PT93614B

PT93614B - Estirpe de levedura melhorada para a producao de proteinas heterologas maduras,em particular hirudina, e processo para a preparacao da hirudina correspondente

Info

Publication number: PT93614B
Application number: PT93614A
Authority: PT
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-30
Publication date: 1996-08-30
Also published as: JP3135550B2; DK0396436T3; ATE109506T1; JPH0372867A; EP0396436A1; US5521093A; ES2060974T3; CA2013239A1; PT93614A; FR2645174B1; DE69011183D1; CA2013239C; EP0396436B1; FR2645174A1; DE69011183T2

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 93 614

REQUERENTE: TRANSGENE S.A., francesa, industrial, com sede em 16 Rue Henri Regnault, 92400 Courbevoie, França.

EPÍGRAFE: « ESTIRPE DE LEVEDURA MELHORADA PARA A PRO

DUÇÃO DE PROTEÍNAS HETERÔLOGAS MADURAS , EM PARTICULAR HIRUDINA, E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA HIRUDINA CORRESPONDENTE

INVENTORES:

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

França, em 31 de Março de 1989 sob o n®. 8904305.

INPI MOO 113 RF 10732

S20SS

Ref. 334 673/d. 12311

f/- ? \ ç

-RESUMOESTIRPE DE LEVEDURA MELHORADA PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS MADURAS, EM PARTICULAR HIRUDINA, S PROCESSO PARJ

A PREPARAÇÃO DA HIRUDINA CORRESPONDENTE”

Descreve-se uma estirpe de levedura melhorada para a produção de proteínas heterólogas mad.uras, em particular hirudina, poi' leveduras que compreendem um vector de e;<pre^cão que contem uma sequência que codifica para a proteína heteróloga. Este aperfeiçoamento é caracterizado pela amplificação do gene KEX2 de levedura, que codifica para a endo-protease jscp. A amplificação efectua-se quer por integração de uma ou mais cópias de todo ou parte do gene ΚΞΧ2 no genoma de levedura, quer por inserção de uma ou mais cópias de todo ou parte do gene KEI.2 no vector de e:<pre=- = ão da prot eína het erólog a.

62066

Ref. 334 67S/D. 12811

Descrição do Objecto do Invento que

TRAN3GSNE S.A., sociedade anóni ma francesa, industrial, com se de em 16 Rue henri Regnault, 92 400 Courbevoie, França, pretende obter em Portugal, oara: ESTIRPE DE LEVEDURA MELHORADA PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HETERÔLOGAS MADURAS, EI·' FARTICU LAR xiIRUDINA, E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA HIRUDINA CORRESPONDENTE .

presente invento refere-se a um aperfeiçoa mento proporcionado na preparação de proteínas heterólogas por meio de leveduras recombinantes, por exemplo Caccharomyces cerevisiae, e mais particularmente na preparação de hiru dina. Refere-se em primeiro lugar a uma nova estirpe de leve dura produtora da proteína hetenóloga transformada por um ve ctor que permite a expressão da proteína em forma madura.

As leveduras são organismos eucariotas unice lulares; o género de levedura 5asscharom.yces compreende estirpes cuja bioquímica e genética são estudadas intensivamen te em laboratório; compreende também estirpes utilizadas na indústria alimentar (pão, bebidas alcoolizadas...) e produzi das, por conseguinte, em quantidades muito grandes. A facili dade com a qual se pode manipular a genética das células de Saccbaromyces cerevisiae e a longa história industrial desta espécie fazem dela um hospedeiro de primeira qualidade para a produção de proteínas estranhas utilizando as técnicas do ADN recombinante.

Quando se procura obter proteínas com interesse industrial, destinadas a ser produzidas· em grande quar. tidade, é desejável que a proteína, para que esta conserve as propriedades desejadas, seja produzida essencialmente sob forma madura, isto é destituída de qualquer ácido aminado ou

62066

Ref. 334 678/D. 12811

9./1/ /

sequência peptídica suplementar que fique fundida ccm a proteína. Isto é particularmente desejável no ca<=o da hirudina. De facto, a hirudina, cuja fonte principal está nas glândulas- salivares das «angueeeugae medicinais, sob a forma de uma mistura de peptídeos de 65 a 66 ácidos aminados, é um inibidor muito específico e muito eficaz da trombina. Trata-ce portanto, de um agente terapêutico muito interessante, cuja utilização em clínica exige uma pureza muito grande de um produto activo.

