PT93615B - Estirpe de sccharomyces cerivisiae produtora de uma proteina heterologa e processo para a preparacao de hirudina recombinante por meio de por meio de fermentacao da referida estirpe - Google Patents

Estirpe de sccharomyces cerivisiae produtora de uma proteina heterologa e processo para a preparacao de hirudina recombinante por meio de por meio de fermentacao da referida estirpe Download PDF

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Description

Descrição do Objecto do Invento que
TRANGENE S.A., sociedade anónima francesa, industrial, com sede em 16 Rue Henri Regnault, 92400 Courbevoie, França, pretende obter em Portugal para: ESTIRPE DE SACCHAROMYCES CEREVISaE PRODU TORA DS UMA PROTEÍNA HETER0LOGA
E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DS HIRUDINA RECOMBINANTE POR MEIO DE FERMENTAÇÃO DA REFERIDA ESTIR PE *“ presente invento refere-se à preparaç-ao de proteínas heterólogas, e mais particularmente de hirudina, por estirpes de leveduras S. cerevistae recombinantes. A expressão proteína heteróloga significa proteína que não é nem produzida naturalmente pela levedura, nem necessária pa ra o seu crescimento.
As leveduras são organismos eucariotas unicelulares; o género de levedura Saccharomyces compreende es tirpes cuja bioquímica e genética são estudadas intensamente em laboratório; compreende também estirpes utilizadas na indústria alimentar (pão, bebidas alcoolizadas ...) e produ zidas, por conseguinte, em quantidades muito grandes. A facilidade com que se pode manipular a genética das células de Sac ch ar o my c e s cerevisiae e a longa história industrial desta espécie fazem dela um hospedeiro de primeira categoria para a produção de proteínas estranhas utilizando as técnicas do ADN recombinante.
Quando óa preparação de proteínas pelas leve duras recombinantes, xem-se verificado muitas vezes que a proteína produzida a partir da estirpe de levedura não é perfeitamente homogénea, o que conduz a rendimentos muitas vezes insuficientes para proteínas com interesse industrial destinadas a ser produzidas em grande quantidade.
Produção de hirudina por estirpes de S. ce(
Ref:334 682/D. 12810
re visiae recombinantes estão descritas em publicações europeias das patentes EP-A-O252854 θ EP-A-0273800.
A hirudina, cuja fonte principal se encontra nas glândulas salivares das sanguessugas medicinais, sob a forma de uma mistura de peptídeos de 65 e 66 ácidos a minados, é um inibidor muito específico e muito eficaz da trombina. Trata-se de un agente terapêutico muito interessante cuja utilização em clínica exige uma pureza do produto muito grande, e que é, portanto, um candidato interessan te a produção por engenharia genética.
Algumas variantes naturais de hirudina foram identificadas e designadas por HVl, HVíJ, HV3. A sua estrutura está descrita na figura 1. Mais tarde, estas varian tes naturais e outros análogos foram preparados por engenha ria genética, em particular por fermentação de estirpes S. cerevisiae, conforme é descrito, por exemplo, nas publicações europeias de patentes já mencionadas EP-A 0252854 e EP -A-0273800 em nome da Requerente.
Observou-se que a hirudina produzida a partir da estirpe de levedura descrita na publicação europeia de patente EP-A-O252854 não é completamente homogénea. Em particular,a ,forma maior e correcta que compreende 65 ácidos aminados é contaminada por duas formas eluídas de uma coluna HPLC muito perto do pico principal e que correspondem a produtos de clivagem que perderam 1 ou 2 ácidos amina dos na extremidade C-terminal.
A presença destas duas formas de 63 θ 64 ácidos aminados di ficulta a purificação da forma correcta com 65 ácidos amina dos.
£ por isso que o presente invento tem como objecto fornecer meios novos para a obtenção a partir de uma estirpe de S. cerevisiae de uma quantidade maior de hirudina correspondente à forma correcta, não clivada.
