HU206897B - Process for utilizing bar-1 gen for selecting strange proteins - Google Patents

Description

A jelen találmány olyan új DNS konstrukciókra irányul, amelyek legalább a Saccbaromyces cerevisiae BARI gén lefordított szignál peptid részét és legalább egy olyan struktúrgént tartalmaznak, amely idegen az említett konstrukcióval transzformált gazdasejtben. A gazdaszervezetek transzformálása ilyen konstrukciókkal egy primer transzlációs termék kifejeződését eredményezi, amely az idegen gén által kódolt struktúr-fehérjét tartalmazza a BARI szignál-peptiddel fuzionálva, úgy, hogy a fehérje a gazdasejt szekréciós pályáján készül el, és kiválasztódhat a tenyészközegbe vagy a periplazmás térbe.

Különböző prokarióta és eukarióta mikroorganizmusokat alkalmaztak heterológ polipeptidek előállítására rekombináns DNS metodika révén, azaz olyan polipeptidek előállítására, amelyeket a gazdaszervezet természetes módon nem termel. Különböző eukarióta gombafajok különösen érdekesek, ezek közé tartoznak a Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus és Neurospora. Különösen sok munkát fektettek a S. cerevisiae sarjadzó élesztőbe. Az élesztősejteket, amikor megfelelő DNS konstrukciókkal, pl. valamely plazmiddai transzformálták, rábírták, hogy kifejezzék a plazmidban lévő heterológ géneket. Ennek a technológiának a jelentős korlátja az, hogy a fehérje termékek sok esetben nem választódnak ki a tenyészközegbe a gazdasejt révén, és így szükséges a sejtek szétzúzása, és a kívánt fehérje megtisztítása a különböző szennyező komponensektől anélkül, hogy denaturálódnának vagy inaktiválódnának. így kívánatos lenne, ha képesek lennénk a transzformált sejteket úgy irányítani, hogy kiválasszák a heterológ terméket, amely egyszerűsítené ennek a terméknek a tisztítását. Ezenkívül az is kívánatos lenne néhány fehérjénél, ha belépne a gazdaszervezet szekréciós pályájába, hogy könnyebb legyen a megfelelő további feldolgozás, azaz a diszulfid-híd képződés.

A S. cerevisiae-ről ismert, hogy kiválaszt néhányat természetes úton termelt fehérjéi közül, bár a folyamatról az ismeretek ugyancsak korlátozottak azokhoz az ismeretekhez viszonyítva, amelyet a fehérjék kiválasztásáról tudunk a baktériumokban és az emlős sejtekben. Úgy tűnik, hogy a kiválasztott élesztő fehérjék többsége enzim, amelyek a periplazmás térben maradnak, bár az invertáz és savas foszfatáz enzimek beépülhetnek a sejtfalba is. Azok között a fehérjék között, amelyekről ismeretes, hogy a S. cerevisiae révén kiválasztódnak a tenyészközegbe, találjuk a párosodási feromonokat (α-faktor és a faktor), a gyilkos toxint és a gát (barrier) aktivitásáén felelős fehérjét (amelyet ezután „barrier”-nek nevezünk). A kiválasztást a sejtfalon keresztül a tenyészközegbe ezentúl „export”-nak nevezzük. A S. cerevisiae párosodási típusú a sejtek a-faktort termelnek, míg az a sejtek két kiválasztott polipeptidet termelnek, az a faktort és a barriert. Az α-faktorhoz tartozó gént már klónozták, szekvenciáját meghatározták, és elemezték [lásd Kurjan és Herskowitz: Cell 30, 933-943 (1982)]. A szignál pepiidet (rövid peptid-szekvencia, amelyről úgy véljük, hogy irányítja a sejtet egy kapcsolt fehérje kiválasztására), a vezető szekvenciát (amely olyan prekurzor polipeptidet tartalmaz, amely lehasad az érett a-faktontol), és a le nem fordított génszekvenciákat (beleértve a promotor és szabályozó területeket) az α-génből használhatjuk az élesztőben termelt idegen fehérjék kiválasztásának irányítására [Brake és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4642-4646 (1984)]. Az a-faktor gén kifejeződést a ΜΑΤ 1 géntermék szabályozza, és az α-faktor prekurzor feldolgozásáról, amely, úgy tűnik, legalább két lépést igényel, úgy véljük, hogy az STE13 és KEX2 gének szabályozása alatt áll.

Az α-faktorral ellentétben a barrierről úgy tűnik, hogy glikozilezve van, arra a képességére alapozva, hogy köti a konkanavalin A-t. A barriert a sejtek termelik, és a kifejeződés - úgy tűnik - az MÁT 2 gén szabályozása alatt áll. A lehetséges szignál-pepiid lehasítás kivételével eddig még nem mutatták ki a barrier prekurzor feldolgozását, és úgy véljük, hogy az STE13 és KEX2 gének nem érdekeltek a barrier kifejeződésében.

A fenti különbségek következtében az α-faktor és a barrier kifejeződésének és feldolgozásának szabályozásában nem lehet meghatározni a priori: ezek közül az élesztő-gének közül melyik illik jobban egy adott idegen fehérje kiválasztásának irányítására. Mivel úgy tűnik, hogy a két fehérje eltérő szekréciós pályán dolgozódik ki, kívánatos lenne felderíteni a barrier szekréciós rendszerjellemzőit.

Ennek megfelelően a jelen találmány egyik tárgya olyan DNS konstrukciókat szolgáltatni, amelyek a BARI gén olyan szegmensét tartalmazzák, amely legalább a szignál pepiidet kódolja, és tartalmaz egy idegen struktúrgént is; ez egy heterológ fehérje kifejeződését eredményezi egy mikrobiális gazdaszervezetben, amely fehérje a gazdasejt szekréciós pályáján keresztül dolgozódik fel.

A jelen találmány további tárgya eljárást nyújtani idegen gének kifejezésére mikrobiális gazdaszervezetben, amely egy ilyen gén áltat kódolt heterológ fehérjét vagy ennek egy részét eredményezi; ez a fehérje a gazdasejt szekréciós pályáján keresztül dolgozódik fel.

A jelen találmány egy másik tárgya eljárást nyújtani idegen fehérjék előállítására, amelyek mikrobiális gazdaszervezetből választódnak ki.

A jelen találmány egy még további tárgya eljárást nyújtani idegen fehérjék előállítására rekombináns DNS technológiával.

A jelen találmány egy másik tárgya eljárás olyan fehérjék előállítására rekombináns DNS technológia révén, amelyek humán proinzulin és inzulin aminosavszekvenciáival rendelkeznek.

A találmánynak ezek és más tárgyai nyilvánvalóak lesznek a speciális kiviteli módok itt következő leírásából és az igénypontokból.

A jelen találmány olyan DNS konstrukciókra és ezeket alkalmazó eljárásokra irányul, amely konstrukciók legalább a Saccharomyces cerevisiae BARI gén szignál pepiidet kódoló szekvenciáját, legalább egy, a gazdaszervezet számára idegen struktúrgént, és egy olyan prompton tartalmaznak, amely promotor szabá2

HU 206 897 B lyozza egy BARI szignál pepiidet és az idegen pepiidet tartalmazó fúziós fehérje kifejeződését egy gazdaszervezetben.

A mellékelt ábrákat az alábbiakban röviden ismertetjük.

Az 1. ábra mutatja be a BARI gén nukleotidszekvenciáját és a primer transzlációs termék leszármaztatott aminosavszekvenciáját. A MÁT 2 kötőhely alá van húzva, a vélt szignál peptid hasítási helyét nyíllal jelöljük, és a lehetséges glikozilezési helyeket csillaggal jelöljük.

A 2. ábra a pZV9 plazmid diagramja.

A 3. ábra a p254 plazmid megalkotását mutatja be.

A 4. ábra a pZV30, pZV31, pZV32 és pZV33 plazmidok megalkotását mutatja be.

Az 5A. és 5B. ábrák a pZV plazmid megalkotását mutatják be.

A 6. ábra az mll5 plazmid megalkotását mutatja be.

A 7. ábra a pZV49 plazmid megalkotását mutatja be.

A 8. ábra a TPI1 promotort tartalmazó pZV134 plazmid megalkotását mutatja be.

A 9. ábra az MF 1 gén egy részének a szubklónozását mutatja be.

A 10. ábra a pZV75 plazmid megalkotását mutatja be.

All. ábra a TPI1 promotor és BAR1-/WF 1 fúzióját tartalmazó plazmidok megalkotását mutatja be.

A 12. ábra a pSW22 plazmid megalkotását mutatja be.

A 13. ábra a BAR1-MF 1 fúziókat tartalmazó plazmidok megalkotását mutatja be.

A 14. ábra a pZVIOO plazmid megalkotását mutatja be.

A 15. ábra a pZV102 plazmid megalkotását mutatja be.

A 16. ábra a pSW96 plazmid megalkotását mutatja be.

A 17. ábra a pSW 97 plazmid megalkotását mutatja be.

A 18. ábra a pSW98 és pSW99 plazmidok megalkotását mutatja be. Δ jelzi a mutációt a 25. kodonnál.

Ahogyan itt használjuk, a „DNS konstrukció” bármilyen olyan DNS molekulát jelent, beleértve pl. egy plazmidot is, amely emberi beavatkozással módosult olyan módon, hogy a molekulában levő nukleotidszekvencia nem azonos azzal a szekvenciával, amely a természetben keletkezett. A „DNS konstrukció” kifejezés magában foglalja olyan DNS molekulák kiónjait is, amelyek ilyen módon módosultak. A „kifejező vektor” vagy „kifejező plazmid” kifejezést úgy határozzuk meg, mint olyan DNS konstrukciót, amely magában foglal egy átírási iniciációs helyet és legalább egy, a szóban forgó fehérjét kódoló struktúrgént, amely kifejezendő a gazdaszervezetben. Egy kifejező vektor általában tartalmaz még olyan megfelelő területeket is, mint pl. promotort és terminátort, amelyek irányítják a szóban forgó fehérje kifejeződését a gazdaszervezetben, valamint egy replikációs origót. A jelen találmány szerinti kifejező vektorok általában tartalmaznak egy szelektálható markert is, pl. antibiotikum rezisztenciához vagy táplálkozási markerhez tartozó gént.

A „DNS konstrukció” kifejezést úgy is tekintjük, hogy a gazda kromoszómákba integrált kifejező vektor részeit foglalja magában.

A „plazmid” kifejezésnek egy általánosan elfogadott jelentése, azaz ez egy függetlenül replikálódó DNS konstrukció, amely általában zárt hurkot képez.

A „szignál peptid” kifejezés egy primer transzlációs terméknek arra a részére vonatkozik, amely a terméket annak a sejtnek a szekréciós pályájára irányítja, amely termeli ezt. A szignál peptid általában lehasad a naszcens polipeptid többi részéről egy szignál peptidáz révén ennek az eljárásnak a folyamán. A szignál pepiidet hidrofób aminosavak jelenléte jellemzi középen; a szignál peptid a primer transzlációs termék amino-terminálisánál fordul elő, és általában 17-25 aminosav hosszúságú. A szignál peptidáz hasítási helyeket Heinje jellemezte [Eur. J. Biochem. 133,17 (1983)]. Ahogyan itt alkalmazzuk, a „szignál peptid” vonatkozhat a természetben előforduló szignál peptid funkcionális részeire is.

A jelen találmány eljárást nyújt transzformált sejtek irányítására, hogy heterológ fehérjéket irányítsanak egy szekréciós pályán keresztül; ezt úgy hajtjuk végre, hogy egy gazdaszervezetet olyan DNS konstrukcióval transzformálunk, amely egy idegen gént tartalmaz az élesztő BARI génnel vagy ennek egy részével összekapcsolva, ahol a BAR 1 gén nevezett része legalább a BARI szignál pepiidet kódolja. Az így előállított fehérjék kiválasztódhatnak a periplazmás térbe vagy a tenyészközegbe. Az élesztő BARI gén kódolja a barrier aktivitású fehérjét (barrier), amelyről úgy véljük, hogy a S. cerevisiae a sejtek által kiválasztott, glikozilezett fehérje. A kiválasztott barrier lehetővé teszi a párosodó a típusú sejtek számára, hogy felülkerekedjenek az α-faktor által indukált fékező hatáson. Úgy vélik, hogy a barrier valószínűleg proteáz [lásd Manney: J. Bacteriol. 155, 291-301 (1983)]. A BARI gén átírását az α-faktor stimulálja. Barrier- vagy ezzel analóg aktivitást nem mutatunk ki a vagy a/a sejtekben, és a BARI gén nem íródik át ezekben a sejttípusokban.

