JPH11266874A - 浸透圧により誘導可能なプロモーターを有する新規ベ クターおよびこれを用いたペプチドあるいは蛋白質の 製造方法 - Google Patents
浸透圧により誘導可能なプロモーターを有する新規ベ クターおよびこれを用いたペプチドあるいは蛋白質の 製造方法Info
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- JPH11266874A JPH11266874A JP10095357A JP9535798A JPH11266874A JP H11266874 A JPH11266874 A JP H11266874A JP 10095357 A JP10095357 A JP 10095357A JP 9535798 A JP9535798 A JP 9535798A JP H11266874 A JPH11266874 A JP H11266874A
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- peptide
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】酵母が持つグリオキサラーゼＩ遺伝子のプロモ
ーターおよび目的の異種遺伝子を有する発現カセット、
当該発現カセットを有する浸透圧によって誘導される発
現ベクター、および当該発現ベクターを含有し、異種遺
伝子の発現産物を著量生産する形質転換細胞を提供する
こと、および、本発現ベクターを利用して、パン酵母で
発現産物を著量生産させることを特徴とする、異種遺伝
子の発現産物の製造法を提供すること。 【解決手段】本発明は、浸透圧により誘導可能なグリオ
キサラーゼＩをコードする遺伝子のプロモーターの下流
に発現させる目的の遺伝子を結合させた発現カセットに
関する。かかる遺伝子のフロモーターが配列番号１の塩
基配列を有するものであることが好ましい。また、本発
明は、かかる発現カセットを有する発現ベクター、この
発現ベクターにより酵母細胞を形質転換してなる形質転
換細胞、およびかかる形質転換細胞を培養し、該培養物
から該異種遺伝子の発現生産物であるペプチド又は蛋白
質を取得することを特徴とするペプチド又は蛋白質の製
造方法にも関する。
ーターおよび目的の異種遺伝子を有する発現カセット、
当該発現カセットを有する浸透圧によって誘導される発
現ベクター、および当該発現ベクターを含有し、異種遺
伝子の発現産物を著量生産する形質転換細胞を提供する
こと、および、本発現ベクターを利用して、パン酵母で
発現産物を著量生産させることを特徴とする、異種遺伝
子の発現産物の製造法を提供すること。 【解決手段】本発明は、浸透圧により誘導可能なグリオ
キサラーゼＩをコードする遺伝子のプロモーターの下流
に発現させる目的の遺伝子を結合させた発現カセットに
関する。かかる遺伝子のフロモーターが配列番号１の塩
基配列を有するものであることが好ましい。また、本発
明は、かかる発現カセットを有する発現ベクター、この
発現ベクターにより酵母細胞を形質転換してなる形質転
換細胞、およびかかる形質転換細胞を培養し、該培養物
から該異種遺伝子の発現生産物であるペプチド又は蛋白
質を取得することを特徴とするペプチド又は蛋白質の製
造方法にも関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵母を宿主とした
形質転換体を用いペプチドおよび蛋白質を生産する技術
に関する。また、本発明は、この技術に用いることが可
能な新規な、発現カセット、発現ベクター、及びこの発
現ベクターによる形質転換細胞にも関する。
形質転換体を用いペプチドおよび蛋白質を生産する技術
に関する。また、本発明は、この技術に用いることが可
能な新規な、発現カセット、発現ベクター、及びこの発
現ベクターによる形質転換細胞にも関する。
【０００２】
【従来の技術】酵母を宿主とした形質転換体を用いペプ
チドおよび蛋白質を生産する技術は広く存在する。この
ペプチド及び蛋白質の生産効率を向上させるためのプロ
モーターも広く利用されている。しかし、強力なプロモ
ーターとして広く利用されているGAL1などのプロモータ
ーは酵母の培養で最もよく利用されているグルコースを
炭素源として用いた場合その機能を発現しない欠点があ
る。
チドおよび蛋白質を生産する技術は広く存在する。この
ペプチド及び蛋白質の生産効率を向上させるためのプロ
モーターも広く利用されている。しかし、強力なプロモ
ーターとして広く利用されているGAL1などのプロモータ
ーは酵母の培養で最もよく利用されているグルコースを
炭素源として用いた場合その機能を発現しない欠点があ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、酵母が
