JPH0372868A - 異種タンパク質産生能を有するサツカロミセス・セレビシエ株、および該株の発酵による該異種タンパク質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景コ 本発明は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（°）の絹
換え株の使用 による異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質の
調製、ざらに特定すればヒルジンの調製、に関する。異
種タンパク質とは、酵母によって天然には産生されずか
つその成長にも必要ではないタンパク質を意味する。

酵母は、単細胞の真植生物である。酵母サツカロミセス
属は、その生化学および遺伝学が研究室で集中的に研究
されている株である。これは、食品工業（パン、アルコ
ール飲料など）において用いられている株でもあり、し
たがって、きわめて大量に生産されている。サッカロミ
セス・セレビシエ細胞の遺伝学的操作の容易さおよび長
い産業の歴史によって、組換えＤＮＡ技術を用いる外来
タンパク質の生産のための宿主としてこの種（ｓｐｅｃ
ｉｅｓ）が選択される。

鞘換え酵母によるタンパク質の調製中に、酵母株から産
生されるタンパク質が完全には均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅ
ｏｕｓ）ではないことをしばしば観察することがあり、
これによれば大量生産が望まれる産業的に重要なタンパ
ク質の生産には不十分であることがしばしばである。

本発明者は、欧州特許公開ＥＰ−Ａ第０．２５２，８５
４号および同ＥＰ−Ａ−第０　、２７３　、８００号明
細書に記載のように、特にサッカロミセス・セレビシエ
の組換え株によるヒルジンの生産について既に関心をも
ってきた。

ヒルジンは、アミノ酸６５〜６６個のペプチドの混合物
のかたちの医用ヒルの唾液腺を主要な原料とし、きわめ
て特異的できわめて効果的なトロンビンの阻害因子であ
る。したがって、ヒルジンはきわめて有利な治療剤であ
り、臨床医療におけるその使用にはきわめて高い純度の
活性産物が要求され、したがって遺伝子工学による生産
の魅力的な候補である。

多くの天然のヒルジンの変異体（ｖａｒ　１ａｎｔｓ）
が同定されていて、ＨＶＩ、ＨＶ２およびＨＶ３と称さ
れている。これらの構造は、第１図に示される通りであ
る。したがって、これらの天然の変異体は、他の類似体
（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）とともに、遺伝子工学によって
、例えば、上記の欧州特許公開ＥＰ−Ａ第０．２５２，
８５４号明細書および同Ｅ　Ｐ　−Ａ第０．２７３，８
００号明細書に本出願人の名前で記述されているように
、特にサッカロミセス・セレビシエ株の発酵によって調
製された。

本発明者は、欧州特許公開ＥＰ−Ａ第０．２５２，８５
４号明細書に記載の酵母株から産生されるヒルジンは、
完全には均質ではないことを観察した。特に、６５個の
アミノ酸からなる主要で正確な型のものには、ＨＰＬＣ
カラムから主要ピークにごく接近して溶出される、Ｃ末
端で一つまたは二つのアミノ酸を欠失している切断産生
物に対応する二つの型のものが混在している。６３およ
び６４個のアミノ酸を有するこれら二つの型の存在は、
正しい６５−アミノ酸型の精製を難しくしている。

［発明の詳細な説明］ このために、本発明は、サッカロミセス・セレビシエ株
から正確な、非切断型に対応するより大量のヒルジンを
得るための新たな方法を提供しようとするものである。

以下の記述において、用語「ヒルジン」は、全ての天然
のヒルジン変異体または抗血栓（ａｎｔｉ−ｔｈｒｏｍ
ｂｏｔｉｃ）活性を保持しながら一つまたはそれ以上の
突然変異または欠失を有している類似体を指すのに用い
る。事実、以下の請訓は ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７　（すなわち、位置４７のアミノ酸
Ａｓｐのアミノ酸Ｌｙｓへの突然変異を有している組換
え体ＨＶ２変異体）と称する類似体について特定して言
及しているが、本発明は全てのヒルジンの生産に関し得
る。本発明は、また、上記の切断された型の存在による
均質性の欠如の問題をかかえる、サッカロミセス・セレ
ビシエの組換え株によって産生きれる全ての異種タンパ
ク質、に関する。

したがって、本発明の対象は、ＰＲＣＩ遺伝子によって
コードされるタンパク質加水分解機能の抑制を含むこと
を特徴とする、異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列
を含む発現ベクターによって形質転換された、異種タン
パク質産生能を有するサッカロミセス・セレビシエの組
換え株である。

