JPH0372867A - 成熟異種タンパク質、特にヒルジン、の製造のための改良された酵母株、および対応するヒルジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は、サッカロミセス・セレビシエ（ｈ低ｈＬ臘旺
競促江■虹社）などの組換え酵母による異種（ｈｅｔｅ
ｒｏｌｏｇｏｕｓ）タンパク質の調製、より詳細にいえ
ばヒルジンの調製のためになされる改良に間する。これ
は、先ず第一に、成熟型タンパク質の発現を可能にする
ベクターによって形質転換された、異種タンパク質産生
能を有する新たな酵母株に間する。

酵母は、単細胞の真核生物である。酵母属は、その生化
学および遺伝学が研究 室で集中的に研究されている株である。これは、食品工
業（パン、アルコール飲料など）において用いられる株
でもあり、したがって、きわめて大量に生産されている
。ｈαｌ山■江部促江ム血起細胞の遺伝学的操作の容易
さおよび長い産業の歴史によって、絹換えＤＮＡ技術を
用いる外来タンパク質の生産のための宿主としてこの種
が選択される。

産業的に重要なタンパク質を大量に生産することが望ま
れている場合には、タンパク質の所望の性質を保持する
ために、タンパク質を実質的に成熟型で、すなわち追加
のアミノ酸またはペプチド配列はいずれもタンパク質に
融合しているように、生産することが望ましい。これは
、ヒルジンの場合に特に望まれる。事実、アミノ酸６５
〜６６個のペプチドの混合物のかたちで医用ヒルの唾液
腺を主要な原料とするヒルジンは、きわめて特異的でき
わめて効果的なトロンビンの阻害因子である。

したがって、ヒルジンは臨床医療における使用できわめ
て高い純度の活性産物が要求される、きわめて有利な治
療剤である。

多くの天然のヒルジンの変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）が
同定されていて、ＨＶＩＳ　）ＩＶ２およびＨＶ３と称
されている。これらの構造は、第１図に示される通りで
ある。したがって、これらの天然の変異体は、他の類似
物とともに、遺伝子工学によって、例えば、欧州特許公
開ＥＰ−Ａ第０．２５２，８５４号明細書および同ＥＰ
−Ａ第０．２７３，８００号明細書に本出願人の名前で
記述されたように、特にＬ 江江虹釘社株の発酵によって調製された。

上記のように、　　　　　　　酵母は異種タンパク質、
すなわち天然には酵母によって生産されずまたその増殖
にも必要ではないタンパク質、の生産に特に有利である
。事実、この酵母はそれ自体でいくつかのタンパク質を
培養培地に分泌することができ、これらタンパク質は正
しくプロセッシングされ、すなわち成熟型になる。例え
ば、α性フエロモンは、　　　　　　　のα接合（ｍａ
ｔｉｎｇ）型株の培養培地中に見出される。

酵母のα性フエロモンは、１３個のアミノ酸のペプチド
である。Ｋｕｒｊａｎおよび）ｌｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　
（Ｃｅｌ　Ｉ３０．９３３−９３４．１９８２）は、α
フェロモン（ＭＦαｌ）の前駆体をコードする構造遺伝
子をクローニングし、この遺伝子の配列から、１３個の
アミノ酸のこのα因子は１６５個のアミノ酸の前駆体プ
レプロタンパク質のかたちで合成されたことを推定した
。この前駆体は１９個の残基のアミン末端疎水性シグナ
ル配列を含み、これに３個のグリコジル化部位を含む６
４個のアミノ酸の「プロ」配列が続き、この配列自体に
、スペーサーペプチドによって分けられる４コピーのα
因子に先行して配列Ｌｙｓ−Ａｒｇが続いている。

シグナル配列が特異的なペプチダーゼによって小胞体に
おいて効果的に切断されることが示された。「プロ」配
列は、小胞体中で始まるＮ−グリコジル化を受ける。タ
ンパク質加水分解的切断の最初の段階は、ＫＥＸ２遺伝
子の産生物、すなわちエンドプロテアーゼｙｓｃＦ、に
よって特異的なシグナルＬｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−
Ａｒｇにおいて行われる。この成熟は、おそらく、ゴル
ジ体内で起きる。Ｋ　Ｅ　Ｘ　２遺伝子の突然変異を受
けた゛　株は、キラータンパク質 （Ｌｅｉｈｏｗｉ　ｔｚおよびＷｉｃｋｎｅｒ：　ＰＮ
ＡＳ　ＵＳＡ　２０６１〜２０６５．１９７６）または
αフェロモン（Ｊｕｌｉｕｓら：Ｃｅ１１３７．１０７
５−１０８９．１９８４）の活性型を、これらタンパク
質の欠陥的成熟のために、もはや分泌することができな
いことが明かにされた。

［発明の詳細な説明］ この基礎的性質の研究を基にして、本発明は、成熟タン
パク質を得るために、異種タンパク質産生能を有する酵
母株中における機能的ＫＥＸ２遺伝子の増幅を提供する
。

本発明は、成熟のプロセスをさらに加えることによって
、　　　　　　゛　のような酵母株によって分泌される
成熟ヒルジンの量を増加させる方法を特に提案する。

本発明の主題は、したがって、酵母株がＫＥＸ２遺伝子
の全部または部分の一つまたはそれ以上のコピーを含み
、その結果エンドプロテアーゼｙｓｃＦのタンパク質加
水分解活性が高まることを特徴とする、少なくとも次の
発現ブロックからなる、成熟型の異種タンパク質産生能
を有する酵母株である。

（イ）成熟可能なタンパク質の前駆体をコードする配列
の酵母による転写を可能にするシグナルを含むＤＮＡ配
列（Ｓ　ｔ　ｒ）、 （ロ）プレシグナルペプチドおよび／またはプロペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列（Ｓｐｒ）、（ハ）ＫＥＸ２
遺伝子の全部または部分の産生物によるタンパク質加水
分解的切断部位を含んでなるペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列（Ｓｃｌ）、（ニ）Ｓｐｒ配列とともに前駆体を
形成する、異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列。

上記のように、本発明は、ヒルジンの生産、特に変異体
ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７の生産、に最もよく適用される。

以下に記述するように、ＫＥＸ２遺伝子は、酵母から全
ＤＮＡライブラリーをクローニングすることによって得
てもよい。遺伝子、の配列は第２図に示される通りであ
る。煩雑さを避けるために明′Ｓ書中に再度記載してい
ないが、この第２図は開示の必須部分を形成するもので
ある。

本発明によれば、この遺伝子の種々の断片を用いてもよ
い。すなわち、ＫＥＸ２遺伝子のゲノムＤＮＡの全部に
相当する第２図に示される塩基３８１からの配列の全部
、またはこの遺伝子の機能的配列のみ、すなわち、第２
図の塩基番号１３４９と３７９３との間（ＡＴＣおよび
ＴＧＡの翻訳開始および終止コードンに挟まれた部分）
、またはコード配列の部分のみ、例えば、第２図の塩基
番号１３４９と３４８８との間の部分、でもよい。第２
図の塩基番号３７９０と４０１０との間からＫＥＸ２遺
伝子の区分の３′末端へ位置する断片の存在は、構築物
のターミネータ−およびスタビライザーとしての役割を
果たすことによって遺伝子の発現を向上させる。

メツセンジャーＲＮＡに関して非安定化の役割を有する
と思われる、第２図中の塩基番号３４８８と３７９０と
の間の断片を除去することが望ましい。

遺伝子の発現の増幅は、種々の方法で行えばよい。第一
の変異体では、ＫＥＸ２遺伝子の全部または部分の一つ
またはそれ以上のコピーを酵母ゲノムに直接に組み入れ
る。第二の変異体では、Ｋ　Ｅ　Ｘ　２遺伝子の全部ま
たは部分の一つまたはそれ以上のコピーを異種タンパク
質の発現のためのベクターに実際の発現ブロックの外側
に挿入する。

以下は、特に第二の変異体に間してより詳細に記述され
よう。

ＫＥＸ２遺伝子の産生物は、タンパク質加水分解的な切
断を特異的に行う。このために、Ｓｃｌ配列を限定され
た数の可能な配列から選択しなければならない。ペプチ
ドＬｙｓ−ＡｒｇまたはＡ　ｒ　ｇ−Ａ　ｒ　ｇさらに
はＳｅ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ａｓ　ｐを選択することが好ま
しいであろう。これらＳｃｌ配列は、「プロ」配列によ
って先行されていてもいなくともよく、すなわち、それ
らは複合分泌系に会合されていてもいなくともよい。事
実、ＫＥＸ２遺伝子の産生物によるタンパク質加水分解
的切断部位が存在する限り、用いる分泌系、即ちプレシ
グナルペプチドをコードする配列またはプロ配列と組合
わさるような配列（プレプロ配列）、にかかわりなくタ
ンパク質の成熟が起きることが期待され得る。

ヒルジンの製造に特に有利な構築物は、酵母のαフェロ
モンのプレプロ配列を、Ｌ　ｙ　ｓ　−Ａ　ｒ　ｇまた
は適当であればＡｒｇ−Ａｒｇ切断部位と結合させたも
のである。最後に、Ｓｔｒ配列として強力なプロモータ
ーを用いて、成熟可能なタンパク質の前駆体に対応する
大量のｍ　ＲＮ　Ａを転写してＫＥＸ２遺伝子を最高の
効率で用いることもまた有利である。強力なプロモータ
ーとしては、例えば、酵母のαフェロモンのプロモータ
ーまたは代わりに酵母のＰＧＫプロモーターを挙げても
よい。

最後に、発現ベクターは、成熟タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列の後に、例えばＰＧＫ遺伝子のターミネータ
−などの、酵母のターミネータ−を有するものでもよい
。

発現ベクターは、一般に、自律的に（ａｕａｔｏｎｏ−
ａ＋ｏｕｓｌｙ）複製するプラスミドであろう。これら
のプラスミドは、これらの複製を可能にする構成要素、
すなわち、酵母の２μプラスミドなどの複製開始点、を
含んでいる。加えて、プラスミドは、酵母の突然変異体
ｕｒａ３または１ｅｕ２の相補性を与える、ＵＲＡ３ま
たはＬＥＵ遺伝子などの選択可能な構成要素を含んでも
よい。特に、そのプローモーターが除去されているＵＲ
Ａ３遺伝子の使用は有利である。

これらのプラスミドは、プラスミドがシャトルプラスミ
ドでなければならない場合に、大腸菌における複製を可
能にする構成要素、例えば、ｐＢＲ３２２のものなどの
複製開始点、ＡｐＲなとのマーカー遺伝子および／また
は当業者に公知の他の構成要素などをも含み得る。

考えられる全酵母株中、サツカロミセス（５ａｃｃｈａ
ｒｏｎ＋ｙｃｅｓ）属、とくにセレビシェ（ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）種、の株の使用が好ましいであろう。プロ
モーターがＭＦαｌ遺伝子のものである場合は、酵母は
ＭＡＴαｌ接合型であることが好ましいであろう。例え
ば、適当な選択的抑圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓ
ｓｕｒｅ）によって酵母中のプラスミドの維持を可能に
するプラスミドによって補完されている、ｕｒａ３また
は１ｅｕ２などの遺伝子型の株、が用いられるであろう
。

最後に、本発明の主題は、酵母による成熟異種タンパク
質の製造法であって、本発明による株を適当な培地で培
養して、培養培地に分泌される成熟タンパク質を回収す
る。

より詳細には、本発明は、ヒルジン、特に変異体ｒ　Ｈ
Ｖ　２　Ｌ　ｙ　ｓ　４７、を成熟型で本発明による酵
母株から分泌する工程に間する。

［実験例］ 以下の語例は、本発明の他の特徴および利点を示すこと
ができよう。これら語例は諸国によって説明される。

このクローニングをｋｅｘ２−１突然変異株の表現型相
補性によって行う。ＫＥＸ２遺伝子の突然変異は、酵母
のＭＡＴα株中では活性αフェロモンの分泌の欠如によ
って、キラーＲＮＡ（Ｋ”）を有する酵母株においては
キラートキシンの分泌の欠如によって、現れる。ＴＧＹ
３８．１株を、Ｋ　Ｅ　Ｘ　２遺伝子のクローニングの
ための受容株として用いる。この株を得るために、８０
株（ＭＡＴａ、ｋｅｙ２−１、ａｄｅｌ、ｕ　ｒ　ａ　
Ｔ。

［Ｋ　Ｉ　Ｌ−ｋｌ　Ｋ−Ｒ＋）　　（Ｙｅａｓｔ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ、Ｂｅｒｋｅｌ
ｅｙ　ＣＡ　９４７２０）およびＴＧＹ１ｓｐ４株（Ｍ
ＡＴａ、ｈｉｓ３、ｕｒａ３）を先ず交配させる。得ら
れる倍数体（ｄｉｐｌｏｉｄ）　Ｔ　Ｇ　Ｙ　３３、を
芽胞分裂させる。次いで芽胞ＴＧＹ３３．１の特徴付け
を行う。その遺伝子型はＭＡＴａ、　　ｈ　ｉ　ｓ　３
、ｕｒａ３およびｋｅｘ２−１である。戻し交配をＴＧ
ＹＩ　ｓ　ｐ４と行う。得られる倍数体ＴＧＹ３８を芽
胞分裂させる。発芽の後、向上した形質転換効率を有す
る分裂体ＴＧＹ３８．１　（ＭＡＴａ、ｕｒａ３、ｈｉ
ｓ３およびｋ　ｅ　ｘ　２−１　）を単離する。

ゲノムクローンｐＴＧ２８０９を、酵母ゲノムライブラ
リー（ｐ　Ｆ　Ｌ　１　（Ｐａｒｅｎｔ、　Ｓ、Ａ、ら
：Ｙｅａｓｔ　１．１９８５）のＢａｍＨ１部位に挿入
された、５ａｕ３Ａで部分消化された染色体ＤＮＡの断
片）から得る。このクローン（１万個のＴＧＹ３８．１
のＵＲＡ十形質転換体の中の１個の（Ｋ＋））を、ｋｅ
Ｘ２−１突然変異による機能的欠陥を廃する能力、すな
わち活性キラータンパク質の分泌、ζこ基づいて単離す
る。

ＤＮＡ配列（第２図）を分析することによって、２４４
２塩基対のコード配列が挿入部分（第２図の翻訳開始お
よび終結コードンによって囲まれた部分）に含まれるこ
とが確認される。この配列ζよ、ＫＥＸ２遺伝子の公表
された配列（Ｍｉｚｕｎｏ　Ｋ、ら：　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏ＋ｕ＋
、　　１５６、１９８８）　　に対応する。ＫＥＸ２遺
伝子のコード配列の分析ζこよって、８１４個のアミノ
酸のポリペプチド（こ対応する情報が明らかになる。タ
ンパク質は、約２１個のアミノ酸の推定されるシグナル
配列を含む。Ｃ末端に近接している２１個のアミノ酸の
疎水性部分が検出され得る（位置６７９〜６９９）。

ｋｅｙ２−２突然変異による欠損を補完するＥｃｏＲＩ
断片は、塩基番号１３４９と３４８８との間の部分（第
２図）で表される、ＫＥＸ２遺伝子の産生物のＣ末端切
断型をコードする。

（Ａ）　　Ｍ１３ＴＧ３８４１の構築 プラスミドｐＴＧ２９５Ｂ　（第３図）は、欧州特許公
開ＥＰ−Ａ第２５２，８５４号明細書に記載のプラスミ
ドｐＴＧ１８３３とほとんど同じで、ｒＨＶ２Ａｓｐ４
７のコード配列を有している。

プラスミドｐＴＧ２９５８は、人工的に導入されたＨ　
ｉ　ｎｄｍ制限部位を含まない。プラスミドｐＴＧ２９
５８は、以下のものを含む。

（ｉ）ＭＦαｌ遺伝子の５′領域に対応する５４７塩基
対の断片（プロモーター　シグナルペプチドをコードす
る配列、「プロ」領域およびペプチドＬｙｓ−Ａｒｇを
コードする配列を含む）、（ｉｉ）ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７
の相補的ＤＮＡを含む２３４塩基対の断片 （ｉｉｉ）酵母のＰＧＫターミネータ−からなる２４３
塩基対の断片、 （１ｖ）このプラスミドの複製開始点およびアンピシリ
ン耐性のための遺伝子からとりわけなる、ｐＢＲ３２２
のＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（２２９２塩基対〉、 （Ｖ）欠失したかたちでＰｓｔ１部位に挿入された、酵
母のＬＥＵ２遺伝子を含む、酵母（Ｂ型）の２μプラス
ミドのＥｃｏＲＴ−Ｈｉｎｄｍ断片、（ｖｉ）酵母のＵ
ＲＡ３遺伝子のＨｉｎｄｍ−ＳｍａＩ断片。

ＬＥＵ２−ｄ、２μおよびＵＲＡ３配列を有しているベ
クターｐＴＧ２９５８ＯＮｃａｌ−Ｎｃｏｌ断片を、２
μプラスミドの配列を有し、更にプロモーターを欠失さ
せた（　Ｕ　ＲＡ　３−　ｄ　）　Ｕ　ＲＡ３遺伝子の
配列を有している、欧州特許公開ＥＰ−Ａ第０．２６８
，５０１号に記載のｐＴｃ；２８００のＮｃｏＩ−Ｎｃ
ｏＩ断片によって置換して、ｐＴＧ２８７７を得る。

ベクターＭ１３ＴＧ３８３９　（第４図）は、同じ部位
にｐＴＧ２８７７のＨｉｎｄｍ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を
導入したＭ　１３　Ｔ　Ｇ　１０３　（Ｋｉｅｎｙ、　
Ｍ、Ｐ。

ら：　Ｇｅｎｅ　２６．１９８３）に由来する。このベ
クターに、５ａｌｌ制限部位を、ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７を
コードする領域の翻訳終結コードンの下流に、次のオリ
ゴヌクレオチドを用いる方向づけした（　ｄ　ｉ　ｒｅ
ｃｔｅｄ）突然変異誘導によって導入する。

５’　ＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣ
ＡＡＴＣＡＴＡＧその結果、Ｍｌ　３ＴＧ３８３９　　
Ｓａ　Ｌ　Ｉを得る。

次いて、５ｐｈｌ制限部位を発現カセットの上流に導入
して、次のオリゴヌクレオチドを用いる方向付けした突
然変異誘導によってＵＲＡ３−ｄ配列を除去して、Ｍｌ
　３ＴＧ３８４９を得る。

５ゝＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴ
ＡＴＴＧＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧベクタ−Ｍ　１３
　Ｔ　Ｇ　１３１　　（Ｋｉｅｎｙ　Ｍ、Ｐ、ら：Ｇｅ
ｎｅ　２ｔ３．１９８３）をＰｓｔＩで切断して、末端
をＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片で処理して平滑
にして、次いでベクターをそれ自体に再連結させて、Ｍ
１３ＴＧ３１６０を得る。次いでこのベクターをＳｍａ
ＩおよびＥｃｏＲＶで切断して、その後で再連結して、
Ｍ１３ＴＧ３１４９を得る。

ｒＨＶ２Ｉ、ｙｓ４７　（転写ターミネータ配列を含ま
ない）の発現のためのカセットを有しているＭ１３Ｔ０
３８４０　（、上記）の５ｐｈｌ−Ｓａｉｌ断片を、Ｍ
１３ＴＧ３１４９の５ｐｈＩ−Ｓａ１１部位に導入して
、Ｍ−１３７Ｇ３８４１（第４図）を得る。

（Ｂ）プラスミドＰＴＧ３８４Ｂの構築欧州特許公開Ｅ
Ｐ−Ａ第０．２５２　、８５４号明！ＩＩＦに記載のプ
ラスミドｐＴＧ８４ＢをＢｇｌＩＩで消化して、次いで
再連結して、ｐＴ０２８８６を得る。

ｐＴ０２８８６の大きいＨｉｎｄｎＴ−ＥｃｏＲＩ断片
を、　　　　　　　０２μプラスミドの配列を有してい
るｐ　Ｆ　Ｌ　１　（Ｐａｒｅｎｔ、　Ｓ、Ａら：　Ｙ
ｅａｓｔ　Ｌ１９８５）の２．１　ｋｂ（７）Ｈｉ　ｎ
　ｄ　ｍ−Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片にＴ４リガーゼの存在
で連結させて、プラスミドＰＴＧ２８８６、ＬＥＵ２−
ｄ、ＵＲＡ３−ｄを得る。ＵＲＡ３−ｄ遺伝子を有して
いる、欧州特許公開ＥＰ−Ａ第０　、２５８　、５０１
号明５ｓりに記載のプラスミドｐＴ０２８００の０．９
ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、次いでこのプラスミドの
ＨｉｎｄｌＩＩ部位に挿入して、ｐＴＧ２８８６、Ｕｒ
ａ３−ｄ、　　δＬＥＵ２−ｄを得る。次いで、いくつ
かの制限部位を有するＭ　１３　ＴＧ　１３１　（Ｋｉ
ｅｎｙら：　Ｇｅｎｅ　２６．１９８３）のＳｍａＩ−
ＢｇｌＩ［断片をこのプラスミドに導入して、ｐＴ０３
８２Ｂを得る。

プラスミドルＴｃ；３８２Ｂを制限酵素ｓｐｈ　１〜５
ａｌｌで消化して、次いでベクターＭｌ　３ＴＧ３８４
１（第４図）の５ｐｈｌ−３ａｌｌ断片を次いでこの部
位に連結させて、プラスミドｐＴ０３８４８を得る。こ
のプラスミドは次のものを含む。

（ａ）プロモーターを欠失させた、ｔＪＲＡ３遺伝子の
配列、 （ｂ）ＭＦα１遺伝子のプロモーター （ｃ）ＭＦαｌのプレプロ配列、 （ｄ）ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７をコードする配列、（ｅ）酵
母のＰＧＫ遺伝子の転写ターミネータ−（ｆ）大腸菌に
おける複製および選択を可能にするｐＢＲ３２２の断片
、 （ｇ）酵母中での減数分裂における複製および構成物の
等分配に必要な構造的構成要素を有する２　７１プラス
ミドの断片。

（Ｃ）ｐＴ０３８５５、ｐＴＧ３８８７、ｐＴＧ３８９
０およびｐＴＧ３８７２の構築 これらのプラスミドはＥｃｏＲＩ部位で開裂させたｐＴ
ｃ；３８４Ｂに由来する。人工的なりａｍＨｒ部位を、
次のオリゴヌクレオチドを用いる方向付けした突然変異
誘導によってＫＥＸ２遺伝子の終止コードンの下流に作
出する。

５’　ＴＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＡＡ
ＴＧＣ３’Ｋ　Ｅ　Ｘ　２遺伝子（第５図［ｌ］）の全
構造構成要素からなり、末端をフレノウＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑にした、ｐＴ０２８０９のＸｈｏ　Ｉ−Ｂａ
ｍＨＩ断片（第２図の５３８〜４−０１１に対応する）
を、同様に処理したｐＴＧ３８４８のＥｃｏＲＩ部位に
挿入して、プラスミドｐＴ０３８５５を得る。末端をフ
レノウＤＮＡポリメラーゼで平滑にした、ｐＴ０２８０
９（第５図［２］）のＸｈｏｌ−ＥｃｏＲＩ断片（第２
図の５３８〜３４３３に対応する）を、同様に処理した
ｐＴＧ３８４８のＥｃｏＲ１部位に挿入して、断片の位
置方向に応じてプラスミドｐＴＧ３８Ｂ？およびプラス
ミドｐ’ｒｃａｅｅａを得る。プラスミドｐＴ０３８８
７の場合には、ＫＥＸ２の転写はプラスミドによっても
たらされる細菌の配列（ｐＢＲ３２２）に向かって起き
、プラスミドｐＴＧ３８８３の場合には転写はプラスミ
ドの２μ配列に向かって起きる。ＥｃｏＲＩ部位とＴＧ
Ａとの間のＫ　Ｅ　Ｘ　２遺伝子の部分を削除するため
に、方向付けした突然変異誘導を次の配列のオリゴヌク
レオチドを用いて行う。

５　’　ＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＴＡＴＧＡＡＴＧ
ＡＴＴＣＧＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＧ３　’このよ
うに形質転換して（第５図［３］）、末端をフレノウＤ
ＮＡポリメラーゼで円滑にしたｐＴＧ２８０９の人工的
なＸｈｏｌ−ＢａｍＨＩ断片（第２図の５３８〜４０１
１に対応する）を、同様に処理したｐＴｃ；３Ｂ４Ｂの
ＥｃｏＲＩ部位に次いで挿入して、ｐＴＧ３８９０を得
る。

Ｋ　Ｅ　Ｘ　２遺伝子（第２図（７）３８１〜３８４４
に対応する）の５ａｕ３Ａ−ＥｃｏＲＩ断片（第５図［
４コ）を含むｐＴｃ２８０９のＥｃｏＲＩＥｃｏＲＩ挿
入物をｐＴ０３８４ＢのＥｃｏＲ１部位に挿入して、プ
ラスミドｐＴＧ３８７２を得る。

産 遺伝子型ＭＡＴａ、Ｕｒａ３−２５１，３７３．３２８
、　Ｉ　　ｅ　ｕ　２−３、１１２、　ｈ　　ｉｓ３、
　ｐｅｐ４−３の酵母株、　　　゛　　種を、プラスミ
ドｐＴＧ３８４８、ｐＴＧ３８７２、ｐＴＧ３８５５、
ｐＴＧ３８８７およびｐＴＧ３８９０によって酢酸リチ
ウム法（ｌｔｏ、Ｈ，ら：Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３．１９８３）を用いて形
質変換させて、Ｕｒａ”原栄養体を選択した。次いでこ
れらをエルレノマイヤー中で選択培地（０，７％の酵母
のための窒素ベース（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　
Ｂａ５ｅ）、０．５％のカザミノ酸および１％のグルコ
ース）で３０℃で培養する。４８時間の培養の後、細胞
および上清を遠心分離によって分離して、トロンビン阻
害活性を比色試験（合成基質クロモチーム（ｃｈｒｏｍ
ｏｚｙｍｅ）　Ｔ　Ｈ（ベーリンガーマンハイム社！！
＞に対するタンパク質加水分解活性）を用いて上清で決
定した。分析の結果は表１に示される通りである。６値
は、二つの独立した実験の平均に対応する。

ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７活性を、細胞のＡＴｕ／八６０へ　
（１〜２×１９７′ｓ胞／ｍｌはＩ　Ａ６００ｎｍユニ
ットに対応する）で表す。

表１ プラスミド　　　Ｋ　Ｅ　Ｘ　２　　　　　ＡＴＵ／Ａ
６００ρＴＧ３８４８ ｐＴＧ３Ｂ？２ ｐＴＧ３８５５ ｐＴＧ３８８７ ｐＴＧ３８９０ ［４］ ［１］ ［２］ ［３コ 本発明による構築物上のＫ　Ｅ　Ｘ　２遺伝子の存在に
よって、活性型のｒ　ＨＶ　２　Ｌ　ｙ　ｓ　４７の生
産を５倍に向上させることができる。

表２ プラスミド ＥＸ２ ＡＴＵ／八〇〇へ プラスミドｐＴ０３８４Ｂ、ｐＴＧ３８５５、ｐＴＧ３
８８３およびｐＴＧ３８９０で形質転換させた酵母株の
培養の粗抽出物を、上記の工程に従って回収した。エン
ドプロテアーゼｙｓ　ｃＦの比活性を、Ａｃｈｓｔｅｔ
ｔｅｒ　Ｔ、およびＷｏｌｆ　Ｄ、Ｈ。

（ＥＭＢＯＪ、　４．１７３−１７７．１９８５）によ
る方法によって決定する。この方法は僅かに修飾された
もので、トリトンを用いない点においてこれら著者らに
よるもとの異なっている。これらの分析結果は、表２に
示される通りである。

ｙｓｃＦの比活性は、ｍｕ／ｍｇタンパク質で表される
。

タンパク質はバイオラド（Ｉ３１０ＲＡＤ）によって市
販されているキットを用いる比色法によって分析される
。

ｐＴＧ３８４８　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２．８ｐＴＧ３８５５　　　　　　　［１］　　　　
　　　　　４３．７ｐＴＧ３８８３　　　　　　　［２
］　　　　　　　　　２０．８ｐＴＧ３８９０　　　　
　　　［３１７４，０本発明による構築物上のＫ　Ｅ　
Ｘ　２遺伝子の存在によって、産生されるエンドプロテ
アーゼｙｓｃＦの比活性を向上させることができる。こ
れらの結果から、ＫＥＸ２のＥｃ　ｏＲ１部位とＴＧＡ
との間の断片（第２図の塩基３４８８から塩基３７９０
まで）は、メツセンジャーＲＮ−Ａに関して非安定化の
役目を果たしていると結論づけてもよいと思われる。対
照的に、断片ＴＧＡ−ＢａｍＨＩ（第２図の塩基３７９
０から４０１０まで）は、ターミネータ−の役目を果た
しており、これによって構築物を安定化させているよう
である。プラスミドｐＴ０３８９０を用いて得られるエ
ンドプロテアーゼｙｓｃＦの型は、したがって、比活性
が参照型に較べて高められる型に対応する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒルジン変異体ＨＶＩ　ＨＶ２およびＨＶ３
の配列を示す図である。 第２図は、酵母のＫＥＸ２遺伝子のゲノムＤＮＡの配列
を示す図である。 第３図は、プラスミドｐＴＧ２９５８を示す図である。 第４図は、ベクターＭｌ　３ＴＣ；３８３９およびＭｌ
　３ＴＧ３８４１の構造を示す図である。 第５図は、用いられるＫＥＸ２遺伝子断片の制限酵素地
図を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵母株がＫＥＸ２遺伝子の全部または部分の一つま
   たはそれ以上のコピーを含み、その結果エンドプロテア
   ーゼｙｓｃＦのタンパク質加水分解活性が高まることを
   特徴とする、少なくとも次の発現ブロックからなる、異
   種タンパク質産生能を有する酵母株。 （イ）成熟可能なタンパク質の前駆体をコードする配列
   の酵母による転写を可能にするシグナルを含む、ＤＮＡ
   配列（Ｓｔｒ）、 （ロ）プレシグナルペプチドおよび／またはプロペプチ
   ドをコードする、ＤＮＡ配列（Ｓｐｒ）、（ハ）ＫＥＸ
   ２遺伝子の全部または部分の産生物によるタンパク質加
   水分解的切断部位を含んでなるペプチドをコードする、
   ＤＮＡ配列（Ｓｃ１）、（ニ）Ｓｐｒ配列とともに前駆
   体を形成する、異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列
   。 ２、該タンパク質がヒルジンであることを特徴とする、
   請求項１に記載の株。 ３、ヒルジンが変異体ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７であることを
   特徴とする、請求項２に記載の株。 ４、ＫＥＸ２遺伝子の全部または部分のコピーが直接に
   酵母ゲノムに組み込まれていることを特徴とする、請求
   項１〜３のいずれか１項に記載の株。 ５、ＫＥＸ２遺伝子のコピーが異種タンパク質の発現の
   ためのベクターに実際の発現ブロックの外側で挿入され
   ていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項
   に記載の株。 ６、第２図に示される配列を有するＫＥＸ２遺伝子の部
   分を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１
   項に記載の株。 ７、第２図の塩基番号１３４９と３７９３との間にＫＥ
   Ｘ２遺伝子の機能的配列を含むことを特徴とする、請求
   項６に記載の株。 ８、第２図の塩基番号１３４９と３４８８との間にＫＥ
   Ｘ２遺伝子の機能的配列を含むことを特徴とする、請求
   項７に記載の株。 ９、第２図の塩基番号５３８と４０１０との間のＫＥＸ
   ２遺伝子の部分を含みかつ第２図の塩基番号３４８８と
   ３７９０との間の配列がそれから削除されていることを
   特徴とする、請求項６に記載の株。 １０、ＫＥＸ２遺伝子の区分が、３′末端に、第２図の
   塩基番号３７９０と４０１０との間の配列に対応するタ
   ーミネーター断片を含むことを特徴とする、請求項６〜
   ９のいずれか１項に記載の株。 １１、第２図の塩基番号３７９０と４０１０との間の配
   列が安定剤の役目を果たすことを特徴とする、請求項１
   ０に記載の株。 １２、サッカロミセス・セレビシエ株であることを特徴
   とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の株。 １３、異種タンパク質の発現のためのベクターが自律的
   に複製するプラスミドであることを特徴とする、請求項
   １〜１２のいずれか１項に記載の株。 １４、Ｓｃ１配列がＬｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒ
   ｇペプチドをコードする配列であることを特徴とする、
   請求項１〜１３のいずれか１項に記載の株。 １５、Ｓｔｒ配列が酵母中の強力なプロモーターである
   ことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記
   載の株。 １６、プロモーターが酵母のαフェロモンのプロモータ
   ーであることを特徴とする、請求項１５に記載の株。 １７、Ｓｐｒ配列が酵母のＭＦα１遺伝子のプレプロ配
   列であることを特徴とする、請求項２〜１５のいずれか
   １項に記載の株。 １８、Ｓｐｒ配列にＬｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒ
   ｇペプチドをコードする配列が続くことを特徴とする、
   請求項１７に記載の株。 １９、請求項２〜１８のいずれか１項に記載の酵母株を
   適当な培地で培養して、得られる成熟ヒルジンを回収す
   ることを特徴とする、酵母による成熟ヒルジンの製造法
   。 ２０、ヒルジンが変異体ｒＨＶ２Ｌｙｓ４７であること
   を特徴とする、請求項１９に記載の製造法。