持つグリオキサラーゼＩ遺伝子の発現系制御機構を解明
し、異種遺伝子の効果的発現を達成すべく鋭意研究を行
った。グリオキサラーゼＩ遺伝子は食塩などの浸透圧を
高める物質を培養液中に添加することで発現量が増大す
る可能性が示唆されており［Inoueら：J. Biological C
hemistry, 271,25958(1996)］、それが該遺伝子のプロ
モーターの機能であることが推定されている。
持つグリオキサラーゼＩ遺伝子の発現系制御機構を解明
し、異種遺伝子の効果的発現を達成すべく鋭意研究を行
った。グリオキサラーゼＩ遺伝子は食塩などの浸透圧を
高める物質を培養液中に添加することで発現量が増大す
る可能性が示唆されており［Inoueら：J. Biological C
hemistry, 271,25958(1996)］、それが該遺伝子のプロ
モーターの機能であることが推定されている。
【０００４】本発明の目的は、酵母が持つグリオキサラ
ーゼＩ遺伝子のプロモーターおよび目的の異種遺伝子を
有する発現カセット、当該発現カセットを有する浸透圧
によって誘導される発現ベクター、および当該発現ベク
ターを含有し、異種遺伝子の発現産物を著量生産する形
質転換細胞を提供することである。
ーゼＩ遺伝子のプロモーターおよび目的の異種遺伝子を
有する発現カセット、当該発現カセットを有する浸透圧
によって誘導される発現ベクター、および当該発現ベク
ターを含有し、異種遺伝子の発現産物を著量生産する形
質転換細胞を提供することである。
【０００５】また、本発現ベクターを利用して、パン酵
母で発現産物を著量生産させることを特徴とする、異種
遺伝子の発現産物の製造法を提供することを目的とす
る。
母で発現産物を著量生産させることを特徴とする、異種
遺伝子の発現産物の製造法を提供することを目的とす
る。
【０００６】なお、本明細書中で異種遺伝子というとき
は、パン酵母由来のグリオキサラーゼＩ遺伝子以外の任
意の遺伝子を意味する。
は、パン酵母由来のグリオキサラーゼＩ遺伝子以外の任
意の遺伝子を意味する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、パン酵母が含有するグリオキサラーゼ
Ｉ遺伝子由来の塩基配列をそのプロモーターとともに解
明した。これらの要素を利用した発現ベクターを構築
し、本発現ベクターを用いて異種遺伝子の発現を試み、
大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させる
ことに成功し、本発明を完成するに至った。
解決するために、パン酵母が含有するグリオキサラーゼ
Ｉ遺伝子由来の塩基配列をそのプロモーターとともに解
明した。これらの要素を利用した発現ベクターを構築
し、本発現ベクターを用いて異種遺伝子の発現を試み、
大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させる
ことに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】なわち、本発明の目的は、下記の構成を有
する本発明によって工業的に有利に達成された。
する本発明によって工業的に有利に達成された。
【０００９】［１］浸透圧により誘導可能なグリオキサ
ラーゼＩをコードする遺伝子のプロモーターの下流に発
現させる目的の遺伝子を結合させた発現カセット。
ラーゼＩをコードする遺伝子のプロモーターの下流に発
現させる目的の遺伝子を結合させた発現カセット。
【００１０】［２］遺伝子のフロモーターが配列番号１
の塩基配列を有することを特徴とする上記［１］記載の
発現カセット。
の塩基配列を有することを特徴とする上記［１］記載の
発現カセット。
【００１１】［３］上記［１］または［２］記載の発現
カセットを有する発現ベクター。
カセットを有する発現ベクター。
【００１２】［４］宿主細胞の染色体DNAと相同な部分
を含み、かつこの部分において相同的組み換えを起こす
ことにより、上記［１］または［２］記載の発現カセッ
トを宿主細胞の染色体DNAに組み込ませることができる
ことを特徴とする上記［３］記載の発現ベクター。
を含み、かつこの部分において相同的組み換えを起こす
ことにより、上記［１］または［２］記載の発現カセッ
トを宿主細胞の染色体DNAに組み込ませることができる
ことを特徴とする上記［３］記載の発現ベクター。
【００１３】［５］宿主細胞内での自律複製を可能なら
しめる塩基配列を有する上記［３］または［４］に記載
の発現ベクター。
しめる塩基配列を有する上記［３］または［４］に記載
の発現ベクター。
【００１４】［６］上記［３］、［４］、または［５］
