CN116555253A - 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法 - Google Patents

含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116555253A
CN116555253A CN202210113569.3A CN202210113569A CN116555253A CN 116555253 A CN116555253 A CN 116555253A CN 202210113569 A CN202210113569 A CN 202210113569A CN 116555253 A CN116555253 A CN 116555253A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mrna
ribozyme
nucleic acid
poly
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210113569.3A
Other languages
English (en)
Inventor
吴立刚
黎硕珂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Original Assignee
Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS filed Critical Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority to CN202210113569.3A priority Critical patent/CN116555253A/zh
Priority to PCT/CN2023/073778 priority patent/WO2023143598A1/zh
Publication of CN116555253A publication Critical patent/CN116555253A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法。具体而言，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子的3’端具有poly(A)尾和位于该poly(A)尾3’端与该poly(A)尾直接相连的核酶。该核酸分子可用作体外转录合成本文所述高均一性mRNA的模板。采用本发明的核酸分子，可以提高mRNA分子poly(A)尾的均一性，防止poly(A)后非A碱基残留，从而提高mRNA的翻译效率和稳定性，使mRNA在细胞内能更高效、持久地表达编码的蛋白质。

Description

含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法
技术领域
本发明涉及含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法。
背景技术
体外合成的mRNA可利用细胞自身的翻译系统，在细胞和动物体内表达不同功能的蛋白质，包括各类天然或非天然的蛋白质产物，例如基因编码的天然蛋白质及其突变形式、抗体、微生物多肽抗原、肿瘤抗原多肽的串联物等。目前，基于mRNA技术的新冠疫苗获得FDA批准并在全球疫情防控中发挥了重要作用。另有多种传染病疫苗的开发也在进行中，如已进入三期临床试验的流感病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗和巨细胞病毒疫苗等。同时，mRNA技术在肿瘤免疫治疗和罕见病治疗等领域崭露头角，多个产品线进入一期或二期临床试验。
mRNA分子设计是mRNA药物开发的关键技术，mRNA稳定性、免疫原性和蛋白质表达效率是决定mRNA药物是否成功的重要因素。已有大量研究证明优化mRNA分子结构、引入核苷酸修饰和改进纯化方法等，可极大提升mRNA的稳定性和翻译效率、降低mRNA免疫原性〔Pardi,N.,Hogan,M.J.,Porter,F.W.,&Weissman,D.(2018).mRNA vaccines-a new erain vaccinology.Nature reviews.Drug discovery,17(4),261–279〕。poly(A)尾是mRNA分子重要功能区域，在mRNA的翻译和稳定性方面具有关键作用〔Passmore,L.A.,&Coller,J.(2021).Roles of mRNA poly(A)tails in regulation of eukaryotic geneexpression.Nature reviews.Molecular cell biology,10.1038/s41580-021-00417-y.Advance online publication〕，因此，制备poly(A)长度合适且均一的mRNA，是mRNA制药技术中重要的一环。
