JP3135550B2 - 成熟異種タンパク質、特にヒルジン、の製造のための改良された酵母株、および対応するヒルジンの製造法 - Google Patents
成熟異種タンパク質、特にヒルジン、の製造のための改良された酵母株、および対応するヒルジンの製造法Info
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- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）などの組換え酵母による異種（hetero
logous）タンパク質の調製、より詳細にいえばヒルジン
の調製のためになされる改良に関する。これは、先ず第
一に、成熟型タンパク質の発現を可能にするベクターに
よって形質転換された、異種タンパク質産生能を有する
新たな酵母株に関する。
ces cerevisiae）などの組換え酵母による異種（hetero
logous）タンパク質の調製、より詳細にいえばヒルジン
の調製のためになされる改良に関する。これは、先ず第
一に、成熟型タンパク質の発現を可能にするベクターに
よって形質転換された、異種タンパク質産生能を有する
新たな酵母株に関する。
酵母は、単細胞の真核生物である。酵母属Saccharomy
cesは、その生化学および遺伝学が研究室で集中的に研
究されている株である。これは、食品工業（パン、アル
コール飲料など）において用いられる株であり、したが
って、きわめて大量に生産されている。Saccharomyces
cerevisiae細胞の遺伝学的操作の容易さおよび長い産業
の歴史によって、組換えDNA技術を用いる外来タンパク
質の生産のための宿主としてこの種が選択される。
cesは、その生化学および遺伝学が研究室で集中的に研
究されている株である。これは、食品工業（パン、アル
コール飲料など）において用いられる株であり、したが
って、きわめて大量に生産されている。Saccharomyces
cerevisiae細胞の遺伝学的操作の容易さおよび長い産業
の歴史によって、組換えDNA技術を用いる外来タンパク
質の生産のための宿主としてこの種が選択される。
産業的に重要なタンパク質を大量に生産することが望
まれている場合には、タンパク質の所望の性質を保持す
るために、タンパク質を実質的に成熟型で、すなわち追
加のアミノ酸またはペプチド配列はいずれもタンパク質
に融合しているように、生産することが望ましい。これ
は、ヒルジンの場合に特に望まれる。事実、アミノ酸65
〜66個のペプチドの混合物のかたちで医用ヒルの唾液腺
を主要な原料とするヒルジンは、きわめて特異的できわ
めて効果的なトロンビンの阻害因子である。したがっ
て、ヒルジンは臨床医療における使用できわめて高い純
度の活性産物が要求される、きわめて有利な治療剤であ
る。
まれている場合には、タンパク質の所望の性質を保持す
るために、タンパク質を実質的に成熟型で、すなわち追
加のアミノ酸またはペプチド配列はいずれもタンパク質
に融合しているように、生産することが望ましい。これ
は、ヒルジンの場合に特に望まれる。事実、アミノ酸65
〜66個のペプチドの混合物のかたちで医用ヒルの唾液腺
を主要な原料とするヒルジンは、きわめて特異的できわ
めて効果的なトロンビンの阻害因子である。したがっ
て、ヒルジンは臨床医療における使用できわめて高い純
度の活性産物が要求される、きわめて有利な治療剤であ
る。
多くの天然のヒルジンの変異体（variants）が同定さ
れていて、HV1、HV2およびHV3と称されている。これら
の構造は、第１図に示される通りである。したがって、
これらの天然の変異体は、他の類似物とともに、遺伝子
工学によって、例えば、欧州特許公開EP−Ａ第0,252,85
4号明細書および同EP−Ａ第0,273,800号明細書に本出願
人の名前で記述されたように、特にS.cerevisiae株の発
酵によって調製された。
れていて、HV1、HV2およびHV3と称されている。これら
の構造は、第１図に示される通りである。したがって、
これらの天然の変異体は、他の類似物とともに、遺伝子
工学によって、例えば、欧州特許公開EP−Ａ第0,252,85
4号明細書および同EP−Ａ第0,273,800号明細書に本出願
人の名前で記述されたように、特にS.cerevisiae株の発
酵によって調製された。
上記のように、S.cerevisiae酵母は異種タンパク質、
すなわち天然には酵母によって生産されずまたその増殖
にも必要ではないタンパク質、の生産に特に有利であ
る。事実、この酵母はそれ自体でいくつかのタンパク質
を培養培地に分泌することができ、これらタンパク質は
正しくプロセッシングされ、すなわち成熟型になる。例
えば、α性フェロモンは、S.cerevisiaeのα接合（mati
ng）型株の培養培地中に見出される。
すなわち天然には酵母によって生産されずまたその増殖
にも必要ではないタンパク質、の生産に特に有利であ
る。事実、この酵母はそれ自体でいくつかのタンパク質
を培養培地に分泌することができ、これらタンパク質は
正しくプロセッシングされ、すなわち成熟型になる。例
えば、α性フェロモンは、S.cerevisiaeのα接合（mati
ng）型株の培養培地中に見出される。
酵母のα性フェロモンは、13個のアミノ酸のペプチド
である。KurjanおよびHerskowitz（Cell 30、933−93
4、1982）は、αフェロモン（MFα１）の前駆体をコー
ドする構造遺伝子をクローニングし、この遺伝子の配列
から、13個のアミノ酸のこのα因子は165個のアミノ酸
の前駆体プレプロタンパク質のかたちで合成されたこと
を推定した。この前駆体は19個の残基のアミノ末端疎水
性シグナル配列を含み、これに３個のグリコシル化部位
を含む64個のアミノ酸の「プロ」配列が続き、この配列
自体に、スペーサーペプチドによって分けられる４コピ
ーのα因子に先行して配列Lys−Argが続いている。
である。KurjanおよびHerskowitz（Cell 30、933−93
4、1982）は、αフェロモン（MFα１）の前駆体をコー
ドする構造遺伝子をクローニングし、この遺伝子の配列
から、13個のアミノ酸のこのα因子は165個のアミノ酸
