禽流感(Avian Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为Ⅰ类传染病。根据毒株致病性的不同，禽流感可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感两大类。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，产蛋家禽感染后,可引起产蛋率下降，软壳蛋、无壳蛋增多，严重的将会停止产蛋。种禽感染后，除上述症状外，还表现出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雏禽出壳困难，出壳后的雏禽弱雏增多。雏禽在一周内死亡率较高，且易感染大肠杆菌，治疗较困难。H9亚型禽流感混合感染其他病原时，可导致发病率和死亡率的大幅度提高，给养殖业带来巨大损失。

疫苗接种是预防和控制流感病毒流行的最有效手段。目前，控制禽流感病毒发病的主要手段是接种灭活全病毒疫苗，其生产主要依靠鸡胚法实现。为了提高灭活疫苗的免疫原性，必须提高疫苗制备时抗原的含量，故如何提高病毒滴度成为关键环节。现在，提高流感病毒含量的方法主要通过浓缩的方法实现，这样将提高疫苗制备的成本，使疫苗制备过程复杂化，并且增加了病毒液的损失和污染风险。

发明内容

为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗，旨在节约疫苗制备成本，提升生产效率。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：

1)对禽流感病毒进行复苏处理；

2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行梯度稀释，以各稀释度病毒液接种鸡胚，再取全部受感染鸡胚尿囊液中其HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批；

3)将步骤2)得到的种子批分别接种鸡胚并传代6～10代，将各代次受感染鸡胚尿囊液中EID₅₀指标≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的种子批作为基础种子批；

4)将步骤3)得到的基础种子批接种鸡胚，增殖禽流感病毒。

优选的，步骤1)所述的复苏处理包括以下流程：取出冻存的禽流感病毒，进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传2～3代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。

优选的，步骤2)具体包括以下流程：将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接种若干鸡胚，接种量为0.08～0.12mL，36.5～37.5℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1～2例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤3～5代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批；

优选的，步骤3)具体包括以下流程：将步骤2)得到的种子批进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传6～10代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作为基础种子批。

优选的，步骤4)具体包括以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-3-10^-6稀释，接种鸡胚，收获24～96h鸡胚尿囊液即为病毒液；进一步的，可以优选为以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-4-10^-5稀释，接种鸡胚，收获65～75h鸡胚尿囊液即为病毒液。

优选的，步骤1)所述的禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒。

优选的，步骤1)所述的禽流感病毒含量为10^-8.0EID₅₀/0.1mL～10^-8.5EID₅₀/0.1mL。

优选的，步骤1)所述的禽流感病毒含量为10^-8.3EID₅₀/0.1mL。

此外，本发明还提供了利用上述禽流感病毒增殖方法进一步制备的禽流感疫苗，该疫苗由以下方法制备：

1)病毒的灭活：将利用上述禽流感病毒增殖方法制备的禽流感病毒液用甲醛灭活，甲醛终浓度为1‰，20℃灭活20小时得到灭活毒液；

2)水相的制备：水相的制备：将灭活毒液以3500r/min离心20min，经8层纱布过滤，将过滤后的灭活毒液与吐温80以(22～26):1的比例混匀，即得到疫苗水相；

3)油相的制备：取白油佐剂95份、司班805份、硬脂酸铝2份混匀，即得到疫苗油相；

4)疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，以12000r/min转速剪切2-5min，即得到禽流感疫苗。

优选的，所述白油佐剂型号为Marcol52。

本发明技术方案具有以下优点：本发明主要利用鸡胚无限稀释法对流感病毒进行纯化，提高了病毒的增殖能力和毒液滴度，制备的病毒含量可以高达10^-9.1EID₅₀/0.1mL～10^-9.5EID₅₀/0.1mL；培养流感病毒时稀释倍数有所提高，提高了病毒的增殖活力，并且节约了病毒培养时间；以本发明方法培养的流感病毒无需浓缩，无需浓缩或稀释后制备成品疫苗，简化了后续疫苗生产工艺、降低生产成本；利用本发明制备的流感病毒灭活疫苗，免疫鸡群后能够较快的产生抗体，并且抗体持续期长，疫苗的保护率有所提高。

附图说明

图1是本发明实施例2制备的疫苗接种后产生的抗体水平对比图。

具体实施方式

实施例1

一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：

1)取出冻存的禽流感病毒，进行10^-3稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37℃培养，收获24-96h鸡胚尿囊液，传3代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。

2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接5枚鸡胚，接种量为0.1mL，36.5～37.5℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液2例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤5代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前10％的尿囊液作为种子批；

3)将步骤2)得到的种子批进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传8代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作为基础种子批，在传代过程中发现，随代次的变化其尿囊液中病毒含量的变化为P1：10^-8.9EID₅₀/0.1mL，P2：10^-9.1EID₅₀/0.1mL，P3：10^-9.3EID₅₀/0.1mL，P4：10^-9.5EID₅₀/0.1mL，P5：10^-9.3EID₅₀/0.1mL，P6：10^-9.3EID₅₀/0.1mL，P7：10^-8.7EID₅₀/0.1mL，P8：10^-8.3EID₅₀/0.1mL。

4)分别将基础种子批进行10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释并分别接种鸡胚，并考察各稀释倍数的种子批接种鸡胚后24-96h收获鸡胚尿囊液时的病毒含量。结果证明将毒种进行10^-4稀释、接种后70h收获得到的尿囊液病毒含量最高，达到10^-9.5EID₅₀/0.1mL。

实施例2

一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：

1)取出冻存的禽流感病毒，进行10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传2代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。

2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接10枚鸡胚，接种量为0.08mL，36.5℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤4代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前20％的尿囊液作为种子批；

3)将步骤2)得到的种子批进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传10代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作为基础种子批。

4)将基础种子批进行10^-5稀释而后接种鸡胚，接种后65h收获被接种鸡胚的尿囊液，即得到禽流感病毒。

实施例3

一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：

1)取出冻存的禽流感病毒，进行10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传3代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。

2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接15枚鸡胚，接种量为0.12mL，37.5℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤3代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前20％的尿囊液作为种子批；

3)将步骤2)得到的种子批进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传6代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作为基础种子批。

4)将基础种子批进行10^-4.5稀释而后接种鸡胚，接种后75h收获被接种鸡胚的尿囊液，即得到禽流感病毒。

实施例4

取实施例1制备的禽流感病毒进行如下工艺，以制备禽流感疫苗：

4.1病毒的灭活

将上述的病毒液进行灭活，甲醛终浓度为1‰，20℃灭活20小时。灭活检验证明毒液灭活完全。

4.2疫苗的制备

水相的制备：将灭活的毒液以3500r/min离心20min，经8层纱布过滤。取96份灭活的毒液，4份吐温80混匀。该水相包括4种毒液，即克隆法获得的高滴度毒液(病毒含量为10^-9.3EID₅₀/0.1mL)、克隆法获得毒液的稀释液(病毒含量为10^-8.3EID₅₀/0.1mL)、原始Sy株禽流感病毒繁殖毒液(病毒含量为10^-8.3EID₅₀/0.1mL)、Sy株禽流感病毒浓缩毒液(病毒含量为10^-9.3EID₅₀/0.1mL)。

油相的制备：进口白油95份，司班805份，硬脂酸铝2份。

疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，12000r/min剪切2-5min即可。

4.3疫苗的质量检测

疫苗的剂型、稳定性和粘度检测均证明制备的疫苗合格。

4.4疫苗的安全性检验

取上述制得的4种疫苗进行如下检验：

将疫苗分别进行1次超剂量(1mL)和单剂量重复接种(0.3mL×2)的安全试验。观察14天，试验鸡均无任何局部和全身不良反应，疫苗安全性良好。

4.5疫苗的效力检验

4.5.1血清学方法

取3-4周龄SPF鸡接种疫苗，第1组注射原始Sy株禽流感病毒繁殖毒液制备的疫苗，第2组注射克隆法获得毒液的稀释液制备的疫苗，第3组注射克隆法获得的高滴度毒液制备的疫苗，第4组注射Sy株禽流感病毒浓缩毒液制备的疫苗，第5组注射磷酸盐缓冲液作为对照，同样条件下饲养，实验条件见表1，免疫后每周采集血清，直至免疫后第8周，按照《中华人民共和国兽药典》规定的血凝抑制试验(HI)方法对特异性抗体进行检测。

表1不同组疫苗免疫剂量及分组

实验结果如表2和图1所示。在实验结果中规定当HI抗体效价的几何平均值不低于(1:64)时判为阳性，否则为阴性。由结果可知第1组疫苗在免疫后第2周可诱导产生禽流感病毒特异性抗体，第8周抗体水平下降，为阴性；而第3组疫苗则在免疫后第1周即可诱导产生特异性抗体，直到第8周抗体水平仍然保持在较高的水平；另外将第2组与第1组疫苗作比较可知：克隆毒稀释液和原始疫苗株繁殖毒液在同样病毒含量情况下，克隆毒稀释液制备的疫苗能够产生较高的抗体水平和较长的抗体持续期；由第3组和第4组结果比较进一步证明：克隆毒无需浓缩就能比原始毒浓缩液更快的产生抗体，并且抗体水平较高。

表2不同组疫苗诱导产生的抗体水平检测结果

4.5.2免疫攻毒法检验

取3-4周龄SPF鸡50只，免疫疫苗，然后按照按照《中华人民共和国兽药典》进行攻毒试验，结果如表3所示。

表3攻击禽流感病毒后各组疫苗产生的保护作用

由表3可知，原始毒液制备的疫苗组有2只鸡携带病毒，即该疫苗可以达到80％的保护率；其他3个疫苗组可以产生100％保护率。由此可知克隆毒制备的疫苗能够产生更高的保护率。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于包括以下步骤：

1)对禽流感病毒进行复苏处理；

2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行梯度稀释，以各稀释度病毒液接种鸡胚，再取全部受感染鸡胚尿囊液中其HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批；

3)将步骤2)得到的种子批分别接种鸡胚并传代6～10代，将各代次受感染鸡胚尿囊液中EID₅₀指标≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的种子批作为基础种子批；

4)将步骤3)得到的基础种子批接种鸡胚，增殖禽流感病毒。

2.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的复苏处理包括以下流程：取出冻存的禽流感病毒，进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传2～3代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。

3.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤2)具体包括以下流程：将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接种若干鸡胚，接种量为0.08～0.12mL，36.5～37.5℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1～2例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤3～5代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批。

4.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤3)具体包括以下流程：将步骤2)得到的种子批进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传6～10代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作为基础种子批。

5.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤4)具体包括以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-3-10^-6稀释，接种鸡胚，收获24～96h鸡胚尿囊液即为病毒液。

6.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒。

7.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的禽流感病毒含量为10^-8.0EID₅₀/0.1mL～10^-8.5EID₅₀/0.1mL。

8.根据权利要求5所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤4)具体包括以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-4-10^-5稀释，接种鸡胚，收获65～75h鸡胚尿囊液即为病毒液。

9.一种禽流感疫苗，其特征在于由以下方法制备：

1)病毒的灭活：将利用权利要求1方法制备的禽流感病毒液用甲醛灭活，甲醛终浓度为1‰，20℃灭活20小时得到灭活毒液；

2)水相的制备：水相的制备：将灭活毒液以3500r/min离心20min，经8层纱布过滤，将过滤后的灭活毒液与吐温80以(22～26):1的比例混匀，即得到疫苗水相；

3)油相的制备：取白油佐剂95份、司班80 5份、硬脂酸铝2份混匀，即得到疫苗油相；

4)疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，以12000r/min转速剪切2-5min，即得到禽流感疫苗。

10.根据权利要求9所述的一种禽流感疫苗，其特征在于所述白油佐剂型号为Marcol52。