JP5713286B2 - 二本鎖核酸の製造方法 - Google Patents
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Description
[1]相同的組換えによって、染色体上の標的部位又は標的領域に、第一の目的ヌクレオチド配列、選択マーカー及び第二の目的ヌクレオチド配列を挿入する活性を有する二本鎖核酸の製造方法であって、
当該二本鎖核酸が、
(A)当該標的部位又は標的領域の5’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列、
(B)第一の目的ヌクレオチド配列、
(C)選択マーカー、
(D)第二の目的ヌクレオチド配列、及び
(E)当該標的部位又は標的領域の3’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列
を、5’側から、(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の順で含み、
(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(D)のヌクレオチド配列と(E)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(B)のヌクレオチド配列と(D)のヌクレオチド配列は同一又は実質的に同一である、
センス鎖と、その相補鎖とからなる二本鎖核酸であり、
方法が以下の工程を含む、二本鎖核酸の製造方法:
(i)当該選択マーカー及び当該目的ヌクレオチド配列を含む環状DNAからなる鋳型、及び
15ヌクレオチド長以上である(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)からなる第一のプライマー
を用いて核酸伸長反応を行い、
(A)のヌクレオチド配列、(B)のヌクレオチド配列及び(C)のヌクレオチド配列を5’側から、(A)、(B)、(C)の順で含み、
(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列が隣接している、
第一の一本鎖核酸を合成すること;
(ii)当該選択マーカー及び当該目的ヌクレオチド配列を含む環状DNAからなる鋳型、及び
15ヌクレオチド長以上である(D)のヌクレオチド配列の相補配列の5’末端部分配列、及び(E)のヌクレオチド配列の相補配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E)のヌクレオチド配列の相補配列が隣接している)からなる第二のプライマー
を用いて核酸伸長反応を行い、
(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E’)、(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D’)、及び(C)のヌクレオチド配列の相補配列(C’)を、5’側から、(E’)、(D’)、(C’)の順で含み、
(E’)のヌクレオチド配列と(D’)のヌクレオチド配列が隣接している、
第二の一本鎖核酸を合成すること;
(iii)第一の一本鎖核酸と第二の一本鎖核酸とを混合し、核酸伸長反応を行うことにより、当該二本鎖核酸を得ること;及び
(iv)(iii)で得た二本鎖核酸からなる鋳型、第一のプライマー、及び第二のプライマーを用いてPCR反応を行い、当該二本鎖核酸を増幅すること。
[2]標的部位又は標的領域が、標的遺伝子のコード領域内に存在する、[1]に記載の二本鎖核酸の製造方法。
[3]目的ヌクレオチド配列が、ポリペプチド残基をコードしており、(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列がインフレームで連結されており、且つ/又は(D)のヌクレオチド配列と(E)のヌクレオチド配列がインフレームで連結されている、[2]に記載の二本鎖核酸の製造方法。
[4]当該二本鎖核酸が、
(F)発現制御配列
を、5’側から、(A)、(B)、(C)、(F)、(D)、(E)の順で更に含み、
(F)のヌクレオチド配列は(D)のヌクレオチド配列に作動可能に連結されているセンス鎖と、その相補鎖とからなる二本鎖核酸であり、
工程(i)及び(ii)において用いられる、環状DNAが当該発現制御配列を更に含み、当該発現制御配列は目的ヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
第二の一本鎖核酸が、(F)のヌクレオチド配列の相補配列(F’)を、5’側から、(E’)、(D’)、(F’)、(C’)の順で更に含み、(F)のヌクレオチド配列が(D)のヌクレオチド配列に作動可能に連結される様式で(F’)のヌクレオチド配列と(D’)のヌクレオチド配列とが連結されている、
[3]に記載の二本鎖核酸の製造方法。
[5]当該ポリペプチド残基がタグを含む、[3]又は[4]に記載の二本鎖核酸の製造方法。
[6]選択マーカーが、肯定的選択及び否定的選択の双方が可能な選択マーカーである、[1]に記載の二本鎖核酸の製造方法。
[7]選択マーカーがオロチジン−5’−リン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子である、[6]に記載の二本鎖核酸の製造方法。
[8]以下の工程を含む、染色体上の標的部位又は標的領域に目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体の製造方法:
(i)[1]〜[7]のいずれかに記載の二本鎖核酸の製造方法により二本鎖核酸を製造すること;
(ii)(i)で得た二本鎖核酸により宿主細胞を形質転換すること;