サッカロミセス・セレビシエ株は、酵母細胞中で異なる
場所において発現される多くのタンパク質加水分解機能
を有している。空胞（ｖａｃｕｏｌａｒ）プロテアーゼ
は、サッカロミセス・セレビシエ株によって産生きれる
異種タンパク質、特にヒルジン、の均質性の欠如におい
て特別な役目を果たすと考えられる。

したがって、本発明は、ヒルジンの均質性の欠如におけ
る、酵母の空胞内生性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）プロテ
アーゼ、カルボキシペプチダーゼｙｓｃＹ、に対応する
、ＰＲＣＩ遺伝子によってコードされるタンパク質加水
分解機能によって果たされるまさにその役割の実証に基
づくものである。

ＰＲＣＩ遺伝子によってコードされるタンパク質加水分
解機能の抑制は、種々のやり方で達成することができる
。例えば、対応する構造遺伝子における一つまたはそれ
以上の突然変異、特に部分的または全遺伝子の欠失、が
挙げられる。突然変異の逆戻りを避けるためには、欠失
によって行うことが有利であり得る。

異種タンパク質の生産のために産業的に用い得る全ての
サッカロミセス・セレビシエ株は、記述した欠陥をそれ
らが有する限り、本発明の対象となり得る。

一般に、用いる株は、α接合（ｍａｔｉｎｇ）型であり
、ＵＲＡ３遺伝子およびアミノ酸生合成の種々の遺伝子
に影響する突然変異を有し、雌雄異体性（ｈｅｔｅｒｏ
ｔｈａｌ　ｌ　ｉｓｍ）を授けるｈｏ突然変異を有する
サッカロミセス・セレビシエの半数体（ｈａｐｌｏｉｄ
）株であり得る。雌雄異体性の株を用いる利点は、株を
半数体および非胞子形成型に保存できることである。事
実、酵母のＭＦ（！１プロモーターをヒルジンの合成に
用いる場合、このプロモーターはα接合型の非胞子形成
型において最高に機能することが見出された。ＨＯ野生
型酵母では、半数相は−または二回の分裂で消失する暫
時的状態である。実験用の酵母は、半数相が安定してい
るり。

突然変異体である。

当然のことながら、αフェロモンプロモーター以外のプ
ロモーターを用いてもよく、これらは必ずしも雌雄異性
の株であることを必要としない。

例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子の転写によ
って機能性が確認された酵母プロモーターすなわち、Ｐ
ＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＬ　１プロモーターなどを挙げる
ことができる。

ｕｒａ３突然変異体を用いることによって、ヒルジンの
発現に適しているベクターによる株の形質転換と、ピリ
ミジン（実質的にはウラシル、シトシンおよびウリジン
）を含まない培養培地組成によるヒルジン産生能を有す
る形質転換細胞の選択が、可能になる。

ｐｅｐ４−３遺伝子型（Ｐ　ＲＡ　ＩまたはＰＥＰ４と
称される遺伝子）を有する株は、さらに特定して記述す
ることができる。プロテアーゼｙｃｓＡもまた空胞に位
置しており、非活性の前駆体のかたちで合成される。前
駆体は、自然にまたはプロテアーゼｙＳＣＡ自身による
酵素的な切断によって活性化される。そのタンパク質加
水分解活性によって、プロテアーゼｙｓ　ｃＡは多くの
空胞タンパク質の活性化に関与しており、これによって
、プロテアーゼＲＮａｓｅなどを産生ずる。遺伝的な突
然変異によるプロテアーゼｙｓｃＡの不活性化の結果、
活性型を犠牲にして、全てのこれら不活性チモーゲンが
蓄積される。つまり、ｐｅｐ４−３突然変異体は、空胞
におけるいくつかの酵素活性の低下をもたらし、それに
より本発明による所望の効果に寄与する。

最後に、本発明は、本発明によるサッカロミセス・セレ
ビシエ株を適当な培地で培養してから、得られるヒルジ
ンを回収する、サッカロミセス・セレビシエの組換え株
の発酵によるヒルジンの製造法にも関する。

本発明の他の特徴および利点は、本発明のサッカロミセ
ス・セレビシエ株によるヒルジン変異体ｒＨＶ２Ｌｙｓ
４７の生産を例にして本発明を説明する、以下の詳細な
記述および第１〜５図によって明かになろう。

［実験例］ 関連株の遺伝子型および表現型の特性およびそれらの構
築の由来の詳綱は、次の通りである。

１　。

遺伝子型：　　ＭＡＴａ、ｕｒａ３−２５１、−３２８
、−２７３、ｈｉｓ３−１１、−１５（欠陥のあるＵＲ
Ａ３遺伝子は、酵素ＯＭＰデカルボキシラーゼに対応す
る。この欠陥はｕｒａ３遺伝子を有しているプラスミド
の存在下で修正される。

この補完はヒルジン発現ベクターの選択系を構成して、
プラスミドを有する株のウラシルを含まないミニマム培
地＋カザミノ酸中での増殖を可能にする）。

表現型：　　ｕｒａ−ｈｉｓ−α接合サイン株の由来の
詳細：　　ＴＧＹ］ｓｐ４株は、二つの保存株、ＦＬ　
　ｕｒａ３　ＭＡＴａ　　ＸＧＲＦ１８ＭＡＴαの交配
の結果である。

ａＦＬ　　ｕｒａ３株は、増殖にウラシルを要求する突
然変異体としてＦ、　Ｌａｃｒｏｕｔｅ　（ストラスブ
ルグ大学）によって選択された。それはＦＬ１００株（
ＡＴＣＣ株２８３８３）と同質遺伝子のもの（１ｓｏ３
ｅｎｉｃ）であり、該株に由来し、ｕｒａ−の性質に間
してのみ該株と異なる。この性質は、三つの突然変異、
すなわちｕｒａ３−２５１、−３２８および−３７３に
よる。

ａＧＲＦ　１８株は、Ｇ、　Ｆｉｎｋ　（ＵＳＡ）によ
って選択されて、多くの研究室で使用されている。形質
転換による遺伝子操作におけるその使用は、例えば、Ｍ
、　Ｒｕｄｏｌｐｈ、１．　Ｋｏｅｎｉｇ−Ｒａｕｓｅ
ｏおよびＡ。

Ｈｉｎｎｅｎ　（Ｇｅｎｅ　８７−９５．１９８５）に
よって記述されている。

ＧＲＦ　１８株の遺伝子型は、ＭＡＴａ、ｈｉｓ３−１
１．−１５．１ｅｕ２−３、−１１２である。

２、　　゛　　　　　　　　。

遺伝子型：　　ＭＡＴ（！、ｕ　ｒ　ａ３−２５１〜３
７３、−３２８、　ｈｉｓ３−１１、−１５．１ｅｕ２
−３、−１１２、ｐｅｐ４−３゜表現型：　　ｕｒａ−
１ｈｉｓ−１ｅｕ−０ＭＡＴα型の株と交配する。芽胞
出芽しない。プロテアーゼｙｓ　ｃＡおよびｙｓｃＢお
よびカルボキシペプチダーゼｙｓｃＹ活性に大きな減少
を示す。

株の由来の詳細は、以下に図示される通りである。

ＧＲＦ］８（ａ）　　　　　　　　ｘ　ＦＬ　ｕｒａ３
（ｂ）ＴＧＹ２ｓｐ２ｃ ｘ　　２０Ｂ−１２（ｃ） （ｂ）　　Ｆ、Ｌａｃｒｏｕｔｅによって選択された株
、ＦＬ　１００株と同質遺伝子のもの（上記を参照され
たい） （ｃ）　　Ｅ、Ｗ、Ｊｏｎｅｓ　（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　
９５．２３．１９７７）に記載のｒＹｅａｓｔ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ＣｅｎｔｅｒＪ　（Ｂｅｒｋｅ
ｌｅｙ。

ＣＡ　９４７２０）から得た株 ＴＧＹＩｓｐ４ ＴＧＹ１４−１ ＴＧＹ２０．３ ＭＡＴ（１、ｕｒａ３−２５１．−３７３、−３２８！
ｅｕ２−３、−１１２、ｈｉｓ３−１１〜１５ｅｐ４−
３ （ａ）　　Ｇ、Ｆｉｎｋによって選択された株（上記を
参照されたい） （Ａ）ＰＲＣＩ遺伝子のクローニング ＰＲＣＩ遺伝子の配列は、Ｖａｌｌｓ、Ｌ、Ａ、ら（Ｃ
ｅｌ１４８．８８７−８９７．１９８７）によって公表
されている。

この配列から二つのオリゴヌクレオチドを構築する。第
一は、遺伝子の５′領域に相補的で、その配列は次の通
りである。

５’　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡＣＴＧＧ　ＧＡＣＴＴＴ　
ＧＴＧ　３’第二は、遺伝子の３′領域に相補的で、そ
の配列は次の通りである。

５’　ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＡ
ＣＣＡＣ３’ｐＦＬ　１に挿入されたＰＲ，ＣＩ遺伝子
を含む大陽画クローンを、酵母ゲノムライブラリー（Ｓ
　ａ　ｕ　３Ａで部分消化した染色体ＤＮＡの断片で、
これをＢａｍＨ１部位でｐ　Ｆ　Ｌ　１　（Ｐａｒｅｎ
ｔ。

