CN105363028A - 一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法 - Google Patents

一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法，具体工艺为利用鸡胚无限稀释法对流感病毒进行纯化，培养出高病毒滴度的流感病毒，将其灭活后与免疫佐剂按一定比例混合，再经过真空冷冻干燥技术获得冻干灭活疫苗，将该疫苗免疫1日龄肉鸡。效力检验结果证明利用本发明制备的禽流感病毒冻干灭活疫苗能够较早的产生抗体，可以克服肉鸡母源抗体的干扰，能够达到较好的免疫效果。同时本发明制备的疫苗免疫剂量小，疫苗能够充分吸收，安全性好。该发明制备的疫苗利用冻干的方法浓缩病毒，简化了疫苗制备的操作程序，降低了病毒的损失。

Description

一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法。
背景技术
禽流感(AvianInfluenza)是由甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为Ⅰ类传染病。本病发病急骤，一旦感染将给养殖业带来重大的经济损失，成为危害畜牧业发展的重大疫病之一。疫苗免疫接种是预防本病的有效措施。
目前大量使用的是鸡胚生产的全病毒油乳剂灭活疫苗，使用矿物油佐剂，该疫苗难于吸收，免疫剂量较大，并且病毒需要浓缩后制备疫苗。另外，肉鸡具有较高的母源抗体，从而限制了油乳剂疫苗的免疫效果。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法，以解决现有技术的油乳剂灭活疫苗所需免疫剂量较大的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术的禽流感病毒疫苗的免疫效果，受鸡的母源抗体影响较严重。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)病毒培养；
2)病毒灭活；
3)将步骤2)灭活后的病毒液与细胞因子IFN-γ以1:1～5:1的比例混匀得到病毒混合液，使得其中细胞因子IFN-γ的含量为100～500μg/mL，而后冷冻干燥得到所述冻干灭活疫苗。
作为优选，步骤1)所述的病毒培养包括以下步骤：
A)将禽流感病毒毒种进行10倍梯度稀释，分别取10-8、10-9、10-10、10-11稀释度的毒种溶液接种鸡胚，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液；
B)在全部感染病毒的鸡胚中选取所注射毒种溶液稀释倍数最大的鸡胚的尿囊液，即为传代用病毒液；
C)利用步骤B)所述的传代用病毒液，重复以上步骤A、B3～5次，取HA效价排名前10～20％的鸡胚尿囊液作为种子批，将该种子批按10-4稀释度进行稀释，接种鸡胚，得到的尿囊液即为灭活前病毒液，用于步骤2)灭活。
作为优选，步骤A)中用于接种鸡胚的毒种溶液剂量为0.1mL。
作为优选，步骤A)接种鸡胚后，将鸡胚于37℃孵育，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液。
作为优选，步骤A)中所述感染病毒的鸡胚是接种后24～96h死亡胚或96h时未死胚。
作为优选，步骤A)中对鸡胚是否感染病毒是通过以下方法确定的：测定鸡胚尿囊液的HA效价，HA效价≥(1:256)的鸡胚是感染病毒的鸡胚。
作为优选，步骤C)中所述灭活前病毒液中禽流感病毒含量为10-9.1EID50/0.1mL。
作为优选，步骤2)中病毒灭活方法为：向灭活前病毒液中加入甲醛至终浓度为0.5～2‰(v/v)，20～25℃条件下灭活12～24小时。
作为优选，步骤3)中所述的冷冻干燥，以蔗糖脱脂乳作为冻干保护剂。
作为优选，步骤3)中病毒混合液与冻干保护剂的混合比例为1:0.5～1:1.5。
本发明意在利用细胞因子IFN-γ作为佐剂，并且将其与抗原混合后冻干，从而起到浓缩抗原的作用，可以通过控制稀释液的体积减少疫苗的免疫剂量，从而提供一种安全、有效的禽流感病毒冻干灭活疫苗。效力检验结果证明利用本发明方法制备的禽流感病毒冻干灭活疫苗能够使鸡较早产生抗体，可以克服肉鸡母源抗体的干扰，能够达到较好的免疫效果。同时本发明制备的疫苗免疫剂量小，疫苗能够充分吸收，安全性好。该发明制备的疫苗利用冻干的方法浓缩病毒，简化了疫苗制备的操作程序，降低了病毒的损失。
附图说明
图1是本发明实施例1中HI抗体检测结果图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
1流感病毒的培养
取稀释度为10-7、10-8、10-9、10-10、10-11的流感病毒液接种鸡胚，每个稀释度接种10枚鸡胚，接种量为0.1mL，37℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤4代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前20％的尿囊液作为种子批；将该种子批做10-4稀释，按常规方法接种鸡胚，72小时收获尿囊液，测得的效价为10-9.1EID50/0.1mL。