(iii)(ii)で得た形質転換体から、染色体上の標的部位又は標的領域に、第一の目的ヌクレオチド配列、選択マーカー及び第二の目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体を選択すること;
(iv)(iii)で得た形質転換体を培養し、第一の目的ヌクレオチド配列と第二の目的ヌクレオチド配列との間で、分子内相同的組換えを引き起こすこと;
(v)(iv)の培養物から、当該分子内相同的組換えを起こした形質転換体を選択し、染色体上の標的部位又は標的領域に目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体を得ること。
[9]以下を含む、[1]に記載の二本鎖核酸の製造方法により二本鎖核酸を合成するためのキット:
(i)当該選択マーカー及び当該目的ヌクレオチド配列を含む環状DNA、
(ii)15ヌクレオチド長以上である(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)、及び
(iii)15ヌクレオチド長以上である(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D’)の5’末端部分配列、及び(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E’)を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E’)が隣接している)。
[10]以下を含む、[4]に記載の二本鎖核酸の製造方法により二本鎖核酸を合成するためのキット:
(i’)当該選択マーカー、当該目的ヌクレオチド配列及び当該発現制御配列を含み、当該発現制御配列は目的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、環状DNA、
(ii’)15ヌクレオチド長以上である(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)、及び
(iii’)15ヌクレオチド長以上である(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D’)の5’末端部分配列、及び(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E’)を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E’)が隣接している)。
[11](ii)又は(ii’)の核酸における(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列と、(iii)又は(iii’)の核酸における(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列の相補配列とが、目的ヌクレオチド配列上で離れているか、隣接しているか、又は重複している、[9]又は[10]に記載のキット。
[12](ii)又は(ii’)の核酸における(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列と、(iii)又は(iii’)の核酸における(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列の相補配列とが、目的ヌクレオチド配列上で隣接しているか、又は重複している、[11]に記載のキット。
[13](ii)又は(ii’)の核酸における(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列と、(iii)又は(iii’)の核酸における(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列の相補配列とが、目的ヌクレオチド配列上で重複している、[12]に記載のキット。
本発明は、相同的組換えによって、染色体上の標的部位又は標的領域に、第一の目的ヌクレオチド配列、選択マーカー及び第二の目的ヌクレオチド配列を挿入する活性を有する二本鎖核酸の製造方法(以下、本発明の二本鎖核酸製造方法ともいう)を提供する。
(A)染色体上の標的部位又は標的領域の5’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列、
(B)第一の目的ヌクレオチド配列、
(C)選択マーカー、
(D)第二の目的ヌクレオチド配列、及び
(E)当該標的部位又は標的領域の3’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列
を、5’側から、(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の順で含み、
(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(D)のヌクレオチド配列と(E)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(B)のヌクレオチド配列と(D)のヌクレオチド配列は同一又は実質的に同一である、
センス鎖と、その相補鎖とからなる二本鎖核酸。
まず、前記選択マーカー及び前記目的ヌクレオチド配列を含む環状DNAからなる鋳型、及び第一のプライマーを用いて核酸伸長反応を行い、前記(A)のヌクレオチド配列、前記(B)のヌクレオチド配列及び前記(C)のヌクレオチド配列を5’側から、(A)、(B)、(C)の順で含み、(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列が隣接している、第一の一本鎖核酸(好ましくは、DNA)を合成する。