に記載の発現ベクターにより、酵母細胞を形質転換して
なる形質転換細胞。
に記載の発現ベクターにより、酵母細胞を形質転換して
なる形質転換細胞。
【００１５】［７］酵母細胞がSaccharomyces cerevisi
aeであることを特徴とする上記［６］記載の形質転換細
胞。
aeであることを特徴とする上記［６］記載の形質転換細
胞。
【００１６】［８］異種遺伝子によりコードされるペプ
チド又は蛋白質の製造方法において、上記［６］または
［７］に記載の形質転換細胞を培養し、該培養物から該
異種遺伝子の発現生産物であるペプチド又は蛋白質を取
得することを特徴とするペプチド又は蛋白質の製造方
法。
チド又は蛋白質の製造方法において、上記［６］または
［７］に記載の形質転換細胞を培養し、該培養物から該
異種遺伝子の発現生産物であるペプチド又は蛋白質を取
得することを特徴とするペプチド又は蛋白質の製造方
法。
【００１７】［９］形質転換細胞の培養を浸透圧調節剤
の存在下に行なうことを特徴とする上記［８］記載のペ
プチド又は蛋白質の製造方法。
の存在下に行なうことを特徴とする上記［８］記載のペ
プチド又は蛋白質の製造方法。
【００１８】［１０］異種遺伝子によりコードされるペ
プチド又は蛋白質が大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ
であることを特徴とする上記［８］または［９］記載の
ペプチド又は蛋白質の製造方法。
プチド又は蛋白質が大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ
であることを特徴とする上記［８］または［９］記載の
ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明の発現ベクターの具体例
は、パン酵母に存在するグリオキサラーゼＩ（以下GLO1
と略称する場合がある）遺伝子のプロモーターを含む周
辺領域を発現カセットとして含み、GLO1遺伝子コード領
域を異種遺伝子に置き換えたものである。ターミネータ
ーについては結合する異種遺伝子由来のもの、あるいは
一般に用いられているものいずれの場合でも発現可能で
ある。このプロモーターは本発明者らにより発見された
もので、配列番号１の塩基配列を有する。
は、パン酵母に存在するグリオキサラーゼＩ（以下GLO1
と略称する場合がある）遺伝子のプロモーターを含む周
辺領域を発現カセットとして含み、GLO1遺伝子コード領
域を異種遺伝子に置き換えたものである。ターミネータ
ーについては結合する異種遺伝子由来のもの、あるいは
一般に用いられているものいずれの場合でも発現可能で
ある。このプロモーターは本発明者らにより発見された
もので、配列番号１の塩基配列を有する。
【００２０】本発明に用いるGLO1遺伝子のプロモーター
は、［Inoueら：J. BiologicalChemistry, 271, 25958
(1996)］に示された塩基配列をもとに、PCR法で取得す
ることができる。プライマーには発現ベクターとしての
利用に便利な制限酵素切断部分を付与したものを用い
る。
は、［Inoueら：J. BiologicalChemistry, 271, 25958
(1996)］に示された塩基配列をもとに、PCR法で取得す
ることができる。プライマーには発現ベクターとしての
利用に便利な制限酵素切断部分を付与したものを用い
る。
【００２１】発現カセットとしては、該プロモーターお
よび異種遺伝子のターミネーターもしくは公知のターミ
ネーターを結合し、プロモーターとターミネーターの間
に異種遺伝子が挿入できるような遺伝子を構築し完成す
る。一方遺伝子を組み込む宿主への組み込みのために、
相同的組み換え部分あるいは自律複製のための部分が必
要となる。前者の場合、URA3遺伝子およびLEU2遺伝子な
ど広く用いられる遺伝子を用いることができる。後者の
場合も、一般に用いられる公知の遺伝子を使用すること
ができる。
よび異種遺伝子のターミネーターもしくは公知のターミ
ネーターを結合し、プロモーターとターミネーターの間
に異種遺伝子が挿入できるような遺伝子を構築し完成す
る。一方遺伝子を組み込む宿主への組み込みのために、
相同的組み換え部分あるいは自律複製のための部分が必
要となる。前者の場合、URA3遺伝子およびLEU2遺伝子な
ど広く用いられる遺伝子を用いることができる。後者の
場合も、一般に用いられる公知の遺伝子を使用すること
ができる。
【００２２】本発明の発現ベクターは、所望の異種遺伝
子を含む上記発現カセットを適当なベクターに挿入して
構成される。そのために使用されるベクターとしては公
知のpUC18, pUC19, pBR322等の大腸菌ベクターが例示