2病毒的灭活
将细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，以180r/min转速，20-25℃条件下灭活12-24小时；
3疫苗的制备
将灭活后的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤。将处理后的病毒液与IFN-γ以1:1的体积比混合，再将混合液与同体积的冻干保护剂混匀，利用该病毒的冻干曲线冻干病毒，制备冻干灭活疫苗。
4疫苗的安全性检验
将疫苗分别进行1次超剂量(1mL)和单剂量重复接种(0.1mL×2)的安全试验。观察14天，试验鸡均无任何局部和全身不良反应，表明上述疫苗安全性良好
5疫苗效力检验
用上述灭活后的病毒液，按1：3的水油比制备成油包水型疫苗，用于同制备出的禽流感病毒冻干疫苗做效力比较。
5.1血清学方法检验
取1日龄肉鸡40只，分为4组，每组10只鸡，第1组经皮下免疫冻干疫苗0.1mL(用冻干前混合液体积的1/2量溶解疫苗，即将抗原浓缩2倍)，第2组皮下注射自制油包水型疫苗0.2mL(抗原浓缩2倍)，第3组注射商品禽流感灭活疫苗0.2mL，第4组注射磷酸盐缓冲液0.2mL作为对照，同样条件下饲养，实验条件见表1，免疫后每周采血，分离血清，直至免疫后第6周，按照《中华人民共和国兽药典》规定的血凝抑制试验(HI)方法对特异性抗体进行检测。
表1疫苗分组及免疫剂量
实验结果如表2和图1所示。由结果可知冻干灭活流感疫苗(第1组)能够较早的产生抗体，并且抗体水平较高，克服了母源抗体的影响，能够产生较好的免疫效果。油包水型疫苗(第2组和第3组疫苗)产生抗体较晚，肉鸡14日龄左右抗体水平较低，增加了感染病毒的风险。
表2抗体水平检测结果
5.2免疫攻毒法检验
取1日龄肉鸡40只，按照表1方法免疫疫苗。免疫后第21天，用1:10稀释的禽流感病毒(H9亚型)SY株进行滴鼻攻毒，每只鸡0.2mL(含2×106.0EID50)。攻毒后第5日，采集每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，并将两者混合后经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1mL。孵育72h，测定所有鸡胚HA效价，每份棉拭子样品接种鸡胚中只要有1枚鸡胚液HA效价不低于1:16，即判为病毒分离阳性。对病毒分离为阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。免疫鸡带毒结果如表3所示。
表3攻击H9亚型禽流感病毒后疫苗的保护率结果
由表2可知，免疫鸡攻击SY株H9亚型禽流感病毒后，对照组10只鸡全部携带病毒；油包水型疫苗组有1只鸡携带病毒；冻干灭活疫苗组和商品疫苗组均10只鸡全部正常，可以产生100％保护率。
实施例2
一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)病毒培养；
2)病毒灭活；
3)将步骤2)灭活后的病毒液与细胞因子IFN-γ以1:1的比例混匀得到病毒混合液，使得其中细胞因子IFN-γ的含量为100μg/mL，而后冷冻干燥得到所述冻干灭活疫苗。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)所述的病毒培养包括以下步骤：
A)将禽流感病毒毒种进行10倍梯度稀释，分别取10-8、10-9、10-10、10-11稀释度的毒种溶液接种鸡胚，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液；
B)在全部感染病毒的鸡胚中选取所注射毒种溶液稀释倍数最大的鸡胚的尿囊液，即为传代用病毒液；
C)利用步骤B)所述的传代用病毒液，重复以上步骤A、B3次，取HA效价排名前10％的鸡胚尿囊液作为种子批；将该种子批做10-4稀释，按常规方法接种鸡胚，70小时收获尿囊液，即得到灭活前病毒液，用于步骤2)灭活。
步骤A)中用于接种鸡胚的毒种溶液剂量为0.1mL。
步骤A)接种鸡胚后，将鸡胚于37℃孵育，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液。
步骤A)中所述感染病毒的鸡胚是接种后24h死亡胚或96h时未死胚。
步骤A)中对鸡胚是否感染病毒是通过以下方法确定的：测定鸡胚尿囊液的HA效价，HA效价≥(1:256)的鸡胚是感染病毒的鸡胚。
步骤C)中所述灭活前病毒液中禽流感病毒含量为10-9.1EID50/0.1mL。
步骤2)中病毒灭活方法为：向灭活前病毒液中加入甲醛至终浓度为0.5‰(v/v)，20℃条件下灭活12小时。
步骤3)中所述的冷冻干燥，以蔗糖脱脂乳作为冻干保护剂。
步骤3)中病毒混合液与冻干保护剂的混合比例为1:0.5。
实施例3
一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)病毒培养；
