MXPA99005326A

MXPA99005326A - Vectores de expresion novedosos que contienen genes de ligando de molecula accesoria y su uso para inmunomodulacion y tratamiento de malignidades y enfermedad autoinmune

Info

Publication number: MXPA99005326A
Application number: MXPA/A/1999/005326A
Authority: MX
Inventors: J Kipps Thomas; Sharma Sanjai; Cantwell Mark
Original assignee: University Of California
Priority date: 1996-12-09
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2000-02-02

Abstract

Esta invención se refiere a genes que codifican ligandos de molécula accesoria y su uso para inmunomodulación, vacunación y tratamiento de varias emfermedades humanas que incluye maliginidades y emfermedades autoinmunes, esta invención también describe el uso de ligandos de molécula accesoria que est n constituidos de varios dominios y porciones de sus dominios de moléculas derivados de la familia del factor de necrosis tumoral;las moléculas quiméricas de esta invención contienen propiedadesúnicas que conducen a la estabilización de sus actividades y asímayor utilidad en el tratamiento de emfermedades;también se mencionan vectores para expresar genes que codifican las moléculas de esta invención.

Description

VECTORES DE EXPRESIÓN NOVEDOSOS QUE CONTIENEN GENES DE LIGANDO DE MOLÉCULA ACCESORIA. Y SU USO PARA INMUNOMODULACION Y TRATAMIENTO DE MALIGNIDADES Y ENFERMEDAD AUTOINMUNE SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama la prioridad para Kipps y otros, "VECTORES DE EXPRESIÓN NOVEDOSOS QUE CONTIENEN GENES DE LIGANDO DE MOLÉCULA ACCESORIA, Y SU USO PARA INMUNOMODULACION Y TRATAMIENTO DE MALIGNIDADES", solicitud provisional de los Estados Unidos No. 60/132145, presentada el 9 de diciembre de 1996, la cual se incorpora en la presente como referencia, incluyendo dibujos.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a vectores de expresión novedosos que contienen genes que codifican para un ligando de molécula accesoria, y el uso de dichos vectores para inmunomodulación, protocolos de vacunación mejorados, y el tratamiento de malignidades y enfermedades autoinmunes. Más particularmente, esta invención provee vectores de expresión y métodos para tratar varias células neoplásicas o malignas, y vectores de expresión y métodos para tratar enfermedad autoinmune. Esta invención contempla también la producción y expresión de ligandos de molécula accesoria con mayor estabilidad y función mejorada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Leucemias, linfomas, carcinomas y otras malignidades son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en Harrison's Principies of Internal Medicine. Wilson y otros, eds., McGraw-Hill, New York, pp. 1599-1612. Estas malignidades parecen haber escapado de algún modo de los mecanismos de vigilancia del sistema inmune que eliminan rápida y continuamente células proliferantes. Se desconoce el mecanismo exacto por el cual estas malignidades escapan de la vigilancia del sistema inmune. Algunas de estas células malignas del sistema inmune son células malignas que presentan antígeno que no funcionan adecuadamente dentro de la cascada inmune. Por ejemplo, las células B neoplásicas no pueden inducir reacciones alógenas o autólogas mixtas incluso débiles en linfocitos in vitro. Más evidencia de que las malignidades sobreviven debido a la falla del mecanismo de vigilancia del sistema inmune, incluye la frecuencia incrementada de dichas malignidades en individuos inmunocomprometidos, tales como receptores de aloinjertos y quienes reciben terapia con inmunosupresores a largo plazo. Además, la frecuencia de estas malignidades se incrementa en pacientes que sufren de Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) y pacientes con síndromes de inmunodeficiencia primaria, tales como síndrome linfoproliferativo ligado al gen X o síndrome de W?scott-Aldrich (Thomas y otros, Adv. Cáncer Res. 57:329,1991 ). El sistema inmune funciona normalmente para eliminar células malignas reconociendo las células malignas como células extrañas, y depurando dichas células del cuerpo. Una reacción inmune depende tanto de la respuesta de los anticuerpos del sistema inmune, como de la respuesta inmune celular dentro de un paciente. Más específicamente, la respuesta inmune celular que actúa para reconocer las células malignas como células extrañas, requiere un número de células diferentes del sistema inmune, y la interacción entre dichas células. Una reacción inmune empieza con un linfocito T (célula T) que tiene sobre su superficie celular el receptor de células T. La célula T tiene también la capacidad de expresar sobre su superficie varias moléculas accesorias que interactúan con moléculas accesorias sobre el linfocito B (célula B). Cuando el receptor de células T de la célula T se une específicamente a un antígeno extraño, tal como una célula maligna, se activa y se expresa el ligando de molécula accesoria, el ligando CD40, sobre su superficie celular. El ligando de molécula accesoria está únicamente presente sobre las células T activadas durante un período breve, y es removido rápidamente de la superficie celular. Después de que el ligando de molécula accesoria de las células es removido de la superficie de la célula T activada, se destruye su capacidad para unirse a las células B mediante el ligando de molécula accesoria.

Cuando está presente sobre la superficie de una célula T activada, el ligando celular accesorio puede unirse específicamente a la molécula celular accesoria presente sobre la célula B. Esta interacción específica de las células T y B hace que las células T y B expresen citocinas y la molécula accesoria coestimulatoria de superficie celular, lo cual da como resultado una activación inmune que hace que las células T citolíticas destruyan específicamente y retiren a la célula maligna del cuerpo. La interacción con una célula T activada no está limitada únicamente a las células B, sino más bien puede ser llevada a cabo por cualquier célula que sea capaz de presentar el antígeno a la célula T (una célula que presenta antígeno). Estas células incluyen linfocitos B; macrófagos, células dendríticas, monocitos, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares o células de Kupffer. Se sabe que todas estas células tienen varias moléculas accesorias sobre su superficie celular, lo cual les permite interactuar con otras células del sistema inmune. Por ejemplo, todas estas células que presentan antígeno tienen la molécula accesoria CD40 sobre su superficie celular. La presencia de estas moléculas accesorias le permite a estas células que presentan antígeno unirse específicamente al ligando complementario de molécula accesoria, e interactuar así directamente con otras células del sistema inmune. Un gran número de ligandos de molécula accesoria son miembros de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (Fanslow y otros, Sem Immun., 6:267-268 (1994). Los genes para un número de estos ligandos de molécula accesoria han sido clonados e identificados. Estos genes de ligando de molécula accesoria codifican para moléculas accesorias las cuales tienen la configuración de proteínas de membrana de tipo II, y exhiben grados variables de homología con otros genes de ligando de molécula accesoria. Por ejemplo, se han aislado los genes de ligando de molécula accesoria que codifican para el ligando CD40 de murino y el ligando CD40 de humano (véase Armitage y otros, Nature. 357:80-82 (1992) y Hollenbaugh y otros, EMBO J.. 11 :4313-4321 (1992). CD40 y su ligando, el ligando CD40, son componentes críticos de una respuesta inmune normal. Las señales mediadas por CD40 hacen que los linfocitos inmunes proliferen y se diferencien, y sean células potentes que presentan antígeno. Las células B malignas o neoplásicas son células pobres que presentan antígeno, y con incapaces de estimular una reacción alógena mixta vigorosa en linfocitos. El entrelazamiento exitoso de moléculas CD40 en células inmunes da como resultado una fuerte reacción alógena mixta en linfocitos, lo cual sugiere una fuerte reacción inmune. Varios ligandos CD40 solubles o anticuerpos específicos para CD40 se han usado para entrelazar potencialmente a CD40. Estos ligandos CD40 solubles y anticuerpos específicos de CD40 no son óptimos para entrelazar las moléculas CD40 en células que presentan antígeno, y no funcionan tan eficazmente como el ligando CD40 expresado sobre una membrana celular para producir una fuerte estimulación de las células que presentan antígeno. Estos métodos son también difíciles de implementar, debido a que se deben aislar grandes cantidades de anticuerpos o construcciones de ligando CD40, lo cual es una labor difícil y que consume tiempo. Otras estrategias para utilizar el ligando CD40 en solución o como una molécula de unión a membrana que incluya transformación de fibroblastos con ligando CD40 para producir células cultivadas las cuales se usan entonces para presentar antígeno, no son fáciles de poner en práctica en protocolos clínicos en humanos in vivo. La interacción de CD95 (Fas) con su ligando (ligando Fas, o FasL) funciona para limitar la duración de la respuesta inmune y/o la vida de los linfocitos activados. La apoptosis inducida por la unión Fas-FasL sirve para depurar linfocitos autorreactivos activados. Se han demostrado problemas causados por la alteración de esta vía en animales con defectos en las interacciones de Fas< - > ligando Fas. Los ratones que padecen mutaciones, las cuales inactivan a CD95 o FasL, desarrollan numerosos trastornos que incluyen patología autoinmune que se asemeja a la observada en pacientes con artritis reumatoide (RA) o lupus eritematoso sistémico. Zhang y otros, en J. Clin. Invest.. mostraron que la inyección de virus que expresan FasL en las articulaciones de ratones con artritis inducida por colágena, da como resultado apoptosis de células sinoviales y alivio de los síntomas de artritis. La expresión del ligando Fas permite la depuración de las células activadas, lo cual desempeña una función en la patogénesis de la enfermedad autoinmune. Por lo tanto, una estrategia de terapia de genes para introducir FasL en las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide, podría funcionar para mejorar la patología de la enfermedad, conduciendo a la destrucción de las células mononucleares infiltrantes. Se ha demostrado que la administración de moléculas accesorias solubles y ligandos de molécula accesoria desencadena o está asociada con efectos fisiológicos adversos. Por ejemplo, el tratamiento de ratones que exhiben expresión del receptor CD40 de tipo silvestre, con proteína de fusión CD40L-CD8 soluble, dio como resultado una respuesta inflamatoria pulmonar. Esto no se observó en ratones en los cuales el gen para el receptor CD40 había sido suprimido. Estos experimentos, descritos en Wiley, J. A. y otros, Journal of Immnunology 158:2932-2938 (1997), apoyan los datos in vitro que sugieren que la ligación de CD40 puede dar como resultado respuestas inflamatorias. La administración directa de factor de necrosis tumoral (a o ß) soluble, recombinante y purificado produce choque y daño tisular, como se describe en Tracey, K. J. y A. Cerami, Annu. Rev. Med. 45:491-503 (1994). Al cabo de algunos minutos después de la administración intravenosa o intraarterial del FNT, se producen síndrome de choque, lesión tisular, síndrome de derrame capilar, hipoxia, edema pulmonar y falla de órganos múltiples asociados con una alta mortalidad. La dosis baja crónica de FNT causa anorexia, pérdida de peso, deshidratación y depleción de proteínas y lípidos de todo el cuerpo. Se ha demostrado también que el receptor y el ligando Fas soluble están asociados con daño tisular y otros efectos adversos. CD95, el receptor de Fas, es un mediador de apoptosis. El ligando Fas induce apoptosis mediante unión al receptor de Fas. Como se muestra en Galle, P. R. y otros, J. Exp. Med 182:1223-1230 (1995), la administración de un anticuerpo anti-Fas agonista causó daño tisular en ratones. Los ratones inyectados intraperitonealmente con el anticuerpo agonista murieron al cabo de algunas horas, y los análisis revelaron que el daño severo del hígado causado por la apoptosis fue la causa más probable de muerte. La función del ligando Fas soluble (FasL), en la patogénesis del daño tisular sistémico en el linfoma agresivo se describe en Sato, K. y otros, Britsh Journal of Haematoloqy. 94:379-382 (1996). Los hallazgos presentados en este reporte indican que FasL soluble está directamente asociado con la patogénesis del daño hepático y pancitopenia. Se demostró que CD27, el receptor del ligando de molécula accesoria, CD70, en un reporte escrito por van Oers y otros, en Blood 82:3430:3436 (1993), está asociado con malignidades de células B. Los hallazgos anteriores contraindican la administración de ligandos solubles de molécula accesoria, destacando la necesidad de terapias que incrementen los niveles de estas moléculas sin producir elevación alguna de sus formas solubles. A pesar del cúmulo de información respecto a los genes de ligando de molécula accesoria y su expresión sobre la superficie de varias células inmunes, se desconoce aún el mecanismo exacto por el cual los genes de ligando de molécula accesoria son regulados en células que presentan antígeno. Sin un conocimiento específico de la regulación de la expresión de los genes de ligando de molécula accesoria sobre estas células que presentan antígeno, hasta la fecha no ha sido posible alterar la respuesta inmune haciendo variar la expresión de un gen de ligando de molécula accesoria. Sin un conocimiento específico de cómo regular la expresión de un gen de ligando de molécula accesoria sobre una célula que presenta antígeno, no es posible alterar la respuesta inmune hacia células malignas. De esta manera, hubo la necesidad de un método para aumentar la expresión de un gen de ligando de molécula accesoria sobre células normales y malignas que incluyan células que presentan antígeno. Además, sin la capacidad para regular la expresión de ligandos de molécula accesoria, no es posible alterar la depuración de estas células inmunes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención satisface estas necesidades proveyendo vectores de expresión novedosos que contengan genes de ligando de molécula accesoria y métodos para introducir dichos genes en células normales y malignas que presentan antígeno, permitiendo así la alteración de una respuesta inmune, el tratamiento de enfermedades autoinmunes y el tratamiento de varias neoplasias. Esta invención provee vectores, incluyendo vectores para terapia de genes, que contengan genes de ligando de molécula accesoria. Estos vectores contienen también los elementos genéticos adicionales, tales como promotores, incrementadores y señales de poliadenilación (extremos 3'), que permiten que el vector sea colocado exitosamente dentro de la célula y dirija la expresión del gen de ligando de molécula accesoria en una célula. Dichos vectores para terapia de genes son capaces de transformar directamente células animales, e introduciendo así el gen de ligando de molécula accesoria en las células de ese animal en una forma que pueda ser utilizado para producir ligandos de molécula accesoria dentro de esa célula. En otros aspectos de la presente invención, la función de un ligando de molécula accesoria se modifica alterando la vida media de la molécula sobre la superficie de la célula, o cambiando el nivel de expresión de esa molécula sobre la superficie celular. En modalidades preferidas, la presente invención provee ligandos de molécula accesoria, los cuales son modificados para mejorar la estabilidad de dichos ligandos de molécula accesoria sobre la superficie celular. Dicha estabilidad incrementada se puede lograr usando cualquiera de los métodos de moléculas descritos en esta solicitud, incluyendo moléculas quiméricas y moléculas en las cuales se han introducido mutaciones en por lo menos un punto. La presente invención contempla también aumentar la expresión de dicha molécula. La presente invención provee también vectores para terapia de genes que contengan los genes de ligando de molécula accesoria que sean quiméricos en esas porciones del gen y se deriven de dos ligandos de molécula accesoria separados los cuales pueden ser o no de diferentes especies. Los genes de ligando de molécula accesoria de la presente invención incluyen genes que codifican para moléculas de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT). Las moléculas que constituyen la familia del FNT incluyen FNTa, FNTß, ligando CD40, ligando Fas, CD70, ligando CD30, ligando 41 BB (4-1 BBL), factor de crecimiento nervioso y ligando de inducción de apoptosis relacionada a FNT (TRAIL). En algunas modalidades de la presente invención, los genes quiméricos de ligando de molécula accesoria de la presente invención contienen por lo menos una porción de un gen de ligando de molécula accesoria de murino junto con porciones de genes de ligando de molécula accesoria derivadas de ratón, humanos u otras especies. Algunas modalidades preferidas de ia presente invención utilizan genes de ligando CD40 de murino y genes quiméricos de ligando CD40 que contengan por lo menos un segmento del gen de ligando CD40 de murino junto con por lo menos un segmento del gen de ligando CD40 de humano. La presente invención contempla genes quiméricos de ligando de molécula accesoria, en donde segmentos del gen de ligando de molécula accesoria de una especie han sido intercambiados con segmentos de un segundo gen de ligando de molécula accesoria los cuales pueden ser opcionalmente de una especie diferente. Por ejemplo, en una modalidad preferida, se han unido los dominios citoplásmico y de transmembrana del gen de ligando CD40 a los dominios extracelulares del gen de ligando CD40 de humano.

La presente invención contempla vectores para terapia de genes que sean capaces de infectar directamente células de humano, mamífero, insecto u otras células. El uso de dichos vectores para terapia de genes simplifica ampliamente la inserción de un gen de ligando de molécula accesoria en dichas células. Los vectores contemplados para terapia de genes se pueden usar in vivo o in vitro para infectar a la célula deseada, y son particularmente útiles para infectar células malignas para efectuar la expresión sostenida de alto nivel de un ligando fisiológico. La presente invención contempla también células de animal, de mamífero y de humano que contengan un vector para terapia de genes que incluya un gen de ligando de molécula accesoria e información genética suficiente para expresar dicho ligando de molécula accesoria dentro de esa célula. En modalidades preferidas, la presente invención contempla también células neoplásicas humanas que presentan antígeno que contienen vectores para terapia de genes de la presente invención o que contienen un gen de ligando de molécula accesoria junto con un promotor y una región terminal 3'. La presente invención contempla también células humanas y células neoplásicas humanas que contengan un vector para terapia de genes que incluya un gen quimérico de ligando de molécula accesoria. La presente invención contempla también células bacterianas o células animales que contengan genes de ligando de molécula accesoria, genes quiméricos de ligando de molécula accesoria, genes de ligando de molécula accesoria de murino, genes de ligando de molécula accesoria de humano, los vectores para terapia de genes de la presente invención, los vectores de la presente invención, y un gen quimérico de ligando de molécula accesoria junto con un promotor heterólogo, incrementador o secuencia de poliadenilación. La presente invención contempla también métodos para alterar la respuesta inmune dentro de un paciente humano, o la inmunorreactividad de células humanas in vivo, introduciendo un gen que codifique para un gen de ligando de molécula accesoria en las células humanas, de modo que el ligando de molécula accesoria se exprese sobre la superficie de dichas células humanas. Este método incluye la introducción del gen de ligando de molécula accesoria como parte de un vector para terapia de genes o en asociación con un promotor heterólogo o nativo, ¡ncrementador o señal de poliadenilación. Algunas modalidades preferidas de la presente invención utilizan la introducción de genes de ligando Fas y genes quiméricos de ligando Fas, construidos como se contempló anteriormente para CD40, en células humanas para alterar su ¡nmunorreactividad. La presente invención incluye también métodos en los cuales dichos genes de ligando de molécula accesoria son insertados en células que tienen la molécula accesoria a la cual el ligando de molécula accesoria se une sobre la superficie de la célula en la cual está el gen de ligando de molécula accesoria. Los presentes métodos para alterar la inmunorreactividad son aplicables a todos los tipos de células de humano, animal y murino, incluyendo células neoplásicas de humano tales como linfoma, leucemias y otras malignidades en humanos. En modalidades preferidas, este método se usa para introducir el gen que codifica para el ligando de molécula accesoria en células potenciales que presentan antígeno de un paciente humano, y el cual pueda estimular a células que presentan antígeno. Dichas células que presentan antígeno incluyen monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares, células de Kupffer, y similares. Las diferentes células que presentan antígeno pueden estar presentes como parte de una malignidad conocida en un paciente humano, tales como leucemias, linfomas, leucemia monocítica aguda (AML), leucemia lifocítica crónica (CLL), leucemia mielomonocítica aguda (AMML), leucemia mielógena crónica o leucemia mielomonocítica crónica (CMML), e incluirían así todos los tumores de cualquier célula capaz de presentar antígeno al sistema inmune de animal o de humano, o son capaces de estimular a células que presentan antígeno. La presente invención contempla también modular el sistema inmune introduciendo genes que codifican para un gen de ligando de molécula accesoria de la presente invención en cualquier número de células diferentes encontradas en un paciente, incluyendo células musculares, células de la piel, células estromáticas, células de tejido conectivo, fibroblastos, y similares. La presente invención contempla también métodos para tratar neoplasias en un paciente humano o un paciente animal. En una modalidad preferida, el método comprende aislar las células neoplásicas del paciente humano o animal, e insertar en dichas células aisladas el gen que codifica para el ligando quimérico de molécula accesoria o el ligando de molécula accesoria, de modo que la molécula sea expresada sobre la superficie celular de dichas células neoplásicas u otras células somáticas. Las células neoplásicas son infundidas entonces de nuevo en el paciente humano o animal, y pueden participar entonces en una respuesta inmune mejorada. La presente invención contempla también la co-infección o cointroducción del gen de ligando de molécula accesoria junto con un gen que codifica para un antígeno específico de tumor o carcinoma. Esta combinación de moléculas se expresa entonces sobre la superficie de las células neoplásicas, y cuando dichas células son introducidas en el paciente, conducen a la respuesta inmune rápida, lo cual da como resultado la destrucción de dichas células. Los presentes métodos incluyen también introducir directamente el vector para terapia de genes u otro vector que posea el gen de ligando de molécula accesoria directamente en el tumor o lecho tumoral de un paciente. Después de entrar en el lecho tumoral del paciente, el vector para terapia de genes u otro vector entra en las células presentes en el tumor o lecho tumoral, y expresa entonces el gen de ligando de molécula accesoria sobre la superficie de dichas células. Estas células son entonces capaces de participar totalmente en la respuesta inmune animal o inmune humana. La presente invención contempla también métodos para aumentar una respuesta inmune a una vacuna. El presente método de vacunación de un animal contra un organismo o antígeno predeterminado, consiste en administrar a dicho animal una vacuna que tenga un vector genético que contenga un gen de ligando de molécula accesoria. Otras modalidades de la presente invención incluyen vacunar a un animal administrando dos vectores genéticos separados, uno conteniendo los antígenos del organismo al cual se desea logra la inmunidad, aislando las células del animal objetivo, y poniendo en contacto con dichas células un vector que codifique para por lo menos un antígeno de un organismo predeterminado de modo que el antígeno sea expresado por las células, y también poniendo en contacto dichas células con un vector diferente que exprese el gen de ligando de molécula accesoria sobre la superficie de las células del animal que presentan antígeno. En conjunto, estos vectores separados producen una vacunación la cual es mucho más fuerte y de más larga duración de lo que es una vacunación con un antígeno solo. Los presentes métodos de vacunación son aplicables a vacunaciones designadas para producir inmunidad contra un virus, una célula, una bacteria, una proteína o un hongo. Los presentes métodos son también aplicables a inmunización contra varios carcinomas y neoplasias. En estas modalidades, el antígeno del tumor contra el cual se desea la inmunidad, es introducido en el animal, junto con el vector genético que contenga el gen de ligando de molécula accesoria. La presente invención contempla también métodos para tratar la artritis, utilizando un vector para terapia de genes que codifique para un ligando de molécula accesoria. De particular interés para usarse en artritis, es la molécula de ligando Fas, en la cual la expresión de ia actividad del ligando Fas ha sido incrementada en la articulación y/o ha sido incrementada la estabilidad de la actividad del ligando Fas sobre las células dentro de la articulación. En otras modalidades, la presente invención contempla métodos para tratar la artritis utilizando ligandos quiméricos de molécula accesoria y genes quiméricos de ligando de molécula accesoria. La presente invención contempla también terapia ex vivo y terapia in vivo de artritis, utilizando los vectores de expresión de la presente invención junto con el ligando Fas y versiones modificadas de dicha molécula, incluyendo moléculas quiméricas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama que muestra un número de genes de ligando de molécula accesoria y los dominios l-IV de dichos genes, deducidos de datos de secuencia. La figura 2 es un diagrama que muestra en ejemplo de genes quiméricos de ligando de molécula accesoria. Se han sombreado los dominios derivados del módulo accesorio de murino. La figura 3 muestra la cantidad del ligando CD40 de ratón o de humano presente sobre la superficie de células Hela o CLL infectadas con vectores para terapia de genes que contienen los genes que codifican para dichas moléculas. La figura 3A muestra células Hela no infectadas (sombreadas), y células Hela infectadas con un vector para terapia de genes que codifica para el ligando CD40 de murino. La figura 3B muestra células Hela no infectadas (sombreadas), y células Hela infectadas con un vector para terapia de genes que codifica para el ligando CD40 de humano. La figura 3C muestra células CLL no infectas (sombreadas) y células CLL infectadas con un vector para terapia de genes que codifica para el ligando CD40 de murino. La figura 3D muestra células CLL no infectadas (sombreadas), y células CLL infectadas con un vector para terapia de genes que codifica para el ligando CD40 de humano. La figura 4 muestra histogramas de la expresión incrementada de CD54 (figura 4B) y CD80 (figura 4D) sobre células CLL en las cuales se ha introducido un vector para terapia de genes que contiene el gen de ligando de molécula accesoria (gen de ligando CD40 de murino). La gráfica sombreada indica tinción control en análisis de FACS, y la gráfica clara indica tinción con anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para CD54 (figuras 4A y 4B) o CD80 (figuras 4C y 4D). La figura 5 muestra la proliferación de células medida por la incorporación de 3H-TdR de células T alógenas en respuesta a varios regímenes de estimulación. Las células CLL que contienen un vector para terapia de genes que expresa un gen de ligando de molécula accesoria (el gen del ligando CD40 de murino) se introdujeron, estimulando la proliferación de células T alógenas.

La figura 6 muestra la producción de gamma interferón (IFNg) por células T alógenas estimuladas con células CLL que contienen un gen de ligando de molécula accesoria.

La figura 7 muestra el tratamiento de una neoplasia en un animal usando un vector para terapia de genes que contiene un gen de ligando de molécula accesoria de la presente invención. Los cuadros claros muestran ratones inmunizados con células neoplásicas que no expresan un ligando de molécula accesoria de la presente invención. Los ratones inmunizados con células neoplásicas que expresan un ligando de molécula accesoria de la presente invención se muestran como la línea horizontal en la parte superior de la figura, y no muestran morbidez.

La figura 8 muestra niveles de producción y estabilidades del ligando CD40 y del transcrito del ligando CD40 en células CLL (gráfica superior) y células mononucleares en sangre normales (gráfica inferior).

La figura 9 muestra el curso de tiempo de la expresión transgénica en células B CLL infectadas con el ligando de molécula accesoria (ligando CD40). La MFIR (relación de intensidad de fluorescencia media), comparando la intensidad de fluorescencia de las células CLL CD19+ teñidas con ligando CD40 marcado con PE contra las mismas teñidas con un mAb control de isotipo marcado con PE en cada punto de tiempo, se representa mediante los círculos cerrados unidos por líneas continuas de acuerdo con la escala provista en la ordenada del lado izquierdo.

La figura 10 muestra cambios en el fenotipo del antígeno de superficie de células B CLL infectadas con un vector para terapia de genes que contiene un ligando de molécula accesoria, el ligando CD40. Los histogramas sombreados representan la tinción de células CLL no infectadas (líneas delgadas) teñidas con anticuerpo de control no específico, los histogramas claros dibujados con líneas delgadas representan células CLL no infectadas teñidas con mAb específico conjugado con FITC, y los histogramas claros dibujados con líneas gruesas (CD154-CLL marcadas) representan células CLL infectadas con el vector para terapia de genes de ligando de molécula accesoria y teñidas con mAb específico conjugado con FITC.

La figura 11 muestra niveles de CD27 producidos en células CLL infectadas con un vector para terapia de genes que contiene un ligando de molécula accesoria. La figura 1 1A muestra que las células CLL (CD154-CLL) infectadas con CD40L expresan niveles reducidos de CD27 de superficie. Los histogramas claros representan la tinción de células CLL no infectadas (líneas delgadas) o células CLL infectadas (líneas gruesas) con mAb aCD27 conjugado con FITC, respectivamente. La figura 1 1 B muestra la producción de la forma soluble de CD27 por células B CLL.

La figura 12 muestra respuestas de células T alógenas inducidas por células CLL infectadas con un vector para terapia de genes que contiene un ligando de molécula accesoria (ligando CD40, también llamado CD154). La figura 12A indica la concentración de IFNg en los sobrenadantes después de la estimulación de las células T alógenas con células CLL que contienen el ligando de molécula accesoria. La figura 12B muestra la proliferación de células, determinada por la incorporación de 3H-timidina. La figuras 12C y 12D muestran respuestas secundarias de células T alógenas inducidas por células CLL que contienen el ligando de molécula accesoria.

La figura 13 ilustra respuestas de células T autólogas inducidas por células B CLL que contienen el ligando de molécula accesoria, ligando CD40 o CD154, y controles. La figura 13A muestra la incorporación de 3H-timidina por células T autólogas co-cultivadas con las células CLL. La figura 13B muestra los niveles de IFNg humano producido por células T autólogas co-cultivadas con ias células CLL. En la figura 13C, se grafican las actividades de CTL de células T autólogas inducidas por células B CLL que contienen el ligando de molécula accesoria.

La figura 14 muestra la especificidad de CTL por células B CLL autólogas. La concentración de IFNg se determinó en los sobrenadantes después de 48 horas de cultivo (figura 14A), y la actividad citolítica se determinó a 3 horas de cultivo (figura 14B). En la figura 14C, se añadieron mAbs a las células leucémicas objetivo autólogas antes de la prueba de CTL.

La figura 15 muestra que la estimulación intercelular juega un papel en la producción de los cambios fenotípicos observados en células CLL que expresan el ligando de molécula accesoria. En la figura 15A, se muestra el efecto de la densidad de cultivo sobre la expresión inducida de CD54 y CD80 después de la infección con un vector para terapia de genes que contiene el ligando de molécula accesoria (ligando CD40, CD154). Los histogramas sombreados representan la tinción de células B leucémicas con un mAb de control de isotipo conjugado con FITC. Los histogramas claros representan células B CLL-CD154, cultivadas a alta o baja densidad (indicadas por las flechas) y teñidas con un mAb conjugado con FITC específico para CD54 o CD80. La figura 15B muestra la inhibición de la activación de células CLL-CD154 por mAb anti-CD154. Las figuras 15C y 15D ilustran la expresión de moléculas accesorias inmunes sobre células B CLL no infectadas expectantes inducida por células CLL que expresan al ligando de molécula accesoria. Los histogramas sombreados representan la tinción con mAb control de isotipo conjugado con PE.

La figura 16 muestra que el vector que codifica para un ligando de molécula accesoria incrementa la inmunización contra ß-gal en ratones. La figura 16 muestra que los ratones que recibieron inyecciones intramusculares del vector pCD40L produjeron significativamente más anticuerpos para ß-gal que los ratones inyectados con pcDNA3 no modificado o pCD40L. Figura 16B, análisis de ELISA de diluciones en serie de sueros reunidos en d28, muestra que los ratones co-inyectados con placZ y pCD40L tenían un título medio ocho veces mayor de anticuerpos anti-ß-gal en d28 que los ratones tratados con pacZ + pcDNA3.

La figura 17 muestra análisis de las repuestas inmunes de IgG-i e lgG2a a inmunizaciones con ADN plasmídico intramuscular con y sin un vector, PCD40L, codificando para un ligando de molécula accesoria. Los anticuerpos anti-ß-gal lgG2a predominaron sobre los anticuerpos de subclase IgGi en los sueros de ratones inyectados ya sea con placZ y pcDNA3 o placZ t pCD40L. En contraste, los ratones BALB/c inyectados con proteína ß-gal desarrollaron predominantemente anticuerpos anti-ß-gal IgG-i, y no anticuerpos anti-ß-gal lgG2a detectables.

La figura 18 muestra la comparación entre la inyección de ratones con un vector pCD40L que codifica para un ligando de molécula accesoria, en el mismo y diferentes sitios que placZ. El efecto adyuvante de pCD40L requiere la co-inyección con placZ en el mismo sitio.

La figura 19 muestra que la co-inyección en la dermis de un vector que codifica para un ligando de molécula accesoria, pCD40L, con placZ, mejora la respuesta de anti-ß-gal IgG en ratones BALB/c.

La figura 20 muestra que un vector que codifica para un ligando de molécula accesoria, pCD40L, incrementa la capacidad de placZ para inducir CTL específica para células objetivo singénicas que expresan b-gal. Las células efectoras de spienocitos, tomadas de ratones que habían recibido inyecciones de placZ y pCD40L, usaron específicamente significativamente más células que los spienocitos de ratones que recibieron inyecciones control.

La figura 21 muestra la submodulación de CD40L humano, pero no de CD40L de murino; en líneas de células de tumor pulmonar que expresan CD40.

La figura 22A muestra que la unión de CD40 induce la expresión incrementada de los marcadores de superficie CD95 (Fas), CD54 (ICAM-1 ) y MHC-I de células tumorales, en líneas de células de tumor pulmonar. La figura 22B muestra la submodulación de células tumorales humanas positivas a CD40L y CD40.

La figura 23 muestra la inhibición de la expresión del ligando Fas por linfocitos en presencia de fluido sinovial RA.

La figura 24 muestra un esbozo de una prueba clínica de un ligando de molécula accesoria (CD40L) y tratamiento con terapia de genes para CLL de células B.

La figura 25 muestra una alineación de secuencias del ligando Fas humano con ligando Fas humano en el cual el dominio lll es reemplazado por el dominio lil del ligando Fas de murino. La secuencia de proteínas superior es el ligando Fas humano nativo. El dominio lll es subrayado con la línea punteada. El doble subrayado indica un sitio de corte MMP putativo. La secuencia de proteína inferior es la del ligando Fas de humano-ratón quimérico. El dominio lll del ligando Fas de ratón (subrayado con línea punteada) es substituido por el dominio lll del ligando Fas humano. Los números corresponden a la secuencia de aminoácidos usando 1 para el inicio de la secuencia de polipéptidos. El número de la primera base de nucléotidos para el codón que codifica para el aminoácido es 1+3x(n-1), en donde n es el número de secuencia de aminoácidos.

La figura 26 muestra una alineación de secuencias del ligando Fas de humano con ligando Fas de humano, en el cual el dominio lll ha sido reemplazado con el dominio lll de CD70 de humano. La secuencia de proteínas superior del ligando Fas de humano nativo y la secuencia inferior es la del ligando Fas quimérico, en el cual el dominio lll de CD70 de humano ha sido substituido por el dominio lll de Fas. Otros marcadores se usan de manera similar como en la figura 25.

La figura 27 muestra una alineación de secuencias del ligando Fas de humano con ligando Fas de humano, en el cual el dominio I ha sido reemplazado con el dominio lll de CD70 de humano. La proteína superior es el ligando Fas de humano nativo, y la secuencia de proteínas inferior es la del ligando Fas quimérico, en el cual el dominio lll ha sido reemplazado con el dominio I de CD70 de humano. Otras marcas se usan similarmente al igual que en la figura 25.

La figura 28 muestra los aminoácidos alrededor y en sitios de corte con metaloproteinasa de matriz (MMP) conocidos, según se describe en Smith, M. M. y otros, Journal of Biol. Chem. 270:6440-6449 (95) y Nagase, H. y G. B. Fields, Biopolymers (Peptide Science) 40:399-416 (96). El sitio de corte se indica con una flecha.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las referencias citadas en la presente se incorporan aquí en su totalidad a manera de referencia.

Definiciones Un "gen de ligando de molécula accesoria" es un gen que codifica para todo o parte de un ligando de molécula accesoria. El gen comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos necesaria para codificar para la porción funcional de un ligando de molécula accesoria. El gen puede incluir opcionalmente elementos genéticos tales como promotores, incrementadores y extremos 3'. El gen de ligando de molécula accesoria se deriva de un ligando que es un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT), incluyendo ligando CD40, ligando Fas, ligando CD70, FNTa, FNTß, ligando CD30, ligando 4-1 BB (4-1 BBL), ligando de factor de crecimiento nervioso y ligando inductor de apoptosis relacionada con FNT (TRAIL). Según se aquí, el término "gen de ligando de molécula accesoria" incluye genes quiméricos de ligando de molécula accesoria como los definidos abajo.

Según se usa aquí, el término "células malignas o células neoplásicas", se define como células malignas o cancerosas que se encuentran en un paciente humano o en un animal. Los tipos preferidos de células malignas o neoplásicas incluyen cualquier célula que presente antígenos malignos. En algunas modalidades preferidas, estas células que presentan antígenos malignos tienen por lo menos niveles bajos de CD40 presente sobre la superficie de la célula.

Según se usa aquí, el término "células humanas neoplásicas" se define como células humanas que son neoplásicas, incluyendo pero no limitadas a, células que presenten antígenos, cualquier célula neoplásica que pueda funcionar como una célula que presente un antígeno o que funcione para facilitar la presentación del antígeno, monocitos neoplásicos, macrófagos neoplásicos, células B neoplásicas, células dendríticas neoplásicas, células de Langerhans neoplásicas, células interdigitales neoplásicas, células dendríticas foliculares o células de Kupffer neoplásicas, y similares. La definición de células humanas neoplásicas incluye aquellas células que están asociadas con células neoplásicas en el lecho tumoral de pacientes humanos. Típicamente, las células humanas neoplásicas son leucemias, linfomas, AML, ALL, AMML, CML, CMML, CLL, otros tumores de células que presenten antígenos o células neoplásicas de mama, ovarios o pulmón. También se contempla que los genes de ligando de molécula accesoria o los genes quiméricos de ligando de molécula accesoria de la presente invención, puedan ser insertados en células somáticas. Estas células somáticas pueden crearse por un procedimiento de ingeniería genética que haya introducido en esas células genes que codifiquen para moléculas que hagan que esas células sean capaces de presentar antígenos al sistema inmune.

Según se usa en la presente, el término "gen quimérico" se define como un gen en el cual parte del mismo se deriva de un segundo gen diferente y se combina con el primer gen de manera tal que por lo menos una porción de cada gen esté presente en el gen quimérico resultante. Un gen puede ser quimérico si alguna porción de la secuencia que codifica para la proteína resultante se deriva de un segundo gen diferente. Los genes quiméricos típicos incluyen genes en los cuales los dominios funcionales específicos de un gen han sido transferidos a un segundo gen y reemplazan los dominios análogos de este segundo gen. Por ejemplo, el gen quimérico resultante puede tener un dominio derivado de un gen de murino y varios dominios derivados de un gen de humano. Estos dominios pueden variar de un tamaño de 5 aminoácidos a varios cientos de aminoácidos. Otros ejemplos de genes quiméricos de ligando de molécula accesoria incluyen genes que contienen nucleótidos que codifican para aminoácidos no encontrados en ningún gen de ligando de molécula accesoria que ocurra naturalmente. Ejemplos de genes quiméricos y de varias combinaciones potenciales de dominio son numerosos, y el experto en la técnica entenderá que no se establece limite alguno en la cantidad de un gen que debe estar presente en un segundo gen para hacerlo quimérico.

Según se usa en la presente, el término "gen de ligando CD40 de murino" se define como un gen de ligando de molécula accesoria que se deriva de un gen de ligando CD40 de murino. Ejemplos de dichos genes de ligando CD40 de murino incluyen el gen aislado por Armitage y otros, Nature, 357:80-82 (1992) y otros genes derivados de origen murino que hibridan con ej gen descrito por Armitage y otros bajo condiciones de hibridación de baja astringencia.

Según se usa en la presente, el término "vector o vector genético" se define como un ácido nucleico que es capaz de replicarse por sí mismo dentro de un organismo, tal como una bacteria o célula animal. Los vectores genéticos típicos incluyen los plásmidos usados comúnmente en tecnología de ADN recombinante, y varios virus capaces de replicarse dentro de células bacterianas o animales. Los tipos de vectores genéticos que se prefieren incluyen plásmidos, fagos, virus, retrovirus, y similares.

Según se usa en la presente, el término "vector para terapia de genes" se define como un vector genético que es capaz de infectar directamente células dentro de un animal, tal como un paciente humano. Se ha descrito en la literatura un número de vectores para terapia de genes, e incluyen el vector para terapia de genes descrito en Cantwell y otros, Blood. en prensa (1996), titulado "Adenovirus Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells". Dichos vectores han sido descritos, por ejemplo, por Woll, P. J. e I. R. Hart, Ann. Oncol .. supl. 6, 1 :73 (1995); Smith, K. T., A. J. Shepherd, J. E. Boyd y G. M. Lees, Gene Ther.. 3:190 (1996); Cooper, M. J., Semin. Oncol.. 23:172 (1996); Shaughnessy, E., D. Lu, S. Chatterjee y K. K. Wong, Semin. Oncol.. 23:159 (1996); Glorioso, J. C, N. A. DeLuca y D. J. Fink, Annu. Rev. Microbiol.. 49:675 (1995); Flotte, T. R. y B. J. Cárter, Gene Ther.. 2:357 (1995); Randrianarison-Jewtoukoff, V. y M.Perricaudet, Bioloaicals.. 23:145 (1995); Kohn, D. B., Curr. Opin. Pediatr.. 7:56 (1995); Vile, R. G. y S. J. Russell, Br. Med. Bull.. 51 :12 (1995); Russell, S. J., Semin. Cáncer Biol.. 5:437 (1994); y Ali, M., N. R. Lemoine y C. J. Ring, Gene Ther.. 1 :367 (1994). Todas las referencias citadas en la presente se incorporan aquí a manera de referencia.

II. Vectores genéticos y construcciones que contienen un gen de ligando de molécula accesoria A. Genes de ligando de molécula accesoria En una modalidad de la presente invención, los vectores para terapia de genes que se prefieren contienen un gen de ligando de molécula accesoria. Este gen de ligando de molécula accesoria puede derivarse de cualquier fuente, y puede incluir moléculas que sean hechas por el hombre y que no aparezcan en la naturaleza. La presente invención contempla genes de ligando de molécula accesoria que se derivan de los genes que codifican para moléculas dentro de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT), que incluyen los genes que codifican para: ligando CD40 de murino, ligando CD40 de humano, ligando Fas, ligando FNTa, FNT?, ligando CD30, ligando 4-1 BB, factor de crecimiento nervioso, CD70, ligando inductor de apoptosis relacionado con FNT (TRAIL) y ligandos quiméricos de molécula accesoria. La secuencia de nucleótidos de un ligando de molécula accesoria, la secuencia de por lo menos una forma del gen de ligando CD40 de murino, se ha determinado y se enlista como SEQ ID NO:1. La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a la secuencia presente en SEQ ID NO:1 , y que de esta manera hidride con esta secuencia bajo condiciones de hibridación de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo el gen de ligando CD40 de murino, útiles en la presente invención, pueden aislarse de varias cepas de murino diferentes.

La secuencia de nucleótidos de un gen de ligando CD40 de humano ha sido determinada, y se muestra como SEQ ID NO:2. La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a SEQ ID NO:2, y de esta manera hibride con su secuencia bajo condiciones de baja astringencia. Ei experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo los genes de ligando CD40 de humano, útiles en la presente invención, pueden variar dependiendo del individuo del cual se aisle el gen, y dichas variaciones pueden ser útiles para producir genes de ligando de molécula accesoria únicos. La presente invención contempla el uso de los dominios, subdominios, secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos del gen de ligando CD40 de humano o del ligando CD40 de humano, como parte de un ligando quimérico de molécula accesoria o de un gen de ligando quimérico de molécula accesoria. La secuencia de nucleótidos de un gen de ligando CD40 de bovino ha sido determinada, y se muestra como SEQ ID NO:8. La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a SEQ ID NO:8 y de esta manera hibride con la secuencia bajo condiciones de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo los genes de ligando CD40 de bovino, pueden variar dependiendo del animal individual del cual se aisle el gen, y que dichas variaciones pueden ser útiles para producir genes de ligando de molécula accesoria únicos.

La secuencia de nucleótidos del FNTa humano y del FNTß de humano se han determinado, y se muestran como SEQ ID NOS: 9 y 10, respectivamente. La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria el cual sea homólogo ya sea al FNTa de humano o al FNTß de humano (SEQ ID NOS: 9 y 10, respectivamente), y de esta manera hibride con estas secuencias bajo condiciones de baja astringencia. Los genes de ligando de molécula accesoria útiles en la presente invención, incluyendo los genes de FNTa y FNTß de humano, pueden variar dependiendo del individuo en particular del cual se haya aislado el gen, y estas variaciones pueden ser útiles para producir genes de molécula accesoria únicos. La secuencia de nucleótidos de FNTa y FNTß de porcino ha sido determinada, y se muestra como SEQ ID NO: 1 1. La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a SEQ ID NO: 11 , y de esta manera hibride con estas secuencias bajo condiciones de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo los genes de FNTa y FNTß de porcino pueden variar, dependiendo del animal en particular del cual se aisla el gen, y que dicha variación puede ser útil para producir genes de molécula accesoria únicos.

Se ha determinado la secuencia de nucleótidos de un gen de FNTa de murino, y se muestra como SEQ ID NO: 12. La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a SEQ ID NO: 12, y de esta manera hibride con la secuencia bajo condiciones de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo el gen de FNTa de murino pueden variar, dependiendo del individuo del cual se aisle el gen, y que estas variaciones pueden ser útiles para producir genes de molécula accesoria únicos. Se ha determinado la secuencia de nucleótidos del ligando Fas de humano y del ligando Fas de murino (C57BLJ6), y se muestra como SEQ ID NOS: 13 Y 14, respectivamente. La secuencia de nucleótidos del ligando Fas de ratones Balb/c y de murino se muestra como SEQ ID NO: 31. La presente invención contempla el uso del gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a cualquiera de SEQ ID NOS: 13, 14 y 31 , y que de esta manera hibride con las secuencias bajo condiciones de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo los genes del ligando Fas de humano o del ligando Fas de murino pueden variar, dependiendo del individuo o el animal particular el cual se aisle el gen, y que dichas variaciones pueden ser útiles para producir cualesquiera genes de molécula accesoria. Se ha determinado la secuencia de nucleótidos de un gen de CD70 de humano, y se muestra como SEQ ID NO: 15. La secuencia dei gen de CD70 de murino también ha sido determinada, y se muestra como SEQ ID NO: 36 y fue descrita por Tesselaar y otros, J. Immunol. 159:4959-65 (1997). La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a SEQ ID NO: 15 o 36, y que de esta manera hidride con esta secuencia bajo condiciones de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo el gen de CD70 de humano pueden variar, dependiendo del individuo del cual se aisle el gen, y que estas variaciones pueden ser útiles para producir genes de ligando de molécula accesoria únicos. Se ha determinado la secuencia de nucleótidos del gen del ligando CD30 de humano, y se muestra como SEQ ID NO: 16. La presente invención contempla el uso de cualquier gen de ligando de molécula accesoria que sea homólogo a SEQ ID NO: 16, y que de esta manera hidride con esta secuencia bajo condiciones de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que el gen de ligando de molécula accesoria, incluyendo el gen de CD30 de humano puede variar, dependiendo del individuo del cual se aisle el gen, y que dichas variaciones pueden ser útiles para producir genes de ligando de molécula accesoria únicos. La presente invención contempla también variaciones y variantes de las secuencias de nucleótidos de genes de ligando de molécula accesoria provistas en la presente, las cuales son ocasionadas mediante el corte alternativo del ARN mensajero. Este corte alternativo del ARN mensajero inserta secuencias de nucleótidos adicionales que pueden codificar para uno o más segmentos de aminoácidos opcionales que a su vez permitan que el gen de ligando de molécula accesoria codificado tenga propiedades o funciones adicionales. La secuencia de nucleótidos de un 4-1 BBL de humano y de ratón se muestra como SEQ ID NOS: 17 y 18, respectivamente. La presente invención contempla el uso de cualquier ligando de molécula accesoria homólogo a SEQ ID NOS: 17 o 18, y de esta manera hidride con estas secuencias bajo condiciones de baja astringencia. El experto en la técnica entenderá que los genes de ligando de molécula accesoria, incluyendo el gen de 4-1 BBL de humano puede variar, dependiendo del individuo del cual se aisle, y que esas variaciones pueden ser útiles para producir genes de ligando de molécula accesoria únicos. La presente invención contempla también moléculas accesorias quiméricas que contienen cualquier dominio, porción de subdominio o secuencia de aminoácidos codificada por los siguientes genes: FNT-a (SEQ ID NO: 21) de bovino, ligando CD40 de murino (SEQ ID NO: 22), factor ß de crecimiento nervioso humano (SEQ ID NO: 23), factor de crecimiento nervioso de murino (SEQ ID NO: 24), ligando Fas de rata (SEQ ID NO: 25), ligando inductor de apoptosis relacionado con FNT de humano (TRAIL) (SEQ ID NO: 41 , número de acceso del banco de genes U37518), ligando inductor de apoptosis relacionado con FNT de murino (TRAIL) (SEQ ID NO: 42, número de acceso del banco de genes U37522), ligando CD30 de murino (SEQ ID NO: 43), 4-1 BBL de humano (SEQ ID NO: 17) y 4-1 BBL de murino (SEQ ID NOS: 44 y 18). La presente invención contempla también moléculas accesorias quiméricas que utilicen genes que codifiquen para secuencias de aminoácidos homologas a estas secuencias. La presente invención contempla genes quiméricos de ligando de moléculas accesorias que comprendan un segmento de nucleótidos derivado de un gen de ligando de molécula accesoria enlazado operablemente a una secuencia de nucleótidos obtenida a partir de un gen de ligando de molécula accesoria diferente o de otro gen.

Por ejemplo, están contemplados los genes de ligando de molécula accesoria quimérica los cuales comprenden un segmento de ligando CD40 de murino el cual ha sido enlazado operativamente a al menos otro segmento de gen adicional obtenido de un gen de ligando de molécula accesoria diferente. El tamaño del segmento particular obtenido del gen de ligando de molécula accesoria diferente puede variar desde una secuencia de nucleótido que codifica unos cuantos aminoácidos, un subdominio de ligando de molécula accesoria, un dominio de ligando de molécula accesoria o más de un dominio de un ligando de molécula accesoria. Otras moléculas accesorias quiméricas de la presente invención están comprendidas de un gen de ligando de molécula accesoria en el cual se han insertado los nucleótidos que codifican un segmento de aminoácido que no se encuentra como parte de un ligando de molécula accesoria que se presenta en la naturaleza. Este segmento de aminoácido puede ser creado artificialmente u obtenido a partir de una proteína encontrada en la naturaleza. El gen de ligando de molécula accesoria quimérico codifica una secuencia de aminoácido quimérica y de esta manera un ligando de molécula accesoria quimérica puede poseer propiedades únicas además de las propiedades encontradas en los segmentos individuales obtenidos a partir de los genes de ligandos de molécula accesoria diferentes. El gen de ligando de molécula accesoria quimérico puede codificar un ligando de molécula accesoria que tiene propiedades obtenidas a partir del ligando de molécula accesoria utilizada para construir el gen quimérico. Cada uno de los genes de ligando de molécula accesoria que son un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral tienen una estructura secundaria similar que consiste de un número de dominios. Esta estructura de dominio incluye un primer dominio que es codificado por la región 5' del gen de ligando de molécula accesoria. El segundo dominio (Dominio II) es el dominio que contiene los aminoácidos que abarcan la membrana celular y son denominados de esta manera el dominio transmembrana. El tercer (Dominio lll) es el dominio extracelular proximal y estos aminoácidos son los aminoácidos que se encuentran próximos a la membrana celular. El cuarto dominio (Dominio IV), está codificado por el extremo 3' del gen de ligando de molécula accesorio y ha sido denominado el dominio extracelular distal. El dominio extracelular distal (Dominio IV) generalmente constituye la forma soluble de la molécula de la familia del factor de necrosis tumoral. Basándose en la estructura cristalina de rayos x de TNF humano, la estructura secundaria predicha de la molécula accesoria, se ha deducido al ligando CD40 junto con la estructura de dominio de estas moléculas por Peitsch and C. Jongeneel, International Immunology. 5:233-238 (1993). Las estructuras secundarias de los otros elementos de la familia del factor de necrosis tumoral se dedujeron utilizando análisis por computadora junto con la comparación con la estructura de dominio del TNF humano y el ligando CD40. En el cuadro 1 , se muestra los límites de dominio de un número de genes de ligando de molécula accesoria. Un diagrama de estos dominios para un número de estos ligandos de molécula de célula accesoria se muestra en la figura 1. Las designaciones de los límites del dominio son aproximados y un experto en la técnica entenderá que estos límites pueden variar y sin embargo pueden todavía proveer identificación útil de los dominios.

CUADRO 1 ESTRUCTURA DEL DOMINIO DE MOLÉCULAS DE LA FAMILIA DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL * Los dominios anteriores se han identificado por los limites de nucleótido de cada dominio utilizando el primer nucleótido de la metionina inicial de ADNc como el nucleótido número 1.

Un experto en la técnica entenderá que los genes de molécula accesoria quiméricos podrían incluir genes producidos por el intercambio de dominios o segmentos de subdominio entre, por ejemplo, un ligando CD40 de ratón y un gen de ligando CD40 humano. Por ejemplo, ei gen de molécula accesoria quimérico puede ser construido mediante el enlazamiento operativo del Dominio I del gen de ligando CD40 humano a los dominios ll-IV del gen de ligando CD40 de murino. Un experto en la técnica entenderá que la variedad de genes de ligando de molécula accesoria quiméricos que podrían ser producidos utilizando las moléculas accesorias identificadas en el cuadro 1. La presente invención contempla también moléculas accesorias quiméricas que no se muestran en el cuadro 1 pero las cuales muestran tener una estructura de dominio similar. Otros genes quiméricos también están contemplados en los cuales los segmentos más pequeños (segmentos de subdominio) son intercambiados entre, por ejemplo, un gen de ligando CD40 de murino y un gen de ligando CD40 humano o un segundo gen de ligando CD40 de murino. Un experto en la técnica en tenderá que los genes que codifican las moléculas accesorias tendrán al menos segmentos génicos que correspondan a diversos segmentos funcionales de un ligando de molécula accesoria tal como el ligando CD40 de murino codificado por el gen de ligando CD40 de murino (SEQ ID NO: 1 ). Será también aparente para un experto en la técnica que los límites de nucleótido identificados en el cuadro 1 pueden variar considerablemente de aquellos identificados para el gen de ligando CD40 de murino (SEQ ID NO: 1 ) y sin embargo todavía definen dominios que son útiles en la presente invención. En una modalidad preferida, el de ligando de molécula accesoria quimérico está compuesto de los nucleótidos que codifican los dominios extracelulares (Dominios lll y IV) del ligando CD40 humano enlazado operativamente a los nucleótidos que codifican al de transmembrana (Dominio II) y los nucleótidos que codifican el dominio citoplásmico (Dominio l) del gen de ligando CD40 de murino. Ejemplos de tales moléculas accesorias quiméricas se muestran en la figura 2. Una secuencia de nucleótido de ejemplo para dicho gen es SEQ ID NO: 7. En otros genes de ligando de molécula accesoria quiméricos de la presente invención, los nucleótidos que codifican los dominios extracelulares (Dominios III y IV) del gen del ligando CD40 de murino pueden estar enlazados operativamente a los nucleótidos que codifican los dominios de transmembrana (Dominio II) y citoplásmicos (Dominio I) del gen de ligando CD40 humano. Una secuencia de nucleótido de ejemplo para dicho gen es SEQ ID NO: 3. En otros genes preferidos de ligando de molécula accesoria quiméricos de la presente invención, los nucleótidos que codifican los dominios extracelulares (Dominios lll y IV) y el dominio de transmembrana (Dominio II) del ligando CD40 humano están acoplados a los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático (Dominio I) del gen de ligando CD40 de murino. Una secuencia de nucleótido de ejemplo para dicho gen es SEQ ID NO: 6. Otros genes de molécula accesoria quiméricos contemplados por la presenten invención comprenden los nucleótidos que codifican los dominios extracelulares (Dominios lll y IV) y el dominio transmembrana (Dominio I) del gen de ligando CD40 de murino enlazado operativamente a los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático del gen de ligando CD40 humano. Una secuencia de nucleótido de ejemplo para dicho gen es SEQ ID NO: 5. Otros genes de ligando de molécula accesoria quiméricos están contemplados por la presente invención en los cuales los dominios extracelulares del gen de ligando CD40 humano (Dominios lll y IV) están operativamente enlazados al dominio de transmembrana del gen de ligando CD40 de murino (Dominio I) el cual está operativamente enlazado al dominio citoplásmico (Dominio I) del gen de ligando CD40 humano. Una secuencia de nucleótido ejemplar para dicho gen es SEQ ID NO: 4. Un experto en la técnica entenderá que son posibles muchas más combinaciones que utilizan dominios u otros segmentos seleccionados de cualquiera de los genes de ligando de molécula accesoria incluyendo los genes de ligando CD40 humano y los genes de ligando CD40 de ratón. Tales genes de molécula accesoria quiméricos podrían incluir los siguientes genes: genes de molécula accesoria quiméricos en los cuales los nucleótidos que codifican al Dominio I se seleccionan de un gen de ligando de molécula accesoria particular y enlazado operativamente, ya sea directamente o mediante una secuencia de nucleótido adicional a los nucleótidos que codifican el Dominio II provenientes de un gen de ligando de molécula accesoria particular. Estos dominios entonces estarían enlazados operativamente ya sea directamente o mediante una secuencia de nucléotido adicional a los nucleótidos que codifican al Dominio lll proveniente de un gen de ligando de molécula accesoria particular. Esta molécula estaría entonces operativamente enlazada ya sea directamente o mediante una secuencia de nucleótido adicional a los nucleótidos que codifican al Dominio IV de un gen de ligando de molécula accesoria particular. El gen de ligando de molécula accesoria quimérico construido en esta manera podría tener nucleótidos adicionales en cualquier extremo o entre los dominios que son útiles para proveer diferentes aminoácidos en estas posiciones. Un experto en la técnica entenderá que estas combinaciones particulares son únicamente ilustraciones y que se podrían contemplar algunas otras combinaciones en las cuales los segmentos génicos que constan de nucleótidos que codifican menos que el dominio entero de una molécula accesoria son intercambiados entre moléculas accesorias diferentes. La presente invención contempla además genes de ligando de molécula accesoria quiméricos los cuales están compuestos de segmentos génicos del ligando CD40 de ratón o de humano en combinación con los segmentos de gen derivados a partir del ligando Fas, TNFa, TNFß, CD70, CD30L, 4-1 BBL, factor de crecimiento de nervio o ligando inductor de apoptosis relacionada a TNF (TRAIL). Los genes de ligando de molécula accesoria quiméricos particularmente útiles comprenden al menos un segmento génico que se obtiene a partir de un gen de ligando CD40 de murino junto con segmentos génicos o un segmento de gen obtenido a partir de un gen de ligando de molécula accesoria diferente. La presente invención contempla además genes de ligando de molécula accesoria quiméricos en los cuales las moléculas accesorias producidas han sido modificadas para remover aminoácidos dentro de la molécula accesoria quimérica que son utilizados por mecanismos de posttraducción para regular el nivel de expresión de la molécula accesoria o la proteína de molécula accesoria en una célula particular. Los sitios removidos de las moléculas accesorias quiméricas o molécula quimérica pueden incluir aminoácidos o sitios que constituyen los sitios de corte con proteasa incluyendo metalotionina proteasas, serina-proteasas y otras proteasas que reconocen una secuencia de aminoácido ya sea de manera específica o de manera no específica. En las modalidades particularmente preferidas, los aminoácidos en el Dominio lll que constituyen sitios normales o potenciales de reconocimiento utilizados por los mecanismos reguladores de post-traducción han sido modificados o retirados. La presente invención contempla además genes de ligando de molécula accesoria quiméricos en los cuales los dominios, fragmentos de subdominio u otros residuos de aminoácido han sido tomados de un gen de ligando de molécula accesoria y movidos hacia un segundo gen de ligando de molécula accesoria proveniente de la misma especie. Por ejemplo, en esta modalidad particular, el Dominio I humano, y el Dominio II humano provenientes de la molécula del ligando CD40 pueden estar enlazados operativamente a los nucleótidos que codifican el Dominio lll humano de por ejemplo, la molécula CD70 la que a su vez está operativamente enlazada al Dominio IV humano para la molécula del ligando CD40. Esta molécula accesoria quimérica por lo tanto contiene los Dominios I, II y IV de CD40L y el Dominio lll CD70 humano. Una secuencia de nucleótido de ejemplo para tal gen es SEQ ID NO: 19. Un experto en la técnica entenderá que un número de tales combinaciones utilizando dominios provenientes de la misma especie a partir de genes de ligando de molécula accesoria diferentes podría crear un número de genes de molécula accesoria quiméricos los cuales podrían todos tener actividades y propiedades específicas. La presente invención contempla genes de ligando de molécula accesoria quiméricos en los cuales el Dominio lll de un gen de ligando de molécula accesoria particular ha sido reemplazado con un Dominio lll proveniente de un gen de ligando de molécula accesoria diferente. En una modalidad particularmente preferida, el Dominio lll de ratón ha sido utilizado para reemplazar el Dominio lll humano en la molécula de ligando CD40. Esta molécula accesoria quimérica por lo tanto contiene el Dominio I de CD40L humano, el Dominio II de CD40L humano, el Dominio lll de CD40L de ratón, y el Dominio IV de CD40L humano. Una secuencia de nucleótido de ejemplo para dicho gen es SEQ ID NO: 20. La presente invención contempla también la utilización de moléculas accesorias quiméricas que contienen secuencias de aminoácidos construidas por el hombre insertadas en o en lugar de una porción de un dominio u otra secuencia de aminoácido de un gen de molécula accesoria. Estos segmentos de aminoácido hechos por ei hombre pueden ser creados seleccionando cualquier secuencia de aminoácido que pudiera ser utilizada para proporcionar a la molécula accesoria una función particular o para retirar otra función no deseada. Estos segmentos de aminoácido hechos por el hombre son producidos insertando en el gen de ligando de molécula accesoria o en el gen de ligando de molécula accesoria quimérica las secuencias de nucleótidos requeridas para codificar aquellos segmentos de aminoácido hechos por el hombre en las posiciones deseadas. Además, los genes de ligando de molécula accesoria quiméricos pueden contener segmentos de nucleótido que comprenden segmentos del subdominio de otras moléculas o segmentos pequeños en los cuales los aminoácidos han sido cambiados para un propósito deseado. La utilización de segmentos de nucleótido de subdominio permiten la introducción de secuencias cortas de aminoácido obtenidas a partir de otras moléculas en moléculas accesorias quiméricas de la presente invención. La incorporación de tales segmentos cortos del subdominio o cambios de aminoácido en el ligando de molécula accesoria permite la introducción de características deseadas o el retiro de características no deseadas de esa molécula. La identificación de las estructuras de dominio dentro de las moléculas de célula accesorias en bien conocido en ia técnica y generalmente requiere la identificación de residuos de cisteina dentro de las moléculas accesorias y el mapeo subsecuente de los enlaces disulfuro entre diversos residuos de cisteina. El mapeo de los diversos segmentos de subdominio de una molécula accesoria es bien conocido en la técnica e implica el análisis de la secuencia de aminoácido de las moléculas accesorias y generalmente implica una comparación de la estructura cristalina del factor de necrosis de tejido con la utilización de algoritmos para predicción con lo cual se produce una estructura predicha de una molécula accesoria quimérica o una molécula accesoria. Esta estructura predicha de estas moléculas puede después ser utilizada para seleccionar diversas porciones del subdominio de la molécula que se va a utilizar para construir moléculas accesorias quiméricas adicionales. Ejemplos de tales estudios de mapeo incluyen los estudios elaborados por M. Pitsch y C. V. Jongeneel, International Immunoloqy, 5:233-238 (1993) y el análisis mostrado en la figura 1. La presente invención contempla además genes de ligando de molécula accesoria y genes de ligando de molécula accesoria quiméricos los cuales están truncados y codifican menos de la longitud completa de la secuencia de aminoácido encontrada en el ligando de molécula accesoria nativo. Estos truncamientos pueden alterar las propiedades del gen de ligando de molécula accesoria pero conservan cierta actividad identificada. Tales truncamientos pueden hacerse removiendo un segmento de gen o segmentos de gen del gen de molécula accesoria y típicamente serán realizados por remoción de los nucleótidos que codifican los dominios que no están directamente implicados en el enlazamiento del ligando de molécula accesoria con su molécula accesoria. Estos genes de ligando de molécula accesoria truncados o genes de ligando de molécula accesoria quimérica truncados pueden contener segmentos de gen adicionales que codifican segmentos de aminoácido o dominios que reemplazan los dominios retirados de los genes de molécula accesoria truncados. Sin embargo, tales reemplazos de las porciones de la molécula accesoria removidos por truncación no es necesario. Los genes de molécula accesoria quiméricos de la presente invención pueden ser construidos utilizando métodos de manipulación genética estándares para enlazar operativamente una secuencia de nucleótido particular proveniente de un gen de ligando de molécula accesoria a una secuencia de nucleótido diferente obtenida a partir de la misma o de genes de ligando de molécula accesoria diferentes. Además, los métodos de manipulación genética estándares pueden ser utilizados para insertar secuencias de nucleótido hechas por el hombre o secuencias de nucleótido de subdominio en el gen de ligando de molécula accesoria quimérico. Un experto en la técnica entenderá que se pueden utilizar diversos métodos para producir tales genes de molécula accesoria quiméricos. Por ejemplo un método de conversión génica conocido como "SOEN" puede ser utilizado para producir un gen de molécula accesoria quimérico que contenga los segmentos de nucleótido obtenidos a partir de diferentes moléculas accesorias quiméricas. Los métodos para utilizar este método de conversión de gen son bien conocidos en la técnica y han sido descritos por ejemplo en Horton, R. M., Mol. Biotechno 3:93 (1995); Ali, S. A. y A. Steinkasserer, Biotechniques. 18:604 (1995); Vilardaga, J:P:, E. Di Paolo Y A. Bollen. Biotechnigues. 18:604 (1995); Majumder, K., F. A. Fattah, A. Selvapandiyan, y R:K: Bhatnagar, PCR. Methods Appl.. 4:212 (1995); Boles, E. y T. Miosga, Curr. Genet. 28:197 (1995); Vallejo, A. N., R. J. Pogulis, y L. R. Pease, PCR. Methods Appl.. 4:S123 (1994); Henkel T. y P.A. Baeuerle, Anal. Biochem.. 214:351 (1993); Tessier, D. C. y D. Y. Thomas, Biotechniques. 15:498 (1993); Morrison, H. G. y R. C. y Desrosiers, Biotechniques. 14:454 (1993); Cadwell, R.C. y G. F. Joyce, PCR. Methods Appl.. 2:28 (1992); y Stappert, J., J. Wirsching, y R. Kemler, Nucleic Acids Res.. 20:624 (1992). Alternativamente, un experto en la técnica entenderá que la mutagenesis dirigida al sitio puede ser utilizada para introducir cambios en una secuencia de nucleótido particular para producir directamente o ser utilizado indirectamente para producir un gen de molécula accesoria quimérico de la presente invención. Por ejemplo, el equipo de mutageno provisto por BioRad Laboratories puede ser utilizado junto con los métodos y protocolos descritos dentro de ese equipo para producir los cambios deseados en la secuencia de nucleótido. Estos métodos se describieron originalmente por Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 82:488-492 (1985) y Kunkel y otros., Meth. Enzol. Mol.. 154:367-382 (1987). Al utilizar los protocolos de mutagenesis dirigida al sitio descritos en la presente y conocidos en la técnica, un investigador experto podría inducir cambios de nucleótidos individuales los cuales resultarían en una secuencia de aminoácido alterada o los cuales conservarían una secuencia de aminoácido pero introducirían una secuencia de reconocimiento de restricción de enzima deseada en el gen. Este nuevo sitio de reconocimiento de restricción de endonucleasa podría ser después utilizado para cortar el gen en un punto particular y usarlo para un gen o segmento de otro gen de ligando de molécula accesoria. En adición a estos métodos, un experto en la técnica entenderá que un gen de ligando de molécula accesoria quimérico completo podría ser sintetizado utilizando métodos sintéticos conocidos en la técnica. Esta metodología requiere únicamente que el experto genere una secuencia de nucleótido de un gen de ligando de molécula accesoria quimérico y provea esa secuencia a una compañía que sea capaz de sintetizar dicho gen.

B. Construcciones genéticas La presente invención contempla la utilización de genes de ligando de moléculas accesorias o genes de ligando de molécula quiméricos los cuales están presentes en diversos tipos de vectores genéticos. Un vector genético se refiere a una molécula de ADN que pueda replicarse de manera autónoma en una célula en la cual otros segmentos de ADN pueden ser insertados para ocasionar que los segmentos de ADN adicionales se repliquen. Los vectores que pueden expresar los genes contenidos en ese vector son conocidos como "vectores de expresión". Por lo tanto, los vectores genéticos y los vectores de expresión de la presente invención son moléculas de ADN recombinantes que constan de al menos dos secuencias de nucleótidos que normalmente no se encuentran juntas en la naturaleza. Los vectores genéticos útiles en la presente invención contienen un gen de ligando de molécula accesoria el cual codifica un ligando de molécula accesoria que esta opcionalmente enlazada de manera operativa a una secuencia de nucleótido de traducción o de regulación de translación apropiada, tal como una obtenida a partir de un gen de mamífero, de microbio, viral o de insecto. Tales secuencias reguladoras incluyen secuencias que tienen un papel regulador en la expresión de gen, tal como un promotor o incrementador de transcripción, una secuencia operadora para controlar la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de enlazamiento a ribosomas dentro del ARN mensajero y secuencias apropiadas que controlan la transcripción, traducción, iniciación o terminación de la transcripción. Las secuencias reguladoras particularmente útiles incluyen las regiones promotoras provenientes de varios genes de mamífero, vírales, microbianos y insectos. La región de promotor dirige una iniciación de la transcripción del gen y ocasiona la transcripción del ADN a través de e incluyendo el gen de ligando de molécula accesoria. Las regiones promotoras útiles incluyen el promotor encontrado en el virus de Sarcoma de Rous (RSV)-la repetición terminal larga (LTR), aumentador de citomegalovirus humano (HCMV)/promotores lac de la región promotora, y promotores aislados provenientes de adenovirus y cualquier otro promotor conocido por el experto en la técnica se entendería que son útiles para la expresión genica en eucariotas, procariotas, virus o células microbianas. Otros promotores que son particularmente útiles para expresar genes y proteínas dentro de células eucarioticas incluyen secuencias de promotor de célula de mamífero y secuencias incrementadoras tales como aquellas obtenidas a partir del virus de polioma, adenovirus, virus de simio 40 (SV40), y el citomegalovirus humano. Particularmente útiles son los promotores vírales tempranos y tardíos que son típicamente encontrado adyacentes al origen viral de replicación en virus tales como SV40. Ejemplos de diversos promotores que han sido utilizados en vectores de expresión han sido descritos por Okiama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983), el pMLSVN SV40, descrito por Kossman y otros., Nature 312:768 (1984). Un experto en la técnica entenderá que la selección de un promotor particular útil depende de las líneas celulares exactas y de algunos otros parámetros de la construcción genética que se va utilizar para expresar el gen de ligando de molécula accesoria o el gen de ligando de molécula accesoria quimérico dentro de una línea celular particular. Además, un experto en la técnica seleccionará un promotor que se sabe expresa genes en la célula objetivo a un nivel suficientemente elevado para que sea útil en la presente invención. Los vectores genéticos y vectores de expresión de la presente invención opcionalmente contienen diversas secuencias reguladoras adicionales que incluyen sitios de unión a ribosoma los cuales permiten la traducción eficiente del ARN mensajero producido a partir de un vector de expresión en las proteínas, la secuencia de ADN que codifica diversas señales péptidas que pueden estar enlazadas operativamente al gen de ligando de molécula accesoria o al gen de ligando de molécula accesoria quimérico. El péptido de señal, si está presente, está expresado como un aminoácido precursor que permite la secreción extra celular mejorada del polipéptido de fusión de traducción. Las construcciones genéticas contempladas por la presente invención por lo tanto incluyen diversas formas de genes de ligando de molécula accesoria descritas anteriormente que están operativamente enlazadas ya sea a la secuencia de promotor o a una secuencia de promotor e incrementador y además están operativamente enlazadas a una secuencia de poliadenilación que dirige la terminación y poliadenilación del ARN mensajero. Esta también contemplado que las construcciones genéticas de la presente invención contendrán otras secuencias genéticas que permitan la replicación eficiente y la expresión de esa construcción dentro de las células deseadas. Dicha secuencia puede incluir ¡ntrones que sean derivados de genes nativos de ligando de molécula accesoria o, por ejemplo, de un gen de virus. La presente invención contempla también vectores para terapia de genes que son capaces de infectar directamente células de mamíferos para introducir el gen de ligando de molécula accesoria deseado o el gen quimérico de ligando de molécula accesoria en esa célula. Estos vectores para terapia de genes son útiles para infectar directamente células que hayan sido aisladas de un animal o paciente, o pueden introducirse directamente en un animal o paciente, y de esta manera infectar directamente la célula deseada dentro de ese animal o paciente.

Se han desarrollado y descrito en la literatura muchos tipos de vectores para terapia de genes que están disponibles para transferir exitosamente genes y ocasionar la expresión de secuencias de ADN extrañas deseadas. Por ejemplo, el artículo titulado "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" en Current Comm. Mol. Biol.. Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1987). Además, el ADN desnudo puede introducirse físicamente en células eucarióticas incluyendo células humanas por transfección, utilizando cualquier número de técnicas, incluyendo la transfección con fosfato de calcio (Berman y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 81:7176 (1984)), transfección de DEAE-Dextrano, fusión de protoplastos (Deans y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 81 :1292 (1984)), electroporación, fusión de liposoma, transfección de polibreno y transferencia de genes directa por micropuntura láser de la membrana de la célula. Además, un experto en la técnica comprenderá que cualquier técnica que sea capaz de introducir exitosamente el ADN en una célula de manera tal que se permita que ésta se integre en el genoma de una célula y permita la expresión del gen deseado sería útil en ia presente invención. Específicamente, se han descrito ampliamente vectores para terapia de genes que utilizan partículas recombinantes de virus infecciosos para el suministro de genes. Véase, por ejemplo, Brody, S. L. y R. G. Crystal, Ann. N. Y. Acad. Sci.. 716:90 (1994); Srivastava, A., Blood. Cells. 20:531 (1994); Jolly, D., Cáncer Gene Ther.. 1 :51 (1994); Russell, S. J., Eur. J. Cáncer. 30A:1165 (1994); Yee, J.K., T. Friedmann, y J.C. Burns, Methods Cell Biol.. 43 Pt A:99 (1994); Boris-Lawrie, K. A. y H. M. Temin, Curr. Qpin. Genet. Dev.. 3:102 (1993); Tolstoshev, P., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.. 33:573 (1993); y Cárter, B. J., Curr. Opin. Biotechnol.. 3:533 (1992). La presente invención contempla el uso de vectores para terapia de genes para llevar a cabo la metodología deseada de la presente invención introduciendo un gen que codifique para un gen de ligando de molécula accesoria o un gen quimérico de ligando de molécula accesoria en la célula. Diversos vectores virales se han definido y utilizado como vectores para terapia de genes e incluyen vectores de virus derivados de virus 40 de simio (SV40), adenovirus, virus adeno-asociados, y retrovirus. Un experto en la técnica entenderá que los vectores para terapia de genes útiles son vectores que son capaces de introducir directamente en las células objetivo el ADN que codifica para el ligando de molécula accesoria y permiten que el ADN persista en la célula para expresar el ligando de molécula accesoria de la manera deseada dentro de la célula. Los vectores para terapia de genes de la presente invención son útiles para introducir genes de ligando de molécula accesoria en una variedad de células de mamíferos, incluyendo células humanas. Las células particulares infectadas por el vector para terapia de genes dependerán de los diversos puntos específicos del vector, y tales vectores pueden utilizarse para introducir los genes de ligando de molécula accesoria de la presente invención en células madre hematopoyéticas o linfoides, células que presenten antígenos, células madre embriónicas, y otras células que sean capaces de presentar antígenos dentro del sistema inmunológico, incluyendo células que tienen CD40 sobre su superficie. Además, dichos vectores para terapia de genes son capaces de introducir un gen que codifique para un gen de ligando de molécula accesoria en una célula neoplásica humana tal como una célula de linfoma, leucemia, AML, CLL, CML, AMML, CMML, de cáncer de mama, de cáncer de pulmón, de cáncer ovárico o de cualquier tumor capaz de actuar como células que presenten antígenos o células que puedan estimular células espectadoras que presenten antígenos. Además, los vectores para terapia de genes contemplados pueden utilizarse para introducir los genes de ligando de molécula accesoria de la presente invención en células que se hayan diseñado para hacer aquéllas células capaces de presentar antígenos al sistema inmunológico. lll. Células que contienen construcciones genéticas que codifican para un ligando de molécula accesoria o ligando guimérico de molécula accesoria La presente invención también contempla varias células que contienen las construcciones genéticas de la presente invención. Estas células contienen las construcciones que codifican para el gen de ligando de molécula accesoria y de esta manera contienen los diferentes elementos genéticos descritos en la sección II B anterior. Estas células pueden ser células microbianas, células eucarióticas, células de insectos, y varias células de mamíferos, incluyendo células humanas. En modalidades preferidas de la presente invención, estas células incluyen varias células neoplásicas, incluyendo células neoplásicas humanas. Estas células neoplásicas pueden ser de cualquier tipo celular e incluyen células del sistema inmunológico, y otras células de la sangre. En particular las células neoplásicas que se prefieren son las que pueden funcionar como células que presentan antígeno dentro del sistema inmunológico, o que pueden estimular a las células espectadoras que presentan antígeno mediante expresión de una molécula de célula accesoria transgénica de la presente invención. Típicamente estas células neoplásicas que pueden funcionar para presentar antígenos al sistema ¡nmunológics tienen o han tenido una molécula accesoria, tal como la molécula CD40, sobre la superficie de la célula. Generalmente, estas células son capaces de presentar antígeno al sistema inmunológico por naturaleza, pero la presente invención también contempla la introducción de genes de ligando de molécula accesoria en una célula que no sea capaz de presentar antígenos al sistema inmunológico por naturaleza, pero que se han diseñado genéticamente para hacer que la célula sea capaz de presentar antígenos al sistema inmunológico. Típicamente, éstas células incluyen varios tipos de células conocidos tales como monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares ó células de Kupffer y similares, que se hayan vuelto neoplásicas. Además, la presente invención también contempla células de varios cánceres, como carcinomas, de mama, ovárico y de pulmón que contienen las construcciones genéticas descritas en la presente. En otras modalidades preferidas, un gen de ligando de molécula accesoria de la presente invención se coloca dentro de las células que pueden inyectarse en un sitio de tratamiento, como un lecho tumoral o articulación. Por ejemplo, el gen de ligando de molécula accesoria de la presente invención puede insertarse en una célula de fibroblasto y el ligando de molécula accesoria expresarse sobre la superficie de esa célula. Los fibroblastos son después inyectados en el sitio de tratamiento y ocasionan el efecto inmunológico deseado debido a la presencia del ligando de molécula accesoria en la superficie de dichas células. Estas células estimulan a otras células inmunes presentes en ese sitio de tratamiento (células espectadoras). Este proceso entonces da como resultado ei efecto deseado en el sistema inmunológico.

IV Métodos gue utilizan vectores genéticos y construcciones gue contienen un gen de ligando de molécula accesoria. La presente invención contempla métodos para alterar la inmunorreactividad de células humanas utilizando un método que incluye la introducción de un gen que codifica para un gen de ligando de molécula accesoria dentro en las células humanas, de tal manera que el ligando de molécula accesoria codificado por ese gen sea expresado sobre la superficie de esas células. La presente invención es útil para cualquier célula humana que participa en una reacción inmunoiógica, ya sea como un objetivo para el sistema inmunológico o como parte del sistema inmunológico que responda al objetivo extraño. Se contempla una gran variedad de métodos en los que el resultado final es que el gen de ligando de molécula accesoria se introduce en las células deseadas. Estos métodos incluyen métodos ex vivo, métodos in vivo y varios otros métodos que involucren la inyección de ADN, vectores genéticos o vectores para terapia de genes en el animal o humano, incluyendo la inyección directamente en el lecho tumoral presente en cualquier animal o humano. Se contemplan los métodos ex vivo en los que las células en las cuales se introducirá el gen de ligando de molécula accesoria se aislan del animal o paciente y después el gen es introducido en esas células aisladas utilizando métodos adecuados. Algunos ejemplos de métodos ex vivo útiles han sido descritos, por ejemplo por Raper, S.E., M. Grossman, D. J. Rader, J. G. Thoene, B. J. Clark, D. M. Kolansky, D. W. Muller y J.M. Wilson, Ann. Surg.. 223:116 (1996); Lu, L., R.N. Shen, y H.E. Broxmeyer, Crit. Rev. Oncol. Hemato 22:61 (1996); Koc. O. N., J. A. Allay, K. Lee, B. M. Davis, J. S. Reese, y S. L. Gerson, Semin. Oncol.. 23:46 (1996); Fisher, L. J. y J. Ray, Curr. Opin. Neurobiol.. 4:735 (1994); y Goldspiel, B. R., L. Green, y K. A. Calis. Clin. Pharm.. 12:488 (1993). D. Dilloo y otros, en Blood 90:1927-1933 (1997), describe un método, utilizando células activadas por CD40L, para tratar la leucemia linfoblástica B-aguda (ALL). Ellos cocultivaron células de leucemia con fibroblastos infectados con un vector retroviral que codificaba para CD40L, después inyectaron la mezcla de células en ratones. Dicho enfoque, si se realiza en humanos, diferiría del contemplado en esta invención, en que las células terapéuticas son estimuladas y in vitro por otra línea de células que expresan al ligando de molécula accesoria. Schultze, J.L. y otros, en Blood 89: 3806-3816 (1997), describen un método para estimular T-TlLs (células T infiltradoras de tumor) citotóxicas para células del linfoma folicular (FL) exponiéndolas, in vitro, a las células B de FL que se cultivaron previamente con fibroblastos que expresan CD40L. Proponen una inmunoterapia adoptiva en la cual se transfunden a los pacientes T-TlLs estimuladas de esta manera. Este método también requiere la estimulación in vitro de las células que se transfundirán, con otra línea de células que expresen una molécula accesoria. Después de la introducción del gen, incluyendo cualesquiera pasos opcionales para asegurar que el gen de ligando de molécula accesoria haya sido introducido exitosamente en esas células aisladas, las células aisladas se introducen en el paciente, ya sea en un sitio específico o directamente en la circulación del paciente. En modalidades preferidas de la presente invención, se usan marcadores de superficie celular, incluyendo moléculas tales como marcadores de tumor o antígenos, que identifiquen las células, para aislar específicamente estas moléculas del paciente. Un experto en la técnica entenderá que dichos métodos de aislamiento son bien conocidos e incluyen metodologías tales como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), inmunoselección que incluye una variedad de formatos incluyendo visualización, columnas y otros métodos similares. La presente invención contempla también la introducción del gen de ligando de molécula accesoria en las células deseadas dentro del cuerpo de un animal o un paciente humano sin remover primero esas células del paciente. Ya se conocen los métodos para introducir genes en células específicas in vivo, o dentro del cuerpo del paciente, e incluyen el uso de vectores para terapia de genes y la inyección directa de varias construcciones genéticas en el animal o paciente. Ejemplos de métodos útiles se han descrito por Danko, I y J. A. Wolff, Vaccine. 12:1499 (1994); Raz, E., A. Watanabe, S. M. Baird, R. A. Eisenberg, T. B. Parr, M. Lotz, T. J. Kipps, y D. A. Carson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90:4523 (1993); Davis, H. L., R. G. Whalen, y B. A. Demeneix, Hum. Gene Ther., 4:151 (1993); Sugaya, S., K. Fujita, A. Kikuchi, H. Ueda, K. Takakuwa, S. Kodama, y K. Tanaka, Hum. Gene Ther.. 7:223 (1996); Prentice, H., R. A. Kloner, Y. Li, L. Newman, y L. Kedes, J. Mol. Cell Cardiol.. 28:133 (1996); Soubrane, C, R. Mouawad, O. Rixe, V. Calvez, A. Ghoumari, O. Verola, M. Weil, y D. Khayat, Eur. J. Cáncer. 32A:691 (1996); Kass-Eisler, A., K. Li, y L. A. Leinwand, Ann. N. Y. Acad. Sci.. 772:232 (1995); DeMatteo, R. P., S. E. Raper, M. Ahn, K. J. Fisher, C. Burke, A. Radu, G. Widera, B. R. Claytor, C. F. Barker, y J. F. Markmann, Ann. Surg.. 222:229 (1995); Addison, C. L., T. Braciak, R. Ralston, W. J. Muller, J. Gauldie, y F. L. Graham, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A.. 92:8522 (1995); Hengge, U. R., P. S. Walker, y J. C. Vogel, J. Clin. Invest.. 97:291 (1996); Felgner, P. , Y. J. Tsai, L. Sukhu, C. J. Wheeler, M. Manthorpe, J. Marshall, y S. H. Cheng, Ann. N. Y. Acad. Sci.. 772:126 (1995); y, Furth, P. A., A. Shamay, y L. Hennighausen, Hybridoma. 14:149 (1995). En una aplicación típica, un vector para terapia de genes que contiene un gen de ligando de molécula accesoria es introducido en la circulación o en un sitio localizado del paciente para permitir que el vector para terapia de genes infecte específicamente las células deseadas. En otras modalidades preferidas, el vector para terapia de genes es inyectado directamente en el lecho tumoral presente en un animal que contiene por lo menos algunas de las células en las cuales será introducido el gen de ligando de molécula accesoria. La presente invención también contempla la inyección directa de ADN de una construcción genética que tiene un promotor y gen de ligando de molécula accesoria, seguida por una secuencia de poliadeniiación en un paciente o animal. Ejemplos de dichos métodos útiles se han descrito por Vile, R. G. e I. R. Hart, Ann. Oncol.. 5 Suppl 4:59 (1994). El ADN de la construcción genética se inyecta directamente en el músculo u otro sitios del animal o paciente o directamente en el lecho tumoral del animal o paciente. De manera alternativa, el ADN de una construcción genética que contenga por lo menos un gen de ligando de molécula accesoria se utiliza y se inyecta directamente en el animal. En modalidades preferidas de la presente invención, la reacción o respuesta inmunológica de un paciente humano o animal es alterada mediante la introducción del gen de ligando de molécula accesoria en células, incluyendo células humanas que tengan presente una molécula accesoria sobre su superficie de la célula. Dichas células incluyen células humanas, células humanas presentadoras de antígenos, y opcionalmente estas células pueden ser células neoplásicas presentadoras de antígenos, que tengan la capacidad de expresar la molécula accesoria sobre la superficie de la célula o células que sean capaces de estimular. En algunas modalidades, la cantidad de molécula accesoria presente sobre la superficie de las células, en las cuales se introducirá el gen de ligando de molécula accesoria, es muy pequeña y dichas cantidades pequeñas de la molécula accesoria pueden ser el resultado de la subregulación de esa molécula accesoria sobre la superficie de dichas células. En algunas modalidades, las células en las cuales se introduce el gen de ligando de molécula accesoria tiene por lo menos niveles bajos de la molécula de CD40 presentes sobre la superficie de la célula o se derivan de células que expresan la molécula de ligando CD40 sobre la superficie de la célula, pero tienen esa expresión reducida o eliminada. Los métodos preferidos para alterar la inmunorreactividad de una célula particular son aplicables a células de mamíferos, incluyendo células humanas. Estas células humanas pueden incluir células humanas neoplásicas tales como linfomas, leucemias, y otras malignidades humanas, incluyendo cáncer de mama, de pulmón u ovárico. En algunas modalidades preferidas, las células son células presentadoras de antígenos normales de un paciente humano tales como monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, célula interdigitantes célula dendríticas foliculares, células de Kupffer, y otras células similares. En modalidades preferidas, las células son linfocitos que adquieren inmunorreactividad alterada cuando las moléculas accesorias de la presente invención se introducen en esas células. En otras modalidades preferidas, las células pueden ser células neoplásicas o normales que sean capaces de estimular células espectadoras presentadoras antígenos cuando los genes de ligando de molécula accesoria de la presente invención sean introducidos en estas células. La presente invención también contempla que las células que no sean capaces naturalmente de presentar antígenos al sistema inmunológico pueden diseñarse genéticamente para introducir los genes que codifiquen para las moléculas necesarias para la presentación de antígenos, incluyendo genes que codifiquen para una molécula accesoria, y de esta manera permiten que estas células actúen como células presentadoras de antígenos artificiales. El gen de ligando de molécula accesoria puede ser introducido después en estas células presentadoras de antígenos artificiales. Ya se conocen varias pruebas en la literatura para determinar si una célula particular puede funcionar como una célula presentadora de antígenos, tal como la proliferación de células o la producción de linfocinas, y por lo tanto este aspecto de la presente invención puede determinarse fácilmente. Además de las células humanas normales anteriores, la presente invención también contempla la introducción del gen de ligando de molécula accesoria en varias células neoplásicas o malignas, que opcionalmente sean células presentadoras de antígenos. Dichas células neoplásicas humanas que se contemplan incluyen leucemias, linfomas, AML, AMML, o CMML, CML, CLL y cualquier célula neoplásica que sea capaz de estimular a las células espectadoras que presentan antígeno cuando un ligando de molécula accesoria se introduzca en esa célula. También se contemplan las células neoplásicas, como célula de cáncer de mama, de pulmón u ovárico que pueda o se diseñe para actuar como una célula presentadora de antígeno. Sin embargo, la presente inmunomodulación también es aplicable a otras malignidades no identificadas específicamente y, ROG lo tanto, puede incluir cualquier tumor de cualquier célula capaz de presentar antígeno dentro del sistema inmunológico del animal o humano, o cualquier célula que sea capaz de actuar como una célula presentadora de antígeno, o capaz de estimular a las células espectadoras que presentan antígeno después de que se ha introducido un gen de ligando de molécula accesoria en esas células. Generalmente, estas células presentadoras de antígeno tienen moléculas accesorias sobre la superficie de las células. Los presentes métodos de alteración de inmunorreactividad de una célula humana o animal contemplan la introducción de un gen de ligando de molécula accesoria en las células para las que se desea la inmunorreactividad alterada. Los genes útiles en la presente invención incluyen la amplia gama de genes de ligando de molécula accesoria y genes quiméricos de ligando de molécula accesoria, identificados arriba, y en modalidades preferidas incluyen por lo menos una porción del gen de ligando CD40 de murino. En modalidades preferidas particularmente, el gen de ligando de molécula accesoria que se introdujo en las células utilizando los métodos de la presente invención se selecciona para que corresponda a la molécula accesoria presente sobre la superficie de las células, para las que se desea la inmunorreactividad alterada. En una aplicación particular de la presente invención, la inmunorreactividad de una célula que expresa la molécula CD40 sobre la superficie de la célula se lograría introduciendo el gen que codifica para la molécula de ligando CD40 y muy preferiblemente para la molécula de ligando CD40 de murino. La presente invención también contempla la alteración de la inmunorreactividad de células humanas o animales mediante la introducción en la célula de un gen de ligando de molécula accesoria, que sea un gen quimérico de ligando de molécula accesoria. Los diversos genes quiméricos de ligando de molécula accesoria útiles se identificaron anteriormente y pueden incluir una amplia variedad de moléculas y permiten que las propiedades únicas de dichos genes quiméricos de ligando de molécula accesoria sean utilizadas para alterar la inmunorreactividad de las células objetivo. En modalidades preferidas, los genes quiméricos de ligando de molécula accesoria útiles son genes que codifican para por lo menos una porción del ligando de molécula accesoria, que es capaz de unir la molécula accesoria presente sobre la superficie de las células para la que se desee la inmunorreactividad alterada. Los métodos para alterar la ¡nmunorreactividad de la presente invención contemplan el uso de vectores genéticos y construcciones genéticas que incluyen vectores para terapia de genes que codifican para un ligando de molécula accesoria, y por lo tanto contienen un gen de ligando de molécula accesoria. Típicamente, los vectores genéticos y construcciones genéticas que incluyen los vectores para terapia de genes de la presente invención tienen un promotor que está enlazado operativamente al gen de ligando de molécula accesoria seguido por una secuencia de poliadenilación. En otras modalidades, el único requisito es que los vectores genéticos, construcciones genéticas, y vectores para terapia de genes de la presente invención contengan el gen de ligando de molécula accesoria o el gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

V. Métodos para el tratamiento de la neoplasia La presente invención también contempla métodos para tratar la neoplasia humana que comprende insertar en una célula neoplásica humana un gen que codifique para un ligando de molécula accesoria de manera tal que el ligando de molécula accesoria sea expresado sobre la superficie de las células neoplásicas. La presente invención contempla tratar la neoplasia humana tanto in vivo, como ex vivo e inyectando directamente al paciente varias moléculas de ADN que contengan un gen que codifique para un ligando de molécula accesoria. Sin embargo, por lo menos, los presentes métodos para el tratamiento de la neoplasia humana involucran la inserción del gen que codifica para el ligando de molécula accesoria en las células neoplásicas, de tal manera que permita a aquellas células neoplásicas expresar el ligando de molécula accesoria sobre la superficie de la célula. La expresión del gen de ligando de molécula accesoria en esas células neoplásicas modula el sistema inmunológico para ocasionar que la neoplasia se reduzca o se elimine. En un método preferido para tratar la neoplasia humana, el método comprende además los paso de obtener primero las células neoplásicas humanas de un paciente humano y después insertar en las células neoplásicas humanas aisladas un gen que codifique para un ligando de molécula accesoria, de tal manera que el ligando de molécula accesoria sea expresado sobre la superficie de las células neoplásicas. Las células neoplásicas humanas que tengan el ligando de molécula accesoria sobre la superficie de esa célula son después ¡nfundidas de nuevo en el paciente humano. Un experto en la técnica comprenderá que pueden aplicarse numerosos métodos para infundir las células neoplásicas humanas alteradas que contienen el gen que codifica para el ligando de molécula accesoria nuevamente en el paciente y que estos métodos ya son conocidos en la técnica. Los métodos contemplados para el tratamiento de la neoplasia humana se aplican a una amplia variedad de neoplasias humanas, incluyendo linfomas, leucemias, y otras malignidades. En modalidades preferidas, la neoplasia humana es una neoplasia que involucra células que presentan antígenos del sistema inmunológico humano e incluye monocitos, macrófagos, células B, células de Langerhans, células interdigitantes, células dendríticas foliculares, células de Kupffer y similares. En otras modalidades preferidas, la neoplasia humana es una leucemia, un linfoma, AML, AMML, CMML, CML o CLL, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico y otras neoplasias similares. Los vectores genéticos, construcciones genéticas y vectores para terapia de genes útiles en los métodos para el tratamiento de neoplasia humana de la presente invención se han descrito anteriormente e incluyen construcciones en las que un promotor se enlaza de manera operativa al gen de ligando de molécula accesoria o al gen quimérico de ligando de molécula accesoria, que a su vez está enlazado operativamente a una secuencia de poliadenilación. Los métodos de tratamiento de neoplasia humana contemplan el uso de construcciones genéticas, vectores genéticos y vectores para terapia de genes como los que se describen aquí. Además, la presente invención contempla el uso de ADN que contiene por lo menos un gen que codifica para un gen de ligando de molécula accesoria. Este gen puede o no contener un promotor y otras secuencias de reguladoras. En las modalidades que se prefieren de la presente invención, las células que comprenden la neoplasia humana se ubican por lo menos en un sitio definido denominado un lecho tumoral dentro del paciente humano. Este lecho tumoral típicamente contiene el tumor o célula neoplásica junto con un número de otras células que están asociadas con el tumor o células neoplásicas. La presente invención contempla métodos para el tratamiento de dicha neoplasia humana presente en un lecho tumoral, inyectando en el lecho tumoral del paciente un gen que codifique para un ligando de molécula accesoria de tal manera que el ligando de molécula accesoria sea expresado sobre la superficie de las células tumorales, ocasionando de esta manera que las células participen en una reacción inmunológica. El gen que codifica para el ligando de molécula accesoria puede estar presente como parte de un vector para terapia de genes, construcción genética o vector genético.

En modalidades preferidas, el gen de ligando de molécula accesoria es un gen quimérico de ligando de molécula accesoria, que tiene por lo menos una porción del gen de ligando CD40 de murino. En otras modalidades preferidas, el ligando de molécula accesoria codificado es capaz de unir una molécula accesoria presente en la neoplasia humana que se tratará. Los diferentes vectores para terapia de genes utilizados en los métodos de tratamiento de la presente invención incluyen vectores que son capaces de infectar directamente células humanas. Dichos vectores se han descrito en la literatura y pueden adaptarse fácilmente a los métodos descritos en la presente invención. La presente invención contempla el uso de cualquier tipo de terapia de genes, incluyendo los métodos de Raper, S.E. y otros, Ann. Surg., 223:116 (1996); Lu, L y otros, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 22:61 (1996); Koc, O. N. y otros, Semin. Oncol.. 23:46 (1996); Fisher, L. J. y otros, Curr. Opin. Neurobiol.. 4:735 (1994); Goldspiel, B.R. y otros, Clin. Pharm.. 12:488 (1993); Danko, I. y otros, Vaccine. 12:1499 (1994); Raz, E. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.. 90:4523 (1993); Davis, H. L. y otros, Hum. Gene Ther.. 4:151 (1993); Sugaya, S. y otros, Hum. Gene Ther.. 7:223 (1996); Prentice, H. y otros, J. Mol. Cell Cardiol.. 28:133 (1996); Soubrane, C. y otros, Eur. J. Cáncer. 32A:691 (1996); Kass-Eisler, A. y otros, ann. N. Y. Acad. Sci.. 772:232 (1995); DeMatteo, R.P. y otros, Ann. Surq.. 222:229 (1995); Addison, C.L. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.. 92:8522 (1995); Hengge, U.R. y otros, J. Clin. Invest.. 97:2911 (1996); Felgner, P. L. y otros, Ann. N. Y. Acad. Sci.. 772:126 (1995); Furth, P.A., Hybridoma. 14:149 (1995); Yovandich, J. y otros, Hum. Gene Ther., 6:603 (1995); Evans, C. H. y otros, Hum. Gene Ther.. 7:1261.

VI. Métodos de Vacunación La presente invención contempla métodos para vacunar a un animal contra un organismo predeterminado que comprende administrar a este animal una vacuna que contiene antígenos de animal inmunogenico capaces de causar una respuesta inmune en ese animal contra el organismo deseado junto con un vector que contiene un gen que codifica un ligando de molécula accesoria. La presente invención también contempla métodos para vacunar a un animal que incluyen administrar los genes que codifican el antigen inmunogénico capaz de provocar una respuesta inmune deseada o alterar la respuesta inmune a un antigen particular junto con un vector que contiene un gen que incluye ei gen de ligando de molécula accesoria. En esta modalidad particular, el vector o vectores introducidos codifican los antigenes inmunogénicos deseados y el ligando de molécula accesoria deseado. La presente invención también contempla que el gen o genes que codifican el péptido o péptidos inmunogénicos pueden estar presentes sobre el mismo vector como está el gen o genes que codifican el ligando de molécula accesoria.

Los métodos de vacunación de la presente invención son generales en que pueden ser utilizados para producir una vacuna contra cualquier organismo predeterminado, como un virus, una bacteria, un hongo u otro organismo. Además, los métodos de vacunación presentes pueden ser utilizados para producir una respuesta inmune contra una célula neoplásica. En otras modalidades preferidas, los métodos de vacunación de la presente invención utilizan un vector genético, un constructo genético o un vector para terapia de genes que contiene un gen de ligando de molécula accesoria que es un gen quimérico de ligando de molécula accesoria. Este gen quimérico de ligando de molécula accesoria contiene preferiblemente al menos una porción del gen de ligando CD40 de murino. En otras modalidades preferidas, el método de vacunación utiliza una molécula de ADN que codifica al mínimo el gen de ligando de molécula accesoria o un gen de ligando de molécula accesoria quimérica. Este ADN particular puede o puede no incluir una secuencia promotora que dirige la expresión del gen de ligando de molécula accesoria. La presente invención también contempla que el método de vacunación puede utilizar un vector genético que es capaz de expresar un ligando de molécula accesoria dentro de una célula u organismo particular junto con un vector que es capaz de expresar al menos un solo polipéptido de un andovirus. Este polipéptido de andovirus puede estar expresado desde el mismo o diferente vector que expresa el ligando de molécula accesoria en esa célula. En esta modalidad particular, el poiipéptido de andovirus también está expresado en al menos un tipo de célula dentro del organismo y sirve para modular la respuesta inmune descubierta en respuesta a este protocolo de vacunación. La presente invención también contempla la introducción de un gen de ligando de molécula accesoria dentro de células que están presentes en las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide. En modalidades preferidas, el gen de ligando de molécula accesoria introducido consta de al menos una porción del gen de ligando Fas y con la expresión el ligando accesorio induce la muerte de la célula o células que expresan Fas sobre la superficie de la célula. Este procedimiento conduce a la reducción del procedimiento inflamatorio destructivo. Los siguientes ejemplos están provistos para ilustrar varios aspectos de la presente invención y no limitan el alcance de esta invención.

Vil. Métodos para Tratar Artritis La presente invención también contempla métodos para tratar artritis que comprenden insertar dentro de una articulación, células que han sido transformadas con una molécula accesoria, como el ligando Fas. En modalidades preferidas, la expresión de este ligando de molécula accesoria o la estabilidad de esta molécula sobre la superficie de las células ha sido alterada. En estas modalidades preferidas, el ligando de molécula accesoria funciona en una manera mejorada para accesoria en el tratamiento de artritis dentro de la articulación. La presente invención contempla el tratamiento de artritis humana in vivo, ex vivo, e inyectando directamente varias moléculas de ADN que contienen genes que codifican el ligando de molécula accesoria útil dentro de los pacientes. Varios protocolos útiles pueden ser diseñados para artritis reumatoide incluyendo aquéllos descritos en la sección de ejemplos enseguida. La presente invención contempla el tratamiento de artritis utilizando genes de ligando de molécula accesoria que pueden ser genes quiméricos de ligando de molécula accesoria que constan de porciones de este gene siendo derivadas de dos genes de ligando de molécula accesoria diferentes. En otras modalidades, los ligandos de molécula accesoria quimérica pueden ser producidos utilizando dominios del mismo gen de ligando de molécula accesoria. Los ligandos quiméricos de molécula accesoria resultantes tienen una estabilidad alterada sobre la superficie de las células sobre las cuales se expresan. Esta estabilidad alterada modula la función del sistema inmune en el medio ambiente local alrededor de las células en las cuales estos ligandos de molécula accesoria quiméricas se expresan. Por ejemplo, en ciertas modalidades preferidas, la estabilidad del ligando Fas se altera sobre la superficie de células dentro de una articulación de un paciente que sufre de artritis. Esta estabilidad alterada modula el sistema inmune y causa que las células sean blanco para apoptosis y por tanto reducen la respuesta inmune dentro de la articulación inflamada. En otras modalidades, los genes de ligando de molécula accesoria descritos dentro de la presente se alteran de tal manera que el ligando de molécula accesoria resultante tiene una estabilidad alterada y causa un efecto inmunomodulatorio que puede ser útil en el tratamiento de artritis. La presente invención contempla en modalidades preferidas que los genes de iigandos de molécula accesoria quimérica sean utilizados en el tratamiento de artritis. Estos genes de ligando de molécula accesoria quimérica contienen preferiblemente al menos una porción del gen de ligando Fas del dominio IV, el cual lleva el efecto o función para el ligando Fas. En modalidades preferidas, al menos en la porción de este dominio, está presente lo que permite que el ligando Fas tenga sus efectos biológicos. En otros ligandos quiméricos de molécula accesoria preferidos, aquellos ligandos contienen dominios de otros genes de ligando de molécula accesoria de la presente invención o de un dominio diferente del mismo ligando de molécula accesoria. Particularmente preferidos son los genes de ligando de molécula accesoria quimérica Fas formados sobre el dominio IV del ligando Fas de humano encadenados operativamente con el dominio lll del ligando Fas de ratón. Esta combinación particular resulta en un ligando Fas más estable y por lo tanto, remplazando el dominio lll del ligando Fas de humano con el dominio lll del ligando de ratón, la actividad del gen de ligando Fas de humano se altera. Alternativamente, en otras modalidades preferidas, el gen de ligando Fas de murino se utiliza para codificar el ligando Fas de murino sobre la superficie de células en lugar del ligando Fas de humano.

El ligando Fas de murino es más estable que el ligando Fas de humano, y por lo tanto, altera la actividad del ligando Fas en la articulación. La actividad del ligando Fas alterada resultante es útil en el tratamiento de artritis reumatoide. Modalidades adicionales preferidas incluyen modalidades en las cuales el efecto o función presente sobre el dominio IV del ligando Fas de humano se combina con otros dominios de otros ligandos de molécula accesoria. Por ejemplo, el dominio lll de CD70 es más estable que el dominio lll del ligando Fas de humano y por lo tanto el ligando de molécula accesoria quimérica formada del dominio lll del CD70 de humano y el dominio IV del ligando Fas juntos con otros dominios de soporte serían más estables. La estabilidad incrementada conduce a un incremento en la actividad del ligando Fas. En otras modalidades preferidas, el dominio lll del ligando Fas se reemplaza con copias múltiples de un dominio o dominios. Tales copias múltiples de dominios incluyen dominios formados de dos o más copias de otros dominios como los dominios lll o I de la molécula CD70. En otras modalidades preferidas, la presente invención contempla genes de ligando de molécula accesoria tales como genes de ligando Fas, en los cuales un sitio de corte de metaloproteinasa de matriz (MMP), ha sido removido del ligando de molécula accesoria. El corte de MMP y los sitios de reconocimiento, graficados en la figura 28, se discuten en Smith, M.M. y otros., Journal of Biol. Chem. 270:6440-6449 (95) y Nagase, H., y G.B. Fields, Biopolymers (Peptide Science) 40:399-416 (96). En modalidades preferidas, al menos un sitio MMP ha sido removido de al menos el dominio lll del gen de ligando Fas. La remoción del sitio MMP del gen de ligando Fas hace al ligando Fas más estable y por lo tanto, más efectivo en el tratamiento de artritis. En otras modalidades preferidas, los genes de ligando de molécula accesoria quimérica constan de porciones del gen de ligando Fas de humano con otros dominios de otros ligandos de molécula accesoria de humano o dominios de moléculas accesorias derivadas de otras especies. Por ejemplo, la presente invención contempla el uso de dominios del ligando CD40, el ligando CD70, el ligando CD30, el ligando que induce apoptosis relacionada con TNF (TRAIL), TNF-a así como mutantes de ligando de Fas de humano y ligando Fas de murino. La producción de tales ligandos de molécula accesoria quimérica se logra fácilmente manipulando y produciendo genes de ligando de molécula accesoria los cuales son quiméricos y por tanto tienen porciones derivadas de al menos dos genes de ligando de molécula accesoria diferentes.

EJEMPLOS 1. Expresión de Ligando de Molécula Accesoria de Humano y de ratón en Células CLL de Humano a. Construcción de un Constructo Genético y Vector para terapia de genes gue contiene un gen de ligando de molécula accesoria de humano y de ratón.

Ya sea el gen de ligando de molécula accesoria de humano (ligando CD40 de humano) o el gen de ligando de molécula accesoria de murino (ligando CD40 de murino) fueron construidos utilizando los genes de humano y de murino respectivos. Cada uno de estos genes se clonó de la siguiente manera. i. Clonación de CD40-L de murino El ARN total se aisló utilizando el equipo ARN STAT-60 (Tel-Test "B" Inc., Friendswood, TX) de 1 x 10 7 esplenocitos B6 de ratón que fueron activados previamente durante 8 horas con mAb específico de CD3 inmovilizado. El ADNc se sintetizó después con el equipo de síntesis de ADNc Superscript (Gibco BRL, Grand Island, NY) utilizando iniciadores oligo-dT. El gen de ligando CD40 (mCD40-L) de murino fue después amplificado del ADNc mediante PCR utilizando los siguientes iniciadores específicos de mCD40-L. d'-GTTAAGCTTTTCAGTCAGCATGATAGAA (SEQ ID NO: 26), 5f-GTTTCTAGATCAGAGTTTGAGTAAGCC (SEQ ID NO:27). El producto mCD40-L amplificado por PCR fue subclonado dentro de los sitios Hindlll y Xbal del vector de expresión eucariótico ADNpc3 (Invitrogen, San Diego, CA). Un fragmento de ADN que abarca el promotor CMV, el gen mCD40-L y la señal de poliadenilación fueron liberados de este constructo de plásmido después de digestión de restricción con enzimas Bgl ll y Xhol. Este fragmento de ADN fue después subsclonado dentro del plásmido de vaivén MCS(SK)pXCX2 (Spessot R, 1989, Vírology 168:378) que fue designado mCD40-L pXCX2. Este plásmido se utilizó para producción de adenovirus como se describe enseguida. ii. Clonación de CD40-L de humano Un plásmido que contiene el gen para CD40-L de humano se utilizó para producir el gen CD40-L de humano utilizado en la presente. La secuencia de este gen esta disponible y por tanto esta fuente del gen se utilizó simplemente por conveniencia. Ver el número de acceso a GenBank no X67878. Este plásmido se utilizó para amplificación PCR del gen CD40-L de humano utilizando los iniciadores específicos, iniciador de sentido 5'CCAAGACTAGTTAACACAGCATGATCGAAA 3' (SEQ ID NO: 28) y el iniciador de antisentido 5'CCAATGCGGCCGCACTCAGAATTCAACCTG 3' (SEQ ID NO: 29). Estos iniciadores contienen sitios flanqueadores de enzima de restricción para subclonación dentro del plásmido de expresión eucariótica pRc/CMV (Invitrogen). El fragmento CD40-L amplificado por PCR fue subclonado dentro de los sitios Spel y Notl de pRc/CMV y se designó como hCD40-L pRc/CMV. Un fragmento Bgl ll y Xhol que abarca al promotor CMV, al gen hCD40-L y la señal de poliadenilación fue después liberado de este plásmido y subclonado dentro del plásmido de vaivén MCS(SK)pXCX2 como se describe anteriormente. Este plásmido fue designado hCD40-L pXCX2. Este plásmido se utilizó para producción de adenovirus como se describe enseguida. iii. Síntesis de adenovirus Cualquiera de los plásmidos mCD40-L pXCX2 o hCD40-L pXCX2 fueron co-transfectados con pJM17 (Graham y Prevec, 1991 , Methods in Molecular Biology, Vol 7) dentro de 293 células (American Type Culture Collection, Rockville, MD) utilizando el método de fosfato de calcio (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, 1989, Molecular Cloning. A Laboratorv Manual. 2nd edition, chapter 16:33-34). Las placas de adenovirus aislado se recogieron y se expandieron infectando nuevamente 293 células. Las preparaciones de titulación alta de adenovirus se obtuvieron como se describe (Graham y Prevec 1991 , Methods in Molecular Biology, Vol 7), excepto por las siguientes modificaciones. El gradiente de cloruro de cesio utilizado para concentrar las partículas virales fue un gradiente de un paso, con densidades de 1.45 g/cm3 y 1.2 g/cm3. Las mezclas fueron giradas en un girador SW41 (Beckman, Brea, CA) a 25,000 rpm a 4°C. La banda viral fue desalada utilizando una columna Sefadex G25 grado ADN (Pharmacia, Piscataway, NJ). El virus aislado se almacenó a 70°C en solución salina regulada en su pH con fosfato con glicerol al 10%. El título de virus se determinó infectando 293 células con diluciones en serie del adenovirus purificado y contando el número de placas formadas. Los títulos virales estuvieron típicamente en la escala de 1010 a 1012 de unidades de formación de placa/ml (PFU/ml). b. Introducción de un Gen de Ligando de Molécula Accesoria de Humano v de murino dentro de Células CLL y Células HeLa Para infección de adenovirus, 106 células CLL o células HeLa recién descongeladas y lavadas fueron suspendidas en 0.5 a 1 mL de medio de cultivo para cultivo a 37°C en un incubador de CO2- al 5% en aire. El adenovirus se añadió a las células a multiplicidades de infección (MOI), variables, y las células infectadas se cultivaron durante 48 horas, a menos que se especifique de otra manera, antes de ser analizadas para expresión de transgen. c. Expresión de un Gen de Ligando de Molécula Accesoria en células CLL v células HeLa Las células CLL y HeLa que fueron infectadas con el vector de adenovirus que contiene ya sea genes de ligando CD40 de ratón o de humano preparado en el ejemplo 1 b fueron después teñidas con anticuerpos monoclonales disponibles comerciales immunoespecíficos para ya sea ligando CD40 de humano o de ratón (Pharmingen, San Diego, CA) utilizando las direcciones del fabricante. Las células CLL y HeLa fueron después lavadas en medios de tinción (SM) consistentes de RPMI-1640, suero de 3% suero de becerro fetal y 0.05% de azida de sodio y conteniendo yoduro de propidio y después se analizaron sobre un FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Las células muertas y los restos fueron después excluidos del análisis mediante perfiles de dispersión de luz lateral y hacia adelante y tinción de yoduro de propidio. La expresión de antigen de superficie se midió como la relación principal de intensidad de fluorescencia (MFIR). El MFIR iguala la intensidad de fluorescencia principal (MFI) de células teñidas con un MoAb conjugado de FITC específico, dividido por el MFI de células teñidas con un IgG-FITC de control. Este método controla los incrementos no específicos en autofluorescencia vistos en células más grandes, y más activadas. Los histogramas, generados para las células CLL y células HeLa que contienen ya sea un vector genético que contiene el gen de ligando CD40 de humano o el gen de ligando CD40 de murino y los controles adecuados, se muestran en la figura 3A-3D. La expresión del gen de ligando de molécula accesoria de humano y de murino (ligando CD40) en las células HeLa se muestra en las figuras 3A y 3B respectivamente. La expresión del ligando de molécula accesoria de humano y de murino en las células CLL se muestra en las figuras 3C y 3D. La expresión de un gen de ligando de molécula accesoria en células CLL y la expresión de ligando CD40 de murino sobre la superficie de las células CLL se muestra en la figura 3C. La falla del ligando de molécula accesoria de humano para ser expresada sobre la superficie de las células CLL se muestra en la figura 3D. La figura 8 muestra datos de un experimento hecho para examinar si es que las células T CD4+ de pacientes CLL podrían ser inducidas para expresar el ligando de molécula accesoria ARNm después de ligación de CD3. Un RT-PCR competitivo cuantitativo basado en ELISA se utilizó para medir los niveles de transcripto del ligando CD40. En este experimento, el ligando CD40 y el ARN transcritos del gen de ligando de CD40 en células CLL se compara con niveles de ligando CD40 y ARN hechos en células donadoras normales, después de la inducción mediante ligación de CD3. Para activación de CD3, los recubrimientos de placa de CD3 mAb fueron hechos e incubados con CLL depositado en placas o células mononucleares donadoras normales durante la cantidad indicada de tiempo, después de lo cual las células se analizaron para la expresión de antigenes de superficie o niveles de mensaje CD154 de ARN. CLL o suero de donador normal fue añadido a las células al inicio del ensayo de activación para análisis de modulación de expresión de superficie de ligando CD40. Para ELISA RT-PCR cuantitativo de CD154, el ARN total se extrajo y ARN competidor se generó del inserto que contiene el ligando CD40 (CD154) de ADNc. Cantidades variables de ARN competidor fueron añadidas para separar pozos de ARN total aislado que subsecuentemente fueron convertidos a ADNc. Las reacciones de activación de CD3, ELISAs y PCR se realizaron como se describe en Cantwell, M. y otros., Nature Medicine 3:984-989 (1997). Los productos de PCR biotinilatados fueron capturados sobre placas de microtitulación (Becton Dickinson, Oxnard, CA) recubiertos con streptavidina (Sigma), e incubados. La placa fue tratada con NaOH para remover las bandas de sentido y se lavaron subsecuentemente. El ADN fue después hibridado con ya sea oligonucleótidos tipo silvestre específico de gen o específico de competidor. Utilizando transferasa terminal, cada sonda fue marcada con una molécula de digoxigenin-11-dideoxyUTP (Boehringer Mannheim). La placa fue incubada y lavada con regulador de pH HYBE y regulador de pH bloqueador, después fue añadido anticuerpo de anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa (150 U/ml; Boehringer Mannheim) en regulador de pH bloqueado. TMB (tetrametilbenzidina) y peroxidasa (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) fueron añadidos para desarrollo de color, y las densidades ópticas fueron medidas a 450 nm y Deltasoft II (Biometallics, Princeton, NJ) fue utilizado para análisis de datos. Las curvas estándar que grafican los moles de producto ARN contra la densidad óptica fueron hechas para las reacciones de ADNs estándar. Las ecuaciones que describen estas curvas estándar fueron después utilizadas para calcular los moles de ADN tipo silvestre o competidor presente en las reacciones de PCR desconocidas basadas en las densidades ópticas obtenidas en las lecturas ELISA. La relación de la cantidad de ADN tipo silvestre a la cantidad de ADN competidor fue después gratificada contra la cantidad conocida de ARN competidor añadido en las muestras iniciales. La relación de 1 fue tomada para la extrapolación de la cantidad de moles desconocidos de ARN objetivo en la muestra (una relación de 1 significa que la cantidad de ARN objetivo contra ARN competidor son iguales). Las moléculas del ARN objetivo por célula CD4 fueron después calculadas basados en la siguiente fórmula: [(moles de ARN CD154 objetivo) x (6 x 1023 moléculas/mole) x (factor de dilución de ARN de prueba)] / (% de células T CD4 en el total de la población de células). La gráfica superior en la figura 8 muestra que las células T de los pacientes con CLL no expresan ligando CD40 detectable después de la ligación de CD3. El ligando CD40 de ARN, es producido, pero no es estable. Aunque el ligando CD40 y el ligando de CD40 de ARN se expresan es células donadoras normales (gráfica inferior), los niveles de ni la proteína o el ARN se mantienen establemente. La figura 9 muestra un transcurso de tiempo para expresión de superficie del ligando CD40. La expresión alcanzo un nivel máximo a las 48 horas después de la infección y persistió a niveles altos durante al menos 6 días después de la misma. En este experimento, las células B CLL fueron infectadas con un vector para terapia de genes que contiene un ligando de molécula accesoria, a una MOI de 1000 a tiempo 0, y después se calcularon mediante citometría de flujo en varias ocasiones después. En cada punto de tiempo listado sobre la abscisa, las proporciones de células B CLL viables que expresaron CD154 detectable se indican por las barras verticales que corresponden a la escala de porcentaje descrita sobre la ordenada de mano derecha. d. Función de los Ligandos de Molécula Accesoria de Humano v de murino i. Inducción de CD80 v CD54 sobre Células gue contienen un Vector para terapia de genes gue codifica una Molécula Accesoria Las células CLL infectadas con el gen de ligando de molécula accesoria de murino preparadas en el ejemplo 1 b fueron después cultivadas en placas de cultivo de tejido. Las células CLL fueron después analizadas utilizando análisis FACS de multiparámetros para detectar ia inducción de expresión de CD80 y CD54 utilizando anticuerpos monoclonales fluorescentes conjugados de isotiocianato inmunoespecíficos para cada uno de estos antígenos de superficie respectivos. Las células CLL no infectadas fueron utilizadas como un control. Las células fueron sometidas al análisis FACS adecuado y los histogramas fueron generados. CD80 mAb se obtuvo de Dr. Edward Clark y CD54 mAb se adquirió de CALTAG Inc. El CD80 fue conjugado utilizando métodos estándar que han sido descritos en Kipps y otros., Laboratorv Immunology II. 12:237-275 (1992). Los resultados de este análisis se muestran en la figura 4A-4D. Las figuras 4A-4B comparan la cantidad de expresión de CD54 en células CLL que no han sido transfectadas (figura 4A) o las células CLL dentro de las cuales un vector para terapia de genes que contiene el gen de ligando CD40 de murino fue introducido (figura 4B). La gráfica obscura indica el control de isotipo para tinsión de FACS y la gráfica abierta indica las células teñidas con el anticuerpo anti-CD54. Estos resultados muestran que el nivel de expresión de CD54 se incrementa en las células CLL dentro de las cuales el vector para terapia de genes que contiene el ligando CD40 de murino fue introducido. Las figuras 4C y 4D comparan la cantidad de expresión de CD80 en células CLL que no han sido transfectadas (figura 4C) o células CLL dentro de las cuales un vector para terapia de genes que contiene el gen de ligando CD40 de murino fue introducido (figura 4D). La gráfica obscura indica el control de isotipo para tinsión de FACS y la gráfica abierta indica las células teñidas con el anticuerpo anti-CD80. Estos resultados muestran que el nivel de expresión de CD80 se incrementa en las células CLL dentro de las cuales el vector para terapia de genes que contiene el ligando CD40 de murino fue introducido. En un experimento adicional, las células CLL infectadas con un vector para terapia de genes que contiene el gen de ligando de molécula accesoria de murino fueron evaluadas mediante citometría de flujo para expresión inducida no sólo de CD54 y CD80, sino también de CD86, CD58, CD70 y CD95. El mAb conjugado con fluoresceína específico para CD54 y CD70 humano se adquirió de CALTAG. El Amb conjugado con fluoresceína específico para CD27, CD58, CD80, CD86 o CD95 humano, y el mAb conjugado con ficoeritrina específico para el ligando CD40 humano o de ratón, se obtuvieron de PharMingen. Los histogramas sombreados representan la tinción de las células B CLL con el mAb no específico de isotipo conjugado con FITC. En contraste con las células CLL no infectadas (figura 10, histogramas de línea delgada) o con las células CLL infectadas con Ad-lacZ (datos similares a los obtenidos con células no infectadas, pero no ilustrados), las células CLL infectadas con el vector de adenovirus que codifica para el ligando CD40 (CD154) expresaron altos niveles de CD54 (figura 10, superior izquierda), CD80 (figura 10, media superior), CD86 (figura 10, superior derecha), CD58 (figura 10, inferior izquierda), CD70 (figura 10, media inferior), y CD95 (figura 10, inferior derecha). Por otro lado, las células CLL del ligando CD40 (CLL CD154) expresaron niveles bastante bajos de CD27 de membranas de superficie (figura 11 A, histograma de línea gruesa) y de CD27 soluble (figura 1 1 B) a diferencia de las células CLL no infectadas (figura 11 A, histograma de línea delgada) (P<0.01 , prueba t de Bonferroni) o las células CLL infectadas con Ad-lacZ (datos similares a los obtenidos con las células no infectadas, pero no ilustrados). En ei experimento que aparece en la figura 11 A, las células B CLL se examinaron para buscar la expresión de CD27 mediante citometría de flujo, tres días después de la infección. Los histogramas sombreados representan la tinción de las células B CLL con el mAb de control de isotipo conjugado con FITC. En la figura 11 B, se reunieron los sobrenadantes libres de células, después de la infección o la estimulación de las células B CLL, durante 72 horas y se examinaron para buscar la concentración de CD27 humano mediante ELISA. La expresión reducida de CD27 (figura 1 1 B) es similar a la mencionada para las células B de leucemia estimuladas mediante el entrelazamiento de CD40 con el mAb G28-5 presentado por las células L con expresión de CD32, como se describe en Rassenti, L.Z. y T.J. Kipps, J. Exp. Med. 185:1435-1445. ii. Respuestas de las células T alógenas a las células CLL. en las gue se introdujo un vector de terapia genética gue contiene un gen del ligando CD40 de murino La capacidad de las células CLL que se infectaron con un vector de terapia genética que contiene el gen del ligando CD40 de murino para estimular las células T alógenas (es decir, de otro individuo) se analizó mediante pruebas de proliferación de células. A la brevedad, las células de prueba se co-cultivaron con el vector de terapia genética que contiene el gen lac-Z o el gen del ligando CD40 de murino a una multiplicidad de infección de 1000 en presencia de IL-4 en una concentración de 10 ng/ml. En otras muestras, las células CLL se estimularon con MOPC21 (un IgG de control) o G28-5 (un anticuerpo monoclonal anti-CD40) o se preincubaron en células L de CD32 y al mismo tiempo se trataron con IL-4. Se ha demostrado que la preincubación con las células L de CD32 junto con el tratamiento IL-4 es una forma eficaz de entrelazamiento de la molécula CD40 a diferencia de ia transfección directa del gen. Después de tres días de cultivo a 37°C, estas células se trataron con mitomicina C para evitar su proliferación, y después se emplearon para estimular las células T alógenas. Previo a este co-cultivo, los distintos alícuotas de las células CLL se habían tratado con el anticuerpo monoclonal anti-CD40 o se habían infectado con el vector para terapia de genes que contiene el gen del ligando CD40 de murino o lac-Z en una relación estimulante de 1 :10. Después de dos días de cultivo a 37°C, la producción del interferón gamma (IFNg) se midió mediante la prueba de ELISA. Después de cinco días de co-cultivo a 37°C la incorporación de 3H-timidina en las células replicantes se midió después de una marca de pulsos de 8 horas. Los resultados de esta prueba aparecen más adelante en el cuadro 2 y en la figura 5.

En otro experimento, las células B CLL infectadas con el vector para terapia de genes, que contiene el gen del ligando de CD40, se evaluaron en cuanto a su capacidad para actuar como células estimulantes en una reacción de células T de linfocitos mixtos alógenas (MLTR). Paralelamente, la capacidad estimulante de las células CLL infectadas con el vector lac-Z y las células B CLL que se habían cultivado con las células L de CD32 y un mAb anti-CD40 (G28-5) o un Ig de control de isotipo también se examinó como se describe en Ranheim, E.A. y T.J. Kipps, J. Exp. Med. 177:925-935 (1993), Clark, E.A. y J.A. Ledbetter, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 83:4494-4498 (1986), y Banchereau, J. y otros, Science 251 :70-72 (1991 ). Las células T efectoras de un donador no relacionado se co-cultivaron con las células CLL estimulantes en un efector a una relación objetivo de 4:1. Después de 18 horas de cultivo a 37°C, se descubrió que más del 30% de las células CD3+ alógenas expresaron CD69 antígeno asociado con la activación al cultivarse con células CLL de CD154- (datos no ilustrados). En contraste, menos de 4% de células T expresaron CD69 al co-cultivarse con células CLL no infectadas o infectadas con Ad-lacZ (datos no ilustrados). Dos días después del inicio de la MLTR, las concentraciones de IFNg en los sobrenadantes de cultivo se sometieron a la prueba ELISA. Los sobrenadantes de la MLTR estimulados con células CLL infectadas con CD40L del ligando de molécula accesoria (figura 12A, CLL CD154) contenían niveles demasiado altos de IFNg (306±5 ng/ml, m± SE, n=3) que los de los cultivos de MLTR estimulados con el mAb anti-CD40 (figura 12A, aCD40-CLL) (23+3 ng/ml) (P<0.05, prueba t de Bonferroni). El último no fue demasiado diferente de los cultivos de MLTR estimulados con células CLL de control infectadas con Ad-lacZ (figura 12A, lacZ-CLL) (43±10 ng/ml) (P>0.1 , prueba t de Bonferroni). Los sobrenadantes sólo de las células efectoras o de los cultivos de MLTR estimulados con células CLL no infectadas (figura 12A, CLL) o células CLL tratadas con Ig de control (figura 12A, MOPC-CLL), no contenían cantidades detectables de IFNg(<2 ng/ml). De manera similar, ninguna de las poblaciones de células B de leucemia produjeron cantidades detectables de IFNg al cultivarse solas, sin agregar células T efectoras (datos no ilustrados). Después de 5 días, la proliferación de células se valoró mediante la incorporación de 3H-timidina. Los cultivos con células estimulantes (figura 12B, CLL) no infectadas o tratadas con igG de control de isotipo (figura 12B, MOPC-CLL) no incorporaron más 3H-timidina que los cultivos sin adición de células estimulantes de leucemia (figura 12B, ninguna). Las células CLL B infectadas con Ad-lacZ (figura 12B, lacZ-CLL) tampoco pudieron estimular las células T alógenas para incorporar cantidades de 3H-timidina que eran mucho mayores que las de los cultivos de control. En contraste, las células de leucemia estimuladas con anti-CD40 o las células CLL de CD154 provocaron, cada cual, una proliferación importante de células efectoras (figura 12B, aCD40-CCL o CD154-CLL) (P < 0.05, prueba t de Bonferroni). Además, la cantidad de 3H-timidina incorporada mediante los cultivos estimulados con células CLL de CD154- (41.004 ± 761 cpm (m ± SE), n = 3) fue mucho mayor que la de los cultivos estimulados con las mismas cantidades de células CLL de aCD40 (22.935 ± 1.892 cpm, n = 3) (P < 0.05, prueba t de Bonferroni). Sin embargo, ninguna de estas poblaciones de células de leucemia tratadas con rjiitomicina C incorporó 3H-timidina al cultivarse sin células T efectoras (datos no ilustrados). Asimismo, como se describió para la MLTR entre células T alógenas y células CLL estimuladas con CD40 {6549, 7167, 7168}, la proliferación de células T alógenas en respuesta a las células CLL de CD154 pudieron inhibirse mediante el mAb de CD11a o Ig de CTLA-4 al agregarse al inicio de la MLTR, indicando que las interacciones respectivas entre CD80/CD86 y CD28, o CD54 y CD11a/CD18, contribuyen a la reacción mencionada de células T alógenas (datos no ilustrados).

CUADRO II Respuestas de las células T alógenas a las células CLL infectadas con adenovirus mCD40-L % de células positivas Respuesta alóqena (mean + SEM) Estimuladores mCD40-L CD80 Humano Captación Producción de IFN? 3H-TdR (ng/ml) (cpm) Ninguna (sólo - - 3577 ± 821 n.d.* células T) CLL con: sin activación 0 1.4 4577 + 1097 n.d. MOPC21 0 1.0 5259 ± 1788 n.d. G28-5 0 26.7 22935 + 1892 22.3 ± 1.6 adeno lac-Z 0 4.8 9037 ± 1781 43.2 ± 10.5 adeno mCD40-L 17.5 19.7 41004 + 761 305.7 ± 4.5 *n.d. - no detectable iii.- Estimulación del interferón gamma mediante células CLL gue contienen un gen del ligando de molécula accesoria La función de las células CLL que contienen un gen del ligando de molécula accesoria (ligando CD40 de ratón) se analizó mediante la determinación de la capacidad de esas células para activar los linfocitos T. El procedimiento se llevó a cabo como sigue: Los linfocitos T alógenos de un donador saludable (mayor a 90% CD3*) se purificaron mediante esferas magnéticas y anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno CD14 y CD19. Después, dichos linfocitos T alógenos se cultivaron junto con las células CLL tratadas con MMC, que se infectaron con el gen del ligando de molécula accesoria (ligando CD40 de murino) o el gen lac-Z. Este co-cultivo se realizó en un medio RPMI-1640 que contiene suero fetal de becerro al 10%. Después de cultivar durante 24 horas, las células se recogieron y se analizaron para determinar la expresión del antígeno CD69 en los linfocitos T empleando un protocolo de clasificación FACS estándar. Los sobrenadantes del cultivo de células se recogieron después de dos días en cultivo y se examinaron para determinar la concentración del interferón gamma humano mediante una prueba de ELISA. Una porción de las células CLL que contienen un gen del ligando de molécula accesoria (ligando CD40 de murino) y una porción de las células que contienen el adenovirus que expresó el lac-Z se cultivaron en presencia de interleucina 4 IL-4 humana (5 ng/ml). También se analizó la producción del interferón gamma mediante linfocitos T alógenos en la presencia de esta cantidad de interleucina 4 humana. Los resultados de estos análisis aparecen en la figura 6. Como puede verse, las células CLL humanas que contienen el gen de ligando de molécula accesoria (CD40 de murino) produjeron concentraciones mucho más altas de interferón gamma en el sobrenadante del cultivo de las células al compararse con las células CLL que contienen el gen lac-Z. El incremento en la producción del interferón gamma (IFNg) mediante linfocitos T expuestos a las células CLL que contienen el gen del ligando de molécula accesoria indican que estas células CLL que contienen los genes del ligando de molécula accesoria fueron efectivas en la producción de una respuesta inmunológica mejorada. iv.- Estimulación de células T alógenas pre-expuestas a células B CLL no modificadas gue contienen un gen del ligando de molécula accesoria Estudios previos indicaron que la presencia de antígenos en las células T, en ausencia de las señales derivadas de las moléculas coestimulantes, como la CD28, pueden dar como resultado una anergia cíonal de células T específicas. Por esta razón, las células T alógenas que se habían cultivado con anterioridad, con células B CLL no modificadas que carecen de expresión de CD80 y otras moléculas accesorias inmunológicas, se examinaron en cuanto a su capacidad para responder a las células CLL que contienen el gen del ligando CD40. Las células efectoras alógenas no incorporaron más 3H-timidina en respuesta a las células CLL no modificadas (figura 12C, CLL), o células CLL de control infectadas con Ad-lacZ (figura 12C, lacZ-CLL), que cuando se cultivaron solas (figura 12C, ninguna). En contraste, aun después del co-cultivo previo con células B CLL no modificadas, las células efectoras alógenas aun podían ser inducidas para proliferarse (figura 12C, CD154-CLL) o para producir IFNg (figura 12D, CLL CD154) en respuesta a las células que expresan un ligando de molécula accesoria. Aunque las cantidades discretas de IFNg se detectaron en los sobrenadates de dichos cultivos secundarios cuando las células de leucemia infectadas con Ad-lacZ se emplearon como células estimulantes (figura 12D, lacZ-CLL), este nivel fue mucho más bajo que el mencionado para los cultivos secundarios con células CLL infectadas con el ligando Ad-CD40 (figura 12D, CD154-CLL) (P < 0.05, prueba t de Bonferroni). De manera similar, los sobrenadantes sólo de las células de leucemia (datos no ilustrados) y sólo las células efectoras (figura 12D, ninguna), de los cultivos de MLTR estimulados con células CLL no infectadas (figura 12D, CLL), contenían cantidades sin importancia de IFNg (<2 ng/ml). Estos resultados indican que las células efectoras alógenas cultivadas con células B CLL no modificadas no están exentas de responder a las células B CLL infectadas con un vector de terapia genética que contiene el gen del ligando de molécula accesoria. v.- Respuestas de las células T autólogas a las células CLL en las gue se introdujo un vector para terapia de genes gue codifica un gen del ligando de molécula accesoria de murino Las células T aisladas de la sangre de pacientes con CLL se examinaron en cuanto a su capacidad de respuesta in vitro a células B CLL autólogas que contienen un vector para terapia de genes que codifica la molécula accesoria de murino, ligando CD40. Las células T se aislaron a >95% de pureza, y luego se co-cultivaron con células de leucemia autológas tratadas con mitomicina C en un medio AIM-V sin suero complementado con ¡nterleucina-2 exógena a 25 U/ml. La incorporación discreta de 3H-timidina (<10,000 cpm) se detectó en cultivos sin adición de células estimuladdoras, secundarias en parte para la IL-2 exógena (figura 13A, y datos no ilustrados). Sin embargo, el nivel de proliferación de células T no aumentó en respuesta a las células CLL no infectadas (figura 13A, CLL) o células CLL infectadas con Ad-iacZ (figura 13A, lacZ-CLL). En contraste, las células CLL infectadas con un vector para terapia de genes que contiene el ligando de molécula accesoria (figura 13A, CD154-CLL) provocó que las células T autólogas incorporaran mucha más 3H-timidina (17, 368 + 1.093 cpm, n=3) que cualquiera de los cultivos de control (P < 0.05, prueba t de Bonferroni). Además, la MLTR estimulada con las células CLL infectadas con un vector que codifica un ligando de molécula accesoria (CD40L) también generó mucho más IFNg (165 ± 3 ng/ml, n=3) que cualquier otro de los cultivos (figura 13B) (P < 0.05, prueba t de Bonferroni).

Las células T se cosecharon después de 5 días de la MLTR autóloga y se valoró en cuanto a la actividad CTL contra las células B CLL autólogas. Las células T co-cultivadas con células CLL del ligando CD40 autólogas desarrollaron una actividad CTL para las células B CLL no modificadas, provocando el efecto de lisis al 40.1 % (± 2.3%) en una relación de E:T de 2:1 (figura 13C, CD154). Sin embargo, dichas células T no desarrollaron actividad CTL detectable para las mismas células objetivo en las reacciones de control, al co-cultivarse con células CLL infectadas con Ad-lacZ-(figura 13C). vi. Especificidad de CTL estimulado mediante células B CLL del ligando CD40 autólogas para las células B CLL alógenas Las células efectoras estimuladas con CLL del ligando CD40 autólogas se evaluaron en cuanto a su capacidad para secretar IFNg o manifestar actividad CTL contra las células B CLL alógenas (figura 14). Después de 5 días de la MLTR autóloga con CD154-CLL o lacZ-CLL, las células T se aislaron mediante centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll, se lavaron muy bien, y luego se cultivaron en medios durante 24 horas. Las células T lavadas se mezclaron con células B CLL objetivo autólogas ("Auto CLL", barra sólida) o alógenas ("Allo-1 CLL" o "Allo-2 CLL", barras sombreadas o plumeadas). Las células T estimuladas en la MLTR autóloga con células CLL del ligando CD40, pero no con células lacZ-CLL, produjeron mucho más IFNg en respuesta al cultivo secundario con células B CLL autólogas no modificadas que con células B CLL alógenas (figura 14A) (P < 0.05, prueba t de Bonferroni). Además, las células T estimuladas con células CLL del ligando CD40, pero no con células lacZ-CLL, eran citotóxicas para las células CLL autólogas, pero no para las células CLL alógenas (figura 14B). Se obtuvieron resultados similares con las células T autólogas activadas con MLTR del donante alógeno, para demostrar una vez más la citotoxicidad específica para las células B CLL autólogas (datos no ilustrados). Por último, W6/32, un mAb para antígenos del complejo de histocompatilbilidad principal clase I (MHC I) pudo inhibir de manera significativa la citotoxicidad de las células T estimuladas con las células CLL del ligando CD40 para las células B CLL autólogas (figura 14C, clase I aHLA) ) (P < 0.05, prueba t de Bonferroni). Dicha inhibición no se observó con el mAb específico para el antígeno de clase II MHC (figura 14C, aHLA-DP), el mAb específico para el ligando Fas (figura 14C aFasL), o un mAb de control de isotipo de especificidad irrelevante (figura 14C; MOPC-21 ). En conjunto, estos estudios indican que las células CLL infectadas con el ligando Ad-CD40 pueden provocar una respuesta inmunológica autóloga de células antileucemia in vitro, dando como resultado la generación de CTL restringido a clase I MHC específico para células B de leucemia no modificadas autólogas. e. Transactivación de células B de leucemia espectadoras no infectadas por las células CLL de Ad-CD40L Para enfatizar si los cambios en la expresión de marcador de tumor (descritos en la sección 1d¡.) resultaron de la estimulación intercelular contra la intracelular, se examinó el efecto de la densidad del cultivo en la expresión inducida de CD54 y CD80 después de la infección con el vector para terapia de genes de adenovirus que codifica el ligando de molécula accesoria (CD40L, o CD154). Después de la infección, las células CLL se cultivaron en una densidad alta estándar (por ejemplo 1 x 106 células/ml) o densidad baja (por ejemplo 2 x 105 células/ml) durante 3 días a 37°C. Las células colocadas en la placa en una densidad alta contenían agregados homotípicos, puesto que las células colocadas en la placa a densidad baja permanecieron dispersas homogéneamente y sin contacto sustancial de célula a célula (datos no ilustrados). A pesar de expresar niveles similares de células B CLL de CD154, CD154 heterólogas cultivadas a alta densidad se indujeron para expresar niveles mayores de CD54 y CD80 que las células CLL de CD154 cultivadas a densidad baja (figura 15A). La estimulación lograda a densidad alta pudo inhibirse mediante el cultivo de las células con un mAb de CD154 de hámster anti-ratón capaz de bloquear las interacciones CD40 < - > CD154 (figura 15B, aCD154 Ab). En conjunto, estos estudios indican que las células CLL de CD154 pueden activarse entre sí in trans y que la expresión de la superficie de CD154 es necesaria para la estimulación óptima de las células de leucemia.

Además, las células CLL infectadas con Ad-CD154, no infectadas, infectadas con Ad-lacZ o estimuladas con G28-5 se marcaron con un tinte verde fosforescente para examinar si las células CLL de CD154 podían estimular las células de leucemia espectadoras no infectadas. Las células marcadas con el tinte se emplearon como células estimulantes para números iguales de células B CLL singénicas no marcadas. Después de un cultivo de 2 días, las células estimulantes cultivadas retuvieron por sí mismas el tinte verde fosforescente, permitiendo que dichas células se distinguieran de las células CLL no marcadas mediante citometría de flujo. Las células B CLL de CD19+ espectadoras (verde fosforescente negativo) se indujeron para expresar CD54 (figura 15C, histograma derecho) o CD86 (figura 15D, histograma derecho) al co-cultivarse con células B de leucemia infectadas con AD-CD154 pero no con células CLL infectadas por simulación (figuras 15C y 15D, histogramas izquierdos), células CLL estimuladas con G28-5 o células CLL infectadas con Ad-lacZ (datos no ilustrados). Como se esperaba, estas células CLL espectadoras (verde fluorescente negativo) también fueron negativas para el CD154 heterólogo. f . Tratamiento de leucemia con vectores para terapia de genes gue codifican un ligando de molécula accesoria La figura 24 muestra un bosquejo para un experimento clínico para el tratamiento de prueba de CLL de células B con vectores para terapia de genes de adenovirus, que codifican de ligando CD40 modificado. Las células de leucemia cosechadas mediante féresis están infectadas con vectores con defecto de replica que codifican el ligando CD40 modificado. Después de la expresión de esta proteína, las células volverán a administrarse al paciente con el propósito de estimular una respuesta inmunológica de las células de antileucemia en el huésped. Esta estrategia es muy superior a la que emplea la terapia de genes para afectar la expresión de sólo una molécula estimulante inmunológica en la superficie de la célula de leucemia. En realidad, esta estrategia da como resultado que las células de leucemia expresen una disposición de moléculas accesorias con estimulación inmunológica y citocinas, así como una molécula que puede afectar los mismos cambios en las células de leucemia del paciente que nunca se cosecharon. 2. Expresión de los genes guiméricos del ligando de molécula accesoria Los genes quiméricos del ligando de molécula accesoria descritos más adelante están preparados mediante el uso de técnicas estándar como aquí se describe. a. Preparación de los genes guiméricos del ligando de molécula accesoria mediante los dominios de dos genes diferentes de molécula accesoria.

El gen del ligando CD40 humano se aislo del ARN preparado de células T que se habían activado mediante un anticuerpo monoclonal de anti-CD3, empleando iniciadores 5' y 3' junto con métodos PCR bien conocidos. Los genes quiméricos de molécula accesoria del ligando CD40 humano y del ligando CD40 de murino se construyen del gen del ligando CD40 humano recién clonado y del gen del ligando CD40 de ratón descritos aquí como SEQ ID NO: 2. Los dominios citoplásmicos y de transmembrana de los genes del ligando CD40 humano se intercambian con los del gen de ligando CD40 de murino y se designaron ligando CD40 de H (Ex)-M(Tm-Cy). Estos genes quiméricos del ligando de molécula accesoria se producen mediante la técnica de conversión de genes descrita como SOEN que ha quedado descrita con anterioridad por Horton, Mol. Biotechnol.. 3:93 (1995). En la figura 4 aparece un diagrama que representa los genes quiméricos del ligando de molécula accesoria que son producidos. Las secuencias de nucleótidos de los respectivos genes quiméricos del ligando de molécula accesoria se designan SEQ IND NOS: 3-7, como se indica en el siguiente cuadro.

CUADRO Gen quimérico del ligando de molécula accesoria SEQ ID NO: Ligando CD40 de HulC/HuTM/MuEX SEQ ID NO: 3 Ligando CD40 de HulC/MuTM/HuEX SEQ ID NO: 4 Ligando CD40 de HulC/MuTM/MuEX SEQ ID NO: 5 Ligando CD40 de MulC/HuTM/HuEX SEQ ID NO: 6 Ligando CD40 de HulC/HuTM/HuEX SEQ ID NO: 7 Los vectores de adenovirus que codifican cada una de las moléculas accesorias quiméricas mostradas en la figura 2 se construyen mediante los métodos descritos en el ejemplo 1. Cada una de estas construcciones luego se transfectan en células HeLa o células CLL, de conformidad con los métodos del ejemplo 1. b. Expresión de los liqandos quiméricos de molécula accesoria en células HeLa v CLL. La expresión de cada uno de los genes quiméricos del ligando de molécula accesoria construidos con anterioridad se analiza mediante el análisis FACS, como se especifica en el ejemplo 1. El anticuerpo monoclonal adecuado inmunoespecífico para el dominio externo del ligando CD40 humano o de ratón se selecciona y emplea para determinar el nivel de expresión de las moléculas accesorias quiméricas en la superficie de estas células. Después de la preparación y el análisis adecuados de los histogramas apropiados, la expresión de las moléculas accesorias quiméricas que contienen por lo menos una porción del gen de ligando CD40 de murino queda confirmada.

C. Función de los liqandos quiméricos de molécula accesoria Las células CLL se infectan con diversos MOI del adenovirus de mCD40L y luego se cultivan en placas de cultivo de tejidos de 48 o 24 cavidades durante diversas ocasiones después de la infección (48, 72 y 96 horas). Las células B CD19+ luego se analizan mediante el análisis FACS de multiparámetro en cuanto a la inducción de la expresión CD54 y CD80 mediante el mAb conjugado con isotiocianato fluorescente, específico para cada antígeno de superficie respectiva, como se describe en el ejemplo 1. El aumento en las cantidades de CD54 y CD80 se encuentran en las células que tienen las moléculas accesorias quiméricas que contienen el dominio o dominios derivados del gen del ligando CD40 de ratón. Un análisis más profundo de las células que contienen los genes quiméricos de molécula accesoria se realiza de conformidad con el ejemplo 1 (d). Las células que contienen los genes quiméricos de molécula accesoria que contiene los dominios derivados del gen del ligando CD40 de murino pueden estimular la producción del interferón gamma y la proliferación de células T. d. Expresión de los genes quiméricos de molécula accesoria que contiene dominios extracelulares próximos de dos moléculas accesorias distintas de las mismas especies. Se prepara un gen quimérico del ligando de molécula accesoria que contiene el dominio extracelular próximo del gen CD70 humano (dominio lll) con el resto de los dominios derivados del gen del ligando CD40 humano. Este gen se prepara usando técnicas biológicas como las descritas previamente en la presente. Este gen quimérico de ligando de molécula accesoria tiene la secuencia de ADN que se mostró como SEQ ID NO: 19. Se prepara un gen quimérico de ligando de molécula accesoria diferente que contiene el dominio extracelular proximal del gen de ligando CD40 de murino con el resto de los dominios derivados del gen de ligando CD40 humano. Este gen se prepara utilizando técnicas estándar como las descritas previamente en la presente. Este gen quimérico de ligando de molécula accesoria tiene la secuencia de ADN que se muestra como SEQ ID NO: 20. Los genes quiméricos de molécula accesoria que se muestran como SEQ ID NOS: 19 y 20 se insertan en los vectores apropiados como se describió en el ejemplo 1 y se introducen en las células neoplásicas humanas. La expresión de ese gen quimérico de molécula accesoria en las células se determina conforme se describió en el ejemplo 1.

La molécula quimérica accesoria codificada por cada uno de estos genes quiméricos de molécula accesoria se encuentra sobre la superficie de las células neoplásicas humanas usando el análisis FACS descrito en el ejemplo 1. Se encuentran cantidades incrementadas de CD54 y CD80 en las células que contienen los genes quiméricos de molécula accesoria usando las técnicas descritas en el ejemplo 1. Las células que contienen el gen quimérico de molécula accesoria son capaces de estimular la producción del interferón gamma y la proliferación de células T como se describió y se comprobó conforme al ejemplo 1. 3. Aumento de vacunación utilizando vectores que codifican para moléculas accesorias Se usaron los siguientes procedimientos para demostrar el aumento de un protocolo de vacunación usando un vector para terapia de genes que codifica para una molécula accesoria.

A. Aumento de la respuesta de anticuerpos en ratones co-inyectados con un vector para terapia de genes de molécula accesoria y placZ Se prepararon tres construcciones para terapia de genes diferentes usando técnicas estándar que incluyen las técnicas descritas en la presente. La primera fue un vector de control para terapia de genes, pcADN3, que no contenía ningún gen. La segunda, placZ, contenía el gen Lac-Z que codifica para ß-galactosidasa (ß-gal). La tercera, p-mCD4OL, contenía el gen de ligando CD40 de murino descrito en el ejemplo 1.

Antes de cualquier inmunización, se aisló suero de un ratón BALB/c de 6 a 8 semanas para determinar la cantidad de cualquier anticuerpo inicial para ß-galactosidasa. Se inyectó cada animal i.m. con 100 microgramos de ADN plasmídico por inyección. Se aplicaron 4 inyecciones separadas a intervalos de una semana.

Antes de la tercera inyección, los animales fueron sangrados para monitorear la respuesta inicial del anticuerpo a ß-gal. Una semana después de la inyección final de ADN plasmídico, los animales fueron sangrados para monitorear la respuesta final del anticuerpo a beta-galactosidasa. Para verificar la sensibilidad de la prueba, se probaron cantidades conocidas de anticuerpos anti-ß-gal aislados en paralelo de un antisuero anti-ß-gal.

Se probaron diluciones de suero de 1 :40, 1 :200 o 1 :1000 en una prueba de ELISA para anticuerpos anti-ß-gal. Para esto último, se recubrieron placas de ELISA de microtítulación de poliestireno con ß-gal a 10 microgramos/ml en solución salina de pH regulado con fosfato. Se lavaron las placas tres veces con regulador de pH de bloqueo que contenía 1% de albúmina de suero de bovino (BSA), 0.2% de Tween 20 en solución salina de pH regulado con borato (BBS) (borato a 0.1 M, NaCI a 0.2 M, y pH de 8.2). Se añadieron 50 microlitros de suero diluido a cavidades separadas. Después de por lo menos 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron las placas tres veces con regulador de pH de bloqueo y después se dejaron reaccionar con un anticuerpo IgG de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa.

Una hora después, se lavaron nuevamente las placas cuatro veces con regulador de pH de bloqueo y se incubaron con 25 ml de substrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD). Se midió la absorbancia a 405 nm de cada cavidad usando un lector de microplaca (Molecular devices, Menlo Park, CA). Entre más alta la lectura de O.D., mayor la cantidad de anticuerpo específico en la muestra.

Se proveen los datos para cada uno de los dos experimentos en los cuadros IV y V que se presentan a continuación en hojas separadas. Se resumen también los resultados en los cuadros VI y Vil recopilando los datos de los dos experimentos. En la página de resumen, n significa el número de animales en cada uno de los cuatro grupos. S.D. significa la desviación estándar y Avg. es el promedio de lectura O.D. para todos los animales en un grupo particular.

Los resultados del grupo 4 demuestran que el uso de un vector para terapia de genes que codifique para un ligando de molécula accesoria (CD40L) incrementa la inmunización contra ß-gal codificada por un vector para terapia de genes o genética. La lectura O.D. promedio de la dilución 1 :40 de los sueros de animales de este grupo es significativamente mayor que la de los grupos 1 , 2 y 3 (P< 0.05, pruebas t de Bonferroni, véase cuadro Vil).

Los datos de un experimento adicional refuerzan más el descubrimiento que el vector para terapia de genes que codifica para un ligando de molécula accesoria incrementa la inmunización contra ß-gal (figura 16). Aquí, se co-inyectaron pCD4OL y placZ en músculo esquelético, para probar el incremento de la respuesta inmune a placZ, un vector a base de pcADN3 que codifica para ß-galactosidasa de E. coli. Las actividades Ab anti-ß-gal relativas se determinaron por medio de una prueba de ELISA. Como se esperaba, los ratones inyectados con el vector pcADN3 no modificado o el pcD40L solo no produjeron anticuerpos detectables para b-gal (figura 16A). Se inyectaron los ratones con 100 µg de pcADN3 (barra a cuadros), 50µg de pcADN3 + 50µg de pCD40L (barra con líneas), 50 µg de pcADN3 + 50 µg de placZ (barra a rayas), o 50 µg de pCD40L + 50 µg de placZ (barra oscura). Por otro lado, los ratones que recibieron placZ y pcADN3 desarrollaron anticuerpos anti-ß-gal detectables una semana después de la cuarta inyección final, el d28. Los ratones que recibieron placZ y pCD40L desarrollaron concentraciones más altas de anticuerpos anti-ß-gal que los ratones inyectados con placZ y pcADN3. La figura 16B representa los análisis ELISA de diluciones en serie de sueros recolectados el d28, y muestra que los ratones co-inyectados con placZ y pCD40L tuvieron una concentración ocho veces más alta de anticuerpos anti-ß-gal el d28 que los ratones que se trataron con placZ + pcADN3. i. Producción de subclase de inmunoqlobulina estimulada por la co-inveccion de vector de molécula accesoria A pesar de incrementar la concentración de la respuesta del anticuerpo anti-ß-gal, no se alteró la subclase del igG anti-ß-gal inducida por la inyección de placZ con la coinyección de pCD40L. Los anticuerpos lgG2a anti-ß-gal predominaron sobre los anticuerpos de la subclase IgGi en los sueros de los ratones inyectados ya sea con placZ y pcADN3 o placZ y pCD40L (figura 17). También se ilustran las mediciones de O.D. en la prueba de ELISA de IgG-i anti-ß-gal e lgG2a anti-ß-gal presentes en los sueros pre-inmunes (barra en rayas) o sueros post-inmunes (barra oscura), recolectados el d28) de cada grupo de ratones, inyectados como se indicó en la abscisa. En contraste, los ratones BALB/c que se inyectaron con proteína ß-gal desarrollaron anticuerpos IgG-i anti-ß-gal de manera predominante y anticuerpos lgG2a anti-ß-gal no detectables. ii. Aumento de la vacunación por medio del vector de molécula accesoria gue reguiere la coinveccion con placz en el mismo sitio. El efecto adyuvante del plásmido pCD40L en la respuesta del anticuerpo anti-ß-gal se notó sólo cuando se inyectó en el mismo sitio que el placZ (figura 18). Los grupos de ratones BALB/c (n=4) recibieron inyecciones intramusculares de placZ y pCD40L simultáneamente en el mismo sitio, o como inyecciones separadas simultáneas en sitios distales (cuadríceps de la pata posterior izquierda y derecha). Un grupo de control recibió inyecciones intramusculares de placZ y pcADN3 en el mismo sitio. Los animales fueron sangrados el d28 y los sueros se probaron para Ab anti-ß-gal a diferentes diluciones, como se indicó en la abscisa. La gráfica ilustra un experimento representativo que ilustra la O.D. media a 405 nm de cavidades multiplicadas de cada una de las muestras del suero para cada grupo, a una dilución de 1 :40, 1 :200 ó 1 :1000. Los animales que se inyectaron simultáneamente con placZ y pCD40L, pero en diferentes lugares, no desarrollaron anticuerpos anti-ß-gal detectables hasta el d28. Además, las concentraciones del anticuerpo anti-ß-gal de los sueros de dichos animales el d28 fueron similares a las de los ratones que recibieron placZ y pcADN3, y significativamente menores que las de los animales que recibieron placZ y pCD40L simultáneamente en el mismo lugar. iii Incremento de la vacunación cuando el vector de molécula accesoria v placZ son co-invectados en la dermis El plásmido pCD40L también incrementó la respuesta del anticuerpo anti-ß-gal al placZ cuando se inyectó en la dermis. En el experimento que se muestra en la figura 19, los ratones recibieron inyecciones intradérmicas, cerca de la base de la cola, con ya sea 50 µg de pcADN3 (barra de cuadros), 250µg de pcADN3 + 265 µg de pCD40L (barra lineada), 25µg de pcADN3 + 25 µg de placZ (barra a rayas), o 25 µg de pCD40L + 25 µg de placZ (barra sólida). Se llevaron a cabo las inyecciones, los sangrados y los análisis de ELISA como se muestra en la figura 16A. Los grupos de la barra en cuadros y los de la barra lineada consistían cada uno de 8 ratones, mientras que los grupos de la barra a rayas y de las barras oscuras consistían cada uno de 12 ratones. La altura de cada barra representa la O.D. media de los sueros a una dilución 1 :14 de cada grupo ± S.E. Un análisis estadístico de los datos indicó que los grupos de la barra a rayas y de la barra oscura son independientes (P < .05). Como se observó con la inyección intramuscular, los ratones co-inyectados con placZ y pCD40L desarrollaron anticuerpos anti-ß-gal de suero detectables una semana después de la segunda inyección (d14), y dos semanas antes de que los ratones fueran inyectados con placZ y pcADN3. Más aún, estos animales también tenían una titulación media ocho veces más alta de anticuerpos anti-ß-gal que los ratones del grupo inyectado con placZ el d28. Los ratones inyectados con el vector pcADN3 no modificado o con el pCD40L solamente, no produjeron anticuerpos detectabies al ß-gal. b- Incremento de la respuesta de CTL en ratones co-inyectados con un vector para terapia de genes de molécula accesoria v placZ.

Se sometió a prueba la capacidad del pCD40L para incrementar la inducción, por medio del placZ, del CTL específico para las células objetivo de expresión de b-gal singénicas. Los ratones BALB/c co-inyectados con pCD40L y placZ en el músculo esquelético (figura 20A) o en la dermis (figura 20B) generaron cantidades más altas de CTL específico para P13.2, una línea de células P815 transfectada con placZ, que los ratones co-inyectados con placZ y pcADN3. A una relación efectopobjetivo de 5:1 , las células efectoras de esplenocitos de los ratones que recibieron inyecciones intramusculares de placZ y pCD40L lograron más del 20% de lisis de P13.2 específica. En contraste, cuando se utilizaron esplenocitos de ratones que recibieron la inyección de control con placZ y pcADN3, se requirió una relación 9 veces mayor del efector a las células objetivo para lograr este nivel de lisis específica. De manera similar, las células efectoras de esplenocitos de los ratones que recibieron inyecciones intradérmicas de placZ y pCD40L aniquilaron más del 50% de las células P13.2 a relaciones efectopobjetivo de 4:1. Para lograr los niveles comparables de la lisis específica se requirieron relaciones efectopobjetivo ocho veces mayores utilizando esplenocitos de ratones que recibieron inyecciones intradérmicas de placZ y pcADN3. Sin embargo, los esplenocitos de ratones co-inyectados con pCD40L y placZ no tuvieron mayor actividad de CTL no específica para las células P815 que la de los ratones que recibieron placZ junto con pcADN3 (figura 20). Como se esperaba, los esplenocitos de los ratones que recibieron inyecciones de pcADN3 solamente, o pcADN3 y pCD40L, no mediaron lisis específica de células P13.2 o P815.

CUADRO IV Expepmento # 1 Inyecciones un. de ADN plasmídico:: 4/3/96; 4/10/96; 4/17/96; 4/24/96 ELISA para anticuerpos anti- Dilución de sangrado Dilución de sangrado Dilución de pre-sangrado (4/3) beta galctosidasa (4/17) (5/1) Grupo 1/140 1/200 1/1000 1/40 1/200 1/140 1/200 1/1000 Animal 1/1000 pcADN3 (p-control, 1 0.09 0.11 0.09 0.06 0.06 0.06 0.11 0.17 0.11 100 mcg) (Vector de Control) 2 0.11 0.09 0.09 0.07 0.07 0.07 0.10 0.09 0.08 3 0.12 0.11 0.10 0.09 0.09 0.10 0.12 0.08 0.08 4 0.11 0.10 0.10 0.08 0.11 0.07 0.11 0.07 0.08 Avg. 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 S.D. 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.01 0.04 0.01 p-lacZ (50 mcg) 5 0.13 0.10 0.10 0.07 0.11 0.06 0.15 0 10 0.08 + 6 0.10 0.11 0.10 0.07 0.06 0.06 0.22 0.15 0.14 p-Control (50 mcg) 7 0.19 0.10 0.18 0.07 0.07 0.06 0.78 0.29 0.12 8 0.10 0.09 0.10 0.08 0.07 0.07 3.04 1.84 0.77 Avg. 0.13 0.10 0.12 0.07 0.08 0.06 1.05 0.60 0.28 S.D. 0.04 0.01 0.04 0.01 0.02 0.00 1.36 0.84 0.33 p-lacZ (50 mcg) 27 0.06 0.06 0 06 0.13 0.11 0.08 2.30 1.68 0.72 + 18 0.06 0.06 0.06 0.27 0.13 0.10 2.35 0.09 0.28 pRcCMV-mCD40L 19 0.06 0.06 0.06 0.23 0.19 0.11 2.06 1.09 0.39 (p-mCD40L, 20 0.06 0.06 0.06 0.23 0.19 0.11 2.06 1.09 0.39 Avg. 0.06 0.06 0.06 0.74 0.47 0.21 2.25 1.00 0.47 S:D: 0.00 0.00 0.00 0.06 0.66 0.24 0.13 0.67 0.19 CUADRO V Experimento # 2 Inyecciones i.m. de ADN plasmídico: 6/5/96; 6/12/96; 6/19/96; 6/26/96 Diluciones de suero para anticuerpos antibeta galactosidasa Dilución de sangrado Dilución de pre-sangrado (6/5) Dilución de sangrado (7/19) (8/3) Grupo 1/140 1/200 1/1000 1/40 1/200 1/1000 1/140 1/200 1/1000 Animal p-Control 850 mcg) 9 0.02 0.02 0.06 0.04 0.01 0.01 0.04 0.03 0.05 + 10 0.06 0.02 0.10 0.02 0.02 0.00 0.08 0.09 0.05 p-mCD40L (50 mcg) 11 0.02 0.02 0.07 0.03 0.01 0.00 0.02 0.02 0.05 12 0.06 0.03 0.05 0.18 0.04 0.01 0.11 0.04 0.05 Avg. 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 S.D. 0.02 0.01 0.02 0.07 0.01 0.01 0.04 0.03 0.00 p-lacZ (50 mcg) 5 0.02 0.03 0.02 0.06 0.04 0.04 0.39 0.11 0.03 + 6 0.03 0.02 0.03 0.14 0.03 0.04 2.85 1.58 0.41 p-Control 850 mcg) 7 0.56 0.13 0.06 0.29 0.06 0.02 0.22 0.07 0.03 8 0.01 0.02 0.05 0.06 0.02 0.02. 0.11 0.04 0.05 Avg. 0.15 0.05 0.04 0.13 0.04 0.03 0.89 0.45 0.13 S.D. 0.27 0.05 0.02 0.11 0.02 0.01 1.31 0.75 0.19 p-lacZ (50 mcg) 13 0.23 0.06 0.05 0.28 0.07 0.02 2.37 0.73 0.18 + 14 0.02 0.02 0.03 0.04 0.02 0.01 3.05 2.23 0.59 p-mCD40L (50 mcg) 15 0.02 0.02 0.02 0.89 0.21 0.05 2.46 0.96 0.21 16 0.05 0.04 0.02 0.11 0.04 0.04 2.75 1.39 0.34 Avg. 0.08 0.04 0.03 0.33 0.08 0.03 2.66 1.33 0.33 S:D: 0.10 0.02 0.02 0.39 0.09 0.02 0.31 0.67 0.19 CUADRO VI Resumen ! Beta-gal Pre Inmune ! Beta-gal inicial : Beta-gal final 1/140 1/200 1/1000 1/140 1/200 1/1000 1/40 1/200 1/1000 1 ) p-Control (n = 4) Avg. 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 S.D. 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.01 0.04 0.01 2) p-mCD40L + p- Avg. 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 Control (n = 4) S.D. 0.02 0.01 0.02 0.07 0.01 0.01 0.04 0.03 0.00 3) p-lacZ + p- Avg. 0.11 0.04 0.04 0.11 0.03 0.03 0.61 0.31 0.09 Control (n = 8) S.D. 0.22 0.04 0.01 0.09 0.02 0.02 1.11 0.62 0.16 4) p-lacZ + p- Avg. 0.11 0.04 0.03 0.25 0.06 0.03 2.06 1.04 0.26 mCD40L (n = 8) S.D. 0.10 0.02 0.01 0.32 0.07 0.02 0.97 0.69 0.18 Estándar anti-beta-galactosidasa 67 ng 22 ng 7.4 ng 2.5 ng .82 ng .27 ng O.D. 3.01 2.98 2.05 1.10 0.52 0.26 3.14 3.14 2.25 1.20 0.56 0.26 CUADRO VII Pruebas t de Bonferroni Grados de libertad: 20 Análisis de variación de una vía Análisis de variación de una sola vía s2 bet MSbet 3.05 F = 4.81 P = 0.002 s2_wit Mswit 0.63 4. Tratamiento de neoplasia usando un vector para terapia de genes que contiene un gen de molécula accesoria o un gen quimérico de molécula accesoria a. Tratamiento de neoplasia en ratones Se ha demostrado el tratamiento de una neoplasia en un sistema de modelo de ratón usando los genes que codifican para los ligandos de molécula accesoria de la presente invención. Los vectores para terapia de genes que contienen un gen de ligando de molécula accesoria (ligando CD40 de murino) se prepararon como se había descrito previamente en los ejemplos anteriores. Estos vectores para terapia de genes se usaron para introducir ese gen de ligando de molécula accesoria en células neoplásicas, células de línea 1 , de un tumor que se originó en ratones BALB/c. Se introdujeron moléculas accesorias en las células neoplásicas de conformidad con los ejemplos anteriores. Se confirmó la expresión del ligando de molécula accesoria sobre la superficie de estas células neoplásicas usando citometría de flujo como se había descrito en los ejemplos anteriores. La efectividad de los genes de ligando de molécula accesoria para tratar la neoplasia se demostró como sigue: se inyectaron i.p. ratones BALB/c hembra (6-8 semanas) con 1.0 x 105 de células neoplásicas de línea 1 irradiadas. Las células neoplásicas de línea 1 se derivan de un adenocarcinoma espontáneo de pulmón en un ratón BALB/c. Esta célula neoplásica ha sido descrita por Blieden y otros., Int. J. Cáncer Supp.. 6:82 (1991 ). Otros ratones BALB/c hembra fueron inyectados i.p. con 1.0 x 105 de células tumorales de línea 1 irradiadas que se habían transducido previamente con el vector para terapia de genes que codifica para el gen de ligando de molécula accesoria (CD40 de murino) como el descrito anteriormente. Se dejó que cada grupo de ratones generara una respuesta inmune durante 10 días. Después de 10 días, cada ratón fue atacado con 1.0 x 104 de células neoplásicas de línea 1 no irradiadas. Estos ratones se monitorearon después para verificar la formación de tumores y después se sacrificaron cuando los tumores crecieron a 2.0 cm debido a su morbilidad. Los resultados de este monitoreo se muestran en la figura 7. Como se puede apreciar en la figura 7, los ratones que se inmunizaron con la célula neoplásica que expresaba los ligandos de molécula accesoria de la presente invención sobre la superficie de la célula permanecieron libres de tumores durante todo el experimento. Los ratones que se inmunizaron con las células neoplásicas que no tenían los genes ligando de molécula accesoria de la presente invención sucumbieron al tumor 50 días después del ataque con células neoplásicas. La figura 21 demuestra una submodulación de CD40L humana, pero no CD40L de murino, en líneas de células de tumor de pulmón que expresan CD40. Las líneas de células humanas HeLa (carcinoma cervical CD40-negativo, figura 21 A), A427 (carcinoma de pulmón CD40-negativo, figura 21 B), NCI 460 (carcinoma de células grandes de pulmón CD40-positivo semanal, figura 21 C) y SK-Mes-1 (tumor de células escamosas de pulmón fuertemente CD40-positivo, figura 21 D) se infectaron con un adenovirus que codifica para lac-z (Ad-LacZ), CD40L de murino (Ad-mCD40L) y CD40L humano (Ad-hCD40L) a una MOI de 0 (blanco), 1 , y 10. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se determinaron tanto la expresión de superficie de CD40L humano como de CD40L de murino. El porcentaje de células que expresan el ligando se gráfica en el eje Y. El CD40L de ratón y humano se expresan a niveles iguales en las líneas de células CD40-negativas. Sin embargo, solamente la expresión de CD40L de murino es estable sobre las líneas de células que expresan CD40. En contraste con mCD40L, el CD40L humano es submodulado sobre tumores CD40-positivos.

Los datos graficados en la figura 22A indican que la unión a CD40 induce la expresión de marcadores de superficie de tumor. El tratamiento de las líneas de células de cáncer en pulmón que expresan CD40 con aCD40 mAb dio como resultado la expresión incrementada de los marcadores de superficie de célula de tumor CD95 (Fas), y CD54 (ICAM-1 ) y antígenos de histocompatibilidad superior clase 1 (MHC I). NCI 460, un carcinoma de célula grande de pulmón CD40-positivo semanalmente, se incubó con un anticuerpo monoclonal CD40-específico (línea gruesa), o MOPC21 , un mAb de control de isotipo (línea delgada), en fibroblastos de ratón que expresan CD32 durante 48 horas. Después de la incubación de 48 horas, las células del tumor pulmonar se analizaron para expresión de CD-95, CD-54 y MHC-1 mediante FACS.

La figura 22B muestra de nuevo la submodulación de las células de tumor CD40L por CD40-positivas de humano. Las células de tumor HeLa (CD40-negativo), CLL (CD40-positivo), y SK-MES-1 (CD40-positivo) se cocultivaron durante 24 horas con las células T donadoras normales activadas por CD3 en una relación de célula de tumopcélula T de 2.5:1. Después del cocultivo, las células T que expresan CD2 se analizaron para la expresión de superficie CD40L por FACS. Las líneas delgadas representan a las células T teñidas con el anticuerpo de control de isotipo marcado con FITC (MOPC21) y las líneas gruesas representan a las células T activadas teñidas con el anticuerpo aCD40L marcado con FITC (anticuerpo aCD154). Las líneas de célula de tumor positivo CD40, SK-MES-1 , y CLL, no expresan al ligando CD40 en sus superficies.

- . Expresión de ligando de molécula accesoria de humano y ratón, ligando Fas, en linfocitos sanguíneos de humano a. Construcción de una estructura genética y vector para terapia de genes que contiene al gen de ligando Fas de humano y ratón El gen de ligando de molécula accesoria y de humano (ligando Fas de humano) o el gen de ligando de molécula accesoria de murino (ligando Fas murino) se construyó utilizando a los genes de humano y murino respectivos. Una molécula de célula de accesorio alterada, en la cual se removió al sitio de corte MMP putativo, se hizo y se denominó ?FasL-ADN3pc. La secuencia nucleótida de ?FasL-ADN3pc se enlistó como ID de SEC NO: 40. Los nucleótidos 325 a 342 de ligando Fas de humano, que codifica a seis aminoácidos, se separan del ?FasL. El diseño de ?FasL se basó en el razonamiento de que el dominio lll contiene sitios más accesibles para los MMPs, y de esta forma pueden ser el objetivo en la molécula para el corte de la superficie de la célula. Las secuencias del gen de ligando Fas humano se han determinado y se enlistan como ID de SEC NOS: 13 y 30 (registro Genbank U11821 ). Se han determinado las secuencias de los genes de ligando Fas de ratón y se enlistan como ID de SEC NO: 14 (C57BLJ6, registro Genbank U10984) y 31 (Balb/c, registro Genbank U58995). Se ha determinado la secuencia del gen de ligando Fas de rata y se enlista como ID de SEC NO: 25 (registro Genbank U03470). Las estructuras quiméricas se hacen, como se describe en el ejemplo 2 para las estructuras quiméricas de ligando CD40, en las que el dominio lll de ligando Fas de humano se reemplaza con los dominios de otras proteínas, particularmente proteína de la familia TNF. Las estructuras quiméricas incluyen, pero no se limitan a, ligando Fas de humano con dominio lll reemplazado para el dominio lll del ligando Fas de murino (la secuencia quimérica enlistada como ID de SEC NO: 37, línea ascendente de secuencia mostrada en la figura 37), se reemplaza por el dominio lll de humano CD70 (secuencia quimérica enlistada como ID de SEC NO: 38, línea ascendente de secuencia mostrada en la figura 38), o se reemplaza con el dominio I de humano CD70 (secuencia quimérica enlistada como ID de SEC NO: 39, secuencia de línea ascendente mostrada en la figura 39). Las estructuras quiméricas en las que los dominios múltiples, por ejemplo, dos copias del dominio lll CD70 de humano, se insertan en el ligando Fas de humano en lugar del dominio lll, también se hacen utilizando los métodos descritos en el Ejemplo I. También se hacen las estructuras quiméricas en las que las secuencias sintéticas se utilizan para reemplazar al dominio lll del ligando Fas de humano. i. Clonación de ligando Fas de humano El ADNc que codifica al ligando Fas de humano se subclonó en el vector ADN3pc de expresión eucariótica. Los linfocitos sanguíneos donadores normales se activaron durante 4 horas con 1 ng/ml de PMA más 0.5 uM de ionomicina. El ARN total se aisló con el equipo Qiagen Rneasy. El ADNc entonces se sintetizó del ARN poli-A con iniciadores oligo-dT utilizando al equipo de síntesis de ADNc Gibco-BRL Superscript. El gen que codifica al ligando Fas de humano entonces fue PCR amplificado con los iniciadores específicos de ligando Fas (iniciador sentido, ID de SEC NO: 32, iniciador antisentido, ID de SEC NO: 33). El producto PCR de ligando Fas entonces se subclonó en ADN3pc utilizando técnicas de biología molecular estándares. Los productos RT-PCR, subclonados en ADN3pc se denominaron FasLh-ADN3pc. ii. Clonación de ligando Fas de murino Los genes de ligando Fas de murino de cepas Balb/c y C57/BL6 de ratones también se amplificaron después de la activación de los esplenocitos de ratón con PMA más ionomicina como se describe anteriormente, y se amplificaron de ADNc sintetizado de poli-A como se describe anteriormente (iniciador sentido, ID de SEC NO: 34, iniciador antisentido ID de SEC NO: 35). Dichos genes se subclonaron en el vector de expresión OBJETIVOp (Promega Madison, Wl). Los productos RT-PCR, subclonados en ADN3pc se denominaron como FasLm-ADN3pc. iii. Construcción de vector adenovirus Para la construcción de los vectores adenovirus que codifican al ligando Fas de humano, ligando Fas de murino o ligando ?Fas, el inserto de ADNc clonado se subclonó en el plásmido pRc/RSV (Invitrogen, San Diego, CA) en el sitio Hindlll-Xbal. Un fragmento Bglll-Xhol con el promotor-impulsor de RSV y la secuencia de señal poli-A de hormona de crecimiento bovino se subclonó en el sitio BamHI-Xhol del plásmido MCS (SK) pXCX2. El plásmido MCS (SK)pXCX2 es una modificación del plásmido pXCX2, en la que la secuencia polienlazadora pBluescript se clonó en la región E1. El plásmido resultante entonces se cotransfectó junto con pJM17 en 293 células utilizando el método de fosfato de calcio. Las placas aisladas y los vectores adenovirus se recolectaron y expandieron mediante la infectación de las 293 células. Se obtuvieron las preparaciones de adenovirus dei título superiores, como se describió anteriormente, las cuales utilizan un gradiente de cloruro de cesio para concentrar las partículas de virus mediante un paso gradiente, con las densidades de 1.45 g/cm3 y 1.20 g/cm3, cuyas muestras se centrifugan durante 2 horas en un rotor SW41 (Beckman, Brea, CA) a 25,000 rpm a 4°C. La banda de virus se determinó utilizando una columna de grado de ADN Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ), y el virus aislado se almacenó a -70°C en fosfato-solución salina regular en su pH con 10% de glicerol. La concentración del virus se determinó mediante la infección de las 293 células permisivas a varias diluciones y contando el número de placas. Las concentraciones típicamente varían de 1010 a 1012 placas que forman unidades/ml. Las estructuras de adenovirus se denominan Ad-FasLh, Ad-FasLm y Ad-?FasL. b. Introducción de los genes de ligando Fas de murino y humano en células humanas Las estructuras FasLh-ADN3pc, FasLm-ADN3pc y ?FasL-ADN3pc se transfectaron en 293 mediante electroporación. Las células transfectadas se seleccionaron en un medio que contiene G418. Los transfectantes de ligando Fas se tamizaron para la expresión del transgen, utilizando un anticuerpo de ligando anti-Fas y citometría de flujo. Los métodos utilizados son similares a aquellos descritos para la transfección de CD40L en las células CLL. Para la infección del adenovirus FasL, las células CLL o células HeLa frescamente descongeladas y lavadas se suspendieron en 0.5 a 1 mL del medio de cultivo para cultivar a 37°C en u 5% de incubador de CO2 en aire. Los adenovirus se agregaron a las células a varias multiplicidades de infección (MOI), y las células infectadas se cultivan durante 48 horas, a menos de que se afirme lo contrario, antes de analizarse para la expresión del transgen. c. Expresión de los genes de ligando Fas en las células humanas Los ratones con el trastorno linfoproliferativo o linfoproiiferativo generalizado son incapaces de suprimir a las células autoreactivas activadas fuera del timo. Lo anterior se relaciona con el hecho de que, en dichos ratones, las interacciones entre el receptor Fas y un ligando de molécula accesoria, ligando Fas, son defectivas. Dichos animales desarrollan numerosos trastornos incluyendo linfadenopatía, esplenomegalia, nefritis y patología autoinmune sistemática que se asemeja al observar a los pacientes con eritematosus de lupus sistemático o artritis reumatoide (RA). Es concebible que las interacciones normales entre el receptor Fas y el ligando de molécula accesoria que son responsables de la claridad de los linfocitos activados de las uniones pueden ser impares de los pacientes de RA. Los linfocitos sinoviales de RA expresan al receptor Fas en una proporción mayor a la de los linfocitos sanguíneos RA relacionados a linfocitos sanguíneos donadores normales relacionados. Por otro lado, los linfocitos sinoviales RA expresan muy pocos o ningún ligando de molécula accesoria. Aunque los linfocitos sinoviales RA son sensibles a la apóptosis inducida de Fas, es posible que la expresión local de ligando Fas en la unión RA puedan servir para eliminar a las células mononucleares sinoviales que potencialmente medían a la patología autoinmune RA. La figura 23 muestra que la expresión de ligando Fas en los linfocitos se inhibe mediante la exposición al fluido sinovial RA. Las células T sanguíneas donadoras normales se activaron durante 5 horas con 1 ng/ml de PMA más 0.5 µM de ionomicina. Las células se incubaron en la presencia del plasma sanguíneo de artritis reumatoide (círculo), fluido sinovial RA (rombo), o ninguno (cuadro). Además, las células se incubaron con el incremento de concentraciones del inhibidor BB94 de MMP. Después de la activación, se analizaron las células para la expresión de la superficie de ligando Fas mediante FACS. El porcentaje de células que expresan al ligando Fas se muestran en la figura 23. Dicho experimento demuestra que hay un factor presente en el fluido sinovial RA y suero que evita la expresión de la superficie de ligando Fas. d. Función de ligando de molécula accesoria de humano, murino y guimérico, ligando Fas Para determinar la capacidad de las estructuras ?FasL, las células transfectadas mencionadas anteriormente se mezclan con la línea de célula T humana sensible de ligando Fas, JURKAT. Después de 4 horas de cocultivo, las células JURKAT no adherentes se recolectaron y se evaluaron para la apóptosis. El compuesto fluorescente de yoduro de 3,3' dihexiloxacarbocianina (DiOC6) se utilizó para evaluar la apóptosis utilizando una modificación de un protocolo previamente descrito. Para lo anterior, las células se lavaron una vez a temperatura ambiente en solución salina regulada en su pH de fosfato (PBS, pH 7.2). Las células se colocaron en cavidades separadas de una placa de microtítulo de plástico de fondo en U de 96 cavidades a 105-5x105 células/cavidad en 50 ml de volumen total. Si se indica, las cantidades de saturación de los anticuerpos conjugados PE se lavan después de la adición de DiOCß y yoduro de propidio (Pl). El DiOCß y Pl se utilizaron a concentraciones finales de 40 nM y 10 ng/ml, respectivamente. Las células entonces se incubaron durante 15 minutos a 37°C, en un incubador de cultivo de tejido de 5% de CO2. Las células teñidas entonces se lavaron dos veces en PBS helado y se suspendieron en 200 ml de SM y se analizaron mediante FACS. Las células muertas y residuos con perfiles característicos hacia adelante y de dispersión de luz y teñido Pl se excluyen del análisis. La capacidad de las células que expresan al ?FasL-ADN3pc para dirigir la apóptosis mediada por Fas de las células que expresan CD95 se compara con la de las células que expresan FasL-ADN3pc. La estabilidad relativa de los productos de proteína codificados por ?FasL-ADN3pc o FasL-ADN3pc se pre y postcultivan con fluido sinovial RA, y con o sin los inhibidores de metalo-proteinasa, se ensayan mediante citometría de flujo de células que expresan cualquier ligando. 6. Tratamiento de artritis con vectores para terapia de gen gue codifican un ligando de molécula accesoria, ligando Fas Las estructuras de ligando Fas heterólogas, hechas como se describió anteriormente, que muestran la estabilidad superior de la expresión y combinación con mayor capacidad de mediar la apóptosis inducida de Fas, se utilizan en la terapia de gen para RA. Las estructuras terapéuticas potenciales se prueban en modelos de ratón y caracterizados de artritis para lograr la eficacia y función in vivo. a. Tratamiento de terapia de gen de artritis en ratones i. Modelos de ratón para artritis Un modelo de artritis de ratón es la artritis inducida de colágeno. Se sabe que ia inyección DBA/1 de ratones con colágeno de tipo II en todo el adyudante de Freund (CFA) induce una artritis con sinovitis y erosiones que se asemejan histológicamente al RA. Para otros estudios, los ratones DBA/I machos se inmunizan con colágeno de tipo II bovino dentro del adyuvante de Freund en el día 0 y se impulsan intraperitonealmente (i.p.) en el día 21. En el día 28 se les da a los animales una inyección i.p. adicional con lipopolisacárido (LPS) y/o el mismo tipo de colágeno, o una inyección de ácido acético. La injerencia y/o rojez de una pata delantera o trasera en animales inmunizados con colágeno típicamente se detecta en la tercera o cuarta semana después de la segunda inyección. Las vértebras se afectan sólo ocasionalmente, y entonces solamente unas semanas después de la injerencia de inyección periférica inicial. Las uniones afectadas muestran cambios histológicos iniciales de edema sinovial, después de la hiperplasia sinovial. Otro modelo animal, recientemente descrito por Kouskoff, V. y otros, en Cell 87:811-822 (1997) se generó de manera de manera fortuita, mediante el cruzamiento de una línea de ratón transgénico de receptor de célula T (TCR) con la cepa no obesa diabética (NOD) para producir el modelo de ratón KRN x NOD de RA. El resultado de dicho acoplamiento desarrolla universalmente una enfermedad conjunta que es altamente similar a la de los pacientes con RA. Además, la enfermedad en dichos animales tiene un tiempo inicial y reproducible de aparición en un curso altamente reproducible. La artritis aparentemente se induce mediante el reconocimiento oportuno de una molécula de clase II de un complejo de histocompatibilidad mayor derivado de NOD (MHc) mediante el TCR, transgénico, conduciendo el rompimiento en los mecanismos generales de auto-tolerancia y auto-reactividad sistemática. ii) Alivio de síntomas de artritis en ratones tratados con un vector para terapia de genes gue codifica un ligando de molécula accesoria Se ha adaptado y modificado un protocolo originalmente descrito por Sawchuk y colegas para los vectores de adenovirus de microinyección en uniones de ratón. Con el uso de dicho procedimiento se puede inyectar reproduciblemente un volumen de 5 µl en el espacio de articulaciones de la rodilla del ratón. En dicho procedimiento, los ratones se anestesian con metofano. Una pequeña incisión de aproximadamente 2-3 mm se hace con una hoja de escalpelo # 11 en la piel con el aspecto lateral de la rodilla para visualizar el ligamento rótulo-tibial. Se pueden inyectar hasta 5 µl de fluido utilizando una jeringa µl Hamilton micro-100 y una aguja de 30-gauge. Después de la inyección, la incisión de la rodilla se cierra con Nexabond (Veterinary Products Laboratory). Las concentraciones de adenovirus típicamente exceden a las unidades de formación de placa 1010 (pfu) por ml, haciendo posible suministrar al menos 5 x 108 en las uniones de la rodilla, como se mencionó anteriormente. Los animales de control se inyectan con el vector Ad-lacZ de control, un vector de adenovirus de replicación-defectivo que carece de un transgén, o con el regulador de pH utilizado para suspender el virus (10 mM Tris, 1 mM MgC , 10% de glicerol). En otro método, los esplenocitos se cosechan de los ratones que son singeneicos para el animal hospedero pretendido para la transferencia adoptiva de células transducidas. La proliferación de célula se inducirá con IL-12 exógeno (100 unidades/ml) durante 48 horas. Las células se cuentan y entonces se vuelven a colocar en placas a densidades de células de 5 x 105 x 1 x 106 por ml en un plato de 12 cavidades con 1 ml de medio de cultivo completo por cavidad. El virus y el ConA se agregan al mismo tiempo de la colocación de placa en la presencia de polibreno (8 µg/ml). El medio se cambia 24 horas después de la infección con el medio completo que contiene 100 unidades de IL-2 recombinante por ml. Las alícuotas de las células transducidas se examinan, para la expresión de ligando Fas, 48 horas después de la infección mediante citometría de flujo. Los animales reciben números estandarizados de células que producen citocina o control de células intraperitonealmente transfectadas de imitación. Las suspensiones de célula concentradas se inyectan directamente en el sinovio de ratón como se describió en la sección 4A anterior. En paralelo, las alícuotas de las poblaciones de células transferidas se mantienen en el cultivo de tejido complementario con el IL-2 exógeno.

Los ratones se monitorean en una forma mezclada para las señales de artritis. Se registra la fecha de inicio de enfermedad y la severidad clínica de cada articulación o grupos de articulaciones (dedos de los pies, tarso, tobillo, muñeca, rodilla) se clasifica de la siguiente manera: 0 (normal), 1 (eritema), 2 (ingerencia), 3 (deformidad), 4 (necrosis). Los resultados se resumen para dar el resultado artrítico. La severidad de artritis se expresa como el resultado medio observado en un día dado, como en medio del resultado artrítico máximo alcanzado por cada ratón durante el curso clínico de la enfermedad. En el momento de la muerte, las patas traseras se disecan de manera libre y se procesan para la examinación histológica o para RT-PCR. La severidad histológica de la artritis se registra en una escala de 0-3 para la proliferación sinovial y la infiltración de célula inflamatoria, en donde un registro de 0 = normal y 3 = severo. Para los ratones que reciben la inyección intracinovial de control del vector de adenovirus de prueba, se compara el nivel de artritis observado entre los sitios contralaterales. Además el registro de articulación general menor al de la articulación inyectada para todo el animal se compara con el observado en la articulación inyectada con el control o vector de adenovirus de prueba. La administración local de los vectores de expresión de adenovirus de ligando Fas resultará en la claridad de las células activadas, como se probó mediante la medición de los niveles relativos de ARN mensajero de CD80 mediante RT-PCR cuantitativo. De igual manera, dicho tratamiento también conducirá a un nivel impulsado, si dicho nivel de apoptosis identificado en el tejido sinovial de ratón afectado se ensaya mediante el ensayo TÚNEL ("deoxinucleotidilo transferasa terminal (TdT) -marcación de extremo Nick dUTP mediadas"). El ensayo TÚNEL se lleva a cabo mediante la inmersión de las secciones en el regulador de pH TdT (30 mM Tris-HCl, pH 7.2, 140 nM de cacodilato de sodio, 1 mm de cloruro de cobalto), y entonces agregando TdT(GIBCO BRL, Grand Island, NY) y dUTP biotinilatado (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). La reacción se termina mediante la inmersión de las secciones en regulador de pH TB (300 mm de cloruro de sodio, 30 mm citrato de sodio). Subsecuentemente, las mezclas se tratan con estreptavidina de peroxidasa marcada y entonces se visualizan utilizando el equipo VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Para la inmunohistoquímica, las secciones se bloquean con 4% de leche descremada durante 30 minutos a temperatura ambiente, entonces se incuban con Absm biotinilatado para CD3, B220, CD80, o CD95 (Fas) de ratón. Dichos anticuerpos están disponibles de Pharmingen (San Diego, CA). b. Tratamiento de pacientes con artritis reumatoide con un vector para terapia de genes que codifica un ligando de molécula de accesorio, ligando Fas. Las estructuras de ligando Fas candidatas identificadas por tener un beneficio terapéutico potencial se utilizan en protocolos humanos para tratar al RA. Los protocolos humanos comprenden métodos in vivo o ex vivo para proveer las estructuras de ligando Fas. Además, las estructuras de ligando Fas se proveen potencialmente mediante métodos virales o no virales. Los métodos de las estrategias terapéuticas se describen a continuación. Una terapia ex vivo es similar a un protocolo descrito para la transplantación intraarticular de sinoviocitos autólogos retroviralmente translúcidos al antagonista de receptor de interleucina-1 sintetizado (Evan, Christopher y otros. Clinical Trial to Assess the Safety, Feasibility, and Efficaciy of Transferring a Potentially Anti-Arthritic Cytokine Gene to Human Joints with Rheumatoid arhtritis, Human Gene Therapy, Vol. 7, 1261-1280). En dicho procedimiento, después del diagnóstico clínico del RA, el sinovio se cosecha durante el remplazo de articulación total. Los slnoviocitos reaislados y expandidos, entonces se translucen o transfieren con el ligando Fas heterólogo en sionoviocitos (mediante retrovirus, adenovirus, ADN desnudo, etc). Los sinoviocitos modificados de gen entonces se vuelven a inyectar en el paciente, a quien se monitorea y se prueba para ei mejoramiento de los síntomas asociados con RA, y para la expresión y función del ligando Fas en sinoviocitos modificados. En otro protocolo ex vivo, una línea de célula inmortalizada halogenéica que expresa de manera estable al ligando Fas heterólogo se administra al paciente RA. En dicho protocolo, se estructura una línea de célula inmortalizada estable que expresa al ligando Fas (introducida mediante transacción del gen en la célula durante métodos no virales, tales como electroporación), o mediante transducción del gen en la célula). La línea de célula modificada se inyecta en el paciente, a quien se monitorea y prueba para el mejoramiento de los síntomas asociados de RA, y para la expresión y función del ligando hFas en sinoviocitos modificados. Una terapia con base in vivo es similar en concepto al mejoramiento de la artritis inducida de colágeno que utiliza un vector para terapia de genes de adenovirus de arenovirus de ligando Fas murino, descrito en Zhang, y otros, J. Clin. Invest. 100:1951-1957 (1997). En el uso de dicho enfoque, ei suministro de la estructura de ligando hFas o ?fasL quimérico dierectamente a las articulaciones de los pacientes RA se lleva a cabo utilizando métodos virales o no virales. En dicho procedimiento, la estructura de ligando Fas (por ejemplo adenovirus de ligandos hFas) se inyecta directamente en el sinovio. Los pacientes se monitorean y se prueban para el mejoramiento de los síntomas asociados con RA así como la prueba biológica para la expresión y función del ligando hFas en sinoviocitos modificados.

LISTADO DE SECUENCIAS (1 ) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTES: Kipps, Thomas J. Sharma, Sanjai Cantwell, Mark (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Vectores de expresión novedosos que contienen genes de ligando de molécula accesoria, y su uso para inmunomodulación y tratamiento de malignidades y enfermedad autoinmune. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 35 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Lyon & Lyon (B) CALLE: 633 West Fifth Street Suite 4700 (C) CIUDAD: Los Angeles (D) ESTADO: California (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 90071-2066 (v) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible 3.5" Capacidad de 1.44 Mb (B) COMPUTADORA: PC IBM COMPATIBLE (C) SISTEMA OPERATIVO: IBM P.C. DOS 5.0 (D) SOFTWARE: FastSeq, Versión 2.0 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: Por asignarse (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 60/132145 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 12/9/96 (viii) INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE (A) NOMBRE: Guise, Jeffrey W. (B) NUMERO DE REGISTRO: 34,613 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 231/003 (ix) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES (A) TELEFONO: (213) 489-1600 (B) TELEFAX: (213) 955-0440 (C) TELEX: 67-3510 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 786 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 : ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC 60 ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGGTTG GACAAGATAG AAGATGAAAG GAATCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATGAA AACGATACAG AGATGCAACA CAGGAGAAAG ATCCTTATCC 240 TTACTGAACT GTGAGGAGAT TAAAAGCCAG TTTGAAGGCT TTGTGAAGGA TATAATGTTA 300 AACAAAGAGG AGACGAAGAA AGAAAACAGC TTTGAAATGC AAAAAGGTGA TCAGAATCCT 360 CAAATTGCGG CACATGTCAT AAGTGAGGCC AGCAGTAAAA CAACATCTGT GTTACAGTGG 420 GCTGAAAAAG GATACTACAC CATGAGCAAC AACTTGGTAA CCCTGGAAAA TGGGAAACAG 480 CTGACCGTTA AAAGACAAGG ACTCTATTAT ATCTATGCCC AAGTCACCTT CTGTTCCAAT 540 CGGGAAGCTT CGAGTCAAGC TCCATTTATA GCCAGCCTCT GCCTAAAGTC CCCCGGTAGA 600 TTCGAGAGAA TCTTACTCAG AGCTGCAAAT ACCCACAGTT CCGCCAAACC TTGCGGGCAA 660 CAATCCATTC ACTTGGGAGG AGTATTTGAA TTGCAACCAG GTGCTTCGGT GTTTGTCAAT 720 GTGACTGATC CAAGCCAAGT GAGCCATGGC ACTGGCTTCA CGTCCTTTGG CTTACTCAAA 780 CTCTGA 786 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 14 (A) LONGITUD: 783 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: ATGATAGAAA CATACAGCCA ACCTTCCCCC AGATCCGTGG CAACTGGACT TCCAGCGAGC 60 ATGAAGATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTCCTTATCA CCCAAATGAT TGGATCTGTG 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGATTG GATAAGGTCG AAGAGGAAGT AAACCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATAAA AAAGCTAAAG AGATGCAACA AAGGAGAAGG ATCTTTATCC 240 TTGCTGAACT GTGAGGAGAT GAGAAGGCAA TTTGAAGACC TTGTCAAGGA TATAACGTTA 300 AACAAAGAAG AGAAAAAAGA AAACAGCTTT GAAATGCAAA GAGGTGATGA GGATCCTCAA 360 ATTGCAGCAC ACGTTGTAAG CGAAGCCAAC AGTAATGCAG CATCCGTTCT AC GTGGGCC 420 AAGAAAGGAT ATTATACCAT GAAAAGCAAC TTGGTAATGC TTGAAAATGG GAAACAGCTG 480 ACGGTTAAAA GAGAAGGACT CTATTATGTC TACACTCAAG TCACCTTCTG CTCTAATCGG 540 GAGCCTTCGA GTCAACGCCC ATTCATCGTC GGCCTCTGGC TGAAGCCCAG CATTGGATCT 600 GAGAGAATCT TACTCAAGGC GGCAAATACC CACAGTTCCT CCCAGCTTTG CGAGCAGCAG 660 TCTGTTCACT TGGGCGGAGT GTTTGAATTA CAAGCTGGTG CTTCTGTGTT TGTCAACGTG 720 ACTGAAGCAA GCCAAGTGAT CCACAGAGTT GGCTTCTCAT CTTTTGGCTT ACTCAAACTC 780 TGA 783 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 783 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC 60 ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGATTG GATAAGGTCG AAGAGGAAGT AAACCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATAAA AAAGCTAAAG AGATGCAACA AAGGAGAAGG ATCTTTATCC 240 TTGCTGAACT GTGAGGAGAT GAGAAGGCAA TTTGAAGACC TTGTCAAGGA TATAACGTTA 300 AACAAAGAAG AGAAAAAAGA AAACAGCTTT GAAATGCAAA GAGGTGATGA GGATCCTCAA 360 ATTGCAGCAC ACGTTGTAAG CGAAGCCAAC AGTAATGCAG CATCCGTTCT ACAGTGGGCC 420 AAGAAAGGAT ATTATACCAT GAAAAGCAAC TTGGTAATGC TTGAAAATGG GAAACAGCTG 480 ACGGTTAAAA GAGAAGGACT CTATTATGTC TACACTCAAG TCACCTTCTG CTCTAATCGG 540 GAGCCTTCGA GTCAACGCCC ATTCATCGTC GGCCTCTGGC TGAAGCCCAG CATTGGATCT 600 GAGAGAATCT TACTCAAGGC GGCAAATACC CACAGTTCCT CCCAGCTTTG CGAGCAGCAG 660 TCTGTTCACT TGGGCGGAGT GTTTGAATTA CAAGCTGGTG CTTCTGTGTT TGTCAACGTG 720 ACTGAAGCAA GCCAAGTGAT CCACAGAGTT GGCTTCTCAT CTTTTGGCTT ACTCAAACTC 780 TGA 783 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 786 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC 60 ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTCCTTATCA CCCAAATGAT TGGATCTGTG 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGGTTG GACAAGATAG AAGATGAAAG GAATCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATGAA AACGATACAG AGATGCAACA CAGGAGAAAG ATCCTTATCC 240 TTACTGAACT GTGAGGAGAT TAAAAGCCAG TTTGAAGGCT TTGTGAAGGA TATAATGTTA 300 AACAAAGAGG AGACGAAGAA AGAAAACAGC TTTGAAATGC AAAAAGGTGA TCAGAATCCT 360 CAAATTGCGG CACATGTCAT AAGTGAGGCC AGCAGTAAAA CAACATCTGT GTTACAGTGG 420 GCTGAAAAAG GATACTACAC CATGAGCAAC AACTTGGTAA CCCTGGAAAA TGGGAAACAG 480 CTGACCGTTA AAAGACAAGG ACTCTATTAT ATCTATGCCC AAGTCACCTT CTGTTCCAAT 540 CGGGAAGCTT CGAGTCAAGC TCCATTTATA GCCAGCCTCT GCCTAAAGTC CCCCGGTAGA 600 TTCGAGAGAA TCTTACTCAG AGCTGCAAAT ACCCACAGTT CCGCCAAACC TTGCGGGCAA 660 CAATCCATTC ACTTGGGAGG AGTATTTGAA TTGCAACCAG GTGCTTCGGT GTTTGTCAAT 720 GTGACTGATC CAAGCCAAGT GAGCCATGGC ACTGGCTTCA CGTCCTTTGG CTTACTCAAA 780 CTCTGA 786 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 783 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5 ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC 60 ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTCCTTATCA CCCAAATGAT TGGATCTGTG 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGATTG GATAAGGTCG AAGAGGAAGT AAACCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATAAA AAAGCTAAAG AGATGCAACA AAGGAGAAGG ATCTTTATCC 240 TTGCTGAACT GTGAGGAGAT GAGAAGGCAA TTTGAAGACC TTGTCAAGGA TATAACGTTA 300 AACAAAGAAG AGAAAAAAGA AAACAGCTTT GAAATGCAAA GAGGTGATGA GGATCCTCAA 360 ATTGCAGCAC ACGTTGTAAG CGAAGCCAAC AGTAATGCAG CATCCGTTCT ACAGTGGGCC 420 AAGAAAGGAT ATTATACCAT GAAAAGCAAC TTGGTAATGC TTGAAAATGG GAAACAGCTG 480 ACGGTTAAAA GAGAAGGACT CTATTATGTC TACACTCAAG TCACCTTCTG CTCTAATCGG 540 GAGCCTTCGA GTCAACGCCC ATTCATCGTC GGCCTCTGGC TGAAGCCCAG CATTGGATCT 600 GAGAGAATCT TACTCAAGGC GGCAAATACC CACAGTTCCT CCCAGCTTTG CGAGCAGCAG 660 TCTGTTCACT TGGGCGGAGT GTTTGAATTA CAAGCTGGTG CTTCTGTGTT TGTCAACGTG 720 ACTGAAGCAA GCCAAGTGAT CCACAGAGTT GGCTTCTCAT CTTTTGGCTT ACTCAAACTC 780 TGA 783 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 786 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: ATGATAGAAA CATACAGCCA ACCTTCCCCC AGATCCGTGG CAACTGGACT TCCAGCGAGC 60 ATGAAGATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGGTTG GACAAGATAG AAGATGAAAG GAATCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATGAA AACGATACAG AGATGCAACA CAGGAGAAAG ATCCTTATCC 240 TTACTGAACT GTGAGGAGAT TAAAAGCCAG TTTGAAGGCT TTGTGAAGGA TATAATGTTA 300 AACAAAGAGG AGACGAAGAA AGAAAACAGC TTTGAAATGC AAAAAGGTGA TCAGAATCCT 360 CAAATTGCGG CACATGTCAT AAGTGAGGCC AGCAGTAAAA CAACATCTGT GTTACAGTGG 420 GCTGAAAAAG GATACTACAC CATGAGCAAC AACTTGGTAA CCCTGGAAAA TGGGAAACAG 480 CTGACCGTTA AAAGACAAGG ACTCTATTAT ATCTATGCCC AAGTCACCTT CTGTTCCAAT 540 CGGGAAGCTT CGAGTCAAGC TCCATTTATA GCCAGCCTCT GCCTAAAGTC CCCCGGTAGA 600 TTCGAGAGAA TCTTACTCAG AGCTGCAAAT ACCCACAGTT CCGCCAAACC TTGCGGGCAA 660 CAATCCATTC ACTTGGGAGG AGTATTTGAA TTGCAACCAG GTGCTTCGGT GTTTGTCAAT 720 GTGACTGATC CAAGCCAAGT GAGCCATGGC ACTGGCTTCA CGTCCTTTGG CTTACTCAAA 780 CTCTGA 786 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 786 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: ATGATAGAAA CATACAGCCA ACCTTCCCCC AGATCCGTGG CAACTGGACT TCCAGCGAGC 60 ATGAAGATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTCCTTATCA CCCAAATGAT TGGATCTGTG 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGGTTG GACAAGATAG AAGATGAAAG GAATCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATGAA AACGATACAG AGATGCAACA CAGGAGAAAG ATCCTTATCC 240 TTACTGAACT GTGAGGAGAT TAAAAGCCAG TTTGAAGGCT TTGTGAAGGA TATAATGTTA 300 AACAAAGAGG AGACGAAGAA AGAAAACAGC TTTGAAATGC AAAAAGGTGA TCAGAATCCT 360 CAAATTGCGG CACATGTCAT AAGTGAGGCC AGCAGTAAAA CAACATCTGT GTTACAGTGG 420 GCTGAAAAAG GATACTACAC CATGAGCAAC AACTTGGTAA CCCTGGAAAA TGGGAAACAG 480 CTGACCGTTA AAAGACAAGG ACTCTATTAT ATCTATGCCC AAGTCACCTT CTGTTCCAAT 540 CGGGAAGCTT CGAGTCAAGC TCCATTTATA GCCAGCCTCT GCCTAAAGTC CCCCGGTAGA 600 TTCGAGAGAA TCTTACTCAG AGCTGCAAAT ACCCACAGTT CCGCCAAACC TTGCGGGCAA 660 CAATCCATTC ACTTGGGAGG AGTATTTGAA TTGCAACCAG GTGCTTCGGT GTTTGTCAAT 720 GTGACTGATC CAAGCCAAGT GAGCCATGGC ACTGGCTTCA CGTCCTTTGG CTTACTCAAA 780 CTCTGA 786 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 864 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: AACTCTAACG CAGCATGATC GAAACATACA GTCAACCTTC TCCCCGCTCC GTGGCCACTG 60 GACCACCTGT CAGTATGAAA ATTTTTATGT ATTTACTTAC AGTTTTTCTT ATCACCCAGA 120 TGATTGGGTC AGCGCTTTTT GCTGTGTATC TTCACAGACG ATTGGACAAG ATAGAAGACG 180 AAAGGAATCT TCATGAAGAT TTTGTGTTCA TGAAAACGAT ACAGAGATGC AATAAAGGAG 240 AGGGGTCCTT ATCCTTACTG AACTGTGAGG AAATTAGAAG CCGGTTTGAA GACTTGGTCA 300 AGGATATAAT GCAAAACAAA GAAGTAAAGA AGAAAGAAAA AAACTTTGAA ATGCACAAGG 360 GTGATCAGGA GCCTCAGATA GCGGCACATG TCATCAGTGA GGCCAGTAGT AAAACAACCT 420 CTGTTCTCCA GTGGGCCCCC AAAGGATACT ACACCCTAAG CAACAACCTG GTAACCCTCG 480 AAAACGGGAA ACAGCTGGCC GTGAAAAGAC AAGGATTCTA TTACATCTAC ACCCAAGTCA 540 CCTTCTGTTC CAATCGGGAA ACTTTGAGTC AAGCTCCATT TATAGCCAGC CTCTGCCTGA 600 AGTCCCCAAG TGGATCAGAG AGAATCTTAC TGAGAGCTGC AAACACCCAC AGTTCTTCCA 660 AACCATGCGG GCAGCAATCC ATTCACTTAG GAGGAGTCTT TGAATTGCAA TCGGGTGCTT 720 CGGTGTTTGT CAATGTGACT GATCCAAGTC AAGTGAGCCA CGGGACGGGC TTCACATCAT 780 TTGGCTTACT CAAACTCTGA ACGGTGTAAG CCAGCAGGCT GCGGCTGGGC TGATGCTGGT 840 GGTCTTCACA ATCCAGGAAA GCAG 864 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3634 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: GAATTCCGGG TGATTTCACT CCCGGCTGTC CAGGCTTGTC CTGCTACCCC ACCCAGCCTT 60 TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG GACCCAAACA 120 CAGGCCTCAG GACTCAACAC AGCTTTTCCC TCCAACCCGT TTTCTCTCCC TCAACGGACT 180 CAGCTTTCTG AAGCCCCTCC CAGTTCTAGT TCTATCTTTT TCCTGCATCC TGTCTGGAAG 240 TTAGAAGGAA ACAGACCACA GACCTGGTCC CCAAAAGAAA TGGAGGCAAT AGGTTTTGAG 300 GGGCATGGGG ACGGGGTTCA GCCTCCAGGG TCCTACACAC AAATCAGTCA GTGGCCCAGA 360 AGACCCCCCT CGGAATCGGA GCAGGGAGGA TGGGGAGTGT GAGGGGTATC CTTGATGCTT 420 GTGTGTCCCC AACTTTCCAA ATCCCCGCCC CCGCGATGGA GAAGAAACCG AGACAGAAGG 480 TGCAGGGCCC ACTACCGCTT CCTCCAGATG AGCTCATGGG TTTCTCCACC AAGGAAGTTT 540 TCCGCTGGTT GAATGATTCT TTCCCCGCCC TCCTCTCGCC CCAGGGACAT ATAAAGGCAG 600 TTGTTGGCAC ACCCAGCCAG CAGACGCTCC CTCAGCAAGG ACAGCAGAGG ACCAGCTAAG 660 AGGGAGAGAA GCAACTACAG ACCCCCCCTG AAAACAACCC TCAGACGCCA CATCCCCTGA 720 CAAGCTGCCA GGCAGGTTCT CTTCCTCTCA CATACTGACC CACGGCTTCA CCCTCTCTCC 780 CCTGGAAAGG ACACCATGAG CACTGAAAGC ATGATCCGGG ACGTGGAGCT GGCCGAGGAG 840 GCGCTCCCCA AGAAGACAGG GGGGCCCCAG GGCTCCAGGC GGTGCTTGTT CCTCAGCCTC 900 TTCTCCTTCC TGATCGTGGC AGGCGCCACC ACGCTCTTCT GCCTGCTGCA CTTTGGAGTG 960 ATCGGCCCCC AGAGGGAAGA GGTGAGTGCC TGGCCAGCCT TCATCCACTC TCCCACCCAA 1020 GGGGAAATGA GAGACGCAAG AGAGGGAGAG AGATGGGATG GGTGAAAGAT GTGCGCTGAT 1080 AGGGAGGGAT GAGAGAGAAA AAAACATGGA GAAAGACGGG GATGCAGAAA GAGATGTGGC 1140 AAGAGATGGG GAAGAGAGAG AGAGAAAGAT GGAGAGACAG GATGTCTGGC ACATGGAAGG 1200 TGCTCACTAA GTGTGTATGG AGTGAATGAA TGAATGAATG AATGAACAAG CAGATATATA 1260 AATAAGATAT GGAGACAGAT GTGGGGTGTG AGAAGAGAGA TGGGGGAAGA AACAAGTGAT 1320 ATGAATAAAG ATGGTGAGAC AGAAAGAGCG GGAAATATGA CAGCTAAGGA GAGAGATGGG 1380 GGAGATAAGG AGAGAAGAAG ATAGGGTGTC TGGCACACAG AAGACACTCA GGGAAAGAGC 1440 TGTTGAATGC TGGAAGGTGA ATACACAGAT GAATGGAGAG AGAAAACCAG ACACCTCAGG 1500 GCTAAGAGCG CAGGCCAGAC AGGCAGCCAG CTGTTCCTCC TTTAAGGGTG ACTCCCTCGA 1560 TGTTAACCAT TCTCCTTCTC CCCAACAGTT CCCCAGGGAC CTCTCTCTAA TCAGCCCTCT 1620 GGCCCAGGCA GTCAGTAAGT GTCTCCAAAC CTCTTTCCTA ATTCTGGGTT TGGGTTTGGG 1680 GGTAGGGTTA GTACCGGTAT GGAAGCAGTG GGGGAAATTT AAAGTTTTGG TCTTGGGGGA 1740 GGATGGATGG AGGTGAAAGT AGGGGGGTAT TTTCTAGGAA GTTTAAGGGT CTCAGCTTTT 1800 TCTTTTCTCT CTCCTCTTCA GGATCATCTT CTCGAACCCC GAGTGACAAG CCTGTAGCCC 1860 ATGTTGTAGG TAAGAGCTCT GAGGATGTGT CTTGGAACTT GGAGGGCTAG GATTTGGGGA 1920 TTGAAGCCCG GCTGATGGTA GGCAGAACTT GGAGACAATG TGAGAAGGAC TCGCTGAGCT 1980 CAAGGGAAGG GTGGAGGAAC AGCACAGGCC TTAGTGGGAT ACTCAGAACG TCATGGCCAG 2040 GTGGGATGTG GGATGACAGA CAGAGAGGAC AGGAACCGGA TGTGGGGTGG GCAGAGCTCG 2100 AGGGCCAGGA TGTGGAGAGT GAACCGACAT GGCCACACTG ACTCTCCTCT CCCTCTCTCC 2160 CTCCCTCCAG CAAACCCTCA AGCTGAGGGG CAGCTCCAGT GGCTGAACCG CCGGGCCAAT 2220 GCCCTCCTGG CCAATGGCGT GGAGCTGAGA GATAACCAGC TGGTGGTGCC ATCAGAGGGC 2280 CTGTACCTCA TCTACTCCCA GGTCCTCTTC AAGGGCCAAG GCTGCCCCTC CACCCATGTG 2340 CTCCTCACCC ACACCATCAG CCGCATCGCC GTCTCCTACC AGACCAAGGT CAACCTCCTC 2400 TCTGCCATCA AGAGCCCCTG CCAGAGGGAG ACCCCAGAGG GGGCTGAGGC CAAGCCCTGG 2460 TATGAGCCCA TCTATCTGGG AGGGGTCTTC CAGCTGGAGA AGGGTGACCG ACTCAGCGCT 2520 GAGATCAATC GGCCCGACTA TCTCGACTTT GCCGAGTCTG GGCAGGTCTA CTTTGGGATC 2580 ATTGCCCTGT GAGGAGGACG AACATCCAAC CTTCCCAAAC GCCTCCCCTG CCCCAATCCC 2640 TTTATTACCC CCTCCTTCAG ACACCCTCAA CCTCTTCTGG CTCAAAAAGA GAATTGGGGG 2700 CTTAGGGTCG GAACCCAAGC TTAGAACTTT AAGCAACAAG ACCACCACTT CGAAACCTGG 2760 GATTCAGGAA TGTGTGGCCT GCACAGTGAA GTGCTGGCAA CCACTAAGAA TTCAAACTGG 2820 GGCCTCCAGA ACTCACTGGG GCCTACAGCT TTGATCCCTG ACATCTGGAA TCTGGAGACC 2880 AGGGAGCCTT TGGTTCTGGC CAGAATGCTG CAGGACTTGA GAAGACCTCA CCTAGAAATT 2940 GACACAAGTG GACCTTAGGC CTTCCTCTCT CCAGATGTTT CCAGACTTCC TTGAGACACG 3000 GAGCCCAGCC CTCCCCATGG AGCCAGCTCC CTCTATTTAT GTTTGCACTT GTGATTATTT 3060 ATTATTTATT TATTATTTAT TTATTTACAG ATGAATGTAT TTATTTGGGA GACCGGGGTA 3120 TCCTGGGGGA CCCAATGTAG GAGCTGCCTT GGCTCAGACA TGTTTTCCGT GAAAACGGAG 3180 CTGAACAATA GGCTGTTCCC ATGTAGCCCC CTGGCCTCTG TGCCTTCTTT TGATTATGTT 3240 TTTTAAAATA TTTATCTGAT TAAGTTGTCT AAACAATGCT GATTTGGTGA CCAACTGTCA 3300 CTCATTGCTG AGCCTCTGCT CCCCAGGGGA GTTGTGTCTG TAATCGCCCT ACTATTCAGT 3360 GGCGAGAAAT AAAGTTTGCT TAGAAAAGAA ACATGGTCTC CTTCTTGGAA TTAATTCTGC 3420 ATCTGCCTCT TCTTGTGGGT GGGAAGAAGC TCCCTAAGTC CTCTCTCCAC AGGCTTTAAG 3480 ATCCCTCGGA CCCAGTCCCA TCCTTAGACT CCTAGGGCCC TGGAGACCCT ACATAAACAA 3540 AGCCCAACAG AATATTCCCC ATCCCCCAGG AAACAAGAGC CTGAACCTAA TTACCTCTCC 3600 CTCAGGGCAT GGGAATTTCC AACTCTGGGA ATTC 3634 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1997 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GAGACAGAGT CTTGCTCTGT CCCCCAGGCT GGAATACAGT GGTGCGATCT TGACTCACTG 60 CAGCCTCCGC CTCCCAGGTT CAAATAATTC TCCAGCCTCA GCCTCCCGAG TAGCTGGGAC 120 TGCAGATGCG CACCAGCACG CCTGGCTAAT TTTTGTATTT ATTATAGAGA TGGGGTTTCA 180 CCATGTTGGC CAGCTGGTCT CAAACTCCTG ACCTCAAGTA ATCCGCCCAC CTCAGACTCC 240 CAAAGTGCCA GGATTACAGG TGTGAGCCAC TGCACCAGGC CTGGAACAAT TTTAAAATAA 300 TGTATTGGCT CTGCAAATGC AGCTTCAGAA CAAGTCCCTT AGCTGTCCCC ACCCCACCCT 360 AAGTCACCAC CCTTAAGCCT CACCCATGTG GAATTCTGAA ACTTCCTTTG TAGAAAACTT 420 TGGAAGGTGT CTGCCACATT GATCCTGGAA TGTGTGTTTA TTTGGGGTTA TATAAATCTG 480 TTCTGTGGAA GCCACCTGAA GTCAGGAAGA GATGGAGGGC ATCCTTCAGG AGTGAGATGA 540 GACCTCATCA TACTTGACTG TCCAGCATCA TCTCTGAGTA AGGGGACCAA AAAATTTATC 600 TTCCAAACTA GGACACTTTC AAGAGTGGAA GGGGGATCCA TTAATATTTT CACCTGGACA 660 AGAGGCAAAC ACCAGAATGT CCCCGATGAA GGGGATATAT AATGGACCTT CTTGATGTGA 720 AACCTGCCAG ATGGGCTGGA AAGTCCGTAT ACTGGGACAA GTATGATTTG AGTTGTTTGG 780 GACAAGGACA GGGGTACAAG AGAAGGAAAT GGGCAAAGAG AGAAGCCTGT ACTCAGCCAA 840 GGGTGCAGAG ATGTTATATA TGATTGCTCT TCAGGGAACC GGGCCTCCAG CTCACACCCC 900 AGCTGCTCAA CCACCTCCTC TCTGAATTGA CTGTCCCTTC TTTGGAACTC TAGGCCTGAC 960 CCCACTCCCT GGCCCTCCCA GCCCACGATT CCCCTGACCC GACTCCCTTT CCCAGAACTC 1020 AGTCGCCTGA ACCCCCAGCC TGTGGTTCTC TCCTAGGCCT CAGCCTTTCC TGCCTTTGAC 1080 TGAAACAGCA GTATCTTCTA AGCCCTGGGG GCTTCCCCGG GCCCCAGCCC CGACCTAGAA 1140 CCCGCCCGCT GCCTGCCACG CTGCCACTGC CGCTTCCTCT ATAAAGGGAC CTGAGCGTCC 1200 GGGCCCAGGG GCTCCGCACA GCAGGTGAGG CTCTCCTGCC CCATCTCCTT GGGCTGCCCG 1260 TGCTTCGTGC TTTGGACTAC CGCCCAGCAG TGTCCTGCCC TCTGCCTGGG CCTCGGTCCC 1320 TCCTGCACCT GCTGCCTGGA TCCCCGGCCT GCCTGGGCCT GGGCTTGGTG GGTTTGGTTT 1380 TGGTTTCCTT CTCTGTCTCT GACTCTCCAT CTGTCAGTCT CATTGTCTCT GTCACACATT 1440 CTCTGTTTCT GCCATGATTC CTCTCTGTTC CCTTCCTGTC TCTCTCTGTC TCCCTCTGCT 1500 CACCTTGGGG TTTCTCTGAC TGCATCTTGT CCCCTTCTCT GTCGATCTCT CTCTCGGGGG 1560 TCGGGGGGTG CTCTCTCCCA GGGCGGGAGG TCTGTCTTCC GCCGCGTGCC CCGCCCCGCT 1620 CACTGTCTCT CTCTCTCTCT CTCTTTCTCT GCAGGTTCTC CCCATGACAC CACCTGAACG 1680 TCTCTTCCTC CCAAGGGTGT GTGGCACCAC CCTACACCTC CTCCTTCTGG GGCTGCTGCT 1740 GGTTCTGCTG CCTGGGGCCC AGGTGAGGCA GCAGGAGAAT GGGGGCTGCT GGGGTGGCTC 1800 AGCCAAACCT TGAGCCCTAG AGCCCCCCTC AACTCTGTTC TCCCCTAGGG GCTCCCTGGT 1860 GTTGGCCTCA CACCTTCAGC TGCCCAGACT GCCCGTCAGC ACCCCAAGAT GCATCTTGCC 1920 CACAGCACCC TCAAACCTGC TGCTCACCTC ATTGGTAAAC ATCCACCTGA CCTCCCAGAC 1980 ATGTCCCCAC CAGCTCT 1997 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10240 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 1 : GAATTCCCCG GATCAAAGTC AGCATTAAAT CCCAGTTTAG GTTTTGAGGC TAAGTTCAAG 60 TTTGAGTCTA ATGTCATTTC AGCCTTGTTT GGAGGACTCA GAGATTTCAC TAGTTTCTCC 120 GCAGAGACCA CTGTAGAAAC TGCATTTCCC TGAGTTTTGG GCACAAGACT CCAGTCATCA 180 CCCCTCCCAC ACAGGGAAAG CCCCAAACCA ACTGCTGGCC TCCTCAAGAA AGAAACCGAA 240 TTTCACACAA CCTCCGAAAC TAAGATTGAA ACCAAGATTG GCCCATCTCA AGGCGCGTCC 300 TCCAGCACAT TGAGAATGTC GCTGATGGAG CCTCGGCCCA GCTCTCGAGC TTCCTTCCTT 360 TCTGTCTCTC ATGTCTTCTC ATCACTCCTT CTCACCTTCC CGTTTTTGTC CTGCAATGCC 420 CCCTTCTTCC TCTCTTCCTG GGGTTTTTCC CTTTATTTCT CACTGTACCA TTTTATATTT 480 TAATAAAGCC GAGGTCTCCT AGTCCATCAG CTCCTACTGT TGGAGAGGAG GCAGAAAGAA 540 ACAGCAGGAC GGCAAAGGGA CTCCAGAGAA AGAGACTCAG AGGAAAGGCA AGAAACAGGG 600 ACCAAGAGAG AGGCCAACAG TGACACAAGA CACAGTGAGG TTAAAAGAAA TAAGATGAGG 660 CCAAGATAGA GACCAAGCTA TTTAAAAGAG CCATCTGTGG CTACCCTTCT TCCGCCATCG 720 CATCTGGTCA GCCACCAAGA TTTTGCCTAG AAACGTTCCT CCTCTCCATT CTCCTGCTGC 780 TGCTGCTGCT GCTGCTGCTG CTGCTGCTGC TGCTGCTGCT GCTGCTGCTG CTGCCTTAAT 840 ACGAATGCAG GCTCTTGTCA TCTCCTTGCT GGGTTGTTGC AAAATCCTCC TAACTGGTCT 900 CCACACTTCT CATTTCCCCT CCAGCCCCCC ATCTTCCATA CTTCCATTTA TTTATTTTGG 960 CCATGCCCAT GGCATGTGGC AGTTCCAGGG GCCAGGGATC AAACCTGTGC CAATGCAGTG 1020 ACCGTGTCAG ATCCTTAACC CACTGCACAC AAGGCAACGC CCCTCGAGTC ATTCTCATTT 1080 TTTAAATATA CCAATTTGAG GGGGTCCCTC TTTCACTTAA AAATTTTGGC AGCTCCCTAT 1140 CATGATGAGA AGGAATTCCA AACCATTTTT CTTGTGTGCA AACCCTTCAG CATGTGTCCT 1200 CAGCTTACTT CCCAAGCCTC ATCCCTGCTC CTTCTACGTG TACCCATGTG TACATCTCCA 1260 CACACCATAT ACTCTTTTTT ACCTCCCATC TTTGCACCTT CTGTTCCCTC TCTCTGCCCC 1320 TCACCATCTT TTTTGCTTTG ATACTTAATG CCTCTCCCTC AGGCCAGGTT CAATGGCTTT 1380 TCTGTGGGCT GCTTTAAGCC CACTGTCATG GAACTTATCA CATTTTATTT TATTTGACTT 1440 TCTTTTTAGG GCCGCACCCA GCATATGGAG ATTCCCAGGC TAGGGATCTA ATCGGAGCTG 1500 TATCTGCCAG CCTGCGCTGG AGCCACAGCA ACGTGGGATC CGAGCCTGAG GGGTTTTGAT 1560 GTCCTGTGGC ACAGAAGTTA CATTCAGGCT GTGCATGAAC TATTTCTCCT GTTCTCCTCC 1620 CCCTGCTTGA GGCCCTGCAG CTTTGCCTCT CATGCCTTGC TGCTCTGACC TATGACTTCT 1680 TTTTGTTTGC ATTCCATCTC TTTAGTTTTC TCTCTGTTCC ACAAACATTT ACTGAGCATC 1740 TACATGAGGC ATTGAGGATA CGGATGGGAA AGACAGTCCC CTGACCTCTG GGACCTCAAA 1800 GACCAATTGT GGAAGACTGG TTGGTTATCA GATAATTACA ATGAAGTGTG GGAGTCCCTG 1860 TCATGGGTCA GCAGGTAATG AACCCAGTAA ACGATCCATG AGGATGCAGA TTCAATCCCT 1920 GGCCTTGCTC AGCGGGTTAA GGATCCAGCG TTCCCACAAG CTGTGGTGTA GGTCGCAGAT 1980 GCGACTCAGA TCTTGCATTG CTGTGGCTGT GGTGTAGGCT GGTGGCTACC CCTAGCCTGG 2040 GAACCTCCAT ATGCCTCAGG TGCGGCCCTA AAAGACAAAA AAAAAAAAGA GAGAAACTTT 2100 TCTTTTTCTT AATGTGTAAC CTACAAGCTA AGTGAAAACT GGCTCCTATT CCATAACGTT 2160 TGTATCATTT TTCATACTAG CCAAATACTA GAAACAGGGA GTTCCCGTCG TGGTGCAGCA 2220 GAAACAAATT CGACTAGGAA CCATGAGGTT GCGGGTTCGA TCCCTGGCCT TGCTCAGTGG 2280 GTTAAGGATC CGGCGTTGCC GTGAGCTGTG GTGTAGGTCG CAGATGTGGC TCGGATCTAG 2340 TGTTGCTGTG GCTCTGGTGT AGGCCGGCAG CAACAGCTCT GATTAGACTC CTAGCCTGAG 2400 AACCTCCATA AGCTGTGGCT GCGGCCCTAT AAAGACAAAA AAAAAAAAAA GGCCAAATAC 2460 TAGAAACAAA CCAAATGCCC ATCAACAGAA GAATAGATAA GTTAATTGGG GTATATGCAC 2520 ACAATAGCAT CACACAATAA CATGCACACA ATAACATCAC AATGAAATAA AAATTACTAC 2580 TGACAGACAC AACCATATAG ATGAATTTCA CAAACACAAC AGCGAGAATA AAAGCCAAGC 2640 ACAGATGAGT TGTCTGTGTG GATTCATTTC TATGAAGTTC AAGCGCAGGA AGAACTTAAT 2700 CTATAGTGAC AGAGGTCAGA GAGCAGTTGG TTGTCTTTGG CAGGTATGAA CTGGGAGTGG 2760 GCATGAGAGA ACTTTCTGGA GACCTAAAAA TATATTGGAC TGGATGGTGG CAACATGGCT 2820 ACAAGAAGAT GGAAAAGTTC CTCAGGCTGT CCACTTGGGA GACGGGCTTC TCACGGGACC 2880 TAAGTTCTGC ATCAGCAGAG GGGGAAATCC TTAATGATTT GACAATTACA AAGTGTATTG 2940 GCTTTACCGA TGTATTTTCA ACACAATCCC TCTGCTGTCC CCACCCCACC CTAGGTCACC 3000 ACCCTTAAGC TCCACCTGTG TGGAATTCTG AAGCCTCCCC TGTAGAGAAC TTTAGCAGTT 3060 GCCACGTTCT TTTGATGCAG GAACGTGTTG TCTAGAGTTA GACACATCTG ATCTGTGGGG 3120 CCCACCCAAG GTTGGGACAT GGTGGGGGGC GGCCTTCTGC AGTGAGATGA AACCTCATTG 3180 TAGGTGATTT CGTGGCCTCA TCCCTGAGTC AGATCTTCCA AATGAGGACA CTTTGGAGAG 3240 CAAAAGGGGG CTCCCTGAAG ATTTCCTCCA GGACAGCAGG AACAAACCAG GATGTCCCAG 3300 GCAGGAGGGT ATAGAAGGGA ACTTGTTGAT ATGAAATCAG CCAGATGACC TGGAAAATAC 3360 ACAGACTGGG ACAAGTGTGA CTTGAGCCTC TTGGGCCCAG GACAGGGGTA CAGAGGAGGA 3 20 AACGTGCACA GAGAGAAGCC CGTAATCAGC CAAGGCTGCA GAGGTGTTAT ACATAATCGC 3480 TCTTCACGCA ACCGGGCAAG CAGCCCACGC CCCAGCTGCA CTCCATCTCC TCCTCTGAAC 3540 TCACCGTCCC TTCTCTGGAA CTCCTAAGCC TGACCCCGCT CCCTGGCCCT CCCAGCCCAC 3600 GGTTCCCCTG ACCCCACTCC CTTTCCCAGA ACTCAGTCAT CTGAGCCCCC AGCCTGCGTT 3660 CTCTCCTAGG CCTCAGCCTT TCCTGCCTTC GCGTGAAACA GCAGCATCTT CTAAGCCCTG 3720 GGCTTCCCCA GGCCCCAGCC CCGGCCTAGA ACCCGCCCAG CCGACCTGCC CACGCTGCCA 3780 CTGCCGGCTT CCTCTATAAA GGGACCCAGG GCGCCCAGAA AGGGGCCCAC AGGGGTCCCG 3840 CACAGCAGGT GAGACTCTCC CACCCCATCT CCTAGGGCTG TCCGGGTGCT GGACTCCCCC 3900 CTCACTTCGG TCCCTCCGCC CGCTCCCTGG CCTTCCTGCC CCTCCTGCAT CTTCACCCCG 3960 GCCTGGGCCT TGGTGGGTTT GGTTTTGGTT TGTTCTCTCT GATTCTTTAT CTGTCAGGCT 4020 CTTTCTAGCT CTCACACACT CTGATCCCTC TCTGTTCCCT TCCCATCTCT GTTTCTCTCT 4080 GGGTCTCCCC CTGCTCACCT CGGGATTTCC CTGAGTGCCT CTGGTCCCCT TCTCTGTCTG 4140 GCGCCCCGTC TCTTGTCTCT CGGGGTGGCT GTCTCCGAGG GCAGGAGGCC TTCTTCCGCA 4200 GGTGCCCCGC CCCGCTCACT GTCTCTCTCC CCCCACAGGT TTTCCCCATG ACACCACCTG 4260 GACGCCTCTA CCTCCGGAGG GTGTGCAGCA CCCCCATCCT CCTCCTCCTG GGGCTGCTGC 4320 TGGCCCTGCC GCCCGAGGCC CAGGTGAGGC AGCAGGAGAG CGGGCCGTGG GGGCAGCCTT 4380 CGCCAACCTT GGGCCTCAGA GCCTCTCTGA CGCTCTTCTC CCCTAGGGGC TCCCTGGCGT 4440 CGGCCTCCCA CCCTCAGCTG CACAGCCTGC CCATCAGCAC CCCCCAAAGC ACTTGGCCAG 4500 AGGCACCCTC AAACCTGCCG CTCACCTCGT TGGTAAACAT CCACCTGGCC TCCCAGACCT 4560 GTAGCCCCCA GTCCTCCTCC TATGCCCCTG CTTCAGGGAC TGAAGCATCC CTCCCCCCCA 4620 TCTCCCCCCA CCCCCTAAAT GGAGGCATCC CACTCCCGAC TCCCTCCCAA CCATCCCCCA 4680 GGAACTCAGT CCAGCACCTG CTTCCTCAGG GATTGAGACC TCCGACCCCC AGGTCCTTGA 4740 CTCCCACCCC CTCTGGCTCT TCCTAGGAGA CCCCAGCACC CCGGACTCAC TGCGCTGGAG 4800 AGCGAACACG GATCGTGCCT TCCTCCGCCA TGGCTTCTTG CTGAGCAACA ACTCCCTGCT 4860 GGTCCCCACC AGTGGCCTCT ACTTTGTCTA CTCCCAGGTC GTCTTCTCCG GGGAAGGCTG 4920 CTTCCCCAAG GCCACCCCCA CCCCTCTCTA CCTGGCCCAC GAGGTCCAGC TCTTCTCCTC 4980 CCAGTACCCC TTCCACGTGC CGCTCCTCAG CGCTCAGAAG TCCGTGTGCC CCGGGCCACA 5040 GGGACCTTGG GTGCGCTCTG TGTACCAGGG GGCTGTGTTC CTGCTCACCC AGGGAGATCA 5100 GCTGTCCACA CACACAGACG GCACCCCCCA CCTGCTCCTC AGCCCCAGTA GCGTCTTCTT 5160 TGGAGCCTTC GCTCTATAGA AGAATCCAGA AAGAAAAAAA TTGGTTTCAA GGCCTTCTCC 5220 CCTTTTCACC TCCCTTATGA CCACTTCGGA GGTCACCGCG CCTCTCCTCT GACAATTTCC 5280 AACAGTCTCA TCTTCCCCCA CGCTCAGCAC CTGGAGCTTC TGTAGAAGGA ATTCTAGGCA 5340 CCTCGGGGGA ACTGGAACCA CCCCGGATGC TCTGCTGAGG ATCTGAATGC CCGCCTGGAG 5400 CCCTTCCCCT GTCCTGCCCG TCTAGGGGCC CTCGTCCAGG ACGTGGAAGG GAAGCTGACC 5460 CATGAGGGAC TTTGAACGGA TGACCGGAGC GGTGTGGGGG GGTTATTTAT GAAGGGGAAA 5520 ATTAAATTAT TTATTTATGG AGGATGGAGA GAAGGGAATC ACAGAGGGAT GTCAGAAGAG 5580 TGTGACACAT GTGCCCAAGA GATAAAGTGA CAGAAGGCAT GGGCTCCAGA TGACCCGGCC 5640 AGAGAGGGCA AAGTGGCTCA GGAAGGGGCT GCTTGACTGG AGGCTCATGA GGAGACGGCT 5700 GACCCTCGAT GAAACCCAAT AAAGCTCTTT TCTCTGAAAT GCTGTCTGCT CGTATCTGTC 5760 ACTCGGGAGG GGAGAATTCT CCAGATGTCT CTAAGGAGTG GAGGGAGGAC AGGAATCAGA 5820 GGGGACGGGA GCTGTGGGTG TGTGATGAGG CCTAAGGGGC TCAGGTGAGA GATGGCGGCC 5880 TCAGGGTGAG GGCAGCCAGA CCCCTGCAGG AGAAGCAGAT GGTTCCTCTG AGAAGACAAA 5940 GGAAGAGATG CAGGGCCAAG GTCTTGAGAA CCGAGGTCGG GGGTCGCCTG GCAGATATGG 6000 CCACAGGTAG AGGGACAGAG GAATAGGGGT GACAGGAGGC TTCCCGGGAG AAGGGAACAC 6060 ACTGAGGGGT GTTCGGGATT CTGAGGGAGG AGCACGGGGA CGCCCTGGGA GACATGCCGT 6120 CCAGGGCCAT GAGGAGTGGG AGAGCCTCTG AGGCTAGCGG CTGGAGATAC AGGGACATTT 6180 GAGGAGACAC GGTCATGGCC AGGAGCCGCG AGGGCCTGGA CAGTCTCTAG GAATCTCGAA 6240 GAAGCAGGAA TTCTTTGAGG ATACGTGGCC ACACAAAGGG AGGCTGAGGT GTGGGGACTT 6300 CATGCAGAAG TCAGGGCCTC ACATTCCCTT GGAAGCCGAG ACTGAAACCA GCAGCAGAGT 6360 TTTGGTGAGT TCCTGTCAGA GTGAAAGGAG AAGGCCCGCC ATGGTGGGTT TGTGAATTCC 6420 CAGCCTGGCT TCCTCTCCCT CTGGGGCTGT CCCAGGCCTG TTCCTGCCGT CCTCCCCCAG 6480 CCCGTGTAGG GCCTCCAGCT GCCCTTCTCC CAGCTCCTCT TCCCTCCAGG AGACGAAACA 6540 TGGGTCTCAG CACCCAGCGC GGTGTCGTCT AAGTTTTCTC TCCATTAAGA ACTCAGCTTT 6600 CTGAAGCTCC TCCCATTCCT AGTTCTACCC CTACCTGAGC CCTGTTCGGA AATCAGAGAG 6660 AAATAGAAGT CATCCCCCAA AGAAAAGGAA TTTGTCCCCC AAAGAAACAG AACTTGTCCC 6720 CCAAAGAAAT GGAAACAATG GGAAATGGGA GGCAGGGGGG ACCTGGGGTC CAGCCTCCAG 6780 GGTCCTACAC ACAGAGCAGT AACTGGCCCA GCAAGCCCAC CTCAGGATCC GGGCAGGGAG 6840 GGTAGGAAGT ATCCCTGATG CCTGGGTGTC CCCAACTTTC CAAACCGCCG CCCCCGCTAT 6900 GGAGATGAAA CTAAGACAGA AGGTGCAGGG CCCGCTACCG CTTCCTCCAG ATGAGCTCAT 6960 GGGTTTCTCC ACCAAGGAAG TTTTCCGCTG GTTGAAAGAG AGCCTCTCCC CGCCCTCTTC 7020 TCACCCAGAG CGTATAAATG CAGCTGTTTG CACACCCAGC CAGCAGAAGC TCCCAGAGTG 7080 AGGACACCAG GGGACCAGCC AGGAGAGAGA CAAGCCATCT CCAGGACCCC CTAGAAATAA 7140 CCTCTCAGAA GACACACCCC CGAACAGGCA GCCGGACGAC TCTCTCCCTC TCACACGCTG 7200 CCCCGGGGCG CCACCATCTC CCAGCTGGAC CTGAGCCCCT CTGAAAAAGA CACCATGAGC 7260 ACTGAGAGCA TGATCCGAGA CGTGGAGCTG GCGGAGGAGG CGCTCGCCAA GAAGGCCGGG 7320 GGCCCCCAGG GCTCCAGGAG GTGCCTGTGC CTCAGCCTCT TCTCCTTCCT CCTGGTCGCA 7380 GGAGCCACCA CGCTCTTCTG CCTACTGCAC TTCGAGGTTA TCGGCCCCCA GAAGGAAGAG 7440 GTGAGCGCCT GGCCAGCCTT GGCTCATTCT CCCACCCGGA GAGAAATGGG GAAGAAAGAG 7500 GGCCAGAGAC GAGCTGGGGG AAAGAAGTGT GCTGATGGGG AGTGTGGGGA GGAAATCATG 7560 GAGAAAGATG GGGAGGCAGA AGGAGACGTG GAGAGAGATG GGGGGAGAGA GAGAAGGATG 7620 GAGAGAAATC CGGTGGCCCG GCCCTTGGAA ATGCTCTCTA AATATTTGTT GCACGAATGA 7680 GTGAGTAAGC AGGGACACCG ATATAAAGAG AGATGAGTAG ACAGACAAGG GGTGTGGTAG 7740 AAAGATAGGG AAAAAACAAG TGATCTGGAT AAAGATAGTG AGACAGGAAG AGGTAGAGGA 7800 GATAGGAAAG AGAGATAAGG AGAGAAGAAG GAAGCGTGGG TGTCTGGCAC GTGGAAGGCA 7860 CTCAATGAAG GAGTTGTTGA ATGGATGGGT GGATGAGAAA ATGGATGAGT GGAGAGAAAA 7920 AACTAGACAT CAGGGCAGAG AGTACAAGCT AGAGAAGCAG GTGGCTGTTT TCCCTTCAGA 7980 GGGGACTTAT TCAAATCTAA TTAATCCTTC TTCTTCTCCC CAACAGTTTC CAGCTGGCCC 8040 CTTGAGCATC AACCCTCTGG CCCAAGGACT CAGTAAGTAT CTCTAAAACC TGTCTCTCAG 8100 TTCTGAGCTT GGACAGGGGT GGGGTTAGTG CTGGGGTGGA AGGAAGAAGG GAAATTTAGG 8160 GTCTGGGTTT GGCGGGGGGA ATGCAGGTCA AAGTAGTGAG ATATTTTCTG GGAAGTCTGA 8220 GGGTCTCATC TTTTTCTTTC CTCTTTCCTC CTCAGGATCA TCGTCTCAAA CCTCAGATAA 8280 GCCCGTCGCC CACGTTGTAG GTAAGAGTTC TGAGGATGTG TCTGGGGGAT GAAGAAATAG 8340 GCAGGACAGA GAGGGATAGG ATTTGGGGGC TGAAGCCAGG CTGAGGGTAG CCAGAGCTTG 8400 GAGATAGTAT GAGGAGGACT CGCTGAGCTC CAGGGGAGGA TGGGGGATAC TCAGAACTTG 8460 AGGAGGATAC TCGGAACCTC ATGGACAGAT GGGATGTGGG AAGACAGACC GAGGGGACAG 8520 GAACCGGATG TGGGGGGCGG GCAGAACTCG AGGGCCAGGA TGTGGAGAGT GGAACTGACA 8580 GGGTCACACT GACTCACCCC TCCCTCTTTG TCTCCTCCCT CCAGCCAATG TCAAAGCCGA 8640 GGGACAGCTC CAATGGCAGA GTGGGTATGC CAATGCCCTC CTGGCCAACG GCGTGAAGCT 8700 GAAAGACAAC C GCTGGTGG TGCCGACAGA TGGGCTGTAC CTCATCTACT CCCAGGTCCT 8760 CTTCAGGGGC CAAGGCTGCC CTTCCACCAA CGTTTTCCTC ACTCACACCA TCAGCCGCAT 8820 CGCCGTCTCC TACCAGACCA AGGTCAACCT CCTCTCTGCC ATCAAGAGCC CTTGCCAGAG 8880 GGAGACCCCC GAGGGGGCCG AGGCCAAGCC CTGGTACGAA CCCATCTACC TGGGAGGGGT 8940 CTTCCAGCTG GAGAAGGATG ATCGACTCAG TGCCGAGATC AACCTGCCCG ACTATCTGGA 9000 CTTTGCTGAA TCTGGGCAGG TCTATTTTGG GATCATTGCC CTGTGAGGGG GCAGGACATC 9060 CGTTCCCTCC CCTGTCCATC CCTTTATTAT TTTACTCCTT CAGACCCCCT CACGTCCTTC 9120 TGGTTTAGAA AGAGAATGAG GGGCTGGGGA CTGGGCTCCA AGCTTAAAAC TTTAAACAAC 9180 AACAGCAACA CTTAGAAATC AGGGATTCAG GGATGTGTGG CCTGGACAAC CAGGCACTGA 9240 CCACCACCAA GAATTGGAAC TGGGGCTTCC AGACTCGCTG GGGTCCTTGG GTTTGGATTC 9300 CTGGATGCAA CCTGGGACAT CTGGAATGTG GCTGCCAGGG AAGCTTGGGT TCCAATCGOA 9360 ATACTTCAGA ACATTCCTTG AGAAGATTTC ACCTCAATCT TGATGACTTT TTAGGCTTCC 9420 CTTTCTTCCA ATTTTCCAGA CTTCCCTGGG ATGGGGAGCC CAGCCCCAAA CCCCACAGGC 9480 CAGCTCCCTC TTATTTATAT TTGCACTTGG CATTATTATT TATTTATTTA TTTATTATTT 9540 ATTTACTAGT GAATGTATTT ATTCAGGAGG GCGAGGTGTC CTGGGAGACC CAGCATAAGG 9600 GCTGCCTTGG TTCAGATGTG TTTTCTGTGA AAACGGAGCT GAACTGTAGG TTGCTCCCAC 9660 CTGGCCTCCT AGCCTCTGTG CCTCCTTTTG CTTATGTTTT TAAAAACAAA TATTTATCTG 9720 ATCGAGTTGT CTAAATAATG CTGATTTGGT GACTAACTTG TCGCTACATC GCTGAACCTC 9780 TGCTCCCCAG GGGAGTTGTG TCTGTAACCG CCCTACTGGT CAGTGGCGAG AAATAAAAGC 9840 GTGCTTAGAA AAGAAATCTG GCCTCTTTCT GCGACTGAAT TCTGCATCTC CTTGGGGGGG 9900 TGAGGCTGCT CCCCAAAATT CTTTCTCCAC CGGGCTTAGG ATTCCCTGGG CTTCACTCCT 9960 GAGCTTGGAC TGCCTGGCTC AGGAGCCTCT GCAAGAAACA AAGCCCAGCC AAACAGGTCC 10020 CTCCCCTAAG AAAGGAACCT GAAGGTAATT ACCTCTCCCT CAGGGTGTGG GAATTTCCAA 10080 GTCTGGGAAT TCCTATCCAG CTGGGGAAGT CTGCAGTGCA GGTGAGACTT CCGGCTGAAA 10140 GAGCCAGGGA GCGGCCAGAT GCTCAGGTAC CTGAACCAGA GCCAAGGGAC TTCCAGACAG 10200 TGAGGCAACT GGGCTCCAAA TAACCTGATC CGGGGAATTC 10240 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1644 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: CCTCAGCGAG GACAGCAAGG GACTAGCCAG GAGGGAGAAC AGAAACTCCA GAACATCCTG 60 GAAATAGCTC CCAGAAAAGC AAGCAGCCAA CCAGGCAGGT TCTGTCCCTT TCACTCACTG 120 GCCCAAGGCG CCACATCTCC CTCCAGAAAA GACACCATGA GCACAGAAAG CATGATCCGC 180 GACGTGGAAC TGGCAGAAGA GGCACTCCCC CAAAAGATGG GGGGCTTCCA GAACTCCAGG 240 CGGTGCCTAT GTCTCAGCCT CTTCTCATTC CTGCTTGTGG CAGGGGCCAC CACGCTCTTC 300 TGTCTACTGA ACTTCGGGGT GATCGGTCCC CAAAGGGATG AGAAGTTCCC AAATGGCCTC 360 CCTCTCATCA GTTCTATGGC CCAGACCCTC ACACTCAGAT CATCTTCTCA AAATTCGAGT 420 GACAAGCCTG TAGCCCACGT CGTAGCAAAC CACCAAGTGG AGGAGCAGCT GGAGTGGCTG 480 AGCCAGCGCG CCAACGCCCT CCTGGCCAAC GGCATGGATC TCAAAGACAA CCAACTAGTG 540 GTGCCAGCCG ATGGGTTGTA CCTTGTCTAC TCCCAGGTTC TCTTCAAGGG ACAAGGCTGC 600 CCCGACTACG TGCTCCTCAC CCACACCGTC AGCCGATTTG CTATCTCATA CCAGGAGAAA 660 GTCAACCTCC TCTCTGCCGT CAAGAGCCCC TGCCCCAAGG ACACCCCTGA GGGGGCTGAG 720 CTCAAACCCT GGTATGAGCC CATATACCTG GGAGGAGTCT -TCCAGCTGGA GAAGGGGGAC 780 CAACTCAGCG CTGAGGTCAA TCTGCCCAAG TACTTAGACT TTGCGGAGTC CGGGCAGGTC 840 TACTTTGGAG TCATTGCTCT GTGAAGGGAA TGGGTGTTCA TCCATTCTCT ACCCAGCCCC 900 CACTCTGACC CCTTTACTCT GACCCCTTTA TTGTCTACTC CTCAGAGCCC CCAGTCTGTG 960 TCCTTCTAAC TTAGAAAGGG GATTATGGCT CAGAGTCCAA CTCTGTGCTC AGAGCTTTCA 1020 ACAACTACTC AGAAACACAA GATGCTGGGA CAGTGACCTG GACTGTGGGC CTCTCATGCA 1080 CCACCATCAA GGACTCAAAT GGGCTTTCCG AATTCACTGG AGCCTCGAAT GTCCATTCCT 1140 GAGTTCTGCA AAGGGAGAGT GGTCAGGTTG CCTCTGTCTC AGAATGAGGC TGGATAAGAT 1200 CTCAGGCCTT CCTACCTTCA GACCTTTCCA GACTCTTCCC TGAGGTGCAA TGCACAGCCT 1260 TCCTCACAGA GCCAGCCCCC CTCTATTTAT ATTTGCACTT ATTATTTATT ATTTATTTAT 1320 TATTTATTTA TTTGCTTATG AATGTATTTA TTTGGAAGGC CGGGGTGTCC TGGAGGACCC 1380 AGTGTGGGAA GCTGTCTTCA GACAGACATG TTTTCTGTGA AAACGGAGCT GAGCTGTCCC 1440 CACCTGGCCT CTCTACCTTG TTGCCTCCTC TTTTGCTTAT GTTTAAAACA AAATATTTAT 1500 CTAACCCAAT TGTCTTAATA ACGCTGATTT GGTGACCAGG CTGTCGCTAC ATCACTGAAC 1560 CTCTGCTCCC CACGGGAGCC GTGACTGTAA TTGCCCTACA GTCAATTGAG AGAAATAAAG 1620 ATCGCTTAAA ATAAAAAACC CCCC 1644 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1890 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: AAACAGAGAG AGATAGAGAA AGAGAAAGAC AGAGGTGTTT CCCTTAGCTA TGGAAACTCT 60 ATAAGAGAGA TCCAGCTTGC CTCCTCTTGA GCAGTCAGCA ACAGGGTCCC GTCCTTGACA 120 CCTCAGCCTC TACAGGACTG AGAAGAAGTA AAACCGTTTG CTGGGGCTGG CCTGACTCAC 180 CAGCTGCCAT GCAGCAGCCC TTCAATTACC CATATCCCCA GATCTACTGG GTGGACAGCA 240 GTGCCAGCTC TCCCTGGGCC CCTCCAGGCA CAGTTCTTCC CTGTCCAACC TCTGTGCCCA 300 GAAGGCCTGG TCAAAGGAGG CCACCACCAC CACCGCCACC GCCACCACTA CCACCTCCGC 360 CGCCGCCGCC ACCACTGCCT CCACTACCGC TGCCACCCCT GAAGAAGAGA GGGAACCACA 420 GCACAGGCCT GTGTCTCCTT GTGATGTTTT TCATGGTTCT GGTTGCCTTG GTAGGATTGG 480 GCCTGGGGAT GTTTCAGCTC TTCCACCTAC AGAAGGAGCT GGCAGAACTC CGAGAGTCTA 540 CCAGCCAGAT GCACACAGCA TCATCTTTGG AGAAGCAAAT AGGCCACCCC AGTCCACCCC 600 CTGAAAAAAA GGAGCTGAGG AAAGTGGCCC ATTTAACAGG CAAGTCCAAC TCAAGGTCCA 660 TGCCTCTGGA ATGGGAAGAC ACCTATGGAA TTGTCCTGCT TTCTGGAGTG AAGTATAAGA 720 AGGGTGGCCT TGTGATCAAT GAAACTGGGC TGTACTTTGT ATATTCCAAA GTATACTTCC 780 GGGGTCAATC TTGCAACAAC CTGCCCCTGA GCCACAAGGT CTACATGAGG AACTCTAAGT 840 ATCCCCAGGA TCTGGTGATG ATGGAGGGGA AGATGATGAG CTACTGCACT ACTGGGCAGA ' 900 TGTGGGCCCG CAGCAGCTAC CTGGGGGCAG TGTTCAATCT TACCAGTGCT GATCATTTAT 960 ATGTCAACGT ATCTGAGCTC TCTCTGGTCA ATTTTGAGGA ATCTCAGACG TTTTTCGGCT 1020 TATATAAGCT CTAAGAGAAG CACTTTGGGA TTCTTTCCAT TATGATTCTT TGTTACAGGC 1080 ACCGAGAATG TTGTATTCAG TGAGGGTCTT CTTACATGCA TTTGAGGTCA AGTAAGAAGA 1140 CATGAACCAA GTGGACCTTG AGACCACAGG GTTCAAAATG TCTGTAGCTC CTCAACTCAC 1200 CTAATGTTTA TGAGCCAGAC AAATGGAGGA ATATGACGGA AGAACATAGA ACTCTGGGCT 1260 GCCATGTGAA GAGGGAGAAG CATGAAAAAG CAGCTACCCA GGTGTTCTAC ACTCATCTTA 1320 GTGCCTGAGA GTATTTAGGC AGATTGAAAA GGACACCTTT TAACTCACCT CTCAAGGTGG 1380 GCCTTGCTAC CTCAAGGGGG ACTGTCTTTC AGATACATGG TTGTGACCTG AGGATTTAAG 1440 GGATGGAAAA GGAAGACTAG AGGCTTGCAT AATAAGCTAA AGAGGCTGAA AGAGGCCAAT 1500 GCCCCACTGG CAGCATCTTC ACTTCTAAAT GCATATCCTG AGCCATCGGT GAAACTAACA 1560 GATAAGCAAG AGAGATGTTT TGGGGACTCA TTTCATTCCT AACACAGCAT GTGTATTTCC 1620 AGTGCCAATT GTAGGGGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTATGACT AAAGAGAGAA 1680 TGTAGATATT GTGAAGTACA TATTAGGAAA ATATGGGTTG CATTTGGTCA AGATTTTGAA 1740 TGCTTCCTGA CAATCAACTC TAATAGTGCT TAAAAATCAT TGATTGTCAG CTACTAATGA 1800 TGTTTTCCTA TAATATAATA AATATTTATG TAGATGTGCA TTTTTGTGAA ATGAAAACAT 1860 GTAATAAAAA GTATATGTTA GGATACAAAT 1890 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1541 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: GGGTGTCTCA C GAGAAGCA AAGAGAAGAG AACAGGAGAA ATGGTGTTTC CCTTGACTGC 60 GGAAACTTTA TAAAGAAAAC TTAGCTTCTC TGGAGCAGTC AGCGTCAGAG TTCTGTCCTT 120 GACACCTGAG TCTCCTCCAC AAGGCTGTGA GAAGGAAACC CTTTCCTGGG GCTGGGTGCC 180 ATGCAGCAGC CCATGAATTA CCCATGTCCC CAGATCTTCT GGGTAGACAG CAGTGCCACT 240 TCATCTTGGG CTCCTCCAGG GTCAGTTTTT CCCTGTCCAT CTTGTGGGCC TAGAGGGCCG 300 GACCAAAGGA GACCGCCACC TCCACCACCA CCTGTGTCAC CACTACCACC GCCATCACAA 360 CCACTCCCAC TGCCGCCACT GACCCCTCTA AAGAAGAAGG ACCACAACAC AAATCTGTGG 420 CTACCGGTGG TATTTTTCAT GGTTCTGGTG GCTCTGGTTG GAATGGGATT AGGAATGTAT 480 CAGCTCTTCC ACCTGCAGAA GGAACTGGCA GAACTCCGTG AGTTCACCAA CCAAAGCCTT 540 AAAGTATCAT CTTTTGAAAA GCAAATAGCC AACCCCAGTA CACCCTCTGA AAAAAAAGAG 600 CCGAGGAGTG TGGCCCATTT AACAGGGAAC CCCCACTCAA GGTCCATCCC TCTGGAATGG 660 GAAGACACAT ATGGAACCGC TCTGATCTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAAGG TGGCCTTGTG 720 ATCAACGAAA CTGGGTTGTA CTTCGTGTAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG TCAGTCTTGC 780 AACAACCAGC CCCTAAACCA CAAGGTCTAT ATGAGGAACT CTAAGTATCC TGAGGATCTG 840 GTGCTAATGG AGGAGAAGAG GTTGAACTAC TGCACTACTG GCCAGATATG GGCCCACAGC 900 AGCTACCTGG GGGCAGTATT CAATCTTACC AGTGCTGACC ATTTATATGT CAACATATCT 960 CAACTCTCTC TGATCAATTT TGAGGAATCT AAGACCTTTT TCGGCTTGTA TAAGCTTTAA 1020 AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCACCAGG AATATTGTCT 1080 TGAATGAGAG TCTTCTTAAG ACCTATTGAG ATTAATTAAG ACTACATGAG CCACAAAGAC 1140 CTCATGACCG CAAGGTCCAA CAGGTCAGCT ATCCTTCATT TTCTCGAGGT CCATGGAGTG 1200 GTCCTTAATG CCTGCATCAT GAGCCAGATG GAAGGAGGTC TGTGACTGAG GGACATAAAG 1260 CTTTGGGCTG CTGTGTAGCA ATGCAGAGGC ACAGAGAAAG AACTGTCTGA TGTTAAATGG 1320 CCAAGAGAAT TTTAACCATT GAAGAAGACA CCTTTACACT CACTTCCAGG GTGGGTCTAC 1380 TTACTACCTC ACAGAGGCCG TTTTTGAGAC ATAGTTGTGG TATGAATATA CAAGGGTGAG 1440 AAAGGAGGCT CATTTGACTG ATAAGCTAGA GACTGAAAAA AAGACAGTGT CTCATTGGCA 1500 CCATCTTTAC TGTTACCTGA TGTTTTCTGA GCCGACCTTT G 1541 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 888 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: GGCTGGTCCC CTGACAGGTT GAAGCAAGTA GACGCCCAGG AGCCCCGGGA GGGGGCTGCA 60 GTTTCCTTCC TTCCTTCTCG GCAGCGCTCC GCGCCCCCAT CGCCCCTCCT GCGCTAGCGG 120 AGGTGATCGC CGCGGCGATG CCGGAGGAGG GTTCGGGCTG CTCGGTGCGG CGCAGGCCCT 180 ATGGGTGCGT CCTGCGGGCT GCTTTGGTCC CATTGGTCGC GGGCTTGGTG ATCTGCCTCG 2 0 TGGTGTGCAT CCAGCGCTTC GCACAGGCTC AGCAGCAGCT GCCGCTCGAG TCACTTGGGT 300 GGGACGTAGC TGAGCTGCAG CTGAATCACA CAGGACCTCA GCAGGACCCC AGGCTATACT 360 GGCAGGGGGG CCCAGCACTG GGCCGCTCCT TCCTGCATGG ACCAGAGCTG GACAAGGGGC 420 AGCTACGTAT CCATCGTGAT GGCATCTACA TGGTACACAT CCAGGTGACG CTGGCCATCT 480 GCTCCTCCAC GACGGCCTCC AGGCACCACC CCACCACCCT GGCCGTGGGA ATCTGCTCTC 5 0 CCGCCTCCCG TAGCATCAGC CTGCTGCGTC TCAGCTTCCA CCAAGGTTGT ACCATTGCCT 600 CCCAGCGCCT GACGCCCCTG GCCCGAGGGG ACACACTCTG CACCAACCTC ACTGGGACAC 660 TTTTGCCTTC CCGAAACACT GATGAGACCT TCTTTGGAGT GCAGTGGGTG CGCCCCTGAC 720 CACTGCTGCT GATTAGGGTT TTTTAAATTT TATTTTATTT TATTTAAGTT CAAGAGAAAA 780 AGTGTACACA CAGGGGCCAC CCGGGGTTGG GGTGGGAGTG TGGTGGGGGG TAGTGGTGGC 840 AGGACAAGAG AAGGCATTGA GCTTTTTCTT TCATTTTCCT ATTAAAAA 888 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1906 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: CCAAGTCACA TGATTCAGGA TTCAGGGGGA GAATCCTTCT TGGAACAGAG ATGGGCCCAG 60 AACTGAATCA GATGAAGAGA GATAAGGTGT GATGTGGGGA AGACTATATA AAGAATGGAC 120 CCAGGGCTGC AGCAAGCACT CAACGGAATG GCCCCTCCTG GAGACACAGC CATGCATGTG 180 CCGGCGGGCT CCGTGGCCAG CCACCTGGGG ACCACGAGCC GCAGCTATTT CTATTTGACC 240 ACAGCCACTC TGGCTCTGTG CCTTGTCTTC ACGGTGGCCA CTATTATGGT GTTGGTCGTT 300 CAGAGGACGG ACTCCATTCC CAACTCACCT GACAACGTCC CCCTCAAAGG AGGAAATTGC 360 TCAGAAGACC TCTTATGTAT CCTGAAAAGA GCTCCATTCA AGAAGTCATG GGCCTACCTC 420 CAAGTGGCAA AGCATCTAAA CAAAACCAAG TTGTCTTGGA ACAAAGATGG CATTCTCCAT 480 GGAGTCAGAT ATCAGGATGG GAATCTGGTG ATCCAATTCC CTGGTTTGTA CTTCATCATT 540 TGCCAACTGC AGTTTCTTGT ACAATGCCCA AATAATTCTG TCGATCTGAA GTTGGAGCTT 600 CTCATCAACA AGCATATCAA AAAACAGGCC CTGGTGACAG TGTGTGAGTC TGGAATGCAA 660 ACGAAACACG TATACCAGAA TCTCTCTCAA TTCTTGCTGG ATTACCTGCA GGTCAACACC 720 ACCATATCAG TCAATGTGGA TACATTCCAG TACATAGATA CAAGCACCTT TCCTCTTGAG 780 AATGTGTTGT CCATCTTCTT ATACAGTAAT TCAGACTGAA CAGTTTCTCT TGGCCTTCAG 840 GAAGAAAGCG CCTCTCTACC ATACAGTATT TCATCCCTCC AAACACTTGG GCAAAAAGAA 900 AACTTTAGAC CAAGACAAAC TACACAGGGT ATTAAATAGT ATACTTCTCC TTCTGTCTCT 960 TGGAAAGATA CAGCTCCAGG GTTAAAAAGA GAGTTTTTAG TGAAGTATCT TTCAGATAGC 1020 AGGCAGGGAA GCAATGTAGT GTGGTGGGCA GAGCCCCACA CAGAATCAGA AGGGATGAAT 1080 GGATGTCCCA GCCCAACCAC TAATTCACTG TATGGTCTTG ATCTATTTCT TCTGTTTTGA 1140 GAGCCTCCAG TTAAAATGGG GCTTCAGTAC CAGAGCAGCT AGCAACTCTG CCCTAATGGG 1200 AAATGAAGGG GAGCTGGGTG TGAGTGTTTA CACTGTGCCC TTCACGGGAT ACTTCTTTTA 1260 TCTGCAGATG GCCTAATGCT TAGTTGTCCA AGTCGCGATC AAGGACTCTC TCACACAGGA 1320 AACTTCCCTA TACTGGCAGA TACACTTGTG ACTGAACCAT GCCCAGTTTA TGCCTGTCTG 1380 ACTGTCACTC TGGCACTAGG AGGCTGATCT TGTACTCCAT ATGACCCCAC CCCTAGGAAC 1440 CCCCAGGGAA AACCAGGCTC GGACAGCCCC CTGTTCCTGA GATGGAAAGC ACAAATTTAA 1500 TACACCACCA CAATGGAAAA CAAGTTCAAA GACTTTTACT TACAGATCCT GGACAGAAAG 1560 GGCATAATGA GTCTGAAGGG CAGTCCTCCT TCTCCAGGTT ACATGAGGCA GGAATAAGAA 1620 GTCAGACAGA GACAGCAAGA CAGTTAACAA CGTAGGTAAA GAAATAGGGT GTGGTCACTC 1680 TCAATTCACT GGCAAATGCC TGAATGGTCT GTCTGAAGGA AGCAACAGAG AAGTGGGGAA 1740 TCCAGTCTGC TAGGCAGGAA AGATGCCTCT AAGTTCTTGT CTCTGGCCAG AGGTGTGGTA 1800 TAGAACCAGA AACCCATATC AAGGGTGACT AAGCCCGGCT TCCGGTATGA GAAATTAAAC 1860 TTGTATACAA AATGGTTGCC AAGGCAACAT AAAATTATAA GAATTC 1906 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1619 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: GTCATGGAAT ACGCCTCTGA CGCTTCACTG GACCCCGAAG CCCCGTGGCC TCCCGCGCCC 60 CGCGCTCGCG CCTGCCGCGT ACTGCCTTGG GCCCTGGTCG CGGGGCTGCT GCTGCTGCTG 120 CTGCTCGCTG CCGCCTGCGC CGTCTTCCTC GCCTGCCCCT GGGCCGTGTC CGGGGCTCGC 180 GCCTCGCCCG GCTCCGCGGC CAGCCCGAGA CTCCGCGAGG GTCCCGAGCT TTCGCCCGAC 240 GATCCCGCCG GCCTCTTGGA CCTGCGGCAG GGCATGTTTG CGCAGCTGGT GGCCCAAAAT 300 GTTCTGCTGA TCGATGGGCC CCTGAGCTGG TACAGTGACC CAGGCCTGGC AGGCGTGTCC 360 CTGACGGGGG GCCTGAGCTA CAAAGAGGAC ACGAAGGAGC TGGTGGTGGC CAAGGCTGGA 420 GTCTACTATG TCTTCTTTCA ACTAGAGCTG CGGCGCGTGG TGGCCGGCGA GGGCTCAGGC 480 TCCGTTTCAC TTGCGCTGCA CCTGCAGCCA CTGCGCTCTG CTGCTGGGGC CGCCGCCCTG 540 GCTTTGACCG TGGACCTGCC ACCCGCCTCC TCCGAGGCTC GGAACTCGGC CTTCGGTTTC 600 CAGGGCCGCT TGCTGCACCT GAGTGCCGGC CAGCGCCTGG GCGTCCATCT TCACACTGAG 660 GCCAGGGCAC GCCATGCCTG GCAGCTTACC CAGGGCGCCA CAGTCTTGGG ACTCTTCCGG 720 GTGACCCCCG AAATCCCAGC CGGACTCCCT TCACCGAGGT CGGAATAACG CCCAGCCTGG 780 GTGCAGCCCA CCTGGACAGA GTCCGAATCC TACTCCATCC TTCATGGAGA CCCCTGGTGC 840 TGGGTCCCTG CTGCTTTCTC TACCTCAAGG GGCTTGGCAG GGGTCCCTGC TGCTGACCTC 900 CCCTTGAGGA CCCTCCTCAC CCACTCCTTC CCCAAGTTGG ACCTTGATAT TTATTCTGAG 960 CCTGAGCTCA GATAATATAT TATATATATT ATATATATAT ATATATTTCT ATTTAAAGAG 1020 GATCCTGAGT TTGTGAATGG ACTTTTTTAG AGGAGTTGTT TTGGGGGGGG GGTCTTCGAC 1080 ATTGCCGAGG CTGGTCTTGA ACTCCTGGAC TTAGACGATC CTCCTGCCTC AGCCTCCCAA 1140 GCAACTGGGA TTCATCCTTT CTATTAATTC ATTGTACTTA TTTGCCTATT TGTGTGTATT 1200 GAGCATCTGT AATGTGCCAG CATTGTGCCC AGGCTAGGGG GCTATAGAAA CATCTAGAAA 1260 TAGACTGAAA GAAAATCTGA GTTATGGTAA TACGTGAGGA ATTTAAAGAC TCATCCCCAG 1320 CCTCCACCTC CTGTGTGATA CTTGGGGGCT AGCTTTTTTC TTTCTTTCTT TTTTTTGAGA 1380 TGGTCTTGTT CTGTCAACCA GGCTAGAATG CAGCGGTGCA ATCATGAGTC AATGCAGCCT 1440 CCAGCCTCGA CCTCCCGAGG CTCAGGTGAT CCTCCCATCT CAGCCTCTCG AGTAGCTGGG 1500 ACCACAGTTG TGTGCCACCA CACTTGGCTA ACTTTTTAAT TTTTTTGCGG AGACGGTATT 1560 GCTATGTTGC CAAGGTTGTT TACATGCCAG TACAATTTAT AATAAACACT CATTTTTCC 1619 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1239 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: AGCCTATAAA GCACGGGCAC TGGCGGGAGA CGTGCACTGA CCGACCGTGG TAATGGACCA 60 GCACACACTT GATGTGGAGG ATACCGCGGA TGCCAGACAT CCAGCAGGTA CTTCGTGCCC 120. CTCGGATGCG GCGCTCCTCA GAGATACCGG GCTCCTCGCG GACGCTGCGC TCCTCTCAGA 180 TACTGTGCGC CCCACAAATG CCGCGCTCCC CACGGATGCT GCCTACCCTG CGGTTAATGT 240 TCGGGATCGC GAGGCCGCGT GGCCGCCTGC ACTGAACTTC TGTTCCCGCC ACCCAAAGCT 300 CTATGGCCTA GTCGCTTTGG TTTTGCTGCT TCTGATCGCC GCCTGTGTTC CTATCTTCAC 360 CCGCACCGAG CCTCGGCCAG CGCTCACAAT CACCACCTCG CCCAACCTGG GTACCCGAGA 420 GAATAATGCA GACCAGGTCA CCCCTGTTTC CCACATTGGC TGCCCCAACA CTACACAACA 480 GGGCTCTCCT GTGTTCGCCA AGCTACTGGC TAAAAACCAA GCATCGTTGT GCAATACAAC 540 TCTGAACTGG CACAGCCAAG ATGGAGCTGG GAGCTCATAC CTATCTCAAG GTCTGAGGTA 600 CGAAGAAGAC AAAAAGGAGT TGGTGGTAGA CAGTCCCGGG CTCTACTACG TATTTTTGGA 660 ACTGAAGCTC AGTCCAACAT TCACAAACAC AGGCCACAAG GTGCAGGGCT GGGTCTCTCT 720 TGTTTTGCAA GCAAAGCCTC AGGTAGATGA CTTTGACAAC TTGGCCCTGA CAGTGGAACT 780 GTTCCCTTGC TCCATGGAGA ACAAGTTAGT GGACCGTTCC TGGAGTCAAC TGTTGCTCCT 840 GAAGGCTGGC CACCGCCTCA GTGTGGGTCT GAGGGCTTAT CTGCATGGAG CCCAGGATGC 900 ATACAGAGAC TGGGAGCTGT CTTATCCCAA CACCACCAGC TTTGGACTCT TTCTTGTGAA 960 ACCCGACAAC CCATGGGAAT GAGAACTATC CTTCTTGTGA CTCCTAGTTG CTAAGTCCTC 1020 AAGCTGCTAT GTTTTATGGG GTCTGAGCAG GGGTCCCTTC CATGACTTTC TCTTGTCTTT 1080 AACTGGACTT GGTATTTATT CTGAGCATAG CTCAGACAAG ACTTTATATA ATTCACTAGA 1140 TAGCATTAGT AAACTGCTGG GCAGCTGCTA GATAAAAAAA AATTTCTAAA TCAAAGTTTA 1200 TATTTATATT AATATATAAA AATAAATGTG TTTGTAAAT 1239 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 606 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC 60 ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA 120 CTTTTTGCTG TGTATCGCTT CGCACAGGCT TTTGAAATGC AAAAAGGTGA TCAGAATCCT 180 CAAATTGCGG CACATGTCAT AAGTGAGGCC AGCAGTAAAA CAACATCTGT GTTACAGTGG 240 GCTGAAAAAG GATACTACAC CATGAGCAAC AACTTGGTAA CCCTGGAAAA TGGGAAACAG 300 CTGACCGTTA AAAGACAAGG ACTCTATTAT ATCTATGCCC AAGTCACCTT CTGTTCCAAT 360 CGGGAAGCTT CGAGTCAAGC TCCATTTATA GCCAGCCTCT GCCTAAAGTC CCCCGGTAGA 420 TTCGAGAGAA TCTTACTCAG AGCTGCAAAT ACCCACAGTT CCGCCAAACC TTGCGGGCAA 480 CAATCCATTC ACTTGGGAGG AGTATTTGAA TTGCAACCAG GTGCTTCGGT GTTTGTCAAT 540 GTGACTGATC CAAGCCAAGT GAGCCATGGC ACTGGCTTCA CGTCCTTTGG CTTACTCAAA 600 CTCTGA 606 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 783 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: ATGATCGAAA CATACAACCA AACTTCTCCC CGATCTGCGG CCACTGGACT GCCCATCAGC 60 ATGAAAATTT TTATGTATTT ACTTACTGTT TTTCTTATCA CCCAGATGAT TGGGTCAGCA 120 CTTTTTGCTG TGTATCTTCA TAGAAGATTG GATAAGGTCG AAGAGGAAGT AAACCTTCAT 180 GAAGATTTTG TATTCATAAA AAAGCTAAAG AGATGCAACA AAGGAGAAGG ATCTTTATCC 240 TTGCTGAACT GTGAGGAGAT GAGAAGGCAA TTTGAAGACC TTGTCAAGGA TATAACGTTA 300 AACAAAGAAG AGAAAAAAGA AAACAGCTTT GAAATGCAAA AAGGTGATCA GAATCCTCAA 360 ATTGCGGCAC ATGTCATAAG TGAGGCCAGC AGTAAAACAA CATCTGTGTT ACAGTGGGCT 420 GAAAAAGGAT ACTACACCAT GAGCAACAAC TTGGTAACCC TGGAAAATGG GAAACAGCTG 480 ACCGTTAAAA GACAAGGACT CTATTATATC TATGCCCAAG TCACCTTCTG TTCCAATCGG 540 GAAGCTTCGA GTCAAGCTCC ATTTATAGCC AGCCTCTGCC TAAAGTCCCC CGGTAGATTC 600 GAGAGAATCT TACTCAGAGC TGCAAATACC CACAGTTCCG CCAAACCTTG CGGGCAACAA 660 TCCATTCACT TGGGAGGAGT ATTTGAATTG CAACCAGGTG CTTCGGTGTT TGTCAATGTG 720 ACTGATCCAA GCCAAGTGAG CCATGGCACT GGCTTCACGT CCTTTGGCTT ACTCAAACTC 780 TGA 783 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 558 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 21 : CTGCTGCACT TCGGGGTAAT CGGCCCCCAG AGGGAAGAGC AGTCCCCAGG TGGCCCCTCC 60 ATCAACAGCC CTCTGGTTCA AACACTCAGG TCCTCTTCTC AAGCCTCAAG TAACAAGCCG 120 GTAGCCCACG TTGTAGCCGA CATCAACTCT CCGGGGCAGC TCCGGTGGTG GGACTCGTAT 180 GCCAATGCCC TCATGGCCAA CGGTGTGAAG CTGGAAGACA ACCAGCTGGT GGTGCCTGCT 240 GACGGGCTTT ACCTCATCTA CTCACAGGTC CTCTTCAGGG GCCAAGGCTG CCCTTCCACC 300 CCCTTGTTCC TCACCCACAC CATCAGCCGC ATTGCAGTCT CCTACCAGAC CAAGGTCAAC 360 ATCCTGTCTG CCATCAAGAG CCCTTGCCAC AGGGAGACCC CAGAGTGGGC TGAGGCCAAG 420 CCCTGGTACG AACCCATCTA CCAGGGAGGA GTCTTCCAGC TGGAGAAGGG AGATCGCCTC 480 AGTGCTGAGA TCAACCTGCC GGACTACCTG GACTATGCCG AGTCCGGGCA GGTCTACTTT 540 GGGATCATTG CCCTGTGA 558 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1783 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: CAAGTCACAT GATCCAGGAT GCAGGGGAAA ATCCTTCTTG GAACAGAGCT GGGTACAGAA 60 CCGAATCAGA TGAGGAGAGA TAAGGTGTGA TGTGGGACAG ACTATATAAA GCATGGAGCC 120 AGGGCTGCAA CAAGCAGGCA GCTGTGGGGC TCCTTCCCCT GACCCAGCCA TGCAGGTGCA 180 GCCCGGCTCG GTAGCCAGCC CCTGGAGAAG CACGAGGCCC TGGAGAAGCA CAAGTCGCAG 240 CTACTTCTAC CTCAGCACCA CCGCACTGGT GTGCCTTGTT GTGGCAGTGG CGATCATTCT 300 GGTACTGGTA GTCCAGAAAA AGGACTCCAC TCCAAATACA ACTGAGAAGG CCCCCCTTAA 360 AGGAGGAAAT TGCTCAGAGG ATCTCTTCTG TACCCTGAAA AGTACTCCAT CCAAGAAGTC 420 ATGGGCCTAC CTCCAAGTGT CAAAGCATCT CAACAATACC AAACTGTCAT GGAACGAAGA 480 TGGCACCATC CACGGACTCA TATACCAGGA CGGGAACCTG ATAGTCCAAT TCCCTGGCTT 540 GTACTTCATC GTTTGCCAAC TGCAGTTCCT CGTGCAGTGC TCAAATCATT CTGTGGACCT 600 GACATTGCAG CTCCTCATCA ATTCCAAGAT CAAAAAGCAG ACGTTGGTAA CAGTGTGTGA 660 GTCTGGAGTT CAGAGTAAGA ACATCTACCA GAATCTCTCT CAGTTTTTGC TGCATTACTT 720 AC GGTCAAC TCTACCATAT CAGTCAGGGT GGATAATTTC CAGTATGTGG ATACAAACAC 780 TTTCCCTCTT GATAATGTGC TATCCGTCTT CTTATATAGT AGCTCAGACT GAATAGTTGT 840 TCTTAACCTT TATGAAAATG CTGTCTACCA TACAGTACTT CATCTGTCCA AACATGGGCC 900 AAAGAAAATA TTAGGACAAC TCAAACTAAG CATGTGAGTT AGTGCACTTC TCTTTCTGTC 960 CTTTGGAAAA ATACAAACCC AGGATTTAGA AAGTGGAGTC TCCTTCAGAT GCACAAACAG 1020 GAAAGAATGT GATATGTGCA CAGAGACCTA CTTGGGCACT AGAAGGGGTG TGAGTTGTCC 1080 CAGTATAACC ACTAATTCAC TGACCTTGAG CCATTTTTCC TTCCCCCTGG AACTTGGGGT 1140 CTGAATCTGG AAAAGTAGGA GATGAGATTT ACATTTCCCC AATATTTTCT TCAACTCAGA 1200 AGACGAGACT GTGGAGCTGA GCTCCCTACA CAGATGAAGG CCTCCCATGG CATGAGGAAA 1260 ATGATGGTAC CAGTAATGTC TGTCTGACTG TCATCTCAGC AAGTCCTAAG GACTTCCATG 1320 CTGCCTTGTT GAAAGATACT CTAACCTCTT GTAATGGGCA AAGTGATCCT GTCTCTCACT 1380 GAGGGGAGTA GCTGCTGCCA TCTCCTGAGA CATACATGGA GACATTTTCT GCCCAAATTC 1440 CATTCTGTGT GCAGTTTTTA AGTATTCCCC CAAAAGTTCT TGACAATGAG AACTTTGAAT 1500 GTGGGAAGAG CTTCTGGACA GCAAACATTA ACAGCTTCTC CTGACCAGAG AGACCATGCA 1560 AGCTTGGTCT TAGACCCATC AAGCTTGAGG TTTCTACATT GTGGGAGACA GACTTTTGAC 1620 AAACCATTTG AGTTGATGTC TGGGCCCCTG GGAGTTCTCC TTCAGTAAGG AGAGCAAGCC 1680 GTTCTAGTGC TGTGTCAGAG GATGGAGTAA AATAGACACT TTTCTGAAGG AAAGGAGAAC 1740 AAAGTTCCAG AAAAAGGCTA GAAAATGTTT AAAAAGAAAA AAA 1783 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1047 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: AGAGAGCGCT GGGAGCCGGA GGGGAGCGCA GCGAGTTTTG GCCAGTGGTC GTGCAGTCCA 60 AGGGGCTGGA TGGCATGCTG GACCCAAGCT CAGCTCAGCG TCCGGACCCA ATAACAGTTT 120 TACCAAGGGA GCAGCTTTCT ATCCTGGCCA CACTGAGGTG CATAGCGTAA TGTCCATGTT 180 GTTCTACACT CTGATCACAG CTTTTCTGAT CGGCATACAG GCGGAACCAC ACTCAGAGAG 240 CAATGTCCCT GCAGGACACA CCATCCCCCA AGTCCACTGG ACTAAACTTC AGCATTCCCT 300 TGACACTGCC CTTCGCAGAG CCCGCAGCGC CCCGGCAGCG GCGATAGCTG CACGCGTGGC 360 GGGGCAGACC CGCAACATTA CTGTGGACCC CAGGCTGTTT AAAAAGCGGC GACTCCGTTC 420 ACCCCGTGTG CTGTTTAGC CCCAGCCTCC CCGTGAAGCT GCAGACACTC AGGATCTGGA 480 CTTCGAGGTC GGTGGTGCTG CCCCCTTCAA CAGGACTCAC AGGAGCAAGC GGTCATCATC 540 CCATCCCATC TTCCACAGGG GCGAATTCTC GGTGTGTGAC AGTGTCAGCG TGTGGGTTGG 600 GGATAAGACC ACCGCCACAG ACATCAAGGG CAAGGAGGTG ATGGTGTTGG GAGAGGTGAA 660 CATTAACAAC AGTGTATTCA AACAGTACTT TTTTGAGACC AAGTGCCGGG ACCCAAATCC 720 CGTTGACAGC GGGTGCCGGG GCATTGACTC AAAGCACTGG AACTCATATT GTACCACGAC 780 TCACACCTTT GTCAAGGCGC TGACCATGGA TGGCAAGCAG GCTGCCTGGC GGTTTATCCG 840 GATAGATACG GCCTGTGTGT GTGTGCTCAG CAGGAAGGCT GTGAGAAGAG CCTGACCTGC 900 CGACACGCTC CCTCCCCCTG CCCCTTCTAC ACTCTCCTGG GCCCCTCCCT ACCTCAACCT 960 GTAAATTATT TTAAATTATA AGGACTGCAT GGTAATTTAT AGTTTATACA GTTTTAAAGA 1020 ATCATTATTT ATTAAATTTT TGGAAGC 1047 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1176 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: GAGCGCCTGG AGCCGGAGGG GAGCGCATCG AGTGACTTTG GAGCTGGCCT TATATTTGGA 60 TCTCCCGGGC AGCTTTTTGG AAACTCCTAG TGAACATGCT GTGCCTCAAG CCAGTGAAAT 120 TAGGCTCCCT GGAGGTGGGA CACGGGCAGC ATGGTGGAGT TTTGGCCTGT GGTCGTGCAG 180 TCCAGGGGGC TGGATGGCAT GCTGGACCCA AGCTCACCTC AGTGTCTGGG CCCAATAAAG 2 0 GTTTTGCCAA GGACGCAGCT TTCTATACTG GCCGCAGTGA GGTGCATAGC GTAATGTCCA 300 TGTTGTTCTA CACTCTGATC ACTGCGTTTT TGATCGGCGT ACAGGCAGAA CCGTACACAG 360 ATAGCAATGT CCCAGAAGGA GACTCTGTCC CTGAAGCCCA CTGGACTAAA CTTCAGCATT 420 CCCTTGACAC AGCCCTCCGC AGAGCCCGCA GTGCCCCTAC TGCACCAATA GCTGCCCGAG 480 TGACAGGGCA GACCCGCAAC ATCACTGTAG ACCCCAGACT GTTTAAGAAA CGGAGACTCC 540 ACTCACCCCG TGTGCTGTTC AGCACCCAGC CTCCACCCAC CTCTTCAGAC ACTCTGGATC 600 TAGACTTCCA GGCCCATGGT ACAATCCCTT TCAACAGGAC TCACCGGAGC AAGCGCTCAT 660 CCACCCACCC AGTCTTCCAC ATGGGGGAGT TCTCAGTGTG TGACAGTGTC AGTGTGTGGG 720 TTGGAGATAA GACCACAGCC ACAGACATCA AGGGCAAGGA GGTGACAGTG CTGGCCGAGG 780 TGAACATTAA CAACAGTGTA TTCAGACAGT ACTTTTTTGA GACCAAGTGC CGAGCCTCCA 840 ATCCTGTTGA GAGTGGGTGC CGGGGCATCG ACTCCAAACA CTGGAACTCA TACTGCACCA 900 CGACTCACAC CTTCGTCAAG GCGTTGACAA CAGATGAGAA GCAGGCTGCC TGGAGGTTCA 960 TCCGGATAGA CACAGCCTGT GTGTGTGTGC TCAGCAGGAA GGCTACAAGA AGAGGCTGAC 1020 TTGCCTGCAG CCCCCTTCCC CACCTGCCCC CTCCACACTC TCTTGGGCCC CTCCCTACCT 1080 CAGCCTGTAA ATTATTTTAA ATTATAAGGA CTGCATGATA ATTTATCGTT TATACAATTT 1140 TAAAGACATT ATTTATTAAA TTTTCAAAGC ATCCTG 1176 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1623 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: TCAGAGTCCT GTCCTTGACA CTTCAGTCTC CACAAGACTG AGAGGAGGAA ACCCTTTCCT 60 GGGGCTGGGT GCCATGCAGC AGCCCGTGAA TTACCCATGT CCCCAGATCT ACTGGGTAGA 120 CAGCAGTGCC ACTTCTCCTT GGGCTCCTCC AGGGTCAGTT TTTTCTTGTC CATCCTCTGG 180 GCCTAGAGGG CCAGGACAAA GGAGACCACC GCCTCCACCA CCACCTCCAT CACCACTACC 240 ACCGCCTTCC CAACCACCCC CGCTGCCTCC ACTAAGCCCT CTAAAGAAGA AGGACAACAT 300 AGAGCTGTGG CTACCGGTGA TATTTTTCAT GGTGCTGGTG GCTCTGGTTG GAATGGGGTT 360 AGGAATGTAT CAACTCTTTC ATCTACAGAA GGAACTGGCA GAACTCCGTG AGTTCACCAA 420 CCACAGCCTT AGAGTATCAT CTTTTGAAAA GCAAATAGCC AACCCCAGCA CACCCTCTGA 480 AACCAAAAAG CCAAGGAGTG TGGCCCACTT AACAGGGAAC CCCCGCTCAA GGTCCATCCC 540 TCTGGAATGG GAAGACACAT ATGGAACTGC TTTGATCTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAAGG 600 CGGCCTTGTG ATCAATGAGG CTGGGTTGTA CTTCGTATAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG 660 TCAGTCTTGC AACAGCCAGC CCCTAAGCCA CAAGGTCTAT ATGAGGAACT TTAAGTATCC 720 TGGGGATCTG GTGCTAATGG AGGAGAAGAA GTTGAATTAC TGCACTACTG GCCAGATATG 780 GGCCCACAGC AGCTACCTAG GGGCAGTATT TAATCTTACC GTTGCTGACC ATTTATATGT 840 CAACATATCT CAACTCTCTC TGATCAATTT TGAGGAATCT AAGACCTTTT TTGGCTTATA 900 TAAGCTTTAA AGGAAAAAGC ATTTTAGAAT GATCTATTAT TCTTTATCAT GGATGCCAGG 960 AATATTGTCT TCAATGAGAG TCTTCTTAAG ACCAATTGAG CCACAAAGAC CACAAGGTCC 1020 AACAGGTCAG CTACCCTTCA TTTTCTAGAG GTCCATGGAG TGGTCCTTAA TGCCTGCATC 1080 ATGAGCCAGA TGGGAAGAAG ACTGTTCCTG AGGAACATAA AGTTTTGGGC TGCTGTGTGG 1140 CAATGCAGAG GCAAAGAGAA GGAACTGTCT GATGTTAAAT GGCCAAGAGC ATTTTAGCCA 1200 TTGAAGAAAA AAAAAACCTT TAAACTCACC TTCCAGGGTG GGTCTACTTG CTACCTCACA 1260 GGAGGCCGTC TTTTAGACAC ATGGTTGTGG TATGACTATA CAAGGGTGAG AAAGGATGCT 1320 AGGTTTCATG GATAAGCTAG AGACTGAAAA AAGCCAGTGT CCCATTGGCA TCATCTTTAT 1380 TTTTAACTGA TGTTTTCTGA GCCCACCTTT GATGCTAACA GAGAAATAAG AGGGGTGTTT 1440 GAGGCACAAG TCATTCTCTA CATAGCATGT GTACCTCCAG TGCAATGATG TCTGTGTGTG 1500 TTTTTATGTA TGAGAGTAGA GCGATTCTAA AGAGTCACAT GAGTACAACG CGTACATTAC 1560 GGAGTACATA TTAGAAACGT ATGTGTTACA TTTGATGCTA GAATATCTGA ATGTTTCTTG 1620 CTA 1623 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: GTTAAGCTTT TCAGTCAGCA TGATAGAA 28 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: GTTTCTAGAT CAGAGTTTGA GTAAGCC 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 28: CCAAGACTAG TTAACACAGC ATGATCGAAA 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: CCAATGCGGC CGCACTCAGA ATTCAACCTG 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 972 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: TCTAGACTCA GGACTGAGAA GAAGTAAAAC CGTTTGCTGG GGCTGGCCTG ACTCACCAGC 60 TGCCATGCAG CAGCCCTTCA ATTACCCATA TCCCCAGATC TACTGGGTGG ACAGCAGTGC 120 CAGCTCTCCC TGGGCCCCTC CAGGCACAGT TCTTCCCTGT CCAACCTCTG TGCCCAGAAG 180 GCCTGGTCAA AGGAGGCCAC CACCACCACC GCCACCGCCA CCACTACCAC CTCCGCCGCC 240 GCCGCCACCA CTGCCTCCAC TACCGCTGCC ACCCCTGAAG AAGAGAGGGA ACCACAGCAC 300 AGGCCTGTGT CTCCTTGTGA TGTTTTTCAT GGTTCTGGTT GCCTTGGTAG GATTGGGCCT 360 GGGGATGTTT CAGCTCTTCC ACCTACAGAA GGAGCTGGCA GAACTCCGAG AGTCTACCAG 420 CCAGATGCAC ACAGCATCAT CTTTGGAGAA GCAAATAGGC CACCCCAGTC CACCCCCTGA 480 AAAAAAGGAG CTGAGGAAAG TGGCCCATTT AACAGGCAAG TCCAACTCAA GGTCCATGCC 540 TCTGGAATGG GAAGACACCT ATGGAATTGT CCTGCTTTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAGGG 600 TGGCCTTGTG ATCAATGAAA CTGGGCTGTA CTTTGTATAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG 660 TCAATCTTGC AACAACCTGC CCCTGAGCCA CAAGGTCTAC ATGAGGAACT CTAAGTATCC 720 CCAGGATCTG GTGATGATGG AGGGGAAGAT GATGAGCTAC TGCACTACTG GGCAGATGTG 780 GGCCCGCAGC AGCTACCTGG GGGCAGTGTT CAATCTTACC AGTGCTGATC ATTTATATGT 840 CAACGTATCT GAGCTCTCTC TGGTCAATTT TGAGGAATCT CAGACGTTTT TCGGCTTATA 900 TAAGCTCTAA GAGAAGCACT TTGGGATTCT TTCCATTATG ATTCTTTGTT ACAGGCACCG 960 AGATGTTCTA GA 972 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 885 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 31 : ATGCAGCAGC CCATGAATTA CCCATGTCCC CAGATCTTCT GGGTAGACAG CAGTGCCACT 60 TCATCTTGGG CTCCTCCAGG GTCAGTTTTT CCCTGTCCAT CTTGTGGGCC TAGAGGGCCG 120 GACCAAAGGA GACCGCCACC TCCACCACCA CCTGTGTCAC CACTACCACC GCCATCACAA 180 CCACTCCCAC TGCCGCCACT GACCCCTCTA AAGAAGAAGG ACCACAACAC AAATCTGTGG 240 CTACCGGTGG TATTTTTCAT GGTTCTGGTG GCTCTGGTTG GAATGGGATT AGGAATGTAT 300 CAGCTCTTCC ACCTGCAGAA GGAACTGGCA GAACTCCGTG AGTTCACCAA CCAAAGCCTT 360 AAAGTATCAT CTTTTGAAAA GCAAATAGCC AACCCCAGTA CACCCTCTGA AAAAAAAGAG 420 CCGAGGAGTG TGGCCCATTT AACAGGGAAC CCCCACTCAA GGTCCATCCC TCTGGAATGG 480 GAAGACACAT ATGGAACCGC TCTGATCTCT GGAGTGAAGT ATAAGAAAGG TGGCCTTGTG 540 ATCAACGAAG CTGGGTTGTA CTTCGTATAT TCCAAAGTAT ACTTCCGGGG TCAGTCTTGC 600 AACAACCAGC CCCTAAACCA CAAGGTCTAT ATGAGGAACT CTAAGTATCC TGGGGATCTG 660 GTGCTAATGG AGGAGAAGAG GTTGAACTAC TGCACTACTG GACAGATATG GGCCCACAGC 720 AGCTACCTGG GGGCAGTATT CAATCTTACC AGTGCTGACC ATTTATATGT CAACATATCT 780 CAACTCTCTC TGATCAATTT TGAGGAATCT AAGACCTTTT TCGGCTTGTA TAAGCTTTAA 840 AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCA 885 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: CTTAAGCTTC TACAGGACTG AGAAGAAGT 29 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: CTTGAATTCC AACATTCTCG GTGCCTGTAA 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: TCAGGATCCA CAAGGCTGTG AGAAGGA 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: CTTGTCTAGA CCTGGTGCC CATGATA 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 680 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 36: ATGCCGGAGG AAGGTCGCCC TTGCCCCTGG GTTCGCTGGA GCGGGACCGC GTTCCAGCGC 60 CAATGGCCAT GGCTGCTGCT GGTGGTGTTT ATTACTGTGT TTTGCTGTTG GTTTCATTGT 120 AGCGGACTAC TCAGTAAGCA GCAACAGAGG CTGCTGGAGC ACCCTGAGCC GCACACAGCT 180 GAGTTACAGC TGAATCTCAC AGTTCCTCGG AAGGACCCCA CACTGCGCTG GGGAGCAGGC 240 CCAGCCTTGG GAAGGTCCTT CACACACGGA CCAGAGCTGG AGGAGGGCCA TCTGCGTATC 300 CATCAAGATG GCCTCTACAG GCTGCATATC CAGGTGACAC TGGCCAACTG CTCTTCCCCA 360 GGCAGCACCC TGCAGCACAG GGCCACCCTG GCTGTGGGCA TCTGCTCCCC CGCTGCGCAC 420 GGCATCAGCT TGCTGCGTGG GCGCTTTGGA CAGGACTGTA CAGTGGCATT ACAGCGCCTG 480 ACATACCTGG TCCACGGAGA TGTCCTCTGT ACCAACCTCA CCCTGCCTCT GCTGCCGTCC 540 CGCAACGCTG ATGAGACCTT CTTTGGAGTT CAGTGGATAT GCCCTTGACC ACAACTCCAG 600 GATGACTTGT GAATATTTTT TTTCTTTTCA AGTTCTACGT ATTTATAAAT GTATATAGTA 660 CACATAAAAA AAAAAAAAAA 680 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 846 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC 60 TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT 120 GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG 180 CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC 240 CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG 300 ATGTTTCAGC TCTTCCACCT GCAGAAGGAA CTGGCAGAAC TCCGTGAGTT CACCAACCAA 360 AGCCTTAAAG TATCATCTTT TGAAAAGCAA ATAGGCCACC CCAGTCCACC CCCTGAAAAA 420 AAGGAGCTGA GGAAAGTGGC CCATTTAACA GGCAAGTCCA ACTCAAGGTC CATGCCTCTG 480 GAATGGGAAG ACACCTATGG AATTGTCCTG CTTTCTGGAG TGAAGTATAA GAAGGGTGGC 540 CTTGTGATCA ATGAAACTGG GCTGTACTTT GTATATTCCA AAGTATACTT CCGGGGTCAA 600 TCTTGCAACA ACCTGCCCCT GAGCCACAAG GTCTACATGA GGAACTCTAA GTATCCCCAG 660 GATCTGGTGA TGATGGAGGG GAAGATGATG AGCTACTGCA CTACTGGGCA GATGTGGGCC 720 CGCAGCAGCT ACCTGGGGGC AGTGTTCAAT CTTACCAGTG CTGATCATTT ATATGTCAAC 780 GTATCTGAGC TCTCTCTGGT CAATTTTGAG GAATCTCAGA CGTTTTTCGG CTTATATAAG 840 CTCTAA 846 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 786 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 38: ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC 60 TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT 120 GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG 180 CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC 240 CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG 300 ATGTTTCAGC TCTTCCGCTT CGCACAGGCT ATAGGCCACC CCAGTCCACC CCCTGAAAAA 360 AAGGAGCTGA GGAAAGTGGC CCATTTAACA GGCAAGTCCA ACTCAAGGTC CATGCCTCTG 420 GAATGGGAAG ACACCTATGG AATTGTCCTG CTTTCTGGAG TGAAGTATAA GAAGGGTGGC 480 CTTGTGATCA ATGAAACTGG GCTGTACTTT GTATATTCCA AAGTATACTT CCGGGGTCAA 540 TCTTGCAACA ACCTGCCCCT GAGCCACAAG GTCTACATGA GGAACTCTAA GTATCCCCAG 600 GATCTGGTGA TGATGGAGGG GAAGATGATG AGCTACTGCA CTACTGGGCA GATGTGGGCC 660 CGCAGCAGCT ACCTGGGGGC AGTGTTCAAT CTTACCAGTG CTGATCATTT ATATGTCAAC 720 GTATCTGAGC TCTCTCTGGT CAATTTTGAG GAATCTCAGA CGTTTTTCGG CTTATATAAG 780 CTCTAA 786 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 864 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC 60 TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT 120 GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG 180 CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC 240 CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG 300 ATGTTTCAGC TCTTCCAATC CTCCATCCTC CCCTATGCCG GAGGAGGGTT CGGGCTGCTC 360 GGTGCGGCGC AGGCCCTATG GGTGCGTCCT GCGGCCATCC TCAATCCTAT AGGCCACCCC 420 AGTCCACCCC CTGAAAAAAA GGAGCTGAGG AAAGTGGCCC ATTTAACAGG CAAGTCCAAC 480 TCAAGGTCCA TGCCTCTGGA ATGGGAAGAC ACCTATGGAA TTGTCCTGCT TTCTGGAGTG 540 AAGTATAAGA AGGGTGGCCT TGTGATCAAT GAAACTGGGC TGTACTTTGT ATATTCCAAA 600 GTATACTTCC GGGGTCAATC TTGCAACAAC CTGCCCCTGA GCCACAAGGT CTACATGAGG 660 AACTCTAAGT ATCCCCAGGA TCTGGTGATG ATGGAGGGGA AGATGATGAG CTACTGCACT 720 ACTGGGCAGA TGTGGGCCCG CAGCAGCTAC CTGGGGGCAG TGTTCAATCT TACCAGTGCT 780 GATCATTTAT ATGTCAACGT ATCTGAGCTC TCTCTGGTCA ATTTTGAGGA ATCTCAGACG 840 TTTTTCGGCT TATATAAGCT CTAA 864 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 828 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG CAGTGCCAGC 60 TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCC A CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT 120 GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG 180 CCACCACTGC CTCCACTACC GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC 240 CTGTGTCTCC TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG 300 ATGTTTCAGC TCTTCCACCT ACAGCGAGAG TCTACCAGCC AGATGCACAC AGCATCATCT 360 TTGGAGAAGC AAATAGGCCA CCCCAGTCCA CCCCCTGAAA AAAAGGAGCT GAGGAAAGTG 420 GCCCATTTAA CAGGCAAGTC CAACTCAAGG TCCATGCCTC TGGAATGGGA AGACACCTAT 480 GGAATTGTCC TGCTTTCTGG AGTGAAGTAT AAGAAGGGTG GCCTTGTGAT CAATGAAACT 540 GGGCTGTACT TTGTATATTC CAAAGTATAC TTCCGGGGTC AATCTTGCAA CAACCTGCCC 600 CTGAGCCACA AGGTCTACAT GAGGAACTCT AAGTATCCCC AGGATCTGGT GATGATGGAG 660 GGGAAGATGA TGAGCTACTG CACTACTGGG CAGATGTGGG CCCGCAGCAG CTACCTGGGG 720 GCAGTGTTCA ATCTTACCAG TGCTGATCAT TTATATGTCA ACGTATCTGA GCTCTCTCTG 780 GTCAATTTTG AGGAATCTCA GACGTTTTTC GGCTTATATA AGCTCTAA 828 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 846 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 41 : ATGGCTATGA TGGAGGTCCA GGGGGGACCC AGCCTGGGAC AGACCTGCGT GCTGATCGTG 60 ATCTTCACAG TGCTCCTGCA GTCTCTCTGT GTGGCTGTAA CTTACGTGTA CTTTACCAAC 120 GAGCTGAAGC AGATGCAGGA CAAGTACTCC AAAAGTGGCA TTGCTTGTTT CTTAAAAGAA 180 GATGACAGTT ATTGGGACCC CAATGACGAA GAGAGTATGA ACAGCCCCTG CTGGCAAGTC 240 AAGTGGCAAC TCCGTCAGCT CGTTAGAAAG ATGATTTTGA GAACCTCTGA GGAAACCATT 300 TCTACAGTTC AAGAAAAGCA ACAAAATATT TCTCCCCTAG TGAGAGAAAG AGGTCCTCAG 360 AGAGTAGCAG CTCACATAAC TGGGACCAGA GGAAGAAGCA ACACATTGTC TTCTCCAAAC 420 TCCAAGAATG AAAAGGCTCT GGGCCGCAAA ATAAACTCCT GGGAATCATC AAGGAGTGGG 480 CATTCATTCC TGAGCAACTT GCACTTGAGG AATGGTGAAC TGGTCATCCA TGAAAAAGGG 540 TTTTACTACA TCTATTCCCA AACATACTTT CGATTTCAGG AGGAAATAAA AGAAAACACA 600 AAGAACGACA AACAAATGGT CCAATATATT TACAAATACA CAAGTTATCC TGACCCTATA 660 TTGTTGATGA AAAGTGCTAG AAATAGTTGT TGGTCTAAAG ATGCAGAATA TGGACTCTAT 720 TCC TCTATC AAGGGGGAAT ATTTGAGCTT AAGGAAAATG ACAGAATTTT TGTTTCTGTA 780 ACAAATGAGC ACTTGATAGA CATGGACCAT GAAGCCAGTT TTTTCGGGGC CTTTTTAGTT 840 GGCTAA 846 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 876 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 42: ATGCCTTCCT CAGGGGCCCT GAAGGACCTC AGCTTCAGTC AGCACTTCAG GATGATGGTG 60 ATTTGCATAG TGCTCCTGCA GGTGCTCCTG CAGGCTGTGT CTGTGGCTGT GACTTACATG 120 TACTTCACCA ACGAGATGAA GCAGCTGCAG GACAATTACT CCAAAATTGG ACTAGCTTGC 180 TTCTCAAAGA CGGATGAGGA TTTCTGGGAC TCCACTGATG GAGAGATCTT GAACAGACCC 240 TGCTTGCAGG TTAAGAGGCA ACTGTATCAG CTCATTGAAG AGGTOACTTT GAGAACCTTT 300 CAGGACACCA TTTCTACAGT TCCAGAAAAG CAGCTAAGTA CTCCTCCCTT GCCCAGAGGT 360 GGAAGACCTC AGAAAGTGGC AGCTCACATT ACTGGGATCA CTCGGAGAAG CAACTCAGCT 420 TTAATTCCAA TCTCCAAGGA TGGAAAGACC TTAGGCCAGA AGATTGAATC CTGGGAGTCC 480 TCTCGGAAAG GGCATTCATT TCTCAACCAC GTGCTCTTTA GGAATGGAGA GCTGGTCATC 540 GAGCAGGAGG GCCTGTATTA CATCTATTCC CAAACATACT TCCGATTTCA GGAAGCTGAA 600 GACGCTTCCA AGATGGTCTC AAAGGACAAG GTGAGAACCA AACAGCTGGT GCAGTACATC 660 TACAAGTACA CCAGCTATCC GGATCCCATA GTGCTCATGA AGAGCGCCAG AAACAGCTGT 720 TGGTCCAGAG ATGCCGAGTA CGGACTGTAC TCCATCTATC AGGGAGGATT GTTCGAGCTA 780 AAAAAAAATG ACAGGATTTT TGTTTCTGTG ACAAATGAAC ATTTGATGGA CCTGGATCAA 840 GAAGCCAGCT TCTTTGGAGC CTTTTTAATT AACTAA 876 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 720 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 43: ATGGAGCCAG GGCTGCAACA AGCAGGCAGC TGTGGGGCTC CTTCCCCTGA CCCAGCCATG 60 CAGGTGCAGC CCGGCTCGGT AGCCAGCCCC TGGAGAAGCA CGAGGCCCTG GAGAAGCACA 120 AGTCGCAGCT ACTTCTACCT CAGCACCACC GCACTGGTGT GCCTTGTTGT GGCAGTGGCG 180 ATCATTCTGG TACTGGTAGT CCAGAAAAAG GACTCCACTC CAAATACAAC TGAGAAGGCC 240 CCCCTTAAAG GAGGAAATTG CTCAGAGGAT CTCTTCTGTA CCCTGAAAAG TACTCCATCC 300 AAGAAGTCAT GGGCCTACCT CCAAGTGTCA AAGCATCTCA ACAATACCAA ACTGTCATGG 360 AACGAAGATG GCACCATCCA CGGACTCATA TACCAGGACG GGAACCTGAT AGTCCAATTC 420 CCTGGCTTGT ACTTCATCGT TTGCCAACTG CAGTTCCTCG TGCAGTGCTC AAATCATTCT 480 GTGGACCTGA CATTGCAGCT CCTCATCAAT TCCAAGATCA AAAAGCAGAC GTTGGTAACA 540 GTGTGTGAGT CTGGAGTTCA GAGTAAGAAC ATCTACCAGA ATCTCTCTCA GTTTTTGCTG 600 CATTACTTAC AGGTCAACTC TACCATATCA GTCAGGGTGG ATAATTTCCA GTATGTGGAT 660 ACAAACACTT TCCCTCTTGA TAATGTGCTA TCCGTCTTCT TATATAGTAG CTCAGACTGA 720 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 930 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 44: ATGGACCAGC ACACACTTGA TGTGGAGGAT ACCGCGGATG CCAGACATCC AGCAGGTACT 60 TCGTGCCCCT CGGATGCGGC GCTCCTCAGA GATACCGGGC TCCTCGCGGA CGCTGCGCTC 120 CTCTCAGATA CTGTGCGCCC CACAAATGCC GCGCTCCCCA CGGATGCTGC CTACCCTGCG 180 GTTAATGTTC GGGATCGCGA GGCCGCGTGG CCGCCTGCAC TGAACTTCTG TTCCCGCCAC 240 CCAAAGCTCT ATGGCCTAGT CGCTTTGGTT TTGCTGCTTC TGATCGCCGC CTGTGTTCCT 300 ATCTTCACCC GCACCGAGCC TCGGCCAGCG CTCACAATCA CCACCTCGCC CAACCTGGGT 360 ACCCGAGAGA ATAATGCAGA CCAGGTCACC CCTGTTTCCC ACATTGGCTG CCCCAACACT 420 ACACAACAGG GCTCTCCTGT GTTCGCCAAG CTACTGGCTA AAAACCAAGC ATCGTTGTGC 480 AATACAACTC TGAACTGGCA CAGCCAAGAT GGAGCTGGGA GCTCATACCT ATCTCAAGGT 540 CTGAGGTACG AAGAAGACAA AAAGGAGTTG GTGGTAGACA GTCCCGGGCT CTACTACGTA 600 TTTTTGGAAC TGAAGCTCAG TCCAACATTC ACAAACACAG GCCACAAGGT GCAGGGCTGG 660 GTCTCTCTTG TTTTGCAAGC AAAGCCTCAG GTAGATGACT TTGACAACTT GGCCCTGACA 720 GTGGAACTGT TCCCTTGCTC CATGGAGAAC AAGTTAGTGG ACCGTTCCTG GAGTCAACTG 780 TTGCTCCTGA AGGCTGGCCA CCGCCTCAGT GTGGGTCTGA GGGCTTATCT GCATGGAGCC 840 CAGGATGCAT ACAGAGACTG GGAGCTGTCT TATCCCAACA CCACCAGCTT TGGACTCTTT 900 CTTGTGAAAC CCGACAACCC ATGGGAATGA 930

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria que será introducido en células humanas para la fabricación de una composición farmacéutica para alterar la inmunorreactividad de células humanas, en donde dicho ligando de molécula accesoria es expresado sobre la superficie de dichas células, y en donde dicho ligando de molécula accesoria exhibe opcionalmente una mayor actividad estabilizada en relación con un ligando nativo de molécula accesoria correspondiente, y en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde las secuencias de nucleótidos para el gen quimérico de ligando de molécula accesoria se seleccionan de SEQ ID NOS: 3-7 y 19-20.

3.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde una molécula accesoria a la cual puede unirse el ligando de molécula accesoria también está presente sobre la superficie de dichas células.

4.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dichas células humanas son células humanas neoplásicas.

5.- El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde dichas células son células leucémicas.

6.- El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde dichas células leucémicas son linfocíticas crónicas (CLL), mielogenosas crónicas (CML), mielomonocíticas (MML), linfocíticas agudas (ALL) y leucemias de linfoma que no es de Hodgkin.

7.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria está presente en un vector capaz de transducir células humanas.

8.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria está presente como parte de un vector genético.

9.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria está enlazado operativamente a una región del promotor y a una señal de poliadenilación.

10.- El uso de conformidad con la reivindicación 9, en donde dicho gen de ligando CD40 es un gen de ligando CD40 de murino.

11.- Una célula que contiene un vector para terapia de genes que comprende un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria que exhibe opcionalmente a una mayor actividad estabilizada en células, en relación con un ligando nativo de molécula accesoria en células, en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria y en donde dicha célula se selecciona del grupo que consiste de células bacterianas, animales, humanas y de insectos.

12.- La célula humana de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha célula es una célula presentadora de antígenos.

13.- La célula humana de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha célula humana es una célula neoplásica.

14.- La célula humana de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha célula es una célula accesoria.

15.- Una composición farmacéutica para vacunar a un animal contra un organismo predeterminado, que comprende un antígeno inmunógeno capaz de causar una respuesta inmunológica a dicho organismo predeterminado junto con un vector que contiene un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria, en donde dicho gen que codifica para dicha molécula accesoria exhibe opcionalmente una mayor actividad estabilizada en relación con un ligando nativo de molécula accesoria presente en dicho animal vacunado y en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

16.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho antígeno ¡nmunógeno es codificado por genes que se encuentran presentes en un vector genético.

17.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho organismo predeterminado es un virus, una bacteria, un hongo o una célula neoplásica.

18.- Una composición farmacéutica para producir una respuesta inmunológica dirigida a un antígeno predeterminado después de la administración a un animal, que comprende: un antígeno y un vector genético que contienen un gen que codifica para un gen de ligando de molécula accesoria, en donde dicho gen que codifica para dicha molécula accesoria exhibe opcionalmente una mayor estabilidad sobre la superficie de las células, en relación con un ligando nativo de molécula accesoria presente en dicho animal para generar dicha respuesta inmunológica, y en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

19.- Una composición farmacéutica para tratar artritis reumatoide en una articulación, que comprende un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria para que dicho ligando de molécula accesoria sea expresado sobre la superficie de dichas células dentro de la articulación, y cuyo ligando exhibe opcionalmente una mayor estabilidad sobre la superficie de dichas células, en relación con un ligando nativo de molécula accesoria presente sobre las células del paciente afligido y en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

20,- La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque dicho gen de ligando de molécula accesoria es un gen de ligando Fas de murino.

- -

21.- Una composición farmacéutica para la infusión y el tratamiento de una articulación artrítica reumática, que comprende: células que han sido transformadas con un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria que es expresado sobre la superficie de dichas células, en donde dicho ligando exhibe opcionalmente una mayor actividad estabilizada, en relación con el ligando nativo de molécula accesoria presente en células de dicha articulación, y en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

22.- Una composición farmacéutica que altera la inmunorreactividad de células animales, que comprende un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria, en donde dicho ligando exhibe opcionalmente una mayor actividad estabilizada, en relación con un ligando nativo de molécula accesoria presente en dicho animal en el cual se desea inmunorreactividad alterada, y en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

23.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque dichas células animales en las que se desea inmunorreactividad alterada son humanas.

24.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el gen seleccionado es un gen de murino.

25.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-24, caracterizada además porque dicho gen de ligando de molécula accesoria es un gen de ligando CD40.

26.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22-24, caracterizada además porque dicho gen de ligando de molécula accesoria es un gen de ligando FAS.

27.- Una composición farmacéutica para tratar una neoplasia en un paciente, que comprende células que expresan un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria que exhibe opcionalmente una mayor estabilidad que un ligando nativo de molécula accesoria presente en dicho paciente, dicho ligando de molécula accesoria expresado sobre la superficie de dichas células ocasionando entonces que dichas células participen de manera más activa en una reacción inmunológica después de la inyección de dichas células en un lecho tumoral de dicho paciente, y en donde dicho gen de ligando de molécula accesoria es opcionalmente un gen quimérico de ligando de molécula accesoria.

28.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 , 22 ó 27, caracterizada además porque dichas células son células neoplásicas.

29.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 , 22 ó 27, caracterizada además porque dichas células son células presentadoras de antígenos.

30.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 , 22 ó 27, caracterizada además porque dichas células son células accesorias.

31.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque dichas células son células leucémicas.

32.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque dichas células leucémicas son linfocíticas crónicas (CLL), mielogenosas crónicas (CML), mielomonocíticas (MML), linfocíticas agudas (ALL) y leucemias de linfoma que no es de Hodgkin.

33.- La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 18, caracterizada además porque dicho vector que contiene dicho gen que codifica para dicho antígeno y dicho vector que contiene dicho gen que codifica para dicho ligando de molécula accesoria son el mismo vector.

34.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque dicho ligando codificado por dicho gen es un ligando Fas.

35.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque dicho ligando Fas es un ligando de murino.

36.- El uso de un gen que codifica para un ligando de molécula accesoria para preparar cualquiera de las composiciones farmacéuticas de conformidad con las reivindicaciones 15, 16, 17, 18, 20, 21 , 22-30 y 31-35 para alterar la inmunorreactividad del animal, incluyendo células humanas, caracterizado además porque dicha composición farmacéutica comprende opcionalmente un antígeno inmunógeno y/o un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.