传统mRNA制备方法包括使用poly(A)聚合酶加尾、使用带有poly(A)的DNA引物进行PCR扩增、或将poly(A)序列加入直接插入到质粒载体中。但这些策略都具有其内在缺陷。如采用poly(A)聚合酶加尾增加生产成本，且得到的poly(A)尾长度不均一，造成纯化困难和难以进行严格的质量控制。而使用带有poly(A)的DNA引物进行PCR扩增制备模板的成本较高，难以广泛应用于工业化大规模生产。质粒载体是目前使用最为广泛的主流方法，但质粒载体在用作体外转录模板前要先进行线性化，因此需要在质粒DNA模板的poly(A)序列后引入限制性内切酶切割位点。然而目前已有的绝大部分限制性内切酶切割质粒后会导致在poly(A)序列后形成非A碱基残留，降低体外转录生成的mRNA在细胞内的蛋白质表达量〔Holtkamp,S.,Kreiter,S.,Selmi,A.,Simon,P.,Koslowski,M.,Huber,C.,Türeci,O.,&Sahin,U.(2006).Modification of antigen-encoding RNA increases stability,translational efficacy,and T-cell stimulatory capacity of dendriticcells.Blood,108(13),4009–4017〕。
综上所述，本领域亟需优化mRNA体外转录的DNA模板，以提高mRNA分子poly(A)尾的均一性和防止poly(A)后非A碱基残留，从而提高mRNA的翻译效率和稳定性，使mRNA在细胞内能更高效、持久地表达编码的蛋白质。
发明内容
本发明第一方面提供一种核酸分子，该核酸分子的3’端具有poly(A)尾和位于该poly(A)尾3’端与该poly(A)尾直接相连的核酶。
在一个或多个实施方案中，所述poly(A)尾长50-250个核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述核酶是自剪切核酶。
在一个或多个实施方案中，所述核酶选自HDV核酶、发夹状核酶和锤头状核酶。
在一个或多个实施方案中，所述核酶是HDV核酶。
在一个或多个实施方案中，所述核酸分子从5’端到3’端依次含有启动子序列、5’非翻译区、Kozak序列、开放阅读框、3’非翻译区、所述poly(A)尾和所述核酶。
在一个或多个实施方案中，所述开放阅读框编码感兴趣的蛋白质或多肽分子。
在一个或多个实施方案中，所述感兴趣的蛋白质或多肽分子选自：病原体抗原、肿瘤抗原、细胞因子、激素、抗体、酶和结构蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述启动子选自：T7启动子、T3启动子、SP6启动子、T7lac启动子、araBAD启动子、trp启动子、lac启动子、Ptac启动子和pL启动子等。
本发明第二方面提供一种核酸构建物，该核酸构建物含有本发明第一方面任一实施方案所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体为质粒，或者PCR扩增的DNA片段。
本发明第三方面提供一种含mRNA分子的制品，该制品由本发明第二方面所述的载体线性化后经体外转录得到。
本发明第四方面提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明第三方面所述的mRNA分子制品中的mRNA分子和药学上可接受的载体。
本发明第五方面提供本发明第一方面所述的核酸分子或第二方面所述的核酸构建物在制备mRNA中的应用，或在提高mRNA在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用。
本发明第六方面提供核酶在制备mRNA中的应用，或在提高mRNA在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述核酶是自剪切核酶。
在一个或多个实施方案中，所述核酶选自HDV核酶、发夹状核酶和锤头状核酶。
在一个或多个实施方案中，所述核酶是HDV核酶。
本发明第七方面提供一种制备翻译效率和/或稳定性提高的mRNA的方法，该方法包括对线性化的载体进行体外转录制备所述mRNA的步骤，其中，所述线性化的载体含有本发明第一方面所述的核酸分子，或载体为本发明第二方面所述的载体。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括制备所述载体的步骤。
附图说明
图1：本发明体外转录模板及HDV核酶结构。(a)HDV核酶的二级结构与序列。(b)使用新型体外转录模板制备mRNA的过程示意图。在质粒载体的poly(A)序列3’端是HDV核酶序列，使用此质粒载体制备线性化的DNA模板进行体外转录反应，得到的mRNA的3’端核酶进行自剪切，形成长度均一、无非A碱基残留的均一的poly(A)尾。
图2：采用三种方案构建质粒载体、制备体外转录模板、合成mRNA。(a)使用Fluc-A100-RZ质粒制备DNA模板，经体外转录合成RZ mRNA。(b)使用Fluc-A100-NotIA-RZ质粒制备DNA模板，经体外转录合成NotIA-RZ mRNA。(c)使用Fluc-A100-NotIA-RZ质粒，使用酶切位点NotI制备DNA模板，经体外转录合成NotIcut mRNA。
图3：检测不同mRNA的电泳条带及蛋白质表达效率。(a)纯化前的RZ、NotIA-RZ、NotIcut用6％PAGE变性胶进行电泳，可观察到核酶自剪切条带(黑色三角形标注)。(b-d)RZ、NotIA-RZ、NotIcut分别在HEK293T、HCT116、Hela细胞中的蛋白质表达效率。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