2)病毒灭活；
3)将步骤2)灭活后的病毒液与细胞因子IFN-γ以5:1的比例混匀得到病毒混合液，使得其中细胞因子IFN-γ的含量为500μg/mL，而后冷冻干燥得到所述冻干灭活疫苗。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)所述的病毒培养包括以下步骤：
A)将禽流感病毒毒种进行10倍梯度稀释，分别取10-8、10-9、10-10、10-11稀释度的毒种溶液接种鸡胚，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液；
B)在全部感染病毒的鸡胚中选取所注射毒种溶液稀释倍数最大的鸡胚的尿囊液，即为传代用病毒液；
C)利用步骤B)所述的传代用病毒液，重复以上步骤A、B5次，取HA效价排名前20％的鸡胚尿囊液作为种子批；将该种子批做10-4稀释，按常规方法接种鸡胚，72小时收获尿囊液，测得的效价为10-9.1EID50/0.1mL，即得到灭活前病毒液，用于步骤2)灭活。
步骤A)接种鸡胚后，将鸡胚于37℃孵育，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液。
步骤A)中对鸡胚是否感染病毒是通过以下方法确定的：测定鸡胚尿囊液的HA效价，HA效价≥(1:256)的鸡胚是感染病毒的鸡胚。
步骤2)中病毒灭活方法为：向灭活前病毒液中加入甲醛至终浓度为2‰(v/v)，25℃条件下灭活24小时。
步骤3)中病毒混合液与冻干保护剂的混合比例为1:1.5。
实施例4
一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)病毒培养；
2)病毒灭活；
3)将步骤2)灭活后的病毒液与细胞因子IFN-γ以3:1的比例混匀得到病毒混合液，使得其中细胞因子IFN-γ的含量为300μg/mL，而后冷冻干燥得到所述冻干灭活疫苗。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种1日龄肉鸡用禽流感病毒冻干灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)病毒培养；
2)病毒灭活；
3)将步骤2)灭活后的病毒液与细胞因子IFN-γ以1:1～5:1的比例混匀得到病毒混合液，使得其中细胞因子IFN-γ的含量为100～500μg/mL，而后冷冻干燥得到所述冻干灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述的病毒培养包括以下步骤：
A)将禽流感病毒毒种进行10倍梯度稀释，分别取10-8、10-9、10-10、10-11稀释度的毒种溶液接种鸡胚，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液；
B)在全部感染病毒的鸡胚中选取所注射毒种溶液稀释倍数最大的鸡胚的尿囊液，即为传代用病毒液；
C)利用步骤B)所述的传代用病毒液，重复以上步骤A、B3～5次，取HA效价排名前10～20％的鸡胚尿囊液作为种子批，将该种子批按10-4稀释度进行稀释，接种鸡胚，得到的尿囊液即为灭活前病毒液，用于步骤2)灭活。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤A)中用于接种鸡胚的毒种溶液剂量为0.1mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤A)接种鸡胚后，将鸡胚于37℃孵育，而后收集感染病毒的鸡胚尿囊液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤A)中所述感染病毒的鸡胚是接种后24～96h死亡胚或96h时未死胚。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤A)中对鸡胚是否感染病毒是通过以下方法确定的：测定鸡胚尿囊液的HA效价，HA效价≥(1:256)的鸡胚是感染病毒的鸡胚。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤C)中所述灭活前病毒液中禽流感病毒含量为10-9.1EID50/0.1mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中病毒灭活方法为：向灭活前病毒液中加入甲醛至终浓度为0.5～2‰(v/v)，20～25℃条件下灭活12～24小时。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的冷冻干燥，以蔗糖脱脂乳作为冻干保护剂。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)中病毒混合液与冻干保护剂的混合比例为1:0.5～1:1.5。
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