の前駆体プレプロタンパク質のかたちで合成されたこと
を推定した。この前駆体は19個の残基のアミノ末端疎水
性シグナル配列を含み、これに３個のグリコシル化部位
を含む64個のアミノ酸の「プロ」配列が続き、この配列
自体に、スペーサーペプチドによって分けられる４コピ
ーのα因子に先行して配列Lys−Argが続いている。
シグナル配列が特異的なペプチダーゼによって小胞体
において効果的に切断されることが示された。「プロ」
配列は、小胞体中で始まるＮ−グリコシル化を受ける。
タンパク質加水分解的切断の最初の段階は、KEX2遺伝子
の産生物、すなわちエンドプロテアーゼyscF、によって
特異的なシグナルLys−ArgまたはArg−Argにおいて行わ
れる。この成熟は、おそらく、ゴルジ体内で起きる。KE
X2遺伝子の突然変異を受けたS.cerevisiae株は、キラー
タンパク質（LeibowitzおよびWickner:PNAS USA 2061−
2065、1976）またはαフェロモン（Juliusら:Cell 37、
1075−1089、1984）の活性型を、これらタンパク質の欠
陥的成熟のために、もはや分泌することができないこと
が明かにされた。
において効果的に切断されることが示された。「プロ」
配列は、小胞体中で始まるＮ−グリコシル化を受ける。
タンパク質加水分解的切断の最初の段階は、KEX2遺伝子
の産生物、すなわちエンドプロテアーゼyscF、によって
特異的なシグナルLys−ArgまたはArg−Argにおいて行わ
れる。この成熟は、おそらく、ゴルジ体内で起きる。KE
X2遺伝子の突然変異を受けたS.cerevisiae株は、キラー
タンパク質（LeibowitzおよびWickner:PNAS USA 2061−
2065、1976）またはαフェロモン（Juliusら:Cell 37、
1075−1089、1984）の活性型を、これらタンパク質の欠
陥的成熟のために、もはや分泌することができないこと
が明かにされた。
［発明の具体的説明］ この基礎的性質の研究を基にして、本発明は、成熟タ
ンパク質を得るために、異種タンパク質産生能を有する
酵母株中における機能的KEX2遺伝子の増幅を提供する。
ンパク質を得るために、異種タンパク質産生能を有する
酵母株中における機能的KEX2遺伝子の増幅を提供する。
本発明は、成熟のプロセスをさらに加えることによっ
て、S.cerevisiaeのような酵母株によって分泌される成
熟ヒルジンの量を増加させる方法を特に提案する。
て、S.cerevisiaeのような酵母株によって分泌される成
熟ヒルジンの量を増加させる方法を特に提案する。
本発明の主題は、したがって、酵母株がKEX2遺伝子の
全部または部分の一つまたはそれ以上のコピーを含み、
その結果エンドプロテアーゼyscFのタンパク質加水分解
活性が高まることを特徴とする、少なくとも次の発現ブ
ロックからなる、成熟型の異種タンパク質産生能を有す
る酵母株である。
全部または部分の一つまたはそれ以上のコピーを含み、
その結果エンドプロテアーゼyscFのタンパク質加水分解
活性が高まることを特徴とする、少なくとも次の発現ブ
ロックからなる、成熟型の異種タンパク質産生能を有す
る酵母株である。
（イ）成熟可能なタンパク質の前駆体をコードする配列
の酵母による転写を可能にするシグナルを含むDNA配列
（Str）、 （ロ）プレシグナルペプチドおよび／またはプロペプチ
ドをコードするDNA配列（Spr）、 （ハ）KEX2遺伝子の全部または部分の産生物によるタン
パク質加水分解的切断部位を含んでなるペプチドをコー
ドするDNA配列（Sc1）、 （ニ）Spr配列とともに前駆体を形成する、異種タンパ
ク質をコードするDNA配列。
の酵母による転写を可能にするシグナルを含むDNA配列
（Str）、 （ロ）プレシグナルペプチドおよび／またはプロペプチ
ドをコードするDNA配列（Spr）、 （ハ）KEX2遺伝子の全部または部分の産生物によるタン
パク質加水分解的切断部位を含んでなるペプチドをコー
ドするDNA配列（Sc1）、 （ニ）Spr配列とともに前駆体を形成する、異種タンパ
ク質をコードするDNA配列。
上記のように、本発明は、ヒルジンの生産、特に変異
体rHV2Lys47の生産、に最もよく適用される。
体rHV2Lys47の生産、に最もよく適用される。
以下に記述するように、KEX2遺伝子は、酵母から全DN
Aライブラリーをクローニングすることによって得ても
よい。遺伝子の配列は第２図に示される通りである。煩
雑さを避けるために明細書中に再度記載していないが、
この第２図は開示の必須部分を形成するものである。
Aライブラリーをクローニングすることによって得ても
よい。遺伝子の配列は第２図に示される通りである。煩
雑さを避けるために明細書中に再度記載していないが、
この第２図は開示の必須部分を形成するものである。
本発明によれば、この遺伝子の種々の断片を用いても
よい。すなわち、KEX2遺伝子のゲノムDNAの全部に相当
する第２図に示される塩基381からの配列の全部、また
はこの遺伝子の機能的配列のみ、すなわち、第２図の塩
基番号1349と3793との間（ATGおよびTGAの翻訳開始およ
び終止コードンに挟まれた部分）、またはコード配列の
部分のみ、例えば、第２図の塩基番号1349と3488との間
の部分、でもよい。第２図の塩基番号3790と4010との間
からKEX2遺伝子の区分の３′末端へ位置する断片の存在
は、構築物のターミネーターおよびスタビライザーとし
ての役割を果たすことによって遺伝子の発現を向上させ
る。
よい。すなわち、KEX2遺伝子のゲノムDNAの全部に相当
する第２図に示される塩基381からの配列の全部、また
はこの遺伝子の機能的配列のみ、すなわち、第２図の塩
基番号1349と3793との間（ATGおよびTGAの翻訳開始およ
び終止コードンに挟まれた部分）、またはコード配列の
部分のみ、例えば、第２図の塩基番号1349と3488との間
の部分、でもよい。第２図の塩基番号3790と4010との間
からKEX2遺伝子の区分の３′末端へ位置する断片の存在
は、構築物のターミネーターおよびスタビライザーとし
ての役割を果たすことによって遺伝子の発現を向上させ
る。
メッセンジャーRNAに関して非安定化の役割を有する
