JPH10513353A - タンパク質の製造法 - Google Patents
タンパク質の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野に属し、タンパク質の遺伝子を含むハイブリッドベクターを担持する、Ｓaccharomyces cerevisiae HT393株またはその誘導体の助けを借りた、酵母に異種のタンパク質を均質形で製造する方法に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
タンパク質の製造法
本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に属し、タンパク質の遺伝子を含むハイブリ
ッドベクターを担持する遺伝子操作した酵母細胞の助けを借りた該タンパク質の
製造法に関する。発明の背景
遺伝子工学において、原核および真核宿主のための多くのタンパク質発現シス
テムが知られているが、既知のシステムを越える利点を有する新規方法の必要性
は続いてる。
パン酵母Ｓaccharomyces cerevisiaeにおける異種タンパク質の発現の操作に
おいて、高レベルの発現が、多くの因子、例えば、プラスミド安定性、プラスミ
ド複製数、プロモーター強度、翻訳効率、低タンパク質分解に依存することが通
常観察されている。
この状況において、非常に重要な要件の一つは、製造に使用するための酵母株
である。
近年、相当な数の異種タンパク質が、酵母細胞を、例えば、α−インターフェ
ロン(Ｈitzeman et al.，Ｎature(1981)，294，717-722)、組織型プラスミノー
ゲン活性化因子(ＥＰ−Ａ−１４３０７１)またはあるデスルファトヒルジン(Ｅ
Ｐ−Ａ−２２５６３３)のような、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む適
当な発現ベクターで形質転換した後に、異なる酵母株から発現されている。しか
しながら、多くの場合、異種タンパク質は純粋な形ではなく、Ｃ−またはＮ−末
端短縮のような部分的に分解されたタンパク質を含む混合物として合成される。
例えば、酵母中のヒト心房性ナトリウム利尿タンパク質(ｈＡＮＰ)の発現は、そ
のＣ−末端が異なる成熟ｈＡＮＰの二つの形の分泌をもたらす(Ｖlasuk et al.,
Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. (1986)，261，4798-4796)。同様な結果が、分泌された発現
生産物が、最後(Ａrg５３)または最後の二つ(Ｌeu５２およびＡrg５３)のアミノ
酸が欠失していることで異なり、完全な長さの表皮成長因子(ＥＧＦ)が生産され
ない、酵母中でのＥＧＦの発現(Ｇeorge-Ｎascimento et al.，Ｂiochemistry(1
988)，27，797-802)後にも得られている。
α−インターフェロン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子阻害因子またはデスルファトヒルジンのような完全な長さの
タンパク質ならびにＣ−またはＮ−末端短縮誘導体のような部分的分解物を含む
混合物の個々の成分への分離およびこれらの成分の均質までの精製は、これらの
誘導体が少しでも生物学的に活性である場合、困難で時間がかかる。付随的経費
を考慮して、酵母におけるデスルファトヒルジンのような均質タンパク質の経済
的製造を可能にする改善された方法の必要性がある。酵母に異種のタンパク質を
均質形で製造する方法が、本発明の目的である。
驚くべきことに、異種タンパク質の発現におけるＳaccharomyces cerevisiae
株3T393の使用が、他の遺伝子的に緊密に関係するＳaccharomyces cerevisiae株
、例えば、遺伝的に最も緊密に関係するＳaccharomyces cerevisiae c13-ABYS-8
6(DSM 9698)と比較して、生理学的に活性で非分解形の発現異種タンパク質の収
率増大を導くことが判明した。発明の記載
本発明は、Ｓaccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)またはその誘導体を
異種タンパク質の発現に使用することを特徴とする、酵母に異種のタンパク質を
均質形で製造する方法に関する。
好ましい態様において、本発明は、異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を
含むハイブリッドベクターで形質転換したＳaccharomyces cerevisiae株HT393(D
SM 9697)またはその誘導体を培養し、異種タンパク質を単離することを含む、酵
母に異種のタンパク質を均質形で製造するための改善された方法に関する。
HT393の誘導体は、HT393に由来し、異種タンパク質の製造に関して同じ性質を
示す株である。本発明の株の使用は、例えば、発現された異種タンパク質の生物
学的に活性で非分解形の増加した収率を導く。
異種タンパク質はまた、更に、例えば、グリコシル化処理できる。有用なタン
パク質は、例えば、栄養物の製造および化学における酵素反応の実施に使用でき
る酵素もしくは、栄養物として有用で価値のあるまたはヒトまたは動物疾病の処
置または予防のためのタンパク質、例えば、ホルモン、免疫調節活性、抗ウイル
スおよび抗癌特性を有するポリペプチド、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固
因子、酵素阻害剤、食料品等である。
このような異種構造遺伝子は、例えば、セクレチン、チモシン、レラキシン、
カルシトニン、黄体化ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノアデノコルチコト
ロピン(adrenoadenocorticotropin)、メラノサイト刺激ホルモン、β−リポトロ
ピン、ウロガストロンまたはインシュリンのようなホルモン、上皮成長因子、イ