No seguimento da presente descrição, utilizar-se-á o termo hirudina para designar todas as hirudi-2Ref:334 682/1). 12810
nas variantes naturais ou análogos que sofreram uma ou mais mutações, eliminações, mantendo, contudo, a sua actividade antitrombótica. De facto, o presente invento pode dizer res peito à produção de todas as hirudinas, embora os exemplos apresentados adiante digam respeito mais particularmente ao anlogo designado por rHV2Lys47 (isto é, uma variante EV2 r_e combinante que foi sujeita a uma mutação do amino ácido Asp em posição 47 em amino ácido Lys). O invento pode dizer tam bém respeito a todas as proteínas heterólogas produzidas por estirpes de S. cerevisíae recombinantes para as quais se depara com o problema de falta de homogeneidade devida à presença de formas clivadas atrás mencionado.
invento tem como objecto, portanto, uma estirpe de S. cerevisiae recombinante produtora de uma proteína heteróloga, transformada por um vector de expressão que contém uma seqência de ADN que codifica para a proteína heteróloga, caracterizada por compreender uma supressão da função proteolítica codificada pelo gene PRGl.
As estirpes de S. cerevisiae apresentam algumas funções proteolíticas que se exprimem, na célula de levedura, em locais diferentes. Parece que as proteases vacuolares desempenham um papel especial na falta de homogeneidade das proteínas heterólogas, e em particular da hirudina, produzidas por estirpes de S. cerevisiae.
presente invento baseia-se em dar destaque ao papel exactamente desempenhado pela função proteolítica codificada pelo gene PRGl, e correspondente a uma protease endógena vacuolar de levedura, a carboxipeptidase yscY, na falta de homogeneidade da hirudina.
A supressão da função proteolítica codifica da pelo gene PRGl pode ser efectuada de diversas maneiras. Podem citar-se, por exemplo, uma ou mais mutações no gene de estrutura correspondente, e, em particular, uma eliminação parcial ou total do gene. Para evitar qualquer reversão da mutação, pode ser vantajoso proceder por eliminação.
CcUD (
Ref:334 632/D. 12610
1991
Todas as estirpes de S. eerevisiae utilizáveis industrial-
mente para a produção de proteínas heterólogas podem ser ob
jecto do invento, desde que apresentem a deficiência indica
da.
De maneira geral, as estirpes utilizadas po dem ser estirpes haplóides de S. eerevisiae, que compreendem a mutação ho, proporcionando o heterotalisma, que são do tipo conjugante alfa, e que têm mutações que influenciam o gene URA3 assim como diferentes genes de biosíntese de ácidos aminados. 0 interesse em utilizar estirpes heterotáli cas ê permitir conservar a estirpe sob forma haplóide e não esporulante. De facto, quando se utiliza para a síntese de hirudina o promotor MFalfal de levedura, verificou-se que este promotor funcionava de maneira óptima nas estirpes não esporulantes de tipo conjugante alfa. Nas leveduras de tipo selvagem HO, a haplofase é um estado transitório que desapa rece depois de uma ou duas divisões. As leveduras de labora tório são mutantes ho nas quais a haplofase é estável.
£ claro que se podem utilizar outros promotores que não o da feromona alfa, os quais não exigem neces sáriamente estirpes heterotálicas. Podem citar-se, por exem pio, os promotores de leveduras cuja funcionalidade foi con firmada pela transcrição de genes que codificam para proteí nas heterólogas: o promotor PGK, PH05, GAll, etc.
A utilização de mutantes ura3 permite a transformação das estirpes por um vector conveniente para a expressão de hirudina, assim como a selecçSo de células transformadas e produtoras de hirudina pela composição do meio de cultura, que deve ser destituído de pirimidina (essencialmente uracilo, citosina, uridina),
Mais particularmente, podem citar-se estirpes que têm um genotipo pep4-3 (gene chamado PSA1 ou PSP4). Á protease yscA tem também localização vacuolar e é sinteti sáda sob a forma de precursor inactivo. 0 precursor pode ser activado por clivagem quer espontaneamente, quer de ma-4Ref:334 682/D. 1281Ú
neira enzimática, devido à própria protease yscA. Pela sua actividade proteolítica, a protease yscA está implicada na activaçao de algumas proteínas vacuolares, gerando assim proteases, RNases, etc. A inactivaçâo da protease yscA por mutação genética tem como efeito a acumulação de todos esse zimogenes inactivos à custa das formas activas. Assim, o mu tante pep4-3 apresenta uma diminuição de várias actividades enzimáticas da vacáola, o que contribui para o efeito desejado de acordo com o invento.
?inalmente, o invento diz também respeito a um processo de preparação de hirudina por fermentação a uma estirpe de S. cerevisiae recombinante, segundo a qual se pãe em cultura uma estirpe de S. cerevisiae de acordo com o invento num meio apropriado e se recupera a hirudina obtida
Outras características e vantagens do inven to vão tornar-se evidentes com a descrição pormenorizada que se segue, que representa o invento por meio de exemplos de produção da variante rHV2-Lys47 da hirudina por uma estirpe de S. cerevisiae de acordo com o invento acômpanhados pelas figuras 1 a 5 seguintes:
- a figura 1 representa as sequências das variantes HV1, HV|2 e H73 da hirudina.
- a figura 2 representa esquematicamente o mapa de restrição do gene PRC1 na sua forma cromossómica e do fragmento que contém o gene HIS3 inserido.
- a figura 3 representa a estrutura do plasmídeo PTG2958.
- a figura 4 representa o perfil HPLC obtido a partir dos sobrenadantes de cultura das estirpes TGYlsp4 e TGYlsp4 prcl-d::HIS3 transformadas pelo plasmídeo pTG2958.
As características genotípicas e fenotípicas das estirpes de referência e o histórico da sua constru ção são pormenorizados a seguir:
1· ESTIRPE DE REFERENCIA TGYlsp4
- Genotipo: MATalfa, ura3-251, -328, -273, his3-ll, -15 (o gene URA3, que é defectivo, corresponde à enzima OMP-de-5Ref:334 682/D. 12810 carboxilase; este efeito é corrigido em presença de um pias mídeo portador do gene URA3· Esta complementação constitui o sistema de selecção do vector de expressão da hirudina, podendo a estirpe que contém o plasmideo multiplicar-se em meio mínimo + casaminoácidos, sem uracilo).
- fenotipoi ura- his- ; signo sexual alfa
- Histórico da estirpe:
A estirpe TGYlsp4 é o resultado do cruzamer to de duas estirpes de colecções, FL ura3 IíATa x GRF18 Matalfa.
A estirpe a?L ura3 foi seleccionada por F. Lacroute (Universidade de Estrasburgo) como mutante que necessita do uracilo para o crescimento; é isogénica da esrii pe FL100 (estirpe da ATCC, 28383) da qual deriva e apenas se distingue pelo carácter ura- ; este carácter é devido a três mutações; ura3-251, -328, -373·
A estirpe alfaGRF 18 foi seleccionada por
G. Fink (EUA) e é utilizada em muitos laboratórios. A sua utilização, manipulações genéticas por transformação, é deji crita por exemplo por M. Rudolph, I. Koenig-Rauseo e A. Hi·· nnen (gene 36, 1985, 87-95).
genotipo da estirpe GRF 18 é: MATalfa, his3-H,-15, leu2-3, -112.
2. ESTIRPE DE REFERENCIA TGY20.3
- Genotipo: MATalfa, ura3-251, -373, -328, his311, -15, leu2-3, -112, pep4-3·
- Fenotipo: ura-, his-, leu-cruza com as estirpes de tipo MATalfa: não esporula; tem uma importante diminuição das actividades proteinases yscA, yscB e carboxipeptidase yscY.
- 0 histórico da estirpe está esquematizado a se.
guir:
-6Λ FL ura3 (b)
KATa, ura3-251, -328, -373 b2Ut>7
Ref:334 682/D. 12810
GRF 18 (a)
KATalpha, his3-ll, -15
TGY2sp2c
KATa, ura3-251, -358, -373, Ieu2-3,H2
< 20B-12(c) KATalpha, trpl, pep4-3 x TGY14-1
TGYlsp4
MATalpha, ura3-251, his3-H, 15
-373, -328,
KATa, ura3-251,-373,-328, pep4-3, leu2-3-112 v
TGY2O.3
MATalpha, ura3-251,-373,-328, leu2-3,-112,his3-ll,-15, pep4-3
a) estirpe seleccionada por G. Fink (ver acima)
b) estirpe seleccionada por F. Lacroute, isogénica da estirpe FL100 (ver acima).
c) estirpe proveniente do Yeast Genetic Stock Cen ter” (Berkeley, CA 94720) e descrita por E.W. Jones (1977, Genetics 95,23).
