CN113913396B - 人工重组的h7n9流感病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

人工重组的h7n9流感病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人工重组的H7N9流感病毒及制备方法和应用。本发明的人工重组的H7N9流感病毒具有高致病性禽流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，但HA裂解位点氨基酸序列为‑PKGR‑，具有流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个内部基因，株号为H7‑Re4，保藏号为CCTCC NO：V202161。该毒株具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高9倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。

Description

人工重组的H7N9流感病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及反向遗传学技术和动物传染病技术领域，具体涉及一种人工重组并致弱的 H7N9亚型重组流感病毒及其制备方法和应用。
背景技术
禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是一种能广泛感染禽类和哺乳动物的分节段的负 链RNA病毒。根据病毒的表面蛋白，AIV被分为16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA) 亚型。其中，H5和H7亚型AIV可在家禽或野鸟中引起疫情，导致重大经济损失，也可感 染人类，引起公共卫生危害。中国研制出一系列全病毒灭活苗，成功控制了2004年以来的 H5亚型和2017年以来H7N9亚型禽流感。
为应对该类H7N9抗原变异株可能引起的家禽疫情和公共卫生危害，本发明进行了人工 重组的H7N9禽流感疫苗株的研制。
理想的流感病毒疫苗株应具备与流行株良好的抗原匹配性，对鸡胚无致病力及鸡胚高滴 度生长性等条件。然而，很难从自然界分离具备上述条件的流感毒株作为疫苗株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种人工重组的H7N9流感病毒及其制备方法和应 用。
本发明的技术方案为：人工重组的H7N9流感病毒，以H7N9亚型禽流感病毒 A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供 体，但HA裂解位点氨基酸序列为-PKGR-；以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA， NP，M和NS基因作为重组病毒6个内部基因供体，通过反向遗传操作方法，人工制造得到 了1株重组的H7N9禽流感病毒，命名为A型流感病毒A/Harbin/H7-Re4/2021(H7N9)(简称 为H7-Re4株)，保藏在位于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，其保藏 号为CCTCC NO：V202161，保藏时间为2021年8月3日。
本发明选用流感病毒的可在鸡胚内生长至很高滴度的实验室鸡胚适应株A/PR/8/34 (H1N1)的6个内部基因作为骨架基因，并选用2021年分离得到的禽流感病毒株 A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)的HA和NA基因作为表面基因，利用反向遗传学人工 构建方法，制备了重组病毒H7-Re4株，该重组毒株将可以作为H7N9流感的疫苗株。
实验证实，H7-Re4与我国H7N9流感病毒流行株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9) 抗原性一致，将对H7N9流感病毒流行株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)产生良好的特 异保护性。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因，因此 具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高9倍以上；以此为疫苗株生产疫 苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的重组的H7N9禽流感病毒在制备预防H7N9流 感病毒所导致疾病的药物中的应用。
进一步地，所述H7N9禽流感病毒为A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)毒株。
更进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组的H7N9禽流感病毒的方法，该方法 包括：
(1)设计HA基因特异性扩增和突变引物，利用RT-PCR方法，扩增出高致病性性H7N9亚型禽流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)株HA基因的HA1和HA2片段，在扩 增HA1片段的同时将HA基因裂解位点氨基酸由-PKRKRIAR-突变为-PKGR-，使其由高致 病性禽流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征；再利用重叠延伸反应， 扩增出裂解位点为典型低致病性禽流感病毒分子特征的HA片段，插入pBD质粒，构建重 组HA基因双向转录载体；
(2)RT-PCR扩增H7N9亚型流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)的NA基因全 基因，插入pBD质粒，构建重组NA基因双向转录载体；
(3)将(1)、(2)所述构建的HA、NA基因2个重组pBD双向转录载体质粒和含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的6个pBD双 向转录载体质粒混合，并与转染试剂一起接种293T细胞，将培养后细胞及上清接种鸡胚， 获得具有HA活性的H7N9禽流感rH7N9-2/6重组病毒株。得到的重组病毒HA和NA来自 于H7N9流感病毒国内分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)，但HA裂解位点氨基酸 序列为-PKGR-，6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。
进一步地，扩增HA1基因的引物对如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，其中SEQID No.10为同时突变HA裂解位点的引物；扩增HA2基因的引物对如SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、H7-Re4与我国H7N9流感病毒流行株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)抗原性一 致，将对H7N9流感病毒流行株A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)产生良好的特异保护 性。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因，因此具有良 好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高9倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可 大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