ンシュリン様成長因子(ＩＧＦ)、例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II、肥満細
胞成長因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞成長因子または変換成長因子(t
ransforming growth factor)(ＴＧＦ)、例えば、ＴＧＦαまたはＴＧＦβ、例え
ば、ＴＧＦβ１、β２またはβ３のような成長因子、ヒトまたはウシ成長ホルモ
ンのような成長ホルモン、インターロイキン−１または−２のようなインターロ
イキン、ヒトマクロファージ遊走阻止因子(ＭＩＦ)、ヒトα−インターフェロン
、例えば、インターフェロン−αＡ、αＢ、αＤまたはαＦ、β−インターフェ
ロン、γ−インターフェロンまたはハイブリッドインターフェロン、例えば、α
Ａ−αＤ−またはαＢ−αＤ−ハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッ
ドインターフェロンＢＤＢＢのようなインターフェロン、α1−アンチトリプシ
ン、ＳＬＰＩのようなプロテイナーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子の阻
害剤(ＰＡＩ−２)等のような阻害剤、Ｂ型肝炎ウイルス表面またはコア抗原また
はＡ型肝炎ウイルス抗原、または非Ａ非Ｂ抗原のような肝炎ウイルス抗原、組織
プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼのようなプラスミノーゲン活性
化因子、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドルフィン、免疫グ
ロブリンＤ、ＥまたはＧの軽および／または重鎖またはヒト−マウスハイブリッ
ド免疫グロブリンのような免疫グロブリン、免疫グロブリンＥ結合因子、例えば
ｓＣＤ２３等のような免疫グロブリン結合因子、カルシトニン、ヒトカルシトニ
ン関連ペプチド、第IX因子または第VIIIｃ因子のような血液凝固因子、エリスロ
ポイエチン、エグリンＣのようなエグリン、デスルファトヒルジン変種ＨＶ１、
ＨＶ２またはＰＡのようなデスルファトヒルジン、ヒトスーパーオキシドディス
ムタ
ーゼ、ウイルスチミジンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼ
をコードするものである。
好ましい遺伝子は、ヒトα−インターフェロンまたはハイブリッドインターフ
ェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢおよびプラスミノーゲン活
性化因子阻害因子(ＰＡＩ−２)をコードするものである。
本発明の好ましい態様において、発現均質タンパク質は分泌されない。
Ｓ．cerevisiae株HT393(E95-1-2A)は、Ｈeinemeyer et al.，ＥＭＢＯ Ｊ．(1
991)，10，555-562に記載のように、c13-ABYS-86株(DSM 9698)から得る。
Ｓ．cerevisiae株HT393の誘導体なる用語は、HT393から遺伝子工学により由来
し、例えば、更に２ミクロン(２μ)ＤＮＡ(cir0)から除かれ、異なる交配型(Ｍ
ＡＴα)および／または異なる分泌マーカーを有する株を含む。好ましいものは
、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、カルボキシペ
プチダーゼＳおよびプロテイナーゼyscＥをまた欠失するHT393およびその誘導体
である。
本質的に好ましくは、少なくとも以下の遺伝的特性、ＭＡＴａ、leu２−３、l
eu２−１１２、ura３Δ５、prb１−１、cps１−３、prc１−１、pra１−１およ
びpre１−１を示すHT393およびその誘導体である。発現カセット
好適な発現カセットは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列および転写停止信
号を含むＤＮＡ配列に操作可能に結合したプロモーターを含む。
発現カセットは、更に、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の適当な
読み取り枠に結合した信号ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み得る。
好ましい態様において、プロモーター、信号配列、存在するのであればターミ
ネーターは、酵母発現システムにより認識される。
ある宿主において発現させるのに好適なプロモーターは既知である。例は、Ｔ
ＲＰ１遺伝子、ＡＤＣ１遺伝子(アルコールデヒドロゲナーゼＩをコード)または
ＡＤＲ２遺伝子(アルコールデヒドロゲナーゼIIをコード)、酸ホスファターゼ(
ＰＨＯ５)遺伝子、ＣＵＰ１遺伝子、イソチトクロームｃ遺伝子のプロモーター
ま
たは糖分解酵素、例えば、ＴＤＨ３、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ(GAPDH)、GAPDHの短縮版(GAPFL)、３−ホスフォクリセラートキ
ナーゼ(ＰＧＫ)、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホプル
クトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラート
ムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセフォスフェートイソメラーゼ、ホスホ
グルコースイソメラーゼ、インバターゼおよびグルコキナーゼ遺伝子をコードす
る遺伝子のプロモーター、ａ−またはα−因子をコードする酵母交配フェロモン
遺伝子のプロモーター、またはGAL/CYC1ハイブリッドプロモーター(GAL1-GAL10
遺伝子／Cytochromel遺伝子の遺伝子間領域：Ｇuarente et al.，Ｐroc. Ｎatl.