目前广泛使用质粒载体来制备mRNA。在使用质粒载体制备作为体外转录模板制备mRNA时，要先线性化质粒载体，因此需要在质粒DNA模板的poly(A)序列后引入限制性内切酶切割位点。然而目前已有的绝大部分限制性内切酶切割质粒后会导致在poly(A)序列后残留有非A碱基，导致体外转录生成的mRNA在细胞内的蛋白质表达量降低。本发明发现，在质粒DNA模板的poly(A)序列与限制性内切酶切割位点之间引入核酶，尤其是自切割核酶，能够有效地防止poly(A)序列后非A碱基的残留，提高所得mRNA分子poly(A)尾的均一性(即该poly(A)尾的长度一致)，从而能提高mRNA的翻译效率和稳定性，使mRNA在细胞内能更高效、持久地表达编码的蛋白质。
因此，本发明提供一种核酸分子，该核酸分子具有poly(A)尾和直接与该poly(A)尾连接的位于该poly(A)尾3’端的核酶。
本文中，核酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。RNA包括mRNA等。DNA可以是单链的或是双链的。在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子是DNA分子。
本文中，对于poly(A)尾的长度无特殊限制。本领域周知的用于mRNA制备的poly(A)尾长度均可用于本发明。示例性的长度为50-250个A。
本文中，核酶指具有催化活性的RNA分子，其化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。在一些实施方案中，本发明的核酶是具有自剪切功能的核酶，包括但不限于HDV核酶、发夹状核酶和锤头状核酶。其它可以自催化切割或通过蛋白因子介导切割的核苷酸序列也可用于本发明。在一些实施方案中，本发明使用其核苷酸序列如SEQ ID NO:1第113-197位所示的HDV核酶。
本发明的核酸分子中还可含有开放阅读框。本文中，所述开放阅读框编码感兴趣的蛋白质或多肽分子。本文中，蛋白质或多肽分子包括但不限于病原体抗原、肿瘤抗原、细胞因子、激素、抗体、酶和结构蛋白。
本文中，所述病原体包括但不限于病毒、细菌、真菌、螺旋体和寄生虫等。病原体抗原可以是来自这些病原体的具有免疫原性的多肽，包括本领域周知的用做疫苗以引发免疫原性反应的抗原肽。
在一些实施方案中，所述蛋白质或多肽分子是抗原多肽。在一些实施方案中，所述抗原多肽来源于病原体。本文中，病原体指能够造成人或动植物感染疾病的微生物。在一些实施方案中，所述病原体包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物和/或寄生虫。
在一些实施方案中，所述病原体包括但不限于以下的病毒：新冠病毒、腺病毒、单纯疱疹、脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒人巨细胞病毒、人疱疹病毒、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、严重急性呼吸道综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、瓜纳里托病毒、胡宁病毒、拉沙病毒、马丘波病毒、萨比亚病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多壁虱热病毒、版纳病毒、人肠道病毒、汉坦病毒、西尼罗病毒、中东呼吸道综合征冠状病毒、日本脑炎病毒和水疱性疱疹病毒。
在一些实施方案中，所述蛋白质或多肽分子是肿瘤抗原。例如肿瘤相关性抗原(tumor-associated antigens)和肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigens，也称为肿瘤新生抗原neoantigen)。
在一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原是正常细胞和肿瘤细胞上都存在的抗原分子，并非肿瘤细胞所特有，它通常在肿瘤细胞增殖时出现高表达状态。示例性的肿瘤相关抗原包括：胚胎抗原、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等。更具体而言，肿瘤相关抗原包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、纽约食管鳞状上皮癌抗原1(NY-ESO-1)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE-A3)和酪氨酸酶等。在一些实施方案中，肿瘤新生抗原由肿瘤细胞的非同义突变所产生，仅表达于肿瘤细胞表面，不存在于任何不同发育阶段的正常细胞上。
本文所述的细胞因子、激素、抗体、酶和结构蛋白可以是本领域周知的具有治疗活性或预防活性的蛋白或多肽，包括天然蛋白或功能性肽段，也包括优化突变的蛋白。
在一些实施方案中，所述开放阅读框是密码子优化的。
本发明的核酸分子中还可含有启动子。本文中，启动子可以是本领域制备mRNA时所使用的各类启动子。启动子包括真核表达系统和原核表达系统的启动子。示例性的真核表达系统的启动子包括但不限于CMV启动子、EF1a启动子、SV40启动子、Ubc启动子、UAS启动子、GAL1启动子、TEF1启动子、H1启动子和U6启动子等。常用的原核表达系统启动子包括T7启动子、T7lac启动子、Sp6启动子、araBAD启动子、trp启动子、lac启动子、Ptac启动子和pL启动子等。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子中还含有5’非翻译区、Kozak序列和3’非翻译区。本文中，5’非翻译区(5’UTR)指位于开放阅读框上游不被翻译为蛋白质的区域。Kozak序列指真核生物mRNA 5’端的一段序列，在翻译起始中发挥重要作用。3’非翻译区(3’UTR)指位于开放阅读框下游不被翻译为蛋白质的区域。5’UTR和3’UTR用于调节mRNA翻译、半衰期和亚细胞定位。可选择使用本领域周知的常用于mRNA制备的5’UTR、Kozak序列和3’UTR来实施本发明。通常，来自高表达基因(如α和β珠蛋白基因)的天然UTR是合成mRNA的首选。此外，UTR可根据细胞类型进行优化，如通过去除3’UTR中的miRNA结合位点和富含AU的区域，将mRNA降解降至最低。
在一个或多个实施方案中，所述核酸分子从5’端到3’端依次含有启动子序列、5’非翻译区、Kozak序列、开放阅读框、3’非翻译区、所述poly(A)尾和所述核酶。
在一些实施方案中，本发明提供一种核酸构建物，该核酸构建物含有本发明任一实施方案所述的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸构建物为载体。本发明中，载体可以是本领域常规用来制备mRNA的载体。示例性的载体包括但不限于pUC19，pBR322，pBluescript等。在本发明的载体中，在核酸分子的两端设有合适的酶切位点。可采用本领域周知的方法构建本发明的载体。在一些实施方案中，本发明的载体是质粒载体，能在宿主细胞中自主复制。
在一些实施方案中，本发明提供一种含mRNA分子的制品，该制品由本发明第二方面所述的载体线性化后体外转录得到。可采用合适的酶对本发明的载体进行酶切，制备得到本发明的核酸分子，将该核酸分子用作体外转录的模板，进行体外转录。可采用常规的方法进行体外转录。通常，体外转录体系包括合适的RNA聚合酶、帽子类似物、ATP、UTP、CTP和GTP、DNA模板，反应缓冲液、RNA酶抑制剂等。反应通常在37℃左右进行，反应结束后可加入DNA酶去除DNA模板，然后对产物进行纯化，即可获得本发明的mRNA制品。
如前文所述，由于使用到本发明的核酸分子作为转录模板，因此，本发明的mRNA制备具有非常高的均一性。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明任一实施方案所述的mRNA分子制品中的mRNA分子和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物是疫苗，即核酸疫苗。在一些实施方案中，所述疫苗是肿瘤疫苗。在一些实施方案中，所述疫苗是预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗中mRNA分子编码抗原多肽。治疗性疫苗中，mRNA分子编码治疗性多肽，包括肿瘤相关性抗原多肽(TAA)和肿瘤特异性抗原多肽(TSA)。本文中，药学上可接受的载体可以是本领域周知的用于递送mRNA分子的药学上可接受的载体、赋形剂等。在一些实施方案中，该药物组合物是含有所述mRNA分子和佐剂的疫苗。佐剂可以是mRNA疫苗常用佐剂。
在一些实施方案中，本发明提供本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建物或核酶在制备mRNA中的应用，或在提高mRNA在体内的翻译效率中的应用。
在一些实施方案中，本发明提供一种制备翻译效率和/或稳定性提高的mRNA的方法，该方法包括对线性化的载体进行体外转录制备所述mRNA的步骤，其中，所述线性化的载体含有本发明任一实施方案所述的核酸分子，或载体为本发明任一实施方案所述的载体。在一些实施方案中，所述方法还包括制备所述载体的步骤。本文中，RNA的稳定性(RNAstability)指RNA分子抗拒降解的程度，稳定性高的RNA不易发生降解，具有较长的半衰期。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料与方法
1.质粒构建
在金斯瑞公司人工合成2种含有poly(A)序列和HDV核酶序列的DNA片段，构建到pUC57-simple质粒上。片段名称分别为：XhoI-A100-RZ-BglII片段、XhoI-A100-NotIA-RZ-BglII片段。
XhoI-A100-RZ-BglII片段从5’端到3’端序列为(SEQ ID NO:1)：
其中下划横线所示序列为XhoI、BglII位点，其中下划波浪线所示序列为HDV核酶(简写RZ)序列。
XhoI-A100-NotIA-RZ-BglII片段从5’端到3’端序列为(SEQ ID NO:2)：
其中下划横线所示序列为XhoI、NotI、BglII位点，其中下划波浪线所示序列为HDV核酶(简写RZ)序列，NotI和HDV核酶序列之间间隔一个A。
使用限制性内切酶XhoI和BglII将以上2个DNA片段从金斯瑞公司提供的pUC57-simple质粒上切下来，做DNA切胶回收，作为插入片段(Insert)；使用已构建好的含有T7启动子序列、5’非翻译区、Kozak序列、萤火虫荧光素酶报告基因(Fluc)的开放阅读框、3’非翻译区的质粒，使用限制性内切酶XhoI和BglII进行酶切，做DNA切胶回收得到Fluc载体片段。
再使用T4 DNA连接酶进行连接反应，分别将XhoI-A100-RZ-BglII片段、XhoI-A100-NotIA-RZ-BglII片段连接到Fluc载体片段上，用感受态细胞DH5α和Stbl3进行转化，挑选单克隆进行sanger测序，确认序列正确，分别得到质粒Fluc-A100RZ和Fluc-A100NotIARZ。
2.DNA模板的线性化
用限制性内切酶将以上质粒中所需的用于体外转录的DNA模板切下，做DNA切胶回收，得到6种DNA模板。