2、通过对HA基因裂解位点人工修饰，H7-Re4具有典型低致病力分子特征，H7-Re4株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
附图说明
图1为RT-PCR扩增基因的凝胶电泳图，A为以A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)毒 株cDNA为模板，RT-PCR扩增的HA1、HA2、HA和NA基因特异性片段，分别为第1～4泳道，M为DNA Marker 2000；B为以重组H7N9病毒的cDNA为模板，RT-PCR扩增的重 组H7-Re4株病毒8个片段，第1至第8泳道为HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基 因片段；M为DNA Marker2000。
图2为病毒HA基因裂解位点区域突变前后序列。
图3为重组H7-Re4株病毒和野生型H7N9流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)在最佳培养温度36℃测定的生长曲线；
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材 料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实验材料
1.病毒株
A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)(简称CK/YN/SD024/21)为2021年在我国云南省采 集的鸡样品中分离得到，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室分离、 鉴定和保存。记载在文献：现用重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗对近期H5和H7病毒 抗原变异株的免疫效力研究，刘艳晶等，《中国预防兽医学报》，2021年9月知网在线公开发 表。申请人保证从申请日起二十年内可开放提供该生物材料。
2.SPF鸡胚及细胞
SPF鸡胚和SPF鸡，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源库， 293T细胞(人胚肾细胞，SCSP-502)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
3.质粒载体
pBD载体(Zejun Li,Hualan Chen,Peirong Jiao,Guohua Deng,Guobin Tian,Yanbing Li, Erich Hoffmann,Robert G.Webster,Yumiko Matsuoka,and KangzhenYu.Molecular Basis of Replication of Duck H5N1 Influenza Viruses in aMammalian Mouse Model.J.Virol.79:12058– 12064.)由陈化兰研究员构建，将单向转录质粒载体pPolIsapIRib中包含聚合酶I启动子-SapI 克隆位点-鼠源核酶序列的XbaI酶切片段，反向插入pCI(Promega)质粒的XbaI位点，形 成RNA聚合酶II启动子(CMV)→病毒RNA转录终止信号序列Rib→流感病毒基因组 cDNA(5’→3’)→人RNA聚合酶I启动子→mRNA转录终止PolyA信号序列(SV40)构成 的双向转录表达质粒载体，利用该载体可同时转录出流感病毒负链vRNA和正链mRNA。插 入A/PR/8/34(H1N1)毒株PB2，PB1，PA，NP，M和NS等6个内部基因的pBD-PB2、pBD- PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M和pBD-NS载体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家 禽流感参考实验室鉴定和保存(Guobin Tian,Suhua Zhang,Yanbing Li,Zhigao Bu,Peihong Liu, Jiyong Zhou,Chengjun Li,Jianzhong Shi,Kangzhen Yu,Hualan Chen.Protective efficacy in chickens,geese and ducks of an H5N1inactivated vaccine developed by reverse genetics.Virology, 2005,341:153-162)。
4.主要试剂
病毒RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒(ReverTraAce RT Kit)购自日本Toyobo公司；Ex-taq酶购自Takara公司；PCR产物纯化试剂盒(CYCLE-PURE- KIT)购自Omega公司；胶回收试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)购自Promega 公司；测序试剂盒(ABI BigDye Terminator v3.1)购自美国Thermo Fisher公司；质粒提取试剂 盒(QIAGEN Plasmid Midi Kit)购自QIAGEN公司。
5.引物
分析比较，设计合成H7N9流感分离株CK/YN/SD024/21(H7N9)HA1、HA2和NA基因 的特异性引物，其中HA1-L为同时突变HA裂解位点的引物。合成引物序列见表1。
表1 H7N9流感病毒CK/YN/SD024/21(H7N9)的HA和NA基因特异性引物序列
Figure BDA0003311352280000051
分析比较，设计合成A/PR/8/34(H1N1)的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段的特异 性引物，合成引物序列见表2。
表2流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6个特异性片段的特异性引物序列
Figure BDA0003311352280000052
实施例1：重组H7N9流感病毒H7-Re4的制备与鉴定
1.重组病毒2个表面基因(HA和NA)的构建和鉴定：
利用病毒RNA提取试剂盒，提取我国H7N9亚型高致病力禽流感病毒分离株 CK/YN/SD024/21(H7N9)RNA作为模板，使用HA1片段特异性引物(HA1-U：atg aac act caa atc ctgata ttc g；HA1-L-：gca cca aat agg cct cgt ccc ttt gga acc tca gga aca ttc tt，其中HA1-L为 同时突变HA裂解位点为低致病力分子特征的引物)和HA2片段特异性引物(HA2-U：gga cga ggc cta ttt ggt gct ata gcg g；HA2-L：tta tat aca aat agt gcaccg cat g)，利用RT-PCR方法，分别 扩增HA的HA1和HA2两个片段；然后以HA1、HA2为模板，HA1-U/HA2-L为引物，用 phusion高保真聚合酶进行重叠延伸反应(SOE-PCR)，扩增出裂解位点不含多个碱性氨基酸 的HA片段(见图1中A)。并将其克隆于pBD载体中，构建成pBD-mutHA重组质粒。
HA基因裂解位点的突变引物(HA1-L)根据HA基因多个连续碱性氨基酸位点的特异性序列设计，PCR扩增后，HA基因裂解位点由-PKRKRIAR-突变为低致病性流感病毒分子 特征-PKGR-(图2)。
以上述提取的H7N9分离株RNA为模板，使用NA片段特异性引物，利用RT-PCR方 法，扩增上述H7N9毒株的NA基因全基因cDNA(见图1中A)，按上述方法插入pBD中， 构建成pBD-NA重组质粒。
2.重组病毒的拯救：