Identificaram-se algumas variantes da hirudina que são designadas por hVl, nV2, uV3. As suas Estruturas estão indicadas na figura 1. Depois, estas variantes naturais e outros análogos foram preparados por meio de engenharia genética, era particular por meio de fermentação de estirpes de

3. cerevisiae, conforme e d°sorito, por exemplo, nas publicações europeias de patente ΞΡ-A-0252354 5P-A-0273S00 em nome da Requerente.

Conforme já foi indicado, a levedura 3. çere visiae é particularmente interessante, portanto, para a produção de proteínas heterólogas, quer dizer proteína^ que não são nem produzidas naturalmente pela levedura, nem necessárias ao seu crescimento. De facto, est a .levedura ° capaz de segregar por si própria algumas proteínas no meio de cultura, correctament e processadas, isto é, numa forma madura. Por exemplo, encontra-se no meio de cultura de uma estirpe de sac charomyces cerevisiae de tipo sexual alfa, a feromona sexual alfa.

A feromona sexual alfa de levedura é um oeptídeo de 13 amino ácidos. Kurjan e Hershowitz (1932, Cell.

30< 933-934) clonaram o gene estrutural do precursor da feromona alfa (MFalphal) e deduz-se da sequência deste gene que este factor alfa de 13 amino ácidos estava sintetizado sob a forma de uma pré-pro-proteina percursora de 165 amino ácidos. 0 precursor contém uma sequência sinal hidrófobo amino terminal de 19 resíduos seguidos por uma sequência ”pro de 64

9_

52056

Ref. 334 673/L. 12811

ácidos aminados que contêm 3 locais de glicosllação, seguida cor sua vez pela sequência Lys-Arg que precede 4 cópias do factor alfa separados por peptídeos espaçadores.

Demonstrou-se que a sequência sinal é efectivamente clivada ao nível do retículo endoplásmico por uma pepitdase «specífica. A sequência pro é sujeita a uma N-glicosilação iniciada no retículo endoplásmico. A primeira fase de clivagem proteolítica é efectuada pelo produto do gene KE X2, isto e, a endo-protease ysc?, ao .nível dos sinais especi ficos Lys-Arg ou Arg-Arg. Esta maturação efectua-se provável mente no aparelho de Golgi. Estabeleceu-se claramente que es tirpes de S. cerevisiae que sofreram mutações no gene KEX2 já não conseguiam segregar uma forma activa da proteína killer (Leibowitz e Wickner (1976) PNA3 USA 2051-2065) ou da feromona alfa (Julius et al. (1984) Cell 37. 1075-1039) devi do a uma maturação defeituosa destas proteínas· invento propõe, a partir destes estudos de natureza fundamental, amplificar um gene KEX2 funcional numa eatirpe de levedura produtora de uma proteína heterologa a fim de obter uma proteína madura.

invento propõe em particular meios para au mentar a quantidade de hirudina madura,segregada por uma es tirpe de levedura como Saccharo.myçes cerevisiae favorecendo o processo de maturação;

invente tem assim como objecto uma estirpe de levedura produtora de uma proteína heterologa sob forma madura que compreende o bloco de expressão seguinte, pelo me nos ί

-uma sequência de ADN (str) que compreende os sinais que garantem a transcrição pela levedura da sequên cia que codifica para um precursor da proteína amadurecível,

-uma sequência de ADN (Sor) que codifica para um peptídeo sinal pre e/ou um peptídeo pro,

-uma sequência de ADN (Scl) que codifica para um peptídeo que compreende um local de clivagem proteolí-362066

Ref. 334 678/?. 12811 tica pelo produto de todo ou parte do gene K3IX2,

-urna sequência de ADN que codifica para a proteína heteróloga, que, coq a sequência Spr, forma o precursor, caracterizada por compreender uma ou mais cópias da todo ou parte do gene ΚΞΧ2 que conduz a um aumento da actividade proteolítica da ^ndoprot esse yscF.

Conforme foi atrás indicado, o invento aplica-se muito particularmente bem à produção de hirudina, designadamente da variante ruV2Ly<=47· gene K3X2 pode ser obtido, conforme =erá adiante descrito, por clonaçao a partir de um banco de ADN total de levedura. A sequência do gene está indicada na figura 2. Não foi retomada na descrição para não a tornar mai pesada, mas deve ser entendido que e<sta figura 2 faz parte integralmente da descrição.

