CN1035127A

CN1035127A - 小蛭素衍生物

Info

Publication number: CN1035127A
Application number: CN89100165A
Authority: CN
Inventors: 彼得·克劳斯; 波尔·哈巴门; 多米尼奎·特里皮尔
Original assignee: Hechester Jsc
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1985-04-11
Filing date: 1989-01-11
Publication date: 1989-08-30
Anticipated expiration: 2004-01-11
Also published as: CN1029988C

Abstract

本发明涉及氨基酸顺序如下所示的水蛭素衍生物及其制备方法 Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly- Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn- Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu- Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Gys-Val- Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Cln-Ser- His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro- Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln

该方法包括在宿主细胞(酵母细胞)内表达编码有所说氨基酸顺序之多肽的DNA。

Description

公开号为（EP-A）0，171，024的欧洲专利申请上公开了水蛭素衍生物及其遗传工程制备。

业已发现有下列氨基酸顺序，即

0 1 10

Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Gys-Leu-

20

Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu-

30 40

Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-

50

Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-

60

Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln

的水蛭素衍生物具有许多优点。EP-A 0，171，024中所用的顺序编号被保留于该顺序中。生物学活性不同的水蛭素及其衍生物，可表现在对凝血酶的亲合力的不同和/或稳定性的不同。依据本发明的水蛭素衍生物因其比活性不同而异于其他衍生物。

也已发现，本发明的水蛭素衍生物特别有利于在酵母中表达。比较实验表明，以N末端Thr-Tyr或Ile-Tyr开始的同系水蛭素衍生物只以低产率表达。

由酵母细胞中表达的优点不仅因为可以分泌水蛭素衍生物，而且还因为它在实际定量上是呈准确析迭形式的并具有高度活性的。

图1显示用于制得基因结构的克隆载体，所说的基因结构编码酵母MFα前体蛋白及本发明的水蛭素衍生物。图2显示含有该基因结构的酵母表达载体。

当然，亦可依不同方法来制备本发明的水蛭素衍生物，如可在细菌或昆虫细胞及动物细胞等较高等真核细胞中表达。但最好是在酵母系统中表达，例如使用在EP-A0，248，227中所列举的酵母，如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、多形汉逊酵母（Hansenula polymorphis）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）或最好是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

用于在酵母中进行表达的许多载体都是已知的，如参见EP-A0，060，057、0，008，632、0，116，201、0，121，884、0，123，544及0，195，691等。下文将描述使用酵母α因子系统制备本发明水蛭素衍生物的方法，但这只是借助实施例阐述本发明，因为亦可使用其他一些表达系统，依照已知方法进行制备。

Kurjan和Herskovitz（Cell 30，933-943，1982）描述了酵母信息素基因MFα的结构，其中还讨论了表达其他基因和分泌基因产物的可能性。关于这个问题，亦可参见Brake等，Proc，Natl.Acad.Sci 81，4642-4646，1984。

优选采用的酵母载体是所谓的穿梭载体，其具有细菌质粒的复制原点，以及在两种宿主系统中分泌的基因。此外，该类型载体还含有表达外来基因所必需的启动子顺序，以及最好有可改善产率的终止顺序，从而即可使利于同分泌信号融合的异源基因定位于启动子和终止密码子之间。

下列实施例将详细阐明本发明。其中所说的百分比均指重量。

实施例1：表达载体的构建

首先依亚磷酸酯法合成DNA顺序1（表1）。该DNA顺序编码MFα前体蛋白的氨基酸49至80，且基本上相当于天然DNA顺序。

DNA顺序I最初用作分离α因子之基因的探针，为此要用³²P标记。该探针被用来从基因组λgtll酵母基因库（现已可由Clontech Laboratories公司〔4055 Fabian Way，Palo Alto，CA94303〕等处购得）分离基因。为此目的，可通过噬斑杂交实验鉴定携带α因子基因的λgtll噬菌体。分离并增殖根据噬斑鉴定的阳性噬菌体，并制得DNA。用EcoRI裂解该DNA并在0.8%琼脂糖凝胶上分析之。Southern转移实验后，将滤膜与32p标记的DNA顺序I杂交。用酶再次切断具有与DNA顺序I杂交之约1.75Kb片段的噬菌体DNA，并分离相应的片段。用EcoRI切开载体pUC19并使用T4连接酶与1.75Kb片段反应。得到克隆载体1。

表2中所列的克隆载体都是在pUC质粒的基础上构建的。此表只显示处于通常的5′-3′方向的这些载体的多连接子区，同时用虚线表明MFα顺序，并用破折线表明水蛭素顺序。连线代表pUC和连接子顺序。图1图解显示了这些克隆载体（未给出比例）。

用连接混合物转化大肠杆菌菌株79/02。分离白色菌落并制取质粒DNA，然后鉴定出含1.75Kb EcoRI片段的质粒。

MFα之前体蛋白的天然DNA顺序在编码氨基酸8至10的区域中含有-pstⅠ裂解位点，在编码氨基酸48/49的区域中含有-TaqⅠ裂解位点。至此通过与pstⅠ和TaqⅠ反应中分离的质粒DNA中分离了编码MFα前体顺序之氨基酸9至48的片段。用PstⅠ和KpnⅠ切开载体pUC18，并使用T4连接酶使之与PstⅠ-TaqⅠ片段及合成的DNA顺序Ⅰ反应。用此连接混合物转化大肠杆菌79/02。将转化混合物接种在IPTG-Xgal-Ap平皿上。分离白色菌落，并根据限制性酶切分析对这些克隆的质粒DNA进行定性。以这种方法制得编码MFα前体顺序之氨基酸8至80的克隆载体2。

经与PstⅠ和KpnⅠ反应由克隆载体2切下所说的编码顺序，并进行下述连接反应。为此目的，使克隆载体1与EcoRI并部分与PstⅠ反应，分离含有MFα前体顺序前8个氨基酸之编码顺序的片段。另外，用EcoRⅠ和KpnⅠ切开载体pUC19并与上述两个片段连接，得到克隆载体3。后者编码多至80个氨基酸的完整的MFα前体顺序。

用于大多数水蛭素顺序的起始材料是EP-A0，171，024中描述为“DNA顺序Ⅰ”，并在表1中示为DNA顺序Ⅳ的合成基因。下标横线标示该顺序中的限制性酶切位点AccⅠ切点在氨基酸1-3区域;BamHI切点在氨基酸30/31处，且SacⅠ切点开始于最后的终止密码子。XbaⅠ的延伸顺序位于基因的5′端，SaLI的外伸顺序位于3′端。

将该合成基因再克隆成两部分（EP-A0，171，024中的图1和2）。这些再克隆载体如表2中序号4（相当于EP-A0，171，024的图2）和序号6（相当于EP-A0，171，024的图1）所示者。

用HincⅡ和HindⅢ切开克隆载体4并将此线性DNA与DNA顺序Ⅱ（表1）连接。由此，在以这种方法得到的克隆载体5中已经过平头连接的位点处形成了一个Ncol酶切位点。

用BamHI和AccⅠ总体消化克隆载体6，切下编码水蛭素部分顺序的片段。然后使该片段与已用BamHI和KpnⅠ切开的克隆载体3，并与DNA顺序Ⅲ（表1）相连接。DNA顺序Ⅲ中后三个密码子以与DNA顺序Ⅳ（表1）中的同样方式进行编号，从而得到编码MFα前体顺序之前80个氨基酸和本发明水蛭素衍生物之前30个氨基酸的克隆载体7，这一点已通过DNA顺序分析得以进一步肯定。

用BamHⅠ和HindⅢ由克隆载体5切掉编码水蛭素氨基酸31至64的片段。将该片段连接到已用同种酶切开的克隆载体7中，得到编码MFα前体顺序之前80个氨基酸和本发明水蛭素衍生物之完整顺序的克隆载体8。经限制性酶切分析进一步明确了该质粒的结构。

用BamHI切开质粒Yep13（Broach等，Gene8：121，1979），并用Klenow聚合酶填充外伸的末端。用乙醇沉淀DNA并用牛碱性磷酸酶处理之。

用NcoⅠ和EcoRⅠ由克隆载体8（表2）中切下编码水蛭素衍生物的片段和MFα前体顺序，并按上述方法填补外伸的末端。

将两个平头DNA顺序连接在一起，得到质粒PαfHir17和pαfHir18（图2）。这两个质粒的差异仅在于被插入片段的方向不同。

如EP-A0，171，024中所述，有可能插入一个被插入顺序的终止密码子下游区（EP-A0，171，024的图4至6）。适于这一目的的是NcoⅠ和/或BamHI酶切位点。

在大肠杆菌MM294中扩增质粒DNA后，依照Ito，H等人（J.Bacteriol，153：163，1983）的锂方法将质粒pαfHir17转化到亮氨酸依赖性酵母菌株Y79（α，trp-1，Leu2-1）（Cantrell等，Proc.Acad.Natl.Sci.USA82：6250，1985）和DM6-6（α/α Leu 2-3，112：：Ura3⁺/Leu2：：Lys2⁺，typl^-/trpl^-，his3-11，15/his3-11，15，ura3^-/ura3^-，LyS2^-/LyS2^-，arg4-17/arg4⁺，adel^-/adel⁺）（Maya Hanna，Dept，Mol.Biol.Massachusetts General Hospital，Boston，USA）。分离能够在没有加亮氨酸的选择性培养基上生长的单个菌落。用单个菌落接种酵母基本培养基并于28℃保温24小时。离心除去细胞并用凝血酶抑制试验检测上清液中的水蛭素活性。再分离其上清液显示水蛭素活性的酵母克隆中的质粒DNA并用限制性分析法进行定性分析。将转化的酵母菌株用于下述表达试验。

实施例2：表达

用得自实施例1基本培养基之新鲜过夜培养物的细胞接种10ml酵母完全培养基，以这种方式达到最适密度OD₆₀₀＝0.1。于28℃振荡培养8小时，然后加入90ml新鲜培养基。再振荡培养20小时。离心分离细胞后，检测上清液中的水蛭素活性。

实施例3：加工处理

酸化实施例2中得到的上清液使pH达到3至5，并加至含有多孔吸附树脂的吸附柱上，所说的吸附树脂系由已用0.1M乙酸平衡过的苯乙烯和二乙烯基苯（

DlAlON HP20）的共聚物组成。用Tris-Hcl（pH8.5）和50mM乙酸洗涤，然后用30%异丙醇洗脱。合并含水蛭素衍生物的各管并在已用20mM哌嗪-HCl（pH6）平衡过的Q-SEPH-AROSE 柱上纯化。此时洗脱是使用30-0.25MNaCl梯度。再次合并含水蛭素衍生物的各管并在C18反相层析柱中以HPLC法纯化。然后对依照这种方法制得的纯化产物进行自动蛋白顺序分析。

实施例4：比较实施例

如果使用实施例1的方法，但用下列顺序代替DNA顺序Ⅲ（表1），则在酵母培养物的上清液中只能测得最小水蛭素活性。

1 2

（Pro） Leu Asp Lys Arg Thr （Tyr）

5′ CT TTG GAT AAA AGA ACG T

Ⅲa 3′ CAT GGA AAC CTA TTT TCT TGC ATA

（KpnⅠ）（AccⅠ）

1 2

（Pro） Leu Asp Lys Arg Ile （Tyr）

5′ CT TTG GAT AAA AGA ATA T

Ⅲb3′ CAT GGA AAC CTA TTT TCT TAT ATA

（KpnⅠ）

当使用DNA顺序Ⅲb时，载体相当于克隆载体7和8（表2），但不含有Accl酶切位点。

表1：DNA顺序

50 55

Ⅰ.5′ C GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTC TCC

3′ TA CAA CGA CAA AAC GGT AAG AGG

（TaqⅠ）

60 65

AAC AGT ACT AAT AAC GGT TTA TTG TTC

TTG TCA TGA TTA TTG CCA AAT AAC AAG

70

ATT AAT ACT ACT ATT GCT AGC ATT GCT

TAA TTA TGA TGA TAA CGA TCG TAA CGA

75 80

GCT AAA GAA GAA GGG GTA C 3′

CGA TTT CTT CTT CCC 5′

（KpnⅠ）

Ⅱ.5′ CATGGA 3′

3′ GTACCTTCGA 5′

（HindⅢ）

（Pro） Leu Asp Lys Arg Leu Thr（Tyr）

Ⅲ.5′ CT TTG GAT AA AGA CTT ACG T 3′

3′ CAT GGA AAC CTA TCT TCT GAA TGC ATA 5′

（KpnⅠ）（AccⅠ）

DNA 顺序Ⅳ

三联体序号

氨基酸 0 1 2 3 4 5

核苷酸序号 Met Thr Tyr Thr Asp Cys

1 10 20

编码链 5′ CT AGA ATG ACG TAT ACT GAC TGC

非编码链 3′ T TAC TGC ATA TGA CTG ACG

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys

30 40 50

ACT GAA TCT GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC

TGA CTT AGA CCA GTC TTG GAC ACG GAC ACG

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn

60 70 80

GAA GGA TCT AAC GTT TGC GGC CAG GGT AAC

CTT CCT AGA TTG CAA ACG CCG GTC CCA TTG

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys

90 100 110

AAA TGC ATC CTT GGA TCC GAC GGT GAA AAG

TTT ACG TAG GAA CCT AGG CTG CCA CTT TTC

36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro

120 130 140

AAC CAG TGC GTT ACT GGC GAA GGT ACC CCG

TTG GTC ACG CAA TGA CCG CTT CCA TGG GGC

46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe

150 160 170

AAA CCG CAG TCT CAT AAC GAC GGC GAC TTC

TTT GGC GTC AGA GTA TTG CTG CCG CTG AAG

56 57 58 59 60 61 62 63 64

Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Stp

180 190 200

GAA GAG ATC CCT GAG GAA TAC CTT CAG TAA

CTT CTC TAG GGA CTC CTT ATG GAA GTC ATT

Stp

210

TAG AGC TCG 3′

ATC TCG AGC AGC T 5′

表2：克隆载体

No.pUC

1 19 -E…（1.75 kb α-片段）…E-

2 18 -K…（α-80-49）…T…（α-48-8）…P-

3 19 -B-K…（α-80-49）…T…（α-48-8）…P…E-

4 8 -B-（Hir31-64）-S-Hc-Hd-

5 8 -B-（Hir31-64）-S-N-Hd-

6 12 -B-（Hir30-3）-A-X-A-

7 19 -Hd-B-（Hir30-3）-A-K-（α-80-8）…P…E-

8 19 -Hd-N-S-（Hir64-3）-A-K…（α-80-8）…P…E-

…MFα顺序 -水蛭素顺序

限制性酶的缩写代号

A＝AccⅠ

B＝BamHⅠ

E＝EcoRⅠ

Hc＝HincⅡ

Hd＝HindⅢ

K＝KpnⅠ

N＝NcoⅠ

P＝PstⅠ

S＝SalⅠ

T＝TaqⅠ

X＝XbaⅠ

Claims

1、制备具有下列氨基酸顺序之水蛭素衍生物的方法

0 1 10

Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Len-Cys-

20

Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Asn-Lys-Cys-

30 40

Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-Gly-

50

Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-

60

Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln

该方法包括在宿主细胞内表达编码有所说氨基酸顺序之多肽的DNA。

2、根据权利要求1的方法，其中宿主细胞是酵母细胞。