Ｓ、Ａ、ら：　Ｙｅａｓｔ　１．８３−１３８．１９８
５）に挿入した）から、これら二つのオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズさせて選択した。

（Ｂ）ＰＲＣＩ遺伝子（第２図）における部分欠失の作
出 ＰＲＣＩ遺伝子において、Ｂｇ１１１部位はコード配列
中に見出される。突然変異誘導によって、第二のＢｇ１
１１部位を、天然のＢｇｌＩＩ部位の上流、後者から５
４９塩基対であり、すなわちなおコード領域中、に導入
する。この突然変異誘導を次のオリゴヌクレオチドを用
いて行う。

５’　ＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣ３’次
いでこのＢｇｌＩＩ断片を切り出して、酵母のＨＩＳ３
遺伝子の配列（Ｓｔｒｕｈｌに、：　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ、　１３．８５８７−８６０１１９８５）
を含む１．２ｋｂ−ＢａｍＨＩ断片で置換して、単離し
てＭ１３ｍ　ｐ　８にクローニングする。ＰＲＣＩ遺伝
子の産生物の活性部位をこのようにして除去する。

（Ｃ）Ｂに記載の突然変異した遺伝子ｐｒｃｌ−ｄ：：
ＨＩ　Ｓ　３を含む株の選択 サッカロミセス・セレビシエのＴＧＹｌ　ｓ　ｐ４株（
ＭＡＴ（１、ｈｉｓ３、ｕｒａ３）およびＴＧＹ２０５
３株（ＭＡＴａ、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌ　ｅｕ２、ｐ
ｅｐ４−３）を約１．７ｋｂのＢａｍＨＩ断片で形質転
換させて、突然変異した対立形質ｐｒｃｌ−ｄ：：ＨＩ
Ｓ３の染色体性交換による作出を可能にする。ヒスチジ
ンに関して原始栄養的であるクローンを選択して、次い
で６株の四つの形質転換体についてＨＩＳ＋特性の安定
性を分析する。最後に、野生型ＰＲＣＩ対立形質が突然
変異した対立形質ｐ　ｒ　ｃ　１〜ｄ：：ＨＩＳ３と確
実に交換されたことを確認するために、これら形質転換
体の染色体性ＤＮＡをサザンハイプリダイゼーションに
よって分析する。二つの株、ＴＣＹ１ｓｐ４　ｐｒｃｌ
−ｄ：：ＨＩＳ３およびＴＧＹ２０．３　　ｐｒｃｌ−
ｄ：：ＨＩＳ３をこのようにして得る。

プラスミドｐＴＧ２９５８　（第３図）は、欧州特許公
開ＥＰ−Ａ第２５２　、８５４号明細書に記載のプラス
ミドｐＴ０１８３３とほとんど同じで、ｒ　ＨＶ２Ａｓ
　ｐ４７のコード配列を有している。

プラスミドｐＴＧ２９５８は、人工的に導入されたＨ　
ｉ　ｎｄｍ制限部位を含まない。プラスミドｐＴ０２９
５８は、以下を含む。

−ＭＦαｌ遺伝子の５９領域に対応する５４７塩基対の
断片（プロモーター　シグナルペプチドをコードする配
列、「プロ」領域およびペプチドＬｙｓ−Ａｒｇをコー
ドする配列を含む〉、−ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の相補的Ｄ
ＮＡを含む２３４塩基対の断片、 一酵母のＰＧＫターミネータ−からなる２４３塩基対の
断片、 −このプラスミドの複製開始点およびアンピシリン耐性
のための遺伝子からとりわけなる、ｐＢＲ３２２のＰｖ
ｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２２９２塩基対）、 一欠失したかたちでＰｓｔ１部位に挿入された、酵母の
ＬＥＵ２遺伝子を含む、酵母（Ｂ型）の２　Ｂプラスミ
ドのＥｃ　ｏＲＩ−Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ断片、−酵母のＵ
　ＲＡ　３遺伝子のＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ−Ｓｍａ　Ｉ
断片。

酵母株をプラスミドｐＴＧ２９５８によって酢酸リチウ
ム法（ｌｔｏ、　Ｈ，ら：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、　１５３．１９８３）を用いて形質変換させて、ウラ
シルに間して原始栄養的であるクローンを選択した。次
いでこれらをエーレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ
）中で選択培地（０，７％の酵母のための窒素ベース（
Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ）、０．５％
のカザミノ酸および１％のグルコース）で３０℃で培養
する。

４８時間の培養の後、細胞および上清を遠心分離によっ
て分離して、上清中のｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の量をＨＰＬ
Ｃカラム（又クレオシル（Ｎｕｃ　Ｉｅｏｓ　ｉ　１）
Ｃ８５μｍＰＳＦ３５−１カートリッジプレカラムを備
えたヌクレオシルＣ８３μｍＳＦＣＣＮ３３３カラム）
上で分離して６５−アミノ酸型に対応するピークを集め
ることによって決定する（第４および５図）、これらの
分析の結果は表１に示される通りである（定常間（５ｔ
ａｔｉｏｎａｒｙｐｈａｓｅ）で回収して得た細胞の吸
光度（ＡＢＯ３）当りのｒ　ＨＶ　２　Ｌ、　ｙ　ｓ　
４７の量をμｇで表す）。

表１ 株名　　　有意の遺伝子型　　ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の生
産μｇ／　へ〇〇〇 ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の産生量の約４倍の増加が明かに示
される。Ｃ末端部分（壊れた型と正しい型の間の違いを
識別できる）に対する特異的なモノクローナル抗体を用
いるイムノアッセイによって、これらの結果は確認され
る。

プラスミドｐＴＧ２９５Ｂによって形質転換されたＴＧ
Ｙ　ｌ　ｓ　ｐ４　　ｐ　ｒ　ｃ　１〜ｄ：：ＨＩ　Ｓ
３株は、１９８９年３月３１日に（、Ｎ、Ｃ，Ｍ　（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　２５　ｒｕ
ｅ　ｄｕ　Ｄｒ。

Ｒｏｕｘ　７５７２４　Ｐａｒｉｓ）に番号Ｉ　−８５
４を付与して寄託された。

ＴＧＹＩＳＰ４　　ＰＲＡＩ　　ＰＲＣＩｏ、０５５ ＰＲＡＩ　　ｐｒｃｌ−ｄｅｌ：：）１１５３　　　０
．２５５ＴＧＹ２０．３　　ｐｅｐ４−３　ＰＲＣＩ　
　　　　　　　　０．０２４ｐｅｐ４−３　ｐｒｃｌ−
ｄｅｌ：：）１１５３　０−０７２ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７
の分析によって、本発明によってＰＲＣＩ遺伝子を欠失
させた株について、

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒルジン変異体ＨＶＩ、ＨＶ２およびＨＶ３
の配列を示す図である。 第２図は、染色体型のＰＲＣＩ遺伝子、および挿入され
たＨＩＳ３Ｉ伝子を含む断片、の制限酵素切断地図を示
す図である。 第３図は、プラスミドｐＴ０２９５８の構造を示す図で
ある。 第４図は、ＴＧＹ１ｓｐ４株、およびプラスミドｐＴ０
２９５８によって形質転換されたＴＧＹ１ｓｐ４　　ｐ
ｒｃｌ−ｄ：：ＨＩＳ３株、の培養上清から得たＨＰＬ
Ｃプロフィールを示す図である。 第５図は、ＴＧＹ２０．３株、およびプラスミドｐＴＧ
２９５８によって形質転換されたＴＯＹ２０．３　　ｐ
ｒｃｌ−ｄ：：ＨＩＳ３株、の培養上清から得たＨＰＬ
Ｃプロフィールを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＰＲＣ１遺伝子によってコードされるタンパク質加
   水分解機能の抑制を含むことを特徴とする、異種タンパ
   ク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターによっ
   て形質転換された、異種タンパク質産生能を有するサッ
   カロミセス・セレビシエの組換え株。 ２、抑制をＰＲＣ１遺伝子上で起きる突然変異によって
   得ることを特徴とする、請求項１に記載の株。 ３、抑制をＰＲＣ１遺伝子上で起きる欠失によって得る
   ことを特徴とする、請求項２に記載の株。 ４、ｐｒｃ１−ｄ：：ＨＩＳ３遺伝子型を有することを
   特徴とする、請求項３に記載の株。 ５、ｐｅｐ４−３突然変異を含むことを特徴とする、請
   求項１〜４のいずれか１項に記載の株。 ６、異種タンパク質がヒルジンであることを特徴とする
   、請求項１〜５のいずれか１項に記載の株。 ７、異種タンパク質がヒルジン変異体 ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７であることを特徴とする、請求項６
   に記載の株。 ８、請求項６または７に記載の株を適当な培地で培養し
   て、得られるヒルジンを回収することを特徴とする、サ
   ッカロミセル・セレビシエ株の発酵による組換えヒルジ
   ンの製造法。