CN108913701A - 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法 - Google Patents

一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，即H7 Re1疫苗毒株HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸；所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体还包括H7N9亚型禽流感病毒NA基因与PR8病毒的6个内部基因。本发明还提供H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒，与H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒以及H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，所述疫苗包括上述H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。本发明利用定点突变技术，对H7 Re1疫苗毒株的HA基因进行突变，将重组病毒接种鸡胚，能够将H7 Re1疫苗毒株的增殖滴度提高1 log2个滴度。

Description

一种提高H7N9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法
技术领域
本发明属于疫苗领域，具体涉及一种提高H7N9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类传染病。禽流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，可分为16个HA亚型和9个NA亚型。高致病性禽流感是由某些H5或H7亚型禽流感病毒引起的严重威胁禽类的烈性传染病。
2013年以来，我国在禽群中发现了H7N9亚型低致病性禽流感病毒。2017年以来，禽群中的H7N9病毒由低致病性进化为高致病性，给养禽业造成了严重的经济损失。自2005年开始，我国针对高致病性禽流感实施大规模强制性免疫政策，并取得了显著成效，疫苗仍然是防控高致病禽流感的重要手段。2017年9月，我国开始使用H7 Re1疫苗对H7N9禽流感实施大规模强制性免疫。生产中发现，H7 Re1在鸡胚上的增殖滴度要明显低于H5亚型禽流感疫苗毒株Re-8的滴度。这就使得H7 Re1疫苗生产的成本要高于Re-8疫苗的生产成本。因此，迫切需要提高H7 Re1疫苗毒株增殖滴度的简易方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体为H7 Re1疫苗毒株HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸。
优选地，本发明所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体中，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体还包括H7N9亚型禽流感病毒NA基因与PR8病毒的6个内部基因，其中，所述PR8病毒的6个内部基因为pHW-191PB2、pHW-192PB1、pHW-193PA、pHW-195NP、pHW-197M、pHW-198NS(Genbank号分别为EF467818、EF467819、EF467820、EF467822、EF467824、EF467817)。
本发明的另一方面为提供H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒包括上述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体的编码基因。
本发明的又一目的在于提供H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，其中，所述H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒中的HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸。
本发明的再一目的为提供上述H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)、构建H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒；
2)、表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒、H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，转染293T细胞并转染鸡胚，收集尿囊液获得重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒，其中，所述PR8病毒的6个内部基因为pHW-191PB2、pHW-192PB1、pHW-193PA、pHW-195NP、pHW-197M、pHW-198NS。
优选地，本发明所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法中，所述步骤1)包括以下步骤：根据H7 Re1疫苗毒株HA基因序列，将其第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，再将其插入到双向表达载体中即得。
优选地，本发明所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法中，所述步骤2)包括以下步骤：
分别表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒H7N9亚型禽流感病毒HA和H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，经脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞，增殖培养后进行胰蛋白消化，转染细胞接种SPF鸡胚，培养收集尿囊液，获得H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
本发明还提供了H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，所述疫苗包括上述方法制备的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
优选地，本发明所述的亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗中，所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的灭活疫苗；所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，经甲醛溶液灭活，与白油佐剂混合配制成灭活疫苗。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明针对上述H7 Re1疫苗毒株增殖滴度的不足，研究建立了一种提高H7 Re1疫苗毒株在鸡胚上增殖滴度的方法。首先利用定点突变技术，对H7 Re1疫苗毒株的HA基因进行突变，使其编码的第56位氨基酸异亮氨酸突变为丙氨酸，再利用反向遗传操作技术重新获得重组病毒。将重组病毒接种鸡胚，能够将H7 Re1疫苗毒株的增殖滴度提高1log2个滴度。
附图说明
图1为本发明的一个实施方式中的重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒的RT-PCR扩增结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 H7N9亚型禽流感疫苗病毒的构建
1.表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒的构建
根据H7 Re1疫苗毒株HA基因序列(Genbank号(CY147172))，设计突变引物(序列为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO2：F:GGAACGAACAAACGCCCCCAGGATCTGCTC，R:GAGCAGATCCTGGGGGCGTTTGTTCGTTCC)，通过重叠延伸PCR方法将其第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，再将其插入到双向表达载体(pHW2000，购自普如汀生物技术有限公司)中，制得表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒pH-Re1 HA56。
2.表达H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒的构建
根据H7 Re1疫苗毒株NA基因序列(Genbank号(CY147174))，通过PCR方法扩增后，再将其插入到双向表达载体pHW2000中，制得表达H7N9亚型禽流感病毒NA基因突变体重组质粒pHW-N9。
3.重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒的包装与鉴定
将表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒pH-Re1 HA56和表达NA基因重组质粒pHW-N9，与表达PR8病毒的6个内部基因(pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M、pHW-NS，参考Vaccine.2002 Aug 19；20(25-26):3165-70.Eight-plasmid system forrapid generation of influenza virus vaccines.Hoffmann E,Krauss S,Perez D,Webby R,Webster RG.))的重组表达质粒，经脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞，6h后更换新鲜的培养基(Opti-MEM(Gibco)，补加TPCK-treated trypsin(Sigma)至终浓度2μg/mL，继续培养48h。将293T转染细胞经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，每个样品接种两个胚，置35℃培养至72h，收集尿囊液，进行血凝和血凝抑制试验鉴定病毒。
将血凝阳性的尿囊液，10000倍稀释后接种鸡胚。收取尿囊液提取RNA，RT-PCR扩增HA基因和NA基因片段进行测序。未经反转录的RNA用PCR扩增作为对照。RT-PCR扩增及测序结果表明，拯救的病毒为重组H7N9亚型禽流感病毒，其HA基因第56位氨基酸已由异亮氨酸突变为丙氨酸。未经反转录的RNA PCR扩增无条带(如图1所示)。重组病毒命名为H7 Re1-56。
4.血凝滴度测定
将H7 Re1-56重组病毒和H7 Re1病毒(韩翡,李永红,王千菊.不同生产工艺的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对鸡的免疫效果对比试验[J].养禽与禽病防治,2017(11):6-9.，HA和NA来自母本病毒A/pigeon/Shanghai/S1069/2013(H7N9))经1000倍稀释后，分别接种10枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置35℃培养至72h。收集尿囊液，测定血凝效价，计算其平均值(表1)。结果显示，H7 Re1-56比H7 Re1高1.1log2个血凝滴度。
表1 重组病毒血凝滴度(log2)
实施例2 H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56在制备灭活疫苗中的应用。
取实施例1 H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56和病毒株H7 Re1，分别接种SPF鸡胚，培养后收集尿囊液，经甲醛溶液灭活，与白油佐剂混合配制成灭活疫苗。
操作步骤如下：
1.病毒增殖
以无菌生理盐水1∶10000倍稀释实施例1 H7N9亚型禽流感疫苗株H7Re1-56和病毒H7 Re1，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.1mL/胚，收获培养72h后的存活鸡胚尿囊液，测定HA效价。
结果如下
表2 重组病毒血凝滴度(log2)
2.病毒灭活
将步骤1收获的尿囊液中加入福尔马林至终浓度0.2％，2-8℃灭活48h，每隔2h摇匀一次。灭活48h后，每个病毒样品接种10枚鸡胚，每胚0.1mL，孵化72h后测定HA效价，无血凝性的尿囊液再盲传一代。第二代仍无血凝性判为病毒完全灭活。结果2株病毒尿囊液鸡胚传代2次均无产生血凝性，灭活完全。
3.油乳剂灭活疫苗制备
灭活的H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56用生理盐水稀释1倍。将H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56和病毒H7 Re1灭活后的原液、H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56稀释1倍后的液体，与白油佐剂按照体积比1︰2的比例乳化，制备成油乳剂灭活疫苗。
4.免疫效力试验
将40只21日龄SPF鸡随机分为4组，每组10只。前3组分别肌肉注射上述H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56油乳剂灭活疫苗(原液)、病毒H7 Re1油乳剂灭活疫苗(原液)和病毒H7 Re1-56油乳剂灭活疫苗(1倍稀释)免疫剂量均为0.3mL/只，第4组为空白对照组，隔离饲养。免疫后3周，采血测定H7亚型禽流感病毒血凝抑制抗体水平(表2)。
H7N9亚型禽流感病毒油乳剂灭活疫苗免疫效力试验结果表明，相比H7 Re1(原液)疫苗，H7 Re1-56(原液)疫苗免疫3周后产生的血凝抑制抗体高0.9log2滴度，H7 Re1-56(1倍稀释)疫苗与H7 Re1(原液)疫苗产生的血凝抑制抗体水平相似。
表2 重组H7N9亚型禽流感病毒灭活疫苗的免疫效力试验
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种提高H7N9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaacgaaca aacgccccca ggatctgctc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcagatcc tgggggcgtt tgttcgttcc 30

Claims (9)

1.一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，其特征在于，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体为H7Re1疫苗毒株HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸。
2.根据权利要求1所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，其特征在于，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体还包括H7N9亚型禽流感病毒NA基因与PR8病毒的6个内部基因，其中所述6个内部基因为pHW-191PB2、pHW-192PB1、pHW-193PA、pHW-195NP、pHW-197M、pHW-198NS。
3.一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒，其特征在于，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒包括如权利要求1所述的H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体的编码基因。
4.一种H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，其特征在于，所述H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒中的HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸。
5.一种H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、构建H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒；
2)、表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒、H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，转染293T细胞并转染鸡胚，收集尿囊液获得重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒。
6.根据权利要求5所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤1)包括以下步骤：根据H7Re1疫苗毒株HA基因序列，将其第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，再将其插入到双向表达载体中即得。
7.根据权利要求6所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤2)包括以下步骤：
表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒和H7N9亚型禽流感病毒NA基因质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，经脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞，增殖培养后进行胰蛋白消化，转染细胞接种SPF鸡胚，培养收集尿囊液，获得H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
8.一种H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求4所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
9.根据权利要求8所述的亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的灭活疫苗；更优选地，所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，经甲醛溶液灭活，与白油佐剂混合配制成灭活疫苗。
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