利用脂质体转染法将上述8个基因的双向表达质粒同时导入单层的293T细胞，48小时 后收获细胞及上清，接种10日龄鸡胚尿囊腔，48小时后收获尿囊液并检测血凝(HA)活性。 HA阳性样品即为救获的H7N9亚型低致病力重组病毒，将获得的重组病毒命名为 A/Harbin/H7-Re4/2021(H7N9)，株号为H7-Re4，保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：V202161。
3.重组病毒的序列鉴定
提取重组病毒H7-Re4的RNA，RT-PCR分别扩增出重组病毒H7-Re4的全基因组的8个片段(见图1中B)，对PCR产物进行核酸凝胶电泳，胶回收后测定每一片段的特定序列。 H7-Re4株HA基因如SEQ ID No.1所示，H7-Re4株NA基因如SEQ ID No.2所示，H7-Re4 株PB2基因如SEQ ID No.3所示，H7-Re4株PB1基因如SEQ ID No.4所示，H7-Re4株PA 基因如SEQ IDNo.5所示，H7-Re4株NP基因如SEQ ID No.6所示，H7-Re4株M基因如 SEQ ID No.7所示，H7-Re4株NS基因如SEQ ID No.8所示。
利用DNAStar软件(DNAStar Lasergene V7.1)，对测定的序列与野生毒株H7N9流感病毒 国内分离株CK/YN/SD024/21(H7N9)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的序列进行序列比较，发 现重组病毒H7-Re4的HA和NA来自于H7N9流感病毒国内分离 A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)，但HA裂解位点为低致病性流感病毒分子特征-PKGR-； 6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，表明H7-Re4 为H7N9亚型的2+6的重组病毒株。
4.重组病毒H7-Re4生长曲线的测定
禽流感疫苗常用鸡胚生产，要求疫苗株在接种的鸡胚中具有良好的生长特性，本研究进 行H7-Re4株病毒在鸡胚中的生长特性研究。将亲本病毒H7N9流感病毒流行株 CK/YN/SD024/21(H7N9)(简称CK/YN/SD024/21)和重组病毒H7-Re4接种2组SPF鸡胚各 20枚，36℃条件下分别培养24、48、72和96小时，分别取上述培养不同时间的各5枚鸡 胚进行血凝测定，检测亲本毒株CK/YN/SD024/21(H7N9)和重组病毒H7-Re4的生长曲线。
从重组H7-Re4病毒在36℃培养条件下测定的生长曲线可以看出，重组病毒生长滴度较 亲本H7N9流感病毒国内分离株CK/YN/SD024/21(H7N9)有明显提高，72h时平均血凝效价 最高(9.2log2，即1:588)，较野生病毒的平均最高血凝价(6log2，即1:64)高出9.18倍(如 图2所示)。这说明本发明制备出了一株高生长滴度的重组病毒，将为以后的批量生产带来巨 大的经济利益。
5.重组病毒H7-Re4的抗原性分析
将亲本H7N9流感病毒国内分离株CK/YN/SD024/21(H7N9)与人工重组的H7N9流感病 毒灭活后制备油乳剂灭活疫苗，免疫SPF鸡制备抗血清，使用HI试验进行抗原性分析，HI试验方法参考高致病性禽流感诊断技术国家标准(GB)(GB/T118936-2020))。HI试验结果显示， 亲本H7N9流感病毒国内分离株CK/YN/SD024/21(H7N9)与人工重组的H7N9流感病毒抗血 清与对应抗原的HI滴度无差异，表明H7N9病毒重组为鸡胚适应性的H7-Re4株后，病毒依然保持着亲本毒株的抗原性(见表3)。
表3亲本毒株CK/YN/SD024/21(H7N9)与重组病毒H7-Re4的抗原性分析
Figure BDA0003311352280000071
6.重组病毒H7-Re4对鸡胚和鸡的致病力试验
疫苗毒株的低致病性是具有生物安全性的前提条件，鸡胚和鸡是评价禽流感疫苗株致病 性的模式宿主。9～11日龄SPF鸡胚和4～8周龄SFP鸡经常作为禽流感病毒致病性评估模 型。
为了解重组毒株的感染能力和致病性，本发明首先使用SPF鸡胚进行病毒致病性评估。 9日龄的SPF鸡胚(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源库)20枚， 随机分为2组，每组10枚，第一组通过尿囊腔接种10-4倍稀释的重组毒株H7-Re4株病毒 液，第二组通过尿囊腔接种10-4倍稀释的亲本毒株CK/YN/SD024/21(H7N9)的病毒液。接种 后72小时内观察和记录鸡胚死亡情况。
本发明同时使用SPF鸡进行病毒致病性和感染能力评估。6周龄的SPF鸡20只，随机分为2组，每组10只，将重组毒株H7-Re4和亲本毒株CK/YN/SD024/21(H7N9)尿囊液分别 稀释10倍后，静脉途径接种6周龄SPF鸡，接种后每日观察发病死亡情况，连续观察10日， 计算鸡静脉内接种致病指数(IVPI)。若IVPI大于1.2，则表明该毒株为高致病性毒株；若 IVPI小于1.2，HA裂解位点为高致病性流感病毒分子特征，则为高致病性禽流感毒株；若 IVPI小于1.2，HA裂解位点为低致病性流感病毒分子特征，则为低致病性禽流感毒株。
6周龄的SPF鸡20只，随机分为2组，每组10只，将重组毒株H7-Re4和亲本毒株 CK/YN/SD024/21(H7N9)尿囊液分别稀释至106EID50/ml后，分别鼻腔途径接种6周龄SPF鸡 各10只，0.1ml/只。接种后每日观察发病死亡情况，连续观察14日，同时采集喉头和泄殖 腔拭子进行病毒滴定，评估病毒对鸡的感染能力。
SPF鸡胚致病试验结果显示，CK/YN/SD024/21(H7N9)病毒接种鸡胚在接种后30～36小 时内全部发病死亡，接种重组毒株H7-Re4株病毒液的所有鸡胚在接种后72小时内全部存 活，表明H7-Re4株重组病毒对鸡胚无致病性。
SPF鸡静脉内接种致病指数试验结果显示，CK/YN/SD024/21(H7N9)病毒接种鸡在接种 后1日内全部发病死亡，其IVPI为3.0；接种重组毒株H7-Re4株病毒液所有鸡在接种后10 日内均无发病和死亡情况发生，构建的H7-Re4株重组病毒IVPI为0(见表4)，表明H7-Re4株重组病毒为低致病性毒株，对鸡无致病性。
SPF鸡鼻腔感染试验结果显示，CK/YN/SD024/21(H7N9)病毒感染鸡在接种后4日内全 部发病死亡，而鼻腔接种重组毒株H7-Re4株病毒液所有鸡在14日观察期内均无任何不良反 应发生；感染CK/YN/SD024/21(H7N9)病毒死亡的所有鸡喉头和泄殖腔拭子病毒检测均呈阳 性，而感染H7-Re4株重组病毒的鸡在3日和5日拭子样品病毒检测均为阴性，表明H7-Re4 株重组病毒为对鸡无感染和致病能力(见表4)。
以上结果表明，H7-Re4株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
表4 H7-Re4株重组病毒的致病性和感染能力测定
Figure BDA0003311352280000081
*该组鸡在攻毒后3～4日内全部发病死亡，所有死亡鸡均排毒均计入攻毒后3日排毒结果；/该组鸡 在攻毒后5日无存活。
7.重组病毒H7-Re4的免疫原性实验
将HA滴度为8log2的重组病毒H7-Re4株以0.2％甲醛灭活后，以美国sornneborn品牌- 40(Lytol)白油为佐剂制备油乳剂灭活疫苗，以10只6周龄的SPF鸡为模型动物，0.3ml/只肌 肉注射免疫，同时设10只不免疫对照鸡。免疫后21日检测所有鸡血清中HI抗体滴度，同 时以100CLD50(CLD50为鸡半数致死量)的剂量攻击CK/YN/SD024/21(H7N9)强毒，攻毒 后观察14日，观察存活情况，并在攻毒后3日和5日采集喉头和泄殖腔式子，接种鸡胚检 测排毒情况。死亡鸡拭子样品随时采集。
结果显示，免疫21日时，免疫鸡血清中针对重组病毒H7-Re4株的HI抗体滴度在7.0log2～9.0log2之间，平均滴度为8.1log2，而对照鸡血清针对重组病毒H7-Re4株的HI抗体 滴度均＜2.0log2(HI＜2log2判定为HI抗体阴性)；免疫后21日以鼻腔感染途径攻击CK/YN/SD024/21(H7N9)强毒后14日内，所有免疫鸡健活，攻毒后3日和5日拭子样品病毒 检测均为阴性；而对照鸡在攻毒后5日内全部发病死亡，而且死亡鸡喉头和泄殖腔拭子样品病毒分离结果均为阳性(见表5)。