と思われる、第２図中の塩基番号3488と3790との間の断
片を除去することが望ましい。
と思われる、第２図中の塩基番号3488と3790との間の断
片を除去することが望ましい。
遺伝子の発現の増幅は、種々の方法で行えばよい。第
一の変異体では、KEX2遺伝子の全部または部分の一つま
たはそれ以上のコピーを酵母ゲノムに直接に組み入れ
る。第二の変異体では、KEX2遺伝子の全部または部分の
一つまたはそれ以上のコピーを異種タンパク質の発現の
ためのベクターに実際の発現ブロックの外側に挿入す
る。以下は、特に第二の変異体に関してより詳細に記述
されよう。
一の変異体では、KEX2遺伝子の全部または部分の一つま
たはそれ以上のコピーを酵母ゲノムに直接に組み入れ
る。第二の変異体では、KEX2遺伝子の全部または部分の
一つまたはそれ以上のコピーを異種タンパク質の発現の
ためのベクターに実際の発現ブロックの外側に挿入す
る。以下は、特に第二の変異体に関してより詳細に記述
されよう。
KEX2遺伝子の産生物は、タンパク質加水分解的な切断
を特異的に行う。このために、Sc1配列を限定された数
の可能な配列から選択しなければならない。ペプチドLy
s−ArgまたはArg−ArgさらにはSer−Leu−Aspを選択す
ることが好ましいであろう。これらSc1配列は、「プ
ロ」配列によって先行されていてもいなくともよく、す
なわち、それらは複合分泌系に会合されていてもいなく
ともよい。事実、KEX2遺伝子の産生物によるタンパク質
加水分解的切断部位が存在する限り、用いる分泌系、即
ちプレシグナルペプチドをコードする配列またはプロ配
列と組合わさるような配列（プレプロ配列）、にかかわ
りなくタンパク質の成熟が起きることが期待され得る。
を特異的に行う。このために、Sc1配列を限定された数
の可能な配列から選択しなければならない。ペプチドLy
s−ArgまたはArg−ArgさらにはSer−Leu−Aspを選択す
ることが好ましいであろう。これらSc1配列は、「プ
ロ」配列によって先行されていてもいなくともよく、す
なわち、それらは複合分泌系に会合されていてもいなく
ともよい。事実、KEX2遺伝子の産生物によるタンパク質
加水分解的切断部位が存在する限り、用いる分泌系、即
ちプレシグナルペプチドをコードする配列またはプロ配
列と組合わさるような配列（プレプロ配列）、にかかわ
りなくタンパク質の成熟が起きることが期待され得る。
ヒルジンの製造に特に有利な構築物は、酵母のαフェ
ロモンのプレプロ配列を、Lys−Argまたは適当であれば
Arg−Arg切断部位と結合させたものである。最後に、St
r配列として強力なプロモーターを用いて、成熟可能な
タンパク質の前駆体に対応する大量のmRNAを転写してKE
X2遺伝子を最高の効率で用いることもまた有利である。
強力なプロモーターとしては、例えば、酵母のαフェロ
モンのプロモーターまたは代わりに酵母のPGKプロモー
ターを挙げてもよい。
ロモンのプレプロ配列を、Lys−Argまたは適当であれば
Arg−Arg切断部位と結合させたものである。最後に、St
r配列として強力なプロモーターを用いて、成熟可能な
タンパク質の前駆体に対応する大量のmRNAを転写してKE
X2遺伝子を最高の効率で用いることもまた有利である。
強力なプロモーターとしては、例えば、酵母のαフェロ
モンのプロモーターまたは代わりに酵母のPGKプロモー
ターを挙げてもよい。
最後に、発現ベクターは、成熟タンパク質をコードす
るDNA配列の後に、例えばPGK遺伝子のターミネーターな
どの、酵母のターミネーターを有するものでもよい。
るDNA配列の後に、例えばPGK遺伝子のターミネーターな
どの、酵母のターミネーターを有するものでもよい。
発現ベクターは、一般に、自律的に（auatonomousl
y）複製するプラスミドであろう。これらのプラスミド
は、これらの複製を可能にする構成要素、すなわち、酵
母の２μプラスミドなどの複製開始点、を含んでいる。
加えて、プラスミドは、酵母の突然変異体ura3またはle
u2の相補性を与える、URA3またはLEU遺伝子などの選択
可能な構成要素を含んでもよい。特に、そのプローモー
ターが除去されているURA3遺伝子の使用は有利である。
y）複製するプラスミドであろう。これらのプラスミド
は、これらの複製を可能にする構成要素、すなわち、酵
母の２μプラスミドなどの複製開始点、を含んでいる。
加えて、プラスミドは、酵母の突然変異体ura3またはle
u2の相補性を与える、URA3またはLEU遺伝子などの選択
可能な構成要素を含んでもよい。特に、そのプローモー
ターが除去されているURA3遺伝子の使用は有利である。
これらのプラスミドは、プラスミドがシャトルプラス
ミドでなければならない場合に、大腸菌における複製を
可能にする構成要素、例えば、pBR322のものなどの複製
開始点、ApRなどのマーカー遺伝子および／または当業
者に公知の他の構成要素などをも含み得る。
ミドでなければならない場合に、大腸菌における複製を
可能にする構成要素、例えば、pBR322のものなどの複製
開始点、ApRなどのマーカー遺伝子および／または当業
者に公知の他の構成要素などをも含み得る。
考えられる全酵母株中、サッカロミセス（Saccharomy
ces）属、とくにセレビシエ（cerevisiae）種、の株の
使用が好ましいであろう。プロモーターがMFα１遺伝子
のものである場合は、酵母はMATα１接合型であること
が好ましいであろう。例えば、適当な選択的抑圧（sele
ctive pressure）によって酵母中のプラスミドの維持を
可能にするプラスミドによって補完されている、ura3ま
たはleu2などの遺伝子型の株、が用いられるであろう。
ces）属、とくにセレビシエ（cerevisiae）種、の株の
使用が好ましいであろう。プロモーターがMFα１遺伝子
のものである場合は、酵母はMATα１接合型であること
が好ましいであろう。例えば、適当な選択的抑圧（sele
ctive pressure）によって酵母中のプラスミドの維持を
可能にするプラスミドによって補完されている、ura3ま
たはleu2などの遺伝子型の株、が用いられるであろう。
最後に、本発明の主題は、酵母による成熟異種タンパ
