KR970707283A - 아스퍼질러스에서 융합 단백질로부터 프로세스된 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편의 발현 방법(expression of processes recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptide fragments from a fusion product in aspergillus) - Google Patents

아스퍼질러스에서 융합 단백질로부터 프로세스된 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편의 발현 방법(expression of processes recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptide fragments from a fusion product in aspergillus)

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KR970707283A KR1019970702908A KR19970702908A KR970707283A KR 970707283 A KR970707283 A KR 970707283A KR 1019970702908 A KR1019970702908 A KR 1019970702908A KR 19970702908 A KR19970702908 A KR 19970702908A KR 970707283 A KR970707283 A KR 970707283A
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데니스 헤돈
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Abstract

본 발명은 숙주 세포 아스퍼질러스(Apergillus)와 신규 플라스미드 구조를 이용하여 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편 생산을 제공한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 아스퍼질러스 숙주 세포에서 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산할 수 있는 신규 벡터를 제공한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 아스퍼질러스, 특히 아스퍼질러스 아와모리(awamori), 나이져(niger) 그리고 오리자(oryzae) 숙주세포에 이용하는데 적합한 신규 폴라스미드를 제공한다. 이는 재조합 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편을 생산하는 것을 특징으로 한다.

Description

아스퍼질러스에서 융합 단백질로부터 프로세스된 락토페린과 락토페린 폴리펩티드 단편의 발현 방법(EXPRESSION OF PROCESSES RECOMBINANT LACTOFERRIN AND LACTOFERRIN POLYPEPTIDE FRAGMENTS FROM A FUSION PRODUCT IN ASPERGILLUS)
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도에서는 ˝pPLF-19 ˝로 지정한 아스퍼질러스 아와모리에서 발현할 수 있는 hLF cDNA를 포함하는 플라스미드 벡터의 구조를 나타낸다, 제2도에서는 pPLF-19를 포함하는 아스퍼질러스 아와모리의 생장 배지로부터 정제한 재조합 hLF(500ng)의 SDS-PAGE이다, 제3도에서는 pPLF-19를 포함하는 아스퍼질러스 아와모리 형질도입체의 성장 배지로부터 정제한 글리코실화된(1㎍)그리고 탈-글리코실화된 재조합 hLF(1μ㎤) 그리고 탈-글리코실화된 재조합 hLF(1㎍)의 웨스턴 블랏이다, 제5도에서는 표준과 재조합 hLF연구에서 철 결합과 포화 결과를 나타낸 것이다, 제7도는 대장균 0111에 대한 천연과 재조합 hLF의 항균작용을 나타낸 것이다.

Claims (58)

  1. 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터에 있어서, 다음의 성분들이 5′에서 3′ 방향으로 연결되는데, a) 프로모터; b) 시그날 서열; c) 아스퍼질러스 세포로 부터 분비되는 5 부분에서 발현된 내생 유전자 생성물; d) 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성되며 이때 벡터는 융합 단백질로써 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드단편을 인코드하고 프로세스된 단백질로써 발현되는 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터는 알코올 디하이드로게나제, α-아밀라제, 글로코아밀라제와, ben A에서 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 프로모터는 글로코아밀라제 유전자로부터 기인된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 글루코아밀라제 유전자는 A. 아와모리(A. awamori) 또는 A. 나이져(niger)에서 기인된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  5. 제2항에 있어서, 프로모터는 α-아밀라제 유전자로 부터 기인된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  6. 제5항에 있어서, α-아밀라제 유전자는 A. 오리자(oryzae)에서 기인된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미트 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 시그날 서열은 글루코아밀라제와 α-아밀라제에서 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 시그날 서열은 A. 아와모리(A. awamori) 또는 A. 나이져(Niger) 글루코아밀라아제 유전자에서 기인된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 시그날 서열은 A. 오리자(oryzae) α-아말라제 유전자로부터 기인된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 바로 발현된 내성 유전자는 α-아밀라제 유전자와 글루코아밀라제 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 발현된 내성 유전자는 A. 오리자(oryzae) α-아밀라제 유전자인 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 발현된 내성 유전자는 A. 아와모리(A. awamori) 또는 A. 나이져(niger) 글루코 아밀라아제 유전자인 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  13. 제1항에 있어서, 링커서열은 펩티다제 절단부위인 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 링커서열은 Kex2 펩티다제 절단부위를 인코드하는 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  15. 제1항에 있어서, 전사 종료 서열과 선택성 표식이 추가로 구성된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 전사 종료 서열은 α-아밀아제, 글로코아밀라제, 알코올디하이드로게나제와 ben A에서 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 전사종료 서열은 A. 나이져(niger) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  18. 제15항에 있어서, 선택성 표식은 pyr4, pyrG. amdS, argB, trpC와 플레오마이신 저항성 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 선택성 표식은 플레오마이신 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  20. 제1항에 있어서, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 사람, 소 또는 돼지로부터 유도된 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  21. 제1항에 따른 벡터가 아스퍼질러스 곰팡이 세포의 형질전환에 사용될 때 생성된 것을 특징으로 하는 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편.
  22. 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터에 있어서, 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.아와모리 글루코아밀라아제 유전자로 부터 기인된 프로모터; b) A. 아와모리 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 시그날 서열; c) A. 아와모리 글리코아밀라아제 유전자의 5 부분 d) 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해 효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 f) 플레오마이신 저항성 표식인자로 구성되며, 이때 벡터는 융합단백질로써 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 인코드하고 프로세스된 단백질로써 발현되는 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  23. 제22항에 따른 벡터가 아스퍼질러스 곰팡이 세포의 형질 전환에 사용될 때 생성된 것을 특징으로 하는 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편.
  24. 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터에 있어서, 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자로 부터 기인된 프로모터; b) A. 나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 시그날 서열; c) A. 나이져 글리코아밀라아제 유전자의 5′부분 d) Kex2 펩티디아제 절단부위를 인코드하는 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해 효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 f) A. 나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 전사 종료서열; g)플레오마이신 저항성 선택 표식 유전자로 구성되며, 이때 벡터는 융합 단백질로써 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하고 프로세스된 단백질로써 발현되는 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  25. 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터에 있어서, 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.오리자 글루코아밀라아제 유전자로 부터 기인된 프로모터; b) A. 오리자 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 시그날 서열; c) A. 오리자 α-아밀라아제 유전자의 5′부분 d) Kex2 펩티디아제 절단부위를 인코드하는 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 f) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 전사 종료서열; g) 플레오마이신 저항성 선택 표식 유전자로 구성되며, 이때 벡터는 융합 단백질로써 락토페린 또는락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하고 프로세스된 단백질로써 발현되는 것을 특징으로 하는 신규한 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  26. 제25항에 따른 벡터가 아스퍼질러스 곰팡이 세포의 형질전환에 사용될 때 생성된 것을 특징으로 하는 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편.
  27. 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변환된 아스퍼질러스 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 공정에 있어서, 이때 플라스미드는 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) 프로모터; b) 시그날 서열; c) 아스퍼질러스 세포로부터 분비되는 5′부분에서 발현된 내성 유전자 생성물; d) 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해 효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성되며 이때 형질변환된 아스퍼질러스 곰팡이 세포는 적절한 배지에 배양하여, 락토페린 또는락토페린 폴리펩티드 단편은 융합 단백질로 생산되고 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱되고 이때 프로세싱된 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 영양배지로 분리되고 여기에서 회수되는 것을 특징으로 하는 공정.
  28. 제27항에 있어서, 플라스미드에는 전사 종료서얼과 선택성 표식 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 공정.
  29. 제27항에 있어서, 프로모터는 알코올 디하이드로게나제, α-아밀아제, 글루코아밀라제와 ben A에서 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 공정.
  30. 제29항에 있어서, 프로모터는 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 것을 특징으로 하는 공정.
  31. 제30항에 있어서, 글루코아밀라제 유전자는 A. 아와모리(A. awamori) 또는A. 나이져(niger)에서 기인된 것을 특징으로 하는 공정.
  32. 제29하에 있어서, 프로모터는 α-아밀라제 유전자로부터 기인된 것을 특징으로 하는 공정.
  33. 제32항에 있어서, α-아밀라제 유전자는 유전자는 A.오리자(oryzae)에서 기인된 것을 특징으로 하는 공정.
  34. 제27항에 있어서, 시그날 서열은 글로코아밀라제와 α-아미라아제에서 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 공정.
  35. 제34항에 있어서, 시그날 서열은 A. 아와모리(A. awamori)글로코아밀라제 유전자에서 기인된 것을 특징으로 하는 공정.
  36. 제34항에 있어서, 시그날 서열은 A. 오리자(oryzae) α-아밀라제 유전자로부터 기인된 것을 특징으로 하는 공정.
  37. 제27항에 있어서, 바로 발현된 내성 유전자는 α-아밀라제 유전자와 글루코아밀라제 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
  38. 제37항에 있어서, 발현된 내성 유전자는 A. 오리자(oryzae) α-아밀라제 유전자인 것을 특징을 하는 공정.
  39. 제10항에 있어서, 발현된 내성 유전자는 A. 아와모리(A. awamori)글루코아밀라제 유전자인 것을 특징으로 하는 공정.
  40. 제27항에 있어서, 링커 서열은 펩티다제 절단부위인 것을 특징으로 하는 공정.
  41. 제40항에 있어서, 링커서열은 Kex2 펩티다제 절단부위를 인코드 하는 것을 특징으로 하는 공정.
  42. 제28항에 있어서, 전사 종료 서열은 α-아밀라제, 글루코아밀라제, 알코올디하이드로게나제의 ben A에서 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는 공정.
  43. 제42항에 있어서, 전사종료 서열은 A. 나이져(niger) 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 것을 특징으로 하는 공정.
  44. 제28항에 있어서, 선택성 표식은 pyr4, pyrG. amdS, argB, trpC와 플레오마이신 저항성 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
  45. 제44항에 있어서, 선택성 표식은 플레오마이신 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 공정.
  46. 제27항에 따른, 공정에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 락토페린 단백질 또는 락토페린 폴립펩티드 단편.
  47. 제46항에 있어서, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 사람, 소 또는 돼지로부터 유도된 것을 특징으로 하는 락토페린 단백질.
  48. 제47항에 있어서, 락토페린 단백질은 탈글리코실화된 것을 특징으로 하는 락토페린 단백질.
  49. 제47항에 있어서, 사람 락토페린 생성물은 탈글리코실화된 것을 특징으로 하는 락토페린 단백질.
  50. 제27항에 있어서, 아스퍼질러스 곰팡이 세포는 락토페린을 발현하는 것을 특징으로 하는 공정.
  51. 제조합 발현 플라스미드 벡터에 있어서, 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.아와모리 글루코아밀라제 유전자로부터 기인한 프로모터; b) A.아와모리 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인한 시그날 서열; c) A.아와모리 글루코아밀라아제 유전자의 5′부분 d) Kex2 펩티다아제 절단부위를 인코드하는 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열; f) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인한 전사종료 서열; 그리고 g) 플레오마이신 저항성 선택 표식인자로 구성되며 이때 플라스미드는 아스퍼질러스 곰팡이 세포에서 사람 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 발현하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 플라스미드 벡터.
  52. 제51항에 있어서, ATCC 기탁번호 74290, Awa LF 24-1으로 정의되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  53. 제51항에 따른, 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포.
  54. 제조합 플라스미드를 포함하는 형질 변화된 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이를 배양하여 락토레핀을 생산하는 공정에 있어서, 이때 플라스미드는 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.아와모리 글루코아밀라제 유전자로부터 기인한 프로모터; b) A.아와모리 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 시그날 서열; c) A.아와모리 글루코아밀라아제 유전자의 5′부분 d) Kex2 펩티다아제 절단부위를 인코드하는 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열; f) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인한 전사종료 서열; 그리고 g) 플레오마이신 저항성 선택 표식인자로 구성되며, 이때 형질 변환된 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포는 적절한 배지에 배양하여, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 융합 단백질로 생산되고 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱 되고 이때 프로세싱된 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 영양배지로 분비되고 여기에서 회수되는 것을 특징으로 하는 공정.
  55. 제조합 플라스미드를 포함하는 형질 변화된 아스퍼질러스 오리자 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 공정에 있어서, 이때 플라스미드는 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.오리자 글루코밀라제 유전자로부터 기인된 프로모터; b) A.오리자 α-아밀라아제 유전자로부터 기인된 시그날 서열; ) A.오리자 α-아밀라아제 유전자의 5′부분 d) Kex2 펩티다아제 절단부위를 인코드하는 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 클레오티드 서열로 f) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인한 전사 종료인자; 그리고 g) 플레오마이신 저항성 선택 표식인자로 구성되며 이때 형질 변환된 아스퍼질러스 오리자 곰팡이 세포는 적절한 배지에 배양하여, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 융합 단백질로 생산되고 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱 되고 이때 프로세싱된 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 영양배지로 비되고 여기에서 회수되는 것을 특징으로 하는 공정.
  56. 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변화된 아스퍼질러스 오리자 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 공정에 의해 생산된 락토페린 단백질 또는 락토페린 폴리펩티드 단편에 있어서, 이때 플라스미드는 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.오리자 α-아밀라제 유전자로부터 기인한 프로모터; b) A.오리자 α-아밀라아제 유전자로부터 기인한 시그날 서열; c) A.오리자 α-아밀라아제 유전자의 5′부분 d) Kex2 펩티다아제 절단부위를 인코드하는 링커서열, 이때 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열; f) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인한 전사 종료인자; 그리고 g) 플레오마이신 저항성 선택 표식인자로 구성되며, 이때 형질 변환된 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포는 적절한 배지에 배양하여, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 융합 단백질로 생산되고 링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱 되고 이때 프로세싱된 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 영양배지로 분비되고 여기에서 회수되는 것을 특징으로 하는 공정.
  57. 재조합 플라스미드 벡터를 포함하는 형질 변화된 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포를 배양하는 것으로 구성된 곰팡이 영양배지로부터 락토페린 폴리펩티드 단편을 분리하는 방법에 있어서, 플라스미드 벡터는 A.아와모리글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 프로모터, A. 아와모리 글루코아밀라아제로 부터 기인된 시그날 서열, A. 아와모리 글루코아밀라아제의 5′부분, Kex2 펩티다아제 절단부위를 코팅하는 링커서열로 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해효소가 있고, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로, A. 나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 전사 종료 서열, 플레오마이신 선택성 표식을 포함하고 이때, 형질도입된 아스퍼질러스 아와모리 곰팡이 세포는 적절한 영양 배지에 배양되고 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편이 융합 단백질로 생산되고, 링커서열에 특이적인 내성 단백질로 생산되고, 링커서열에 특이적인 내성 단백질 효소에 의해 프로세싱되고, 이때프로세싱된 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편인 영양배지로 분비되고 이로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 변화된 아스퍼질러스 나이져 곰팡이를 배양하여 락토페린을 생산하는 공정에 있어서, 이때 플라스미드는 다음의 성분들이 5′에서 3′방향으로 연결되는데, a) A.나이져 글루코아밀라제 유전자로부터 기인한 프로모터; b) A.나이져 글루코아밀라제 유전자로부터 기인된 시그날 서열; c) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자의 5′부분 d) Kex2 펩티다아제 절단부위를 인코드하는 링커서열, 이때링커서열에 특이적인 내성 단백질 분해효소가 있고; e) 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 f) A.나이져 글루코아밀라아제 유전자로부터 기인된 전사 종료인자; 그리고 g) 플레오마이신 저항성 선택 표식인자로 구성되며 이때, 형질 변환된 아스퍼질러스 나이져 곰팡이 세포는 적절한 배지에 배양하여, 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 융합 단백질로 생산되고 링커서열에 특이적인 내생 단백질 분해 효소에 의해 프로세싱 되고 이때 프로세싱된 락토페린 또는 락토페린 폴리펩티드 단편은 영양배지로 분비되고 여기에서 회수되는 것을 특징으로 하는 공정.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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