表5 H7-Re4株重组病毒制备疫苗免疫鸡后HI抗体和攻毒后存活及排毒情况
Figure BDA0003311352280000091
*该组鸡在攻毒后3～4日内全部发病死亡，所有死亡鸡均检测排毒，排毒结果计入攻毒后3日排毒结 果；/该组鸡在攻毒后5日无存活。
以上结果表明，人工重组H7N9流感病毒H7-Re4株具有良好的免疫原性，能够预防H7N9亚型禽流感。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 人工重组的H7N9流感病毒及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1683
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 1
atgaacactc aaatcctgat attcgcgctg attacgacca ttccgacaaa tgcagacaaa 60
atctgcctcg gacatcactc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaaa 120
ggagtggaag tcgtcaatgc aaccgaaaca gtggaacgaa caaacacccc caggatctgc 180
tcaaaaggga aaaagacagt tgacctcggt cgatgtggac tcctggggac aatcactgga 240
ccacctcaat gtgaccaatt cctaaaattt tcagccgatt taattgttga gaggcgggaa 300
ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctctgag gcaaattctc 360
agagaatcag gcggaattga caaggaatcc atgggattca aatacgatgg aataaggact 420
aatgggacaa ccagtgcatg tatgagatca agaccttcat tttatgcaga aatgaaatgg 480
ctcctgtcaa acacagataa tgctacattc ccgcagatga ccaagtcata taaaaataca 540
agggaaagcc cagctatagt agtatggggg atccatcatt ccgtttcaac tgcagagcaa 600
accaagctat atgggagtgg agacaaactg gtgacagttg agagttctaa ctatcaacaa 660
tctttcgtac cgagtccagg agtaagacca aaagttaatg gtcaatctgg aagaattgac 720
ttacattggc tagtactaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780
atagctccag atcgtgcaag cttcctgaga gggaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840
caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagtaac 900
ttgccatttc agaacataga tagcagggca gtcggaaaat gtccgagata tgttaggcaa 960
aggagtcttc tgctggcaac agggatgaag aatgttcctg aggttccaaa gggacgaggc 1020
ctatttggtg ctatagcggg gttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080
tatggtttca gacatcaaaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140
caatcggcaa tagatcaaat aacagggaaa ttaaaccgac ttatagccaa aaccaatcaa 1200
caatttgagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260
aattggacca gagactctat aacagaagta tggtcataca atgccgaatt cttggtggca 1320
atggagaacc aacatacaat tgatctggcg gattcagaaa tgaacaaatt gtatgaacga 1380
gtgaaaagac agttgagaga gaatgctgaa gaagacggca cgggttgctt tgaaatattt 1440
cacaagtgtg atgatgactg catggccagt attagaaata acacctatga tcacagaaaa 1500
tacagagaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc caatcaaact aagcagcggc 1560
tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620
gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtgaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680
taa 1683
<210> 2
<211> 1398
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 2
atgaatccaa accagaagat tctatgcact tcagccactg ctatcgcaat aggcgcaatc 60
acagtactca ttgggatagc aaacatagga ctgaacatag gactgcatct aaaatcgggc 120
tgcaattgct cacgctcaca acctgaaaca accaacacaa gccaaacaac aatatacaac 180
tattataatg aaacaaacat caccaatatc caaatgggag aaagaacaag caggaatttc 240
aataacttaa ctaaagggct ctgtactata aattcatggc acatatatgg gaaagacaac 300
gcagtaagaa ttggagaaag ctcggaagtt ttagtcacaa gagaacccta tgtttcatgc 360
gacccagatg aatgcaagtt ctatgctctc agccaaggaa caacaatcag agggaaacac 420
tcaaacggaa caatacacga taggtcccag tatcgtgccc tgataagctg gccactatca 480
tcaccgccca cagtgtacaa tagcagggtg gagtgcatcg ggtggtcaag tactagttgc 540
catgatggca aatccagaat gtcaatatgt atatcaggac caaacaacaa tgcatctgca 600
gtagtatggt acaacagaag gcctgttgca gaaattaaca catgggcccg aaacatacta 660
agaacacagg aatctgaatg tgtatgcaac aatggcgtat gcccagtagt tttcaccgat 720
gggcctgcca ctggacctgc agacacaaga atatactatt ttaaagaggg gaaaatattg 780
aagtgggagt ttctgactgg aactgctaag catgttgaag aatgctcatg ttacgggaaa 840
cgaacaggga ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt 900
cagatagacc cagtaacaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgtccttaca 960
gacagtcccc gaccgaatga cccaaacata ggtgagtgta atgaccctta tccaggtaat 1020
aataacaacg gggtcaaggg attctcatac ctggatggga ataacacttg gctagggaga 1080
acaataagca catcctcgag gtctgggtac gagatgttaa aagtgccaaa tgcattgaca 1140
gatgatagat caaagcccat ccaaggtcag acaattgtat taaacactga ctggagtggt 1200
tacagtgggt ctttcataga ctattgggct gaaggggact gctatcgagc gtgtttttat 1260
gtggagctaa tacgtgggaa acccaaggag gataaagtgt ggtggaccag caatagtata 1320
gtatcgatgt gttccagtac agaattcctg ggacaatgga actggcctga cggggctaaa 1380
atagagtact tcctctaa 1398
<210> 3
<211> 2280
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 3
atggaaagaa taaaagaact aagaaatcta atgtcgcagt ctcgcacccg cgagatactc 60
acaaaaacca ccgtggacca tatggccata atcaagaagt acacatcagg aagacaggag 120
aagaacccag cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagcagac 180
aagaggataa cggaaatgat tcctgagaga aatgagcaag gacaaacttt atggagtaaa 240
atgaatgatg ccggatcaga ccgagtgatg gtatcacctc tggctgtgac atggtggaat 300
aggaatggac caatgacaaa tacagttcat tatccaaaaa tctacaaaac ttattttgaa 360
agagtcgaaa ggctaaagca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420
atacgtcgga gagttgacat aaatcctggt catgcagatc tcagtgccaa ggaggcacag 480
gatgtaatca tggaagttgt tttccctaac gaagtgggag ccaggatact aacatcggaa 540
tcgcaactaa cgataaccaa agagaagaaa gaagaactcc aggattgcaa aatttctcct 600
ttgatggttg catacatgtt ggagagagaa ctggtccgca aaacgagatt cctcccagtg 660
gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttgcatt tgactcaagg aacatgctgg 720
gaacagatgt atactccagg aggggaagtg aagaatgatg atgttgatca aagcttgatt 780
attgctgcta ggaacatagt gagaagagct gcagtatcag cagacccact agcatcttta 840
ttggagatgt gccacagcac acagattggt ggaattagga tggtagacat ccttaagcag 900
aacccaacag aagagcaagc cgtggatata tgcaaggctg caatgggact gagaattagc 960
tcatccttca gttttggtgg attcacattt aagagaacaa gcggatcatc agtcaagaga 1020
gaggaagagg tgcttacggg caatcttcaa acattgaaga taagagtgca tgagggatct 1080
gaagagttca caatggttgg gagaagagca acagccatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140
ttgattcagc tgatagtgag tgggagagac gaacagtcga ttgccgaagc aataattgtg 1200
gccatggtat tttcacaaga ggattgtatg ataaaagcag ttagaggtga tctgaatttc 1260
gtcaataggg cgaatcagcg actgaatcct atgcatcaac ttttaagaca ttttcagaag 1320
gatgcgaaag tgctttttca aaattgggga gttgaaccta tcgacaatgt gatgggaatg 1380
attgggatat tgcccgacat gactccaagc atcgagatgt caatgagagg agtgagaatc 1440
agcaaaatgg gtgtagatga gtactccagc acggagaggg tagtggtgag cattgaccgg 1500
ttcttgagag tcagggacca acgaggaaat gtactactgt ctcccgagga ggtcagtgaa 1560
acacagggaa cagagaaact gacaataact tactcatcgt caatgatgtg ggagattaat 1620
ggtcctgaat cagtgttggt caatacctat caatggatca tcagaaactg ggaaactgtt 1680
aaaattcagt ggtcccagaa ccctacaatg ctatacaata aaatggaatt tgaaccattt 1740
cagtctttag tacctaaggc cattagaggc caatacagtg ggtttgtaag aactctgttc 1800
caacaaatga gggatgtgct tgggacattt gataccgcac agataataaa acttcttccc 1860
ttcgcagccg ctccaccaga gcaaagtaga atgcagttct cctcatttac tgtgaatgtg 1920
aggggatcag gaatgagaat acttgtaagg ggcaattctc ctgtattcaa ctacaacaag 1980
gccacgaaga gactcacagt tctcggaaag gatgctggca ctttaaccga agacccagat 2040
gaaggcacag ctggagtgga gtccgctgtt ctgaggggat tcctcattct gggcaaagaa 2100
gacaggagat atgggccagc attaagcatc aatgaactga gcaaccttgc gaaaggagag 2160
aaggctaatg tgctaattgg gcaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg aaaacgggac 2220
tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattag 2280
<210> 4
<211> 2274
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 4
atggatgtca atccgacctt acttttctta aaagtgccag cacaaaatgc tataagcaca 60
actttccctt ataccggaga ccctccttac agccatggga caggaacagg atacaccatg 120
gatactgtca acaggacaca tcagtactca gaaaagggaa gatggacaac aaacaccgaa 180
actggagcac cgcaactcaa cccgattgat gggccactgc cagaagacaa tgaaccaagt 240
ggttatgccc aaacagattg tgtattggaa gcaatggctt tccttgagga atcccatcct 300
ggtatttttg aaaactcgtg tattgaaacg atggaggttg ttcagcaaac acgagtagac 360
aagctgacac aaggccgaca gacctatgac tggactttaa atagaaacca gcctgctgca 420
acagcattgg ccaacacaat agaagtgttc agatcaaatg gcctcacggc caatgagtca 480
ggaaggctca tagacttcct taaggatgta atggagtcaa tgaaaaaaga agaaatgggg 540
atcacaactc attttcagag aaagagacgg gtgagagaca atatgactaa gaaaatgata 600
acacagagaa caataggtaa aaggaaacag agattgaaca aaaggggtta tctaattaga 660
gcattgaccc tgaacacaat gaccaaagat gctgagagag ggaagctaaa acggagagca 720
attgcaaccc cagggatgca aataaggggg tttgtatact ttgttgagac actggcaagg 780
agtatatgtg agaaacttga acaatcaggg ttgccagttg gaggcaatga gaagaaagca 840
aagttggcaa atgttgtaag gaagatgatg accaattctc aggacaccga actttctttc 900
accatcactg gagataacac caaatggaac gaaaatcaga atcctcggat gtttttggcc 960
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ccaataatgt tctcaaacaa aatggcgaga ctgggaaaag ggtatatgtt tgagagcaag 1080
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gtctccatcc tgaatcttgg acaaaagaga tacaccaaga ctacttactg gtgggatggt 1320
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<210> 5
<211> 2151
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 5
atggaagatt ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgattg tcgagcttgc ggaaaaaaca 60
atgaaagagt atggggagga cctgaaaatc gaaacaaaca aatttgcagc aatatgcact 120
cacttggaag tatgcttcat gtattcagat ttccacttca tcaatgagca aggcgagtca 180
ataatcgtag aacttggtga tcctaatgca cttttgaagc acagatttga aataatcgag 240
ggaagagatc gcacaatggc ctggacagta gtaaacagta tttgcaacac tacaggggct 300
gagaaaccaa agtttctacc agatttgtat gattacaagg aaaatagatt catcgaaatt 360
ggagtaacaa ggagagaagt tcacatatac tatctggaaa aggccaataa aattaaatct 420
gagaaaacac acatccacat tttctcgttc actggggaag aaatggccac aagggccgac 480
tacactctcg atgaagaaag cagggctagg atcaaaacca ggctattcac cataagacaa 540
gaaatggcca gcagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg agaagagaca 600
attgaagaaa ggtttgaaat cacaggaaca atgcgcaagc ttgccgacca aagtctcccg 660
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tacattgagg gcaagctgtc tcaaatgtcc aaagaagtaa atgctagaat tgaacctttt 780
ttgaaaacaa caccacgacc acttagactt ccgaatgggc ctccctgttc tcagcggtcc 840
aaattcctgc tgatggatgc cttaaaatta agcattgagg acccaagtca tgaaggagag 900
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aggtcgcttg caagttggat tcagaatgag ttcaacaagg catgcgaact gacagattca 1260
agctggatag agcttgatga gattggagaa gatgtggctc caattgaaca cattgcaagc 1320
atgagaagga attatttcac atcagaggtg tctcactgca gagccacaga atacataatg 1380
aagggggtgt acatcaatac tgccttactt aatgcatctt gtgcagcaat ggatgatttc 1440
caattaattc caatgataag caagtgtaga actaaggagg gaaggcgaaa gaccaacttg 1500
tatggtttca tcataaaagg aagatcccac ttaaggaatg acaccgacgt ggtaaacttt 1560
gtgagcatgg agttttctct cactgaccca agacttgaac cacacaaatg ggagaagtac 1620
tgtgttcttg agataggaga tatgcttcta agaagtgcca taggccaggt ttcaaggccc 1680
atgttcttgt atgtgaggac aaatggaacc tcaaaaatta aaatgaaatg gggaatggag 1740
atgaggcgtt gtctcctcca gtcacttcaa caaattgaga gtatgattga agctgagtcc 1800
tctgtcaaag agaaagacat gaccaaagag ttctttgaga acaaatcaga aacatggccc 1860
attggagagt ctcccaaagg agtggaggaa agttccattg ggaaggtctg caggacttta 1920
ttagcaaagt cggtatttaa cagcttgtat gcatctccac aactagaagg attttcagct 1980
gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaatctgga acctgggacc 2040
tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc taattaatga tccctgggtt 2100
ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc cttacacatg cattgagtta g 2151
<210> 6
<211> 2994
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 6
atggcgtccc aaggcaccaa acggtcttac gaacagatgg agactgatgg agaacgccag 60
aatgccactg aaatcagagc atccgtcgga aaaatgattg gtggaattgg acgattctac 120
atccaaatgt gcacagaact taaactcagt gattatgagg gacggttgat ccaaaacagc 180
ttaacaatag agagaatggt gctctctgct tttgacgaaa ggagaaataa atacctggaa 240
gaacatccca gtgcggggaa agatcctaag aaaactggag gacctatata cagaagagta 300
aacggaaagt ggatgagaga actcatcctt tatgacaaag aagaaataag gcgaatctgg 360
cgccaagcta ataatggtga cgatgcaacg gctggtctga ctcacatgat gatctggcat 420
tccaatttga atgatgcaac ttatcagagg acaagggctc ttgttcgcac cggaatggat 480
cccaggatgt gctctctgat gcaaggttca actctcccta ggaggtctgg agccgcaggt 540
gctgcagtca aaggagttgg aacaatggtg atggaattgg tcaggatgat caaacgtggg 600
atcaatgatc ggaacttctg gaggggtgag aatggacgaa aaacaagaat tgcttatgaa 660
agaatgtgca acattctcaa agggaaattt caaactgctg cacaaaaagc aatgatggat 720
caagtgagag agagccggaa cccagggaat gctgagttcg aagatctcac ttttctagca 780
cggtctgcac tcatattgag agggtcggtt gctcacaagt cctgcctgcc tgcctgtgtg 840
tatggacctg ccgtagccag tgggtacgac tttgaaagag agggatactc tctagtcgga 900
atagaccctt tcagactgct tcaaaacagc caagtgtaca gcctaatcag accaaatgag 960
aatccagcac acaagagtca actggtgtgg atggcatgcc attctgccgc atttgaagat 1020
ctaagagtat tgagcttcat caaagggacg aaggtggtcc caagagggaa gctttccact 1080
agaggagttc aaattgcttc caatgaaaat atggagacta tggaatcaag tacacttgaa 1140
ctgagaagca ggtactgggc cataaggacc agaagtggag gaaacaccaa tcaacagagg 1200
gcatctgcgg gccaaatcag catacaacct acgttctcag tacagagaaa tctccctttt 1260
gacagaacaa ccgttatggc agcattcact gggaatacag aggggagaac atctgacatg 1320
aggaccgaaa tcataaggat gatggaaagt gcaagaccag aagatgtgtc tttccagggg 1380
cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcagcgagcc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440
atgagtaatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtacga caattaaatg 1500
gcgtcccaag gcaccaaacg gtcttacgaa cagatggaga ctgatggaga acgccagaat 1560
gccactgaaa tcagagcatc cgtcggaaaa atgattggtg gaattggacg attctacatc 1620
caaatgtgca cagaacttaa actcagtgat tatgagggac ggttgatcca aaacagctta 1680
acaatagaga gaatggtgct ctctgctttt gacgaaagga gaaataaata cctggaagaa 1740
catcccagtg cggggaaaga tcctaagaaa actggaggac ctatatacag aagagtaaac 1800
ggaaagtgga tgagagaact catcctttat gacaaagaag aaataaggcg aatctggcgc 1860
caagctaata atggtgacga tgcaacggct ggtctgactc acatgatgat ctggcattcc 1920
aatttgaatg atgcaactta tcagaggaca agggctcttg ttcgcaccgg aatggatccc 1980
aggatgtgct ctctgatgca aggttcaact ctccctagga ggtctggagc cgcaggtgct 2040
gcagtcaaag gagttggaac aatggtgatg gaattggtca ggatgatcaa acgtgggatc 2100
aatgatcgga acttctggag gggtgagaat ggacgaaaaa caagaattgc ttatgaaaga 2160
atgtgcaaca ttctcaaagg gaaatttcaa actgctgcac aaaaagcaat gatggatcaa 2220
gtgagagaga gccggaaccc agggaatgct gagttcgaag atctcacttt tctagcacgg 2280
tctgcactca tattgagagg gtcggttgct cacaagtcct gcctgcctgc ctgtgtgtat 2340
ggacctgccg tagccagtgg gtacgacttt gaaagagagg gatactctct agtcggaata 2400
gaccctttca gactgcttca aaacagccaa gtgtacagcc taatcagacc aaatgagaat 2460
ccagcacaca agagtcaact ggtgtggatg gcatgccatt ctgccgcatt tgaagatcta 2520
agagtattga gcttcatcaa agggacgaag gtggtcccaa gagggaagct ttccactaga 2580
ggagttcaaa ttgcttccaa tgaaaatatg gagactatgg aatcaagtac acttgaactg 2640
agaagcaggt actgggccat aaggaccaga agtggaggaa acaccaatca acagagggca 2700
tctgcgggcc aaatcagcat acaacctacg ttctcagtac agagaaatct cccttttgac 2760
agaacaaccg ttatggcagc attcactggg aatacagagg ggagaacatc tgacatgagg 2820
accgaaatca taaggatgat ggaaagtgca agaccagaag atgtgtcttt ccaggggcgg 2880
ggagtcttcg agctctcgga cgaaaaggca gcgagcccga tcgtgccttc ctttgacatg 2940
agtaatgaag gatcttattt cttcggagac aatgcagagg agtacgacaa ttaa 2994
<210> 7
<211> 982
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 7
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctagg caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcgcta ttgccgcaaa 780
tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840
ttaccgtcgc tttaaatacg gactgaaagg agggccttct acggaaggag tgccaaagtc 900
tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gagtgctgtg gatgctgacg atggtcattt 960
tgtcagcata gagctggagt aa 982
<210> 8
<211> 838
<212> DNA
<213> Influenza virus
<400> 8
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60
cgagttgtag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120
aaatccctaa gaggaagggg cagcactctt ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct 180
ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc 240
atggcctctg tacctgcgtc gcgttaccta accgacatga ctcttgagga aatgtcaagg 300
gaatggtcca tgctcatacc caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac 360
caggcgatca tggataaaaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420
ctggagactc taatattgct aagggctttc accgaagagg gagcaattgt tggcgaaatt 480
tcaccattgc cttctcttcc aggacatact gctgaggatg tcaaaaatgc agttggagtc 540
ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600
ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacga 660
gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tgaagaaata agatggttga ttgaagaagt 720
gagacacaaa ctgaaggtaa cagagaatag ttttgagcaa ataacattta tgcaagcctt 780
acatctattg cttgaagtgg agcaagagat aagaactttc tcatttcagc ttatttaa 838
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaacactc aaatcctgat attcg 25
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcaccaaata ggcctcgtcc ctttggaacc tcaggaacat tctt 44
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggacgaggcc tatttggtgc tatagcgg 28
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttatatacaa atagtgcacc gcatg 25

Claims (6)

1.人工重组的H7N9流感病毒毒株H7-Re4，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：V202161，保藏时间为2021年8月3日。
2.权利要求1所述的毒株H7-Re4在制备预防H7N9流感病毒所导致疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述H7N9流感病毒为A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)毒株。
4.一种疫苗，含有权利要求1所述的毒株H7-Re4。
5.权利要求1所述的毒株H7-Re4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计HA基因特异性扩增和突变引物，利用RT-PCR方法，扩增出高致病性性H7N9亚型禽流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)株HA基因的HA1和HA2片段，在扩增HA1片段的同时将HA基因裂解位点氨基酸由-PKRKRIAR-突变为-PKGR-，使其由高致病性禽流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征；再利用重叠延伸反应，扩增出裂解位点为典型低致病性禽流感病毒分子特征的HA片段，插入pBD质粒，构建重组HA基因双向转录载体；
(2)RT-PCR扩增H7N9亚型流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)的NA基因全长，插入pBD质粒，构建重组NA基因双向转录载体；
(3)将(1)、(2)所述构建的HA、NA基因2个重组pBD双向转录载体质粒和含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的6个pBD双向转录载体质粒混合，并与转染试剂一起接种293T细胞，将培养后细胞及上清接种鸡胚，获得具有HA活性的H7N9禽流感重组病毒株H7-Re4。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，扩增HA1基因的引物对如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，其中SEQ ID No.10为HA裂解位点的突变引物；扩增HA2基因的引物对如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
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