ク質の製造法であって、本発明による株を適当な培地で
培養して、培養培地に分泌される成熟タンパク質を回収
する。
ク質の製造法であって、本発明による株を適当な培地で
培養して、培養培地に分泌される成熟タンパク質を回収
する。
より詳細には、本発明は、ヒルジン、特に変異体rHV2
Lys47、を成熟型で本発明による酵母株から分泌する工
程に関する。
Lys47、を成熟型で本発明による酵母株から分泌する工
程に関する。
［実験例］ 以下の諸例は、本発明の他の特徴および利点を示すこ
とができよう。これら諸例は諸図によって説明される。
とができよう。これら諸例は諸図によって説明される。
例1:KEX2遺伝子のクローニング このクローニングをkex2−１突然変異株の表現型相補
性によって行う。KEX2遺伝子の突然変異は、酵母のMAT
α株中では活性αフェロモンの分泌の欠如によって、キ
ラーRNA（K+）を有する酵母株においてはキラートキシ
ンの分泌の欠如によって、現れる。TGY38.1株を、KEX2
遺伝子のクローニングのための受容株として用いる。こ
の株を得るために、80株（MATa、kex2−１、ade I、ura
I、［KIL−ｋ］Ｋ−Ｒ＋）（Yeast Genetic Stock Cen
ter、Berkeley CA 94720）およびTGY1sp4株（MATα、hi
s3、ura3）を先ず交配させる。得られる倍数体（diploi
d）TGY33、を芽胞分裂させる。次いで芽胞TGY33.1の特
徴付けを行う。その遺伝子型はMATa、his3、ura3および
kex2−１である。戻し交配をTGY1sp4と行う。得られる
倍数体TGY38を芽胞分裂させる。発芽の後、向上した形
質転換効率を有する分裂体TGY38.1（MATa、ura3、his3
およびkex2−１）を単離する。
性によって行う。KEX2遺伝子の突然変異は、酵母のMAT
α株中では活性αフェロモンの分泌の欠如によって、キ
ラーRNA（K+）を有する酵母株においてはキラートキシ
ンの分泌の欠如によって、現れる。TGY38.1株を、KEX2
遺伝子のクローニングのための受容株として用いる。こ
の株を得るために、80株（MATa、kex2−１、ade I、ura
I、［KIL−ｋ］Ｋ−Ｒ＋）（Yeast Genetic Stock Cen
ter、Berkeley CA 94720）およびTGY1sp4株（MATα、hi
s3、ura3）を先ず交配させる。得られる倍数体（diploi
d）TGY33、を芽胞分裂させる。次いで芽胞TGY33.1の特
徴付けを行う。その遺伝子型はMATa、his3、ura3および
kex2−１である。戻し交配をTGY1sp4と行う。得られる
倍数体TGY38を芽胞分裂させる。発芽の後、向上した形
質転換効率を有する分裂体TGY38.1（MATa、ura3、his3
およびkex2−１）を単離する。
ゲノムクローンpTG2809を、酵母ゲノムライブラリー
（pFL1（Parent,S.A.ら:Yeast 1、1985）のBamH I部位
に挿入された、Sau3Aで部分消化された染色体DNAの断
片）から得る。このクローン（１万個のTGY38.1のURA＋
形質転換体の中の１個の（Ｋ＋））を、kex2−１突然変
異による機能的欠陥を廃する能力、すなわち活性キラー
タンパク質の分泌、に基づいて単離する。
（pFL1（Parent,S.A.ら:Yeast 1、1985）のBamH I部位
に挿入された、Sau3Aで部分消化された染色体DNAの断
片）から得る。このクローン（１万個のTGY38.1のURA＋
形質転換体の中の１個の（Ｋ＋））を、kex2−１突然変
異による機能的欠陥を廃する能力、すなわち活性キラー
タンパク質の分泌、に基づいて単離する。
DNA配列（第２図）を分析することによって、2442塩
基対のコード配列が挿入部分（第２図の翻訳開始および
終結コードンによって囲まれた部分）に含まれることが
確認される。この配列は、KEX2遺伝子の公表された配列
（Mizuno K.ら:Biochem.Biophys.Res.Comm.156、1988）
に対応する。KEX2遺伝子のコード配列の分析によって、
814個のアミノ酸のポリペプチドに対応する情報が明ら
かになる。タンパク質は、約21個のアミノ酸の推定され
るシグナル配列を含む。Ｃ末端に近接している21個のア
ミノ酸の疎水性部分が検出され得る（位置679〜699）。
kex2−２突然変異による欠損を補完するEcoR I断片は、
塩基番号1349と3488との間の部分（第２図）で表され
る、KEX2遺伝子の産生物のＣ末端切断型をコードする。
基対のコード配列が挿入部分（第２図の翻訳開始および
終結コードンによって囲まれた部分）に含まれることが
確認される。この配列は、KEX2遺伝子の公表された配列
（Mizuno K.ら:Biochem.Biophys.Res.Comm.156、1988）
に対応する。KEX2遺伝子のコード配列の分析によって、
814個のアミノ酸のポリペプチドに対応する情報が明ら
かになる。タンパク質は、約21個のアミノ酸の推定され
るシグナル配列を含む。Ｃ末端に近接している21個のア
ミノ酸の疎水性部分が検出され得る（位置679〜699）。
kex2−２突然変異による欠損を補完するEcoR I断片は、
塩基番号1349と3488との間の部分（第２図）で表され
る、KEX2遺伝子の産生物のＣ末端切断型をコードする。
例2:プラスミドpTG3848、pTG3855,pTG3887、pTG3890お
よびpTG3872の構築 （Ａ） M13TG3841の構築 プラスミドpTG2958（第３図）は、欧州特許公開EP−
Ａ第252,854号明細書に記載のプラスミドpTG1833とほと
んど同じで、rHV2Asp47のコード配列を有している。プ
ラスミドpTG2958は、人工的に導入されたHind III制限
部位を含まない。プラスミドpTG2958は、以下のものを
含む。
よびpTG3872の構築 （Ａ） M13TG3841の構築 プラスミドpTG2958（第３図）は、欧州特許公開EP−
Ａ第252,854号明細書に記載のプラスミドpTG1833とほと
んど同じで、rHV2Asp47のコード配列を有している。プ
ラスミドpTG2958は、人工的に導入されたHind III制限
部位を含まない。プラスミドpTG2958は、以下のものを
含む。
（ｉ）MFα１遺伝子の５′領域に対応する547塩基対の
断片（プロモーター、シグナルペプチドをコードする配
列、「プロ」領域およびペプチドLys−Argをコードする
配列を含む）、 （ii）rHV2Lys47の相補的DNAを含む234塩基対の断片 （iii）酵母のPGKターミネーターからなる243塩基対の
断片、 （iv）このプラスミドの複製開始点およびアンピシリン
耐性のための遺伝子からとりわけなる、pBR322のPvu II
−EcoR I断片（2292塩基対）、 （ｖ）欠失したかたちでPst I部位に挿入された、酵母
のLEU2遺伝子を含む、酵母（Ｂ型）の２μプラスミドの
EcoR I−Hind III断片、 （vi）酵母のURA3遺伝子のHind III−Sma I断片。
断片（プロモーター、シグナルペプチドをコードする配
列、「プロ」領域およびペプチドLys−Argをコードする
配列を含む）、 （ii）rHV2Lys47の相補的DNAを含む234塩基対の断片 （iii）酵母のPGKターミネーターからなる243塩基対の
断片、 （iv）このプラスミドの複製開始点およびアンピシリン
耐性のための遺伝子からとりわけなる、pBR322のPvu II
−EcoR I断片（2292塩基対）、 （ｖ）欠失したかたちでPst I部位に挿入された、酵母
のLEU2遺伝子を含む、酵母（Ｂ型）の２μプラスミドの
EcoR I−Hind III断片、 （vi）酵母のURA3遺伝子のHind III−Sma I断片。
LEU2−ｄ、２μおよびURA3配列を有しているベクター
pTG2958のNco I−Nco I断片を、２μプラスミドの配列
を有し、更にプロモーターを欠失させた（URA3−ｄ）UR
A3遺伝子の配列を有している、欧州特許公開EP−Ａ第0,
268,501号に記載のpTG2800のNco I−Nco I断片によって
置換して、pTG2877を得る。
pTG2958のNco I−Nco I断片を、２μプラスミドの配列
を有し、更にプロモーターを欠失させた（URA3−ｄ）UR
A3遺伝子の配列を有している、欧州特許公開EP−Ａ第0,
268,501号に記載のpTG2800のNco I−Nco I断片によって
置換して、pTG2877を得る。
ベクターM13TG3839（第４図）は、同じ部位にpTG2877
のHind III−Hind III断片を導入したM13TG103（Kieny,
M.P.ら:Gene 26,1983）に由来する。このベクターに、S
al I制限部位を、rHV2Lys47をコードする領域の翻訳終
結コードンの下流に、次のオリゴヌクレオチドを用いる
方向づけした（directed）突然変異誘導によって導入す
る。
のHind III−Hind III断片を導入したM13TG103（Kieny,
M.P.ら:Gene 26,1983）に由来する。このベクターに、S
al I制限部位を、rHV2Lys47をコードする領域の翻訳終
結コードンの下流に、次のオリゴヌクレオチドを用いる
方向づけした（directed）突然変異誘導によって導入す
る。
その結果、M13TG3839 Sal Iを得る。次いで、Sph I制
限部位を発現カセットの上流に導入して、次のオリゴヌ
クレオチドを用いる方向付けした突然変異誘導によって
URA3−ｄ配列を除去して、M13TG3849を得る。
限部位を発現カセットの上流に導入して、次のオリゴヌ
クレオチドを用いる方向付けした突然変異誘導によって
URA3−ｄ配列を除去して、M13TG3849を得る。
ベクターM13TG131（Kieny M.P.ら:Gene 26、1983）を
Pst Iで切断して、末端をDNAポリメラーゼＩのクレノウ
断片で処理して平滑にして、次いでベクターをそれ自体
に再連結させて、M13TG3160を得る。次いでこのベクタ
ーをSma IおよびEcoR Vで切断して、その後で再連結し
て、M13TG3149を得る。
Pst Iで切断して、末端をDNAポリメラーゼＩのクレノウ
断片で処理して平滑にして、次いでベクターをそれ自体
に再連結させて、M13TG3160を得る。次いでこのベクタ
ーをSma IおよびEcoR Vで切断して、その後で再連結し
て、M13TG3149を得る。
rHV2Lys47（転写ターミネータ配列を含まない）の発
現のためのカセットを有しているM13TG3840（上記）のS
ph I−Sal I断片を、M13TG3149のSph I−Sal I部位に導
入して、M13TG3841（第４図）を得る。
現のためのカセットを有しているM13TG3840（上記）のS
ph I−Sal I断片を、M13TG3149のSph I−Sal I部位に導
入して、M13TG3841（第４図）を得る。
（Ｂ）プラスミドPTG3848の構築 欧州特許公開EP−Ａ第0,252,854号明細書に記載のプ
ラスミドpTG848をBgl IIで消化して、次いで再連結し
て、pTG2886を得る。pTG2886の大きいHind III−EcoR I
断片を、S.cerevisiaeの２μプラスミドの配列を有して
いるpFL1（Parent,S.Aら:Yeast 1、1985）の2.1kbのHin
d III−EcoR I断片にT4リガーゼの存在で連結させて、
プラスミドPTG2886、LEU2−ｄ、URA3−ｄを得る。URA3
−ｄ遺伝子を有している、欧州特許公開EP−Ａ第0,258,
501号明細書に記載のプラスミドpTG2800の0.9kbのHind
III断片を、次いでこのプラスミドのHind III部位に挿
入して、pTG2886、Ura3−ｄ、δLEU2−ｄを得る。次い
で、いくつかの制限部位を有するM13TG131（Kienyら:Ge
ne 26、1983）のSma I−Bgl II断片をこのプラスミドに
導入して、pTG3828を得る。
ラスミドpTG848をBgl IIで消化して、次いで再連結し
て、pTG2886を得る。pTG2886の大きいHind III−EcoR I
断片を、S.cerevisiaeの２μプラスミドの配列を有して
いるpFL1（Parent,S.Aら:Yeast 1、1985）の2.1kbのHin
d III−EcoR I断片にT4リガーゼの存在で連結させて、
プラスミドPTG2886、LEU2−ｄ、URA3−ｄを得る。URA3
−ｄ遺伝子を有している、欧州特許公開EP−Ａ第0,258,
501号明細書に記載のプラスミドpTG2800の0.9kbのHind
III断片を、次いでこのプラスミドのHind III部位に挿
入して、pTG2886、Ura3−ｄ、δLEU2−ｄを得る。次い
で、いくつかの制限部位を有するM13TG131（Kienyら:Ge
ne 26、1983）のSma I−Bgl II断片をこのプラスミドに
導入して、pTG3828を得る。
プラスミドpTG3828を制限酵素Sph I−Sal Iで消化し
て、次いでベクターM13TG3841（第４図）のSph I−Sal
I断片を次いでこの部位に連結させて、プラスミドpTG38
48を得る。このプラスミドは次のものを含む。
て、次いでベクターM13TG3841（第４図）のSph I−Sal
I断片を次いでこの部位に連結させて、プラスミドpTG38
48を得る。このプラスミドは次のものを含む。
（ａ）プロモーターを欠失させた、URA3遺伝子の配列、 （ｂ）MFα１遺伝子のプロモーター、 （ｃ）MFα１のプレプロ配列、 （ｄ）rHV2Lys47をコードする配列、 （ｅ）酵母のPGK遺伝子の転写ターミネーター、 （ｆ）大腸菌における複製および選択を可能にするpBR3
22の断片、 （ｇ）酵母中での減数分裂における複製および構成物の
等分配に必要な構造的構成要素を有する２μプラスミド
の断片。
22の断片、 （ｇ）酵母中での減数分裂における複製および構成物の
等分配に必要な構造的構成要素を有する２μプラスミド
の断片。
（Ｃ）pTG3855、pTG3887、pTG3890およびpTG3872の構築 これらのプラスミドはEcoR I部位で開裂させたpTG384
8に由来する。人工的なBamH I部位を、次のオリゴヌク
レオチドを用いる方向付けした突然変異誘導によってKE
X2遺伝子の終止コードンの下流に作出する。
8に由来する。人工的なBamH I部位を、次のオリゴヌク
レオチドを用いる方向付けした突然変異誘導によってKE
X2遺伝子の終止コードンの下流に作出する。
KEX2遺伝子（第５図［１］）の全構造構成要素からな
り、末端をクレノウDNAポリメラーゼで平滑にした、pTG
2809のXho I−BamH I断片（第２図の538〜4011に対応す
る）を、同様に処理したpTG3848のEcoR I部位に挿入し
て、プラスミドpTG3855を得る。末端をクレノウDNAポリ
メラーゼで平滑にした、pTG2809（第５図［２］）のXho
I−EcoR I断片（第２図の538〜3433に対応する）を、
同様に処理したpTG3848のEcoR I部位に挿入して、断片
の位置方向に応じてプラスミドpTG3887およびプラスミ
ドpTG3883を得る。プラスミドpTG3887の場合には、KEX2
の転写はプラスミドによってもたらされる細菌の配列
（pBR322）に向かって起き、プラスミドpTG3883の場合
には転写はプラスミドの２μ配列に向かって起きる。Ec
oR I部位とTGAとの間のKEX2遺伝子の部分を削除するた
めに、方向付けした突然変異誘導を次の配列のオリゴヌ
クレオチドを用いて行う。
り、末端をクレノウDNAポリメラーゼで平滑にした、pTG
2809のXho I−BamH I断片（第２図の538〜4011に対応す
る）を、同様に処理したpTG3848のEcoR I部位に挿入し
て、プラスミドpTG3855を得る。末端をクレノウDNAポリ
メラーゼで平滑にした、pTG2809（第５図［２］）のXho
I−EcoR I断片（第２図の538〜3433に対応する）を、
同様に処理したpTG3848のEcoR I部位に挿入して、断片
の位置方向に応じてプラスミドpTG3887およびプラスミ
ドpTG3883を得る。プラスミドpTG3887の場合には、KEX2
の転写はプラスミドによってもたらされる細菌の配列
（pBR322）に向かって起き、プラスミドpTG3883の場合
には転写はプラスミドの２μ配列に向かって起きる。Ec
oR I部位とTGAとの間のKEX2遺伝子の部分を削除するた
めに、方向付けした突然変異誘導を次の配列のオリゴヌ
クレオチドを用いて行う。
このように形質転換して（第５図［３］）、末端をク
レノウDNAポリメラーゼで円滑にしたpTG2809の人工的な
Xho I−BamH I断片（第２図の538〜4011に対応する）
を、同様に処理したpTG3848のEcoR I部位に次いで挿入
して、pTG3890を得る。KEX2遺伝子（第２図の381〜3844
に対応する）のSau3A−EcoR I断片（第５図［４］）を
含むpTG2809のEcoR I−EcoR I挿入物をpTG3848のEcoR I
部位に挿入して、プラスミドpTG3872を得る。
レノウDNAポリメラーゼで円滑にしたpTG2809の人工的な
Xho I−BamH I断片（第２図の538〜4011に対応する）
を、同様に処理したpTG3848のEcoR I部位に次いで挿入
して、pTG3890を得る。KEX2遺伝子（第２図の381〜3844
に対応する）のSau3A−EcoR I断片（第５図［４］）を
含むpTG2809のEcoR I−EcoR I挿入物をpTG3848のEcoR I
部位に挿入して、プラスミドpTG3872を得る。
例3:プラスミドによるrHV2Lys47の生産 遺伝子型MATα、ura3−251、373、328、leu2−３、11
2、his3、pep4−３の酵母菌S.cerevisiae種を、プラス
ミドpTG3848、pTG3872、pTG3855、pTG3887およびpTG389
0によって酢酸リチウム法（Ito,H.ら:J.Bacteriol.15
3、1983）を用いて形質変換させて、Ura+原栄養体を選
択した。次いでこれらをエルレンマイヤー中で選択培地
（0.7％の酵母のための窒素ベース（Yeast Nitrogen Ba
se）、0.5％のカザミノ酸および１％のグルコース）で3
0℃で培養する。48時間の培養の後、細胞および上清を
遠心分離によって分離して、トロンビン阻害活性を比色
試験（合成基質クロモチーム（chromozyme）TH（ベーリ
ンガーマンハイム社製）に対するタンパク質加水分解活
性）を用いて上清で決定した。分析の結果は表１に示さ
れる通りである。各値は、二つの独立した実験の平均に
対応する。
2、his3、pep4−３の酵母菌S.cerevisiae種を、プラス
ミドpTG3848、pTG3872、pTG3855、pTG3887およびpTG389
0によって酢酸リチウム法（Ito,H.ら:J.Bacteriol.15
3、1983）を用いて形質変換させて、Ura+原栄養体を選
択した。次いでこれらをエルレンマイヤー中で選択培地
（0.7％の酵母のための窒素ベース（Yeast Nitrogen Ba
se）、0.5％のカザミノ酸および１％のグルコース）で3
0℃で培養する。48時間の培養の後、細胞および上清を
遠心分離によって分離して、トロンビン阻害活性を比色
試験（合成基質クロモチーム（chromozyme）TH（ベーリ
ンガーマンハイム社製）に対するタンパク質加水分解活
性）を用いて上清で決定した。分析の結果は表１に示さ
れる通りである。各値は、二つの独立した実験の平均に
対応する。
rHV2Lys47活性を、細胞のATU/A600（１〜２×197細胞
/mlは1 A600nmユニットに対応する）で表す。
/mlは1 A600nmユニットに対応する）で表す。
本発明による構築物上のKEX2遺伝子の存在によって、
活性型のrHV2Lys47の生産を５倍に向上させることがで
きる。
活性型のrHV2Lys47の生産を５倍に向上させることがで
きる。
例4:プラスミドによる、エンドプロテアーゼyscFの比活
性 プラスミドpTG3848、pTG3855、pTG3883およびpTG3890
で形質転換させた酵母株の培養の粗抽出物を、上記の工
程に従って回収した。エンドプロテアーゼyscFの比活性
を、Achstetter T.およびWolf D.H.（EMBO J.4、173−1
77、1985）による方法によって決定する。この方法は僅
かに修飾されたもので、トリトンを用いない点において
これら著者らによるもとの異なっている。これらの分析
結果は、表２に示される通りである。
性 プラスミドpTG3848、pTG3855、pTG3883およびpTG3890
で形質転換させた酵母株の培養の粗抽出物を、上記の工
程に従って回収した。エンドプロテアーゼyscFの比活性
を、Achstetter T.およびWolf D.H.（EMBO J.4、173−1
77、1985）による方法によって決定する。この方法は僅
かに修飾されたもので、トリトンを用いない点において
これら著者らによるもとの異なっている。これらの分析
結果は、表２に示される通りである。
yscFの比活性は、mU/mgタンパク質で表される。タン
パク質はバイオラド（BIORAD）によって市販されている
キットを用いる比色法によって分析される。
パク質はバイオラド（BIORAD）によって市販されている
キットを用いる比色法によって分析される。
本発明による構築物上のKEX2遺伝子の存在によって、
産生されるエンドプロテアーゼyscFの比活性を向上させ
ることができる。これらの結果から、KEX2のEcoR I部位
とTGAとの間の断片（第２図の塩基3488から塩基3790ま
で）は、メッセンジャーRNAに関して非安定化の役目を
果たしていると結論づけてもよいと思われる。対照的
に、断片TGA−BamH I（第２図の塩基3790から4010ま
で）は、ターミネーターの役目を果たしており、これに
よって構築物を安定化させているようである。プラスミ
ドpTG3890を用いて得られるエンドプロテアーゼyscFの
型は、したがって、比活性が参照型に較べて高められる
型に対応する。
産生されるエンドプロテアーゼyscFの比活性を向上させ
ることができる。これらの結果から、KEX2のEcoR I部位
とTGAとの間の断片（第２図の塩基3488から塩基3790ま
で）は、メッセンジャーRNAに関して非安定化の役目を
果たしていると結論づけてもよいと思われる。対照的
に、断片TGA−BamH I（第２図の塩基3790から4010ま
で）は、ターミネーターの役目を果たしており、これに
よって構築物を安定化させているようである。プラスミ
ドpTG3890を用いて得られるエンドプロテアーゼyscFの
型は、したがって、比活性が参照型に較べて高められる
型に対応する。
第１図は、ヒルジン変異体HV1、HV2およびHV3の配列を
示す図である。 第２図は、酵母のKEX2遺伝子のゲノムDNAの配列を示す
図である。 第３図は、プラスミドpTG2958を示す図である。 第４図は、ベクターM13TG3839およびM13TG3841の構造を
示す図である。 第５図は、用いられるKEX2遺伝子断片の制限酵素地図を
示す図である。
示す図である。 第２図は、酵母のKEX2遺伝子のゲノムDNAの配列を示す
図である。 第３図は、プラスミドpTG2958を示す図である。 第４図は、ベクターM13TG3839およびM13TG3841の構造を
示す図である。 第５図は、用いられるKEX2遺伝子断片の制限酵素地図を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 昭63−152987（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−85082（ＪＰ，Ａ) Ｆｏｕｎｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎ ｄ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｒｅｓ．，Ｖｏ ｌ．５（1987）ｐ．139−148 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．６，Ｎｏ．１（1988）ｐ．72−77 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．156, Ｎｏ．１（1988）ｐ．246−254 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/81 C12N 1/19 C12P 21/02 C07K 14/815 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】酵母において複製可能なマルチコピープラ
スミドであって、 下記KEX2遺伝子： の変異体のコピーと、異種タンパク質の発現のための下
記のブロック： （ａ） 成熟可能なタンパク質の前駆体をコードする配
列の、酵母における転写を可能にするシグナルを含んで
なるDNA配列（Str）、 （ｂ） シグナルペプチドまたはプレペプチドおよび／
またはプロペプチドをコードするDNA配列（Spr）、 （ｃ） 前記KEX2遺伝子の変異体の産生物により、タン
パク質加水分解によって切断される部位を含んでなるペ
プチドをコードするDNA配列（Scl）、および （ｄ） 前記Sprとともに、前記（ａ）に記載の前記前
駆体を形成する、異種タンパク質をコードするDNA配列 とを少なくとも含んでなり、 前記KEX2遺伝子の変異体が、 前記KEX2遺伝子の配列の塩基番号3488と3790との間の配
列が欠失しているものであり、 前記KEX2遺伝子の配列の3791から4011までの配列からな
るターミネータ断片を含み、かつ その産生物のタンパク質加水分解活性が高められたもの
である ことを特徴とする、プラスミド。 - 【請求項２】前記KEX2遺伝子の変異体が、請求項１に示
されるKEX2遺伝子の配列の、3488から3790までの塩基が
欠失した381から4011までの配列からなるものである、
請求項１に記載のプラスミド。 - 【請求項３】前記KEX2遺伝子の変異体が、請求項１に示
されるKEX2遺伝子の配列の、3488から3790までの塩基が
欠失した538から4011までの配列からなるものである、
請求項１に記載のプラスミド。 - 【請求項４】前記KEX2遺伝子の変異体が、請求項１に示
されるKEX2遺伝子の配列の1349から3488までの配列と、
3791から4011までの配列からなるターミネーター断片と
からなるものである、請求項１に記載のプラスミド。 - 【請求項５】前記異種タンパク質がヒルジンである、請
求項１〜４のいずれか一項に記載のプラスミド。 - 【請求項６】前記ヒルジンがrHV2Lys47である、請求項
５に記載のプラスミド。 - 【請求項７】請求項１に示されるKEX2遺伝子の配列の37
91と4011との間の配列が、安定化の役割を担うものであ
る、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプラスミド。 - 【請求項８】前記Sclが、Lys−ArgまたはArg−Argペプ
チドをコードする配列である、請求項１〜７のいずれか
一項に記載のプラスミド。 - 【請求項９】前記Sprが、酵母における強力なプロモー
タである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプラス
ミド。 - 【請求項１０】前記プロモータが、酵母のαフェロモン
プロモータである、請求項９に記載のプラスミド。 - 【請求項１１】前記Sprが、酵母のMFα１遺伝子のプレ
プロ配列である、請求項１〜10のいずれか一項に記載の
プラスミド。 - 【請求項１２】前記Sprに、Lys−ArgまたはArg−Argペ
プチドをコードする配列が続く、請求項１〜11のいずれ
か一項に記載のプラスミド。 - 【請求項１３】請求項１〜12のいずれか一項に記載のプ
ラスミドを含んでなる、酵母株。 - 【請求項１４】前記酵母が、サッカロミセス・セルビシ
エ株である、請求項13に記載の酵母株。 - 【請求項１５】請求項13または14に記載の酵母株を適切
な培地において培養し、得られる成熟異種タンパク質を
回収することを含んでなる、成熟異種タンパク質の製造
法。 - 【請求項１６】前記成熟異種タンパク質がヒルジンであ
る、請求項15に記載の方法。 - 【請求項１７】前記ヒルジンがrHV2Lys47である、請求
項16に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8904305 | 1989-03-31 | ||
| FR8904305A FR2645174B1 (fr) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0372867A JPH0372867A (ja) | 1991-03-28 |
| JP3135550B2 true JP3135550B2 (ja) | 2001-02-19 |
Family
ID=9380295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02087339A Expired - Fee Related JP3135550B2 (ja) | 1989-03-31 | 1990-03-31 | 成熟異種タンパク質、特にヒルジン、の製造のための改良された酵母株、および対応するヒルジンの製造法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5521093A (ja) |
| EP (1) | EP0396436B1 (ja) |
| JP (1) | JP3135550B2 (ja) |
| AT (1) | ATE109506T1 (ja) |
| CA (1) | CA2013239C (ja) |
| DE (1) | DE69011183T2 (ja) |
| DK (1) | DK0396436T3 (ja) |
| ES (1) | ES2060974T3 (ja) |
| FR (1) | FR2645174B1 (ja) |
| PT (1) | PT93614B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10392827B2 (en) | 2014-02-27 | 2019-08-27 | Parsons Corporation | Wind tower erection system |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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