A 2750 bázispáros, a BARI gént tartalmazó gént az

1. ábrában mutatjuk be, a primer transzlációs termék ebből leszármaztatott aminosavszekvenciájával együtt. A BARI ATG transzlációs iniciációs helye az 1. ábrában bemutatott mintegy 2,75 kb-s fragmentum, amelyet egy élesztő genom könyvtárból kapott fragmentumból szubklónoztunk, 681. helyénél van [Nasmyth és Tatchell: Cell 19, 753-764 (1980)]. Egy nyitott leolvasó keret kezdődik az ATG kodonnál a +l-nél és 1761 bp-n át terjed a 3’ irányban. A BARI primer transzlációs termék első 24 aminosava, úgy tűnik, hasonló az ismert élesztő és emlős szignál peptidekhez, így az alanint a 24. helyzetnél lehet hasítási helyként alkalmazni, élesztő invertázzal és savas foszfatázzal. Hasítás történhet a 23. aminosav után is. Legalább kilenc, aszparigonhoz kötött glikozilező hely létezik a primer transzlációs termékben, bár az érett, kiválasztott

HU 206 897 Β barrier glikozilezésének mértéke még nem ismeretes. A BARI gén promotor és regulától- területei a transzlációs iniciációs kodon 5’ oldalán levő mintegy 680 bp-s területen belül helyezkednek el. A teljes promotor működés és α-faktor stimulálásra adott válasz az 5’-le nem fordított terület mintegy 680 bp-s, ATG-közeli területére lokalizálődik.

A jelen találmány szerinti DNS konstrukció előnyösen egy hasítási helyet kódol a barrier és az idegen fehérje részek csatlakozásánál. Egy ilyen előnyös hely egy KEX2 hasítási hely, egy olyan aminosavszekvencia, amelyet a S. cerevisiae KEX2 gén terméke felismer és elhasít [Julius és munkatársai: Celi 37, 1075-1080 (1984)]. AKEX2 helyet bázisos aminosavak párja jellemzi, ilyen pár pl. a lizin és az arginin. Előnyös, ha a KEX2 hely szekvenciája Lys-Arg vagy Arg-Arg. A BARI primer transzlációs termék két ilyen párt tartalmaz a struktíír-területben elhelyezve: Arg-Arg-ot a 177-178. helynél és Lys-Lys-t a 404—405. helynél. Amint fentebb megjegyeztük, a KEX2 gén nem érdekelt a barrier prekurzor gén feldolgozásánál, azt sugallva, hogy a lehetséges feldolgozási helyek gátolva vannak a fehérje-konformáció vagy glikozilezés miatt, továbbá azt sugallja, hogy a barrier normálisan olyan pályán dolgozódik fel, amely különbözik attól, amelyet az ilyen KEX2 által feldolgozott fehérjéknél, mint az α-faktomál alkalmazunk. A jelen feltalálók azonban arra jöttek rá, hogy egy KEX2 feldolgozó helyet a BARI gén primer transzlációs termék egy részét amely ennek szignál peptidjét tartalmazza a szóban forgó fehérjével együtt - tartalmazó fúziós fehérjébe zárva a fúziós fehérje elhasad a KEX2 helyen, a szóban forgó fehérje kiválasztását eredményezve. Arra is rájöttünk, hogy a KEX2 hasítási helyet tartalmazó fúziós fehérje barrier-részének szignál-peptidáz hasítása hatékonyságának csökkentésével a szóban forgó fehérje megnövekedett szintjei exportálódnak. A KEX2 hasítási helyet a BARI szekvenciával, vagy a szóban forgó génnel lehet szolgáltatni, vagy kapcsoló (linker) hozzáadásával, hely-specifikus mutagenezissel stb. lehet bevezetni a fúziós termékbe.

így a jelen találmány szerint a BARI gén ATG iniciációs kodont és a szignál pepiidet kódoló szekvenciáját tartalmazó részét egyesíthetjük egy adott idegén génnel, és ezt transzformálhatjuk egy élesztő vagy fungus gazdaszervezetbe. Az így létrejövő fúziós gén magában foglal egy feldolgozó helyet, előnyösen egy KEX2 hasítási helyet, a BARI és az idegen szekvenciák csatlakozásánál. Egy ilyen konstrukció tartalmazhat szabályozó területeket és a promotort is a BAR 1 gén 5’ nem -kódoló területéből, vagy tartalmazhat szabályozó területeket és/vagy promotorokat más génekből. A BARI génből származó promotoron kívül más prornotorok, amelyek alkalmazhatók, lehetnek pl. a S. cerevisiae alkohol dehidrogenáz I. vagy alkohol dehidrogenáz II. génekből számlázó promotorok, a S. cerevisiae glikolitikus pálya génjeinek promotorjai, és más fajok megfelelő génjeinek promotorjai, a fajok közé beleértve az osztódó Schizosaccharomyces pombe élesztőt [Russell és Hall: J. Bioi. Chem. 258, 143-149 (1983);

A „

Russell: Natúré 30/, 167-169 (1983)]. A S. cerevisiae alkohol dehidrogenáz I. gént Ammerer írta le [Methods in Enzymology SOI,192-201 (1983)].

Az alkohol dehidrogenáz II. gént Russell és munkatársai írták le [J. Bioi. Chem. 258, 2674-2682 (1983)]. A S. cerevisiae glikolitikus génjeit Kawasaki [Doktori értekezés, University of Washington (1979)], Hitzeman és munkatársai [J. Bioi. Chem. 225, 12073-12080 (1980)], Kawasaki és Fraenkel [Biochem. Biophys. Rés. Comm. 108, 1107-1112 (1982)], valamint Alber és Kawasaki [J. Mól. Appl. Génét. /, 419-434 (1982)] írták le.'

Egy előnyös kiviteli módban a BARI gén szignál peptid kódoló szekvenciáját megváltoztatjuk, hogy lecsökkentsiik a KEX2 hasítási helyet tartalmazó fúziós fehérje barrier része szignál peptidáz hasításának hatékonyságát. Ezt a lehetséges hasítási helyek helyspecifikus mutagenezisével hajtjuk végre, előnyösen a barrier fehérje szekvencia 23-24. aminosavainál levő csatlakozásnál vagy 24—25. aminosavainál levő csatlakozásnál található hasítási helyeknél.

A jelen találmány szerinti DNS konstrukciók képzéséhez alkalmazott módszerek hagyományos technikákat foglalnak magukban. A strukturális BARI gén vagy része és a kifejezendő struktúrgén előnyösen egy egyedi promotor irányítása alatt vannak. A DNS fragmentumok ligálásának módszerei részletesen le vannak írva, és a szakterületen jártas szakemberek köteles tudásán belül van, hogy kivitelezzék ezeket. A kifejezendő fehérjét kódoló DNS szekvencia lényegében bármilyen fehérjét kódoló DNS szekvencia lehet, főleg azonban olyan kereskedelmi fontosságú fehérjéket kódoló génekről van szó, mint az interferonok, inzulin, proinzulin, α-1-antitripszin, növekedési faktorok, és szöveti plazminogén aktivátor.

A BARI gént vagy egy részét és a kifejezendő struktúrgént tartalmazó DNS konstrukció előállítása után a konstrukciót a gazdaszervezetbe transzformáljuk transzformáló körülmények között. A prokarióták és eukarióták (beleértve az emlős sejteket is) transzformálására szolgáló technikák az irodalomból ismeretesek.

A gazdaszervezet előnyösen a Saccharomyces cerevisiae sarjadzó élesztő egyik törzse, de más gombák is alkalmazhatók, pl. Schizosaccharomyces pombe osztódó élesztő és az Aspergillus nidulans és Neurospora species fonalas gombák.

Az ezután következő példákat csak példaként hozzuk fel és nem korlátozás céljából. Hacsak másképpen nem jelezzük, mindenütt standard molekuláris biológiai módszereket alkalmazunk. A restrikciós endonukleázokat a Bethesda Research Laboratories-ből, a New England Bioiabs-tól, és a Boebringer-Mannheim Biochemicals-tól szerezzük be, és úgy alkalmazzuk ezeket, ahogyan a gyártó előírja, az emésztett anyagokhoz általában pankreász eredetű RN-áz hozzáadásával (I0pg/ml). A T4 DNS ligázt a Bethesda Research Laboratories-ből vagy a Boehringer-Mannheimtől szerezzük be, és az általuk adott útmutatás szerint alkalmazzuk. Az M13 és pUC gazdatörzseket és vektorokat a Bethesda Research Laboratóries-től szerezzük be. Az

HU 206 897 B

M13 klónozását úgy végezzük, ahogyan ezt Messing leírta [Methods in Enzymology 101,20-77 (1983)]. A DNS polimeráz I-et (Klenow- fragmentum) úgy használjuk, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás: Laboratóriumi Kézikönyv), Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Az E. coli tenyészeteket Bolivár és munkatársai módszerével transzformáljuk (Gene 2,95-113 (1977)]. A S. cerevisiae tenyészeteket Beggs módszerével transzformáljuk [Natúré 275,104— 108 (1978)], McKay módosítását alkalmazva [Methods in Enzymology 101, 325 (1983)]. A S. pombe-t a Russell által leírt módszemel transzformáljuk [Natúré 301, 167-169 (1983)]. A párosodási feromon a-faktort Duntze és munkatársai módszerével állítjuk elő [Eur. J. Biochem. 35, 357-365 (1973)], amint azt Manney és munkatársai módosították [J. Cell Bioi. 96,1592-1600 (1983)], vagy a Sigma Chemical Co.-tól vásároljuk. Az oligonukleotidokat Applied Biosystems Model 380A típusú DNS szintetizátoron szintetizáljuk és poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítjuk denaturáló géleken.

Módszerek

A barrier aktivitás mérése

A transzformált élesztősejtek által végzett barrier termelés kimutatásához alkalmazott vizsgálat a barriernek azon a képességén alapul, hogy közömbösíti az α-faktomak kitett érzékeny a sejtek növekedésének gátlását. A vizsgáló törzs olyan, amely rendkívül érzékeny az α-faktorra, mint pl. az RC629 (MATa bari) törzs, mivel ez nem termel barrier aktivitású anyagot.

Ez a törzs a ZymoGenetics Inc.-től (Seattle, Washington) szerezhető be. Élesztő-mezőt készítünk ilyen törzset alkalmazva lágy agar fedőrétegben, a fedőréteg agar lemezen van. Megfelelő mennyiségű a-faktort (0,05-0,1 egység, Manney módszere szerint mérve, lásd a fentebb idézett munkát) adunk a fedőréteghez, hogy gátolja a sejtek növekedését A barrier termelésre átvizsgált transzformánsokat azután az élesztő-mezőre átoltjuk. A transzformált sejtek által kiválasztott barrier semlegesíti az α-faktor növekedésgátlását közvetlenül a folt környezetében, ezáltal lehetővé válik, hogy az érzékeny sejtek magukhoz térjenek. Ezeket a megújult sejteket úgy figyeljük meg, mint növekedési szegélyeket a transzformáit sejtek normálisan egyenletes telepszélei körül. Ezeknek a szegélyeknek a jelenléte azt jelzi, hogy a transzformált törzsben a plazmid irányítja a barrier kifejeződését és kiválasztódását.

IRI és IRC vizsgálatok

Az IRI és IRC vizsgálatokat kereskedelmi vizsgáló készletet alkalmazva hajtjuk végre (Novo Industri, Bagsvaerd, Dánia). Tengerimalac anti-sertés inzulin és tengerimalac antihumán C-peptid antitesteket szolgáltatnak a készlettel együtt.

Vizsgálat IRl-hez

50μ1 minta NaFAM-ban [0,04 mól/1 foszfát puffer (pH 7,4), amely szarvasmarha szérum albumint is tartalmaz];

50μ1 antitest (törzsoldat 1:30 arányban hígítva);

16-24 óra 4 °C hőmérsékleten;

50μ1 ¹²⁵I-inzulin (1; 100 arányban hígítva);

óra 4 °C hőmérsékleten;

50μ1 1%-os Staphylococcus aureus NaFAM-ban;

perc 0 °C hőmérsékleten;

Mosás kétszer 1% BSA/TNEN-ben [a TNEN összetétele: 20 mmól/1 trisz (pH 8,0), 100 mmól/1 NaCl, 1 mmól/1 EDTA, 0,5% NP-40];

Centrifugálás és az üledék számlálása.

A különböző lépéseket kényelmesen lehet végezni mikrotitráló edényzetben, amíg az üledéket át nem visszük a szcintillációs csövekbe.

Vizsgálat ÍRC'hez 50μΙ minta NaFAM-ban;

50μ1 antitest (törzsoldat 1:50 arányban hígítva);

16-24 óra 4 °C hőmérsékleten;

50μ1 ^l25I-C-peptid (törzsoldat 1:30 arányban hígítva); 2-4 óra 4 °C hőmérsékleten;

50μ1 1%-os S. aureus NaFAM-ban;

perc 0 °C hőmérsékleten;

Mosás kétszer 1%-os BSA/TNEN-ben;

Centrifugálás és az üledék számlálása.

Az alfa-faktor aktivitás mérése

A transzformált sejtek által előidézett α-faktor export kimutatására alkalmazott vizsgálat az a-faktornak azt a képességét alkalmazza, hogy gátolja az érzékeny a sejtek növekedését. A vizsgáló törzs [mint pl. a S. cerevisiae RC629 (AZATa bari) törzs] olyan mutációt tartalmaz a BARI génben, amely megakadályozza barrier aktivitású anyag keletkezését és a sejtet szuperérzékennyé teszi α-faktorra. A vizsgáló törzs élesztő-mezejét készítjük el lágy agar fedőrétegben, amely fedőréteg standard, élesztőre szelektív szintetikus tápközeg (pl. leucint nélkülöző tápközeg) lemezen helyezkedik el. Az α-faktor exportra átvizsgálandó transzformánsokat átoltjuk erre a mezőre, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A transzformánsok által kiválasztott a-faktor a növekedés gátlását idézi elő a telepet közvetlenül körülvevő élesztő-mezőben. A növekedésgátlás udvara a vizsgálati sejtek mezejében azt jelzi, hogy a telep aktív α-faktort exportál. Az udvar-méretek összehasonlítása lehetővé teszi az egyes transzformánsok által exportált α-faktor relatív mennyiségeinek becslését.

1. példa

Proinzulin kifejeződése S. cerevisiae-ben, a BARI gént alkalmazva.

Teljes élesztő-genomot tartalmazó rekombináns plazmidgyűjteményt alkotunk meg [Nasmyth és Tatchell: Cell 19, 753-764 (1980)], az YEpl3 „ingázó” vektort alkalmazva [Broach és munkatársai: Gene 8, 121-133 (1979)]. A részleges Sau3A emésztés útján termelt élesztő DNS fragmentumokat BamHI-gyel emésztett YEpl3-ba iktatjuk be. A részleges emésztést úgy végezzük, hogy a DNS-t a Sau3A három különböző koncentrációjával (0,5,1,0 és 2,0 relatív egységek) emésztjük részlegesen úgy, hogy a fragmentumok át5

HU 206 897 B lagmérete 10 kilobázis legyen [ilyen emésztést ír le Nasmytb és Reed az alábbi irodalmi helyen: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2113-2123 (1980)]. A plazmid gyűjteményt S. cerevisiae XP635-10C (ΜΑΤά leu2-3 /e«2-112 harl-1 ga/2; ATCC 20679) törzs transzformálására alkalmazzuk, és transzformánsokat választunk ki leucin prototrófiára és növekedésére a-faktor olyan koncentrációjánál, amely gátló hatású az a bari sejtekre. Az így létrejött telepeket azután átvizsgáljuk arra a képességükre, hogy barrier aktivitású anyagot választanak ki. Két olyan telepet találunk, amely hordoz mind leucin-függetlenséget, mind barrier-kiválasztó képességet. Ezek a telepek a pBAR2 és pBAR3 jelzésű plazmidot hordozzák.

Az ebből a két transzformánsból izolált plazmid DNS-t alkalmazzuk E. coli RRI törzs (ATCC 31 343) transzformálására. A transzfonnánsokal ampicillin rezisztenciára választjuk ki. A pBAR2 és pBAR3 plamzidokat az E. coli transzformánsokból megtisztítjuk, és restrikciós endonukleázos emésztéssel, és agaróz vagy akrilamid géleken végzett elektroforézissel jellemezzük. A pBAR2 plazmidról kimutatjuk, hogy tartalmaz egy mintegy 9,2 kilobázisos beiktatást. A pBAR2 plazmiddal transzformált E. coli RRl-et az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 39 410 letéti számon.

A szubklónozás azt mutatja, hogy a pBAR3 plazmid beiktatás a pBAR2 beiktatás egy részét tartalmazza, de az irányítottsága a vektorban ellenkező irányú. A további szubklónozás és barrier-kiválasztásra való átvizsgálás a funkcionális BARI gén szekvenciát egy mintegy 2,75 kb-s területre lokalizálja. Ez a fragmentum tartalmazza a kódoló szekvenciát, át nem fordított szekvenciákat, promotort, szabályozó területeket, átírási terminátort és szegélyező kromoszómái is szekvenciákat.

A pBAR2 plazmidot HindlII és Xhol restrikciós endonukleázokkal emésztjük és egy mintegy 3 kb-s fragmentumot tisztítunk agaróz gélen végzett elektroforézissel. Ezt a fragmentumot pUC13 plazmidba iktatjuk, amelyet előzőleg HindlII-mal és Sall-gyel emésztettünk. Az így létrejött rekombináns plazmidot, amelyet pZV9-nek nevezünk (2. ábra), alkamazhatjuk E. coli transzformálására, de egy élesztő vektorhoz szükséges replikációs origó és szelektálható marker hiányzik. A pZV9 plazmidot E. coli RRI transzformáns törzsben helyeztük letétbe az ATCC-nél, ATCC 53 283 letéti számon.

A proinzulin kiválasztásának irányítására alkalmazandó BARI génhez a BARI génnek az 5’ területet és a kódoló szekvencia egy részét tartalmazó fragmentumait alkalmazzuk. A BARI és proinzulin gén fragmentumok fúzióját a megfelelő leolvasó keretben végezzük és annál a pontnál a BARI szekvenciában, amelynél a létrejövő fúziós polipeptidet elhasíthatjuk, előnyösen in vivő. A BARI génben számos hely potenciális hasító hely; az Arg-Arg-ot a 177-178. helyen választjuk ki a fúzió vizsgáló helyeként proinzul innál. Következésképpen a BARI 5’ szabályozó szekvenciáit és mintegy 800 bp-s kódoló szekvenciáját tisztítjuk a pZV9 plazmádból 1,9 kb-s HindlII-Sall fragmentumként.

A 3. ábrára utalva bemutatunk egy módszert humán preproinzulin cDNS szubklónozásra. Egy humán preproinzulin cDNS-t (preBCA klón), a p27-et állítjuk elő Pstl-gyel emésztett pBR327 G-farokképzésével és Cfarokkal ellátott DNS beiktatásával, amelyet emberi hasnyálmirigyből kapott teljes RNS fordított átírásával készítünk. A pBR327-et Soberon és munkatársai írják le [Gene 9, 287-305 (1980)], míg a humán preproinzulin szekvenciájáról Bell és munkatársai számolnak be [Natúré 232, 525-527 (1979)]. A teljes lefordított szekvenciát Ncol-Hgal fragmentumként hasítjuk ki. A kinyúló végeket betöltjük DNS-polimeráz I-gyel (Klenow-fragmentum), és szintetikus EcoRI kapcsolókat (GGAATTCC) és Xbal kapcsolókat (CTCTAGAG) rögzítünk hozzájuk egyidejűleg. A szintetikus kapcsolók a New England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachussets, USA) cégtől szerezhetők be. Az így kapott fragmentumokat pUC 13-ba klónozzuk [Viera és Messing: Gene 19, 259-268 (1982); és Messing: Meth. in Enzymology 101, 20-77 (1983)], amelyet előzőleg EcoRIgyel és Xbal-gyel hasítottunk. Mivel egy EcoRI kapcsoló hozzáadása az 5’ végnél helyreállítja az Ncol helyet (CCATGG) az iniciációs kodonnál, a plazmidokat átvizsgáljuk egy 340 bp-s beiktatást szegélyező EcoRI, Ncol és Xbal helyek jelenlétére. Egy plazmidot, amely ilyen tulajdonságokkal bír, p47-nek nevezünk; ezt a 3. ábrában mutatjuk be. Egy proinzulin (BCA) fragmentumot tompa 5’ véggel alakítunk ki a p47 plazmid primer helyreállító szintézisével [Lawn és munkatársai: Nuc. Acids Rés. 9, 6103-6114 (1981)]. Az Xbal-gyel ezt követően végzett emésztés egy 270 bp-s fragmentumot termel, amelyet pUC 12-be iktatunk be (Viera és Messing, fentebb idézett munka; és Messing, fentebb idézett munka). A vektort úgy készítjük elő, hogy HindlII-mal elhasítjuk, DNS polimeráz Igyel (Klenow-fragmentum) a végeket tompává teszszük, Xbal-gyel hasítjuk, végül pedig gélen tisztítjuk. Azután az így létrejött vektor fragmentumot, amely egy tompa véget és egy Xbal tapadós véget tartalmaz, a fentebb leírt BCA fragmentumhoz ligáljuk. Mivel az érett BCA fenilalanin aminosavval kezdődik (TIT kodon), a két fragmentum tompa-vég ligálása regenerál egy HindlII helyet a csatlakozásnál. A plazmidokat átvizsgáljuk először a HindlII hely visszanyerésére, majd szekvencia-sorrendre a csatlakozások mentén, M13 szekvenciaképző prímért alkalmazva. A p254 plazmid rendelkezik a korrekt szekvenciával.

A 4. ábrára utalva, p254 plazmidot emésztünk Hindlll-mal és EcoRI-gyel, és a mintegy 270 bp-s proinzulin fragmentumot gélen tisztítjuk. A fragmentum-végeket tompává tesszük DNS polimeráz I-et (Klenowfragmentum) és dezoxinukleotid tri foszfátokat alkalmazva. Sáli kapcsoló szekvenciákat (GGTCGACC) kezelünk T4 polinukleotid kinázzal és y-³²P-ATP-vel, és ligáljuk a tompa végűvé tett proinzulin fragmentumokhoz. Sall-gyel és BamHI-gyel végzett emésztés, •amelyet 1,5%-os agaróz gélen végzett elektroforézis követ, Sáli és BamHl kohezív végekkel ellátott proinzulin fragmentumot termel.

A proinzulin fragmentumot és az 1,9 kb-s BARI

HU 206 897 B fragmentumot együtt ligáljuk pUC13-ba, amelyet előzőleg HindlII-mal és BamHI-gyel emésztettünk. Ezt a konstrukciót alkalmazzuk E. coli K12 (JM83) transzformálására. Ez a törzs a Boehringer Mannheim Biochemicals cégtől (Indianapolis, Indiana, USA) szerezhető be (katalógusszám: 1013-084).

A transzformált törzseket ampicillin rezisztenciára és fehér telepek képzésére átvizsgáljuk. A HindlII-at, BamHI-et és Sall-et alkalmazó restrikciós endonukleázos emésztéssel végzett további átvizsgálás egy olyan plazmidot (pZV27) azonosít, amely egy megfelelő méretű HindlH-BamHI fragmentumot és egy egyedi Sáli helyet tartalmaz.

Abból a célból, hogy a proinzulin első aminosavát hozzákössük a BARI géntermék Arg-Arg potenciális feldolgozó helyéhez, a BARl-proinzulin fúzióba beavatkozó anyagot kiiktatjuk. Egy szintetikus oligonukleotidot alkalmazunk, hogy irányítsa ennek az ide nem tartozó anyagnak a kiiktatását az alábbi módon. A 4. ábrára utalva, a pZV27 plazmidot emésztjük HindlII-mal és BamHI-gyeI, és a mintegy 2,2 kb-s BARl-proinzulin fúziós fragmentumot gélen tisztítjuk. Ezt a fragmentumot azután beiktatjuk az M13mpl 1 fág vektor [Messing: Meth. in Enzymology 101,20-77 (1983)] replikatív formájába, amelyet előzőleg HindlII-mal és BamHI-gyel emésztettünk. Ezt a rekombináns DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 (JM 103) átfertőzésére (lásd Messing, fentebb idézett munka). Ez a törzs a Boehringer Mannheim Biochemicals cégtől (Indianapolis, Indiana, USA) szerezhető be (katalógusszám: 1013-076). Fehér tarfoltokat szúrunk fel, és a rekombináns fág replikatív formáit átvizsgáljuk a korrekt restrikciós mintára enzimes emésztéssel, HindIII+Sall-et és Sall+BamHI-et alkalmazva. A kívánt mintát mutató konstrukció mpll-ZV29-ként ismert. Az oligonukleotid prímért (szekvencia: 3’-GGATCTTCTAAACACTTG-5’) jelezzük y-^P-ATP-t és T4 polinukleotid kinázt alkalmazva. 7,5 pmól kinázzal kezelt prímért egyesítünk 80 ng M13 szekvenáló primerrel (Bethesda Laboratories, Inc.). Ezt a keveréket összeforrasztjuk 2pg egyszálú mpll-ZV29-cel, és a második szálat kiterjesztjük, T4 DNS ligáztés DNS polimeráz I-et (Klenow-fragmentum) alkalmazva, amint ezt az oligonukleotid-irányított mutagenezissel (kettős primer módszer) Zoller és munkatársai leírták [Manual fór Advanced Techniques in Molecular Cloning Course (Kézikönyv a haladó technikákhoz a molekuláris klónozás folyamatában), Cold Spring Harbor Laboratory (1983)]. Az ezen az úton készített DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 (JM103) átfertőzésére, és tarfoltokat vizsgálunk át a kinázzal kezelt oligomert alkalmazva vizsgáló mintaként (Zoller és munkatársai, fentebb idézett munka). Az így azonosított tarfoltokat alkalmazzuk fág replikatív forma (RF) DNS előállításához (Méssing, fentebb idézett munka). Az RF DNS restrikciós enzimes emésztése két kiónt azonosít, amelyek rendelkeznek a megfelelő Xbal restrikciós mintával (7,5 kb-s, 0,81 kb-s és 0,65 kb-s fragmentumok), és amelyekből hiányzik a Sáli restrikciós hely (amely a BARlproinzulin fúziós tennék kiiktatott területében van jelen).

Az RF DNS-t ezekből a kiónokból HindlII-mal és PamHI-gyel emésztjük, és az egyes klónokból kapott

1,9 kb-s fúziós fragmentumokat gélen tisztítjuk. Ezeket a fragmentumokat pUC13 és YEpl3 [Broach és munkatársai: Gene 8, 121-133 (1979)] vektorokba ligáljuk, amelyeket előzőleg HindlII-mal és BamHI-gyel emésztettünk. pUC/BARl-proinzulin hibrid plazmidokat ezt követő szekvenciaelemzéshez alkalmazunk E. coli K12 (JM83) transzformálására. Ezek közül a plazmidok közül kettőt elnevezünk pZV32-nek és pZV33nak. YEpl3 eredetű rekombinánsokat alkalmazunk E. coli RRI transzformálására [Nasmyth és Reed: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2119-2123 (1980)]. Ezek közül a plazmidok közül kettőt elnevezünk pZV30nak, illetve pZV31-nek (4. ábra).

A pZV32 és pZV33 szekvenciaelemzését Maxam és Gilbert módszerével hajtjuk végre [Meth. in Enzymology 65, 57 (1980)]. A BARl-proinzulin fúziós termék szekvenciavizsgálatát a csatlakozás 5’ oldalától mintegy 190 bp-re elhelyezkedő BglII helytől és a csatlakozás (a proinzulin génben) 3’ oldalától mintegy 140 bp-re elhelyezkedő Sau 961 helytől végezzük. Az ezekből a kísérletekből nyert adatok igazolják, hogy a kívánt fúziót alkottuk meg a BARI és a proinzulin gének között.

S. cerevisiae XP635-10C törzset transzformálunk pZV30 és pZV31 plazmidokkal. 1 liter tenyészetet növesztünk standard élesztő szintetikus tápközegben, amely leucint nem tartalmaz. 34 óra után a-faktort adunk az egyes tenyészetek 10 ml-es alikvotjaihoz. További 11 óra után a tenyészeteket centrifugálással kinyerjük. A sejtüledéket és felülúszókat megvizsgáljuk inzulin vagy inzulinszerű anyag jelenlétére. Két ilyen, pZV31 plazmiddal transzformált tenyészet felülúszóján végzett vizsgálat eredménye 3 pmól IRI anyag/ml tenyészközeget és 5,8 pmól IRC anyag/ml tenyészközeget mutat. Az IRI korrekt módon hajtogatott inzulin, proinzulin vagy ezek bomlásterméke. Az IRC szabad C-peptid, nem korrekt módon hajtogatott proinzulin, vagy ezek bomlásterméke.

2. példa

Proinzulin kifejeződése S. cerevisiae-ban, alkohol dehidrogenáz promotort, BARI gént és trióz-foszfátizomeráz terminátort alkalmazva.

A S. cerevisiae alkohol dehidrogenáz I. promotort (ezután ezt ADHI promotomak nevezzük; ez ismeretes ADCI promotorként is) megvizsgáljuk idegen polipeptidek kifejeződése irányításában való felhasználásra BARI szekvenciákkal együtt. Olyan plazmidot alkotunk meg, amely ezeket a szekvenciákat tartalmazza.

A pZV50 plazmid (5B. ábra) tartalmazza a S. cerevisiae ADHI promotort, a fentebb leírt BARl-proinzulin fúziós terméket, és a S. cerevisiae trióz-foszfát-izomeráz (TPI1) gén terminátor területét [Alber és Kawasaki: J. Molec. Appl. Génét. /, 419-434 (1982)]. Ezt a következő módon alkotjuk meg: Az 5A. ábrára utalva pAH5 plazmidot (Ammerer, fentebb idézett munka) emésztünk HindlII-mal és BamHI-gyel, és az 1,5 kb-s ADHI promotor fragmentumot gélen tisztítjuk. Ezt a fragmentumot a pUC 13-ból származó HindlII-EcoRI polilinker fragmentummal együtt beiktatjuk EcoRI7

HU 206 897 B gyei és BamHI-gyel emésztett pBR322-be, T4 DNS ligázt alkalmazva. Az így létrejött plazmidot, amelyet pAM5-nek nevezünk, Sphl-gyei és Xbal-gyel emésztjük, és a mintegy 0,4 kb-s ADHI promotor fragmentumot 2%-os agaróz gélen tisztítjuk. A pZV9 plazmidot Xbal-gyel emésztjük, és a mintegy 2 kb-s BARI fragmentumot, amely a teljes BARI kódoló területet tartalmazza, hasonlóképpen gélen tisztítjuk. Ezt a két fragmentumot, az ADHI promotort és a BAR 1 szekvenciát Xbal-gyel és Sphl-gyel emésztett YEp 13-ba ligáljuk, hogy a pZV24 plazmidot állítsuk elő. A pZV24 emésztése Sphl-gyel és Bg 111-vel, amelyet gélen végzett tisztítás követ, egy mintegy 800 bp-s fúziós terméket alakít ki, amely tartalmazza az ATG transzlációs rajt kodont, de nélkülözi az Arg-Arg lehetséges feldolgozási helyhez tartozó kodonokat. A pZV33 plazmidot, amely tartalmazza a BARI-proinzulin fúziós terméket, BglIIvel és Xbal-gyel emésztjük, és a fúziós fragmentumot (mintegy 500 bp), amely az Arg-Arg kodonokat tartalmazza, tisztítjuk.

A 6. ábrára utalva a TPI1 terminátort a pFGl plazmidból kapjuk (Alber és Kawasaki, fentebb idézett munka). A pFGl-et EcoRI-gyel emésztjük, a linearizált plazmid végeit tompává tesszük DNS polimeráz I-et (Klenow-fragmentum) alkalmazva, és BamHI kapcsoló szekvenciákat (CGGATCCA) adunk hozzá. A fragmentumot BamHI-gyel emésztjük, és újra ligáljuk, hogy a pl36 plazmidot alakítsuk ki. A 700 bp-s TPI1 terminátort a pl36-ból tisztítjuk, mint Xbal-BamHI fragmentumot. Ezt a fragmentumot beiktatjuk Xbalgyel és BamHI-gyel emésztett YEpl3-ba, amelyet azután HindlII-mal elhasítunk, a végeket tompává teszszük DNS polimeráz I-et (Klenow-fragmentum) alkalmazva, és újra ligáljuk, hogy a p270 plazmidot alakítsuk ki. A TPI1 terminátort a p270-ből tisztítjuk YbalBamHI fragmentumként és beiktatjuk Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztett pUC 13-ba, hogy az ml 15 plazmidot kapjuk meg.

Az 5B. ábrára utalva, a TPI1 terminátort eltávolítjuk az m l 15 plazmidból Xbal-gyel és Sstl-gyel végzett emésztéssel, amelyet gélen végzett tisztítás követ. A három fragmentumot, az ADHI-BAR1 fúziós terméket, BARI-proinzulin fúziós terméket ésTPIl terminátort, pUC18 plazmidba [Narrander és munkatársai: Gene 26, 101-106 (1983)] iktatjuk, amelyet előzőleg Sphlgyel és Sstl-gyel emésztettünk. Ezt a DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 (JM83) transzformálására. Az ampicillin rezisztenciára végzett szelekció és a fehér telepek előfordulására végzett átvizsgálás egy olyan plazmidot (pZV45) azonosít, amely a kívánt beiktatásokat tartalmazza. A pZV45 plazmidot azután Sphl-gyel és BamHI-gyel emésztjük, és az ADHI-BARl-proinzulín-TPI terminátor szekvenciát gélen tisztítjuk. Ezt a fragmentumot YEp 13-ba iktatjuk, amelyet előzőleg Sphl-gyel és BamHI-gyel emésztettünk, így alakítjuk ki a pZV50 S. cerevisiae kifejező vektort.

S. cerevisiae XP635-10C törzset transzformálunk pZV50-nel, és úgy tenyésztjük és vizsgáljuk, ahogyan ezt a fentebbi 1. példában leírtuk. IRI anyagot nem találunk a tenyészközegben, és az IRC anyag kevesebb, mint

0,5 pmól/ml. A 0,1% Nonidet Ρ-40-nel extrahált sejtek 1 pmól/ml sejtextraktum IRC anyagot mutatnak.

3. példa

Proinzulin kifejeződése Schizosaccharomyces pombe-ban, BARI gént és S. pombe alkohol dehidrogenáz promotort alkalmazva.

Ez a példa a BARI gén részleteinek alkalmazását mutatja be egy transzformált Schizosaccharomyces pombe gazdaszervezetben kifejezett idegen polipeptidek kiválasztásának irányítására. Olyan plazmidot alkotunk meg, amely kombinálja a S. pombe alkohol dehidrogenáz (ADH) gén promotort a BARl-proinzulin gén fúziós termékkel.

A S. pombe ADH promotort S. pombe 972h~ (ATCC 24843) törzsből származó DNS fragmentumok könyvtárából kapjuk, amely fragmentumokat előzőleg YEp 13-ba klónoztunk, ahogyan ezt Russell és Hall leírták [J. Bioi. Chem. 258,143-149 (1983)]. A promotor szekvenciát a könyvtárból 0,75 kb-s SphI-EcoRI fragmentumként tisztítjuk. A fenti lépések részletei az alábbiak:

A Schizosaccharomyces pombe ADH promotort a pADHpol plazmidból (Russel és Hall fentebb idézett munkája) izoláljuk. Schizosaccharomyces pombe 2-15 kb közti mérettartományban lévő Sau RA DNS fragmentumainak könyvtárát az YEp 13 élesztő vektorba klónozzuk. A könyvtárat Saccharomyces cerevisiae 500-11 törzsbe transzformáljuk; ebből a törzsből hiányzik a működőképes alkohol-dehidrogenáz. A transzformánsokat olyan tápközegen növesztjük, amelyből hiányzik a leucin, ugyanakkor tartalmaz légzésgátló antimicin A-t; ezen a tápközegen olyan transzformánsokat választunk ki, amelyek alkohol-dehidrogenázt tartalmaznak. Azokból az élesztő klónokból, amelyek képesek növekedni leucin távollétében és antimicin A jelenlétében, plazmid DNS-t izolálunk. Az egyik plazmid, amelyet pADHpo 1-nek nevezünk, tartalmaz egy mintegy 5,5 kb-s beiktatást. A pADHpo 1-et tartalmazó Saccharomyces cerevisiae transzformánsokat megfestjük alkohol-dehidrogenázra, és a Saccha-. romyces cerevisiae transzformánsokban jelen lévő alkohol-dehidrogénázt összehasonlítjuk a Schizosaccharomyces pombe natív enzimjével. A beiktatás kódoló szekvenciáját R-hurokképzési technikákat alkalmazva lokalizáljuk, felhasználva a glükózt tartalmazó dús tápközegben nőtt Schizosaccharomyces pombe sejtekből tisztított poli(A)RNS-t. A pADHpol Schizosaccharomyces pombe eredetű beiktatásában jelen lévő vélt kódoló szekvencia összetételét meghatározzuk. Az 5’ szegélyező terület szekvenciaelemzése azt mutatja, hogy a Schizosaccharomyces pombe alkohol dehidrogenáz gén olyan promotor-vonásokat mutat, amelyek a Saccharomyces cerevisiae gének vonásaival lehetnek közösek. A szegélyező terület a pADHpol 0,75 kb-s SphI-EcoRI fragmentumán belül megtalálható. A fenti módon kapott fragmentumot és a pUC12 EcoRIHindlII polilinker fragmentumát YEp13.-ba ligáljuk, amelyet előzőleg Sphl-gyel és HindlII-mal emésztettünk. Az így létrejövő plazmid pEVP-11-ként ismeretes.

HU 206 897 Β

A 7. ábrára utalva, S. pombe kifejező vektor megalkotásához az ADH promotort a pEVP-11-ből SphlXbal fragmentumként tisztítjuk. pZV33 plazmidot emésztünk Xbal-gyel és BglII-vel, és a mintegy 340 bp-s BARI fragmentumot, amely magában foglalja az ATG iniciációs kodont, tisztítjuk. pZV33-at emésztünk BglII-vel és Sstl-gyel, és a BARl-proinzulin fúziós szekvenciát tisztítjuk. A három fragmentumot egyesítjük SphI-gyel és Sstl-gyel emésztett pUC18-cal, így alakítjuk ki a pZV46 plazmidot. Mivel a pUC18 nem hatásos a S. pombe transzformációjához, a plazmidot két kettős enzimes emésztésnek vetjük alá. ADH promotor-BARl fúziós fragmentumot tisztítunk HindIII+BglH emésztésből, és BARl-proinzulin fúziós szekvenciát tisztítunk BglII+Xbal emésztésből. Ezeket a fragmentumokat beiktatjuk HindlII-mal és Xbal-gyel emésztett YEpl3-ba, így alakítjuk ki a pZV49 S. pombe kifejező vektort. Transzformált S. pombe 118—4h^_ (ATCC 20680) törzs 1 literes tenyészetét növesztjük 36 órán át 30 °C hőmérsékleten standard szintetikus tápközegben (-leu D), amely tartalmaz még 200 mg/ml aszparaginsavat és 100100 mg/ml hisztidint, adenint és uracilt. A tenyészeteket centrifugálással kinyerjük, és a felülúszókat mérjük IRI és IRC mérésekkel. pZV49-cel transzformált sejtekből kinyert két minta 1,6 pmól/ml IRI anyagot, illetve 0,5 pmól/ml IRC-reaktív anyagot tartalmaz. Az YEpl3mal transzformált tenyészetekből kapott kontroll minta nem tartalmaz kimutatható IRC-reaktív anyagot.

4. példa

Alfa-faktor exportja, BARI szignál pepiidet alkalmazva.

A BARI szignál peptidet megvizsgáljuk arra a tulajdonságára, hogy irányítja az α-faktor exportját egy élesztő transzformánsból. Több plazmidot alkotunk meg, amelyek különböző hosszúságú BARI fehérjével és érett α-faktor 1 vagy 4 másolatával kialakított fúziós fehérjéket kódoló DNS fragmentumokat tartalmaznak. Ezeket a plazmidokat egy ű/α diploid gazdatörzsbe transzformáljuk, és a transzformánsokat α-faktor termelésre mérjük a gyűrű-képződési vizsgálat segítségével.

A pSW94, pSW95, pSW96 és pSW97 plazmidok tartalmazzák a S. cerevisiae trióz-foszfát-izomeráz (TPI1) promotort, a BARI gén egy 355 bp-s vagy 767 bp-s fragmentumát (amelyek a BARI kódoló szekvencia 5’ végének 114 vág 251 kodonját tartalmazzák), és az alfa-faktor (Λ/Fal) kódoló szekvencia vagy egy, vagy négy másolatát. Ezeket a konstrukciókat az 1. táblázat mutatja be.

/. táblázat

Plazmid	BARI fragmentum	a-faklor
pSW94	355 bp	4 másolat
pSW95	767 bp	4 másolat
pSW96	355 bp	1 másolat
pSW97	767 bp	1 másolat

A pM220 plazmidot (amely pM210-ként is ismeretes) alkalmazzuk a TPI1 promotor fragmentum forrásaként. A pM220-szal transzformált E. coli RRI törzs letétbe van helyezve az ATCC-nél ATCC 39853 letéti számon. A pM220 plazmidot EcoRI-gyel emésztjük és a TPI1 promotort tartalmazó 0,9 kb-s fragmentumot agaróz gél elektroforézissel izoláljuk, és a végeket tompává tesszük DNS polimeráz I-gyel (Klenow-fragmentum). Kinázzal kezelt Xbal kapcsolókat adunk a fragmentumhoz, amelyet azután BglII-vel és Xbalgyel emésztünk. Ezt a módosított TPI1 promotor fragmentumot azután a pDR1107 3,4 kb-s BglII-Xbal vektor fragmentumába ligáljuk, hogy a pZV118-at alakítsuk ki. A pDRllO7 plazmidot úgy alakítjuk ki, hogy a pM220 900 bp-s BglII-EcoRI TPI1 promotor fragmentumát pIC7-be [Marsh, Erfle és Wykes: Gene 32, 481-485 (1984)] szubklónozzuk, így alakítjuk ki a pDRllOl plazmidot. A pDRllOl plazmidot HindlIImal és SphI-gyel emésztjük, hogy a 700 bp-s részleges TPI1 promotor fragmentumot izoláljuk. A pDRllOO plazmidot, amely a pM220 800 bp-s Xbal-BamHI TPI1 terminátor fragmentumát tartalmazza pUC18-ba szubklónozva, elhasítjuk HindlII-mal és SphI-gyel. A 700 bp-s részleges TPI1 promotort a linearizált pDRllOO-ba ligáljuk, hogy a pDR1107-et alakítsuk ki.

A TPI1 promotor 5’ végénél levő EcoRI helyet a pZV 118-ban elroncsoljuk. A plazmidot HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztjük, és a 0,9 kb-s fragmentumot izoláljuk és egy szintetikus kapcsolóhoz ligáljuk; ezt a kapcsolót ZC708 (5’-AATTGCTCGAGT-3’) és ZC709 (3-CGAGCTCAGATC-5’) oligonukleotidok összeforrasztásával alkotjuk meg. A kapcsoló hozzáadása eltünteti az EcoRI helyet a TPI1 promotor fragmentum 3’ végénél és Xhol és Xbal helyeket ad hozzá. Ezt a fragmentumot azután összekapcsoljuk HindlIImal és Xbal-gyel hasított pUC13-mal. Az így létrejött plazmidot pZV!34-nek nevezzük (8. ábra).

Az élesztő párosító feromona-faktor (MFal) gén klónozását Kurjan és Herkowitz írják le (fentebb idézett munka). A gént saját laboratóriumunkban izoláljuk hasonló módon YEpl3 BamHl helyébe klónozott részleges Sau3A fragmentumok élesztő genom könyvtárából [Nasmyth és Tatchell: Cell 19,753-764 (1983)]. A klón egy beiktatást tartalmaz, amely átfedésben van a Kurjan és Herskowitz által jellemzett MFal génnel. Ezt a plazmidot, amelyet pZA2-nek nevezünk, EcoRIgyel emésztjük, és az MFal-et tartalmazó 1,7 kb-s fragmentumot izoláljuk, és EcoRI-gyel hasított pUC 13-ba ligáljuk. Az így létrejött plazmidot, amelyet pl92-nek nevezünk, EcoRI-gyel hasítjuk, és az így létrejött 1,7 kb-s MFal fragmentumot izoláljuk és MboII-vel emésztjük. Az 550 bázispáros MboII-EcoRI fragmentumot izoláljuk és kinázzal kezelt Sál kapcsolókhoz ligáljuk.

A kapcsolókkal ellátott fragmentumot Sall-gyel hasítjuk. Az így létrejött 0,34 kb-s Sáli fragmentumot Sall-gyel hasított pUC4-be ligáljuk [Vieira és Messing: Gene 19, 259-268 (1982)], így hozzuk létre a p489-nek nevezett plazmidot (9. ábra).

Egy gén fúziós terméket alkotunk meg ezután,

HU 206 897 B amely a BARI részeit (114 kodon) és az MFal kódoló szekvenciát tartalmazza. pZV24 plazmidot (2. példa) emésztünk SphI-gyel és Bg 111-vel, és a 0,8 kb-s ADH1 promotor-BAR 1 fragmentumot izoláljuk. A p489 plazmidot BamHI-gyel hasítjuk, és a 0,3 kb-s fragmentumot izoláljuk. E két fragmentumot három részes ligálással egyesítjük SphI-gyel és BamHI-gyel hasított YEpl3-mal. Az így létrejött plazmidot pZV69-nek nevezzük (11. ábra).

Egy második fúziós gént, amely a barrier 251 aminosavát az alfa-faktor prekurzor egy részével egyesítve kódolja, alkotunk meg. pZV16 plazmidot, amely a pZV9-bó'l származó 767 bp-s Xbal-Sall BARI fragmentumot (1. példa) tartalmazza Xbal-gyel és Sallgyel hasított pUC 13-ba ligáivá, linearizálunk Sall-gyel végzett emésztéssel. Ezt a 4,0 kb-s fragmentumot egyesítjük a p489-ből eredő, az α-faktor négy másolatát kódoló 0,3 kb-s Sáli fragmentummal. Egy plazmidot, amely a BARl-MFal fúziós termékkel rendelkezik a korrekt orientációban, pZV71-nek nevezünk. A pZV71-ből eredő BARlL-MFal fúziós terméket azután az ADH1 promotorhoz kapcsoljuk. A pZV71 plazmidot Xbal-gyel és Pstl-gyel emésztjük, és az 1,07 kb-s fragmentumot izoláljuk. Az ADH1 promotort 0,42 kb-s SphI-Xbal fragmentumként izoláljuk pZV24-ből. Ezt a két fragmentumot-egyesítjük három részes ligálással SphI-gyel és Pstl-gyel hasított pUC 18-ba. Az így létrejött pZV73 plazmidot SphI-gyel és BamHI-gyel emésztjük, és a kifejező egységet tartalmazó 1,56 kb-s fragmentumot izoláljuk és az SphI-gyel és BamHI-gyel hasított YEpl3-ba ligáljuk, hogy a pZV75-öt képezzük (10. ábra).

Abból a célból, hogy könnyen alakítsunk ki nagy mennyiségű plazmidot pUC típusú vektorokat alkalmazva, a pZV69-ből és pZV75-ből számlázó BAR1A/Fal fúziós egységeket szubklónozzuk a TPI1 promotorral pUC18-ba (11. ábra). A pZV69 plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztjük és a fúziós terméket tartalmazó 0,55 kb-s fragmentumot izoláljuk. A 0,9 kb-s TPI1 promotor fragmentumot izoláljuk pZVl 18-ból HindlII-mal és EcoRI-gyel végzett emésztéssel. Három részes ligálást hajtunk végre, a 0,55 kb-s BARl-AfFal fragmentumot, a 0,9 kb-s TPI1 promotor fragmentumot, a 0,9 kb-s TPI1 promotor fragmentumot és a HindlII-mal és BamHI-gyel hasított pUC19-et alkalmazva. Az így létrejött plazmidot pSW59-nek nevezzük. A pZV75 plazmidot EcoRI-gyel és BamHIgyel emésztjük, hogy a 954 bp-s BARl-MFal fúziós fragmentumot izoláljuk. Ezt a BARI-Λ/Ααΐ fragmentumot három részes ligálással ligáljuk a 0,9 kb-s Hindii + EcoRI TPI1 promotor fragmentumhoz és a HindIH-mal és BamHI-gyel hasított pUC 18-hoz, hogy a pSW60 plazmidot alakítsuk ki.

Kifejezőplazmidokmegalkotásában a BARI kódoló szekvencia 5’ 116 bp-s részének forrása a pSW22, amelyet az alábbi módon alkotunk meg (12. ábra). A pSW22-ben található BARI kódoló terület pZV9-ből ered. A pZV9 plazmidot (1. példa) Sall-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, hogy az 1,3 kb-s BARI fragmentumot izoláljuk. Ezt a fragmentumot Sall-gyel és BamHl-gyel hasított pUC 13-ba szubklónozzuk, hogy a pZV17-nek nevezett plazmidot kialakítsuk. A pZVI7 plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, hogy eltávolítsuk a BARI kódoló terület 3’ felé eső 0,5 kb-s területét. A vektor-BARl fragmentumot újra ligáljuk, a pJH66-nak nevezett plazmidot alkotva meg. A pJH66 plazmidot EcoRI-gyel linearizáljuk és Klenow-fragmentum segítségével tompa végűvé tesszük. Kinázzal kezelt BamHI kapcsolókat (5’-CCGGATCCGG-3’) adunk hozzá és a fölösleges kapcsolókat BamHI-gyel végzett emésztéssel eltávolítjuk úrjaligálás előtt. Az így létrejött plazmidot, a pSW8-at Sall-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, hogy a BARI 252. és 525. aminosavai közti területet kódoló 824 bp-s fragmentumot izoláljuk. Ezt a BARI fragmentumot a P anyag [Munro és Felhám: EMBO J. 3, 3087-3093 (1984)] C terminális részét kódoló fragmentumhoz fuzionáljuk. A pPM2 plazmidot, amely a P anyag dimer formáját kódoló szintetikus oligonukleotid szekvenciát tartalmazza, az MRC Laboratory of Molecular Biology-től (Cambridge, Anglia) lehet beszerezni. A pPM2 plazmidot BamHI-gyel és Sall-gyel végzett emésztéssel linearizáljuk, és ligáljuk a 824 bp-s BARI fragmentummal. Az így létrejött pSW14 plazmid, amint a 12. ábrából látható, tartalmazza a pSW8ból származó 824 bp-s BamHI-Sall fragmentumot az M13mp8 vektorban lévő pPM2 P vegyület dimerhez kapcsolva. Az M13mp8 jelölés a pSW14 rajzában lényegében ismertté teszi a pSW 14-ben lévő további vektor szekvenciákat is. A pSW 14 plazmidot Sall-gyel és Smal-gyel emésztjük, hogy izoláljuk a 871 bp-s BAR1-P anyag fragmentumot. A pZVló plazmidot (10, ábra) Xbail-gyel és Sall-gyel hasítjuk, hogy izoláljuk a BARI 767 bp-s 5’ kódoló szekvenciáját. Ezt a fragmentumot a 87 bp-s BAR1-P anyag fragmentummal ligáljuk három részes ligálással Xbal-gyel és Smal-gyel hasított pUC18-caI. Az így létrejött plazmidot pSW15-nek nevezzük. A pSW15 plazmidot Xbalgyel és Smal-gyel emésztjük, hogy izoláljuk az 1,64 kb-s BAR1-P anyag fragmentumot. Az ADH1 promotort pRLO29-ből kapjuk, úgy, hogy a plazmidot SphIgyel és Xbal-gyel emésztjük, és a 0,42 kb-s ADH1 promotor fragmentumot izoláljuk. A pRLO29-et, amely pUC 18-ban tartalmazza az ADH1 promotort és a pZV24-ből eredő BARI 5’ kódo'ló terület 116 bp-ját, a korábban ismertetett és 5A. ábrában bemutatott pZV24-bó'l állítjuk elő olyan módon, hogy SphI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük, az SphI-EcoRI fragmentumot izoláljuk és ezt EcoRI-gyel és SphI-gyel emésztett pUC18 fragmentumhoz ligáljuk. A TPI1 terminátort [Alber és Kawasaki: J. Mól. Appl. Gén. /, 419-434 (1982)] úgy szolgáltatjuk, mint 0,74 kb-s Xbal-BamHI fragmentumot pUC 18-ban.

A terminátor fragmentumnak van egy EcoRI terminális restrikciós helye a pUC!8 vektorban lévő polilinkere miatt. Egy, a TPI1 terminátor és pUC18 vektor szekvenciákat tartalmazó, Xbal-gyel linearizált fragmentumot DNS polimeráz I-gyel (Klenow-fragmentum) kezelünk a dXTP-k jelenlétében. Az így létrejövő tompavégű fragmentumot SphI-gyel emésztjük, amely felszabadít égy Sphl-kompatíbilis véget a pUC18 vek10

HU 206 897 B tor polilinker szekvenciájában. Az így létrejövő fragmentum tartalmaz egy Sphl kompatíbilis véget, amelyet pUC vektor szekvenciák, a TPI1 terminátor szekvencia és egy terminális, Klenow-val tompává tett vég követ, amint ezt a 12. ábrában bemutatjuk. A TPI1 terminátort és a Klenow- fragmentummal kitöltött Xbal véggel és Sphl véggel rendelkező pUC18-at tartalmazó linearizált fragmentumot ligáljuk a 0,42 kb-s ADH1 promotor fragmentummal és az 1,64 kb-s BAR1-P anyag fragmentummal három részes ligálással, hogy a pSW22 plazmidot hozzuk létre.

Ezután a pSW94 plazmidot alkotjuk meg (13. ábra). A BAR1-P anyag fúziós terméket és a ΤΡΙ1 terminátort tartalmazó 2,3 kb-s fragmentumot izoláljuk a pSW22 plazmidból Xbal-SstI fragmentumként. Ezután pZV134-et HindlII-mal és Xbal-gyel emésztünk, és az így létrejövő 0,9 kb-s fragmentumot agaróz gélelektroforézissel izoláljuk. A kapott HindlII-Xbal ΤΡΙ1 promotor fragmentumot egyesítjük a BAR1-P anyagTPI1 terminátor fragmentummal három részes ligálással HindlII-mal és Sstl-gyel hasított pUC18-cal. Az így létrejött pSW81 plazmidot HindIU-mal és EcoRI-gyel hasítjuk, hogy a TPI1 promotort és a BARI 5’ 116 bp-s részét tartalmazó 1,02 kb-s fragmentumot izoláljuk. A pSW59 plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, hogy a 0,55 kb-s BARl-MFal fúziós fragmentumot izoláljuk. Ezt a fragmentumot azután három részes ligálással ligáljuk a pSW81-ból származó TPI1 promotor-BARl fragmentummal és a HindlII-mal és BamHI-gyel linearizált YEpl3-mal, a pSW94 plazmidot kapva.

A pSW95 megalkotását a 13. ábra ábrázolja. A pSW60 plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, hogy a 954 bp-s BARl-MFal fúziós fragmentumot izoláljuk, A pSW81 plazmidot HindlII-mal és EcoRIgyel hasítjuk, hogy az 1,02 kb-s TPI1 promotor-BARl fragmentumot izoláljuk, amelyet egyesítünk a BARlMFal fúziós fragmentummal három részes ligálással HindHI-mal és BamHI-gyel hasított YEp 13-ba. Az így létrejött plazmidot pSW95-nek nevezzük.

Az α-faktornak csupán egyetlen másolatát tartalmazó TPI1 promotor-BARl-MFal fúziós konstrukciók származnak (α-faktor négy másolatát kódoló) BAR1-MF1 fúziókból, amelyek TPI1 promotort és MFal prepro-szekvenciát tartalmaznak (lásd a 14., 15. és 16. ábrákat). A pZV16 plazmidot EcoRI-gyel és SalI-gyel emésztjük. Az izolált 651 bp-s BARI fragmentumot kinázzal kezelt HindlII-EcoRI BARI fajlagos adapterrel ligáljuk HindlII-mal és SalI-gyel hasított pUC13-ba [az adaptert úgy állítjuk elő, hogy a ZC566 oligonukleotidot (5’-AGCTTTAACAAACGATGGCACTGGTCACTTAG-3’) összefonasztjuk a ZC567 oligonukleotiddal (5-AATTCTAAGTGACCAGTGCCATCGTTTGTTAA-3’)]. Az így létrejött pZV96 plazmidot HindlII-mal és SalI-gyel emésztjük, hogy a 684 bp-s BARI fragmentumot izoláljuk. A pM220 plazmid a TPI1 promotort az MFal preproszekvenciával fuzionálva szolgáltatja. A pM220 plazmidot BglIII-vel és HindIU-mal emésztjük, hogy izoláljuk az 1,2 kb-s TPÍ1 poromotor-MFal prepro fragmentumot. A BARI kódoló terület 3’ részét olyan módon kapjuk meg, hogy a pZV9-et SalI-gyel és BamHIgyel hasítjuk, hogy az 1,3 kb-s BARI fragmentumot izoláljuk. A 684 bp-s HindlII-Sall BARI fragmentumot, az 1,2 kb-s BglIl-HindlII TPI1 promotor-MFal prepro fragmentumot, és az 1,3 kb-s Sall-BamHI BARI fragmentumot egyesítjük BamHI-gyel linearizált YEpl3-mal négy részes ligálásban. A promotor kívánt orientációjával és MFal-BARl fúziós termékkel bíró konstrukciót pZV 100-nak nevezzük.

Abból a célból, hogy könnyen alakítsunk ki nagy mennyiségű plazmidot pUC típusú vektorokkal, a pZVIOO-ból eredő megcsonkított MFal-prepro-szekvencia-BARl fúziós fragmentumot pUC 13-ba szubklónozzuk 1,6 kb-s Pstl-BamHI fragmentumként. Az így létrejött plazmidot, a pZVIOl-et Pstl-gyel és EcoRl-gyel elhasítjuk, hogy a 270 bp-s MF 1-preproBAR1 fragmentumot izoláljuk. A pZV69 plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztjük, hogy (az a-faktor négy másolatát kódoló) 0,55 kb-s BARl-MFal fúziós fragmentumot izoláljuk. Ezt a fragmentumot és a 270 bp-s MFal-prepro-BARl fragmentumot három részes ligálással ligáljuk Pstl-gyel és BamHI-gyel hasított pUC13-ba. Az így létrejött plazmidot pZV102-nek nevezzük. (15. ábra).

Olyan kifejező egységet alkotunk meg ezután, amely a TPI1 promotort, a BARI egy részét, és az α-faktor kódoló szekvencia egy egyedi másolatát tartalmazza (16. ábra). A pZV102 plazmidot Pstl-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, hogy a 0,82 kb-s MFal-preproBARl fragmentumot izoláljuk. ATPI1 promotort és a pM220-ból származó, megcsonkított MF 1-prepro szekvenciát tartalmazó 1 kb-s HindlII-PstI fragmentumot egyesítjük a pZV102-ből izolált 0,82 kb-s MF 1-prepro-BARl fragmentummal, három részes ligálásban HindIU-mal és BamHI-gyel hasított YEpl3-mal. Az így létrejött plazmidot pZV105-nek nevezzük. A pZV105 plazmidot HindlII-mal hasítjuk, hogy az 1,2 kb-s TPI1 promotor-MFal-prepro-fragmentumot izoláljuk. A pZV102 plazmidot HindIU-mal emésztjük, hogy izoláljuk a terminális α-faktor másolatát tartalmazó vektor-fragmentumot. Ezt a 2,8 kb-s vektor-MF 1 fragmentumot az 1,2 kb-s TPI1 promotor-MFalprepro-fragmentumba ligáljuk. A korrekt orientációval és az MFal kódoló szekvencia egyedi másolatával rendelkező plazmidot pSW61-nek nevezzük. A pSW61 plazmidot HindIU-mal végzett részleges emésztéssel linearizáljuk. A részleges emésztést úgy végezzük, hogy HindIU-mal emésztünk standard körülmények között 20 percig és 30 percig. Az emésztményeket elektroforézisnek vetjük alá agaróz gélen, és a 4,04 kb-s lineáris fragmentumot izoláljuk.

A pZV102-t HindIU-mal emésztjük, hogy izoláljuk a 0,3 kb-s BARl-MFal fragmentumot. Ezt a fragmentumot a linearizált pSW61-be ligáljuk. Ezt a plazmidot, amely a beiktatást az MFal rajt-kodontól 3’ felé 264. helyen levő HindlII helynél korrekt orientációban tartalmazza, pSW70-nek nevezzük. A pSW70 plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, hogy a 361 bp-s BARl-MFal fragmentumot izoláljuk. A pSW81 plaz11

HU 206 897 B midot (13. ábra) HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztjük, hogy izoláljuk az 1,02 kb-s TPJ1 promotor-BARl fragmentumot. Ezt a fragmentumot egyesítjük három részes ligálással BARl-MFal fragmentummal, valamint HindlII-mal és BamHI-gyel linearizált YEpl3-mal. Az így létrejött plazmid, a pSW96, tartalmazza a TPI1 promotort és az α-faktor kódoló szekvencia egy másolatához fuzionált BARI 5’ kódoló szekvenciájának 356 bp-ját.

Az MFal kódoló szekvencia egy másolatához fuzionált BARI 767 bp-ját tartalmazó második BAR1MFl konstrukciót készítünk, BARI fragmentum-forrásként pZV75-öt alkalmazva (17. ábra). A pZV75 plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztjük, hogy a 954 bp-s BARl-MFal fragmentumot izoláljuk. A BARl-hez fuzionált MFal -prepro-szekvenciát tartalmazó pZVIOl plazmidot Pstl-gyel és EcoRI-gyel hasítjuk, hogy izoláljuk a 0,27 kb-s MFai-prepro-BARl fragmentumot. Ezt a fragmentumot összekapcsoljuk a 954 bp-s BARl-íWFal fragmentummal három részes ligálásban Pstl-gyel és BamHI-gyel linearizált pUC13mal. Az így létrejött pZV104 plazmidot HindlII-mal hasítjuk, hogy izoláljuk a 0,70 kb-s BARl-MFal fragmentumot. Ezt a fragmentumot pSW61-be ligáljuk, amelyet HindlII-mal végzett részleges emésztéssel linearizáltunk. Ezt a plazmidot, amely az MFal rajt-kodonjától 3’ irányban 264 bp-re lévé' HindlII helynél korrekt orientációban tartalmazza a beiktatást, pSW74nek nevezzük. A pSW74-et EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasítjuk, hogy izoláljuk a 738 bp-s BARl-MFal fragmentumot. A pSW81 plazmidot HindlII-mal és EcoRIgyel hasítjuk, hogy izoláljuk az 1,02 kb-s TPI1 promotor-BARl fragmentumot. Ezt a fragmentumot hozzákapcsoljuk a 738 bp-s BARl-MFal fragmentumhoz három részes ligálásban HindlII-mal és BamHI-gyel hasított YEpl3-maI. Az így létrejött pSW97 plazmid tartalmazza a TPI1 promotort és az α-faktor kódoló szekvencia egyedi másolatához fuzionált BARI 5’ végének 767 bp-jét.

Az ű/α diploid S. cerevisiae XP733 (MATa leu2-3 Ieu2-ll2 barl-l gal2/MAT leu2-3 Zcm2—112 barl-l gall) törzset transzformáljuk pSW73, pSW94 és pSW95 plazmidokkal. Ez az élesztő a ZymoGenetics, Inc-tól (Seattle, Washington, USA) szerezhető be.

Az élesztő transzformálását lényegében úgy hajtjuk végre, amint ezt Beggs leírása [Natúré 275, 104-108 (1978)] alapján Mackay kidolgozta [Meth. Enzymol. 101 325 (1983)]. ApSW73 plazmid tartalmazza a TPI1 promotort, az MFcí.í szignál pepiidet és prepro szekvenciát, és az YEpl3-ban levő α-faktor négy másolatát. A transzformánsokat S. cerevisiae RC629 sejtek élesztőmezejére szúrjuk át (ahol az élesztő-mező szelektív tápközeg lemeze fölött levő lágy agar fedőrétegben van) és inkubáljuk egy éjszakán át 30 °C hőmérsékleten. A gyűrű-méretek összehasonlítása azt mutatja, hogy a pSW94 mintegy 15%-kal több a-faktort exportál, mint a pSW73.

Az MFal kódoló szekvencia egy másolatához fuzionált BARl-et tartalmazó konstrukciót megvizsgáljuk hasonló módon α-faktor exportjára. A pS W96 és pSW97 plazmidokhoz kontrollként a pSW67 plazmidot alkalmazzuk, amely tartalmazza a TPII promotort, az MFal szignál peptid és prepro területet és YEpl3 eredetű α-faktoregy másolatát kódoló területet. A gyűrű-méretek összehasonlítása azt jelzi, hogy a pSW96 mintegy 30-40%-kal több α-faktor kiválasztását irányítja, mint a pSW67.

A pSW73 és pSW67 plazmidok a ZymoGenetics, Inc-tól (Seattle, Washington, Amerikai Egyesült Államok) szerezhetők be.

5. példa

A BARI szignál peptid hasító hely mutációja

Amint fentebb leírtuk, arra jöttünk rá, hogy a barrier prekurzor szignál peptid hasítási helyének megváltoztatása várhatóan megkönnyíti a barrier-tartalmú fúziós fehérjék feldolgozását és exportját a KEX2 pálya mentén. Potenciális hasító helyek vannak a 23. és 24. aminosavak közt és a 24. és 25. aminosavak közt. így a BARI primer transzlációs terméket kódoló DNS szekvenciát úgy mutáljuk, hogy prolin gyököt kódoljon a 25. helynél. A pSW98 és pSW99 plazmidok YEpl3-alapú plazmidok, amelyek tartalmazzák a S. cerevisiae TPII promotort, a BAR 1 gén 355 bp-s vagy 767 bp-s fragmentumát, beleértve a mutált szignál peptid hasítási helyet, és az a-faktor kódoló szekvencia egy másolatát.

A szignál peptid mutációját standard in vitro mutagenezis módszerekkel vezetjük be [Zoller és munkatársai: Manual fór Advanced Techniques in Molecular Cloning Course (Kézikönyv a haladó technikákhoz a molekuláris klónozás folyamatában), Cold Spring Harbor Laboratory (1983)], M13 fág templátot és egy szintetikus mutagén oligonukleotidot (szekvencia: 5’ATTACTGCTCCTACAAACGAT-3’) alkalmazva. A pSW54 fág templátot úgy alkotjuk meg, hogy a pSW22 0,54 kb-s SphI-EcoRI fragmentumát ligáljuk Sphlgyel és EcoRI-gyel emésztett M13mpl9-cel. In vitro mutagenezist követően potenciálisan mutagenizált tarfoltokat vizsgálunk át ³²P-jelzett mutagén oligonukleotiddal végzett tarfolt-hibridizálás segítségével, és szekvencia-elemzést végzünk, hogy igazoljuk a mutáció jelenlétét. Az igazoltan mutagenizált fágok egyikének, az mZC634-7-nek replikatív formáját SphI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük, és a 0,54 kb-s fragmentumot izoláljuk és ligáljuk SphI-gyel és EcoRI-gyel hasított pUC18-cal. Az így létrejött plazmidot, a pSW66-ot (18. ábra) HindlII-mal és Xbal-gyel emésztjük, hogy eltávolítsuk az ADH1 promotort, és a vektort, valamint BARI szekvenciákat tartalmazó fragmentumot ligáljuk a pZV134 0,9 kb-s HindlII-Xbal TPII promotor fragmentumával. Ezt a plazmidot, amely tartalmazza a TPII promotort és a BARI 5’ végének 119 bp-jét, beleértve a szignál peptid hasítás mutációját, pSW82nek nevezzük.

A 18. ábrára utalva, a pSW82 plazmidot emésztjük HindlII-mal és EcoRI-gyel, valamint BGlII-vel és EcoRI-gyel, és az így létrejövő 1,02 kb-s fragmentumokat izoláljuk. A pSW82 HindlII-EcoRI fragmentumát ligáljuk a pSW74 EcoRI-BamHI fragmentumával és HindlII-mál, valamint BamHI-gyel emésztett

HU 206 897 Β

YEpl3-mal, hogy a pSW99-et alakítsuk ki. A pSW82 BglII-EcoRI fragmentumát ligáljuk a pSW70 0,30 kbs EcoRI-BamHI fragmentumával és BamHI-gyel emésztett YEpl3~maI, hogy a pSW98-at alakítsuk ki. A pSW98 plazmid magában foglalja a TPI1 promotort, a mutagenizált BARI szekvencia 5’ végének 355 bp-jét, és az α-faktor kódoló szekvencia egy egyedi másolatát. A pSW99 plazmid az azonos kifejező egységet tartalmazza azzal az eltéréssel, hogy a mutagenizált BARI szekvencia 767 bp-vel rendelkezik.

A gyűrű-vizsgálat elemzése azt mutatja, hogy a hasítási hely mutáció növeli a α-faktor exportot, amikor az α-faktor egy másolatát kódoló plazmidokat alkalmazzuk. A pSW98-at tartalmazó transzformánsok mintegy 50%-kal több α-faktort exportálnak, mint a pSW96-ot tartalmazó vad-típusú kontroll.

6. példa

BARI gén alkalmazása aspergillusokban

A rekombináns DNS technológia alkalmazása penészgombákhoz, ezen belül Aspergillushoz az irodalomban jól dokumentált (lásd ezzel kapcsolatban Upshall összefoglaló munkáját: Biotechniques 4, 158— 166/1986). Az idegen fehérjék kiválasztásának irányítására képes Saccharomyces cerevisiae BARI gént alkalmazunk arra, hogy irányítsa valamely heterológ fehérje kiválasztását Aspergillusból.

Heterológ fehérjék kiválasztásának irányítására képes Aspergillus kifejező egységet alkotunk meg a Saccharomyces cerevisiae BARI gén egy részletét alkalmazva, egy analóg Saccharomyces cerevisiae kifejező egységből olyan módon, hogy a Saccharomyces cerevisiae transzkripciós promotort és terminátort helyettesítjük Aspergillus transzkripciós promotorral és terminátorral. Egy Aspergillus kifejező egységet alkotunk meg az alábbi módon, amelyben a pHG49 kifejező egységben lévő Saccharomyces cerevisiae transzkripciós promotor és terminátor a pTOC68 plazmidból származó Aspergillus transzkripciós promotorral és terminátorral van helyettesítve.

A pJH49 plazmid tartalmazza az 1-178 aminosavakat kódoló BARI szekvenciát, a Ser kodonnál azonos keretben összekapcsolva egy TPA cDNS szekvenciával. A pJH49 plazmidot az 1. példában található általános ismertetést követve alkotjuk meg. A BARI szekvencia a pZV9 plazmidból származik, amelyet az 1. példában ismertettünk; ez az ATCC-nél deponálva is van E. coli RR1 transzformánsként ATCC 53283 letéti számon. Amint a leírás 17. oldalán ismertetjük, az 5’ szabályozó szekvenciákat és a BARI kódoló szekvenciájának mintegy 800 bp-ját tartalmazó 1,9 kb HindlIISall fragmentumot pZV9-ből tisztítjuk és a pJH6 plazmidba szubklónozzuk, hogy megalkossuk a pJH18 plazmidot. A pJH6 plazmid egy szöveti plazminogén aktivátor (tPA) cDNS-t tartalmaz, 1,6 kb Sall-Xbal fragmentumként szubklónozva pUC13-ba. A pJH18ból származó mintegy 400 bp-s BglII fragmentumot, amely az 1. ábra 114-252. aminosavait kódoló BARI DNS szekvenciát tartalmazza a Gly-Ala-Arg-Ser aminosavakat kódoló tPA szekvenciával összekapcsolva, a

BglII-vel linearizált pIC19H-ba szubklónozzuk. Azt a plazmidot, amely Sáli hellyel bír a BARl-tPA fragmentumon belül a vektorban lévő BamHI helyhez proximálisan, pJH20-nak nevezzük. A pJH20-ból a BARl-tPA fragmentumot 400 bp HindlII-BamHI fragmentumként szubklónozzuk a HindlII-mal és BamHI-gyel linearizált M13mpl9-be. Az így létrejövő fág klónból készült replikatív formájú DNS-t Sall-gyel és BamHI-gyel emésztjük, hogy eltávolítsuk a tPA kódoló szekvenciát és izoláljuk a vektort tartalmazó fragmentumot. A vektort tartalmazó fragmentumot egy olyan 1,6 kb Sall-BamHI fragmentumhoz kapcsoljuk, amely tartalmaz egy teljes tPA kódoló szekvenciát. Az így létrejövő fág kiónt pm 19-JH38-nak nevezzük. Elkészítjük az mpl9-JH38 egyszálú templát DNS-ét in vitro mutagenezishez. Közvetlen fúziót hajtunk végre az egyszálú templát DNS-en az Arg-Arg-ot (a BARI 177—178. helyei) kódoló DNS szekvencia és a tPAelső ser kodonja között, lényegében ugyanúgy, ahogyan az

1. példában ismertettük, a ZC365/5’ GAC TTG GTA GGA TCT TCT TGG GAA CCC A AT TCC 3’) és ZC151 (5’ TTG CTG GTA TAT CTA CTC 3’) oligonukleotidokat alkalmazva. Pozitívan azonosított fág kiónokat izolálunk és egyszálú DNS-t állítunk elő az ezt követő szekvenciaelemzéshez. Egy olyan fág kiónt azonosítunk amelynél igazolható, hogy korrekt szekvenciával bír a BARl-tPA csatlakozásnál; ezt mpl9JH43-nak nevezzük. Az mpl9-JH43-ból készített replikatív formájú DNS BARl-tPA fragmentumát HindlII-Xbal fragmentumként szubklónozzuk az 1,8 kb HindlII-mal és Xbal-gyel linearizált pUC13-ba. Az így létrejövő plazmidot BglII-vel és Xbal-gyel emésztjük, hogy izoláljuk az 1,8 kb BARl-tPA fragmentumot, amely egy, a pZV24-ből származó 800 bp SphI-BglII fragmentumhoz csatlakozik, amely tartalmazza a Saccharomyces cerevisiae ADH1 promotort működőképesen összekötve a BARI gén egy részével (amely a leírás 27. oldalán van ismertetve), továbbá csatlakozik egy 3,5 kb SphI-Xbal fragmentumhoz, amely tartalmazza a TPIJ terminátor és pUC19 vektor szekvenciákat. Az így létrejövő plazmidot SphI-gyel és BamHI-gyel emésztjük, hogy olyan 3,3 kb kifejező egységet izoláljunk, amely tartalmazza az ADH1 promotort, az 1-178. aminosávakat kódoló BARI szekvenciát azonos keretben egyesítve a tPA Ser-formáját kódoló DNS szekvenciával, és a TPI1 terminátort. A

3,3 kb SphI-BamHI kifejező egységet egyesítjük az SphI-gyel és BamHI-gyel linearizált Yepl3-mal, így alakítjuk ki a pJH49 plazmidot.

A pJH49 plazmidban a Saccharomyces cerevisiae transzkripciós promotort és terminátort ezután helyettesítjük az Aspergillus TAKA promotorral, illetve az Aspergillus glükoamiláz terminátorral. Abból a célból, hogy megfelelő terminális restrikciós helyeket kapjunk, a pJH49-ben jelen lévő kifejező egység BARltPA részét 2,15 kb Xbal fragmentumként 2,7 kb Xbalgyel linearizált pUC 18-ba szubklónozzuk. Az egyik plazmidot, amely a vektorban lévő BamHI helyet a kifejező egységben lévő BglII helyhez proximálisan tartalmazza, ρΖΥΙΟΙ-nek nevezzük. Az Aspergillus

HU 206 897 B transzkripciós promotor és terminátor a pTOC68 plazmidból származik, amely tartalmaz egy Aspergillus TAKA promotort és egy Aspergillus glukoamiláz terminátort pUC típusú plazmidokban lévő polilinkerekkel szegélyezve. A pZYlOl plázmidot BamHI, Sáli és XmnI enzimekkel emésztjük, hogy 4,5 kb izoláljuk az 1,8 kb BamHI-Sall kifejező egység BARl-tPa részét. A kifejező egységet BamHI-vel és Xhol-gyel linearizált pTOC68-ba szubklónozzuk. Az így létrejövő plazmid, amelyet pZY 103-nak nevezünk, az alábbi működőképesen összekapcsolt elemeket tartalmazza: egy Aspergillus TAKA promotor, ez 1-178. aminosavakat kódoló BARI szekvencia azonos keretben összekapcsolva a tPA Ser formáját kódoló DNS szekvenciával, és egy Aspergillus glukoamiláz terminátor.

Egy kontroll plázmidot is megalkotunk, amely tartalmaz egy Aspergillus TAKA promotort, egy t-PA cDNS szekvenciát és egy Aspergillus gliikoamiláz terminátort. A t-PA cDNS szekvenciái 1,6 kb Ncol-Xbal fragmentumként kapjuk meg. Szintetikus oligonukleotidokat szintetizálunk, amelyek úgy vannak tervezve, hogy amikor összeforrasztjuk ezeket, egy EcoRI-BamHI-NcoI adaptert kódoljanak; a szintézist „Applied Biosystems Model 38OA” DNS szintetizáló berendezésen végezzük és poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítjuk. A ZC2667 (5ΆΑΤ TCG GAT CCA C 3’) és ZC3668 (5’CAT GGT GGA ATC G 3’) oligonukleotídokat kinázzal kezeljük, összeforrasztjuk és ligálással egyesítjük az Ncol-Xbal 1,6 kb tPÁ fragmentummal és az EcoRJ-gyel és Xbal-gyel linearizált pUC18-cal. Az így létrejövő pZY99 plazmid tartalmazza a tPA cDNS-t 5’ végén EcoRl, BamHI és Ncol restrikciós helyekkel szegélyezve és 3’ végén Xbal, Sáli, PstI, Sphl és HindlII restrikciós helyekkel és pUC18 vektor szekvenciákkal szegélyezve. Az Aspergillus transzkripciós promotor és terminátor szekvenciákat a pTOC68-ból kapjuk meg. A pZY99 plázmidot BamHI-gyel és SálIgyel emésztjük, hogy izoláljuk a t-Pa cDNS fragmentumot, amely a BamHI-gyel és Sall-gyel linearizált pTCO68-cal van összekapcsolva. Az így létrejövő plazmid, amelyet pZY105-nek nevezünk, az alábbi működőképes elemeket tartalmazza: egy Aspergillus TAKA promotor, egy olyan DNS szekvencia, amely a tPA érett formáját kódolja, és egy Aspergillus glükoamiláz terminátor.

A pZY103 és a pZY105 plázmidot kiilön-külön alkalmazzuk pM006-tal együtt (amely tartalmazza az Aspergillus argB⁺ alléit és a pUC vektor szekvenciákat), hogy együttesen transzformáljuk Aspergillus nidulans valamely argB törzsét az alább leírtak szerint, lényegében Yelton és munkatársai eljárását alkalmazva (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474/1984). Egy éjszakás spóratenyészetekből protoplasztokat készítünk olyan módon, hogy először a micéliumot kiszűrjük sterilezett vászonszűrőn, majd a micéliumot 0,6 mól/l-es MgSO₄ oldattal mossuk, A micéliumot újra szuszpendáljuk 8 ml ozmotikus tápközegben (1,2 mól/1 MgSO₄, 10 mmól/l nátrium-foszfát, pH 5,8), amely még 23 mg Novozyme 234 enzimet (Novo Industri/AS, Dánia) is tartalmaz, és 37 °C hőmérsékleten órán át inkubálunk. A protoplasztokat kétszer mossuk ST-ben [0,6 mól/1 szorbit, 100 mmól/l trisz-HCl (pH 7,0)] szuszpendálva. A protoplasztokat azután kétszer mossuk 25 ml STC-ben [1,2 mól/1 szorbit, 10 mmól/l trisz-HCl/pH 7,5) 10 mmól/I CaCl₂]. Az STC-ben szuszpendált plazmid DNS-t hozzáadjuk a protoplasztokhoz és a keveréket 30 °C hőmérsékleten 23 percen át inkubáljuk. Inkubálás után 200μ1 60%-os polietilénglikolt (PEG) adunk a keverékekhez, amelyeket kézzel gyengéden rázogatunk. Másodszor is adunk hozzá 200μΙ 60%-os PEG-et, ezt is gyengéden keverjük kézzel, majd harmadszorra 800μ1 60%-os PEG-et adunk hozzá. A protoplasztokat 30 °C hőmérsékleten 25 percen át inkubáljuk. Inkubálás után a protoplasztokat tartalmazó csöveket STC-vel töltjük és centrifugáljuk, hogy a protoplasztokat üledékbe vigyük. A felülúszókat dekantáljuk és az üledéket szuszpendáljuk 1 ml oldatban, amely CM-bó'l és 60% szorbitból áll [Pontecorvo és munkatársai; Advances in Genetics 5, 141-238(1953)], majd szélesztjük. A transzformán sokat 30 °C hőmérsékleten három napon át inkubáljuk.

Transzformánsokat csíkokban szélesztünk 0,05% glükózzal és 1% oldható keményítővel kiegészített minimál tápközegen. A transzformánsokat azután olyan friss minimál tápközegbe inokuláljuk, amely 0,05% glükózzal és 1% oldható keményítővel van kiegészítve, és 37 °C hőmérsékleten 1 éjszakán át inkubálunk. A lemezeket feiülrétegezzük steril Whatman-szűrőkkel és inkubálunk 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át, A szűrő-felülrétegezést eltávolítjuk, és transzformánsokat tartalmazó agar dugókat készítünk eldobható 1 ml-es pipetták kihegyezett végét alkalmazva. Az agar dugókat kiemeljük és egy fibrin lizáló lemez [150 mg agaróz B, 18 ml lizáló puffer, 1 cső fibrinogén (2096), 10μ1 plazminogén, 10μ1 trombin] üregeibe helyezzük. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. Azok az üregek, amelyeknek tiszta udvara van, jelzik azokat a transzformánsokat, amelyek biológiailag aktív t-PA-t választanak ki. A pZY103 transzformánsok fibrin lemez vizsgálata azt mutatja, hogy ez választ ki tPA-t.

A fenti, 6. példában leírt eljárásban alkalmazott olyan plazmidok és törzsek, amelyek beszerezhetó'ségi 'helye a példa szövegében nincs megadva, az alábbi módon, illetőleg az alábbi helyekről szerezhetők be:

A pJH6, pTOC68 és pM006 plazmidok beszerezhetők az ZymoGenetics, Inc. (Seattle, Washington, USA) cégtől.

A pIC 19H plázmidot eredetileg J. Lawrence Marsh (Developmental Biology Center and Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine, Califomia, USA) bocsátotta rendelkezésünkre, azóta ez a plazmid ugyancsak a ZymoGenetics, Inc. (Seattle, Washington, USA) cégtől szerezhető be.

Az 1,6 kb. Sall-BamHI fragmentumot, amely a teljes pB A-t kódoló szekvenciát tartalmazza és amelyet az mpl9-JH38 konstrukciójában alkalmaztunk, eredetileg a pDR 1296 plazmidból képeztük. Ezt a plázmidot E. coli transzformánsként ATGG 53 347 szám alatt de. ponáltuk. .. ¹ 14

HU 206 897 Β

A TPI1 terminátor és pUC19 vektor szekvenciákat tartalmazó 3,5 kb SphI-Xbal fragmentumot a pJH35 plazmidból képeztük; ez a plazmid a ZymoGenetics, Inc. (Seattle, Washington, USA) cégtől szerezhető be.

A pZY105 kontroll plazmidban szereplő tPA cDNS szekvenciát egy 1,6 kb Ncol-Xbal fragmentumként a pDR1299 plazmidból képeztük; ez a plazmid ugyancsak ZymoGenetics cégtől szerezhető be.

Az Aspergillus nidulans argB törzs szintén beszerezhető a ZymoGenetics cégtől.

7. példa

Élesztő glükolitikus útból származó további promotorok alkalmazása.

Az élesztő glükolitikus útból származó, de a TPI1 promotortól eltérő promotorok szintén alkalmasak a jelen találmányban való felhasználáshoz. Az élesztő glikolitikus promtorok ismertek a szakterületen és rendelkezésre állnak a jelen találmányon belüli hasznosításra. így pl. Kawasaki (4599311 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) leírja glikolitikus promotorok alkalmazását heterológ fehérjék kifejezéséhez élesztőben; Ammerer [Meth. Enzymol. 101, (192-201)] leírja gének kifejezését élesztőben ADCI promotort (amely most már ADH1 poromotorként ismeretes) alkalmazva; Young és munkatársai [Genetic Engineering of Micro-organisms fór Chemicals; szerkesztők: Holláder és munkatársai; kiadó: Plenum (1982)] leírnak különböző alkohol dehidrogenáz promotorokat; és Bittér és Egan [Gene 32, 263274(1984)] leírják heterológ gének kifejezését élesztőben, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz gén promotort alkalmazva. Mindezeket a promotorokat jó eredménnyel alkalmazzuk a találmányunk szerinti eljárásban.

Claims (14)

1. Eljárás idegen fehérjét vagy polipeptidet is tartalmazó fúziós fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNS konstrukció előállítására, azzal jellemezve, hogy

- valamely promotort,

- a Saccharomyces cerevisiae BARI gén egy részét, amely legalább ennek a szignál peptidet kódoló szekvenciáját a 22. aminosavig változtatás nélkül tartalmazza, és

- legalább egy, adott esetben terminátor szekvenciával kibővített struktúrgént, amely az alkalmazandó gazdaszervezet számára idegen fehérjét vagy polipeptidet kódol, ligálunk egymással, és kívánt esetben hordozó plaztnidba építjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan DNS konstrukció előállítására, amely KEX2 helyet tartalmazó fúziós polipeptidet vagy fehérjét kódol, azzal jellemezve, hogy a megfelelő alkotórészeket ligáljuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 23-24. vagy 24-25. aminosavakat kódoló szakaszban helyspecifikus mutagenezissel megváltoztatott szignál peptid kódoló szekvenciát tartalmazó BARI génrészt ligáljuk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promotorként valamely, az élesztő glikolitikus útjában résztvevő gén promotorját ligáljuk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promotorként Saccharomyces cerevisiae BARI gén promotorját, Saccharomyces cerevisiae alkohol dehidrogenáz I promotort vagy Schizosaccharomyces pombe alkohol dehidrogenáz promotort ligálunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

a) a pZV30 vagy pZV31 plazmidok előállítására a

BARI promotort, a Saccharomyces BARI génnek egy, a szignál peptidjét tartalmazó részét és legalább egy, az alkalmazandó gazdaszervezet számára idegen fehérjét vagy polipeptidet kódoló struktúrgént ligálunk; vagy

b) a pZV49 plazmid előállítására a Schizosaccharomyces pombe promotort, a Saccharomyces cerevisiae BARI egy, a szignál peptidjét tartalmazó részét és legalább egy, az alkalmazandó gazdaszervezet számára idegen fehérjét vagy polipeptidet kódoló struktúrgént ligálunk; vagy

c) pZV50 plazmid előállítására a Saccharomyces cerevisiae ADH1 promotort, a Saccharomyces cerevisiae BARI gén egy, a szignál peptidjét tartalmazó részét és legalább egy, az alkalmazandó gazdaszervezet számára idegen fehérjét vagy polipeptidet kódoló struktúrgént ligálunk.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy struktúrgénként a Saccharomyces cerevisiae trióz foszfát izomeráz gén transzkripciós terminátor területével kibővített struktúrgént ligálunk.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett BARI génként olyan gént ligálunk, amely tartalmazza a transzlációs iniciációs hellyel szomszédos 5’ nem transzlatált terület 680 bázispáros szekvenciáját is.

9. Eljárás heterológ fúziós fehérje előállítására alkalmas transzformált gomba gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gomba sejtet valamely, az 1-8. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS konstrukcióval transzformálunk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás transzformált élesztő gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely élesztősejtet transzformálunk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás transzformált Saccharomyces cerevisiae gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Saccharomyces cerevisiae sejtet transzformálunk.

12. A 10. igénypont szerinti eljárás transzformált Schizosaccharomyces pombe gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Schizosaccharomyces pombe sejtet transzformálunk.

13. A 9. igénypont szerinti eljárás transzformált Aspergillus gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Aspergillus penészgombát transzformálunk.

14. Eljárás legalább BARI szignál peptidet és egy,

HU 206 897 B az alkalmazott gazdasejt számára idegen fehérjét vagy polipeptidet is tartalmazó helerológ fehérje vagy polipeptid előállítására valamely transzformált gomba gazdasejtben, azzal jellemezve, hogy

- valamely promotort, a Saccharomyces cerevisiae 5 BARI gén egy, ennek a szignál peptidjét kódoló szekvenciáját a 22. aminosavig változtatás nélkül tartalmazó részét és legalább egy heterológ fehérjét kódoló struktúrgént, működőképesen összekapcsolva, tartalmazó DNS konstrukcióval egy gomba gazdaszervezetet transzformálunk, és

- a fenti módon transzformált gazdaszervezetet alkalmas táptalajban tenyésztjük, és a kiválasztott heterológ fehérjét vagy polipeptidet elkülönítjük.