Ａcad. Ｓci. (1982)，79，7410-7414)である。本発明の好ましいベクターは、
例えば、成長条件の変化により付けたり消したりできる転写制御を有するプロモ
ーター、例えば、ＰＨＯ５、ＡＤＲ２またはGAL/CYC1プロモーターを含む。例え
ば、ＰＨＯ５プロモーターは、単に、培地中の無機リン酸濃度の増加または減少
により、意のままに抑制または脱抑制できる。
信号ペプチドをコードするＤＮＡ配列(“信号配列”)、例えば、酵母信号ペプ
チドは、通常分泌されるタンパク質をコードする酵母遺伝子由来である。酵母信
号配列は、例えば、酵母インバーターゼ(ＳＵＳ２)、α−因子、フェロモンペプ
チダーゼ(ＫＥＸ１)、“死滅毒素”および抑制可能酸ホスファターゼ(ＰＨＯ５)
遺伝子およびＡspergillus awamori由来のグルコアミラーゼ信号配列である。特
別な処理信号を担持し得るプロ−またはスペーサー−配列のような付加配列をま
た構築物中に含むことができ、前駆体分子の正確な処理を容易にする。例えば、
処理信号は、ゴルジ膜に位置する酵母エンドペプチダーゼにより認識される、Ｌ
ys−Ａrg残基を含む。
転写停止信号、例えば、酵母転写停止信号を含むＤＮＡ配列は、好ましくは、
転写停止およびポリアデニル化の正確な信号を含む遺伝子、例えば、酵母遺伝子
の３'フランキング配列である。好ましいフランキング配列は、酵母ＰＨＯ５、
ＦＬＰおよびα−因子遺伝子のものである。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、制限酵素、ＰＣＲを使用した所望
のフラグメントの切除のような、当分野で既知の方法により、天然宿主の遺伝子
バンクから単離し得、または、例えば、宿主の好ましいコドン使用を使用して、
化学的に合成し得る。
プロモーター、タンパク質をコードするＤＮＡ遺伝子および転写停止信号を含
むＤＮＡ配列は互いに操作可能に結合し、すなわち、それらの通常の機能が維持
される方法で、並列している。配列は、プロモーターが適切なタンパク質の発現
、または、信号配列が存在する場合、適切な信号配列−タンパク質複合体の発現
を果し；転写停止信号が転写およびポリアデニル化の適切な停止を果すようにす
る。信号配列を使用する場合、信号配列は、信号配列の最後のコドンがタンパク
質の遺伝子の最初のコドンに直接結合するように、タンパク質遺伝子の適切な読
み取り枠内で結合する。信号配列は、存在する場合、翻訳開始のためのそれ自体
のＡＴＧを有する。これらの配列の結合は、例えば、エンドヌクレアーゼの認識
配列を担持する合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーの手段により成す。関
連する発現カセットの例は、例えば、ＥＰ−Ａ−３４１２１５に記載されている
。
好ましい発現カセットは、ＰＨＯ５、ＡＤＲ２またはGAL/CYC1プロモーター、
上記で定義のタンパク質をコードする遺伝子およびＰＨＯ５、α−因子またはＦ
ＬＰターミネーターを含む。
特に好ましくは、例えば、pPAI-2A-10、pPAI-2A-20、pPAI-2B-10、pPAI-2B-20
からなる、もしくは配列番号１またはその機能的フラグメントまたは誘導体から
なる発現カセットである。
組換えＤＮＡ分子の機能的フラグメントまたは誘導体は、例えば、上記タンパ
ク質の短縮または伸長形をコードするフラグメントまたは該タンパク質をコード
する組換えＤＮＡ分子を含む発現カセットである。組換えプラスミド
上記の発現カセットは、通常、酵母中での異種タンパク質の発現に適当なプラ
スミド中に挿入されている。これらのプラスミドは、２ミクロン、すなわち、pM
B354またはpEMBLyexプラスミドを基にする(ＣesareniおよびＭurray，Ｇenetic
Ｅngineering(1987)，4，135-154)。好適な組換えプラスミドは、例えば、タン
パク質発現カセットの他に、複製の起点を含む２ミクロンＤＮＡに由来するＤＮ
Ａセグメントまたは全２ミクロンＤＮＡを含む。例えば、本発明のプラスミドは
、非中断形で完全な２ミクロンＤＮＡを含み、すなわち、２ミクロンを一度制限
エンドヌクレアーゼで開裂し、直鎖状にしたＤＮＡをベクターの他の成分と結合
させ、その後再環化する。制限部位は、ＲＥＰ１、ＲＥＰ２およびＦＬＰ遺伝子
および２ミクロンＤＮＡのＯＲＩ、ＳＴＢ、ＩＲ１およびＩＲ２部位ならびに、
ＦＬＰリコンビナーゼが作用する点である各逆反復(ＩＲ)の中心の近くに位置す
る、小“ＦＬＰ認識標的”(ＦＲＴ)部位の正常な機能が維持されるように選択す
る。所望により、制限部位は、２ミクロンＤＮＡのＤ遺伝子がまた無傷で保たれ
るように選択する。適当な制限部位は、例えば、全ての該遺伝子および部位の外
に位置する独特なＨpalおよびＳnaＢＩ部位である。しかしながら、同様に、発
現カセットおよび更なる成分(下記参照)を、２ミクロンＤＮＡ内の異なる(例え
ば２つの)制限部位、特に上記の所に挿入することが可能である。
このようなプラスミド誘導体は、二つの逆に反復したＦＲＴ部位または更なる
、第３のＦＲＴ部位を含み得る。前者の種のプラスミドを以後“対称２ミクロン
様ハイブリッドベクター”と呼ぶ。後者の種のプラスミドを、本当の対称ではな
いが、それで形質転換した酵母細胞中で対称２ミクロン様ハイブリッドベクター
を発生させるため、以後“対称２ミクロン様分解ベクター”と呼ぶ。
本発明の対称２ミクロン様ハイブリッドベクターは、好ましくは、細菌または
ウイルスＤＮＡ、即ち、細菌ゲノムまたはプラスミドまたはウイルス由来のＤＮ
Ａを含まない。しかしながら、本発明の２ミクロン様分解ベクターは、本分解ベ
クターから対称２ミクロン様ハイブリッドベクターが製造される形質転換酵母細
胞中でベクターから切断される二つの直接反復したＦＲＴ部位の間に、真核起源
のＤＮＡ配列を含み得る。これらのＤＮＡ配列は、下記のような細菌配列であり
、ベクター必須構造的または機能的特性に提供され得、または、対称２ミクロン
様ハイブリッドベクターまたは対称分解ベクターを構築するために、非対称２ミ
クロン様プラスミド誘導体または“非対称”分解ベクターの二つの逆に反復した
ＦＲＴ部位の間の二つの領域を満たす機能のみを有し得る。
好ましくは、本発明の発現ベクターは、１個またはそれ以上の、特に１個また
は２個の選択的遺伝子マーカー、例えば、酵母のためのマーカーおよび、細菌宿
主、特にＥscherichia coliのマーカーおよび(対称２ミクロン様ハイブリッドベ
クター以外の)複製起点を含む。
選択的遺伝子マーカーに関して、マーカー遺伝子の表現型的発現により、形質
転換体の選択を容易にするマーカー遺伝子が使用できる。適当なマーカーは、例
えば、抗生物質耐性を発現するもの、または、栄養要求酵母変異体の場合、宿主
の障害を補足する遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば、抗生物質Ｇ４１８
、ヒグロマイシンまたはブレオマイシンに対する耐性を付与するかまたは栄養要
求酵母変異体、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３またはＴＲＰ
遺伝子に原栄養性を提供する。
発現プラスミドの増幅が原核生物、例えば、Ｅ．coliで簡便に行われるため、
原核生物(例えば、Ｅ．coli)遺伝子マーカーおよび原核生物(例えば、Ｅ．coli)
複製起源を有利には含む。これらは、対応する原核生物プラスミド、例えば、原
核生物、例えば、Ｅ．coli複製起源およびアンピシリンのような抗生物質に耐性
を付与する遺伝子マーカーを含むpBR322またはｐＵＣプラスミド、例えば、ｐＵ
Ｃ１８またはｐＵＣ１９のようなＥ．coliプラスミドから得ることができる。
タンパク質発現カセット、複製起点および遺伝子マーカーの他に、本発明の発
現プラスミドは、所望により、付加的発現カセット、例えば、１個から３個のタ
ンパク質発現カセットを含むことができる。付加的タンパク質発現カセットは、
互いに同一または異なり、ベクター中に既に存在するタンパク質発現カセットと
同一または異なる。タンパク質の単離
タンパク質は慣用の方法で単離できる。例えば、第１段階は、通常、細胞壁の
融解または機械的破壊および遠心による細胞残骸の除去から成り、または、分泌
型タンパク質の場合、遠心による培養液からの細胞の分離から成る。上清は、ほ
とんどの非タンパク質様物質を除去するようにポリエチレンイミンで処理し、硫
酸アンモニウムで溶液を飽和してタンパク質を沈殿させ、または適当な溶媒で抽
出して、タンパク質に富ませることができる。宿主タンパク質が、存在する場合
、例えば、酢酸（例えば、０.１％、ｐＨ４−５)で酸性化してまた沈殿させ得る
。他の精製段階は、例えば、淡水化、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透
クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆層ＨＰＬＣ等のよ
うなクロマトグラフィー工程を含む。混合物の成分の分離はまた透析により、電
荷に従ってゲル電気泳動または無担体電気泳動により、分子サイズに従って適当
なＳephadexカラムにより、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体での親和性
クロマトグラフィーにより行う。
本発明の更なる態様は、酵母に異種のタンパク質を均質形で製造するための、
Ｓaccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)またはその誘導体の使用に関する
。図面の簡単な説明
以下の実験部分において、本発明の種々の態様が添付の図面を参考にして記載
されており：
図１はプラスミドpPAI-2A-10の図式的説明である。
図２はプラスミドpPAI-2A-20の図式的説明である。
図３はプラスミドpDP34R-PHO5-IFAM119の図式的説明である。酵母株の説明
Ｓｃ７９ （Ｐriece et al.，Ｇene(1987)，55，287-293）
XV2181 （Ｐriece et al.，Ｇene(1987)，55，287-293）
150-2B （Ｂaldrai et al.，EMBO(1987)，6，229-293）
CGY1465 （Ｒudolph et al.，Ｃell(1989)，58，1333-145）
c13-ABYS-86 （Ｈeinemeyer et al.，EMBO J．(1991)，10，555-562）DSM 9698
MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pr
a1-1、his
HT393 （Ｈeinemeyer et al.，EMBO J．(1991)，10，555-562）DSM 9697
MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pr
a1-1、pre1-1実施例
全ＤＮＡ操作は−特記しない限り−例えば、Ｓambrook et al.，Ｍolecular