(1)用限制性内切酶EcoRI和BglII切质粒Fluc-A100RZ，做DNA切胶回收得到模板Fluc-A100-RZ-DH5α和Fluc-A100-RZ-Stbl3。
(2)用限制性内切酶EcoRI和BglII切质粒Fluc-A100NotIARZ，做DNA切胶回收得到模板Fluc-A100-NotIA-RZ-DH5α和Fluc-A100-NotIA-RZ-Stbl3。
(3)用限制性内切酶EcoRI和NotI切质粒Fluc-A100NotIARZ，做DNA切胶回收得到模板Fluc-A100-NotIcut-DH5α和Fluc-A100-NotIcut-Stbl3。
3.体外转录得到mRNA
使用以上线性化的DNA模板作为体外转录的模板，用T7 RNA聚合酶进行体外转录反应，得到相应的mRNA分子。在体外转录反应中，使用终浓度为1.6mM的帽子类似物和终浓度为2mM的ATP、UTP、CTP，以及终浓度为0.4mM的GTP、20ng/ul DNA模板、1x T7反应缓冲液、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂，在37℃反应4小时后终止反应，加入DNase I在37℃反应15分钟以去除DNA模板，再使用MEGAclear转录纯化试剂盒(Thermo Fisher)对产物进行纯化。
4.mRNA的PAGE变性胶电泳
配制6％PAGE、8M尿素的变性胶，使用纯化前的RZ-mRNA、NotIA-RZ-mRNA、NotIcut-mRNA进行200V 25min电泳。
5.mRNA转染细胞及报告基因实验
分别使用不同的萤火虫荧光素酶报告基因(firefly luciferase，简称Fluc)的mRNA转染细胞，并同时转染等量海肾荧光素酶(renilla luciferase，简称Rluc)报告基因的mRNA作为参照。以24孔板为例：当HEK293T细胞密度约为40％时，将0.22μllipofectamine2000稀释于50μl Opti-MEM中，室温静置5分钟后，加入预先稀释于50μlOpti-MEM的100ng Fluc mRNA和10ng Rluc mRNA中，混匀后再室温静置20分钟，最后小心加入细胞中，培养24小时后，用1×PBS漂洗细胞，再用适量裂解缓冲液(100mM磷酸钾[pH7.8]，0.2％(v/v)Triton X-100)裂解细胞，在室温10000rpm离心1分钟，取适量上清，加入相应体积的双荧光素酶报告基因检测试剂盒里提供的荧光素酶反应底物，用多功能微孔板检测仪记录荧光值。将萤火虫荧光素酶荧光值除以海肾荧光素酶荧光值(Fluc/Rluc比值)即为报告基因的表达情况，作为mRNA的蛋白质表达效率的参考值。
实验结果
本发明在质粒载体的poly(A)序列3’端引入了一个改造过的丁型肝炎病毒核酶(HDV RZ)序列(图1，a)，在体外转录反应生成mRNA分子后，3’端的核酶进行自剪切，形成具有固定长度的poly(A)尾，并且防止了poly(A)3’端的非A碱基残留(图1，b)。
为了比较新型体外转录模板与传统体外转录模板，我们构建了不同的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，简称Fluc)报告基因质粒载体，制备相应的体外转录模板和mRNA，包括：(1)构建poly(A)序列3’端紧连着HDV核酶序列的质粒载体，记为Fluc-A100-RZ质粒；用限制性内切酶EcoRI和BglII将其线性化，得到DNA模板用于体外转录，生成poly(A)3’端含核酶、不含非A碱基的mRNA，命名为RZ mRNA(图2，a)。(2)构建poly(A)序列与HDV核酶序列之间含NotI酶切位点和1个A碱基的质粒载体，记为Fluc-A100-NotIA-RZ质粒；用限制性内切酶EcoRI和BglII将其线性化，得到DNA模板用于体外转录；生成poly(A)3’端含核酶、含非A碱基的mRNA，命名为NotIA-RZ mRNA(图2，b)。(3)使用第(2)点中同样的Fluc-A100-NotIA-RZ质粒，但是用限制性内切酶EcoRI和NotI将其线性化，得到DNA模板用于体外转录；生成poly(A)3’端不含核酶、含非A碱基的mRNA，命名为NotIcut mRNA(图2，c)。
构建获得的Fluc-A100-RZ质粒和Fluc-A100-NotIA-RZ质粒分别转入菌株DH5a和Stbl3感受态细胞进行质粒扩增，提取的质粒经体外转录合成的mRNA分别标记为：RZ-D、RZ-S；NotIA-RZ-D、NotIA-RZ-S；NotIcut-D、NotIcut-S，其中后缀-D代表来自DH5a菌株的克隆，后缀-S代表来自Stbl3菌株的克隆。使用6％PAGE变性胶进行电泳，发现RZ、NotIA-RZ mRNA的样品中，在100bp左右位置出现RNA条带，即核酶自剪切条带(图3，a)，mRNA经过纯化后即可完全去除该核酶分子，不会对后续的反应和细胞实验造成任何影响。
我们将这6种Fluc mRNA分别转染至HEK293T细胞中，24h后检测其蛋白质表达效率。结果发现，poly(A)3’端不含非A碱基的RZ mRNA的蛋白质表达效率显著高于poly(A)3’端含若干个非A碱基的NotIA-RZ(RZ核酶切割后仍然带有若干个非A碱基)、NotIcut mRNA(不带有RZ核酶)的(图3，b-d)，说明去除poly(A)3’端非A碱基对于提高mRNA在细胞内表达效率的重要性。
以上实验结果说明在mRNA的poly(A)3’端添加自切割核酶，能形成准确均一的、不带有其他多余核苷酸的poly(A)尾，从而提高mRNA的蛋白质翻译效率。
序列表
<110> 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
<120> 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法
<130> 220404
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacccg ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaggccggca 120
tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacattc cgaggggacc gtcccctcgg 180
taatggcgaa tgggaccaga tct 203
<210> 2
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacccg ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagcggccgc 120
aggccggcat ggtcccagcc tcctcgctgg cgccggctgg gcaacattcc gaggggaccg 180
tcccctcggt aatggcgaat gggaccagat ct 212

Claims (10)

1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的3’端具有poly(A)尾和位于该poly(A)尾3’端与该poly(A)尾直接相连的核酶。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述poly(A)尾长50-250个核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酶是自剪切核酶；优选地，所述核酶选自HDV核酶、发夹状核酶和锤头状核酶；更优选地，所述核酶是HDV核酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子从5’端到3’端依次含有启动子序列、5’非翻译区、Kozak序列、开放阅读框、3’非翻译区、所述poly(A)尾和所述核酶。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，
所述开放阅读框编码感兴趣的蛋白质或多肽分子；优选地，所述感兴趣的蛋白质或多肽分子选自：病原体抗原、肿瘤抗原、细胞因子、激素、抗体、酶和结构蛋白；和/或
所述启动子选自：T7启动子、T3启动子、SP6启动子、T7lac启动子、araBAD启动子、trp启动子、lac启动子、Ptac启动子和pL启动子。
6.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求1-5中任一项所述的核酸分子；
优选地，所述核酸构建物为载体或者为PCR扩增的DNA片段；优选地，所述载体为质粒。
7.一种含mRNA分子的制品，其特征在于，所述制品由权利要求6所述的载体线性化后经体外转录得到。
8.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求7所述的mRNA分子制品中的mRNA分子和药学上可接受的载体。
9.权利要求1-5中任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的核酸构建物在制备mRNA中的应用，或在提高mRNA在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用，或核酶在制备mRNA中的应用，或核酶在提高mRNA在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用；
优选地，所述核酶是自剪切核酶；更优选地，所述核酶选自HDV核酶、发夹状核酶和锤头状核酶。
10.一种制备翻译效率和/或稳定性提高的mRNA的方法，其特征在于，该方法包括对线性化的载体进行体外转录制备所述mRNA的步骤，其中，所述线性化的载体含有权利要求1-5中任一项所述的核酸分子，或所述载体为权利要求6所述的载体。
CN202210113569.3A 2022-01-30 2022-01-30 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法 Pending CN116555253A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210113569.3A CN116555253A (zh) 2022-01-30 2022-01-30 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法
PCT/CN2023/073778 WO2023143598A1 (zh) 2022-01-30 2023-01-30 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210113569.3A CN116555253A (zh) 2022-01-30 2022-01-30 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116555253A true CN116555253A (zh) 2023-08-08

Family

ID=87470749

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210113569.3A Pending CN116555253A (zh) 2022-01-30 2022-01-30 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116555253A (zh)
WO (1) WO2023143598A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1092777A1 (en) * 1999-10-15 2001-04-18 Aventis Pharma S.A. Self-cleaving RNA sequences and their use for the control of protein synthesis.
CN109971775B (zh) * 2017-12-27 2021-12-28 康码（上海）生物科技有限公司 一种核酸构建物及其调控蛋白合成的方法
WO2020198174A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
CN115335526A (zh) * 2020-02-07 2022-11-11 罗切斯特大学 核酶介导的rna组装和表达

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023143598A1 (zh) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Trepotec et al. Segmented poly (A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life
JP7121443B2 (ja) 多用途性且つ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン
AU699384B2 (en) Alphavirus cDNA vectors
Oh et al. Design, assembly, production, and transfection of synthetic modified mRNA
WO2023035372A1 (zh) 一种有限自我复制mRNA分子系统、制备方法及应用
CN114574483A (zh) 基于翻译起始元件点突变的重组核酸分子及其在制备环状rna中的应用
WO2023109975A2 (zh) 提高基因表达的rna复制子及其应用
JP2023521290A (ja) 自己環状化ｒｎａ構造体
CN116555253A (zh) 含高均一性poly(A)尾的mRNA及其制备方法
CN109207559B (zh) 一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法
AU2017225350A1 (en) Promoter
CN114990093B (zh) 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d
CN115927331A (zh) 一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途
AU2022272235A1 (en) Methods and compositions for genomic integration
WO2023165530A1 (zh) 提高rna分子的胞内翻译效率和/或稳定性的方法
AU753729B2 (en) Alphavirus vectors
Johnson A small-scale plasmid preparation yielding DNA suitable for double-stranded sequencing and in vitro transcription
US20190374567A1 (en) Reverse Transcriptase Dependent Conversion of RNA Templates Into DNA
Hornblower et al. Minding your caps and tails—Considerations for functional mRNA synthesis
Liu et al. Development and application of an uncapped mRNA platform
EP4123029A1 (en) In-vitro transcript mrna and pharmaceutical composition comprising same
US20240066116A1 (en) Fully synthetic, long-chain nucleic acid for vaccine production to protect against coronaviruses
WO2024055272A1 (zh) 能高效表达目的基因的mRNA载体系统、其构建及应用
KR102129584B1 (ko) 목적 유전자를 선형 벡터에 삽입하는 방법
CN116004682A (zh) 一种快速无痕制备含长多聚腺嘌呤的mRNA的方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication