CN108913701B - 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法 - Google Patents

一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108913701B
CN108913701B CN201810913521.4A CN201810913521A CN108913701B CN 108913701 B CN108913701 B CN 108913701B CN 201810913521 A CN201810913521 A CN 201810913521A CN 108913701 B CN108913701 B CN 108913701B
Authority
CN
China
Prior art keywords
avian influenza
vaccine
virus
subtype avian
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201810913521.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108913701A (zh
Inventor
蒋文明
侯广宇
李金平
陈继明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Original Assignee
CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER filed Critical CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority to CN201810913521.4A priority Critical patent/CN108913701B/zh
Publication of CN108913701A publication Critical patent/CN108913701A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108913701B publication Critical patent/CN108913701B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

本发明提供了一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，即H7 Re1疫苗毒株HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸；所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体还包括H7N9亚型禽流感病毒NA基因与PR8病毒的6个内部基因。本发明还提供H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒，与H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒以及H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，所述疫苗包括上述H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。本发明利用定点突变技术，对H7 Re1疫苗毒株的HA基因进行突变，将重组病毒接种鸡胚，能够将H7 Re1疫苗毒株的增殖滴度提高1 log2个滴度。

Description

一种提高H7N9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法
技术领域
本发明属于疫苗领域，具体涉及一种提高H7N9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类传染病。禽流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，可分为16个HA亚型和9个NA亚型。高致病性禽流感是由某些H5或H7亚型禽流感病毒引起的严重威胁禽类的烈性传染病。
2013年以来，我国在禽群中发现了H7N9亚型低致病性禽流感病毒。2017年以来，禽群中的H7N9病毒由低致病性进化为高致病性，给养禽业造成了严重的经济损失。自2005年开始，我国针对高致病性禽流感实施大规模强制性免疫政策，并取得了显著成效，疫苗仍然是防控高致病禽流感的重要手段。2017年9月，我国开始使用H7 Re1疫苗对H7N9禽流感实施大规模强制性免疫。生产中发现，H7 Re1在鸡胚上的增殖滴度要明显低于H5亚型禽流感疫苗毒株Re-8的滴度。这就使得H7 Re1疫苗生产的成本要高于Re-8疫苗的生产成本。因此，迫切需要提高H7 Re1疫苗毒株增殖滴度的简易方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体为H7 Re1疫苗毒株HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸。
优选地，本发明所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体中，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体还包括H7N9亚型禽流感病毒NA基因与PR8病毒的6个内部基因，其中，所述PR8病毒的6个内部基因为pHW-191PB2、pHW-192PB1、pHW-193PA、pHW-195NP、pHW-197M、pHW-198NS(Genbank号分别为EF467818、EF467819、EF467820、EF467822、EF467824、EF467817)。
本发明的另一方面为提供H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒包括上述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体的编码基因。
本发明的又一目的在于提供H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，其中，所述H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒中的HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸。
本发明的再一目的为提供上述H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)、构建H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒；
2)、表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒、H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，转染293T细胞并转染鸡胚，收集尿囊液获得重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒，其中，所述PR8病毒的6个内部基因为pHW-191PB2、pHW-192PB1、pHW-193PA、pHW-195NP、pHW-197M、pHW-198NS。
优选地，本发明所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法中，所述步骤1)包括以下步骤：根据H7 Re1疫苗毒株HA基因序列，将其第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，再将其插入到双向表达载体中即得。
优选地，本发明所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法中，所述步骤2)包括以下步骤：
分别表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒H7N9亚型禽流感病毒HA和H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，经脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞，增殖培养后进行胰蛋白消化，转染细胞接种SPF鸡胚，培养收集尿囊液，获得H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
本发明还提供了H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，所述疫苗包括上述方法制备的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
优选地，本发明所述的亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗中，所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的灭活疫苗；所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，经甲醛溶液灭活，与白油佐剂混合配制成灭活疫苗。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明针对上述H7 Re1疫苗毒株增殖滴度的不足，研究建立了一种提高H7 Re1疫苗毒株在鸡胚上增殖滴度的方法。首先利用定点突变技术，对H7 Re1疫苗毒株的HA基因进行突变，使其编码的第56位氨基酸异亮氨酸突变为丙氨酸，再利用反向遗传操作技术重新获得重组病毒。将重组病毒接种鸡胚，能够将H7 Re1疫苗毒株的增殖滴度提高1log2个滴度。
附图说明
图1为本发明的一个实施方式中的重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒的RT-PCR扩增结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 H7N9亚型禽流感疫苗病毒的构建
1.表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒的构建
根据H7 Re1疫苗毒株HA基因序列(Genbank号(CY147172))，设计突变引物(序列为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO2：F:GGAACGAACAAACGCCCCCAGGATCTGCTC，R:GAGCAGATCCTGGGGGCGTTTGTTCGTTCC)，通过重叠延伸PCR方法将其第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，再将其插入到双向表达载体(pHW2000，购自普如汀生物技术有限公司)中，制得表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒pH-Re1 HA56。
2.表达H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒的构建
根据H7 Re1疫苗毒株NA基因序列(Genbank号(CY147174))，通过PCR方法扩增后，再将其插入到双向表达载体pHW2000中，制得表达H7N9亚型禽流感病毒NA基因突变体重组质粒pHW-N9。
3.重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒的包装与鉴定
将表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒pH-Re1 HA56和表达NA基因重组质粒pHW-N9，与表达PR8病毒的6个内部基因(pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-NP、pHW-M、pHW-NS，参考Vaccine.2002 Aug 19；20(25-26):3165-70.Eight-plasmid system forrapid generation of influenza virus vaccines.Hoffmann E,Krauss S,Perez D,Webby R,Webster RG.))的重组表达质粒，经脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞，6h后更换新鲜的培养基(Opti-MEM(Gibco)，补加TPCK-treated trypsin(Sigma)至终浓度2μg/mL，继续培养48h。将293T转染细胞经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，每个样品接种两个胚，置35℃培养至72h，收集尿囊液，进行血凝和血凝抑制试验鉴定病毒。
将血凝阳性的尿囊液，10000倍稀释后接种鸡胚。收取尿囊液提取RNA，RT-PCR扩增HA基因和NA基因片段进行测序。未经反转录的RNA用PCR扩增作为对照。RT-PCR扩增及测序结果表明，拯救的病毒为重组H7N9亚型禽流感病毒，其HA基因第56位氨基酸已由异亮氨酸突变为丙氨酸。未经反转录的RNA PCR扩增无条带(如图1所示)。重组病毒命名为H7 Re1-56。
4.血凝滴度测定
将H7 Re1-56重组病毒和H7 Re1病毒(韩翡,李永红,王千菊.不同生产工艺的重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对鸡的免疫效果对比试验[J].养禽与禽病防治,2017(11):6-9.，HA和NA来自母本病毒A/pigeon/Shanghai/S1069/2013(H7N9))经1000倍稀释后，分别接种10枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，置35℃培养至72h。收集尿囊液，测定血凝效价，计算其平均值(表1)。结果显示，H7 Re1-56比H7 Re1高1.1log2个血凝滴度。
表1 重组病毒血凝滴度(log2)
Figure BDA0001762370420000041
实施例2 H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56在制备灭活疫苗中的应用。
取实施例1 H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56和病毒株H7 Re1，分别接种SPF鸡胚，培养后收集尿囊液，经甲醛溶液灭活，与白油佐剂混合配制成灭活疫苗。
操作步骤如下：
1.病毒增殖
以无菌生理盐水1∶10000倍稀释实施例1 H7N9亚型禽流感疫苗株H7Re1-56和病毒H7 Re1，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.1mL/胚，收获培养72h后的存活鸡胚尿囊液，测定HA效价。
结果如下
表2 重组病毒血凝滴度(log2)
Figure BDA0001762370420000051
2.病毒灭活
将步骤1收获的尿囊液中加入福尔马林至终浓度0.2％，2-8℃灭活48h，每隔2h摇匀一次。灭活48h后，每个病毒样品接种10枚鸡胚，每胚0.1mL，孵化72h后测定HA效价，无血凝性的尿囊液再盲传一代。第二代仍无血凝性判为病毒完全灭活。结果2株病毒尿囊液鸡胚传代2次均无产生血凝性，灭活完全。
3.油乳剂灭活疫苗制备
灭活的H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56用生理盐水稀释1倍。将H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56和病毒H7 Re1灭活后的原液、H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56稀释1倍后的液体，与白油佐剂按照体积比1︰2的比例乳化，制备成油乳剂灭活疫苗。
4.免疫效力试验
将40只21日龄SPF鸡随机分为4组，每组10只。前3组分别肌肉注射上述H7N9亚型禽流感疫苗株H7 Re1-56油乳剂灭活疫苗(原液)、病毒H7 Re1油乳剂灭活疫苗(原液)和病毒H7 Re1-56油乳剂灭活疫苗(1倍稀释)免疫剂量均为0.3mL/只，第4组为空白对照组，隔离饲养。免疫后3周，采血测定H7亚型禽流感病毒血凝抑制抗体水平(表2)。
H7N9亚型禽流感病毒油乳剂灭活疫苗免疫效力试验结果表明，相比H7 Re1(原液)疫苗，H7 Re1-56(原液)疫苗免疫3周后产生的血凝抑制抗体高0.9log2滴度，H7 Re1-56(1倍稀释)疫苗与H7 Re1(原液)疫苗产生的血凝抑制抗体水平相似。
表2 重组H7N9亚型禽流感病毒灭活疫苗的免疫效力试验
Figure BDA0001762370420000061
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种提高H7N9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaacgaaca aacgccccca ggatctgctc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcagatcc tgggggcgtt tgttcgttcc 30

Claims (9)

1.一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，其特征在于，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体为H7Re1疫苗毒株HA基因序列的第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸；所述H7Re1疫苗毒株HA基因序列的GenBank登录号为CY147172。
2.一种用于构建H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的基因组合，其特征在于，包括权利要求1所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体，还包括H7N9亚型禽流感病毒NA基因与PR8病毒的6个内部基因，其中所述6个内部基因的重组表达质粒为pHW-191PB2、pHW-192PB1、pHW-193PA、pHW-195NP、pHW-197M、pHW-198NS；所述H7N9亚型禽流感病毒NA基因为H7Re1疫苗毒株NA基因；所述H7Re1疫苗毒株NA基因序列的GenBank登录号为CY147174；所述pHW-191PB2重组表达质粒中PB2基因序列的GenBank登录号为EF467818；所述pHW-192PB1重组表达质粒中PB1基因序列的GenBank登录号为EF467819；所述pHW-193PA重组表达质粒中PA基因序列的GenBank登录号为EF467820；所述pHW-195NP重组表达质粒中NP基因序列的GenBank登录号为EF467822；所述pHW-197M重组表达质粒中M基因序列的GenBank登录号为EF467824；所述pHW-198NS重组表达质粒中NS基因序列的GenBank登录号为EF467817。
3.一种H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒，其特征在于，所述H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒包括如权利要求1所述的H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体的编码基因。
4.一种H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、构建H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒；
2)、表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒、H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，转染293T细胞并转染鸡胚，收集尿囊液获得重组H7N9亚型禽流感疫苗病毒；其中所述6个内部基因的重组表达质粒为pHW-191PB2、pHW-192PB1、pHW-193PA、pHW-195NP、pHW-197M、pHW-198NS；
所述步骤1)包括以下步骤：根据H7Re1疫苗毒株HA基因序列，将其第56位氨基酸由异亮氨酸突变为丙氨酸，再将其插入到双向表达载体中即得；所述H7Re1疫苗毒株HA基因序列的GenBank登录号为CY147172；
所述步骤2)中H7N9亚型禽流感病毒NA基因重组质粒为H7Re1疫苗毒株NA基因重组质粒；H7Re1疫苗毒株NA基因序列的GenBank登录号为CY147174；所述pHW-191PB2重组表达质粒中PB2基因序列的GenBank登录号为EF467818；所述pHW-192PB1重组表达质粒中PB1基因序列的GenBank登录号为EF467819；所述pHW-193PA重组表达质粒中PA基因序列的GenBank登录号为EF467820；所述pHW-195NP重组表达质粒中NP基因序列的GenBank登录号为EF467822；所述pHW-197M重组表达质粒中M基因序列的GenBank登录号为EF467824；所述pHW-198NS重组表达质粒中NS基因序列的GenBank登录号为EF467817。
5.根据权利要求4所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤2)包括以下步骤：
表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因突变体重组质粒和H7N9亚型禽流感病毒NA基因质粒，与表达PR8病毒的6个内部基因的重组表达质粒，经脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞，增殖培养后进行胰蛋白消化，转染细胞接种SPF鸡胚，培养收集尿囊液，获得H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
6.一种H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由权利要求4或5所述构建方法而获得。
7.一种H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求6所述的H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒。
8.根据权利要求7所述的亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒的灭活疫苗。
9.根据权利要求8所述的亚型禽流感疫苗重组病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为H7N9亚型禽流感疫苗重组病毒，经甲醛溶液灭活，与白油佐剂混合配制成灭活疫苗。
CN201810913521.4A 2018-08-13 2018-08-13 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法 Expired - Fee Related CN108913701B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810913521.4A CN108913701B (zh) 2018-08-13 2018-08-13 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810913521.4A CN108913701B (zh) 2018-08-13 2018-08-13 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108913701A CN108913701A (zh) 2018-11-30
CN108913701B true CN108913701B (zh) 2020-08-28

Family

ID=64404370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810913521.4A Expired - Fee Related CN108913701B (zh) 2018-08-13 2018-08-13 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108913701B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172452B (zh) * 2019-05-21 2021-07-06 广州医科大学 一种高致病性h7n9禽流感病毒、疫苗、检测试剂以及病毒、疫苗的制备方法
CN110106192B (zh) * 2019-05-23 2021-11-12 广州医科大学 一种具有低受体结合活性的高致病性h7n9禽流感病毒抗原及其制备方法
CN110106193B (zh) * 2019-05-23 2021-11-12 广州医科大学 一种具有低受体结合活性的高致病性h7n9禽流感病毒抗原及其制备方法
CN110760486A (zh) * 2019-11-29 2020-02-07 山东省农业科学院家禽研究所 一种h13n8重组流感病毒及应用
CN113913396B (zh) * 2021-10-19 2022-06-07 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 人工重组的h7n9流感病毒及其制备方法和应用
CN115960842B (zh) * 2022-11-26 2023-09-01 哈尔滨维科生物技术有限公司 一种提高重组禽流感病毒感染鸡胚能力的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746298A (zh) * 2004-09-10 2006-03-15 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 人工重组的h7亚型流感病毒及其制备方法和应用
CN100467591C (zh) * 2005-06-21 2009-03-11 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 重组禽流感病毒毒株、其制备方法及由其制得的疫苗
CN105671002A (zh) * 2015-10-09 2016-06-15 华中农业大学 H9n2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用
CN106399265B (zh) * 2016-09-19 2018-03-02 中国动物卫生与流行病学中心 一种提高禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1746298A (zh) * 2004-09-10 2006-03-15 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 人工重组的h7亚型流感病毒及其制备方法和应用
CN100467591C (zh) * 2005-06-21 2009-03-11 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 重组禽流感病毒毒株、其制备方法及由其制得的疫苗
CN105671002A (zh) * 2015-10-09 2016-06-15 华中农业大学 H9n2亚型禽流感病毒细胞高产疫苗株构建及应用
CN106399265B (zh) * 2016-09-19 2018-03-02 中国动物卫生与流行病学中心 一种提高禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines;Erich Hoffmann et al;《Vaccine》;20021231;第20卷;第3165-3170页 *
利用反向遗传学技术构建H5N9重组流感病毒株;郭磊等;《国际病毒学杂志》;20170630;第24卷(第3期);第145-150页 *
影响H5N1甲型流感病毒对哺乳动物毒力变异的HA序列关键位点研究;许慧琳等;《复旦学报（医学版）》;20060930;第33卷(第5期);第642-646页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108913701A (zh) 2018-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108913701B (zh) 一种提高h7n9亚型禽流感疫苗毒株增殖滴度的方法
Heinen Swine influenza: a zoonosis
CN102802666B (zh) 猪流感血凝素变异体
CN102149405A (zh) 流感血凝素和神经氨酸酶变体
Choi et al. Genetic relationship of H3 subtype avian influenza viruses isolated from domestic ducks and wild birds in Korea and their pathogenic potential in chickens and ducks
US11510976B2 (en) H7 avian influenza vaccine strain which differentiates infected from vaccinated animals, preparation method therefor, and application
CN102257135A (zh) 流感疫苗的生产
US11607448B2 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and its use in producing H7N9 subtype avian influenza vaccine
CN105518129A (zh) 减毒流感疫苗和其用途
CN1261564C (zh) 人工重组的流感病毒及其应用
US11512117B1 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and recombinant H5N2 subtype avian influenza virus, vaccine and uses thereof
JP2018064493A (ja) Ｍｄｃｋ細胞を用いたインフルエンザウイルスの増殖方法
EP3715459B1 (en) H9 avian influenza vaccine strain which differentiates infected from vaccinated animals, and preparation method therefor
Sun et al. Evolution of the PB1 gene of human influenza A (H3N2) viruses circulating between 1968 and 2019
CN100467591C (zh) 重组禽流感病毒毒株、其制备方法及由其制得的疫苗
CN108300702B (zh) 一株鸡源h9n2禽流感病毒冷适应株筛选方法及其应用
MX2015001499A (es) Produccion de virus infecciosos de influenza.
US11547754B2 (en) H5 avian influenza vaccine strain which differentiates infected from vaccinated animals, preparation method therefor, and application
JP6573746B1 (ja) 組み換え鳥パラミクソウイルス
Peeters et al. New DIVA vaccine for the protection of poultry against H5 highly pathogenic avian influenza viruses irrespective of the N-subtype
CN111454908A (zh) 一种Tpl2缺陷型MDCK细胞株及其构建方法和应用
CN104109655B (zh) H7亚型禽流感疫苗和诊断试剂所需种毒的制备方法
CN114410681B (zh) 一种基于m基因核苷酸片段删除的流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用
US11214799B2 (en) HA-specific influenza virus attenuated vaccine comprising mutations in segment 7, and uses therefor
Suphaphiphat et al. Antigenic characterization of influenza viruses produced using synthetic DNA and novel backbones

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200828

Termination date: 20210813