2XEMPL0 1: Construção das estirpes que contêm uma o gene
PRCl parcialmente eliminado
A. Clonagem do gene PRC1
A sequência do gene PRCl foi publicada por
Valls, L.A. et al. Qcell, 48 p 887-897 (1987)3 . Dois oligo nucleótidos são construídos a partir desta sequência. 0 pri meiro é complementar da região 5’ do gene e a sua sequência é a seguinte:
5' AAG ΛΑΑ GAC TGG GAC TTT GTG 3'
-7bZUO/
Ref:334 682/D. 12810
-itíf 199i segundo - é complementar da região 3’ do gene e a sua sequência é a seguinte:
5' GAT TGG ATG AAG CGT ΪΑ0 CAC 3’
A partir de um banco genrííico de levedura (fragmentos de ADIJ cromossómico parcialmente digerido por 3au3A inseridos no local BamHI de pFLl [j?arent, S.A. et al. Yeast _1 83-138 (1985)3 e P°r hibridação com estes dois oligonucleótido s, selecciona-se um clone de E. coli que contém o gene PRC1 inserido em pFLl.
B. Oriaçâo da eliminação parcial no gene PR01 (figura 2)
No gene PRG1 encontra-se um local BglII na sequência codificadora. Por mutagénese dirigida, introduz-se um segundo local BglII a montante do local BglII natural a 549 pares de bases deste último, isto é, sempre na se. quência codificadora. Esta mutagénese é realizada com a uti lização do oligonucleótido seguinte:
5’ CGATGTGGAGATGTTGGOO 3’
En seguida este fragmento BglII é excisado e substituído por um fragmento BamHI de 1,2 kb que contém a sequência do gene HIS3 da levedura Qstruhl K. (1985) Nucl. Acids Res. 13 8587-86013 , e obtido depois de isolamento e clonagem em M13mp8. Elimina-se assim o local activo do produto do gene PRG1.
G. Selecção das estirpes que contêm o gene mutado prcl-d:: HIS3 descrito em B.
As estirpes de S. cerevisiae TGYlsp4 (HAIal fa, his3» ura3) e TGY20.3 (MATalfa, his3, ura3, leu2, pep43) são transformadas com um fragmento BamHI com aproximadamente 1,7 kb, que permite gerar a alela mutada precl-d:;HI5 3 por troca cromossómica. Os clones protótrofos era histidina são seleccionados e quatro transformados de cada estirpe são seguidamente analisados quanto a estabilidade do carác^ ter HIS+.
-8ί
Ref:334 682/D. 12810
/
Finalmente, o AI)N cromossónico destes -transformados é anali sado por hibridaçâo de Southern, a fim de verificar que a alela selvagem PR01 foi de facto trocada com a a leia mutada precl-d::HIS3· Obtêm-se assim duas estirpes TGYlsp4 prcl -d::HIS3 e TGY2O.3 prcl-d::HIS3·
EXEMPLO 2; Construção do plasmídeo pTG295&
plasmídeo pTG2958 (figura 3) é pouco dife rente do plasmídeo pIG1833 descrito na publicação europeia de patente EP-A-252854 portador da sequência codificadora rHV2Asp47. O plasmídeo pTG2958 não contém o local de restri ção HindIII introduzido artificialmente. 0 plasmídeo pTG295 contém:
- um fragmento de 547 pares de bases correspondentes à região 5* do gene MPaldal (que contém o promotor, a sequência que codifica para o peptídeo sinal, a região pro” e uma se quência que codifica para o peptídeo Lys-Arg),
- um fragmento de 234 pares de bases que contém o ADN complementar de rHV2Lys47,
- um fragmento de 243 pares de bases que compreendem o terminador PGX de levedura,
- o fragmento PvuII-EcoRI de pER322 que compreende entre ou tros a origem de replicação deste plasmídeo e o gene de resistência à ampicilina (2292 pares de bases),
- o fragmento EcoRI-HindIII do plasmídeo 2//da levedura (forma 3), que contém o gene LEU2 de levedura, sob a forma eliminada e inserida no local PstI,
- um fragmento HindIII-Smal do gene GRA3 de levedura.
EXEMPLO 3: Produção de rHV2Lys47 pelas estirpes obtidas anteriormente que contém o gene PR01 sob uma forma eliminada
As estirpes de levedura são transformadas pelo plasmídeo pTG2958 pelo processo do acetato de D to, H. et al.J. Bactério 1. 1£3; 1983] e seleccionam-se os clones
-9Eefi334 682/D. 12810
protótrofos em uracilo. São seguidamente postos cm cultura em erlenmeyer a 30°C sobre um meio selectivo (0,7$ bases azotadas para leveduras (Yeast Nitrogen Base), 0,5$ de casamino ácidos e 1$ de glucose).
Depois de 48 horas de cultura, separan-se células e sobrena dante por centrifugação e determina-se a quantidade de rHV2Lys47 no sobrenadante por separação numa coluna HPLO (coluna Nucléosil 083 um SFOC N333 equipada com uma précolu na cartucho 08 5Am Nucléosil PSF35-1) e integração do pico correspondente à forna 65 ácidos aminados (figuras 4 e 5).
quadro 1 apresenta os resultados destas dosagens (as quantidades são dadas em /tgde rIIV2Lys47 por unidade de densidade óptica (A600) das células obtidas depoi de recolha em fase estacionária).
Quadro 1
Estirpe (Jenotipo Produção de rHV2Lys47
Significativo em jug/A600
TGYlsp4 PEAI PEC1 0,055
PEAI prcl-del;;HIS3 0,255
TGY20.3 pep4-3 PEC1 0,024
pep4-3 prcl-del:íHIS3 0,072
As dosagens de rHV2Lys47 pãem claramente em destaque um aumento da produção de rHV2Dys47 por um factor de aproximadamente quatro para as estirpes cujo gene PEC1 foi eliminado de acordo com o invento. A dosagem imunológica por meio de anticorpos monoclonais específicos dirigidos contra a parte C-terminal (que permite discriminar entre as formas degradadas e a forma correcta) confirma estes resultados.
-10Ref:334 682/D. 12810
A estirpe TGYlsp4 prlc-d.: :HIS3 transformada pelo plasmideo pTG2958 foi depositada em 31 de Março de 1989 ha G.N.C.M., 25 rua do Dr. Roux 75724 PARIS com o número 1-854.
depósito do primeiro pedido para o Invento acima descrito, foi efectuado em França, em 31 de Março de 1989 sob o NS. 89 04306.

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    18 - Estirpe de Saccharom.yces cerevisiae re combinante produtora de uma proteína heteróloga, transforme, da por um vector de expressão que contém uma sequência de ADN que codifica para a proteína heteróloga, caracterizada por compreender uma supressão da função proteolítica codifj cada pelo gene PRCL.
    28 - Estirpe de acordo com a reivindicação
    1, caracterizada por a supressão ser obtida por uma mutaçãc operada sobre o gene PRCl.
    3ã - Estirpe de acordo com a reivindicação
  2. 2, caracterizada por a supressão ser obtida por uma elimina ção no gene PRCl.
    4& - Estirpe de acordo com a reivindicação
  3. 3, caracterizada por apresentar o genotipo prcl-d::HIS3·
  4. 5δ - Estirpe de acordo com uma das reivindj caçSes 1 a 4, caracterizada por compreender a mutação pep4-3·
    68 - Estirpe de acordo com uma das reivindj cações 1 a 5, caracterizada por a proteína heteróloga ser t. hirudina.
    78 - Estirpe de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por a proteína heteróloga ser a variante rEV2Lys47 da hirudina.
    88 - Processo para a preparação de hirudina recombinante por meio de fermentação de uma estirpe de
    -1162067
    Ref:334 682/D. 12810
    S. cerevisiae, caracterizado por ser cultivada, num meio a?ropriado, uma estirpe de acordo com uma das reivindicações
  5. 6 ou 7) e ser recuperada a hirudina obtida.
PT93615A 1989-03-31 1990-03-30 Estirpe de sccharomyces cerivisiae produtora de uma proteina heterologa e processo para a preparacao de hirudina recombinante por meio de por meio de fermentacao da referida estirpe PT93615B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

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FR8904306A FR2645175B1 (fr) 1989-03-31 1989-03-31 Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT93615A PT93615A (pt) 1990-11-20
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