Diferentes fragmentos deste gene podem ser utilizados de acordo com o invento: quer a totalidade da saquência indicada na figura 2 a partir da base 381, que corresponde à totalidade do ADN genómico do gene K3X2; quer úni camente a sequência funcional deste gene, içto á, a que está compreendida entre as bases numeradas 1349 e 5793 (delimi tada pelos codões ATO e TGA de iniciação e terminação de tra dução) na figura 2· quer mesmo apenas uma parte da sequência codificadora, por exemplo a parte compreendida entre as baces numeradas 1349 θ 3438 na figura 2.

A presença do fragmento situado entre as bac.es numeradas 3790 e 4010 da figura 2 na extremidade 3’ do segmento do gene K5X2 melhora a exprec-eão do gene, de «empenhando um papel de terminador e estabilizador da construção.

É desejável eliminar o fragmento compreendido entre as bases numeradas 3483 e 3790 na figura 2, o qual teria um papel deseetabilizadon ao nível do ARN mensageiro.

A amplificação da pxpree^ão do gene pode <=er realizada de diversa- maneiras· Numa primeira variante, uma ou várias cópias de todo ou parte do gene ΚΞΧ2 cão integra-462CSS n?

>f. 334 673/L. 12811

âas directamente no genoma da levedura. Numa segunda variante, uma ou várias copiai de todo ou parte do gene KEX2 são inserida? no vector de expressão da proteína lieteróloga, fera do bloco de expressão propriamente dito. No 'seguimento d descrição, o interesso incidirá «sobretudo na «segunda variante.

produto do gene KSX2 efectua as clivagens proteolítica? de maneira específica, u por isso qu° a« eoquências 3cl devem ser escolhidas entre um núm°ro limitado de «sequências po-s£v»is. Escolher-se-ão de preferencia o« pe ptídeos Lys-Arg ou Arg-Arg ou mesmo 3er-Leu-Asp. Estas sequências 3cl podem ser ou não precedidas por uma sequência pro”, quer dizer que podem «ser ou não associada? a um siote ma de «secreção complexo. De facto, logo que o local de cliva gera proteolítica pelo produto do gene KEX2 «=stá presente, á de esperar que a maturação da proteína se efectue, qualquer que seja o sistema de secreção utilizado: uma sequência que codifica para um peptídeo sinal pré ou tal sequência associa da a uma sequência pro (sequência prá-pro).

Uma construção particularmente interessante para a produção de hirudina á a que associa a sequência pré-pro da feromona alfa de levedura do local de clivagem Lys-Arg ou eventualmente Arg-Arg. Finalmente, também tem interesse utilizar como sequência Str um promotor forte na levedura, de maneira a transcrever uma quantidade importante de ARNm correspondente ao precursor da proteína amadurecível e a utilizar o gene KSX2 com um máximo de eficácia. Como promotor forte, pode citar-se por exemplo o promotor da feromona alfa de levedura ou ainda o promotor PGK de levedura.

Finalmente, os vectores de expressão poderão apresentar, depois da sequência de ADN que codifica para a proteína madura, uma sequência de terminador de levedura,por exemplo o do gene PGK.

Cs vectores de expressão serão em geral pias míd.eos de replicação autonema. Estes plasmideos terão elemen

-567Ô/D. 12311

tos que garantem a sua replicação, isto é, uma origem de γρplicação tal como a do plasmídeo 2>u de levedura. Além disso o plasmídeo poderá compreender elementos de selecção como o gene URA3 ou 1EU2 que promovem a complementação do*³ mut antes de levedura ura3 ou leu2. Em particular, poderá utilizar-se vantajo®amente o gene URAJ destituído do sou promotor.

Estes plasmídeos podem também compreender elementos qu^a promovem a sua replicação <°m E. coli, quando o plasmídeo d^oves^ar um plasmídeo lançad°ira, por exemplo uma origem de replicação como a do p3R322, um gene marcador como PpR e/ου. outros elementos conhecidos pelos técnicos d.a especialidade .

Entre todas as estirpes de levedura que podem ser consideradas, utilizar-se-ão c.e preferencia as estirpes do género 3accharomyc°s. de signadamente da <=spé_Gie çerevisjao. Quando o promotor p o do gene MFalphal, a levedura será de preferência de tipo sexual ííATalfa. Utilizar-=e-á, por exemplo, uma estirpe de genotipo ura3 ou leu2 ou outro, complementada pelo plasmídeo para promover a manutenção do plasmídeo na levedura por uma pr°s-ão d.e seie_Cçgo apropriada,

Finalmente, o invento tem como objecto um processo de preparação de uma proteína hetercloga madura por leveduras, «efundo o qual se promove a cultura num meio apropriado das estirpes de acordo com o invento ° _eP recupera a proteína madura segregada no meio de cultura.

Mais part icularmente, o invento diz respei·· to a um processo de secreção d° hirudina, d° signadamente da variante rúV2Ly«47, ®ob forma madura a partir das estirpes de leveduras de acordo com o invento.

Os exeuiplos qu° se seguem permitirão destacar outras caracteristicas e vantagens do present° invento. Este exemplos serão representádd.s «pelas figuras seguintes:

-a figura 1 representa a sequência das variantes AVI, uV2, hV3 da hirudina.

-a figura 2 representa a sequência do ADK

-6c

62066

Ref. 334 Ó73/D. 12311

genomico do gene KEX2 da levedura,

-a figura 3 representa esquematicamente

-a plasmídeo pTG2953.

-a figura 4 representa esquemática me nt» estrutura dos vector®s H13TG3839 ® í13TG3341.

-a figura 5 representa esquematicamente carta d® restrição dos fragmentos do gene KEX2 utilizados.

ne KEX2 manifesta-se numa estirpe de levedura FATalfa pela ausência d® secreção de ferornona alfa activa e numa estirpe d^p lev°dura que tem c ARN killer (K+) pela ausência de c°cr°' ção da toxina killer. A estirpe TGY33.1 e utilizada como estirpe receptora para a clonagem do gene KEX2. Para obt^r esta estirpe, as estirpes 30 (KATa, kex2-l, ad®I, ural, j~KIL-kj K- R+) ^Yeast Genetic 3tock Center, 3®rk®ley CA 94720/] e TGYlsp4 (MATalfa, his3> ura3) são primeiramente cruzadas. 0 diplóide obtido TGY33 á posto a esporular. Um esporo TGY33·! é seguidamente caracterizado, o seu genotipo ® KATa, his'3, ura3, kex2-l. Efectua-se um cruzamento de retorno com TGlsp4 0 diplóide obtido TC-Y33 é posto a esporular. Depois d® ge_rmi nação, isola-ee um segregante TGY3S.1 (KATa, ura3, his3, kex

2-1) que tem melhor eficácia d® transformação.

0btem-se um clone genomico, pTG2S09 a partir do banco genomico d® 1®ν®άura(fragmentos de ADN cromossó mico parcialmente digerido por Sau3A inseridos no local BamH: de pFLl J/Parent, 3.A. et al. Y®ast 1 (1935)3 · Sst® clon°(um k+) entr® dez mil transformantes URA+ da estirpe TYG38.1) é isolado com base na sua capacidade para suprimir o defeito funcional d°vido a mutação kex2-l: secr®ção kill°r activa.

d® uma prct°ína

co oetá contida na inserção (delimitada pelos codõe® d° iniciação ° de terminação de tradução na figura 2). A sequência corresponde á sequência publicada do g°ne KEX2 Qpizuno K. et al., Biochem. 3iophy°· R^ps. Coram, lpo (1933)^} . A. análise da sequência codificadora do gene KEX2 r°vela uma informação correspondente a um polipeptideo de 814 ácido® aminados. A. proteína conteria uma sequência sinal putativa d» aproximada mente 21 ácidos aminados. Jma parte hidrófoba de 21 ácidos aminados localizados porto da parte C-terminal pode sor posta em destaque (posição 679-899). 0 fragmento EcoRI que completamente a deficiência d°vida à mutação kex2-l, codifica para uma forma truncada em C-terminal do produto do ΚΞΧ que representa a part° compreendida entre as ba®oe numerada® 1349 ^A 3433 (figura 2).

EXEMPLO 2: Construção dos plasmideo® pT&3343, dTG3835, pTG 3337, PT&339O ° _ptg3872

A. Construção de M13TG3841 plasmideo pTG2953 (figura 3) é pouco diferente do plasmideo pTGlS33 descrito na publicação europeia d° pat°nte SP-A-252354 portador da sequência codificadora pa ra rhV2Asp47· 0 plasmideo pTG295S não contém o local de restrição HindIII introduzido artificialmente. 0 plasmideo pTG 2953 contém:

- um fragmento de 547 pares d° bases correspondente à região 5’ do gene MFalfal (qu° contém o promotor, a sequência codificadora para o peptídeo sinal, a região ”pro^,f e uma sequência que codifica para 0 peptídeo Ly®-Arg),

- um fragmento de 234 pares d° bases qu^a contêm o ADN comple mentar de mV2Ly®47,

- um fragmento de 243 pares de ba®e® que compreendem c termi nador PGK de levedura,

- o fragmento PvuII-EcoRI σ^Λ p3R322 que compr^nde entr° outra® a origem c° replicação d^c^-t° plasmideo ° o g°ne resistência a ampicilina (2292 par°s de ba®e®),

62066

Ref. 334 573/L. 12811

30. 199) /77 ί

- ο fragmento EcoRI-ηinaIII do plasmideo 2//da levedura (for ma 3), úlí° contém o gene LEU2 d^Q levedura, eob a forma elimí nada e inserido no local PstI,

- um fragmento uindlll-3mal do gene URA3 de levedura.

fragmento Ncol-Ncol do vector pTG2953 qu° t°ci as eequonciae LEU'2-d, 2/j & URA3 ° substituídc p^alo fragmento Ncol-Ncol de pTC-2300 descrito na publicação “uropeia ce patente EP-A-02633G1 que t°m a® s%a“ncia« do pis« ;· p eo 2/J e do gene URA 3 destituído do se·? ”· ηη.υηί- .-vs f o ara d o r ol C-2 877·

13TG1O3 [jíieny,

H-χ rov.oz or (UR.A3”d.) ,Λ vector K13TG3339 (figura 4) et al. Gene 26 (1933)21 no deriva de I’ uai o fragmento iiindlll-iiinllI de pTG2877 é introduzido no mesmo local Um local de restrição Gall é introduzido n°st^o v^actor a jusante do codão de terminação de tradução da região codificadora para rHV2Lps47 por mutagénese dirigida com a contribuição do oligonucl°ótido seguinte;

5’ CAATGAAAAATGGTGGAGTATCAATCATAG para dar M13TG3339 Sall. Introduz-se então um local d.° restrição 3phl a montante da caixa d° eliminando a se quência URA3“d por mutagénese dirigida com a contribuição do oligonucleótido seguinte;

* GAGGGGGAGTGAATTGGCATC-CTATTGATAAGATTTAAAG para dar M13TG3340.

vector K13TG131 QKieny M.P. et al. Gene 26 (1983)2] é clivado por PstI, tornando-se a® extremidades francas por meio de tratamento com fragmento Klenow do ADN polimerase I para ser seguidamente religado sobre si próprio para dar M13TG31ÓO. Este vector <=> ceguidamente clivado oor 3mal e EcoRV ° gognida religado para dar EL3TG3149.

fragmento Sphl-Sall de M13TG3S4O (atras descrito) que tem a caixa de expressão de rnV2lysg7 (som sequência terminadora de transcrição) é introduzido no local 3phl-oall de N13TG3149 para dar N13TG3SA1 (figura g).

3. Construção do plasmideo p?G3S43 _O_

Ó2GÓB

Ref. 334 673/υ. 12311

70.MÍÍ 19) ^rtj_L plasmídeo 0TG848 descrito na publicação europeia de patente EP-A-0252854 é digerido por BglII e em seguida religado para dar pTG2336. 0 grande fragmento nina III-EcoRI de pTG23S3 é ligado na presença de ligase T4 ac fragmento xíindlll-EcoRI de 2,1 kb do plasmídeo pFLl f^Parent, â.A. et al. Yeast 1 1935^ que tem a sequência do plasmídeo 2 âe S. çerevisiae para dar o plasmídeo pTG28S3 LEU2-d, URA3-d· 0 fragmento iiindlll d° 0,9 kb do plasmídeo pTG2300 descrito na publicação europeia de patente EP-A-0253501 que tem o gene URA3-d é então inserido no local HindIII deste plasmí· deo para dar pTG2883 URA3-d, delta LEU2-d. 0 fragmento 3mal-BglII de M13TG131 [jíieny et al. Gene 25; 1983J que tem vários locais de restrição é seguidamente introduzido neste plasmídeo para dar pTG3S23.

plasmídeo pTG3328 é digerido pelas enzimas de restrição 3phI-SalI, e em seguida o fragmento Sphl-Sall do vector M13TG3841 (figura 4) é inserido neste local para dar o plasmídeo pTC-3848. Este plasmídeo compreende:

- a sequência do gene URA3 destituída do promotor,

- o promotor do gene MPalfal,

- a sequência pré-pro de KFalfal,

- a sequência que codifica para rHVLysg7

- o terminador de transcrição do gene PGK de levedura

- um fragmente de pBR322 qu° permite a replicação e selecção em Esçherichia coli,

- um fragmento do plasmídeo 2 /J que tem os elementos e^trutu· rai<= necessários para a replicação e equipartição mitótica na levedura.

C. Construção de pTG3355, pTG3387, pTG3S9O e _?TG3372

Estes plasmídeos derivam d° pTG334S aberto no local EcoRI. Cria-se um local artificial Bamn.1 a jusante de codão stop do gene KEX2 por mutagénese dirigida com a con tribuição do oligonucleótido seguinte:

5’ TAAAAGGGGAGGATCCAATTAATGC 3’ fragmento XHcI-Barrml (coordenadas 533 a 4011, figura 2) de

-1062C66

Ref. 334 673/D. 12311

□TG2809 que compreende todos o«g elementos estruturais do gene KSX2 (figura di) cuja® extremidades eão tornadas francas pela ADN polimerase de Klenow é inserido no local ScoRI de pT&3343 que foi sujeito ao mesmo tratamento para dar o plasmídeo pTG3355· 0 fragmento Xhol-ScoRI (coord°nadae 533 a 3433, figura 2) de pTG28O9 (figura 5 C.²Zl ) cujas extremidades são tornadas francas pela ADN polimerase de Klenow para ser inserido no local ScoRI de pTG3S43 que foi sujeito ao mesmo tratamento para dar o plasmídeo pTG3337 e o plasmídeo □TG3333 segundo a orientação do fragmento. No ca?o do plasmí deo pTG3887, a transcrição de KSX 2 faz-se em direcção à sequência bacteriana (p3R322) contida no plasmídeo, enquanto que para 0 plasmídeo pTG33S3 a transcrição se faz em direcção à sequência 2/j do plasmídeo. Para eliminar a parte 80 gene KSX 2 compreendida °ntre o local ScoRI e o TGA, realiza-se uma mutagenese dirigida utilizando o oligonucleótido de sequência :

5’ AAGAGGGGAAACGTATGAATGATTCGATATGTACAGAAAG 3’ fragmento Xhol-3amiil artificial (coordenadas 533 a 4011, figura 2) de pTG2809 a^im transformado (figura 5^3j ), cujas extremidades são tornadas francas pela ADN polimerase de Klenow, é seguidamente inserido no local ScoRI de plG3343 que foi sujeito ao mesmo tratamento para dar o plasmídeo pTG 3390. A inserção ScoRI-ScoRI de pTG28O9 que contém o fragmen to 3au3A-ScoRI do g°ne KSX 2 (cooord®nadas 331 a 3433, figura 2) (figura 5 D+J ) é i_flSo_rig_{c n0} local ScoRI d° pTG3343 para dar o plasmídeo pTG3S72.

SXSMPLO 3: Produção de ru.V2Lys47 em função do plasmídeo uti· lizado uma estirpe ce levedura da «spécie Saceneromyc°3 c*»reyi?iae de genotipo NATalda, ura3-251, 373, 323, leu2-3, 112, Kisj, peei.-3 a transformada pelos plasmíd°os pT G3S43, pTG3S72, P1GJ355, pTGJSG? e pTC38SG pelo processo do acetato de lítio [jto, n. et al. J. Bactériol. 155: I9S3J e

