CN113913394B - 人工重组的h5n6流感病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工重组的H5N6流感病毒及制备方法和应用。本发明的一种人工重组的H5N6流感病毒具有高致病性禽流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因，但HA裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(‑RETR‑)，具有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个内部基因，株号为H5‑Re13，保藏号为CCTCC NO：V202159。具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高10倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。

Description

人工重组的H5N6流感病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及反向遗传学技术和动物传染病技术领域，具体涉及一种人工重组并致弱的 H5N6亚型重组流感病毒及其制备方法和应用。
背景技术
高致病性禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的烈性呼吸道疾病，被世界动物卫生组织(OIE)定为A类传染病，AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类生命安全，AI防控成了目前人兽共患传染病研究的焦点。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)为分节段的负链RNA病毒，含有8个基因片段，容易发生基因突变和重组，产生新型病毒。根据病毒的表面蛋白，AIV被分为16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。我国家禽中已监测到多种 H5Nx亚型禽流感病毒，如H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H5N9等。
自2014年以来，高致病性H5N6亚型病毒逐渐取代我国早期的H5N1亚型病毒，成为我国家禽中传播和流行的优势毒株。我国采用疫苗免疫和扑杀相结合的综合措施应用于H5亚型高致病性AI的防控，家禽中未出现大规模的疫情。近期病原学监测发现，家禽中分离到的H5N6病毒发生抗原性变异，导致现有H5亚型禽流感疫苗无法提供完全有效保护，给家禽养殖业带来严重威胁；同时2021年上半年我国南方多个省份发生人感染H5N6病毒的病例，引起人们对其导致更大公共卫生危害的担忧。为有效控制我国家禽H5N6亚型禽流感病毒，避免其可能产生更大范围的公共卫生危害，本发明进行了人工重组的H5N6禽流感疫苗株的研制。
理想的流感病毒疫苗株应具备与流行株良好的抗原匹配性，对鸡胚无致病力及鸡胚高滴度生长性等条件。然而，很难从自然界分离具备上述条件的病毒作为疫苗株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种人工重组的H5N6流感病毒及其制备方法和应用。
本发明的技术方案为：重组的H5N6禽流感病毒，以高致病性H5N6亚型禽流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体，但HA裂解位点具有典型低致病性禽流感病毒分子特征(-RETR-)；以流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)为PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个内部基因的供体，通过反向遗传操作方法，人工重组得到了1株重组的H5N6禽流感病毒，命名为A型流感病毒 A/Harbin/H5-Re13/2021(H5N6)(简称为H5-Re13株)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：V202159，保藏时间为2021年8月3 日。
本发明选用流感病毒的可在鸡胚内生长至很高滴度的实验室鸡胚适应株A/PR/8/34 (H1N1)的6个内部基因作为骨架基因，并选用2020年分离得到的高致病性禽流感病毒株A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)的HA和NA基因作为表面基因，利用反向遗传学人工构建方法，制备了致弱的重组病毒H5-Re13株，该重组毒株将可作为H5N6流感的疫苗株。
实验证实，H5-Re13株病毒与我国H5N6禽流感病毒流行株A/duck/Fujian/S1424/2020 (H5N6)抗原性一致，制备疫苗免疫鸡后将对H5N6流感病毒流行株 A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)的攻击产生良好的特异保护效果。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因，因此具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高10倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
进一步地，本发明还提出了所述的重组的H5N6禽流感病毒(H5-Re13株)在制备预防 H5N6流感病毒所导致疾病的药物中的应用。
进一步地，所述H5N6流感病毒为A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)毒株。
更进一步地，本发明还提出了一种构建所述的重组H5N6禽流感病毒的方法，该方法包括：
(1)使用HA基因特异性扩增和突变引物，利用RT-PCR方法，扩增出高致病性H5N6亚型禽流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)的HA1和HA2基因片段，在扩增HA1片段的同时将HA基因裂解位点氨基酸由-RERRRKR-突变为-RETR-，使其由高致病性禽流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征；再利用重叠延伸反应，扩增出裂解位点为典型低致病性流感病毒分子特征的HA片段，插入pBD质粒，构建重组HA基因双向转录载体；
(2)利用RT-PCR方法，扩增出H5N6亚型禽流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6) 的NA基因全基因片段，插入pBD质粒，构建重组NA基因双向转录载体；
(3)将(1)、(2)所述构建的HA、NA基因2个重组pBD双向转录载体质粒和含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的6个pBD 双向转录载体质粒混合，并与转染试剂一起接种293T细胞，将培养后收获的细胞及上清接种鸡胚，获得具有HA活性的H5N6禽流感rH5N6-2/6重组病毒株。得到的重组病毒HA和 NA来自于高致病性H5N6流感病毒国内分离株A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)，但HA裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(-RETR-)，6个内部基因PB2、PB1、PA、 NP、M及NS来自流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)。
进一步地，扩增HA1基因的引物对如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，其中SEQID No.10为HA裂解位点的突变引物；扩增HA2基因的引物对如SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、H5-Re13与我国H5N6禽流感病毒流行株A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)抗原性一致，制备疫苗免疫鸡后将对H5N6流感病毒流行株A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)的攻击产生良好的特异保护效果。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因，因此具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高10倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
2、通过对HA基因裂解位点人工修饰，H5-Re13株病毒具有典型低致病性流感病毒的分子特征，H5-Re13株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
附图说明
图1为RT-PCR扩增基因的凝胶电泳图，图中A为以A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6) 毒株cDNA为模板，RT-PCR扩增的HA1、HA2、HA和NA基因片段，分别为第1～4泳道，M为DNA Marker 2000；B为以重组H5N6病毒的cDNA为模板，RT-PCR扩增的重组病毒8个基因片段，第1至第8泳道分别为HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因片段，M为DNA Marker 2000。
图2为H5-Re13病毒HA基因裂解位点区域突变前后序列。
图3为重组H5-Re13病毒和野生型H5N6流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)的生长曲线。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实验材料
1.病毒株
A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)(简称DK/FJ/S1424/20)为2020年在我国福建活禽市场鸭中分离得到，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室分离、鉴定和保存，该毒株记载文献：“现用重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗对近期H5和H7病毒抗原变异株的免疫效力研究”，刘艳晶等，《中国预防兽医学报》，2021年9月知网在线发表。申请人保证从申请日起二十年内可开放提供该生物材料。
2.SPF鸡胚及细胞
SPF鸡胚和SPF鸡，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源库，293T细胞(人胚肾细胞，SCSP-502)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
3.质粒载体
pBD载体(Zejun Li,Hualan Chen,Peirong Jiao,Guohua Deng,Guobin Tian,Yanbing Li, Erich Hoffmann,Robert G.Webster,Yumiko Matsuoka,and KangzhenYu.Molecular Basis of Replication of Duck H5N1 Influenza Viruses in aMammalian Mouse Model.J.Virol.2005, 79:12058-12064)由陈化兰研究员构建，将单向转录质粒载体pPolIsapIRib中包含聚合酶I 启动子-SapI克隆位点-鼠源核酶序列的XbaI酶切片段，反向插入pCI(Promega)质粒的 XbaI位点，形成RNA聚合酶II启动子(CMV)→病毒RNA转录终止信号序列Rib→流感病毒基因组cDNA(5’→3’)→人RNA聚合酶I启动子→mRNA转录终止PolyA信号序列 (SV40)构成的双向转录表达质粒载体，利用该载体可同时转录出流感病毒负链vRNA和正链 mRNA。插入A/PR/8/34(H1N1)毒株PB2，PB1，PA，NP，M和NS等6个内部基因的 pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M和pBD-NS载体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定和保存(Guobin Tian,Suhua Zhang,YanbingLi, Zhigao Bu,Peihong Liu,Jiyong Zhou,Chengjun Li,Jianzhong Shi,Kangzhen Yu,Hualan Chen. Protective efficacy in chickens,geese and ducks of an H5N1inactivated vaccine developed by reverse genetics.Virology,2005,341:153-162)。
4.主要试剂
病毒RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒(ReverTraAce RT Kit)购自日本Toyobo公司；Ex-taq酶购自Takara公司；PCR产物纯化试剂盒(CYCLE-PURE-KIT)购自Omega公司；胶回收试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)购自 Promega公司；测序试剂盒(ABI BigDye Terminator v3.1)购自美国Thermo Fisher公司；质粒提取试剂盒(QIAGEN Plasmid Midi Kit)购自QIAGEN公司。
5.引物
分析比较，设计合成H5N6流感分离株DK/FJ/S1424/20(H5N6)HA1、HA2和NA基因的特异性引物，合成引物序列见表1。
表1 H5N6禽流感病毒DK/FJ/S1424/20(H5N6)的HA和NA基因特异性引物序列
Figure BDA0003310876740000051
分析比较，设计合成A/PR/8/34(H1N1)的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的特异性引物，合成引物序列见表2。
表2 流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因片段的特异性引物序列
Figure BDA0003310876740000052
实施例1：重组H5N6流感病毒H5-Re13的制备与鉴定
1.重组病毒2个表面基因(HA和NA)的构建和鉴定：
提取H5N6亚型高致病性禽流感分离株DK/FJ/S1424/20(H5N6)的RNA，并将其反转录为cDNA，使用HA基因的HA1片段特异性引物(HA1-U：atg gag aaa ata gta ctt ctt cttt； HA1-L：gct cca aac agt cct cta gtt tcc ctt aga gga cta ttt ctg agc，其中HA1-L为突变HA裂解位点为低致病性病毒分子特征的引物)和HA2片段特异性引物(HA2-U：actaga gga ctg ttt gga gct ata gca gga t；HA2-L：tta aat gca aat tct gca ttg taac)，利用RT-PCR方法，分别扩增出HA 基因的HA1和HA2片段(图1中A)，并在扩增HA1基因片段的同时对HA裂解位点进行致弱突变修饰；然后以HA1、HA2为模板，HA1-U/HA2-L为引物，用phusion高保真聚合酶进行重叠延伸反应(SOE-PCR)，扩增出裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(- RETR-)的HA片段(图1中A)。并将其克隆于pBD载体中，构建成pBD-HA重组质粒。
HA基因裂解位点的突变引物(HA1-L)根据HA基因多个连续碱性氨基酸位点的特异性序列设计，扩增后的HA基因裂解位点由-RERRRKR-突变为-RETR-，使其由高致病性禽流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征(图2)。
再利用RT-PCR方法，扩增上述高致病性H5N6毒株的NA基因全长(图1中A)，按上述方法插入pBD载体中，构建成pBD-NA重组质粒。
2.重组病毒的拯救：
利用脂质体转染法，将上述HA、NA基因2个重组质粒和含有A/PR/8/34(H1N1)病毒内部基因的pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS等6个重组质粒同时导入单层的293T细胞，48小时后收获细胞及上清，接种9～11日龄鸡胚尿囊腔，48小时后收获尿囊液并检测血凝(HA)活性。HA阳性样品即为救获的H5N6亚型低致病性重组病毒，将获得的重组病毒命名为A/Harbin/H5-Re13/2021(H5N6)，株号为H5-Re13，保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：V202159。
3.重组病毒的序列鉴定
提取重组病毒H5-Re13的RNA，利用RT-PCR方法，分别扩增出重组病毒H5-Re13全基因组的8个片段，对PCR产物进行核酸凝胶电泳(图1中B)，胶回收后测定每一片段的特定序列。
H5-Re13株HA基因序列如SEQ ID No.1所示，H5-Re13株NA基因序列如SEQ ID No.2所示，H5-Re13株PB2基因序列如SEQ ID No.3所示，H5-Re13株PB1基因序列如 SEQ ID No.4所示，H5-Re13株PA基因序列如SEQ ID No.5所示，H5-Re13株NP基因序列如SEQ ID No.6所示，H5-Re13株M基因序列如SEQ ID No.7所示，H5-Re13株NS基因序列如SEQ ID No.8所示。
利用DNAStar软件(DNAStar Lasergene V7.1)，对测定的序列与野生毒株H5N6流感病毒国内分离株DK/FJ/S1424/20(H5N6)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的序列进行序列比较，发现重组病毒H5-Re13的HA和NA来自于高致病性H5N6流感病毒国内分离株 DK/FJ/S1424/20(H5N6)，但HA裂解位点呈典型低致病性流感病毒分子特征(-RETR-)；6 个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自于鸡胚高度适应性的流感病毒 A/PR/8/34(H1N1)。
4.重组病毒H5-Re13生长曲线的测定
禽流感疫苗常用鸡胚生产，要求疫苗株在接种的鸡胚中具有良好的生长特性。本研究进行H5-Re13株病毒在鸡胚中的生长特性研究。将亲本病毒H5N6流感病毒流行株 DK/FJ/S1424/20(H5N6)和重组病毒H5-Re13接种2组SPF鸡胚各20枚，在最适36℃条件下分别培养24、48、72和96小时，分别取上述培养不同时间的各5枚鸡胚进行血凝测定，检测亲本毒株DK/FJ/S1424/20(H5N6)和重组病毒H5-Re13的生长曲线。
从试验结果可以看出重组病毒在36℃培养条件下，重组病毒的血凝效价远高于野生毒株H5N6流感病毒国内分离株A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)，72h时平均血凝效价最高 (9log2，即1:512)，较野生病毒的平均最高血凝价(5.6log2，即1:48.5)高出10.6倍(图 3)。这说明本发明制备出了一株高生长滴度的重组病毒，将为以后的疫苗批量生产带来巨大的经济利益。
5.重组病毒H5-Re13的抗原性分析
抗原性是病毒是否可以作为疫苗株的关键指标。本研究将亲本H5N6流感病毒国内分离株DK/FJ/S1424/20(H5N6)与人工重组的H5N6流感病毒灭活后制备油乳剂灭活疫苗，免疫 SPF鸡制备抗血清，使用HI试验进行抗原性分析，HI试验方法参考高致病性禽流感诊断技术国家标准(GB)(GB/T118936-2020))。HI试验结果显示，亲本H5N6流感病毒国内分离株DK/FJ/S1424/20(H5N6)与人工重组的H5N6流感病毒与对应血清之间的交叉HI滴度无差异，表明H5N6病毒重组为鸡胚适应性的H5-Re13株后，病毒依然保持着亲本毒株的抗原性 (见表3)。
表3：亲本毒株DK/FJ/S1424/20(H5N6)与重组病毒H5-Re13株的抗原性分析
Figure BDA0003310876740000071
6.重组病毒H5-Re13株对鸡胚和鸡的致病力试验
疫苗毒株的低致病性是具有生物安全性的前提条件。9～11日龄SPF鸡胚和4～8周龄 SFP鸡经常作为禽流感病毒致病性评估模型。
为了解重组毒株的致病性，本发明首先使用SPF鸡胚进行病毒致病性的评估。9日龄的 SPF鸡胚(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源库)20枚，随机分为 2组，每组10枚，第一组通过尿囊腔接种10-4倍稀释的重组H5-Re13株病毒液，第二组通过尿囊腔接种10-4倍稀释的亲本毒株DK/FJ/S1424/20(H5N6)的病毒液。接种后72小时内观察和记录鸡胚死亡情况。
本发明同时使用SPF鸡进行病毒致病性和感染能力的评估。6周龄的SPF鸡20只，随机分为2组，每组10只，将重组毒株H5-Re13和亲本毒株DK/FJ/S1424/20(H5N6)尿囊液分别稀释10倍后，静脉途径接种6周龄SPF鸡，接种后每日观察发病死亡情况，连续观察10 日，计算鸡静脉内接种致病指数(IVPI)。若IVPI大于1.2，则表明该毒株为高致病性毒株；若IVPI小于1.2，HA裂解位点为高致病性禽流感病毒分子特征，则为高致病性禽流感毒株；若IVPI小于1.2，HA裂解位点为低致病性流感病毒分子特征，则为低致病性禽流感毒株。
6周龄的SPF鸡20只，随机分为2组，每组10只，将重组毒株H5-Re13和亲本毒株 DK/FJ/S1424/20(H5N6)尿囊液分别稀释至106EID50/ml后，分别鼻腔途径接种6周龄SPF鸡各10只，0.1ml/只。接种后每日观察发病死亡情况，连续观察14日，同时采集喉头和泄殖腔拭子进行病毒滴定，评估病毒对鸡的感染能力。
所有的试验鸡均在拥有独立通风系统的负压隔离器里饲养，所有涉及H5N6高致病性病毒的试验均在生物安全三级实验室内进行。
SPF鸡胚致病试验结果显示，接种亲本毒株DK/FJ/S1424/20(H5N6)病毒液的鸡胚在接种后26～30小时内全部发病死亡，接种重组毒株H5-Re13株病毒液的所有鸡胚在接种后72 小时内均全部存活，表明H5-Re13株重组病毒对鸡胚无致病性。
SPF鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定试验结果显示，接种亲本毒株 DK/FJ/S1424/20(H5N6)病毒液的鸡在接种后1日内全部发病死亡，其IVPI为3.0；接种重组毒株H5-Re13株病毒液的所有鸡10日内均无任何不良反应发生，构建的H5-Re13株重组病毒IVPI为0(见表4)。表明H5-Re13株重组病毒为低致病性毒株，对鸡无致病性。
SPF鸡鼻腔感染试验结果显示，鼻腔接种亲本毒株DK/FJ/S1424/20(H5N6)病毒液的所有鸡在接种后2～3日内全部发病死亡；而鼻腔接种重组毒株H5-Re13株病毒液的所有鸡在14 日观察期内均无任何不良反应发生；感染DK/FJ/S1424/20(H5N6)病毒死亡的所有鸡喉头和泄殖腔拭子病毒检测均呈阳性，而感染H5-Re13株重组病毒的鸡在3日和5日拭子样品病毒检测均为阴性，表明H5-Re13株重组病毒为对鸡无感染和致病能力(见表4)。
以上结果表明，H5-Re13株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
表4 H5-Re13株重组病毒的致病性和感染能力测定
Figure BDA0003310876740000081
*该组鸡在攻毒后2～3日内全部发病死亡，所有死亡鸡均排毒均计入攻毒后3日排毒结果；/该组鸡在攻毒后5日无存活。
7.重组病毒H5-Re13株的免疫原性评估
将HA价为8log2的重组病毒H5-Re13株以0.2％甲醛灭活后，以美国sornneborn品牌- 40(Lytol)白油为佐剂制备油乳剂灭活疫苗，以10只3周龄的SPF鸡为模型动物，0.3ml/只肌肉注射免疫，同时设10只不免疫对照鸡。免疫后21日检测所有鸡血清中HI抗体滴度，同时以100CLD50(CLD50为鸡半数致死量)的剂量攻击DK/FJ/S1424/20(H5N6)强毒，攻毒后观察14日，观察存活情况，并在攻毒后3日和5日采集喉头和泄殖腔拭子，接种鸡胚检测排毒情况。死亡鸡拭子样品随时采集。
结果显示，免疫21日时免疫鸡血清中针对重组病毒H5-Re13株的HI抗体滴度在7.0log2～10.0log2之间，平均滴度为8.1log2，而对照鸡血清针对重组病毒H5-Re13株的HI抗体滴度均＜2.0log2(HI＜2log2判定为HI抗体阴性)；免疫后21日以鼻腔感染途径攻击DK/FJ/S1424/20(H5N6)强毒后14日内，所有免疫鸡健活，攻毒后3日和5日拭子样品病毒检测均为阴性；而对照鸡在攻毒后2～4日全部发病死亡，而且死亡鸡喉头和泄殖腔拭子样品病毒分离结果均为阳性(见表5)。
表5 H5-Re13株重组病毒制备疫苗免疫鸡后HI抗体和攻毒后存活及排毒情况
Figure BDA0003310876740000091
*该组鸡在攻毒后2～4日全部发病死亡，所有死亡鸡均检测排毒，排毒结果计入攻毒后3日排毒结果；/该组鸡在攻毒后5日无存活鸡。
以上结果表明，人工重组H5N6流感病毒H5-Re13株具有良好的免疫原性，能够预防H5N6亚型禽流感。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 人工重组的H5N6流感病毒及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1692
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagaaaa tagtacttct tctttcagtg gttggccttg ttaaaagtga tcagatctgc 60
attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaaaaacgtc 120
actgttacgc atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatctg 180
aatggagtga aacctctgat tttaaagaat tgtagtgtgg ctggatggct tcttggaaac 240
ccaatgtgcg atgagttcat cagcgtaccg gaatggtctt atatagtgga gagggccaac 300
ccagccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacaccta 360
ttgagcagaa taaatcattt tgagaagact cagatcatcc ccaaggagtc ttggtccaat 420
catacaacat caggagtgag cgcagcatgt ccataccaag gagtggcctc cttttttaga 480
aatgtggtat ggcttaccaa gaagaatgaa acatacccga caataaagaa gagctacaat 540
aataccaata aagaggacct tttgatacta tggggaattc atcattccaa cagtgtagag 600
gagcagacag atctctacaa gaacccaacc acctatgttt ccgttgggac atcaacacta 660
aatcagaggt tggtgccaaa aatagctacc agatcccaag taaatgggca acgtggaaga 720
atggatttct tctggacaat tttaagaccg aatgatgcaa tccacttcgg gagtaatgga 780
aattttatcg ctcctgaata tgcatacaaa atcatcaaga caggagactc aacaattatg 840
aaaagtgaaa tagaatatgg cgactgcaac agcaagtgtc aaactccgat aggggcgata 900
aactctagta tgccattcca caatatacac cctctcacta tcggggagtg ccccaaatat 960
gtgaaatcaa acaaattagt ccttgcgact gggctcagaa atagtcctct aagggaaact 1020
agaggactgt ttggagctat agcaggattt atagagggag gatggcaagg aatggtagat 1080
ggttggtatg ggtaccatca tagtaatgaa caggggagtg ggtacgctgc agacagagaa 1140
tccactcaaa aggcaataga tggggtcacc aacaaggtca actcgataat agacaaaatg 1200
aacactcaat ttgaggccgt tggaagagaa tttaacagct tagaacggag aatagagaat 1260
ttaaataaga aaatggaaga cggattccta gatgtctgga cttataatgc tgaactttta 1320
gttctcatgg aaaatgagag aactctagat ttccatgact caaatgtcaa gaacctttat 1380
gacaaagtcc gactacagct tagggataat gcaaaggagc tgggtaatgg ttgtttcgaa 1440
ttctatcaca aatgtgataa tgaatgtatg gaaagtgtaa gaaatggaac gtatgactac 1500
ccccagtact cagaggaggc aagattaaaa agggaagaaa taagcggagt gagattggaa 1560
acaataggaa ctttccaaat actgtcaatt tattcaacag tggcgagctc cctagtactg 1620
gcaatcattg tggctggtct atctttatgg atgtgctcca atgggtcgtt acaatgcaga 1680
atttgcattt aa 1692
<210> 2
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaatccaa atcaaaagat aacatgcatt tcagcaacag gagtaacact atcaatagta 60
agcctgctaa taggaatcac caatttgggc ctaaatatcg gactacacta caaagtgagt 120
gattcaacaa ctataaacat tccaaacatg aatgagacca acccaacaac aacaaacatc 180
actaacatta taatgaataa aaacgaagaa aaaacatttc ttaaattgac caagccgcta 240
tgtgaagtca actcatggca cattctatcg aaagacaatg cgataagaat aggtgaggat 300
gctcatatac tggtcacaag ggagccttac ctgtcctgtg atccacaagg ctgcagaatg 360
tttgctctga gtcagggcac aacactcaga gggcaacatg cgaatggaac catacatgat 420
aggagcccat ttcgagctct tataagttgg gaaatgggtc aagcacccag tccatacaat 480
actagggtcg aatgcatagg atggtcaagc acgtcatgcc atgatggcat atcgaggatg 540
tcagtatgca tatcaggacc taataacaat gcatcggcag tagtgtggta ccggggaaga 600
ccagtaacag aaatcccatc atgggctggg aacattctca gaactcaaga atcagaatgt 660
gtgtgccata aaggaatctg cccagtagtc atgacagatg gtccagcaaa caacaaggca 720
gctactaaaa tagtctactt aaaagaggga aagatacaaa agactgaaga actgcaaggg 780
aacgctcaac acatcgaaga atgttcatgc tacggagcag caaggatgat caaatgtgta 840
tgcagagaca attggaaggg ggcaaataga ccaataatca ctatagaccc cgaaaggatg 900
acccacacaa gcaaatactt gtgttcgaaa atcttaaccg acacaagtcg tcctaatgac 960
cccaccaatg ggaactgtga tgcgccaata acaggaggga acccagaccc cggggtaaaa 1020
gggtttgcat tcctagacgg ggagaattca tggcttggaa ggacaattag caaagactcc 1080
agatcaggct acgaaatgtt aaaggtccca aatgcagaaa tcgacactca atcagggcca 1140
atctcatacc agctgattgt caacaaccaa aattggtcag ggtactcagg ggcattcata 1200
gactattggg caaacaagga gtgcttcaac ccttgttttt atgtggagct gatcaggggg 1260
agacccaaag agagtagtgt actgtggact tctagtagca tggtagctct ctgtggatcc 1320
agggaacgat tgggatcatg gtcctggcat gatggtgcag aaatcatcta ctttaagtag 1380
<210> 3
<211> 2280
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaaagaa taaaagaact aagaaatcta atgtcgcagt ctcgcacccg cgagatactc 60
acaaaaacca ccgtggacca tatggccata atcaagaagt acacatcagg aagacaggag 120
aagaacccag cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagcagac 180
aagaggataa cggaaatgat tcctgagaga aatgagcaag gacaaacttt atggagtaaa 240
atgaatgatg ccggatcaga ccgagtgatg gtatcacctc tggctgtgac atggtggaat 300
aggaatggac caatgacaaa tacagttcat tatccaaaaa tctacaaaac ttattttgaa 360
agagtcgaaa ggctaaagca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420
atacgtcgga gagttgacat aaatcctggt catgcagatc tcagtgccaa ggaggcacag 480
gatgtaatca tggaagttgt tttccctaac gaagtgggag ccaggatact aacatcggaa 540
tcgcaactaa cgataaccaa agagaagaaa gaagaactcc aggattgcaa aatttctcct 600
ttgatggttg catacatgtt ggagagagaa ctggtccgca aaacgagatt cctcccagtg 660
gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttgcatt tgactcaagg aacatgctgg 720
gaacagatgt atactccagg aggggaagtg aagaatgatg atgttgatca aagcttgatt 780
attgctgcta ggaacatagt gagaagagct gcagtatcag cagacccact agcatcttta 840
ttggagatgt gccacagcac acagattggt ggaattagga tggtagacat ccttaagcag 900
aacccaacag aagagcaagc cgtggatata tgcaaggctg caatgggact gagaattagc 960
tcatccttca gttttggtgg attcacattt aagagaacaa gcggatcatc agtcaagaga 1020
gaggaagagg tgcttacggg caatcttcaa acattgaaga taagagtgca tgagggatct 1080
gaagagttca caatggttgg gagaagagca acagccatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140
ttgattcagc tgatagtgag tgggagagac gaacagtcga ttgccgaagc aataattgtg 1200
gccatggtat tttcacaaga ggattgtatg ataaaagcag ttagaggtga tctgaatttc 1260
gtcaataggg cgaatcagcg actgaatcct atgcatcaac ttttaagaca ttttcagaag 1320
gatgcgaaag tgctttttca aaattgggga gttgaaccta tcgacaatgt gatgggaatg 1380
attgggatat tgcccgacat gactccaagc atcgagatgt caatgagagg agtgagaatc 1440
agcaaaatgg gtgtagatga gtactccagc acggagaggg tagtggtgag cattgaccgg 1500
ttcttgagag tcagggacca acgaggaaat gtactactgt ctcccgagga ggtcagtgaa 1560
acacagggaa cagagaaact gacaataact tactcatcgt caatgatgtg ggagattaat 1620
ggtcctgaat cagtgttggt caatacctat caatggatca tcagaaactg ggaaactgtt 1680
aaaattcagt ggtcccagaa ccctacaatg ctatacaata aaatggaatt tgaaccattt 1740
cagtctttag tacctaaggc cattagaggc caatacagtg ggtttgtaag aactctgttc 1800
caacaaatga gggatgtgct tgggacattt gataccgcac agataataaa acttcttccc 1860
ttcgcagccg ctccaccaga gcaaagtaga atgcagttct cctcatttac tgtgaatgtg 1920
aggggatcag gaatgagaat acttgtaagg ggcaattctc ctgtattcaa ctacaacaag 1980
gccacgaaga gactcacagt tctcggaaag gatgctggca ctttaaccga agacccagat 2040
gaaggcacag ctggagtgga gtccgctgtt ctgaggggat tcctcattct gggcaaagaa 2100
gacaggagat atgggccagc attaagcatc aatgaactga gcaaccttgc gaaaggagag 2160
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tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattag 2280
<210> 4
<211> 2274
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggatgtca atccgacctt acttttctta aaagtgccag cacaaaatgc tataagcaca 60
actttccctt ataccggaga ccctccttac agccatggga caggaacagg atacaccatg 120
gatactgtca acaggacaca tcagtactca gaaaagggaa gatggacaac aaacaccgaa 180
actggagcac cgcaactcaa cccgattgat gggccactgc cagaagacaa tgaaccaagt 240
ggttatgccc aaacagattg tgtattggaa gcaatggctt tccttgagga atcccatcct 300
ggtatttttg aaaactcgtg tattgaaacg atggaggttg ttcagcaaac acgagtagac 360
aagctgacac aaggccgaca gacctatgac tggactttaa atagaaacca gcctgctgca 420
acagcattgg ccaacacaat agaagtgttc agatcaaatg gcctcacggc caatgagtca 480
ggaaggctca tagacttcct taaggatgta atggagtcaa tgaaaaaaga agaaatgggg 540
atcacaactc attttcagag aaagagacgg gtgagagaca atatgactaa gaaaatgata 600
acacagagaa caataggtaa aaggaaacag agattgaaca aaaggggtta tctaattaga 660
gcattgaccc tgaacacaat gaccaaagat gctgagagag ggaagctaaa acggagagca 720
attgcaaccc cagggatgca aataaggggg tttgtatact ttgttgagac actggcaagg 780
agtatatgtg agaaacttga acaatcaggg ttgccagttg gaggcaatga gaagaaagca 840
aagttggcaa atgttgtaag gaagatgatg accaattctc aggacaccga actttctttc 900
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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cacttggaag tatgcttcat gtattcagat ttccacttca tcaatgagca aggcgagtca 180
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ggaagagatc gcacaatggc ctggacagta gtaaacagta tttgcaacac tacaggggct 300
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tacactctcg atgaagaaag cagggctagg atcaaaacca ggctattcac cataagacaa 540
gaaatggcca gcagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg agaagagaca 600
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ccgaacttct ccagccttga aaattttaga gcctatgtgg atggattcga accgaacggc 720
tacattgagg gcaagctgtc tcaaatgtcc aaagaagtaa atgctagaat tgaacctttt 780
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aaattcctgc tgatggatgc cttaaaatta agcattgagg acccaagtca tgaaggagag 900
ggaataccgc tatatgatgc aatcaaatgc atgagaacat tctttggatg gaaggaaccc 960
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tttgacgact gtaaagatgt aggtgatttg aagcaatatg atagtgatga accagaattg 1200
aggtcgcttg caagttggat tcagaatgag ttcaacaagg catgcgaact gacagattca 1260
agctggatag agcttgatga gattggagaa gatgtggctc caattgaaca cattgcaagc 1320
atgagaagga attatttcac atcagaggtg tctcactgca gagccacaga atacataatg 1380
aagggggtgt acatcaatac tgccttactt aatgcatctt gtgcagcaat ggatgatttc 1440
caattaattc caatgataag caagtgtaga actaaggagg gaaggcgaaa gaccaacttg 1500
tatggtttca tcataaaagg aagatcccac ttaaggaatg acaccgacgt ggtaaacttt 1560
gtgagcatgg agttttctct cactgaccca agacttgaac cacacaaatg ggagaagtac 1620
tgtgttcttg agataggaga tatgcttcta agaagtgcca taggccaggt ttcaaggccc 1680
atgttcttgt atgtgaggac aaatggaacc tcaaaaatta aaatgaaatg gggaatggag 1740
atgaggcgtt gtctcctcca gtcacttcaa caaattgaga gtatgattga agctgagtcc 1800
tctgtcaaag agaaagacat gaccaaagag ttctttgaga acaaatcaga aacatggccc 1860
attggagagt ctcccaaagg agtggaggaa agttccattg ggaaggtctg caggacttta 1920
ttagcaaagt cggtatttaa cagcttgtat gcatctccac aactagaagg attttcagct 1980
gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaatctgga acctgggacc 2040
tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc taattaatga tccctgggtt 2100
ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc cttacacatg cattgagtta g 2151
<210> 6
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcgtccc aaggcaccaa acggtcttac gaacagatgg agactgatgg agaacgccag 60
aatgccactg aaatcagagc atccgtcgga aaaatgattg gtggaattgg acgattctac 120
atccaaatgt gcacagaact taaactcagt gattatgagg gacggttgat ccaaaacagc 180
ttaacaatag agagaatggt gctctctgct tttgacgaaa ggagaaataa atacctggaa 240
gaacatccca gtgcggggaa agatcctaag aaaactggag gacctatata cagaagagta 300
aacggaaagt ggatgagaga actcatcctt tatgacaaag aagaaataag gcgaatctgg 360
cgccaagcta ataatggtga cgatgcaacg gctggtctga ctcacatgat gatctggcat 420
tccaatttga atgatgcaac ttatcagagg acaagggctc ttgttcgcac cggaatggat 480
cccaggatgt gctctctgat gcaaggttca actctcccta ggaggtctgg agccgcaggt 540
gctgcagtca aaggagttgg aacaatggtg atggaattgg tcaggatgat caaacgtggg 600
atcaatgatc ggaacttctg gaggggtgag aatggacgaa aaacaagaat tgcttatgaa 660
agaatgtgca acattctcaa agggaaattt caaactgctg cacaaaaagc aatgatggat 720
caagtgagag agagccggaa cccagggaat gctgagttcg aagatctcac ttttctagca 780
cggtctgcac tcatattgag agggtcggtt gctcacaagt cctgcctgcc tgcctgtgtg 840
tatggacctg ccgtagccag tgggtacgac tttgaaagag agggatactc tctagtcgga 900
atagaccctt tcagactgct tcaaaacagc caagtgtaca gcctaatcag accaaatgag 960
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ctaagagtat tgagcttcat caaagggacg aaggtggtcc caagagggaa gctttccact 1080
agaggagttc aaattgcttc caatgaaaat atggagacta tggaatcaag tacacttgaa 1140
ctgagaagca ggtactgggc cataaggacc agaagtggag gaaacaccaa tcaacagagg 1200
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cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcagcgagcc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440
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<211> 982
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctagg caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcgcta ttgccgcaaa 780
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ttaccgtcgc tttaaatacg gactgaaagg agggccttct acggaaggag tgccaaagtc 900
tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gagtgctgtg gatgctgacg atggtcattt 960
tgtcagcata gagctggagt aa 982
<210> 8
<211> 838
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60
cgagttgtag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120
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caggcgatca tggataaaaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420
ctggagactc taatattgct aagggctttc accgaagagg gagcaattgt tggcgaaatt 480
tcaccattgc cttctcttcc aggacatact gctgaggatg tcaaaaatgc agttggagtc 540
ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600
ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacga 660
gaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tgaagaaata agatggttga ttgaagaagt 720
gagacacaaa ctgaaggtaa cagagaatag ttttgagcaa ataacattta tgcaagcctt 780
acatctattg cttgaagtgg agcaagagat aagaactttc tcatttcagc ttatttaa 838
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggagaaaa tagtacttct tcttt 25
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctccaaaca gtcctctagt ttcccttaga ggactatttc tgagc 45
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actagaggac tgtttggagc tatagcagga t 31
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttaaatgcaa attctgcatt gtaac 25

Claims (6)

1.人工重组的H5N6流感病毒毒株H5-Re13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：V202159，保藏时间为2021年8月3日。
2.权利要求1所述的毒株H5-Re13在制备预防H5N6流感病毒所导致疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述H5N6流感病毒为A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)毒株。
4.一种疫苗，含有权利要求1所述的毒株H5-Re13。
5.权利要求1所述的毒株H5-Re13的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(1)设计HA基因特异性扩增和突变引物，利用RT-PCR方法，扩增出高致病性H5N6亚型禽流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)株HA基因的HA1和HA2片段，在扩增HA1片段的同时将HA基因裂解位点氨基酸由-RERRRKR-突变为-RETR-，使其由高致病性禽流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征；再利用重叠延伸反应，扩增出裂解位点为典型低致病性禽流感病毒分子特征的HA片段，插入pBD质粒，构建重组HA基因双向转录载体；
(2)利用RT-PCR方法，扩增出H5N6亚型禽流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)的NA基因全长片段，插入pBD质粒，构建重组NA基因双向转录载体；
(3)将(1)、(2)所述构建的HA、NA基因2个重组pBD双向转录载体质粒和含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因的6个pBD双向转录载体质粒混合，并与转染试剂一起接种293T细胞，将培养后收获的细胞及上清接种鸡胚，获得具有HA活性的H5N6禽流感重组病毒株H5-Re13。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，扩增HA1基因的引物对如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，其中SEQ ID No.10为HA裂解位点的突变引物；扩增HA2基因的引物对如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
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