Ｃloning：Ａ laboratory manual，2nd Ｅdn，Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌaborato
ry Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈabor ＮＹ，1989の記載のような標準プロトコール
に従って行う。１.プラスミノーゲン活性化因子(ＰＡＩ−２)の発現 １.１ pMB354の構築
本プラスミドは酵母／Ｅ．coliシャトルベクターＹep24を基本にし、Ｓ．cere
visiae中での異種タンパク質の発現のためにＡＤＲ２プロモーターを有する。
ＡＤＲ２遺伝子に特異的なＤＮＡ配列は、ＢamＨＩおよびＳall制限部位がア
ルコールデヒドロゲナーゼIIタンパク質の本来のＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に
製造されている以外、Ｒussell et al.(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．(1983)，258，2674-
2682)により発表されているものと同一である。変異ＥcoＲＶ／Ｘbal ＤＮＡフ
ラグメントをｐＭac５.８にクローンし、ｐＭac５.８−ＡＤＲを製造し(Ｓtrass
en et al.，Ｎucl．Ａcids Ｒes．(1985)，17，4441-4454に記載のように)、Ｓm
aＩおよびＸbalで消化する。１１００bpフラグメントを、プラスミドをＸbalお
よびＥcoＲＩで切断することによりそこから単離する。本フラグメントをベクタ
ーＹep24にクローンし、ＮhelおよびＰvuIIで切断し、新プラスミドpMB354を製
造する。
クローンＡＤＲプロモーターの対応部位は以下の構造を有する：
１.２ ＰＡＩ−２をコードするｃＤＮＡの単離
ＰＡＩ−２のｃＤＮＡは、４１５アミノ酸であり、開始メチオニンを除去した
後の非グリコシル化タンパク質のＭr.が４６.５４３と予測されるタンパク質を
コードするＵ９３７細胞系由来である。タンパク質は恐らく３つのＮ−グリコシ
ル化部位を有する(Ａntalis et al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad，Ｓci．USA(1988)，
86，985-998)。ＰＡＩ−２を含む適当なＢgIII／ＥcoＲＩフラグメントをプラス
ミドpBT447(Ａntalis et al.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad，Ｓci．USA(1988)，86，98
5-989)から単離する。突出したＢgIIIおよびＥcoＲＩ末端を、ポリメラーゼＩク
レノウフラグメントで平滑末端とする。
この対立遺伝子タイプをＰＡＩ−２のＡと呼ぶ(ＰＡＩ−２Ａ)。アミノ酸位
で変化した３つのアミノ酸を有する他の対立遺伝子が存在し、ＰＡＩ−２のタイ
プＢと呼ぶ(ＰＡＩ−２Ｂ)。１.３ ＰＡＩ−１Ａのクローニング
ＰＡＩ−２発現ベクターpPAI-2A-10およびpPAI-2A-20は、プラスミドpEMBLyex
4(ＣesareniおよびＭurray，Ｇenetic Ｅngineering(1987)，9，135-154)に基づ
いている。pEMBLyex4および必要なＤＮＡ要素は、その刊行物に詳細に記載され
ている。
pEMBLyex4を、ポリリンカー内でＳaclで開裂し、突出したＳacl末端をポリメ
ラーゼＩクレノウフラグメントで平滑末端にし、その後単離ＰＡＩ−２フラグメ
ントとライゲートし(上記参照)、プラスミドpPAI-2A-10(図１)を得る。
同様に、ＰＡＩ−２Ａ ｃＤＮＡをプラスミドpMB354(実施例１.１)のＢamＨ
Ｉ／ＳaII部位にクローンし、pPAI-2A-20(図２)を製造する。１.４ ＰＡＩ−ＩＢのクローニング
ＰＡＩ−２ＢをコードするｃＤＮＡを、ＰＡＩ−２Ａ ｃＤＮＡのクローニン
グと同様に、プラスミドpEMBLyex4のポリリンカー内にクローンし(実施例１.３)
、pPAI-2B-10を得、pMB354内にクローンし、pPAI-2B-20を得る。１.５ pPAI-2A-10およびpPAI-2B-20での酵母の形質転換
プラスミドpPAI-2A-10およびpPAI-2B-20を６つの異なる株：
Ｓｃ７９ （Ｐriece et al.，Ｇene(1987)，55，287-293）
XV2181 （Ｐriece et al.，Ｇene(1987)，55，287-293）
150-2B （Ｂaldrai et al.，EMBO(1987)，6，229-293）
CGY1465 （Ｒudolph et al.，Ｃell (1989)，58，1333-145）
cl3-ABYS-86 （Ｈeinemeyer et al.，EMBO J．(1991)，10，555-562）DSM 9698
MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pr
a1-1、his
HT393 （Ｈeinemeyer et al.，EMBO J．(1991)，10，555-562）DSM 9697
MATα、leu2-3、leu2-112、ura3Δ5、prb1-1、cps1-3、prc1-1、pr
a1-1、pre1-1
に形質転換する。１.６ ＰＡＩ−２ＡおよびＰＡＩ−２Ｂの発現
ＰＡＩ−２は、全株の細胞抽出物の可溶性フラクション内に検出できるが、不
溶性物質を含む沈降物および培養液中では検出できない。ＰＡＩ−２の発現は、
ウェスタンブロッティング、ELISAおよび生物学的活性試験により分析する。
表１は、参考文献に記載されているように、振盪フラスコ内で培養した時の、
異なる株でのＰＡＩ−２ＡおよびＰＡＩ−２Ｂの発現収率を記載する。
株HT393は、ＰＡＩ−２Ａの発現をGAL/CYC1プロモーター制御下で行った時、
他の４種の株と比較して最も良好な生産体であり、５０mgのＰＡＩ−２Ａ／１培
養液を製造する。
HT393はまたＡＤＲ２プロモーター制御下でのＰＡＩ−２Ｂの発現にも最良の
宿主である。
ＩＬ発酵器中で、プラスミドpPAI-2A-10の手段で得た生産物は、cl3-ABYS-86
では３１０mgのＰＡＩ−２／１およびHT393では６８０mgのＰＡＩ−２／１であ
る。２.α−インターフェロンＢ／Ｄハイブリッドの発現 ２.１ α−インターフェロンサブタイプＢおよびＤのｃＤＮＡクローンの単離 ならびにＢ／Ｄハイブリッドの構築
ヒトナマルバ(Ｎamalva)細胞を、標準条件下（ＥＰ−Ａ−０７６１８９）で細
胞をニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)で攻撃することにより、インターフェロ
ン合成を誘発する。全ｍＲＮＡを単離し、ＥＰ−Ａ−２０５４０４に記載のよう
にシュークロース密度勾配遠心で分画する。富化フラクションをｃＤＮＡ合成に
使用する。ポリ(ｄＣ)伸長ｃＤＮＡのクローニングを、Ｅ．coliベクターpBR322
のＰstＩ部位に行う。ＤＮＡ配列分析は、Ｈenco et al．(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．(1
985)185，227-260)に記載のように、α−インターフェロンサブタイプへの遺伝
子の割り当てを可能にする。α−インターフェロンサブタイプＢおよびＤに対応
するポリペプチドをコードするクローンを単離する。
サブタイプＢおよびＤの共通のエンドヌクレアーゼ制限部位の存在が、タンパ
ク質コード領域の４つの領域への細分を可能にする。
α−インターフェロンコード領域の、その領域の分離のための制限部位：
α−インターフェロンコード領域
これらのサブタイプＢおよびＤ領域の組み合わせは、１４の異なるＢ／Ｄハイ
ブリッドの入手を可能にする。構造配置：Ｂ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4はサブタイプＤの対応領
域で第２領域(アミノ酸残基６１から９２)を置換されたサブタイプＢのα−イン
ターフェロンである。この配列配置は、Ｂ遺伝子の第１領域を含む制限フラグメ
ントと、Ｄ遺伝子の残りを含む制限フラグメントを、最初の共通の内部Ｓau３Ａ
制限部位でライゲートすることにより得、ハイブリッドＢ1Ｄ2Ｄ3Ｄ4を得る。Ｂ
／ＤハイブリッドＢ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4は、Ｂ1Ｄ2Ｄ3Ｄ4遺伝子のＮ−末端側の半分と、
Ｂ遺伝子(Ｂ1Ｂ2Ｂ3Ｂ4)のＣ−末端側の半分を、共通の内部Ｐvu11制限部位によ
り組み合わせることにより得る(ＥＰ−Ａ−２０５４０４)。Ｂ／Ｄハイブリッド
Ｂ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4はまたＩＦＡＭ１１９とも呼ぶ。Ｂ／Ｄハイブリッド構造は、本来
のＢおよびＤ遺伝子の下位領域に特異的な制限エンドヌクレアーゼを使用した制
限分析により確認される。最終の証拠は、ＤＮＡ配列分析により得る。ハイブリ
ッド遺伝子Ｂ1Ｄ2Ｂ3Ｂ4のコード領域のＤＮＡ配列データは配列番号１に示す。２.２ 発現プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119の構築
α−インターフェロンＢ／Ｄの発現は、培地中の無機リン酸の低い濃度により
抑制される、酵母酸ホスファターゼ遺伝子(ＰＨＯ５)の制止可能プロモーターの
制御下である。
ＰＨＯ５遺伝子のＡＴＧから−５４１位のＢamＨＩ制限部位および遺伝子の−
８位に挿入されたＥcoＲＩリンカーは、５３４bp ＢamＨＩ−ＥcoＲＩ ＰＨＯ
５プロモーターフラグメントの簡便なクローニングを可能にする。ＰＨＯ５プロ
モーターは、以下の配列
の合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーにより、α−インターフェロンＢ／
Ｄのコード配列にライゲートされる。
リンカーは、ＰＨＯ５プロモーターフラグメントへのライゲーションのための
ＥcoＲＩ制限部位、４つの非転写ヌクレオチド、翻訳開始のためのＡＴＧおよび
ＡＴＧから＋１４位のＤdel制限部位までの純粋なα−インターフェロンＢ／Ｄ
コード配列を提供する。
プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119のPHO5-IFAM119発現カセットは、pBR322の２
７６bp Ｓall−ＢamＨＩフラグメント、５３４bp ＢamＨＩ／ＥcoＲＩ ＰＨ
Ｏ５プロモーターフラグメント、α−インターフェロンＢ／Ｄのコード配列(５
０４bp)およびＰＨＯ５転写停止領域由来の１８１bp ＤＮＡフラグメントから
成る(図１)。カセットの３'末端はＨindIII部位であり、それは反応をクレノウ
ＤＮＡポリメラーゼで満たし、１.６kb ＳaII−ＨindIII平滑末端発現カセット
の２ミクロン基本酵母ベクターｐＤＰ３４へのクローニングにおいて開裂されな
い(Ｈinnen et al.,（1989）Ｉn Ｂarr et al.,（編）Ｙeast Ｇenetic Ｅngine
ering．Ｂutterworths，Ｂoston，pp．189-213)。
プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119の完全な発現カセットの配列は、Ｓangerに従
った鎖停止法により、二本鎖ＤＮＡを配列決定により測定される。ＤＮＡ配列は
、予期される配列(配列番号１)と同一である。
発現プラスミドpDP34R/PHO5-IFAM119は、完全酵母２ミクロン環、酵母ＵＲＡ
３遺伝子および酵母dLEU2遺伝子から成る。dLEU2遺伝子は、それ自体のプロモー
ターを有せず(dLEU2≡Ｅnhard et al.，et al.，Ｊ．Ｂacteriol．(1983)，156,
625中のleu2-d)、従って、dLEU2遺伝子の転写は５'上流２ミクロン配列の開始
に依存する。プラスミド地図は図３に示す。２.３ Ｂ／Ｄハイブリッドの発現
pDP34R/PHO5-IFAM119を、Ｈinnen et al.，(Proc．Natl．Acad，Sci．USA (19
78)，1929)の記載のように、ポリエチレングリコールの存在下、Ｓaccharomyces
cerevisiae HT393に挿入する。宿主株HT393は、ロイシンおよびウラシルに関
して栄養要求である。発現プラスミドは、宿主のロイシンおよびウラシル栄養要
求を捕うために、dLEU2およびURA3遺伝子を含む。プラスミド含有形質転換体の
選択は、ロイシン供給、ウラシル欠失培地での成育により成す。発現プラスミド
pDP34R/PHO5-IFAM119は、天然培地での非選択的成育条件下でさえ、宿主中で、
多いコピー数で、安定に維持される。
α−インターフェロンＢ／Ｄは、培地中の無機リン酸の低い濃度で誘発される
、ＰＨＯ５プロモーターの制御下で発現される。
形質転換HT393の一つの単一コロニーを、振盪フラスコ内のウラシル欠失酵母
最小培地１０ml中に取り出して入れ、３０℃で２００rpmで２４時間成育させる
。これらの細胞を最小培地で洗浄し、５００ml振盪フラスコ、２０００mlフラス
コおよび３０Ｌ発酵器での、各４８時間の発酵のためのウラシル欠失培地への接
種に使用する。最後に、細胞を低Ｐi−完全培地を使用した３００Ｌ発酵器中で
４７時間成育させる。
製造されたインターフェロンは、細胞のサイトゾルに細胞内的に蓄積される。２.４ α−インターフェロンＢ／Ｄの単離
細胞５g(実施例２.３から)を遠心により回収し、洗浄し、水および緩衝液(２
０％ＮａＣｌ ｗ／ｗおよび８.３％ ＫＨ2ＰＯ4 ｗ／ｗ)で以下の最終組成に
合わせる：
湿潤細胞重量：６０％ ｗ／ｗ
ＮａＣｌ： ０.５Ｍ
Ｋ−リン酸： ７０mＭ。
ｐＨを７.０に合わせ、細胞を、ガラスビーズを充填したＤyno Ｍill(商標)タ
イプＫＤ−５ホモジナーザーを一回通すことにより破壊する。
α−インターフェロンＢ／Ｄを、
ａ）７部の９.５％ Ｋ−リン酸および１２.５％ ＮａＣｌ(重量当たり)の溶液
；および３部のPEG1500を含む２相システムを使用した上相への抽出；
ｂ）２０％ Ｋ−リン酸および５.８％ ＮａＣｌの溶液を使用した上相の洗浄
ｃ）１８.８％ ＭｇＳＯ4(重量当たり)の溶液を使用した洗浄相から、下相への
戻し抽出
ｄ）および続く逆相ＨＰＬＣ分析
カラム：１５０×４.６mm Ｃ−１８(Ｖydac 218TP5415)
緩衝液Ａ：Ｈ2Ｏ中の０.１％トリフルオロ酢酸
緩衝液Ｂ：０.０９％トリフルオロ酢酸含有８０％アセトニトリル
流速：２.０ml／分
注入用量：５０μl
勾配：３５分での６１％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂ
生理学的活性α−インターフェロンＢ／Ｄの保持時間：２２分±１−２分
による、２相抽出により単離する。
単離α−インターフェロンのアミノ酸組成を、ガス相加水分解およびアミノ酸
のジメチルアミノベンゼンスルホニル(ＤＡＢＳ；Ｋnecht＆Ｃhang，Ａnalyt．
Ｂiochem．(1986)，58，2375-2379)による誘導体化により測定した、表２参照。
単離α−インターフェロンＢ／ＤのＮ−末端配列は、ガス相シークエンサー内
の自動エドマン分解およびＲＰ−ＨＰＬＣによるフェニルチオ−ヒダントインア
ミノ酸の検出により測定する。最初の２０アミノ酸の実験的に測定した配列は、
予定された配列(配列番号３)と一致する。
電子噴霧イオン化質量分光により実験的に測定した単離されたα−インターフ
ェロンＢ／Ｄのモル当たりのアミノ酸のモル量(１９５６６.６×０.２７)は、計
算値(１９５６８.６)と一致する。
単離α−インターフェロンの特異的抗ウイルス活性は、ＭＤＢＫ細胞およびＶ
ＳＶ(ＭＤＢＫ：Ｍadin Ｄarbyウシ腎臓；ＶＳＶ：水疱性口内炎ウイルス）を使
用して、Ｒubinstein et al.，(Ｊ．Ｖiol．(1981)，37，755)による標準検定で
測定して、１.５−２.３×１０8ＩＵ／タンパク質mg(ＩＵ：国際単位)である。２.５ 他の酵母株との比較
pDP34R/PHO5-IFAM119をＳ．cerevisiae株cl3-ABYS-86(HT393の親株)に挿入し
、培養液にヒスチジンを添加する以外、上記のように培養する。製造されたα−
インターフェロンを上記のように単離する(表３参照)。
pDP34R/PHO5-IFAM119で形質転換されたHT393株は、pDP34R/PHO5-IFAM119で形
質転換された親cl3-ABYS-86株と比較して、１０倍に増加したインターフェロン
発現を示す。微生物の寄託
以下の微生物株を、ドイツ連邦共和国、デー−３８１４２ブランシュヴェイク
、マシェローダー・ヴェーク１ベー番のドイッチェ・サムルンク・フォン・ミク
ロオルガニズメン(ＤＳＭ)に寄託した(受託番号および寄託日は)：
Ｓaccharomyces cerevisiae HT393 DSM 9697 27.01.1995
Ｓaccharomyces cerevisiae cl3-ABYS-86 DSM 9698 27.01.1995
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ
//(Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｐ 21/00
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ
Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ
)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ
，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，
ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ
Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ
，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ブレーカー，ミヒャエル
ドイツ連邦共和国デー−35041マールブル
ク、パッペルヴェーク30番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．Ｓaccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)またはその誘導体を異種タ ンパク質の発現に使用することを特徴とする、酵母に異種のタンパク質を均質形 で製造する方法。 ２．異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むハイブリッドベクターで形 質転換したＳaccharomyces cerevisiae株HT393(DSM 9697)またはその誘導体を培 養し、異種タンパク質を単離することを含む、請求項１記載の方法。 ３．異種タンパク質が分泌されないことを特徴とする、請求項１記載の方法。 ４．異種タンパク質が、α−インターフェロン、ハイブリッドインターフェロ ンおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害因子からなる群から選択されるもので ある、請求項１記載の方法。 ５．異種タンパク質がハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢまたはプラスミ ノーゲン活性化因子ＰＡＩ−２阻害因子である、請求項１記載の方法。 ６．HT393の誘導体がcir0またはＭＡＴαであることを特徴とする、請求項１ 記載の方法。 ７．HT393の誘導体がまたプロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、カルボキシペプ チダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼＳおよびプロテイナーゼyscＥを欠失する ことを特徴とする、請求項１記載の方法。 ８．HT393の誘導体がＭＡＴａ、leu２−３、leu２−１１２、ura３Δ５、prb １−１、cps１−３、prc１−１、pra１−１およびpre１−１であることを特徴と する、請求項１記載の方法。 ９．Ｓ．cerevisiae HT393株またはその誘導体が、タンパク質をコードするＤ ＮＡ配列および転写停止信号を含むＤＮＡ配列に操作可能に結合したプロモータ ーを含む発現カセットを含むプラスミドで形質転換されていることを特徴とする 、請求項１記載の方法。 １０．プロモーターが、ＰＨＯ５、ＡＤＲ２およびGAL/CYC1プロモーターから なる群から選択されることを特徴とする、請求項９記載の方法。 １１．ターミネーターが、酵母ＰＨＯ５、ＦＬＰおよびα−因子ターミネータ ーからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９記載の方法。 １２．発現カセットが、pPAI-2A-10、pPAI-2A-20、pPAI-2B-10、pPAI-2B-20ま たは配列番号１に記載のものまたはそれらの機能的フラグメントまたは誘導体に 含まれるような組換えＤＮＡ分子を含むことを特徴とする、請求項９記載の方法 。 １３．プラスミドが、２ミクロン、Ｙep２４またはpEMBLyexプラスミドからな る群から選択されるプラスミドを基本にしていることを特徴とする、請求項９記 載の方法。 １４．酵母に異種のタンパク質を均質形で製造するための、Ｓaccharomyces c erevisiae HT393株(DSM 9697)またはその誘導体の使用。
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A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr |
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