-1162055

Ref. 334 678/d. 12811 •⁷C Hí? 1990 ζλ/ ^rtÀ eeleccionam-?e protótrofos Ura+. Seguidamente são po?tos pe cultura pe erlpnE^oi'pr a 3020 sobre um meio selectivo (0,7 fde bases azotada? para levedura? (Yea^t Nitrogen 3ase), 0,5 / de ca?amino acido? e 1/ de glucose). Depois de 48 horas de cultura, separam-se células e sobrenadante por centrifugação e determina-se 5 actividade inibidora da trombina no soorena·· dante utilizando o ensaio colorimétrico (actividade proteolí·· tica sobre ura substrato sintético, o cromozima TH - Boebringer Idanneim). 0 quadro 1 apresenta os resultados fias άο^Π'ΐ; cada valor corresponde à média d° duas experiências independentes. A actividade d° riiV2Lys47 é pxpr°«g psj ATb’/A6C0 das células (1-2x10^ célula?/ml correspondem a 1 unidade AôOO nm .

Quadro 1

Plasmideo	KEX2	ÁTU/A600
pTG3848	-	8
DTG3372	ra	23
pTG3355	ra	34
PTG3337	ra	34
PTG339O	ra	40

A presença do gene KEX2 sobre as construções de acordo com o invento permite um aumento da produção de rKV2ly?47 sob forma activa de um factor cinco.

EXEMPLO 4: Actividade específica da endo-protease yscF °m função do plasmideo utilizado

Recuperam-se os extratos brutos de cultura de estirpes de leveduras transformadas pelos pla«míõ°o«! pTG 3843, 0TG3S55, pTG3333 e pTC-3890 de acordo com os métodos atrás descritos. A actividade específica da endo-protease y«c F é determinada pelo proc°-^o des_Crito na publicação de Achs tetter T. e Wolf D.H. (1985) (EM30 J. 4 ; p 173-177). Este

O6UQO

Ref. 334 678/D. 12811

processo p um pouco modificado, da facto não se emprega Triton, contráriamente a estes autores.

quadro 2 apr°<=enta o? rpsultados âesta= co?sg^on?· A actividade p^pacífica de yscF e expressa em mU/ mg de proteína. As proteínas são doseadas por um procedo co lorimptrico utilizando o pstojo comercializado por BIORAL·

Quadro 2

Plasmídeo	KEX 2 forma	Actividade psppcí fica
PTG3348	—	2,8
PTG3S55	(1)	43,7
pTG3333	(2)	<-·> /> 0 í- u _f u
pTG3390	(3)	74,0

A prpsença do gene Kex 2 eobre as construções de acordo com o invento permite aumentar a actividade °specífica da endo-protea<=e yscF produzida. Deste*? resultado ? pode concluir-ee que o fragmento compreendido entre o local EcoRI de KEX 2 a o TGA (da base 3488 at“ à base 3790; figura

2) desempenharia um papel desestabilizador ao nível do ARN mpnsageiro. Em contrapartida, o fragm°nto TGA-BamílI (da base 3750 ate à base 4010; figura 2) dp*?empenharia o papel de ter·· minador e estabilizaria a^im a construção. A forma da endo-protease yscF obtida por meio do plastnídeo pTG389O corresponde, portanto, a uma forma cuja actividade específica é aumentada pm comparação com a forma de referencia.

Deposito do primeiro pedido para o Invpn·· to acima descrito foi efectuado em França, pm 31 de Narço de 1589 = cb o n°. 8904305.

-13199p<

62066

Ref. 334 673/D. 12311

Claims

-REIVINDICAÇÕE3lâ:.- Estirpe de levedura produtora de uma proteína heteróloga melhorada que compreende o bloco de expressão seguinte, pelo menos; - uma sequência de ADN (str) que compreende os sinais que promovem a transcrição para a levedura da sequência que codifica para um precursor da proteína amacurecível, - uma sequ«ncia de ADM (3pr) que codifica para um sinal peptídeo pre e/ou um peptídeo pro, - uma sequência de ADN (Scl) que codifica para um peptídeo que compreende um local de clivagem pro teolítico pelo produto do todo ou parte do gene KEX2, - uma sQquência de ADN que codifica para a proteína heteróloga, a qual, com a sequência Spr, forma o precursor, caracterizado por compreender uma ou mais cópias de todo ou parte do gene KEX2, o qu° da origem a um aumento da activida de proteolítica da endoprotease yscP» 2a.- Estirpe de acordo com a reivindicação

1. ooor et al. FEBS letters 1984 165, 180-183.

1, caracterizada por a referida proteína ser hirudina.

3&·- Estirpe d° acordo com a reivindicação

2. HARVEY et- al. Proc. Na^H · Acad. USA 1986 83,1084-1088

2, caracterizada por a hirudina ser a variante rHV21ysg7.

4§l._ Estirpe d° acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a cópia ou cópias d^c todo ou parte do gene XEX2 estar(em) integrada(s) directamente no genoma da levedura.

5&·- Estirpe de acordo com uma das reivindi a cooia ou copias co gene n' caçoes j_ a p, caracterizaca o o X2 serem inseridas no v^ctor de «repressão da proteína heteró Ioga, no exterior do bloco ά° expresego propriamente dito.

6a.- Estirpe de acordo com uma das reivind cações 1 :aracterizada por compreender a part° do gene

-14S2O66

Ref. 334 673/D. 12311

KEX2 cuja sequência °stá representada na figura 2.

?£·- Estirpe de acordo com a reivindicação

6, caracterizada por compreender a sequência funcional do ge ne KEX2, compreendida °ntre n bases numeradas 1349 e 3793 na figura 2.

8ã-.- Estirpe de acordo com a reivindicação

7, caracterizada por compreender a sequência funcional do ge ne KEX2 compreendida °ntre a« bases numeradas 1349 e 3438 na figura 2.

9&·- Estirpe d° acordo com a reivindicação

6, caracterizada por a estirpe compreender a parte do gene ΚΞΧ2 compreendida entre as bases numerada? 538 e 4010 na fi gura 2, e por ser eliminada da sequência compreendida entre as bases numeradas 3488 e 3790 na figura 2.

10^.- Estirpe βο acordo com uma das reivin dicações 6 a 9» caracterizada por o segmento do gene KEX2 compreender na extremidade 3* um fragmento terminador corres pondente à sequência compreendida entre a? bases numeradas

3790 e 4010 na figura 2.

llê· — Estirpe de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por a sequência compreendida entre as bases numerada? 3790 e 4010 na figura 2-desempenhar um papel estabilizador.

12&.- Estirpe de acordo com uma das reivin· dicações anteriores, caracterizada por a estirpe ser de 5açcharomyçes cerevieiae.

13ê.- Estirpe de acordo com uma das reivin· dicações anteriores, caracterizada por o vector de expressão

14ê.- Estirpe d° acordo com uma das reivin dicações anteriores, caracterizada por a sequência 3cl ser

15ê.- Estirpe de acordo com uma das reivin

-1562066

Ref. 334 673/D. 12811 dicações 1 a 14, caracterizada por a sequência Str ser um promotor forte na levedura.

164.- Estirpe de acordo com a reivindicação 15, caracterizada oor se tratar de um promotor da fero mo na alfa de levedura.

17‘í.- Estirpe de acordo com uma das reivindicações 2 a 15, caracterizada por a sequência 3pr ser a sequência pré-pro do gene MFalfal de levedura.

185.- Estirpe de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por a sequência 3pr ser seguida por uma sequência que codifica para um peptídeo L.ys-Arg ou Arg-Arg.

19&·- Proce^co para a preparação de hirudina madura por leveduras, caracterizado por uma ectirpe de levedura de acordo com uma da = reivindicações 2 a 18, ser cultivada, num meio apropriado, e _qPr recuperada a hirudina madura obtida.

204.- Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a hirudina se_{r a} variante riíV21ys 47.

Lisboa, 7C H/R1990

Por TRANSGENE S.A.

Afeme O|iciel

Pr opriedad· Industriei

- Arc· de ÇuMplf*·. 1«

FIG.1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1HV1 VAL VAL TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU 2HV2 ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU 3HV3 ILE THR TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 GLY SER ASP GLY GLU LYS ASN GLN CTS VAL THR.GLY GLU GLY THR PRO GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO GLY SER GLN GLY LYS ASP ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO

LYS

ASN

LYS

48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 56 59 60 61 62 63 64 65 PRO GLN SER HIS ASN ASP GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN PRO GLU SER HIS ASN ASN 6LY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU TYR LEU GLN PRO GLN SER HIS ASN GLN 6LY ASP PHE GLU PRO ILE PRO GLU ASP TYR ASP GLU

I 64 65 66 *ALA

3· DOOT et al. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1986 367, 803-811.