前記選択マーカー及び前記目的ヌクレオチド配列を含む環状DNAからなる鋳型、及び第二のプライマーを用いて核酸伸長反応を行い、前記(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E')、前記(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D')、及び前記(C)のヌクレオチド配列の相補配列(C')を、5’側から、(E’)、(D’)、(C’)の順で含み、(E’)のヌクレオチド配列と(D’)のヌクレオチド配列が隣接している、第二の一本鎖核酸(好ましくは、DNA)を合成する。
次いで、工程(i)で合成した第一の一本鎖核酸と工程(ii)で合成した第二の一本鎖核酸とを混合し、核酸伸長反応を行なう。各一本鎖核酸を、工程(i)又は工程(ii)の反応液から単離又は精製した後、混合してもよいし、工程(i)の反応液と工程(ii)の反応液とをそのまま混合してもよい。
工程(iii)で得た二本鎖核酸からなる鋳型、第一のプライマー、及び第二のプライマーを用いてPCR反応を行い、当該二本鎖核酸を増幅する。
(A)当該標的部位又は標的領域の5’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列、
(B)第一の目的ヌクレオチド配列、
(C)選択マーカー、
(D)第二の目的ヌクレオチド配列、
(E)当該標的部位又は標的領域の3’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列、及び
(F)発現制御配列
を、5’側から、(A)、(B)、(C)、(F)、(D)、(E)の順で含み、
(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(D)のヌクレオチド配列と(E)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(B)のヌクレオチド配列と(D)のヌクレオチド配列は同一又は実質的に同一であり、
(F)のヌクレオチド配列は(D)のヌクレオチド配列に作動可能に連結されているセンス鎖と、その相補鎖とからなる二本鎖核酸であり得る。
前記選択マーカー、前記目的ヌクレオチド配列及び前記発現制御配列を含み、当該発現制御配列とポリペプチド残基をコードしている目的ヌクレオチド配列とが作動可能に連結されている環状DNAからなる鋳型、及び前記第一のプライマーを用いて核酸伸長反応を行い、前記(A)のヌクレオチド配列、前記(B)のヌクレオチド配列及び前記(C)のヌクレオチド配列を5’側から、(A)、(B)、(C)の順で含み、(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列が隣接している、第一の一本鎖核酸(好ましくは、DNA)を合成する。第一のプライマーは、前記工程(i)と同じプライマーを用いることができるが、(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列とがインフレームで連結されていることが好ましい。工程(i’)は、鋳型となる環状DNAが異なる点を除き、前記工程(i)と同様に行うことができる。
前記選択マーカー、前記目的ヌクレオチド配列及び前記発現制御配列を含み、当該発現制御配列とポリペプチド残基をコードしている目的ヌクレオチド配列とが作動可能に連結されている環状DNAからなる鋳型、及び前記第二のプライマーを用いて核酸伸長反応を行い、前記(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E')、前記(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D')、前記(F)のヌクレオチド配列の相補配列(F’)及び前記(C)のヌクレオチド配列の相補配列(C')を、5’側から、(E’)、(D’)、(F')、(C’)の順で含み、(E’)のヌクレオチド配列と(D’)のヌクレオチド配列が隣接しており、(F)のヌクレオチド配列が(D)のヌクレオチド配列に作動可能に連結される様式で(F’)のヌクレオチド配列と(D’)のヌクレオチド配列とが連結されている、第二の一本鎖核酸(好ましくは、DNA)を合成する。第二のプライマーは、前記工程(ii)と同じプライマーを用いることができるが、(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列の相補配列と(E)のヌクレオチド配列とがインフレームで連結される様式で、(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列と(E’)のヌクレオチド配列が連結されていることが好ましい。工程(ii’)は、鋳型となる環状DNAが異なる点を除き、前記工程(ii)と同様に行うことができる。
次いで、工程(i’)で合成した第一の一本鎖核酸と工程(ii’)で合成した第二の一本鎖核酸とを混合し、核酸伸長反応を行なう。各一本鎖核酸を、工程(i’)又は工程(ii’)の反応液から単離又は精製した後、混合してもよいし、工程(i’)の反応液と工程(ii’)の反応液とをそのまま混合してもよい。工程(iii’)は、工程(i’)で合成した第一の一本鎖核酸と工程(ii’)で合成した第二の一本鎖核酸とを用いる点を除き、前記工程(iii)と同様に行うことができる。工程(iii’)の核酸伸長反応により、(A)、(B)、(C)、(F)、(D)及び(E)のヌクレオチド配列を、5’側からこの順で含み、(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列は隣接しており、(D)のヌクレオチド配列と(E)のヌクレオチド配列は隣接しており、(B)のヌクレオチド配列と(D)のヌクレオチド配列は同一又は実質的に同一であり、(F)のヌクレオチド配列は(D)のヌクレオチド配列に作動可能に連結されているセンス鎖と、その相補鎖とからなる二本鎖核酸を得ることができる。
工程(iii’)で得た二本鎖核酸からなる鋳型、第一のプライマー、及び第二のプライマーを用いてPCR反応を行い、当該二本鎖核酸を増幅する。工程(iv’)は、前記工程(iv)と同様に行うことができる。
本発明は、以下の工程(i)〜(v)を含む、染色体上の標的部位又は標的領域に目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体の製造方法を提供する(以下、本発明の形質転換体製造方法ともいう)。尚、図3には本発明の形質転換体製造方法の模式図を示す。
まず、上記1に記載の本発明の二本鎖核酸製造方法により二本鎖核酸を合成する。
次いで、工程(i)で得た二本鎖核酸により宿主細胞を形質転換する。
次いで、工程(ii)で得た形質転換体から、相同組換えにより、染色体上の標的部位又は標的領域に、第一の目的ヌクレオチド配列、選択マーカー及び第二の目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体を選択する。このような選択は通常、使用した選択マーカーによる肯定的選択によって行なう。例えば、選択マーカーとして栄養要求性遺伝子を使用した場合、形質転換した細胞を当該栄養を含まない選択培地で培養し、増殖した細胞を選択する。また薬剤耐性遺伝子を使用した場合、形質転換した細胞を宿主細胞の増殖を阻害する濃度で当該薬剤を含む選択培地で培養し、増殖した細胞を選択する。選択培地には、宿主に応じて公知の組成の培地を使用することができる。
工程(iii)で得た形質転換体を培養し、第一の目的ヌクレオチド配列と第二の目的ヌクレオチド配列との間で、分子内相同的組換えを引き起こさせる。当該分子内相同的組換えは、形質転換体を培養することにより自然に起こる。培地、培養条件などは、宿主に応じて適宜設定することができるが、分子内相同的組換えを起こした形質転換体は選択マーカーを失うため、形質転換前の宿主細胞が増殖可能である必要がある。
工程(iv)の培養物から、当該分子内相同的組換えを起こした形質転換体を選択し、染色体上の標的部位又は標的領域に目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体を得る。当該分子内相同的組換えは、細胞を培養することにより自然に起こり得るが、その効率は一般的には極めて低い。そのためこのような選択は通常、使用した選択マーカーの有する性質に基づく否定的選択により行なう。例えば、Saccharomyces cerevisiaeやCandida albicansのURA3を選択マーカーとして使用した場合には、URA3を有する形質転換体は5-FOA(5-fluoroorotic acid)の存在下では増殖できないため、工程(iv)の培養物を5-FOA(及びウラシル)を含む培地に移して培養することにより、分子内相同的組換えを起こしてURA3を失った形質転換体のみを増殖させ、選択することができる。またこのような否定的選択は、工程(iv)の培養時に行なってもよい。
更に本発明は、以下の(i)〜(iii)を含む、本発明の方法により二本鎖核酸を合成するためのキットを提供する:
(i)前記選択マーカー及び前記目的ヌクレオチド配列を含む環状DNA、
(ii)15ヌクレオチド長以上である前記(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び前記(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)、及び
(iii)15ヌクレオチド長以上である前記(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び前記(E’)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E’)のヌクレオチド配列が隣接している)。
(i’)当該選択マーカー、当該目的ヌクレオチド配列及び当該発現制御配列を含み、当該発現制御配列は目的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、環状DNA、
(ii’)15ヌクレオチド長以上である(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)、及び
(iii’)15ヌクレオチド長以上である(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D’)の5’末端部分配列、及び(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E’)を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E’)が隣接している)。
非必須遺伝子URM1に3xFLAGをコードする配列をインフレームで挿入するための形質転換用DNA断片の調製
一本鎖DNA合成の鋳型となるプラスミドベクターは、以下の手順に従って構築した。
(1)タグと6xGLY(6個の連続するグリシン)とが連結されたアミノ酸配列をコードするDNA断片を得るために、表1に示す組合せのオリゴヌクレオチドを合成した。
これにより、以下の10種類のプラスミドベクターを作製した:
pAG60-3xFLAG-6xGLY(pFOM310)(3xFLAGタグをコードする配列を含む);
pAG60-FLAG-6xGLY(pFOM311)(1xFLAGタグをコードする配列を含む);
pAG60-V5-6xGLY(pFOM319)(V5タグをコードする配列を含む);
pAG60-T7-6xGLY(pFOM312)(T7タグをコードする配列を含む);
pAG60-Strep-tag-6xGLY(pFOM314)(Strep-tagIIをコードする配列を含む);
pAG60-RGS-6xHis-6xGLY(pFOM315)(RGS-6xHisタグをコードする配列を含む);
pAG60-S-tag-6xGLY(pFOM318)(Sタグをコードする配列を含む);
pAG60-MYC-6xGLY(pFOM313)(Mycタグをコードする配列を含む);
pAG60-VSV-6xGLY(pFOM316)(VSV-Gタグをコードする配列を含む);及び
pAG60-HSV-6xGLY(pFOM317)(HSVタグをコードする配列を含む)。
一例として、pAG60-3xFLAG-6xGLYの制限酵素地図を図4に示す。
尚、下記の2種類のプライマーセット(#510と#511、又は#539と#540)を用いて、2種類のDNA断片を合成した。
フォワードプライマー#510:
TACT AAAACGAGAT AGGTTAATAG CAAAATCGGG ATGGTA gac tac aaa gac cat gac gg(配列番号21)(大文字はURM1遺伝子 に由来し、小文字は3xFLAGに由来する)
リバースプライマー#511:
AAATAGCATCAAGTCCACCTAGAAACTCCACTTTCACGTT tcc acc ccc gcc tcc ccc ct(配列番号22)(大文字はURM1遺伝子に由来し、小文字は6xGLYに由来する)
フォワードプライマー#539:
TGATTTCTGATACTAAAACGAGATAGGTTAATAGCAAAATCGGGATGGTAgactacaaagaccatgacgg(配列番号23)(大文字はURM1遺伝子に由来し、小文字は3xFLAGに由来する)
リバースプライマー#540:
TGTTTTCCAAAAATAGCATCAAGTCCACCTAGAAACTCCACTTTCACGTTtccacccccgcctcccccct(配列番号24)(大文字はURM1遺伝子に由来し、小文字は6xGLYに由来する)
3xFLAGが挿入されたURM1遺伝子産物を発現する形質転換体の作製
実施例1で増幅したPCR産物(#539+#540)を用いて、酢酸リチウム法により定法に従ってSaccharomyces cerevisiae YPH499(MATa ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1)(九州大学、西本研究室より供与)を形質転換した。形質転換後の酵母細胞を、ウラシルを含まない選択用寒天培地(CAA寒天培地、1 Lの組成:20 g Agar(和光純薬)、6.7 g Yeast Nitrogen base w/o Amino acid(Difco)、20 g Bacto casamino acid(Difco)、20 g グルコース(和光純薬)、20 mg アデニン(和光純薬)、20 mg ヒスチジン(和光純薬)、30 mg ロイシン(和光純薬)、30 mg リシン(和光純薬)、20 mg メチオニン(和光純薬)、20 mg トリプトファン(和光純薬))上に塗布し、コロニーが形成されるまで30℃でインキュベートした。コロニーを形成したウラシル非要求性株を、形質転換用断片が染色体に組み込まれた株として選択した。次いで、染色体に組み込まれたURA3遺伝子をループアウトにより脱落させるために、ウラシル非要求性株を、5-FOAを含む選択用寒天培地(5-FOA寒天培地、1 Lの組成:20 g Agar(和光純薬)、7 g Yeast Nitrogen base w/o Amino acid(Difco)、1 g 5-フルオロオロチン酸(和光純薬)、20 g グルコース(和光純薬)、30 mg アデニン(和光純薬)、20 mg ヒスチジン(和光純薬)、40 mg ロイシン(和光純薬)、40 mg リシン(和光純薬)、20 mg メチオニン(和光純薬)、30 mg トリプトファン(和光純薬)、40 mg ウラシル(和光純薬))上に塗布し、コロニーが形成されるまで30℃でインキュベートした。
得られた酵母株について、ウェスタンブロッティング法により3xFLAGが挿入されたURM1遺伝子産物の発現を確認した。ウェスタンブロッティングは、ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugate(SIGMA)、及び検出試薬としてCDP-Star, ready-to-use(Roche)を用いて、定法に従って行なった。結果を図6に示す。5-FOA寒天培地上で形成されたコロニーから選択された形質転換体(レーン3)では、14 kDaのバンドが検出され、3xFLAGが挿入されたURM1遺伝子産物が発現していることが確認された。親株であるYPH499(レーン1)及び5-FOAによる選択前の形質転換体3xFLAG-URA3-3xFLAG-URM1(レーン2)においては、14 kDaのバンドは検出されなかった。
以上の結果から、本発明の方法により作製された形質転換用断片を用いて、目的ヌクレオチド配列を染色体上の非必須遺伝子に挿入することができることが示された。
必須遺伝子PGK1/YCR012Wに3xFLAGをコードする配列をインフレームで挿入するための形質転換用DNA断片の調製
PGK1/YCR012W遺伝子は必須遺伝子である。必須遺伝子をターゲットとして実施例2と同様な形質転換用断片で1倍体を形質転換した場合、URA3遺伝子挿入時にターゲット遺伝子の発現を止めてしまい形質転換体が得られない。そこで、URA3遺伝子挿入時にもターゲット遺伝子が発現できるようにADH1 promoter+開始コドンを挿入した新たなプラスミドを構築した。
ADH1 promoter+開始コドンの増幅は、下記プライマー及び鋳型、並びに他の試薬を表3に示す組成で混合し、PCR法にて行った。反応条件は以下の通りである:94℃、2分→(94℃、30秒→55℃、30秒→72℃、1分)×30サイクル→72℃、1分→4℃。
フォワードプライマー225-pGBK-RC(ADH1pro)-F
AGCACgagctcTTCGTTGCTTGCATGCAACTTCT(配列番号25)(小文字はSacI認識部位を示す)
リバースプライマー1329-ADH1pro+ATG-Rv
GCTTCgagctcCATGTTGATTGTATGCTTGGTATA(配列番号26)(小文字はSacI認識部位を示す)
テンプレートDNA
pGBK-RC(Ito.T et al.(2000) PNAS 97:1143-1147)
pAG60-3xFLAG-6xGLY(pFOM310)、
pAG60-FLAG-6xGLY(pFOM311)、
pAG60-MYC-6xGLY(pFOM313)、
pAG60-RGS-6xHis-6xGLY(pFOM315)。
ADH1 promoter+開始コドンの挿入は、Sequence法にて確認した。
作製したプラスミドを以下のように命名した:
pAG60-ADH1pro-3xFLAG-6xGLY(pFOM358)、
pAG60-ADH1pro-FLAG-6xGLY(pFOM359)、
pAG60-ADH1pro-MYC-6xGLY(pFOM360)、
pAG60-ADH1pro-RGS-6xHis-6xGLY(pFOM361)。
一例として、pAG60-ADH1pro-3xFLAG-6xGLY(pFOM358)の制限酵素地図を図8に示す。
(a)標的遺伝子GCN5/YGR252W、鋳型pAG60-MYC-6xGLY(pFOM313)
フォワードプライマー1301-GCN5-MYC-F
CGCCCAAAAGTCTTCAGTTAACTCAGGTTCGTATTCTACATTAGATGGTCGAGCAGAAACTCATCTCAGA(配列番号27)(下線はGCN5遺伝子に由来する配列を示す)
リバースプライマー1302-GCN5-6xGLY-Rv
CGGGATCCGTCGTAGCTCCATCCAAGTGATCCTCTTCAATCTGATGTTTTGTTCCACCCCCGCCTCCCCC(配列番号28)(下線はGCN5遺伝子に由来する配列を示す);
(b)標的遺伝子RPT5/YOR117W、鋳型pAG60-ADH1pro-3xFLAG-6xGLY(pFOM358)
フォワードプライマー1326-RPT5_Pro-3xFLAG-F
TATAGAGGTGAGAACAAATTGGAAAGTTTTGATTTTAGTTTAAGATGGCCGACTACAAAGACCATGACGG(配列番号29)(下線はRPT5遺伝子に由来する配列を示す)
リバースプライマー1325-6xGLY-Rpt5(3rdaa)-Rv
GATCTAATTCATCGTCTCCTGGTAAAGTTTGAGCATCCAATTCTTCCAAGGTTCCACCCCCGCCTCCCCC(配列番号30)(下線はRPT5遺伝子に由来する配列を示す);
(c)標的遺伝子RPT5/YOR117W、鋳型pAG60-ADH1pro-MYC-6xGLY(pFOM360)
フォワードプライマー1327-RPT5_Pro-MYC-F
TATAGAGGTGAGAACAAATTGGAAAGTTTTGATTTTAGTTTAAGATGGCCGAGCAGAAACTCATCTCAGA(配列番号31)(下線はRPT5遺伝子に由来する配列を示す)
リバースプライマー1325-6xGLY-Rpt5(3rdaa)-Rv
GATCTAATTCATCGTCTCCTGGTAAAGTTTGAGCATCCAATTCTTCCAAGGTTCCACCCCCGCCTCCCCC(配列番号32)(下線はRPT5遺伝子に由来する配列を示す);
(d)標的遺伝子RPT5/YOR117W、鋳型pAG60-ADH1pro-RGS-6xHis-6xGLY(pFOM361)
フォワードプライマー1328-RPT5_Pro-RGS-6xHis-F
TATAGAGGTGAGAACAAATTGGAAAGTTTTGATTTTAGTTTAAGATGGCCCGTGGTTCTCATCATCACCA(配列番号33)(下線はRPT5遺伝子に由来する配列を示す)
リバースプライマー1325-6xGLY-Rpt5(3rdaa)-Rv
GATCTAATTCATCGTCTCCTGGTAAAGTTTGAGCATCCAATTCTTCCAAGGTTCCACCCCCGCCTCCCCC(配列番号34)(下線はRPT5遺伝子に由来する配列を示す);
(e)標的遺伝子PGK1/YCR012W、鋳型pAG60-ADH1pro-3xFLAG-6xGLY(pFOM358)
フォワードプライマー1299-PGK1-3xFLAG-F
CATCAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAATGTCTGACTACAAAGACCATGACGG(配列番号35)(下線はPGK1遺伝子に由来する配列を示す)
リバースプライマー1298-PGK1-6xGLY-Rv
AGACACGCTTGTCCTTCAAGTCCAAATCTTGGACAGACAACTTTGAAGATAATCCACCCCCGCCTCCCCC(配列番号36)(下線はPGK1遺伝子に由来する配列を示す);
(f)標的遺伝子PGK1/YCR012W、鋳型pAG60-ADH1pro-MYC-6xGLY(pFOM360)
フォワードプライマー1300-PGK1-MYC-F
CATCAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAATGTCTGAGCAGAAACTCATCTCAGA(配列番号37)(下線はPGK1遺伝子に由来する配列を示す)
リバースプライマー1298-PGK1-6xGLY-Rv
AGACACGCTTGTCCTTCAAGTCCAAATCTTGGACAGACAACTTTGAAGATAATCCACCCCCGCCTCCCCC(配列番号38)(下線はPGK1遺伝子に由来する配列を示す)。
PGK1増幅用フォワードプライマー1312-PGK1(-329)-F:CTATGATGCCCACTGTGATCTCCAGA(配列番号39)
PGK1増幅用リバースプライマー1313-PGK1(in380)-Rv:TCTTCGATGTGGTAACGCAAGTTTTCCAAC(配列番号40)
GCN5増幅用フォワードプライマー1375-GCN5(-340)-F:AAGACATGTAGTGCGCTGTATGGAAAAG(配列番号41)
GCN5増幅用リバースプライマー1376-GCN5(+334)-Rv:CTTTAGTATTATCATTATTCACCACCCTAAACTC(配列番号42)
RPT5増幅用フォワードプライマー1330-RPT5(-337)-F:GAGACGAGTGCAATTAGTGGCTGATAC(配列番号43)
RPT5増幅用リバースプライマー1331-RPT5(in360)-Rv:CTTGACTACAGCAGCTTTGCCAACAG(配列番号44)
これらのプライマーセットを用いた場合、PGK1、GCN5及びRPT5について、それぞれ709+(目的ヌクレオチド配列の長さ)bp、674+(目的ヌクレオチド配列の長さ)bp、及び697+(目的ヌクレオチド配列の長さ)bpの断片がそれぞれ増幅される。
さらに得られた形質転換体について、ウェスタンブロッティング法でタグの付加されたタンパク質の検出を行なうことにより、目的の形質転換体が得られたことを確認できる。FLAGタグが付加されたPGK1タンパク質の検出には、ANTI-FLAG M2 monoclonal Antibody-Perooxidase Conjugate(SIGMA)を用いる。Mycタグが付加されたPGK1タンパク質及びMycタグが付加されたGCN5タンパク質の検出は、Anti c-Myc, Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated (和光純薬)を用いて行なう。His-tagが付加されたRPT5の検出は、Anti 6xHistidine, Monoclonal Antibody (和光純薬)と抗マウスIgG(H+L), ウサギ, F(ab’)2, ペルオキシダーゼ結合(和光純薬)を用いて検出する。予想されたサイズのタンパク質が検出された場合、目的の形質転換体が得られたことを確認できる。
タグと6xGLYとが連結されたアミノ酸配列をコードするDNA断片を得るためのオリゴヌクレオチド。
[配列番号21]〜[配列番号24]
一本鎖DNA合成及びPCRのためのプライマー。
[配列番号25]、[配列番号26]、及び[配列番号39]〜[配列番号44]
PCRプライマー。
Claims (13)
- 相同的組換えによって、染色体上の標的部位又は標的領域に、第一の目的ヌクレオチド配列、選択マーカー及び第二の目的ヌクレオチド配列を挿入する活性を有する二本鎖核酸の製造方法であって、
当該二本鎖核酸が、
(A)当該標的部位又は標的領域の5’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列、
(B)第一の目的ヌクレオチド配列、
(C)選択マーカー、
(D)第二の目的ヌクレオチド配列、及び
(E)当該標的部位又は標的領域の3’側に隣接し、相同的組換えを起こすのに十分な長さを有する、染色体上のセンス鎖の部分ヌクレオチド配列
を、5’側から、(A)、(B)、(C)、(D)、(E)の順で含み、
(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(D)のヌクレオチド配列と(E)のヌクレオチド配列は隣接しており、
(B)のヌクレオチド配列と(D)のヌクレオチド配列は同一又は実質的に同一である、
センス鎖と、その相補鎖とからなる二本鎖核酸であり、
方法が以下の工程を含む、二本鎖核酸の製造方法:
(i)当該選択マーカー及び当該目的ヌクレオチド配列を含む環状DNAからなる鋳型、及び
15ヌクレオチド長以上である(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)からなる第一のプライマー
を用いて核酸伸長反応を行い、
(A)のヌクレオチド配列、(B)のヌクレオチド配列及び(C)のヌクレオチド配列を5’側から、(A)、(B)、(C)の順で含み、
(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列が隣接している、
第一の一本鎖核酸を合成すること;
(ii)当該選択マーカー及び当該目的ヌクレオチド配列を含む環状DNAからなる鋳型、及び
15ヌクレオチド長以上である(D)のヌクレオチド配列の相補配列の5’末端部分配列、及び(E)のヌクレオチド配列の相補配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E)のヌクレオチド配列の相補配列が隣接している)からなる第二のプライマー
を用いて核酸伸長反応を行い、
(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E’)、(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D’)、及び(C)のヌクレオチド配列の相補配列(C’)を、5’側から、(E’)、(D’)、(C’)の順で含み、
(E’)のヌクレオチド配列と(D’)のヌクレオチド配列が隣接している、
第二の一本鎖核酸を合成すること;
(iii)第一の一本鎖核酸と第二の一本鎖核酸とを混合し、核酸伸長反応を行うことにより、当該二本鎖核酸を得ること;及び
(iv)(iii)で得た二本鎖核酸からなる鋳型、第一のプライマー、及び第二のプライマーを用いてPCR反応を行い、当該二本鎖核酸を増幅すること。 - 標的部位又は標的領域が、標的遺伝子のコード領域内に存在する、請求項1記載の二本鎖核酸の製造方法。
- 目的ヌクレオチド配列が、ポリペプチド残基をコードしており、(A)のヌクレオチド配列と(B)のヌクレオチド配列がインフレームで連結されており、且つ/又は(D)のヌクレオチド配列と(E)のヌクレオチド配列がインフレームで連結されている、請求項2記載の二本鎖核酸の製造方法。
- 当該二本鎖核酸が、
(F)発現制御配列
を、5’側から、(A)、(B)、(C)、(F)、(D)、(E)の順で更に含み、
(F)のヌクレオチド配列は(D)のヌクレオチド配列に作動可能に連結されているセンス鎖と、その相補鎖とからなる二本鎖核酸であり、
工程(i)及び(ii)において用いられる、環状DNAが当該発現制御配列を更に含み、当該発現制御配列は目的ヌクレオチド配列と作動可能に連結されており、
第二の一本鎖核酸が、(F)のヌクレオチド配列の相補配列(F’)を、5’側から、(E’)、(D’)、(F’)、(C’)の順で更に含み、(F)のヌクレオチド配列が(D)のヌクレオチド配列に作動可能に連結される様式で(F’)のヌクレオチド配列と(D’)のヌクレオチド配列とが連結されている、
請求項3に記載の二本鎖核酸の製造方法。 - 当該ポリペプチド残基がタグを含む、請求項3又は4記載の二本鎖核酸の製造方法。
- 選択マーカーが、肯定的選択及び否定的選択の双方が可能な選択マーカーである、請求項1記載の二本鎖核酸の製造方法。
- 選択マーカーがオロチジン−5’−リン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子である、請求項6記載の二本鎖核酸の製造方法。
- 以下の工程を含む、染色体上の標的部位又は標的領域に目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体の製造方法:
(i)請求項1〜7のいずれか1項に記載の二本鎖核酸の製造方法により二本鎖核酸を製造すること;
(ii)(i)で得た二本鎖核酸により宿主細胞を形質転換すること;
(iii)(ii)で得た形質転換体から、染色体上の標的部位又は標的領域に、第一の目的ヌクレオチド配列、選択マーカー及び第二の目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体を選択すること;
(iv)(iii)で得た形質転換体を培養し、第一の目的ヌクレオチド配列と第二の目的ヌクレオチド配列との間で、分子内相同的組換えを引き起こすこと;
(v)(iv)の培養物から、当該分子内相同的組換えを起こした形質転換体を選択し、染色体上の標的部位又は標的領域に目的ヌクレオチド配列が挿入された形質転換体を得ること。 - 以下を含む、請求項1記載の二本鎖核酸の製造方法により二本鎖核酸を合成するためのキット:
(i)当該選択マーカー及び当該目的ヌクレオチド配列を含む環状DNA、
(ii)15ヌクレオチド長以上である(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)、及び
(iii)15ヌクレオチド長以上である(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D’)の5’末端部分配列、及び(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E’)を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E’)が隣接している)。 - 以下を含む、請求項4記載の二本鎖核酸の製造方法により二本鎖核酸を合成するためのキット:
(i’)当該選択マーカー、当該目的ヌクレオチド配列及び当該発現制御配列を含み、当該発現制御配列は目的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、環状DNA、
(ii’)15ヌクレオチド長以上である(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列、及び(A)のヌクレオチド配列を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(A)のヌクレオチド配列が隣接している)、及び
(iii’)15ヌクレオチド長以上である(D)のヌクレオチド配列の相補配列(D’)の5’末端部分配列、及び(E)のヌクレオチド配列の相補配列(E’)を含む核酸(但し、当該部分配列の5’側に(E’)が隣接している)。 - (ii)又は(ii’)の核酸における(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列と、(iii)又は(iii’)の核酸における(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列の相補配列とが、目的ヌクレオチド配列上で離れているか、隣接しているか、又は重複している、請求項9又は10記載のキット。
- (ii)又は(ii’)の核酸における(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列と、(iii)又は(iii’)の核酸における(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列の相補配列とが、目的ヌクレオチド配列上で隣接しているか、又は重複している、請求項11記載のキット。
- (ii)又は(ii’)の核酸における(B)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列と、(iii)又は(iii’)の核酸における(D’)のヌクレオチド配列の5’末端部分配列の相補配列とが、目的ヌクレオチド配列上で重複している、請求項12記載のキット。
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