FR2727129A1 - Systeme de criblage permettant de selectionner des molecules ayant une activite specifiquement dirigee contre une cible biochimique determinee - Google Patents

Abstract

1. Système de criblage permettant de sélectionner des molécules ayant une activité spécifiquement dirigée contre une cible biochimique déterminée. 2. Il comprend au moins deux microorganismes distincts, identiques du point de vue génétique à l'exception de l'activité cible ou d'un homologue de cette activité: . le premier pour tester l'expression de l'activité cible capable de complémenter un microorganisme ne présentant plus d'activité homologue endogène et permettre ainsi sa croissance, . le second pour tester l'expression d'une activité homologue à l'activité cible provenant d'un organisme quelconque et capable de complémenter le même microorganisme ne présentant plus d'activité homologue endogène et permettre ainsi sa croissance.

Description

Système de criblage permettant de sélectionner des molécules ayant une activité
spécifiquement dirigée contre une cible biochimique détenninée
La présente invention a pour objet un système de criblage permettant de sélectionner des molêctees ayant une activité spécifiquement dirigée contre une cible biochimie déterminée.

La nécessité d'obtenir des produits phytosanitaires à mode d'action parfaitement caractérisé rend de plus en plus indispensable l'utilisation de tests de criblages permettant de sélectionner les molécules issues de la synthèse sur la base d'un critère d'activité spécifique vis à vis d'une cible biochimique déterminée. De tels tests doivent de plus arc adaptable à un criblage d'un très grand nombre de produits. Une des conditions serait d'automatisa l'utilisation de tels tests et par conséquent les paramètres mesurables du test doivent arc simples à observer.

L'oïdium des céréales (Erysiphe graminis), des arbres fruitiers et de la vigne représente une maladie causant la destruction d'une part appréciable des récoltes. Cette maladie est contrôlée par différents produits à activité fongicide et, en particulier, de la famille des triazoles. La nécessité de produits alternatifs est évidente. Cependant, les moyens de criblage sur oidium sont compliqués par la nature de parasite obligatoire de ce champignon. En effet, sa croissance est impossible en dehors de la présence de la plante hôte, ce qui exclue toute possibilité de test de criblage sur boîtes de Pétri et nécessite un criblage en serre relativement lourd à mettre en oeuvre.

La présente invention a pour but de répondre à ce besoin en proposant un système de criblage spécifique in vitro et adaptable au criblage d'un très grand nombre de produits. Elle concerne plus particulièrement un système de criblage permettant de sêlectionner des molécules ayant une activité spécifiquement dirigée contre une cible biochimique déterminée, comprenant au moins deux microorganismes distincts, identiques du point de vne génétique à l'exception de l'activité cible ou d'un homologue de cette activité:: . le premier pour tester rexpression de ractivité cible capable de complémenter un
microorganisme ne présentant plus d'activité homologue endogène et permettre ainsi sa
croissance, le second pour tester l'expression d'une activité homologue à l'activité cible provenant
d'un organisme quelconque et capable de complémenter le même microorganisme ne
présentant plus d'activité homologue endogène et permettre ainsi sa croissance.

De préférence le système comprend 2 ou 3 microorganismes distincts.

Ces microorganismes peuvent être soit eukaryotes, soit prokaryotes.

Les microorganismes complémentés sont nouveaux et font également partie dc l'invention. lls sont caraciis6s en ce qu'ils ne présentent plus, par mutation, d'activit homologue de l'activité d'une cible déterminée et qu'il sont complémentés par expression de l'activité cible ou d'une activité homologue.

Les microorganismes sont rigoureusement identiques d'un point de vue génétique à l'exception de rexpression de l'activité cible ou d'un homologue de cette activité. L'inhibition différentielle potentielle de leur croissance ne peut résulter que de l'inhibition de l'activité qui les différencie. Une inhibition de la croissance des deux résulterait, soit de l'inhibition d'une activité commune, soit de l'inhibition par un même produit de l'activité qui les différencie.

Par conséquent, l'observation de la croissance de ces deux types de microorganismes peenet de cribler des molécules ayant une activité inhibitrice spécifique de la cible biochimique donnée.

Toute cible biochimique peut être utilisée afin de réaliser le système de criblage qui fait l'objet de la présente invention, qu'elle soit d'origine végétale, fongique, bactérienne, animale ou humaine. Cependant, afin de permettre une observation simple basée sur le cntàe de croissance, il est préféré que l'inhibition de l'activité de la cible biochimique soit létale pour la croissance du microorganisme, au moins dans un milieu de culture déerminé.

Par activité cible, on entend l'activité enzymatique présente dans l'organisme dont on veut assurer le contrôle par la découverte de produits.

Par activité homologue à l'activité cible, on entend ractivité enzymatique identique à celle contenue dans l'organisme cible, mais présente dans un autre organisme.

Par complémentation, on entend la capacité d'une activité enzymatique hétérologue, c'est à dire provenant d'une source différente de celle de l'organisme hôte utilisé pour l'exprimer, à permettre la restauration d'un comportement analogue ou très poche du comportement de l'organisme sauvage, c'est à dire non modifié, à un organisme hôte modifié, dont le comportement, par rapport à un type Sauvage, est altéré par absence de cette activit.

L'acétylcoenzyme A carboxylase (ACoACase ou ACCase; EC 6.4.1.2) catalyse la carboxylation ATP-dépendante de l'acétyl-CoA pour produire du malonyl-CoA. Le malonyl
CoA produit par l'ACoACase est utilisé dans diverses réactions et voies métaboliques: en particulier elle représente l'étape limitante de la voie de biosynthèse des acides gras Qlcz les organismes de type eukaryote, les trois activités composant l'activité ACoACase (biotiz carboxyl carrier protein, biotin carboxylase et carboxyltransferase) sont portes par un seul polypeptide multifonctionnel. La séquence codant pour les gènes ou ADNc de plusieurs
ACoACase est connue et a été publiée. La taille de l'ADNc complet est de l'ordre de 7 kbp pour la partie codante. Cependant, à l'exception du gène codant pour l'ACoACase de levage (accl), aucune des séquences publiées ne correspond à un équivalent complet d'un ADNc codant pour l'ACoACase. Cest à dire que la séquence a été obtenue à partir de clone d'ADNc incomplets et chevauchant, mais la reconstitution ou obtention d'un ADNc complet et fonctionnel, car permettant la synthèse d'un polypeptide actif, n'a jamais été rapport. ll a été montré que l'inactivation par disruption génique du gène codant pour l'ACoACase de la levure Saccharomyces cerevisiae était létale à l'état haploide. n est de plus bien connu que certaines isoformes de l'enzyme de plantes monocotylédones sont inhibées par des produits herbicides de la famille des aryloxyphenoxypropionates et des cyclohexanediones et que cette inhibition conduit à la destruction des plantes sensibles, confirmant ainsi le caractère létal de l'inactivation de l'ACoACase sensible à ces produits. L'invention a également pour objet la séquence du gène codant pour l'ACoACase d'Erysiphe graminis, qui est nouvelle.

L'invention a également pour objet un procédé pour cribler des molécules protectrices des plantes qui consiste à préparer les microorganismes tels que décrits ci-dessus
La mise en oeuvre du sytème de criblage tel que décrit dans la présente invention pour la sélection de molécules présentant une activité spécifique d'inhibition vis à vis d'une cible biochimique déterminée, et particulièrement de rACoACase d'oïdium, est réalisée de la façon suivante. Un ou l'autre des microorganismes mutants, Neurospora ou levure, décrits dans les exemples développés ci-dessous, est complémenté avec les ACoACases provenant de différentes sources: rat, oïdium par exemple.On obtient donc un microorganisme exprimant un type d'ACoACase et l'autre microorganisme exprimant l'autre type d'ACoACase. Ces deux microorganismes sont strictement identiques par ailleurs. Les deux microorganimes son mis en présence du produit à tester et on observe l'inhibition éventuelle de la croissance, par exemple en culture dans un dispositif de microplaques. Si une inhibition de la croissance du microorganisme exprimant l'activité ACoACase d'oïdium est observée en même temps qu'une absence d'inhibition de croissance du microorganisme exprimant l'activité ACoACase, par exemple de rat, on peut alors conclure que ce produit a une action spécifique sur l'ACoACase d'oïdium.Une observation de ce type correspond bien au résultat attendu de la mise en oeuvre du système de criblage tel que décrit dans la présente invention.

Deux exemples sont pressentes afin de donner un aperçu du champ d'application de la présente invention. Ces exemples ne sont pas restrictifs et n'épuisent videmment pas toasts les possibilités d'utilisation d'un tel système de criblage par un homme de nattier.

Seules les techniques non généralement accessibles ou peu répandues en utilisation de routine, comme par exemple la transformation de Neurospora crassa ou les techniques de mutagnèses spécifiques à ce champignon, ont t6 décrites de façon exhaustive. En ce qui concerne les techniques d'extraction, de manipulations enzymatiques, d'observation visuelle ou après marquage radioactif des acides nucléïques, elles sont décrites dans la plupart des manuels de référence. Les modifications enregistrées entre les différentes versions n'ont pas de conséquences qualitatives sur le résultat attendu De même en ce qui concerne l'utilisation de la levure Saccharomyces cerevisiae et, en particulier, les techniques de recombinaison homologue de l'ADN pour l'obtention de mutants.L'homme de l'art peut donc avec ttitfice choisir une ou un mélange de ces différentes méthodes. Les deux manuels de référence que nous avons utilisés pour les expériences décrites cilessous sont tout à fait généralement accessibles: o Current Protocols in Molecular Biology, 2 volumes (1994) Ausubel F.M., Brent R,
Kingston RE., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl IL editars, John Wiley
and Sons,Inc. Ce manuel de référence sera cité par la suite comme "CPMB".

o Molecular cloning: a laboratory manual, 3 volumes (1989) Sambrook J., Fritsch E.F. and
Maniatis T. editors, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ce manuel de référence sera
cid par la suite comme "Maniatis".

Exemple
Dans ce premier exemple, une souche de levure diploïde disruptét dans une des copies du gène accl, c'est à dire dont le gène accl a été spécifiquement inactivé, a été complémentée par l'expression d'un ADNc d'ACoACase de rat. La sporulation des levures transformées a permis d'obtenir des levures haploïdes disruptées gardant leur capacité dc croissance par expression de l'activité ACoACase de rat.

1) Obtention d'une souche de levure Saccharomvces cerevisiae diploïde présentant une copie disruptée du gène acci
La souche de levure Saccharomyces cerevisiae YPH 501 utilisée pour ce travail a été obtenue auprès du fournisseur Stratagene, n catalogue: 2174415. Cette souche présente le génotype suivant: mat ala, ura3-52, lys2-801amber, ade2-101ochre, trpl-D63, his3-D200, leu2-Dl.

a- obtention du fragment disruptant
L'ADN de la souche YPH 501 a été extrait suivant le protocole décrit dans le "CPMB". Cent ng d'ADN génomique ont été utilisés pour amplifier un fragment dc l'ACoACase de levure dont la séquence est décrite dans: Al-Feel W., Chirala S.S. and Wakil
S.J. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 89, 4534-4538. Cent cinquante ng de chacun des deux oligonucléotides suivants ont été utilisés sous un volume final de 50 ml, la position nucléotidique correspondant à la première base 5' par rapport à la séquence publiée est indiquée entre parenthèse à côté de l'extrémité 5': oligol: 5'(4800)-GACGAATTCTTCAATAAGG-3' (site EcoRI souligne) oligo2: 5'(6188)-GATAATTGAGATCTCAATTC-3' (site BglII souligne)
Les conditions de la PCR sont celles décrites par le fournisseur Perkin-Elmer avec un appareil de type 9600. Les conditions de cycles utilisées sont 5min./95 C-35x(30sec./95 C- 30sec./50 C-lmin.30sec./72 C)-5min./72 C. La taille du fragment amplifié est de environ 1,4 kpb.

Le fragment amplifié a été cloné par ligation dans un vecteur de clonage de produits
PCR construit de la façon suivante. L'ADN du plasmide pBSIISK- est digéré par l'enzyme de restriction EcoRV, puis traité par l'enzyme terminal transférase cn présence de dideoxythymidine, dans les conditions décrites par le fournisseur (Boehringer). L'ADN du plasmide recombinant résultant de la ligation du produit PCR avec le vecteur préparé selon les conditions ci-dessus a été préparé en quantité puis digéré par les enzymes de restriction
MscI et EcoRV qui coupent toutes deux uniquement dans l'insert et éliminent un fragment de 0,7 kpb. Le fragment de haut poids moléculaire obtenu est séparé du fragment de 0,7 kpb par électrophorèse et purifié à partir du gel.Ce grand fragment est mis à liguer avec un fragment à extrémités franches de 1,1 kpb contenant le gène ura3. Ce fragment provient de la digestion par les enzymes de restrictions EcoRI et Hindi du plasmide pYEUra3 commercialit par Clontech sous la référence 6195-1, suivi d'un remplissage des extrémités cohésives par la polymérase de Klenow, puis d'une purification du fragment de 1,1 kpb contenant le gène ura3 après électrophorèse en gel d'agarose. Un des plasmides obtenus obtenus a Cd ét en masse, puis digéré par les enzymes de restrictions EcoRI et BglIL Le fragment de environ 1,8 kpb a été purifié après électrophorèse en gel d'agarose.Ce fragment linéaire contint: environ 0,35 kpb du site EcoRI au début du gène ura3 inséré, 1,1 kpb correspondant à l'insertion du gène ura3, environ 0,35 kpb de la fin du gène ura3 inséré au site BglIL Ce fragment linéaire sera utilisé par la suite pour obtenir la disruption du gène accl dans la levure. ll sera nommé par la suite : le fragment disruptant.

b disruption de YPH501
Le protocole suivi est décrit dans le "CPMB". Un mg du fragment disruptant est électroporé dans les levures YPH501 électrocompétentes avec un BioRad pulser dans une cuvette de 0,2cm d'épaisseur, 200Ohms, 25 farads et 1500volts. Les levures sont étalées sur un milieu minimum (Yeast nitrogen base) contenant tous les acides aminés et bases pour lesquels la souche est auxotrophe (leucine, histidine, lysine, adenine, tryptophane) à l'exception de l'uracile. Ce milieu contient 1M sorbitol comme osmoprotectant.Après 3 jours de croissance à 28 C, les colonies sont repiquées sur le même milieu sans sorbitoL Après 2 à 3 jours de croissance à 28 C, quelques colonies sont ensemencées dans 10 ml du même milieu liquide et misent à pousser pour deux à trois jours, à 28 C et à 250 rpm sur une table agitante.

L'ADN chromosomique de ces colonies est extraits suivant le protocole décrit dans le "CPMB". Environ 1 mg d'ADN est digéré par les enzymes de restrictions EcoRI et BglII et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN est ensuite transféré sur une membrane
Nytran (Scleicher et Schüll) en suivant les instructions du fournisseur. Cette membrane est hybridée à 65 C dans une solution contenant 0,25% lait écrémé; 6xSSC; 0,1% SDS avec le fragment amplifié de 1,4 kpb rendu radioactif par "random-priming" . La membrane est rince à 65 C dans une solution de 0,5xSSC; 0,1% SDS, puis mise en fluorographie à -700C avec un film RPXOmat et un écran renforçateur QuantaIII.Après environ 4 heures de fluorographie, les clones disruptée dans une copie du gène accl présentent un profil d'hybridation de 2 bandes. Une bande à 1,4 kpb correspondant à l'hybridation du fragment
EcoRI/BglII dde la copie sauvage du gène accl et une bande à 1,8 kpb correspondant au fragment EcoRVBglII ayant été délété du fragment MscVEcoRV et ayant intégré à la place il gène ura3. La même hybridation réalisée sur de 1'ADN extrait de la souche YPH 501 non transformée ne permet d'observer que la bande à 1,4 kpb.

Un des clones de levures présentant le profil ci-dessus a été mis en croissance dans le milieu de sporulation dans les conditions décrites dans le "CPMB". La dissection des spores t été réalisée avec un micromanipulateur de Fombrun. Les spores ont été misent à germer sur un milieu complet de levure YPD supplémenté par différents acides gras: acide mytini, acide oléique, acide stéarique et acide palmitique, chacun à 0,01%, dans 1% du détergent Brij58. Dans ces conditions, seules deux spores sont viables pour chaque asque contenant 4 spores. Les deux spores viables étant haploïdes et auxotrophes pour l'uracile.Cette expérience permet de confirmer que la disruption du gène accl est létale à l'état haploïde, répétant ainsi les travaux décrits par: Hasslacher M., Ivessa A.S., Paltauf F. and Kohlwein
S.D. (1993) J.Biol.Chem., 268, 10946-10952. Cette souche diploïde YPH 501 présentant une copie disruptée du gène accl a été nommée YPH 501 Daccl, et sera utilisé par la suite comme souche récipiendaire pour la complémentaion par les différentes activités ACoACase testées.

2) Obtention d'un clone d'ADNc complet de l'ACoACase de raL
Les différentes expériences ont été réalisées à partir de la séquence de l'ACoACase de rat de 7038 pb a été publiée par: Lopez-Cazillas F., Bai D-H., Luo X., Kong I-S., Hermodson
M.A. and Kim K-H. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 57845788. Trois couples d'oligonucléotides ont été synthétisés pour permettre l'amplification par PCR de l'ensemble des fragments constituant l'ADNc complet de l'ACoACase de rat à partir d'ADNc simple brin de foie de rat disponible commercialement chez clontech sous la référence: 7151-1. Les couples d'oligonucléotides ont été choisis de façon à permettre un remontage facilitt de l'ADNc complet car présentant des sites de restrictions uniques.

La séquence des 3 couples d'oligonucléotides utilisés est la suivante, la position nucléotidique correspondant à la première base 5' par rapport à la séquence publiée est indi entre parenthèse à côté de l'extrémité 5': 1: 5'(1)-ACGTCTCGAGATGGATGAACCATCTCCGTTG-3' (le site XhoI, rajouté sur l'oligonucléotide et absent de la séquence de l'ACoACase de rat, est souligné.La sequence publiée commence au A juste derriére le site XhoI souligne) 1':5'(2721)-GCCAGAGACACTGGTCATG-3' 2:5'(2515)-CAGAGCACAGCTCTCCGAG-3' 2':5'(4740)-GTCTTTGGTCACATACGGAG-3' 3:5'(4518)-GGTCCTCCAGGCAGAACTG-3' 3':5'(7038)-CTACGTAGAAGGGGAGTCC-3'
Les conditions utilisées pour l'amplification PCR étaient 5 ml de Quick-clone cDNA de foie de rat de Clontech, 300ng de chacun des oligos des couples sous un volume de 100ml dans les conditions données par le fournisseur de la Taq DNA polymérase: Perkin-Elmer. Les conditions de cycles sur l'appareil Perkin-Elmer 9600 étaient: 5min/95 C-50x(30sec/95 C- 30sec/55 C-3min72 C)-5min/72 C.

Les produits d'amplification ont été clonus dans un vecteur pBSIISK- selon les mêmes modalités que celles décrites ci-dessus pour le clonage du fragment disruptant Sauf pour l'insert résultant de l'amplification par les oligonucléotides 1/1' qui a préalablement été digéré par XhoI et XbaI puis ligaturé avec le plasmide pBSIISK- digéré par les mêmes enzymes.

Trois fragments clonés ont ainsi été obtenus correspondant à:
l'utilisation du couple d'oligonucléotides 1/1' pRPA-ML-756
l'utilisation du couple d'oligonucléotides 212' pRPA-ML-751
l'utilisation du couple d'oligonucléotides 3/3' pRPA-ML-757
L'obtention d'un ADNc complet codant pour l'ACoACase de rat à partir dc Ces tois clones a été effectuée de la façon suivante: 1- l'insert ClaI/EcoNI du clone pRPA-ML-751 est ligaturé avec l'ADN du clone pRPA-ML 757 digéré par EcoNI/ClaI. Le clone résultant, nommé pRPA-ML- 758, contient les deux fragments présents dans pRPA-ML-751 et pRPA-ML-757.

2- l'insert XbaI du clone pRPA-ML-758 est ligaturé avec l'ADN du clone pRPA-ML-756 digéré par XbaI. Un des clones résultant de l'orientation en sens requis de rincent de pRPA
ML-758 dans pRPA-ML-756, nommé pRPA-ML-760, contient les trois fragments présents dans pRPA-ML-756, pRPA-ML-751 et pRPA-ML-757 .

Ce plasmide final obtenu a été nommé pRPA-ML-760 et contient un insert de 7038 pb correspondant à rADNc complet de l'ACoACese de rat. Cet insert est utilisable pour transfert dans d'autres vecteurs après digestion par XhoI(coté 5'-ATG)et NotI ou EagI (côté 3'-stop).

3) Obtention de levure haploïdes disruptées dans le gène accl et complémentées par le produit de l'expression de l'ADNc de l'ACoACase de rat
a- transfert de l'ADNc complet de l'ACoACase de rat dans un vecteur d'expression levure
Le vecteur d'expression dans la levure pYES2 commercialisé par la société Invitrogen sous la référence V825-20 a été utilisé comme vecteur de base. Une partie du gène z présent dans ce vecteur a été éliminé par coupure par les enzymes de restrictions Apal et
NheI. Le vecteur délété a été traité par la T4 DNA polymérase afin de rendre franches les extrémités des coupures.

Deux oligonucléotides de séquence, la position nucléotidique correspondant à la première base 5' par rapport à la séquence publiée est indiquée entre parenthèse à côté de l'extrémité 5',: 5'(208)-GTGAGCGCTAGGATCCACTGCCAGG-3' 5'(1434)-CGTTTACAATTTCCGGATCCGGTATTTTCTCC-3' ont été utilisés pour amplifier le gène his3 à partit du plasmide pRS413 commercialisé par la société Stratagene sous la référence: 217413. Le fragment a été amplifié par PCR dans les conditions suivantes: Appareil Perkin 9600; 50ng d'ADN du plasmide pRS413; 300ng de chacun des deux oligonucléotides sous un volume final de 100ml dans les conditions préconisées par Perkin-Elmer, foumisseur de la Taq polymerase; 5min/95 C- 25x(30sec/95 C-30sec/55 C-1min30sec/72 C)-5min/72 C.Le fragment amplifié a ensuite été traité par la T4 DNA polymérase afin de rendre franches les extrémités. Le fragment his3 et le vecteur pYES2 délété d'une partie du gène ura3 ont été ligaturés. Le plasmide résultant, nommé pYES2/his3, confère aux levures présentant une mutation his3 un phénotype d'autotrophie pour l'histidine.

Le plasmide pRPA-ML760 a été digéré par l'enzyme de restriction EagI, puis traité par la polymérase de Klenow afin de rendre franche cette extrémité, et enfin digéré par l'enzyme XhoL L'insert contenant l'ADNc complet de l'ACoACase de rat prsentant le site
XhoI à son extrémité 5' et le site EagI rempli à son extrémité 3' a été purifié.Le vecteur pYES2/his3 a été digéré par l'enzyme XbaI puis traité par la polymérase de Klenow afin de rendre franche cette extrémité, et enfin coupé par XhoL Le vecteur ainsi coupé a été lignez avec l'insert d'ACoACase de rat tel que préparé cidessus. Un clone obtenu contient rADNc complet de l'ACoACase de rat dans le vecteur pYES2/his3 et a été nommé pRPA-ML-761.

Ce plasmide a été utilisé par la suite pour toutes les expériences de transformation de levure et l'expression de l'ACoACase de rat dans les levures transformées.

b- transformation des levures YPHSOlDaccl et obtention de levures haploïdes disruptées
Le protocole suivi est décrit dans le "CPMB". Environ îoOng du plasmide pRPA-ML-761 sont électroporés dans les levures YPHSOlDaccl électrocompétentes avec un
BioRad pulser dans une cuvette de 0,2cm d'épaisseur, 2000hms, 25 pFarads et 1500 volts.

Les levures sont étalées sur un milieu minimum contenant tous les acides aminés et bases pour lesquels la souche est auxotrophe (leucine, lysine, adenine, tryptophane) à l'exception de l'uracile et de l'histidine. Ce milieu contient 1M sorbitol comme osmoprotectant. Après 3 jours de croissance à 28 C, les colonies sont repiqués sur le même milieu sans sorbitol. Après 2 à 3 jours de croissance à 28 C, une colonie est repiquée sur milieu de sporulation. Les 4 spores isssues d'un même asque sont microdisséquées avec un micromanipulateur dc
Fombrun et mise à germer sur un milieu complet YPD contenant 3% de galactose comme source carbonée.

Les 4 spores formées sont alors repiquées sur milieu minimum à 3% de galactose comme source carbonée contenant tous les acides aminés et bases pour lesquels la souche est auxotrophe (leucine, lysine, adenine, tryptophane) à l'exception de l'uracile et de histidine ct un milieu identique mais contenant de uracile. Deux des 4 spores poussent sur milieu sans histidine et sans uracile. Les deux autres spores nécessitent de l'uracile pour leur croissance.

Les 2 spores poussant sur milieu sans uracile et histidine sont repiquées sur un milieu minimum identique mais contenant 2% de glucose comme source carbonée. Dans ces conditions, aucune croissance n'est observée. Par conséquent les levures haploeees obvenues présentent bien une disruption du gène acci par le gène ura3 et d'autre part exprime une activité ACoACase, dépendante de la présence de l'inducteur galactose, capable de complémenter l'activité endogène supprimée. Cette levure haploïde disruptée dans le gène accl et complémentée par le produit de l'expression de rADNc de l'ACoACase de rat a été nommé Yhap/rat.Cette souche de levure valide la faisabilité de l'objet de l'invention et est un des éléments à la base du test de criblage qui fait l'objet de la présente invention.

Exemple2
Dans ce second exemple, une souche mutante de Neurospora crassa déficiente dans l'expression de l'activité ACoACase endogène a été complémentée fonctionnellement par l'expression d'un fragment d'ADN codant pour l'activité ACoACase d'oïdium.

1) Isolement et caractérisation d'un gène d'ACCase d'Ervsinhe graminis f. Sp. horde@
a- souche fongique
La souche Erysiphe graminis f. sp. hordei (désigné après Egh) 23D5 (Hollomon et al., 1984 Proceeding of the British Crop Protection Conference - Pests and Disease, 477-482) est maintenue sur orge (variété Halcyon) en microcosme de 20 plantes. Les plants d'orge de 7 jours sont infectés par la souche 23D5 en secouant des feuilles de plantes infectees dans le microcosme. Les spores d'Egh 23D5 sont récupérées par aspiration 10 jours après l'infection.

b extraction d'ADN d'Egh
Cmq cents mg de spores d'Egh sont broyés dans un mortier avec 500 mg de billes de verre (Sigma Chemical Co.). Le broyat est repris dans 4 ml de tampon d'extraction (200mM
Tris-HCl pH8; 25 mM EDTA; 250 mM NaCl, 0,5% SDS; 14 mM imercaptoethanol). Le mélange est chauffé à 65 C pendant 1 heure. 1 ml d'acétate de potassium (4M, pH 5,5) est ajouté et le mélange est mis à 4 C pendant 2 heures. Après une centrifugation de 1 heurt à 4 C à 12000 x g, le surnageant est récupéré. L'ADN est alors précipité en pisence de 2 volumes déthanol à -20 C pendant 1 heure.Après une centrifugation de 1 heure à 40C à 12000 x g, l'ADN est repris dans 2 ml de TE 7,5 (10 mM Tris-base, 1mM EDTA, pH ajusté à 7.5 avec HC1 concentré). Une extraction au phénol chloroforme (1/1) est effectuée et rADN est alors précipité de nouveau par 2 volumes d'éthanol en présence de 1/10 de volume d'acétate de sodium (3M, pH 4,8). Le culot d'ADN est lavé avec de l'éthanol à 70%. L'ADN est repris dans 300 pl de TE 7,5 et purifié sur un gradient de chlorure de sodium Les fractions contenant 1'ADN propre et non dégradé sont alors conservées à -20 C.

c clonage de 1'ADN d'Egh dans le phage lambda EMBL3
L'ADN d'Egh est digéré de façon partielle par l'enzyme de restriction Sau3AL L'ADN partiellement digéré dont la taille est comprise entre 9 et 23 kb est sélectionné par passage sur un gradient de chlorure de sodium. L'ADN obtenu est cloné entre les sites BamHI du pilage lambda EMBU (Stratagene). L'ADN phagique est alors cmpaqueté in vitro en utilisant le kit "Gigapack II Gold Packaging Extract" (Stratagene) en utilisant les conditions recommandées par le fabricant et est ensuite utilisé pour infecter E. coli P2392.Le titre de la banque de gènes obtenue est de 105 pfulml. Après amplification, le titre de la banque de gènes a été porté à 5.108 pf!ml.

d- préparation de la sonde de la région transcarboxylase de l'ACCase de levure.

Deux amorces oligonucléotidiques #109 (5'GACGAATTCTTCAATAAGG3') correspondant aux nucléotides 4800-4819 de la séquence de Saccharonvyocs cerevisiae (Al
Feel et al., 1992, Proc. Natl Acad Sci. USA, 89:45344538) et f110 (5'GATAATTGAGATCTCAATTC3') correspondant aux nucléotides 6168-6188 ont été synthétisées. Ces amorces ont été utilisées pour amplifier l'ADN de S. cerevisiac DH4 (Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155:335-350).La réaction d'amplification est effectuée dans un volume réactionnel contenant 100 ng d'ADN, 10 mM Tris-HCl pH9, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1 % Triton X100, 0,2 mg/ml BSA, 0,1 pM des amorces oligonucléotidiques #109 et 110, 200 pM de chacun des quatre désoxynucléotides dATP, dCTP, dTTP, dGTP. Différents cycles sont effectués sur un thermocycleur (Autogene H
Grant Instruments (Cambridge) Ltd). Après une étape de dénaturation à 95 C pendant 3 min, 35 cycles de dénaturation à 95 C pendant 1 min, d'hybridation à 500C pendant 1 min et de synthèse à 72 C pendant 1 min sont effectués. Le mélange réactionnel est ensuite laissé à 72 C pendant 3 min pour une extension finale.L'ADN amplifié est visualis sur gel d'agarose (1,2%) après coloration au bromure d'éthidium.

e- préparation de la sonde de la région transcarboxylase de l'ACCase d'Egh
L'ADN d'Egh a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI (Appligene - France) et mis à migrer sur un gel d'agarose (0,8% agarose dans tampon TBE (0.45 M Tris-Borate; 0,01
M EDTA)). L'ADN a été transféré sur une membrane de nylon (Amersham) en utilisant le système de transfert LKB 2016 Vacugene (Pharmacia LKB Biotechnology) et en suivant le protocole préconisé par le fabricant.

La membrane a été préhybridée à 42 C dans une solution de SSC 5X, Denhardts 5X, 30% formamide, 0,1% SDS (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A laxntory manual, 2nd Edition) pendant 3 heures. La sonde marquée correspondant à la partie transcarboxylase de l'ACCase de S. cerevisiae est alors ajoutée à la solution de préhybridation et l'hybridation est effectuée à 42 C pendant 16 heures. La membrane est lavée à 50 C pendant 30 min dans une solution de SCC 2x, 0,1% SDS et deux fois 15 min dans une solution SCC 2X. Le signal d'hybridation est révélé sur un autoradiogrannne.

L'ADN d'Egh présentant une homologie avec la sonde de la région transcarboxylase de la levure a été cloné dans le plasmide pUC18 (Messing, 1983, Methods EnzymoL, 101:20) digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. Le plasmide a été utilisé pour transformer E. colt DH5a
f- marquage des sondes
Les sondes sont marquées radioactivement au 32P en utilisant le "Random Primed
DNA Labelling Kit" et en suivant les recommandations du fabricant (Boehringer Mannheim
Biochemica).

g- criblage de la banque de gène - Préparation des membranes.

Cinquante ml de milieu TB (5g/l NaCI, 10 g/l Tryptone) contenant 1 ml d'une solution de maltose 10% et 0,5 ml d'une solution de 1M MgSO4 sont inocules avec E. colt
P2392. Après une incubation à 37 C sous agitation, les cellules sont centrifugées et reprises dans 10 mM MgSO4 afin d'avoir une densité optique à 600 nm de 0,5. 50 pl de la banque génomique diluée dans du tampon SM (5.8g/l NaCl, 3,6g/l MgSO4.7H2O,50 mM Tris-HCl pH 7,5,0,01% (p/v) gélatine) afin d'avoir 15 plages de lyse par cm2 sont ajoutes à 200 pl de cellules bactériennes.Les phages sont absorbés sur les cellules pendant 20 min à 370C. Ce mélange est alors ajouté à 3 ml de "Top Agar" (Milieu NZ-(Gibco BRL 16 g/l, 7 g/l agar) et est étalé sur milieu gélosé (16 gfl milieu NZ - Gibco BRL, 10 gfl agar) en boîte de Petri ( diamètre 9 cm). Les boîtes sont alors laissées à 37 C pendant environ 6 heures jusqu'à apparition des plages de lyse. L'ADN phagique est alors transféré sur membrane de nylon (Amersham) en suivant le protocole préconisé par le fabricant.

h- criblage de la banque de gènes
Les membranes sont préhybridées à 42 C dans une solution de SSC 5X, Denhardts 5X, 30% formamide, 0,1% SDS (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd Edition) pendant 3 heures. La sonde marquée est alors ajoute à la solution de préhybridation et l'hybridation est effectuée à 42 C pendant 16 heures. Les membranes sont lavées à 50 C pendant 30 min dans une solution de SCC 2X, 0,1% SDS et pendant deux fois 15 min dans une solution SCC 2X. Les signaux d'hybridation sont révélés sur un autoradiogramme.

Les plages de lyse donnant un signal d'hybridation sont isolées et le phage est élué dans 1 ml de tampon SM à 4 C Le phage peut être utilisé pour infecter des cellules bactériennes.

i- extraction de l'ADN phagique
Les phages sont récupérés à partir de plage de lyse par solution avec 5 ml de tampon
SM par boîte de Petri pendant 2 heures sous agitation à température ambiante. Le milieu SM est ensuite centrifugé à 8000g pendant 10 min à 4 C pour supprimer les débris cellulaim
RNase A et DNase I sont alors ajoutées à une concentration de 1 pg/ml au surnageant et le mélange est incubé pendant 30 min à 37 C. Puis un volume d'une solution contenant 20% (p/v) de polyéthylène glycol et 2M de NaCI dans le tampon SM est ajouté et le mélange est incubé 1 heure à 0 C. Les particules phagiques sont alors récupérées par centrifugation à
10000g pendant 20 min à 4 C.Les particules phagiques sont alors reprises dans 0.5 ml de
SM. Après centrifigation à 8000g pendant 10 min à 4 C, 5 l de SDS 10% et 5 l de 0,5 M
EDTA pH8 sont ajoutés au surnageant. Le mélange est incubé à 68 C pendant 15min. Deux extractions au phénol chloroforme (1/1) et une extraction au chloroforme sont alors effectuées. L'ADN est alors précipité par un volume d'isopropanol. Le culot d'ADN est lavé à l'éthanol 70% et repris dans 50 l de TE8 et conservé à -20 C.

j-séquençage de l'ADN.

L'ADN a été séquen par la méthode enzymatique de Sanger et al. (1977, Proc. NatL
Acad. Sci. USA, 47:5463-5467). Le sèquençage du gène de l'ACCase a été effectué dans le laboratoire du Dr. L. Hall à l'Université de Bristol (Bristol - Angleterre) en utilisant un séquenceur automatiquc (Du Pont GenesisTM 2000 DNA analysis system). Le séquençage a été effectué sur les deux brins.

k- Résultat du clonage du gène ACCase d'Egh
Le clonage de l'ADN d'Egh digéré par EcoRI présentant une homologie par hybridation avec la partie transcarboxylase de l'ACCase de levure a permis d'isoler un clone contenant un fragment d'ADN de 3,16 kb. Ce clone pMCl a été séquencé et a montré une forte homologie (64%) avec l'ACCase de levure. Ce fragment a été utilisé pour cribler la banque d'ADN génomique d'Egh.

Un premier criblage de la banque a pennis d'isoler le clone p19.1. p19.1 a été digéré par l'enzyme de restriction SolI (ce qui permet de séparer l'insert de l'ADN phagique) et a été sous cloné dans le plasmide pUC9 digéré par Sali. Un clone p19.1-6 contenant un insert d'environ 8 kb et présentant l'homologie avec pMCl a été isolé. Le séquençage des extrémités de l'insert contenu dans p19.1-6 a montré que ce clone ne contenait pas le gène d'ACCase d'Egh en entier. L'extrémité 5' de l'insert pl9.1-6 correspondant au fragment SalI-
XbaI (0,7 kb) a donc été utilisée comme sonde pour cribler une deuxième fois la banque d'ADN génomique d'Egh.Un clone différent de p19.1, p18.1, a été isolé et le sous-clonage dans pUC9 après digestion par Sa@I a permis d'isoler le clone pl8.1-6 présentant lilomologie avec la sonde correspondant à l'extrémité 5' de p19.1-6. L'insert contenu dans p18.1-6 est de
13.5 kb. L'analyse des sites de restriction et le séquençage des extrémités 3' et 5' de ce clone a montré que pl8.1-6 avait la même extrémité 3' que le clone p19.1-6 mais possédait environ 5 kb de plus en son extrémité 5'. Le clone p18.1-6 contient le gène de l'ACCase d'Egh en entier ainsi qu'environ 3,5 kb en amont du gène et 3 kb en aval du gène. La séquence SEQ.ID 1 dc 8123 pb contient 1070 pb de région promotrice ainsi que 80 pb de région 3' du gène de l'ACCase d'Erysiphe graminis f. Sp. hordei.

Le gène de l'ACCase d'Egh est de 6973 bp. Trois introns putatifs ont été localisés dans la séquence. Ces trois introns sont respecflvement de 54, 50, et 47 uncléotides. La séquence d'acides aminés déduites de la séquence d'acides nucléiques (2274 aa) présente 63% d'identité (77% de similarité) avec la séquence de la levure, 47% d'identité (67% de similarité) avec les séquences de rat (Lopez-Casillas et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci
USA, 85: 5784-5788) et de poulet Crakai et al., 1988, J. BioL Chem. 263: 2651-2657).

2) Obtention de mutants ACCase de Neurospora crassa.

a- souches de Neurospora crassa
Deux souches de "mating type" opposé portant la mutation am132 (délétion du gène de la NADP-specific glutamate dehydrogenase (Kinnaird et al., 1982, Gene, 20:387-396)) ont été utilisées. Am132A et Am132a sont cultivées sur milieu Vogel 1X, Sucrose 2%, acide glutamique 0,1%, agar 15g/l à 30 C.

b- construction du vecteur.

La région transcarboxylase du gène de l'ACCAse de N. crassa a été amplifiée par les amorces dégénérées #14997 (5'GTT(C)CGT(C)CTG(T,C)GGT(C)CAA(G)A(C)G3') et.94 (5'TCGTTG(A)ATG(A)GCC(T)TGG(A)GCG(A,T)GTC(G,T)TTA(G,C)AA3') déduites de la séquence de S. cerevisiae en tenant compte de l'usage des codons chez N. crassa
L'amplification avec les amorces oligonucléotidiques 14997 et 94 a permis d'obtenir un fragment de 591bp qui a été clone dans le site SmaI du plasmide pUC18. Après séquençage de ce fragment, il a été cloné dans le site SmaI du plasmide pEmBll9 (Dente et al., 1983,
Nucleic Acid Research, 11:1645-1655) portant comme marqueur le gène am cloné dans le site BamHL Le vecteur obtenu est nommé pNC600.

c- transformation de N. crassa
N. crassa Am132A est cultivé sur un milieu incliné (Vogel 1X, sucrose 2%, acide glutamique 6mM, agar 15 g/l) pendant 5 jours. Les spores sont reprises dans un milieu de germination (Vogel 0,5X, sucrose 1,5%, acide glutamique 6mM). La solution de spores est filtrée sur une gaze stérile et la solution de spores est diluée avec du milieu de germination pour obtenir une concentration de spores de 0,5.108 à 109 spores/ml. La solution de spores est mise à incuber à 30 C sous agitation pendant 4 heures. A intervalles réguliers après 3 heures, la germination des spores est vérifiée sous microscope.Lorsque 70-90% des spores ont geint, les spores sont lavées deux fois dans de l'eau stérile, puis une fois dans 10 mi dc sorbitol 1M. Les spores sont alors reprises dans 50 ml de sorbitol 1M en présence de 2(hng de Novozyme234 et incubées à 30 C sous agitation pendant 50-70min. La compétence est alors vérifiée en ajoutant 20 l d'eau à 10 l de cellules. n y a lyse des cellules compétents
Les cellules sont lavées deux fois dans 10 ml de sorbitol 1M, puis 1 fois dans 10 ml de STC (1M Sorbitol, 50mM Tris-HCl pH8, 50mM CaCl2). Les cellules compétentes sont alors reprises dans 400 l de STC (par tube utilisé au départ), 5 l de DMSO, et 10 l de PIC (40% polyéthylène glycol 4000, 50mM Tris-HCl pH8, 50mM (CaCl2).Les cellules compétentes sont conservées à -20"C.

Pour la transformation des cellules, lOpg de plasmide est mis en présence de 400 l de cellules compétentes et de 25 l d'héparine (5mg/ml dans STC). Le mélange est rnis à incuber 30 min sur la glace. 5 ml de PTC est ajouté et l'incubation est poursuivie pendant 20 min à température ambiante. Différents volumes de cellules transformées sont mélangés à 15ml dc
Top Agar (Vogel 1X, 1M Sorbitol, 55mM Sorbose, 1,5mM Glucose, 1,5mM Fructose, 20mM Glycine, 28g/l agar) et étalés sur un milieu gélosé (Vogel 1X, 55mM Sorbose, 1,5mM
Glucose, 1,5mM Fructose, 20mM Glycine, 15g/l agar). Après 2 à 3 jours de croissance à 300 C, les transformants sont transférés sur milieu sélectif incliné (Vogel 1X, 2% Sucrose, 20mM glycine, 15g/l agar).Les transformants sont ensuite purifiés par trois passages sur milieu sélectif contenant 1M de sorbitol qui permet l'isolement d'une colonie.

d- croisement de N. crassa.

Une des souches parentes est mise à pousser en boîte de Petri sur un milieu minimum de croisemen (1g/l KH2PO4, 1g/l KNO3, 0,5g/l MgSO4.7H2O, 0,1g/l NaCl, 0,1g/l CaCl2, 5 g/l D-biotine, 1g/l acide glutamique, 15g/l agar et 0.1 ml/1 d'une solution conteenant 50g/l d'acide citrique, 50 g/l ZnSO4.7H2O, 10g/l Fe(NH4)2(SO4)2,6H2O, 2,5g/l CuSO4-5H2O, 0,5g/l MnSO4.H2O,0,5g/l H3BO3, 0,5g/l Na2MoO4.2H2O,pH6,5.La source de carbone est la cellulose apportée sous forme de papier Whatman 3MM. La souche est incubée sur ce milieu pendant 6 jours à 250C avant de la croiser avec une solution de spores de l'autre souche parente. Les spores sont éjectées des périthèces environ 9 jours après le croisement
Les spores sont alors récupérées sur le couvercle de la boîte de Petri et étales sur le milieu de sélection et incubées à 250C pendant la nuit.Les spores présentant de longs tubes germinatifs (am+) sont isolées sous microscope.

e- Résultat de la mutation du gène de l'ACCase de N.crassa
Chez N. crassa, la présence de squences répétées soumet ces séquences à des mutations préméiotiques (Repeat Induced Mutations, Seller, 1990, Annu. Rev. Genet 24: 579-613). Les séquences répétées sont inactivés par des changements de paires de base (G-C : A-T) et par des méthylations de cytosines. Ce phénomène a été utilisé pour muter le gène codant pour l'ACCase de N. crassa.

Pour muter le gène de l'ACCase de N. crassa, un vecteur comprenant une partie de la région transcarboxylase du gène de l'ACCase de N. crassa ainsi que le gène de la NADP specific glutamate dehydrogenase (gene am) comme marqueur de sélection a été construit et a été utilisé dans la transformation de la souche Am132A (délétée du gène am). 72 transformants ont été récupérés. 24 de ces tranformants présentant une croissance rapide ont été purifiés par 3 isolements successifs sur milieu contenant du sorbitoL 12 de ces 24 transformants ont été utilisés dans un croisement avec la souche Am132a. Ce premier croisement a permis de vérifier la stabilité des transformants et de sélectionner la descendance ne portant qu'une seule copie du plasmide. 7 descendants ont été sélectionnés et ont été croisés avec Am132a ou Am132A en fonction de leur mating type. Les descendants de ce deuxième croisement ont été sélectionnés pour leur différence de croissance sur milieu avec ou sanspalmitate. Un mutant MC2C662 a montré une nette différence de croissance en milieu avec ou sans palmitate à 250C.

3)Complémentation fonctionnelle du mutant ACCase de N.crassa par l'ACC ase d'Egh
Ce mutant MC2C662 est utilisé pour l'expression du gène ACCase d'Egh. Pour cda, l'insert contenu dans le clone p18.1-6 a été séparé du plasmide pUC9 par digestion avec l'enzyme de restriction SalI et purification par électrophorèse sur gel d'agarose. Ce fragment
Sali de 13 kpb contient la partie codante du gène de l'ACCase d'E.graminis ainsi que 3,5 kpb de la région 5' amont et 3 kpb de la région 3' aval. Les extrémités de l'insert ont été rendues franches par traitement avec l'ADN polymérase de Klenow.L'insert à bouts francs a ensuite été cloné dans le site Bgm rendu franc par traitement par 1'ADN polymérase de Klenow du plasmide pAN7-1 porteur du gène codant pour l'hygromycine B (Punt et al., 1987, Gene, 56:117-124). Un des plasmides obtenu a été nommé pEGH94 et a été utilisé pour la transformation de la souche mutante de N. crassa MC2C662 décrite ci-dessus. Une des souches transformée sélectionnée de N.crassa est capable de pousser sur un milieu contenant de l'hygromycine et ne contenant pas de palmitate.

Cette souche de N.crassa complémentée par l'ACCase d'oïdium valide la faisabilité de l'objet de rinvention et est un des éléments à la base du test de criblage qui fait l'objet de la présente invention.

Ces deux exemples montrent bien l'utilisation de la présente invention telle qu'elle a été décrite dans sa généralité ci-dessus, à Savoir un test de criblage permettant de déterminer une activité potentielle spécifique d'une cible biochimique déterminée.

SEQUENCE LISTING
SEQ. ID. NO. 1
1 TAATGGCAGCCATCTAGCCCCATCACTACTCCAGCCCTCCACGTAAACCATGAGGCTTGT 60
61 AATGGCGTGTGCAAGAAGTGGCTACAGAGATTGGGAAGGATGCATATTGAGACAAGGGGC 120
121 TTTCAAGCGCTGTAGCATTCTAGCACTGCTCAACTTAAGCTACCTCACAGCCTTATGAGA 180
181 GATTTTGGCCCGTTTTTCCCAGCCACATGGTAAGAAGATGATGATGTCATTTACATGACT 240
241 GTAAGGAGGGGCTGTGGCGAAAGTTCACACATTGCAAGACCCCTCATTCTCGTATTGGAC 300
301 CTTGATTGTTAATTTAAGCGGGAAATCCGTGTCCTCACCCTCTTGATTTTCTGCCTCAAA 360
361 CTAAAGGCGGCTTTAACCCTGGCAAACAGGGCGGGTGCTACCGAAGTGTATCCATCACGC 420
421 CGGAATGTACTTTCATCAAGGGCTTGCGAGTCTTAGAAGTAAATTTGGGTAATTCTTGGA 480
481 ACGGATYGCGCTCAGCCTTTGCTGTGTGAGCCATTGAATTCATAGCGATTTGCTAXGATT 540
541 GAAAATAGTTGTCACTAGCATTAGTAATCTCCCCAGGCAGTCAATGTCGTTGGCAGGCGT 600
601 TGTTGGATTGGCGGGCTACCCGATATAGTTAGATCAGCCCAACGTGTAGACCCCGTACTC 660
661 ACCAAATTTGGCCCAGATCGCCAGCCGCTGCGCTGTGTTGGGATGATTTGACCAAGAGCT 720
721 AGTCAAGCTCATCGCTGCAGGCAAAAATTCATGTTTCCATGATATGCCGACAGGCCCCAA 780
781 TCT cTAACGTCC CTT CATAT CTTTGAACTGTTCAACTTCAAT CATTCAATACTAAAAATT 840
841 TTCGCTCTTCCCACTTATT CTTC CTCAAGCTCTTCAATAGTCTTTACAATACATTTCAGA 900
901 CATTGTGAAAGGGCATAAATTTACTCCGAACTACACTAGGAGTTACTGTCGAAAATTTAT 960
961 ATATTCTGTCTGTACAATATTAAGAAAGATTTAGTCTACACTTCTTCTACTGTATTACTG 1020
1021 GCGACATCATCACACCAAGCTCGTCTACTGCGAGCTASAAAACACACACCATGACTGAGA 1080 M T El
1081 TTAACGGTGAAGTCAGAAGACTAAGCTGTGCTGTGCCACTTGTACGCAATCAGTCATACT 1140
N G E V R R L S C A V P L V R N Q S Y S
1141 CAGCAAGGCATCAAATTGCTGAGCATTTTATCGGAGGTAACAAATTGGAAAATGCCTCTC 1200 A R H QI A E H FI G G N K LE N A SP
1201 CAAGCGATGTCAAGGAGTTTGTTGCAAAACATGATGGCCACACTGTTATCXCAAACGTAA 1250 SDV K E F VA K H DG H T VIT N
1261 ATATCTGATTCCTTCTCGTACCTACAAGACTGATTAGTCGTTTCAATTAGGTTCTGATCG 1320
V L I A
1321 CAAATAACGGCATAGCTGCTGTCAAGGAAATCCGATCGGTCAGAAAGTGGGCTTATGAGA 1380 N N GI A AV K E I R 5V R KW A Y E T
1381 CTTTCGGAGATGAACGTGCCATTCAGTTCACTGTTATGGCAACGCCTGAAGATCTTCAAG 1440 F G DE RAI Q F TV M A TP E DL Q A
1441 CCAACGCTGACTATATTCGTATGGCTGATCAATATGTAGAGGTTCCCGGTGGCACAAATA 1500 N AD Y I R M AD Q Y V E V P G G T N N
1501 ATAATAATTGCGCAAATGTCGAGCTAATCGTAGATGTGGCTGAGCGTATGGATGTCCATG 1560 N N CA N V E LIV DV A E R MDV H A
1561 CTGTCTGGGCCGGATGGTGAGTCTTCCGCTTAACGAACAATTCCAAACAATCCTAATCCC 1620
V W A G W 1621 GGTAAGGCGACATGCTTCAGAAAACCCAAAGTTACCCGAATCACTTGCCGCCAGCCCCAA 1680 G HA S ENP KL P ES L AA S PK 1681 AAAAATCGTCTTCATTGGGCCACCAGGTTCTGCAATGAGATCACTTGGTGATAAAATATC 1740
K I V F I G P P G S A M R S L G D K I S 1741 cTCAACAATTGTAGCCCAGCACGCCAAGGTGCCATGTATACCTTGGTCCGGAACAGGAGT 1800 ST IV A Q H A K V PC I P W SGT G V 1801 AGATCAAGTTGAGGTGAACGACGAAGGAATCGTAACTGTTGATAAGGAAGTATATATGAA 1860
D Q V E V N D E G I V T V D K E V Y M K 1861 AGGATGTGTGCAATCCTGGCAGGAGGGACTTGAAAAAGCCCGTGAAATTGGGTTCCCGGT 1920
G C V Q S W Q E G L E K A R E I G F P V 1921 CATGATCAAAGCTTCCGAAGGTGGCGGTGGCAAGGGTATCCGAAAAGTAGATTCTGACGA 1980 MI K A SE G G G G K GI R K V D S DE 1981 GGGATTTGAGGCGTTACAAAGCTGCTGCAAATGAAATTCCTGGATCGCCAATATTCAT 2040
G F E A L Y K A A A N E I P G S P I F I 2041 AATGAAGCTTGCTGGAAATGCAAGGCATTTAGAGGTGCAGTTACTGGCCGATGAATATGG 2100
M K L A G N A R H L E V Q L L A D E Y G 2101 AAATAATATTTCACTATTCGGAAGGGACTGTTCTGTTCAACGAAGACATCAAAATCAT 2160
N N I S L F G R D C S V Q R R H Q K I I 2161 TGAGGAGGCCCCTGTCACTATTGCAAAGACGTCAACTTTTCAAGATATGGAAAAAGCCGC 2220
E E A P V T I A K T S T F Q D M E K A A 2221 CGTACGGCTAGGGCGACTTGTAGGCTACGTTTCTGCAGGGACTGTCGAATATTTGTACTC 2280
V R L G R L V G Y V S A G T V E Y L Y S 2281 GCATGCTGAAGATAAATTCTACTTTTTGGAATTAAATCCCCGGCTTCAGGTCCAACATCC 2340
H A E D K F Y F L E L N P R L Q V E H P 2341 AACGACAGAAATGGTCAGTGGTGTCAATTTACCCGCGGCACAGCTTCAAATTGCAATGGG 2400 T T E M V S G V N L P A A Q L Q I A M.G 2401 ACTTCCCCTTCACAGAATACGAGACATTCGACTATTGTATGGAGTAGATCCCCAGGGATC 2460
L P L H R I R D I R L L Y G V D P Q G S 2461 TACAGAGATCGATTTTGATTTTTCGAAGGATTCTTCTTCTGAAACTCAGAGGAGGCCAAC 2520 T E ID F D F SK D SSSE T Q R R PT 2521 CCCCAAAGGCCACACAACTGCTTGCCGAATAACCTCTGAAGACCCTGGAGAAGGGTTTAA 2580 P K G H T T A CRI T SE DP G E G F K 2581 GCCATCAAGCGGCATGATGCATGAACTAAACTTTAGAAGTAGCTCTAACGTCTGGGGTTA 2640 P S S G M M H E L N F R S S S N V W G Y 2641 TTTCTCTGTGGGTACAGCTGGTGGAATTCACAGCTTTTCAGACAGTCAGTTTGGTCACAT 2700
F S V G T A G G I H S F S D S Q F G H I 2701 ATTCGCGTACGGTGAAAATAGATCAGCATCTCGGAAACATATGGTAGTTGCATTAAAAGA 2760 F A Y G E N R SAS R K H M V VAL K E 2761 ACTAAGCATCAGAGGAGATTTCCGCACAACGGTCGAGTATTTGATTAAACTCCTTGAAAC 2820
L S I R G D F R T T V E Y L I K L L E T 2821 TCCCGCCTTTGAAGATAACACCATAACAACTGGCTGGCTAGACGAACTTATCTCAAATAA 2880 PAF E D N T I T T G WL DE LIS N K 2881 GCTGACTGCTGAAAGACCCGACCCTACACTAGCTGTTGTTTGTGGTGCAGTTAcTAAGGc 2940
L T A E R P D P T L A V V C G A V T K A 1941 CCACATTGCGAGTGAGGCTTGCATATCTGAATACCGAACAAGCTTAGAAAAGGGACAGGT 3000
H I A S E A C I S E Y R T S L E K G Q V 3001 TCCAGCGAAAGATATTCTTAAGACAGTATTTCCTATAGA r CATCTATGATGGGCAGCG 3060
P A K D I L K T V F P I D F I Y D G Q R 3061 ATACAAATTTACAGCCACCCGGTCGAGCTTAGACAGTTATCATTTGTTCATCAATGGTTC 3120
Y K F T A T R S S L D S Y H L F I N G S 3121 CAAATGCTCTGTTGGTGTTCGAGCCTTAAGCGACGGAGGACTCTTGGTTCTCCTCAGTGG 3180
K C S V G V R A L S D G G L L V L L S G 3181 TCGGAGTCACAATGTCTACTGGAAAGAAGAAGTTGGAGCTACCAGATTGAGCGTCGATAG 3240
R S H N V Y W K E E V G A T R L S V D S 3241 TAAAACATGCTTATTAGAGCAAGAGAATGACCCTTCTCAGCTTAGAACCCCATCACCTGG 3300
K T C L L E Q E N D P S Q L R T P S P G 3301 AAAATTAGTCAAGTACACTGTTGAAAACGGACAGCACGTCAAGACGGGGCAACCATTTGC 3360
K L V K Y T V E N G E H V K T G Q P F A 3361 TGAAGTAGAGGTGATGAAGATGTACATGCCGCTACTCGCAGCTGAGGACGGTATTGTACA 3420
E V E V M K M Y M P L L A A E D G I V Q 3421 ACTTATAAAACAACCTGGGGCAACTCTTGAAGCAGGAGATATTTTGGGAATACTTGCTCT 3480
L I K Q P G A T L E A G D I L G I L A L 3481 AGACGACCCTTCGAGAGTAAAACAAGCGCAACCTTTCTTAGGACAACTACCTGACTTGGG 3540
D D P S R V K Q A Q P F L G Q L P D L G 3541 ACCTCCTCAGGTTGTTGGAACGAAGCCGGCTCAAAGATTCGTCTTACTGCACAATGTGCT 3600
P P Q V V G T K P A Q R F V L L H N V L 3601 ACTCAACATTTTAGACGGTTTCGACAATCAAGTTATCATGGCAGCTTCTTTGAGAGAACT 3660 t NIL DG F D N Q VI M A AS L R EL 3661 TATCGATGTCCTCCGCGATCCAGAGCTTCCCTACGGCGAATGGAACGCCCAGTTTTCCGC 3720
I D V L R D P E L P Y G E W N A Q F S A 3721 TCTCAGCTCGAGAATGCCACCTCGCCTTGCCACGACTTTTGCTCAAGTAATGGACCGTTC 3780
L S S R M P P R L A T T F A Q V M D R S 3781 AAGACAAAGAAAAGCCGATTTCCCAGCACGAAATCTGTCA'AAGCTCTGAATAAATTTCT 3840 R Q R K AD F PAR N L S K A L N K FL 3841 TGACGAAAGCGTTGATCCAGCTGATATAGACGCGCTCAAAGCCACGTTATCCCCCTTGAA 3900 DES V DP ADI D A L K A T t SP L N 3901 TGACGTAATGGAGAGATACCCTGAAAGTCAGAAAGCTCATGAATTTAACGTATTTGCTGA 3960 DV M E R Y A E SQ K A H E F N V F AD 3961 CCTCCTAGAGCGGTATGCAGCAGTAGAAAGATTGTTTTCCAATCGAACATCTCGTGACGA 4020
L L E R Y A A V E R L F S N R T S R D E 4021 GGAAGTTATACTAAAACTAAGAGATGAAAATAAGGACGATATTT CAAAAGTAATTCAGAC 4080 E VIL K t R DE N KO DIS K VI Q T 4081 CGTTCTTTCTCATAGTAGkCGGAGCTAAGAATAACTTGATTCTAGCCATÀcTAGATGA 4140
V L S H S R I G A K N N L I L A I L D E 4141 GTATAAACCCAACAAGCCTCATGCCGGTAATGTTGCACAGTTCTTTAGGCCGGCTCTTCG 4200 Y K P N K PHAG NVAQ F F RPAtR 4201 AAAGTTGACTGAACTTGAATCACGACAAACAGCAAAAGTTTCCCTCAAAGCCCGTGAACT 4260
K L T E L E S R Q T A K V S L K A R E L 4261 GCTCATTCAATGTGCTATGCCTTCATTAGAAGAGCGAGCAGCTCAGATGGAACATATCCT 4320
L I Q C A M P S L E E R A A Q M E R I L 4321 ACGATCATCAGTTGTTGAGTCAAGGTACGGTGAAACAGGATGGGAACACCGCGAACCTGA 4380 R S S V V E S R Y G E T G W E H R E P D 4381 CATTGAAGTGCTCAAAGAATGCGTCGATTCTAAATATACGGTCTTTGATGTGCTACCGCT 4440
I E V L K E V V D S K Y I V F D V L P L 4441 TTTCTTCGGCCATCAAGATCCATGGGTCTCGCTTGCTGCTCTTGAAGTTTACATCAGGCG 4500
F F G H Q D P W V S L A A L E V Y I R R 4501 TGCATATCGTGCCTACTCTTTAAAAAAGGTTGAGTACCACAACGATAGTTCTGATTCCCC 4560
A Y R A Y S L K K V E Y R N D S S D S P 4561 TTTCATTGTCTCTTGGGACTTTGTACTTCGAAACGTTGGCACGTCTGAATTCGGACTACC 4620
F I V S W D F V L R N V G T S E F G L P 4621 AGCCCAGTCAGGCGCAGTTACACCTGCCTCTTCAGATTTCAAAAGTAATTTTCAACGCGT 4680
A Q S G A V T P A S S D F K S N F Q R V 4681 CGCCTCGATCAGCGACATGTCATATCTTGTGAATCGCGAGAGCCACGAACCTATTAGAAA 4740
A S I S D M S Y L V N R E S H E P I R K 4741 GGGGGTCATAGTACCCGTCCCTTATCTCGATGAAGCCGAAGAATACTTGGTCCGAGCCCT 4800
G V I V P V P Y L D E A E E Y L V R A L 4801 CGAGTTTCTTCCTACATCTTCAGGTAGGAAGAAGTACCCTAACGGACTGATGCCAGATCT 4860
E F L P T S S G R K K Y P N G L M P D L 4861 GGCAGGGAAACGGAAGACGGTGTCTTCTTCTAATGCTGAAGACGAATTAACAGCTGTAGT 4920
A G K R K T V S S S N A E D E L T A V V 4921 GAATGTTGCAGTTCGTGACTCCGAAAGCCATGATGATAATGAAACAGTTGCTAGGATCAA 4980
N V A V R D S E S H D D N E T V A R I N 4981 TGCAATCGTAAAAGAGATCAAATCAGAACTATTGTCTCGCCGCGTCCGTCGCCTAACGTT 5040
A I V K E I K S E L L S R R V R R L T F 5041 CATCTGTGGTCACAAAGATGGATCTTACCCAGGATACTACACTTTCCGTGGCCCCAAATA 5100
I C G H K D C S Y P G Y Y T F R G P K Y 5101 CGAAGAGGACCAAAGTATTCGTCACAGTGAACCAGCTCTAGCCTTTCAACTTGAACTCGA 5160 E E O Q SI R H SE PAL A F Q LE LE 5161 AAGGTTGTCCAAATTCAGGATCCGGCCTGTATTTACCGAAAATCGGAATATTCATATCTA 5220
R L S K F R I R P V F T E N R N I R I Y 5221 CGAGGCAATCGGGAACAATGTTGAGGGCGACAAACGGTATTTCACACGTGCAGTTGTTCG 5280 E AI G N N V E G 0K R Y F T R A V V R 5281 CCCAGGAAGACTAAGAGATGAAATTCCAACTGCCGAGTACCTTATCTCTGAGTCTGATAG 5340
P G R L R D E I P T A E Y L I S E S D R 5341 ACTGATGAATGATATTCTCGATGCCTTGGAGATAATTGGAAATAACAATTCTGACCTAAA 5400
L M N D I L D A L E I I G N N N S D L N 5401 TCACATCTTCATAAACTTTTCGCCTGTCTTTCCCCTGCAGCCACCAGAAGTAGAGGAAGC 5460
H I F I N F S P V F P L Q P P E V E E A 5461 TCTCGGTGGATTTTTAGAGCGTTTTGGACGACGTCTTTGGAGATTGCGTGTTACTGGCGC 5520
L G G F L E R F G R R L W R L R V T G A 5521 TGAGATACGCATCATTTGTACTGATCCTATCACTAGCATGCcTTATCCTcTCCGTGTTGT 5580
E I R I I C I D P I T S M P Y P L R V V 5581 CATCACAAACACCTCTGGATACGTGATCCAAGTGGAGATGTACGCCGAAAGAAAATCCGA 5640
I T N T S G Y V I Q V E M Y A E R K S E 5641 AAAGGGTGGCGAATGGGTCTTCCACAGTATCGGAGGTACGACTCCTATCGGATCCATGCA 5700
K G G E W V F H S I G G T T P I G S M H 5701 CTTGAGATCTGTTTCAACTCCATATCCCACCAAGGAGTGGCTTCAACCTAAAAGGTATAA 5760 L R SV ST P Y PT K E WL Q P K R Y K 5761 GGCCCACTTGATGGGCACGCAGTATGTCTATGACTTCCCAGAATTGTTTAGACAATCCAT 5820
A H L M G T Q Y V Y D R P E L F R Q S I 5821 TCAAAATAGTTGGTCCAAAGCTGoeCGCAAGCATCCTTCACTACTCGAAAAGCAGCCAGC 5880
Q N S W S K A A R K H P S L L E K Q P A 5881 CACCGGGGAGTGCATTGACTTCAGTGAGCTTGTTTTGGACGACACCGACAATCTTGCTGA 5940
T G E C I D F S E L V L D D T D N L A E 5941 AGTTAATCGTGAGCCAGGAACTAACAGTCACGGAATGGTTGGATGGATTATTACAGCAAG 6000
V N R E P G T N S H G M V G W I I T A R 6001 AACCCCAGAGTATCCCAGAGGTCGAAAGTTTGTCGTGGTCGCAAATGACATCACATTTAA 6060
T P E Y P R G R K F V V V A N D I T F K 6061 AATTGGCAGTTTTGGCCCGAAAGAAGACCAATTTTTCCACAAATGTACGGAACTTGCAAG 6120
I G S F G P K E D Q F F H K C T E L A R 6121 GAAATTGGGCATACCGCGGGTCTATTTATCTGCTAATTCTGGAGCTCGAATTGGTATGGC 6180
K L G I P R V Y L S A N S G A R I G M A 6181 AGAAGAGCTGATACCTCATTTCAATGTCGCTTGGAACGACCCAGAAAAACCGGAGGCTGG 6240
E E L I P H F N V A W N D P E K P E A G 6241 TTTCAAGTATCTATACCTCAATCGAGATGCCAAAAAACGCTTCGAAGACGGAAAGACAAA 6300
F K Y L Y L N R D A K K R F E D G K T K 6301 AGAGGTTATCACAGAAGAGATTGTTGAGGACGGAGAAACTCGTTACCGTATAACCACAAT 6360
E V I T E E I V E D G E T R Y R I T T I 6361 AGTTGGTGCTGAAGACGGTCTTGGTGTCGAATGTCTAAAGGGCTCAGGTTTAATTGCAGG 6420
V G A E D G L G V E C L K G S G L I A G 6421 GGCTACAAGTCGTGCATATGAGGACATCTTCACAATTACCCTTGTGACATGTAGGTCCGT 6480 A T S R A Y SDI F T I T LV T C R SV 6481 TGGAATCGGGGCTTATCTTGTToeTCTTGGACAACGAGCTATCCAAATAGAAGGGCAGCC 6540
G I G A Y L V R L G Q R A I Q I E G Q P 6541 TATTATTCTTACTGGTGCCCCTGCAATTAACAAACTTCTTGGCCGCGAAGTATATACTTC 6600
I I L T G A P A I N K L L G R E V Y T S 6601 AAACTTGCAACTTGGTGGAACCCAAATTATGTATCGCAATGGAGTCTCTCACATGACGGC 6660 N L Q L G G T QI M Y R N G V SH M T A 6661 AACTGATGATTTTGAGGGTGTTTCCAAAATTCTCGAGTGGATGTCATACGTACCCGACAA 6720
T D D F E G V S K I L E W M S Y V P D K 6721 AAGGAACAATCCATTACCAATTGGACCGGCAAGTGATTCGTGGGATCGGGAAGTGAGTTA 6780
R N N P L P I G P A S D S W D R E V S Y 6781 CTCACCACCACCTAAGCAGCCATATGATGTTAGATGGCTTATCGCTGGCAAGGACGACGA 6840
S P P P K Q P Y D V R W L I A G K D D E 6841 AGAAGGGTTTTTACCTGGTCTATTTGATAAGGACTCTTTCGTCGAAACTCTTGGTGGCTG 6900
E G F L P G L F D K D S F V E T L G G W 6901 GGCCAAGACTGTTGTTGTCGGTCGTGCAAGACTTGGTGGTATTCCAATGGGTGTAATTGG 6960 A K TV V V G RA Rt G GI P M G VI G 6961 TGTTGAAACCCGTTCAGTCGAAAATATTACACCCGCAGACCCTGCAAACCCTGATTCTAC 7020
V E T R S V E N I T P A D P A N P D S T
7021 AGAGCAAATTACCAATGAAGCAGGCGGAGTATGGTATCCAAACTCTGCTTTTAAGAcTGC 7080
E Q I T N E A G G V W Y P N S A F K T A
7081 TCAAGCAATCAAGGACTTCAATAATGGCGAACAGTTGCCGTTGATGATACTTGCTAATTG 7140
Q A I K D F N N G E Q L P L M I L A N W
7141 GAGAGGTTTcTcTGGAGGTCAGCGGGATATGTACAATGAGGTATTGAAATATGGcTcATA 7200
R G F S G G Q R D M Y N E V L K Y G S Y
7201 CATTGTCGATGCCCTGGTCAAGTACGAGCAACCAATTTTTGTATATATACCTCCATTTGG 7260
I V D A L V K Y E Q P I F V Y I P P F G
7261 AGAGcTACGCGGAGGCTCTTGGGTAAGTTATCAACTTTGGACTACTAAAATTATTTCTAA 7320 E t R G G SW
7321 CGATTGCAGGTTGTCGTTGACCcTACCATTAATCCCGATTTTATGGAGATGTATGCTGAT 7380 V V V Dp T I N P D F M E M Y AD
7381 ATCGAcTCTCGCGGTGGCGTCCTTGAGCCTGAAGGTATAGTAAACATCAAATACCGTCGT 7440
I D S R G G V L E P E G I V N I K Y R R
7441 GATAAGCAAcTCGAGACTATGGcACGTCTGGACCCTGAGTACGGTGcTCTTCGAAAGCAG 7500
D K Q L E T M A R L D P E Y G A L R K Q
7501 cTCACAGATCCGTCAcTCACTC CAGATCAATTAAGTGATATTAAAGTCAAAGCAAGTGCA 7560
L T D P S L T P D Q L S D I K V K A S A
7561 CGTGAACAATTACTTTTACCTGTGTACATGCAGGTTTCATTACAGTTTGCCGATTTACAC 7620
R E Q L L L P V Y M Q V S L Q F A D L H
7621 GATCGAGCTGGGCGTATGAAAGCAAAAGATGTAATACGTCAGTCATTAGTCTGGAGAGAA 7680
D R A G R M K A K D V I R Q S L V W R E
7681 GCTCGCCGCTTCTTcTACTGGCGGGTACGTCGTCGTGTTAACGAAGAGTATATTCTAAAG 7740
A R R F F Y W R V R R R V N E E Y I L K
7741 CGTATGTcAACGGcGTCTAAGAATTCTCTGAAATCCCGAGCTCGAAACATTGCAACTTTA 7800
R M S T A S K N S L K S R A R N I A T L
7801 TCTGCATGGACTGGCATTTCATTGTTCGAAACGGCTGACCGTGAGGTCGCAATGTGGTAC 7860
S A W T G I S L F E T A D R E V A M W Y
7861 GAAGAAAATCGTAAAGTTGTCGGTGAGAAGGTCGAGTCTCTCAAAACTGATGACGTAGCA 7920
E E N R K V V G E K V E S L K T D D V A
7921 TTCGAGGTCTCAGCCTTGCTGCGATCTAATGGAAAGGGTGGACTTAAAGGTGTACACCAG 7980
F E V S A L L R S N G K G G L K G V H Q 7981 GTGCTGAGTATGTTGCCTGCAAATGAGAGGGAAGAGGCGTTAAGATACTTGAGTGAGACG 8040
V L S M L P A N E R E E A L R Y L S E T 8041 TAAACAGATTGAAATATTTTGAAAGTCTTACTTTTTCCCTAGTCACTTCATAGGGACGAG 8100
* 8101 AGGATAATATTTGTATATATATA 8123

Claims (16)

1. Revendications 1. Microorganisme, caractérisé en ce qu'il ne présente plus, par mutation, d'activité homologue de l'activiste d'une cible biochimique déterlriinée et qu'il est complémenté par expression de l'activité cible ou d'une activité homologue.
2. 2. Microorganisme selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est de type eukaryote.
3. 3. Microorganisme selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par une levure.
4. 4. Microorganisme selon la revendication 3, caractérisé en ce que la levure est du type

   Saccharomyces.
5. 5. Microorganisme selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un champignon.
6. 6. Microorganisme selon la revendication 5, caractérisé en ce que le champignon est du type

   Neurospora.
7. 7. Microorganisme selon rune des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la cible biochimique est l'acétylcoenzymeAcarboxylase: ACoACase, EC 6.4.1.2.
8. 8. Microorganisme selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'ACoACase provient du rat: Ratus norvegicus.
9. 9. Microorganisme selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'ACoACase provient de

   Erysiphe graminis SEQ ID NO: 1.

   présentant plus d'activité homologue endogène et permettre ainsi sa croissance.

   d'un organisme quelconque et capable de complémenter le même microorganisme ne

   le second pour tester l'expression d'une activité homologue à l'activité cible provenant

   croissance,

   microorganisme ne présentant plus d'activité homologue endogène et permettre ainsi sa

   le premier pour tester l'expression de l'activité cible capable de complémenter un
10. 10- Système de criblage permettant de sélectionner des molécules ayant une activité spécifiquement dirigée contre une cible biochimique déterminée, comprenant au moins deux microorganismes, selon rune des revendications 1 à 9, identiques du point de vue génétique à l'exception de l'activité cible ou d'un homologue de cette activité:
11. 11- Système de criblage selon la revendication 10, caractérisé en ce qu il comprend deux microorganismes distincts.
12. 12- Système de criblage selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend trois microorganismes distincts.
13. 13- Système de criblage selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la cible biochimique est choisie de sorte que l'inhibition de l'activité de la cible biochimique soit létale pour la croissance du microorganisme complémenté, au moins dans un milieu de culture déterminé.
14. 14. Procédé de criblage permettant de sélectionner des molécules ayant une activité spécifiquement dirigée contre une cible biochimique déterminée, caractérisé en ce qu'on applique le produit à tester sur chacun des microorganismes du système selon l'une des revendications 10 à 13 et qu'on effectue l'observation de l'inhibition différentielle, par le produit testé, de la cible et d'un de ses homologues.
15. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on selectionne des molécules ayant une action protectrice des plantes.
16. 16-. Séquence du gène codant pour l'ACoACase d'Erysiphe graminis selon SEQ ID NO:1.