される。これらのベクターに異種遺伝子、GLO1プロモー
ター、URA3遺伝子などを挿入し、発現ベクターを完成す
る。これらの手法は、後記実施例の記載を参照して、あ
るいは慣用の技術により当業者が適宜実施することがで
きる。
子を含む上記発現カセットを適当なベクターに挿入して
構成される。そのために使用されるベクターとしては公
知のpUC18, pUC19, pBR322等の大腸菌ベクターが例示
される。これらのベクターに異種遺伝子、GLO1プロモー
ター、URA3遺伝子などを挿入し、発現ベクターを完成す
る。これらの手法は、後記実施例の記載を参照して、あ
るいは慣用の技術により当業者が適宜実施することがで
きる。
【００２３】本発明は、上記発現ベクターにより形質転
換された形質転換細胞を培養し、目的とする異種遺伝子
の発現産物であるペプチド又は蛋白質を製造する方法に
も関する。
換された形質転換細胞を培養し、目的とする異種遺伝子
の発現産物であるペプチド又は蛋白質を製造する方法に
も関する。
【００２４】本発明の形質転換細胞は、食塩、ソルビト
ールなどの浸透圧調節剤を添加した条件下で培養する
と、異種遺伝子の発現が誘導され、所望のペプチド又は
蛋白質を細胞内あるいは細胞外に著量生産する。
ールなどの浸透圧調節剤を添加した条件下で培養する
と、異種遺伝子の発現が誘導され、所望のペプチド又は
蛋白質を細胞内あるいは細胞外に著量生産する。
【００２５】形質転換のための宿主細胞としては特に限
定されるものではないが、好ましいのは酵母であり、特
に好ましいのはGLO1プロモーターを取得したパン酵母
（Saccharomyces cerevisiae）である。形質転換体のス
クリーニングのために、適当な選択マーカーを用いる。
一例として、宿主細胞の染色体DNA上の代謝に関与する
遺伝子を用いることが望ましい。すなわち、染色体DNA
上の上記遺伝子を突然変異などの適当な手段により機能
しないような宿主細胞を用い、相当する正常な遺伝子を
含む発現ベクターを用いて、相同的組み換えを起こすこ
とにより、正常な代謝遺伝子を含む形質転換細胞のみを
増殖させてスクリーニングできる物が好ましい。具体的
には上記したようなURA3,LEU2など広く用いられている
選択マーカー遺伝子を発現ベクターに接続する。自律複
製遺伝子を含んだ場合にもこれらの遺伝子はスクリーニ
ングのマーカーとなる。
定されるものではないが、好ましいのは酵母であり、特
に好ましいのはGLO1プロモーターを取得したパン酵母
（Saccharomyces cerevisiae）である。形質転換体のス
クリーニングのために、適当な選択マーカーを用いる。
一例として、宿主細胞の染色体DNA上の代謝に関与する
遺伝子を用いることが望ましい。すなわち、染色体DNA
上の上記遺伝子を突然変異などの適当な手段により機能
しないような宿主細胞を用い、相当する正常な遺伝子を
含む発現ベクターを用いて、相同的組み換えを起こすこ
とにより、正常な代謝遺伝子を含む形質転換細胞のみを
増殖させてスクリーニングできる物が好ましい。具体的
には上記したようなURA3,LEU2など広く用いられている
選択マーカー遺伝子を発現ベクターに接続する。自律複
製遺伝子を含んだ場合にもこれらの遺伝子はスクリーニ
ングのマーカーとなる。
【００２６】パン酵母の形質転換法および外来遺伝子が
染色体DNAに組み込まれた形質転換細胞の取得法は、リ
チウム酢酸法、エレクトロポーレイション法、プロトプ
ラスト法などの公知の方法を利用できる。また自律複製
を可能ならしめるDNA断片の例ならびにそれらのベクタ
ーへの組み込みは、［Kurtsら：Mol. Cell. Biol. 7,20
9(1987)］に開示されており、これを本発明において用
いることができる。
染色体DNAに組み込まれた形質転換細胞の取得法は、リ
チウム酢酸法、エレクトロポーレイション法、プロトプ
ラスト法などの公知の方法を利用できる。また自律複製
を可能ならしめるDNA断片の例ならびにそれらのベクタ
ーへの組み込みは、［Kurtsら：Mol. Cell. Biol. 7,20
9(1987)］に開示されており、これを本発明において用
いることができる。
【００２７】異種遺伝子を組み込んだ酵母を増殖させる
培養方法は一般的なものでよく、グルコース、サッカロ
ースなどの糖、あるいはエタノール、メタノールなどの
アルコールを炭素源、硫酸アンモニウムなどの無機窒素
源、あるいはポリペプトンなどの有機窒素源、その他無
機塩、微量金属、ビタミン、あるいは天然成分である酵
母エキスなどを含んだ培地を用いる。
培養方法は一般的なものでよく、グルコース、サッカロ
ースなどの糖、あるいはエタノール、メタノールなどの
アルコールを炭素源、硫酸アンモニウムなどの無機窒素
源、あるいはポリペプトンなどの有機窒素源、その他無
機塩、微量金属、ビタミン、あるいは天然成分である酵
母エキスなどを含んだ培地を用いる。
【００２８】GLO1プロモーターの発現を誘導させる浸透
圧処理を行う。すなわち培養の適当なフェース゛で食塩、ソ
ルビトールなどの浸透圧を高める物質を添加する。
圧処理を行う。すなわち培養の適当なフェース゛で食塩、ソ
ルビトールなどの浸透圧を高める物質を添加する。
【００２９】発現ペプチドまたは蛋白質の回収方法とし
ては、形質転換細胞を培養後、その菌体を集め、ガラス
ビーズで破砕する方法、フレンチプレスで破壊する方法
など酵母細胞を破砕する一般的な方法を用い、細胞の内
容物を回収する。培養上清に分泌する場合は遠心分離な
どで細胞を除去し、培養上清を得、蛋白質を回収する。
ては、形質転換細胞を培養後、その菌体を集め、ガラス
ビーズで破砕する方法、フレンチプレスで破壊する方法
など酵母細胞を破砕する一般的な方法を用い、細胞の内
容物を回収する。培養上清に分泌する場合は遠心分離な
どで細胞を除去し、培養上清を得、蛋白質を回収する。
【００３０】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。。
【００３１】［実施例１］GLO1プロモーターの調製 GLO1遺伝子の塩基配列をもとに、SmaI切断部位を付加し
た ５’CTGAAGGAGGTGCCCGGGGGATAAACCTAC ３’（配列番号
２）と５’ATCATTCCCGGGTTTCTCAATCTGAATTGG ３’（配
列番号３）の２種類のプライマーをDNAシンセサイザー
にて合成した。Saccharomycescerevisiae S288C(MATα
SUC2 mal1 me1 gal2 CUP1)の染色体DNAを鋳型とし、下
記条件でPCRを行い、GLO1プロモーターを得た。［PCR条
件は以下のようである。鋳型DNA約0.1μg、各プライマ
ー２０pmol、１０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．３）、
１．５mM MgCl2、５０mM KCl、１００μg/ml BSA、
５０μM各dNTP、３単位γTaq DNAポリメラーゼ（東洋紡
社製）となるよう各試薬を加え、全量を５０μlとす
る。DNAの変性条件を９２℃、１分、プライマーのアニ
ーリング条件を６０℃、２分、伸長反応を７４℃、２分
の各条件でパーキンエルマー社製のDNAサーマルサイク
ラーを用い、３０サイクル反応させた。これを１％低融
点アガロースゲルにて電気泳動し、９９３bpのDNA断片
を常法に従って調製した。］ ここで得たDNA断片をSmaIで切断後、同様にSmaIで切断
したlacZ（β-ガラクトシダーゼ構造遺伝子を含む）ベ
クターpMC1871と接続した。ここで調製したプラスミドp
MCGlac18を制限酵素SalIで切断し、GLO1プロモーターと
lacZ遺伝子のカセットを、同様にSalIで切断した酵母形
質転換用ベクターpRS415と結合し、pRSGlac415を得た。
た ５’CTGAAGGAGGTGCCCGGGGGATAAACCTAC ３’（配列番号
２）と５’ATCATTCCCGGGTTTCTCAATCTGAATTGG ３’（配
列番号３）の２種類のプライマーをDNAシンセサイザー
にて合成した。Saccharomycescerevisiae S288C(MATα
SUC2 mal1 me1 gal2 CUP1)の染色体DNAを鋳型とし、下
記条件でPCRを行い、GLO1プロモーターを得た。［PCR条
件は以下のようである。鋳型DNA約0.1μg、各プライマ
ー２０pmol、１０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．３）、
１．５mM MgCl2、５０mM KCl、１００μg/ml BSA、
５０μM各dNTP、３単位γTaq DNAポリメラーゼ（東洋紡
社製）となるよう各試薬を加え、全量を５０μlとす
る。DNAの変性条件を９２℃、１分、プライマーのアニ
ーリング条件を６０℃、２分、伸長反応を７４℃、２分
の各条件でパーキンエルマー社製のDNAサーマルサイク
ラーを用い、３０サイクル反応させた。これを１％低融
点アガロースゲルにて電気泳動し、９９３bpのDNA断片
を常法に従って調製した。］ ここで得たDNA断片をSmaIで切断後、同様にSmaIで切断
したlacZ（β-ガラクトシダーゼ構造遺伝子を含む）ベ
クターpMC1871と接続した。ここで調製したプラスミドp
MCGlac18を制限酵素SalIで切断し、GLO1プロモーターと
lacZ遺伝子のカセットを、同様にSalIで切断した酵母形
質転換用ベクターpRS415と結合し、pRSGlac415を得た。
【００３２】［実施例２］酵母への組み換えプラスミド
の組み込み プラスミドの組み込みはエレクトロポーレーション法で
以下のように行った。
の組み込み プラスミドの組み込みはエレクトロポーレーション法で
以下のように行った。
【００３３】Saccharomyces cerevisiae YIT2(MATa ur
a3-52 ,lys2-801, ade2-101,trp1-△1, his3-△200, le
u2-△1,cta1△::TRP1)をYPD培地（Glucose 2%,Polypept
one 2%,Yeast extract 1%)5mLを入れた試験管に一白金
耳植菌し、２日２８℃で培養した。この前培養液をYPD
培地50mLを入れた200mL坂口フラスコにOD610が1.0程度が約
１．０になった時点で集菌した。20 mLの1Mソルビトー
ル溶液に菌体を懸濁し、菌体を洗浄した。遠心分離で上
清を除いた。この操作を３回繰り返した。菌体を100μL
の1Mソルビトール溶液に懸濁し、エレクトロポーレーシ
ョン（Bio-Rad社製、ジーンパルサーII）用のキュベッ
ト（0.2cm electrode、gap 50、カタログNo.165-2086）
に移液した。ここに実施例１で得たDNApRSG415を加えよ
く混ぜ、1.5kvolt、25uF、200オームでパルスを与えた。1M
ソルビトールを含む最小寒天培地（Glucose 1%,硫安
0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO4・7H2O0.05%,CaCl2・2H2O 0.01
%,NaCl 0.01%,Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、ウラシ
ル、アデニン各0.002%、）をキュベットに1mL加えて菌
体を回収し、滅菌したワッセルマンチューブに写し、２
８℃で２時間振とうした。遠心分離で菌体を回収し、適
当量の滅菌生理食塩水に懸濁し、上記最小培地に2%寒天
を添加した固体培地に菌体を広げ、２８℃で３から４日
静置培養した。出現したコロニーを最小寒天培地で純化
した後、組み換え体とした。
a3-52 ,lys2-801, ade2-101,trp1-△1, his3-△200, le
u2-△1,cta1△::TRP1)をYPD培地（Glucose 2%,Polypept
one 2%,Yeast extract 1%)5mLを入れた試験管に一白金
耳植菌し、２日２８℃で培養した。この前培養液をYPD
培地50mLを入れた200mL坂口フラスコにOD610が1.0程度が約
１．０になった時点で集菌した。20 mLの1Mソルビトー
ル溶液に菌体を懸濁し、菌体を洗浄した。遠心分離で上
清を除いた。この操作を３回繰り返した。菌体を100μL
の1Mソルビトール溶液に懸濁し、エレクトロポーレーシ
ョン（Bio-Rad社製、ジーンパルサーII）用のキュベッ
ト（0.2cm electrode、gap 50、カタログNo.165-2086）
に移液した。ここに実施例１で得たDNApRSG415を加えよ
く混ぜ、1.5kvolt、25uF、200オームでパルスを与えた。1M
ソルビトールを含む最小寒天培地（Glucose 1%,硫安
0.5%,KH2PO4 0.1%,MgSO4・7H2O0.05%,CaCl2・2H2O 0.01
%,NaCl 0.01%,Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、ウラシ
ル、アデニン各0.002%、）をキュベットに1mL加えて菌
体を回収し、滅菌したワッセルマンチューブに写し、２
８℃で２時間振とうした。遠心分離で菌体を回収し、適
当量の滅菌生理食塩水に懸濁し、上記最小培地に2%寒天
を添加した固体培地に菌体を広げ、２８℃で３から４日
静置培養した。出現したコロニーを最小寒天培地で純化
した後、組み換え体とした。
【００３４】［実施例３］組み換え体の培養 組み換え体をSD（2%グルコース、0.67% Yeast Nitrogen
Base）培地にL-リジン、L-ヒスチジン、ウラシル、ア
デニンを各0.002%加えた培地を5mL入れた試験管培地に
植菌し、３０時間２８℃で培養した。YPD培地（2%グル
コース、2%ポリペプトン、1%酵母エキス）50mLを入れた
200mLエーレンマイヤーフラスコに植菌し、約１８時間
２８℃培養した。OD610nmが約1.0に達した時点で最終濃
度0.5MになるようNaClを添加し、さらに１時間培養し
た。培養液から遠心分離により菌体を得た。菌体をpH7.
0の10mMリン酸緩衝液で懸濁し、0.5mm径のガラスビーズ
を入れ、３分間ボルテックスミキサーで攪拌し、菌体を
破砕した。遠心分離で得た上清液を抽出液とした。
Base）培地にL-リジン、L-ヒスチジン、ウラシル、ア
デニンを各0.002%加えた培地を5mL入れた試験管培地に
植菌し、３０時間２８℃で培養した。YPD培地（2%グル
コース、2%ポリペプトン、1%酵母エキス）50mLを入れた
200mLエーレンマイヤーフラスコに植菌し、約１８時間
２８℃培養した。OD610nmが約1.0に達した時点で最終濃
度0.5MになるようNaClを添加し、さらに１時間培養し
た。培養液から遠心分離により菌体を得た。菌体をpH7.
0の10mMリン酸緩衝液で懸濁し、0.5mm径のガラスビーズ
を入れ、３分間ボルテックスミキサーで攪拌し、菌体を
破砕した。遠心分離で得た上清液を抽出液とした。
【００３５】［実施例４］β-ガラクトシダーゼ活性測
定 β-ガラクトシダーゼ活性測定はミラーの方法［Mille
r：Experiments inMolecular Genetics,352(1972)］に
従った。その結果を表１に示した。 表１ 菌株（プラスミド） 0.5MNaCl β-ガラクトシダーゼ活性 （ユニット/mg） 比較例 YIT2 添加 ０ 本発明例 YIT2(pRSGlac415) 添加 ３６４
定 β-ガラクトシダーゼ活性測定はミラーの方法［Mille
r：Experiments inMolecular Genetics,352(1972)］に
従った。その結果を表１に示した。 表１ 菌株（プラスミド） 0.5MNaCl β-ガラクトシダーゼ活性 （ユニット/mg） 比較例 YIT2 添加 ０ 本発明例 YIT2(pRSGlac415) 添加 ３６４
【００３６】
【発明の効果】本発明によれば、異種遺伝子によりコー
ドされるペプチド又は蛋白質を大量生産することができ
る。
ドされるペプチド又は蛋白質を大量生産することができ
る。
【００３７】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９９３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTGAAGGAGG TGCCCGGGGG ATAAACCTAC GGGTTTTTAA 40 ATTAGCGAAA AGCTTTTTCA ATGGGGATCT TTCTGGTTCG 80 GGACAGTTAA ATATAGCATT AACCAGCGGG TTCAACAGCG 120 TTGGTAAATG GTAAACTGAC ATTGTCAACC CTAGCTAAGC 160 CATAGCTTTT CCGTTGAGGA ATTTACAATA AGGTGGTTCC 200 TTTAGTTATA AATTGCAACT GCCAAAATTT TCGGGTAGCG 240 GCAAAATTAA ACGAAAACCT TCTGTCATAT TAAACATAGT 280 TTAGTGACGC AATGCACACA CACTCATATA TATGTATATA 320 TTTATCTATA TCATAGGTGT AAGGCAAAGT TATCACGTGA 360 ATATACTGTT TAGTATACAA GTACGTTGAT TTAACGGCTG 400 AGAGATTCTC AAACAAAGTA ACGCTTAGTT TAGCTAAAGT 440 AGAATCGAAG CGCAGTGAAG GCAAGACGAG TTATCCCTTT 480 ATCACAAAAT ATAAAAAATA GGTAAAGAGG GGGGTGGGGG 520 TGGTTCGGAC TTTGCATCTC GGTGCATTAG TACCACTCAG 560 CTTCAGTTAT AGGAATACTG ACAATGTTCT TGAGCCAGGG 600 AGAACTGAAA TTTCCATACC CTTTAACCCT TTATTCTTGA 640 GCATATGATC TTATTTTTCC ACTCAGCACA AAATACACAT 680 CCCGCATATG ATCTGGACAC TGAATAAACA AGGGGCTTTA 720 CGATGGAGTA GTAGACCTGG ATACGTAGTC ACCACAGGGA 760 TCCTAAACTG CGTCATAGTA AGTTTCTTTG ATACTAGAAT 800 GTCCCTCTCT CGTAGTAGTT GATATCCCGT ATTTCTAGTT 840 AGTGACGTTT ATAAATAGGG AGAAAAAAAA TCGGAATAAC 880 ATTTCCATGC CTTTTTTTTG ACACTTCAGA CCAGATACGC 920 CACCAGCTAC AAACTAACAA TGTCCACTGA TAGTACACGC 960 TATCCAATTC AGATTGAGAA AGCCGGGAAT GAT 993 配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列：CTGAAGGAGG TGCCCGGGGG ATAAACCTAC 30 配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列：ATCATTCCCG GGTTTCTCAA TCTGAATTGG 30
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (10)
- 【請求項１】浸透圧により誘導可能なグリオキサラーゼ
Ｉをコードする遺伝子のプロモーターの下流に発現させ
る目的の遺伝子を結合させた発現カセット。 - 【請求項２】遺伝子のフロモーターが配列番号１の塩基
配列を有するものであることを特徴とする請求項１記載
の発現カセット。 - 【請求項３】請求項１または２記載の発現カセットを有
する発現ベクター。 - 【請求項４】宿主細胞の染色体DNAと相同な部分を含
み、かつこの部分において相同的組み換えを起こすこと
により、請求項１または２記載の発現カセットを宿主細
胞の染色体DNAに組み込ませることができることを特徴
とする請求項３記載の発現ベクター。 - 【請求項５】宿主細胞内での自律複製を可能ならしめる
塩基配列を有する請求項３または４に記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項６】請求項３、４、または５に記載の発現ベク
ターにより、酵母細胞を形質転換してなる形質転換細
胞。 - 【請求項７】酵母細胞がSaccharomyces cerevisiaeであ
ることを特徴とする請求項６記載の形質転換細胞。 - 【請求項８】異種遺伝子によりコードされるペプチド又
は蛋白質の製造方法において、請求項６または７に記載
の形質転換細胞を培養し、該培養物から該異種遺伝子の
発現生産物であるペプチド又は蛋白質を取得することを
特徴とするペプチド又は蛋白質の製造方法。 - 【請求項９】形質転換細胞の培養を浸透圧調節剤の存在
下に行なうことを特徴とする請求項８記載のペプチド又
は蛋白質の製造方法。 - 【請求項１０】異種遺伝子によりコードされるペプチド
又は蛋白質が大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼである
ことを特徴とする請求項８または９記載のペプチド又は
蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10095357A JPH11266874A (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | 浸透圧により誘導可能なプロモーターを有する新規ベ クターおよびこれを用いたペプチドあるいは蛋白質の 製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10095357A JPH11266874A (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | 浸透圧により誘導可能なプロモーターを有する新規ベ クターおよびこれを用いたペプチドあるいは蛋白質の 製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11266874A true JPH11266874A (ja) | 1999-10-05 |
Family
ID=14135405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10095357A Pending JPH11266874A (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | 浸透圧により誘導可能なプロモーターを有する新規ベ クターおよびこれを用いたペプチドあるいは蛋白質の 製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11266874A (ja) |
-
1998
- 1998-03-24 JP JP10095357A patent/JPH11266874A/ja active Pending
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071106 |
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