JPS605600B2 - 新規なポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なポリベプチドに関するものである。 さらに詳しくいえば、本発明は、コルチコトロピン放出
促進因子（ＣＲＦ）の誘導体に関するものである。副腎
皮質ホルモンの分泌を促進するホルモンであるコルチコ
トロピン（ＡＣＴＨ）の分泌が、脳視床下部から放出さ
れる化学物質によって調節されているらしいことは既に
２３王以上前に示唆されていた。 しかし、このイＧ学物質が何であるかは長い間謎であっ
た。１９８１年ヴェールらはヒツジ視床下部からコルチ
コトロピン放出促進因子（ＣＲＦ）を抽出し、構造決定
した（サイエンス、第２１３巻、第１３９４頁、１９８
１年）。 このＣＲＦは４１個のアミノ酸残基からなるポリベプチ
ドで、ＡＣＴ日だけでなく８ーェンドルフインの放出も
促進することが明らかにされている。 ＣＲＦの生理的役割に関しては、まだその研究の端緒に
ついたばかりであり、不明な部分がほとんどではあるが
、その役割は極めて重要であると考えられ、これが解明
されるにつれて、ＣＲＦが診断薬としてはもちろん、医
薬としても重要性をもつてくることは十分期待できると
ころである。 ところで、ＣＲＦはＮ末端から教えて２１番目にメチオ
ニソ残基を有しているが、このメチオニンは比較的容易
に酸化し、メチオニンスルホキシドに変化するが、酸化
をうけたＣＲＦのＡＣＴ日放出促進活性はＣＲＦ自身の
約十分の一に低下することが知られており、その保存性
等に重大な問題がある。本発明者らは、このＣＲＦを安
定化させる技術を関発すべく鋭意研究を重ねた結果、２
１番目のメチオニン残基を／ルロィシン又はノルバリン
で置き換えた誘導体が、ＡＣＴ日放出促進活性を保ちな
がら、酸化に対して極めて安定になることを見出し、こ
の知見に基づいて本発明をなすに至った。 すなわち、本発明は、次の式で表わされる新規なポリプ
チドを提供するものである。 Ｈ−Ｓｅｒ−ＧＩｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ｌｉｅ
−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−１６ｕ−Ａ止ｇ−ＧＩｕ−Ｖａｌ一Ｌ
ｅｕ一Ｇ１ｕ一×一Ｔｈｒ一Ｌ＄−Ｎａ−ＡＳｐ−Ｇｉ
ｎ−Ｌｅｕ−ＡＩａ−Ｇｉｎ一ＧＩｕ−ＡＩａ一日ｉｓ
−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
ＡＳｐ−ｌｉｅ−ＡＩａ−ＮＨ２で示される新規なポリ
ベプチド ただし、式中のＸはＬーノルロィシン（Ｎ１ｅ）残基、
又はＬ−ノルバリン（Ｎｖａ）銭基を意味し、他の各記
号は以下のアミノ酸残基を意味する。 Ｍａ：Ｌ−アラニン Ａ

【ｇ：Ｌ−アルギニン 蛇ｐ；Ｌ−アスパラギン酸 ＡＳｎ：Ｌーアス／ぐラギン ＧＩｕ：Ｌーグルタミン酸 Ｇｉｎ：Ｌーグルタミン Ｈｉｓ：Ｌーヒスチジン ｎｅ：Ｌーイソロイシン Ｌｅｎ：Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ：Ｌーリジン Ｐｈｅ三 Ｌーフエニルアラニン Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン Ｓｅｒ：Ｌーセリン 丁ｈｒ：Ｌースレオニン Ｖａｌ：Ｌ−バリン 本発明のポリベプチド‘ま、ベプチド合成の際に用いら
れる常法に従い、アミノ基の保護されたＱーアミノ酸と
カルボキシル基の保護されたＱ−アミノ酸とを上記の構
造の順序に日頃次べプチド結合させることにより製造す
ることができる。 この際のべプチド結合形成は、活性ェステル法、混合酸
無水物法、アシド法「ＤＣＣなどの縮合剤を用いる方法
など公知の方法の中から適当に選択して行うことができ
るが、特に有利なのは合成樹脂をベースとした固相合成
法である。この方法によると、先ず反応性基をもつ合成
樹脂、例えばペンズヒドリルアミン樹脂にアミノ基を保
護したＬーアラニン誘導体を反応させても１−アラニル
基の結合した合成樹脂を製造し「次いでＬ−アラニル基
のＱ位のアミノ基の保護基を除去しＬ これにＱ−アミ
ノ基を保護したィソロィシン誘導体を反応させた。この
操作を繰り返しも４１個のＱ−アミノ酸を結合させ、所
望のポリベプチドを得ることができる。このようにして
得られた本発明のポリベプチド、〔Ｎ１ｅ２１〕一ＣＲ
Ｆ（Ｘ）および〔Ｎｖａ２１〕一ＣＲＦ（ロ）は、ラツ
トを用いた系において、ＣＲＦとほぼ同程度のＡＣＴ日
分泌促進活性、および血圧降下活性を示した。 また、ＣＲＦは５％過酸化水素水（ＩＭ酢酸溶液）中も
０℃「 ５分間で２１番目のメチオニンがほぼ完全に酸
化され失活するのに対し、ポリベプチド１及び川ま同条
件下で全く不変であった。次に実施例によって、本発明
をさらに詳細に説明する。 実施例中に示されている略号は以下の意味をもつ。ＣＲ
Ｆ：コルチコトロピン放出促進因子 Ｎａ三Ｌーアラニン単位 ルｇ：Ｌ−アルギニン単位 ＄ｐ：Ｌ−アスパラギン酸単位 松ｎ：Ｌ−アスパラギン単位 ＧＩｕ：Ｌーグルタミン酸単位 Ｇｉｎ：Ｌーグルタミン単位 Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン単位 ｎｅ；Ｌ−ィソロイシン単位 戊ｕ：Ｌーロィシン単位 Ｌｙｓ；Ｌ−リジン単位 Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン単位 Ｐｒｏ三Ｌ−プロリン単位 Ｓｅｒ；Ｌーセリン単位 Ｔｈｒ：Ｌースレオニン単位 Ｖａｌ：Ｌーバリン単位 Ｎ１ｅ客Ｌ−ノルロイシン単位 Ｎｖａ：Ｌーノルバリン単位 ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミドＴＦＡ：トリ
フルオロ酢酸 ＴＥＡ：トリエチルアミン ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ８Ｘ：ｔ−プトキシカルボニル基 Ｂｚｌ：ペンジル基 ＣＩ一Ｚ：○−クロロベンジルオキシカルボニル基Ｔｏ
ｓ：トシル基 ＯＮｐ：ｐ−ニトロフエニルエステル 実施例 風 節ｃ−ＡＩａ−樹脂の製造 ペンズヒドリルアミン樹脂塩酸塩７．００夕をクロロホ
ルム中にけんだくし、ＴＥＡで中和したのち、Ｂｏｃ−
ＡＩａ−ＯＨＩ．０９夕を３０のＺのジクロルメタンに
溶かしたものを加え、５分間放置後ＤＣＣＩ．１８夕の
ジクロルメタン溶液（３０の‘）を加えて１時間蝿拝し
た。 グラスフィルター上に樹脂を集め、メタノール「ジクロ
ルメタンで洗ったのち、Ｎ一アセチルイミタゾールのジ
クロルメタル溶液を加えて、末反応アミノ基をアセチル
化した。この樹脂をグラスフィルター上で、ジクロルメ
タン、メタノールを用いて洗浄し、真空乾燥して７．５
０夕の靴ｃ−Ｎａ−樹脂を得た。この樹脂のＮａ含量は
、樹脂１夕あたり０．４０ミリモルであった。【Ｂ’
＆ｃ‐Ｓｅｒ−（ＢＺＩ）−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ（ＢＺＩ）
‐Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ｌｉｅ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−ｍｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ
−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−仏ｕ‐Ｌｅｕ‐〜ｇ（Ｔｏｓ）‐
ＧＩｕ（Ｂｚｌ）‐Ｖａｌ−にｕ‐ＧＩｕ（Ｂｚｌ）‐
Ｎ１ｅ‐Ｔｈｒ（ＢＺＩ）−Ｌｙｓ（ＣＩ‐Ｚ）‐Ａｌ
ａ−偽ｐ（ＢＺＩ）−Ｇｉｎ‐じｕ‐ＡＩａ‐Ｇｉｎ−
Ｇｉｎ‐ＡＩａ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）
−Ａｓｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−Ｌ
ｅｕ−Ｕｕ−偽ｐ（ＢＺＩ）−ｌｉｅ−Ａｌａ一樹脂の
製造合成は固相合成法により、ベプチド自動合成装置を
用いて行った。 Ｑーアミノ基の保護基には、弦ｃを使い、アミノ酸側頭
の保護には次のようなものを用いた。Ａｓｐ、ＧＩｕ、
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｂｚｌ；〜ｇＨｉｓ；Ｔｏｓ；ＬｙＳ
；ＣＩ−Ｚ。各アミノ酸の縮合は第１表に示した工程に
従って行なった。アミノ酸誘導体及びＤＣＣは、樹脂に
ついて山ａの２．５倍当量を用い「それぞれ２又は３回
ずつ縮合を繰り返した。松ｎ、Ｇｉｎの導入には活性ェ
ステル法を用い、第２表の工程に従って行なった。Ｂに
−母ｎ‐ＯＮｐ及び歌ｃ−Ｇｉｎ−ＯＮｐはＡＩａに対
て８倍当量を用いた。全縮合工程を終ったのち、樹脂を
グラスフィルター上に集め、ＤＭＦトメタノール、ジク
ロルメタンの順に洗い、真空乾燥した。 この方法により、ＢＸ−ＡＩａ−樹脂２．６１夕から保
護べプチド樹脂６．４８夕が得られた。第１表 第２表 （Ｃ’ Ｈ−Ｓｅｒ−Ｇｉｎ一ＧＩｕ一Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−ｌｉｅ−Ｓｅｒ一Ｌ６ｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
Ｐｈｅ一日ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＧＩｕ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−ＧＩｕ−Ｎ１ｅ−Ｔｈｒ一Ｌ侭一ＡＩａ
一ＡＳｐ一Ｇｉｎ−Ｌｅｕ一ＡＩａ‐Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−
山ａ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａ【ｇ一Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ｎｅ−ＡＩａ−ＮＨ２（１）の製
造。 脚で製造した保護べプチド樹脂３．１４のこ、アニソー
ル６羽を加えて１晩放置したのち、反応容器をドライア
イスーヱタノールで冷やしながらＨＦ５０叫を加え、０
℃で１時間反応させた。 減圧下で、ＨＦおよびアニソ−ルを除き、残留物を酢酸
エチルおよびジェチルェーテルで十分洗った。これを淡
路酸２００の‘で抽出し、グラスフィルターで樹脂を櫨
別し「 に残った樹脂を１００の‘の水で洗浄した。櫨
液と洗液をあわせて凍結乾燥し「得られた微黄色粉末を
セフアデツクスＧ−２５によるゲル櫨過（溶出液：２Ｍ
酢酸）で精製し「最も高分子側のピークを集めた。これ
を更に、ヌクレオシルに，８力ラム（１０×２５０）を
使い、０．０９Ｍトリェチルアンモニウムホスフエート
ーアセトニトリル混合液を溶出液としたセミ分取高遠液
クロで精製し、最後に同上のカラムを用い、０．１％Ｔ
ＦＡーアセトニトリル混合液を用いて脱塩して目的の精
製べプチド７０の９を得た。印肌よる分析 条件：力ラム；ヌクレオシル皮，８（１０×２５０側）
溶出液：０．０８Ｍトリェテルアンモニウムホスフエー
ト、３９．５％アセトニトリル 検 出：ＵＶ２１仇机 溶出位置：１２．８分（クロマトグラムは第１図に示す
）磯塩酸による加水分解（２幼時間）後のアミノ酸組成
。 ＡＳｐ：４．１５【４）、Ｔｈｒ：１．８０｛２１、Ｓ
ｅｒ：２．７５【３｝、ＧＩｕ：７．３０‘７）、Ｐｒ
ｏ：１．８５■、山ａ；４．２０‘４｝、Ｖａｌ：０．
９５０１、ｎｅ：１．８７■、Ｌｅｕ：８．３２‘８｝
、Ｐｈｅ：１．００‘１｝、Ｈｉｓ：１．９３‘２｝、
Ｌｙｓ：１．９５【２１、ＡＪｇ：１．９０２１、Ｎ１
ｅ：０．９３１｝カツコ内の値は理論値Ｄ’ Ｈ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｉｎ−ＧＩｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ｌｉｅ−Ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ一日ｉｓ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡＪｇ−Ｇ】ｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇ
Ｉｕ−Ｎｖａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ＡＩａ−ＡＳｐ−Ｇｉ
ｎ−Ｌｅｕ−山ａ一Ｇｉｎ−Ｇｉｎ・−Ｎａ一日ｉｓ−
Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌ＄−Ｌｅｕ‐いｕ−偽ｐ−
ｎｅ−ＡＩａ−ＮＨ２（ロ）の製造。 ポリベプチド（１）の場合と同様の方法で合成し、精製
した。Ｂｏｃ−Ｎａ−樹脂３．５０夕から保護べプチド
樹脂８．８５夕が得られ、このうち３夕を精製して、６
５の２の目的ポリベプチド（０）が得られた。抑止‘こ
よる分析 条件：カラム：ヌクレオシルに，６（１０×２５０柳）
溶出液：０．０８Ｍトリェチルァンモニウムホスフエー
ト、３９．５％アセトントリル 検 出：ＵＶ２１仇肌 綾出位置：９．９分（クロマトグラムは第２図に示す）
鮒塩酸による加水分解（２幼時間）後のアミノ酸組成。 ＡＳｐ：４．０８‘４１、Ｔｈｒ：１．７５‘２１、Ｓ
ｅｒ：２．７３｛３’、ＧＩｕ：７．１３｛７｝、Ｐｒ
ｏ：１．９７■、Ｎａ：４．３０■、Ｖａｌ：０．９９
‘１１、ｌｉｅ：２．０３‘２｝、Ｌｅｕ：８．２５脚
、Ｐｈｅ：１．０００’、Ｈｉｓ：１．９２脚、Ｌｙｓ
：２．０２ｔ２）、Ａ止ｇ：１．９○２１、Ｎｖａ：○
‐９８１）

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の化合物１のクロマトグラム、第２図
は、本発明の化合物０のクロマトグラムを示す。 第１図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 Ｈ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ
   −Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−
   Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇ
   ｌｕ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−
   Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｓ
   ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓ
   ｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＮＨ＿２で示される新規なポリペ
   プチド。 ただし、式中のＸはＬ−ノルロイシン残基、またはＬ−
   ノルバリン残基を意味し、他の各記号は以下のアミノ酸
   残基を意味する。 Ａｌａ：Ｌ−アラニン Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン ｌｕ：Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン Ｌｅｎ：Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ：Ｌ−リジン Ｐｈｅ：Ｌ−フエニルアラニン Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン Ｓｅｒ：Ｌ−セリン Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン Ｖａｌ：Ｌ−バリン。