JP3152918B2 - 異種タンパク質産生能を有するサツカロミセス・セレビシエ株、および該株の発酵による該異種タンパク質の製造法 - Google Patents
異種タンパク質産生能を有するサツカロミセス・セレビシエ株、および該株の発酵による該異種タンパク質の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae）の組換え株の使用による異種（he
terologous）タンパク質の調製、さらに特定すればヒル
ジンの調製、に関する。異種タンパク質とは、酵母によ
って天然には産生されずかつその成長にも必要ではない
タンパク質を意味する。
romyces cerevisiae）の組換え株の使用による異種（he
terologous）タンパク質の調製、さらに特定すればヒル
ジンの調製、に関する。異種タンパク質とは、酵母によ
って天然には産生されずかつその成長にも必要ではない
タンパク質を意味する。
酵母は、単細胞の真核生物である。酵母サッカロミセ
ス属は、その生化学および遺伝学が研究室で集中的に研
究されている株である。これは、食品工業（パン、アル
コール飲料など）において用いられている株でもあり、
したがって、きわめて大量に生産されている。サッカロ
ミセス・セレビシエ細胞の遺伝学的操作の容易さおよび
長い産業の歴史によって、組換えDNA技術を用いる外来
タンパク質の生産のための宿主としてこの種（specie
s）が選択される。
ス属は、その生化学および遺伝学が研究室で集中的に研
究されている株である。これは、食品工業（パン、アル
コール飲料など）において用いられている株でもあり、
したがって、きわめて大量に生産されている。サッカロ
ミセス・セレビシエ細胞の遺伝学的操作の容易さおよび
長い産業の歴史によって、組換えDNA技術を用いる外来
タンパク質の生産のための宿主としてこの種（specie
s）が選択される。
組換え酵母によるタンパク質の調製中に、酵母株から
産生されるタンパク質が完全には均質（homogeneous）
ではないことをしばしば観察することがあり、これによ
れば大量生産が望まれる産業的に重要なタンパク質の生
産には不十分であることがしばしばである。
産生されるタンパク質が完全には均質（homogeneous）
ではないことをしばしば観察することがあり、これによ
れば大量生産が望まれる産業的に重要なタンパク質の生
産には不十分であることがしばしばである。
本発明者は、欧州特許公開EP−Ａ第0,252,854号およ
び同EP−Ａ−第0,273,800号明細書に記載のように、特
にサッカロミセス・セレビシエの組換え株によるヒルジ
ンの生産について既に関心をもってきた。
び同EP−Ａ−第0,273,800号明細書に記載のように、特
にサッカロミセス・セレビシエの組換え株によるヒルジ
ンの生産について既に関心をもってきた。
ヒルジンは、アミノ酸65〜66個のペプチドの混合物の
かたちの医用ヒルの唾液腺を主要な原料とし、きわめて
特異的できわめて効果的なトロンビンの阻害因子であ
る。したがって、ヒルジンはきわめて有利な治療剤であ
り、臨床医療におけるその使用にはきわめて高い純度の
活性産物が要求され、したがって遺伝子工学による生産
の魅力的な候補である。
かたちの医用ヒルの唾液腺を主要な原料とし、きわめて
特異的できわめて効果的なトロンビンの阻害因子であ
る。したがって、ヒルジンはきわめて有利な治療剤であ
り、臨床医療におけるその使用にはきわめて高い純度の
活性産物が要求され、したがって遺伝子工学による生産
の魅力的な候補である。
多くの天然のヒルジンの変異体（variants）が同定さ
れていて、HV1、HV2およびHV3と称されている。これら
の構造は、第１図に示される通りである。したがって、
これらの天然の変異体は、他の類似体（analogues）と
ともに、遺伝子工学によって、例えば、上記の欧州特許
公開EP−Ａ第0,252,854号明細書および同EP−Ａ第0,27
3,800号明細書に本出願人の名前で記述されているよう
に、特にサッカロミセス・セレビシエ株の発酵によって
調製された。
れていて、HV1、HV2およびHV3と称されている。これら
の構造は、第１図に示される通りである。したがって、
これらの天然の変異体は、他の類似体（analogues）と
ともに、遺伝子工学によって、例えば、上記の欧州特許
公開EP−Ａ第0,252,854号明細書および同EP−Ａ第0,27
3,800号明細書に本出願人の名前で記述されているよう
に、特にサッカロミセス・セレビシエ株の発酵によって
調製された。
本発明者は、欧州特許公開EP−Ａ第0,252,854号明細
書に記載の酵母株から産生されるヒルジンは、完全には
均質ではないことを観察した。特に、65個のアミノ酸か
らなる主要で正確な型のものには、HPLCカラムから主要
ピークにごく接近して溶出される、Ｃ末端で一つまたは
二つのアミノ酸を欠失している切断産生物に対応する二
つの型のものが混在している。63および64個のアミノ酸
を有するこれら二つの型の存在は、正しい65−アミノ酸
型の精製を難しくしている。
書に記載の酵母株から産生されるヒルジンは、完全には
均質ではないことを観察した。特に、65個のアミノ酸か
らなる主要で正確な型のものには、HPLCカラムから主要
ピークにごく接近して溶出される、Ｃ末端で一つまたは
二つのアミノ酸を欠失している切断産生物に対応する二
つの型のものが混在している。63および64個のアミノ酸
を有するこれら二つの型の存在は、正しい65−アミノ酸
型の精製を難しくしている。
［発明の具体的説明］ このために、本発明は、サッカロミセス・セレビシエ
株から正確な、非切断型に対応するより大量のヒルジン
を得るための新たな方法を提供しようとするものであ
る。
株から正確な、非切断型に対応するより大量のヒルジン
を得るための新たな方法を提供しようとするものであ
る。
以下の記述において、用語「ヒルジン」は、全ての天
然のヒルジン変異体または抗血栓（anti−thrombotic）
活性を保持しながら一つまたはそれ以上の突然変異また
は欠失を有している類似体を指すのに用いる。事実、以
下の諸例はrHV2Lys47（すなわち、位置47のアミノ酸Asp
のアミノ酸Lysへの突然変異を有している組換え体HV2変
異体）と称する類似体について特定して言及している
が、本発明は全てのヒルジンの生産に関し得る。本発明
は、また、上記の切断された型の存在による均質性の欠
如の問題をかかえる、サッカロミセス・セレビシエの組
換え株によって産生される全ての異種タンパク質、に関
する。
然のヒルジン変異体または抗血栓（anti−thrombotic）
活性を保持しながら一つまたはそれ以上の突然変異また
は欠失を有している類似体を指すのに用いる。事実、以
下の諸例はrHV2Lys47（すなわち、位置47のアミノ酸Asp
のアミノ酸Lysへの突然変異を有している組換え体HV2変
異体）と称する類似体について特定して言及している
が、本発明は全てのヒルジンの生産に関し得る。本発明
は、また、上記の切断された型の存在による均質性の欠
如の問題をかかえる、サッカロミセス・セレビシエの組
換え株によって産生される全ての異種タンパク質、に関
する。
したがって、本発明の対象は、PRC1遺伝子によってコ
ードされるタンパク質加水分解機能の抑制を含むことを
特徴とする、異種タンパク質をコードするDNA配列を含
む発現ベクターによって形質転換された、異種タンパク
質産生能を有するサッカロミセス・セレビシエの組換え
株である。
ードされるタンパク質加水分解機能の抑制を含むことを
特徴とする、異種タンパク質をコードするDNA配列を含
む発現ベクターによって形質転換された、異種タンパク
質産生能を有するサッカロミセス・セレビシエの組換え
株である。
サッカロミセス・セレビシエ株は、酵母細胞中で異な
る場所において発現される多くのタンパク質加水分解機
能を有している。空胞（vacuolar）プロテアーゼは、サ
ッカロミセス・セレビシエ株によって産生される異種タ
ンパク質、特にヒルジン、の均質性の欠如において特別
な役目を果たすと考えられる。
る場所において発現される多くのタンパク質加水分解機
能を有している。空胞（vacuolar）プロテアーゼは、サ
ッカロミセス・セレビシエ株によって産生される異種タ
ンパク質、特にヒルジン、の均質性の欠如において特別
な役目を果たすと考えられる。
したがって、本発明は、ヒルジンの均質性の欠如にお
ける、酵母の空胞内生性（endogenous）プロテアーゼ、
カルボキシペプチダーゼyscY、に対応する、PRC1遺伝子
によってコードされるタンパク質加水分解機能によって
果されるまさにその役割の実証に基づくものである。
ける、酵母の空胞内生性（endogenous）プロテアーゼ、
カルボキシペプチダーゼyscY、に対応する、PRC1遺伝子
によってコードされるタンパク質加水分解機能によって
果されるまさにその役割の実証に基づくものである。
PRC1遺伝子によってコードされるタンパク質加水分解
機能の抑制は、種々のやり方で達成することができる。
例えば、対応する構造遺伝子における一つまたはそれ以
上の突然変異、特に部分的または全遺伝子の欠失、が挙
げられる。突然変異の逆戻りを避けるためには、欠失に
よって行うことが有利であり得る。
機能の抑制は、種々のやり方で達成することができる。
例えば、対応する構造遺伝子における一つまたはそれ以
上の突然変異、特に部分的または全遺伝子の欠失、が挙
げられる。突然変異の逆戻りを避けるためには、欠失に
よって行うことが有利であり得る。
異種タンパク質の生産のために産業的に用い得る全て
のサッカロミセス・セレビシエ株は、記述した欠陥をそ
れらが有する限り、本発明の対象となり得る。
のサッカロミセス・セレビシエ株は、記述した欠陥をそ
れらが有する限り、本発明の対象となり得る。
一般に、用いる株は、α接合（mating）型であり、UR
A3遺伝子およびアミノ酸生合成の種々の遺伝子に影響す
る突然変異を有し、雌雄異体性（heterothallism）を授
けるho突然変異を有するサッカロミセス・セレビシエの
半数体（haploid）株であり得る。雌雄異体性の株を用
いる利点は、株を半数体および非胞子形成型に保存でき
ることである。事実、酵母のMFα１プロモーターをヒル
ジンの合成に用いる場合、このプロモーターはα接合型
の非胞子形成株において最高に機能することが見出され
た。HO野生型酵母では、半数相は一または二回の分裂で
消失する暫時的状態である。実験用の酵母は、半数相が
安定しているho突然変異体である。
A3遺伝子およびアミノ酸生合成の種々の遺伝子に影響す
る突然変異を有し、雌雄異体性（heterothallism）を授
けるho突然変異を有するサッカロミセス・セレビシエの
半数体（haploid）株であり得る。雌雄異体性の株を用
いる利点は、株を半数体および非胞子形成型に保存でき
ることである。事実、酵母のMFα１プロモーターをヒル
ジンの合成に用いる場合、このプロモーターはα接合型
の非胞子形成株において最高に機能することが見出され
た。HO野生型酵母では、半数相は一または二回の分裂で
消失する暫時的状態である。実験用の酵母は、半数相が
安定しているho突然変異体である。
当然のことながら、αフェロモンプロモーター以外の
プロモーターを用いてもよく、これらは必ずしも雌雄異
性の株であることを必要としない。例えば、異種タンパ
ク質をコードする遺伝子の転写によって機能性が確認さ
れた酵母プロモーター、すなわち、PGK、PHO5、GAL1プ
ロモーターなどを挙げることができる。
プロモーターを用いてもよく、これらは必ずしも雌雄異
性の株であることを必要としない。例えば、異種タンパ
ク質をコードする遺伝子の転写によって機能性が確認さ
れた酵母プロモーター、すなわち、PGK、PHO5、GAL1プ
ロモーターなどを挙げることができる。
ura3突然変異体を用いることによって、ヒルジンの発
現に適しているベクターによる株の形質転換と、ピリミ
ジン（実質的にはウラシル、シトシンおよびウリジン）
を含まない培養培地組成によるヒルジン産生能を有する
形質転換細胞の選択が、可能になる。
現に適しているベクターによる株の形質転換と、ピリミ
ジン（実質的にはウラシル、シトシンおよびウリジン）
を含まない培養培地組成によるヒルジン産生能を有する
形質転換細胞の選択が、可能になる。
pep4−３遺伝子型（PRA1またはPEP4と称される遺伝
子）を有する株は、さらに特定して記述することができ
る。プロテアーゼycsAもまた空胞に位置しており、非活
性の前駆体のかたちで合成される。前駆体は、自然にま
たはプロテアーゼyscA自身による酵素的な切断によって
活性化される。そのタンパク質加水分解活性によって、
プロテアーゼyscAは多くの空胞タンパク質の活性化に関
与しており、これによって、プロテアーゼRNaseなどを
産生する。遺伝的な突然変異によるプロテアーゼyscAの
不活性化の結果、活性型を犠牲にして、全てのこれら不
活性チモーゲンが蓄積される。つまり、pen4−３突然変
異体は、空胞におけるいくつかの酵素活性の低下をもた
らし、それにより本発明による所望の効果に寄与する。
子）を有する株は、さらに特定して記述することができ
る。プロテアーゼycsAもまた空胞に位置しており、非活
性の前駆体のかたちで合成される。前駆体は、自然にま
たはプロテアーゼyscA自身による酵素的な切断によって
活性化される。そのタンパク質加水分解活性によって、
プロテアーゼyscAは多くの空胞タンパク質の活性化に関
与しており、これによって、プロテアーゼRNaseなどを
産生する。遺伝的な突然変異によるプロテアーゼyscAの
不活性化の結果、活性型を犠牲にして、全てのこれら不
活性チモーゲンが蓄積される。つまり、pen4−３突然変
異体は、空胞におけるいくつかの酵素活性の低下をもた
らし、それにより本発明による所望の効果に寄与する。
最後に、本発明は、本発明によるサッカロミセス・セ
レビシエ株を適当な培地で培養してから、得られるヒル
ジンを回収する、サッカロミセス・セレビシエの組換え
株の発酵によるヒルジンの製造法にも関する。
レビシエ株を適当な培地で培養してから、得られるヒル
ジンを回収する、サッカロミセス・セレビシエの組換え
株の発酵によるヒルジンの製造法にも関する。
本発明の他の特徴および利点は、本発明のサッカロミ
セス・セレビシエ株によるヒルジン変異体rHV2Lys47の
生産を例にして本発明を説明する、以下の詳細な記述お
よび第１〜５図によって明かになろう。
セス・セレビシエ株によるヒルジン変異体rHV2Lys47の
生産を例にして本発明を説明する、以下の詳細な記述お
よび第１〜５図によって明かになろう。
［実験例］ 関連株の遺伝子型および表現型の特性およびそれらの
構築の由来の詳細は、次の通りである。
構築の由来の詳細は、次の通りである。
1.関連株TGY1sp4 遺伝子型:MATα、ura3−251、−328、−273、his3−1
1、−15（欠陥のあるURA3遺伝子は、酵素OMPデカルボキ
シラーゼに対応する。この欠陥はura3遺伝子を有してい
るプラスミドの存在下で修正される。この補完はヒルジ
ン発現ベクターの選択系を構成して、プラスミドを有す
る株のウラシルを含まないミニマム培地＋カザミノ酸中
での増殖を可能にする）。
1、−15（欠陥のあるURA3遺伝子は、酵素OMPデカルボキ
シラーゼに対応する。この欠陥はura3遺伝子を有してい
るプラスミドの存在下で修正される。この補完はヒルジ
ン発現ベクターの選択系を構成して、プラスミドを有す
る株のウラシルを含まないミニマム培地＋カザミノ酸中
での増殖を可能にする）。
表現型:ura−his−、α接合サイン株の由来の詳細:TG
Y1sp4株は、二つの保存株、FL ura3 MATa×GRF18 MATα
の交配の結果である。
Y1sp4株は、二つの保存株、FL ura3 MATa×GRF18 MATα
の交配の結果である。
aFL ura3株は、増殖にウラシルを要求する突然変異体
とてF.Lacroute（ストラスブルグ大学）によって選択さ
れた。それはFL100株（ATCC株28383）と同質遺伝子のも
の（isogenic）であり、該株に由来し、ura−の性質に
関してのみ該株と異なる。この性質は、三つの突然変
異、すなわちura3−251、−328および−373による。
とてF.Lacroute（ストラスブルグ大学）によって選択さ
れた。それはFL100株（ATCC株28383）と同質遺伝子のも
の（isogenic）であり、該株に由来し、ura−の性質に
関してのみ該株と異なる。この性質は、三つの突然変
異、すなわちura3−251、−328および−373による。
αGRF18株は、G.Fink（USA）によって選択されて、多
くの研究室で使用されている。形質転換による遺伝子操
作におけるその使用は、例えば、M.Rudolph、I.Koenig
−RauseoおよびA.Hinnen（Gene87−95、1985）によって
記述されている。
くの研究室で使用されている。形質転換による遺伝子操
作におけるその使用は、例えば、M.Rudolph、I.Koenig
−RauseoおよびA.Hinnen（Gene87−95、1985）によって
記述されている。
GRF18株の遺伝子型は、MATα、his3−11、−15、leu2
−３、−112である。
−３、−112である。
2.関連株TYG20.3 遺伝子型:MATα、ura3−251、−373、−328、his3−1
1、−15、leu2−３、−112、pep4−３。
1、−15、leu2−３、−112、pep4−３。
表現型:ura−、his−、leu−。
MATα型の株と交配する。芽胞出芽しない。プロテア
ーゼyscAおよびyscBおよびカルボキシペプチダーゼyscY
活性に大きな減少を示す。
ーゼyscAおよびyscBおよびカルボキシペプチダーゼyscY
活性に大きな減少を示す。
株の由来の詳細は、以下に図示される通りである。
例1:部分的に欠失した、PRC1遺伝子を含む株の構築 （Ａ）PRC1遺伝子のクローニング PRC1遺伝子の配列は、Valls,L.A.ら（Cell48、887−8
97、1987）によって公表されている。この配列から二つ
のオリゴヌクレオチドを構築する。第一は、遺伝子の
５′領域に相補的で、その配列は次の通りである。
97、1987）によって公表されている。この配列から二つ
のオリゴヌクレオチドを構築する。第一は、遺伝子の
５′領域に相補的で、その配列は次の通りである。
第二は、遺伝子の３′領域に相補的で、その配列は次
の通りである。
の通りである。
pFL1に挿入されたPRC1遺伝子を含む大腸菌クローン
を、酵母ゲノムライブラリー（Sau3Aで部分消化した染
色体DNAの断片で、これをBamH I部位でpFL1（Parent,S.
A.ら:Yeast 1、83−138、1985）に挿入した）から、こ
れら二つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて
選択した。
を、酵母ゲノムライブラリー（Sau3Aで部分消化した染
色体DNAの断片で、これをBamH I部位でpFL1（Parent,S.
A.ら:Yeast 1、83−138、1985）に挿入した）から、こ
れら二つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて
選択した。
（Ｂ）PRC1遺伝子（第２図）における部分欠失の作出 PRC1遺伝子において、Bgl II部位はコード配列中に見
出される。突然変異誘導によって、第二のBgl II部位
を、天然のBgl II部位の上流、後者から549塩基対であ
り、すなわちなおコード領域中、に導入する。この突然
変異誘導を次のオリゴヌクレオチドを用いて行う。
出される。突然変異誘導によって、第二のBgl II部位
を、天然のBgl II部位の上流、後者から549塩基対であ
り、すなわちなおコード領域中、に導入する。この突然
変異誘導を次のオリゴヌクレオチドを用いて行う。
次いでこのBgl II断片を切り出して、酵母のHIS3遺伝
子の配列（Struhl K.:Nucl.Acids Res.13、8587−860
1、1985）を含む1.2kb−BamH I断片で置換して、単離し
てM13 mp8にクローニングする。PRC1遺伝子の産生物の
活性部位をこのようにして除去する。
子の配列（Struhl K.:Nucl.Acids Res.13、8587−860
1、1985）を含む1.2kb−BamH I断片で置換して、単離し
てM13 mp8にクローニングする。PRC1遺伝子の産生物の
活性部位をこのようにして除去する。
（Ｃ）Ｂに記載の突然変異した遺伝子prc1−d::HIS3を
含む株の選択 サッカロミセス・セレビシエのTGY1sp4株（MATα、hi
s3、ura3）およびTGY20.3株（MATα、his3、ura3、leu
2、pep4−３）を約1.7kbのBamH I断片で形質転換させ
て、突然変異した対立形質prc1−d::HIS3の染色体性交
換による作出を可能にする。ヒスチジンに関して原始栄
養的であるクローンを選択して、次いで各株の四つの形
質転換体についてHIS＋特性の安定性を分析する。最後
に、野生型PRC1対立形質が突然変異した対立形質prc1−
d::HIS3と確実に交換されたことを確認するために、こ
れら形質転換体の染色体性DNAをサザンハイブリダイゼ
ーションによって分析する。二つの株、TGY1sp4 prc1−
d::HIS3およびTGY20.3 prc1−d::HIS3をこのようにして
得る。
含む株の選択 サッカロミセス・セレビシエのTGY1sp4株（MATα、hi
s3、ura3）およびTGY20.3株（MATα、his3、ura3、leu
2、pep4−３）を約1.7kbのBamH I断片で形質転換させ
て、突然変異した対立形質prc1−d::HIS3の染色体性交
換による作出を可能にする。ヒスチジンに関して原始栄
養的であるクローンを選択して、次いで各株の四つの形
質転換体についてHIS＋特性の安定性を分析する。最後
に、野生型PRC1対立形質が突然変異した対立形質prc1−
d::HIS3と確実に交換されたことを確認するために、こ
れら形質転換体の染色体性DNAをサザンハイブリダイゼ
ーションによって分析する。二つの株、TGY1sp4 prc1−
d::HIS3およびTGY20.3 prc1−d::HIS3をこのようにして
得る。
例2:プラスミドpTG2958の構築 プラスミドpTG2958（第３図）は、欧州特許公開EP−
Ａ第252,854号明細書に記載のプラスミドpTG1833とほと
んど同じで、rHV2Asp47のコード配列を有している。プ
ラスミドpTG2958は、人工的に導入されたHind III制限
部位を含まない。プラスミドpTG2958は、以下を含む。
Ａ第252,854号明細書に記載のプラスミドpTG1833とほと
んど同じで、rHV2Asp47のコード配列を有している。プ
ラスミドpTG2958は、人工的に導入されたHind III制限
部位を含まない。プラスミドpTG2958は、以下を含む。
−MFα１遺伝子の５′領域に対応する547塩基対の断片
（プロモーター、シグナルペプチドをコードする配列、
「プロ」領域およびペプチドLys−Argをコードする配列
を含む）、 −rHV2Lys47の相補的DNAを含む234塩基対の断片、 −酵母のPGKターミネーターからなる243塩基対の断片、 −このプラスミドの複製開始点およびアンピシリン耐性
のための遺伝子からとりわけなる、pBR322のPvu II−Ec
oR I断片（2292塩基対）、 −欠失したかたちでPst I部位に挿入された、酵母のLEU
2遺伝子を含む、酵母（Ｂ型）の２μプラスミドのEcoR
I−Hind III断片、 −酵母のURA3遺伝子のHind III−Sma I断片。
（プロモーター、シグナルペプチドをコードする配列、
「プロ」領域およびペプチドLys−Argをコードする配列
を含む）、 −rHV2Lys47の相補的DNAを含む234塩基対の断片、 −酵母のPGKターミネーターからなる243塩基対の断片、 −このプラスミドの複製開始点およびアンピシリン耐性
のための遺伝子からとりわけなる、pBR322のPvu II−Ec
oR I断片（2292塩基対）、 −欠失したかたちでPst I部位に挿入された、酵母のLEU
2遺伝子を含む、酵母（Ｂ型）の２μプラスミドのEcoR
I−Hind III断片、 −酵母のURA3遺伝子のHind III−Sma I断片。
例3:欠失した型のPRC1遺伝子を含む上記で得た株によ
る、rHV2Lys47の生産 酵母株をプラスミドpTG2958によって酢酸リチウム法
（lto,H.ら:J.Bacteriol.153、1983）を用いて形質転換
させて、ウラシルに関して原始栄養的であるクローンを
選択した。次いでこれらをエーレンマイヤー（Erlenmey
er）中で選択培地（0.7％の酵母のための窒素ベース（Y
east Nitrogen Base）、0.5％のカザミノ酸および１％
のグルコース）で30℃で培養する。48時間の培養の後、
細胞および上清を遠心分離によって分離して、上清中の
rHV2Lys47の量をHPLCカラム（ヌクレオシル（Nucleosi
l）C8 5μmPSF35−１カートリッジプレカラムを備えた
ヌクレオシルC8 3μmSFCC N333カラム）上で分離して65
−アミノ酸型に対応するピークを集めることによって決
定する（第４および５図）。これらの分析の結果は表１
に示される通りである（定常期（stationary phase）で
回収して得た細胞の吸光度（A600）当りのrHV2Lys47の
量をμｇで表す）。
る、rHV2Lys47の生産 酵母株をプラスミドpTG2958によって酢酸リチウム法
（lto,H.ら:J.Bacteriol.153、1983）を用いて形質転換
させて、ウラシルに関して原始栄養的であるクローンを
選択した。次いでこれらをエーレンマイヤー（Erlenmey
er）中で選択培地（0.7％の酵母のための窒素ベース（Y
east Nitrogen Base）、0.5％のカザミノ酸および１％
のグルコース）で30℃で培養する。48時間の培養の後、
細胞および上清を遠心分離によって分離して、上清中の
rHV2Lys47の量をHPLCカラム（ヌクレオシル（Nucleosi
l）C8 5μmPSF35−１カートリッジプレカラムを備えた
ヌクレオシルC8 3μmSFCC N333カラム）上で分離して65
−アミノ酸型に対応するピークを集めることによって決
定する（第４および５図）。これらの分析の結果は表１
に示される通りである（定常期（stationary phase）で
回収して得た細胞の吸光度（A600）当りのrHV2Lys47の
量をμｇで表す）。
rHV2Lys47の分析によって、本発明によってPRC1遺伝
子を欠失させた株について、rHV2Lys47の産生量の約４
倍の増加が明かに示される。Ｃ末端部分（壊れた型と正
しい型の間の違いを識別できる）に対する特異的なモノ
クローナル抗体を用いるイムノアッセイによって、これ
らの結果は確認される。
子を欠失させた株について、rHV2Lys47の産生量の約４
倍の増加が明かに示される。Ｃ末端部分（壊れた型と正
しい型の間の違いを識別できる）に対する特異的なモノ
クローナル抗体を用いるイムノアッセイによって、これ
らの結果は確認される。
プラスミドpTG2958によって形質転換されたTGY1sp4 p
rc1−d::HIS3株は、1989年３月31日にC.N.C.M（Nationa
l Collection of Microorganism Cultures、25 rue du
Dr.Roux 75724 Paris）に番号Ｉ−854を付与して寄託さ
れた。
rc1−d::HIS3株は、1989年３月31日にC.N.C.M（Nationa
l Collection of Microorganism Cultures、25 rue du
Dr.Roux 75724 Paris）に番号Ｉ−854を付与して寄託さ
れた。
【図面の簡単な説明】 第１図は、ヒルジン変異対HV1、HV2およびHV3の配列を
示す図である。 第２図は、染色体型のPRC1遺伝子、および挿入されたHI
S3遺伝子を含む断片、の制限酵素切断地図を示す図であ
る。 第３図は、プラスミドpTG2958の構造を示す図である。 第４図は、TGY1sp4株、およびプラスミドpTG2958によっ
て形質転換されたTGY1sp4 prc1−d::HIS3株、の培養上
清から得たHPLCプロフィールを示す図である。 第５図は、TGY20.3株、およびプラスミドpTG2958によっ
て形質転換されたTGY20.3 prc1−d::HIS3株、の培養上
清から得たHPLCプロフィールを示す図である。
示す図である。 第２図は、染色体型のPRC1遺伝子、および挿入されたHI
S3遺伝子を含む断片、の制限酵素切断地図を示す図であ
る。 第３図は、プラスミドpTG2958の構造を示す図である。 第４図は、TGY1sp4株、およびプラスミドpTG2958によっ
て形質転換されたTGY1sp4 prc1−d::HIS3株、の培養上
清から得たHPLCプロフィールを示す図である。 第５図は、TGY20.3株、およびプラスミドpTG2958によっ
て形質転換されたTGY20.3 prc1−d::HIS3株、の培養上
清から得たHPLCプロフィールを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 昭62−224284（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−152987（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−2385（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−104279（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．73（1977）ｐ．553−556 ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．６（1987) ｐ．2157−2163 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．48（1987）ｐ. 887−897 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/81 C12N 15/15 C07K 14/815 C12N 1/16 - 1/19 C12N 9/99 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】天然のPRC1遺伝子によってコードされるタ
ンパク質加水分解機能がPCR1遺伝子上で起きる欠失によ
って抑制されることを特徴とする、異種タンパク質をコ
ードするDNA断片を含む発現ベクターによって形質転換
された、異種タンパク質生産能を有するサッカロミセス
・セレビシエの組換え株。 - 【請求項２】プロテアーゼyscAをコードするPEP4遺伝子
が機能的であることを特徴とする、請求項１に記載の組
換え株。 - 【請求項３】天然のPRC1遺伝子によってコードされるタ
ンパク質加水分解機能が、プロテアーゼyscYの成熟体を
コードするPRC1遺伝子の領域を部分的に欠失させること
により抑制されたことを特徴とする、請求項１または２
に記載の組換え体。 - 【請求項４】酵母のHis3遺伝子の配列を含む断片がprc1
−ｄ遺伝子に挿入されたことを特徴とする、請求項１〜
３のいずれか一項に記載の組換え体。 - 【請求項５】異種タンパク質がヒルジンであることを特
徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え
体。 - 【請求項６】異種タンパク質がヒルジン変異体rHV2Lys4
7であることを特徴とする、請求項５に記載の組換え
体。 - 【請求項７】請求項５または６に記載の株を適当な培地
で培養し、得られたヒルジンを回収することを特徴とす
る、サッカロミセス・セレビシエ株の発酵による組換え
ヒルジンの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8904306A FR2645175B1 (fr) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR8904306 | 1989-03-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0372868A JPH0372868A (ja) | 1991-03-28 |
| JP3152918B2 true JP3152918B2 (ja) | 2001-04-03 |
Family
ID=9380296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08734090A Expired - Fee Related JP3152918B2 (ja) | 1989-03-31 | 1990-03-31 | 異種タンパク質産生能を有するサツカロミセス・セレビシエ株、および該株の発酵による該異種タンパク質の製造法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5162208A (ja) |
| EP (1) | EP0390676B1 (ja) |
| JP (1) | JP3152918B2 (ja) |
| AT (1) | ATE117371T1 (ja) |
| CA (1) | CA2013240C (ja) |
| DE (1) | DE69016075T2 (ja) |
| DK (1) | DK0390676T3 (ja) |
| ES (1) | ES2067703T3 (ja) |
| FR (1) | FR2645175B1 (ja) |
| GR (1) | GR3015605T3 (ja) |
| PT (1) | PT93615B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| GB8907110D0 (en) * | 1988-05-04 | 1989-05-10 | Ciba Geigy Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| JPH06500470A (ja) * | 1990-09-04 | 1994-01-20 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生 |
| DE69232666T2 (de) * | 1991-04-01 | 2003-03-20 | Merck & Co., Inc. | Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung |
| HU214698B (hu) * | 1992-04-09 | 1998-06-29 | Gyógyszerkutató Intézet Kft. | Eljárás rekombináns deszulfátó-hirudin HV-1 peptidek előállítására |
| FR2692907B1 (fr) * | 1992-06-25 | 1995-06-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Levures kluyveromyces modifiees, preparation et utilisation. |
| SG49859A1 (en) * | 1992-09-04 | 2002-03-19 | Ucp Gen Pharma Ag | Process for the production of protease inhibitors |
| TW282490B (ja) * | 1992-12-15 | 1996-08-01 | Ciba Geigy Ag | |
| US5712114A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-27 | Basf Aktiengesellschaft | Compositions for expression of proteins in host cells using a preprocollagen signal sequence |
| DE19529997C1 (de) * | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE69625623T2 (de) | 1996-01-31 | 2003-11-06 | Sumitomo Bakelite Co. Ltd., Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von in Epoxyharz eingekapselter Halbleitervorrichtung |
| US7795205B2 (en) * | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
| KR100781386B1 (ko) | 2005-10-14 | 2007-11-30 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 프로테인 다이설파이드아이소머라아제1를 코딩하는 유전자및 이알오1을 코딩하는 유전자를 동시 도입시킨 히루딘생산능 재조합 사카로마이세스 세레비지애 및 이를 이용한히루딘 단백질의 생산방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6236183A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-02-17 | ザ・サルク・インステイチユ−ト・バイオテクノロジ−／インダストリアル・アソシエイツ・インコ−ポレ−テツド | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| FR2607517B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| ATE248925T1 (de) * | 1988-01-05 | 2003-09-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur herstellung von proteinen oder proteinhaltigen genprodukten |
| AU614121B2 (en) * | 1988-05-04 | 1991-08-22 | Novartis Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| FR2634495B1 (fr) * | 1988-07-01 | 1990-10-26 | Chambon Pierre | Procede de preparation d'une proteine par des levures utilisant un systeme inductible, vecteurs et souches transformees correspondantes |
-
1989
- 1989-03-31 FR FR8904306A patent/FR2645175B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-03-28 AT AT90400839T patent/ATE117371T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-28 ES ES90400839T patent/ES2067703T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-28 EP EP90400839A patent/EP0390676B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-28 CA CA002013240A patent/CA2013240C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-28 DK DK90400839.8T patent/DK0390676T3/da active
- 1990-03-28 DE DE69016075T patent/DE69016075T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-29 US US07/500,884 patent/US5162208A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1990-03-31 JP JP08734090A patent/JP3152918B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-03-23 GR GR950400681T patent/GR3015605T3/el unknown
Non-Patent Citations (3)
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| Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．４８（１９８７）ｐ．８８７−８９７ |
| ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．６（１９８７）ｐ．２１５７−２１６３ |
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７３（１９７７）ｐ．５５３−５５６ |
Also Published As
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| ES2067703T3 (es) | 1995-04-01 |
| DK0390676T3 (da) | 1995-03-20 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |